Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и слияние протопластов грибов продуцитов целилолитических и личнолитических ферментов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и слияние протопластов грибов продуцитов целилолитических и личнолитических ферментов"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХЮШ Ш. Л. Я БАХА

Яа правая рзтош.тш

Образцова Кргза Нкзиаетаа,

Ш 1«

шшчагз и тшшв иготсяшяш ттов - пигдйрггов щш^тЕшг-щшх и вггшЕГ^чшзя сшлзггсз

(03.00.04 - биохимия)

Азтореферат диссертации яа соискагшв ученой степэни кандидата биологических наук

г&огаа - 1991

Работа выполнена в лаборатории углеводов Института биохимии им. Л. Е Баха АН СССР

Науцкш р^ювадизселхг доктор хиыичэских наук, профессор А. А. Клесов кандидат химических наук Е Е Нуцубидзе

О&адаш&шв сгашкеши доктор биологических наук М. С. Крнцкий кандидат тачееких наук Л Д. Румш

Ведуна учревдэша: Московский государственный университет им. И К Ломоносова, Химический факультет

в 10 час. на васедаиии специализированного совета К 002.9В. 01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. ЯЕаха АН ССОР (117071, Москва, Ленинский проспект, аз, корп. г).

С диссертацией мэкно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Шсква, Ленинский проспект, 33 корп. 1).

Зашята диссертации состоится

года

Учений секр'етарь спец. совета догаор биологических наук

Ы.11 Мэлчанс

х'^жгяиятгы рдвдга

про о;«; ta Утилизации лигнацэллшозоеодер.уд-щчх седасвохоэяйотгениых и пропиленных: отходов и превращение их н обогацошгке белгспмч, jrarraycBaniraeMHtrt углеводщ/л, физиологически активными соединениями корча для яипотпых, а таю® получение из них путем микробной конверсии метаболитов и Ферментов для пкшевой, химической и целлюлозно-бумажной промышленности, является одной из актуальных проблем современной биотехнологии. Успешная реализация данной задачи затруднена рядом существенных недостатков, присущих лигиолитическим и цед-лшолитически« ферментам, участвующим в процессе биоконверсии: низкой. термостабильнэстью, низким сродством к целлюлозе и ио-внвеняой чувствительностью к ингибироваяию продуктами гидролиза целлюлозы, несбалансированностью по компонентному составу лигноцеллюдолптических ферментных комплексов я т. д. Перед исследователями вояникзет необходимость конструирования новых микроорганизмов, обладаю®« повмшнпш уровней секреции ферментов о заданными биохимическими характеристиками. Среди альтернативных подходов методы клеточной киаикерии, в частности, метод слияния протопластов, на наш взгляд, является наиболее перспективным в этой аспекте. В литературе на сегодняшний день нет данных о проведении мегродового слияния протопластов вышеуказанных грибов.

Цель Целью работы являлась разработка аффективных

методов получения и меяродового слияния протопластов мицели-альных грибов-продуцентов лиг.чиназ и иелдвлаз; изучение лигно-целлвлолитичесгах ферментных комплексов, секретируемых как исходными родительскими, тан и рекомбинантными штаммами; изучение возможных путей повышения эффективности гидролиза целлюлозы путем анализа кянетичэсш« закономерностей процесса.

Дшт достижения поставленной цели необходимо Сыло решить следущпе задачи:

- Подобрать оптимальные условия протопяастировакия ет.е- . лчашшх грибов, относящихся к классам дейтероьяцетов (Гп'с/ю-dorrra longibrachiatum) и базидисиидогов (Fi&noroclm-Jta chryso-spon uni) ;

- Разработать эффектившй метод такродового слияния про-

топластов грибов, относящихся к таксонэшческл отдаленным классам;

- Подобрать олти.у,адьиыз условия культивирования, обеспечивавшие максимальный уровень секреции микроорганиэмаьм изучаемых ферментов;

- Лзучить постадийный механизм ферментативного гидролиза цедмоловы

Научная тзанака рзДсггц Влервые получен сгабидьвШ ;ша-неспособный микроорганизм путем слияния протопластов грийоз, относящихся к различным классам - дейтерошцетам (Т. ХопёгЬга-сШаШт) л баандиомицетам (Р. сЬтувозрохчит).

Показано, что стероидный гликозид - дигитотш в присутствии полиэтиленгдиколя способствует образованию стабильных рекомби-нангннх культур, об'^единлюадк Ферментативные активности, присущие обоиь родительским штаммам и отличающиеся от них по морфологическим и биохимическим характеристикам.

Исследованы возможные механизмы регенерации клеточной стенки и реверсии микроорганизмов из изолированных протопластов целлюлолитического гриба Т. Лоп^ЬгазгиаШт.

Обнаружены две необычные кинетическиезакономерности ферментативного гидролиза целлшоаы, выходящие аа рамки общепринятой теории гидролиза целлюлозы, раскрывающие воамолшости повышения эффективности процесса на его лишгирувцей стадии.

Практическая зиашгшсть работ , Разработанный метод межродового слияния протопластов позволил получить новый микроорганизм, способный секретировать сбалансированный по лигнолити-ческиы и целлшолитическим активностям ферментный комплекс с повышенной целлобиазкой активностью, способный гидролизовать лигноцеллюлогу эффективнее обоих родительских штаммов. Предлагаемый метод а перспективе ыодег был с успехом применен для конструирования новых высокоактивных продуцентов биологически активных соединений.

В результате исследования кинетических еаксаомэрностей ферментативного гидролиза целлюлозы показаны пути ловызения вф^ектизкости процесса и экономии фзрыента.

бдцюбырзя работы. Основные результаты " работы были представлены на конкурсе фундаментальных научных работ йнсти-

тута биохимии им. Л. JL Баха н 1939 г. , Конференции молодых ученых "Современные проблемы биотехнологии мцкрооргашшмоЕ" (Рига, 1907г. ), VI Всесоюзном симпозиума но инженерной энзимологии (Каунас, 1&й8г,), ¡V Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микро орган из ма>ли" (Ташкент, 1988г.), V-th Sci. Sym. Soc. Countrios Biotechnology (Hungary, Budapest. 1989), III Международной школе молодых ученых (Варна, Болгария, 1983), Международной конференции по проблемам я перспективам биотехнологии (;Техо-Словакия, Братислава, 1989г.).

ИуОлккацщ». По материалам диссертации опубликовало 11 печатных работ (5 статей и б теаксов). Имеется полоштельное решение на авторское свидетельство М 4418176/31-13 от 26.10. 68г.

95221? работы. Диссертацнонизя работа состоит из введения, четырех глав обзора литературы, экспериментальной части, тред глав, в которых излагаются результаты исследований и их обсуждение, еыеодоз, списка литературы (221 наименование). Работа галогена на 125 страницах, вкдазчазт 11 рисунков, 15 таблиц и 3 схемы.

саюдшв содгргдшв р.шли

I. ПОЛУЧЕНИЕ ПГОТОКГЛСГГСЗ IS ГЯЦЕЛНДШШХ ГРЖОЗ.

1. Иалучешет прогспгастаг. из допгерсмгцзта Trichadervzt Jonrribrnchi¿atea

Для протопластирования брали мицелий на экспоненциальной ]азе роста (20-часовой), ног да еце не сформирована вторичная клеточная стенка, пркдагавэп метке кесткость и тогда ока наиболее чувствительна к атаке литнчесгскми ферментами.

Для лизиса клеточной стелют использовали разработанную в лаборатории углеводов Института бшяюяш им. А. Е Баха логическую систему, созданяук яа основе промышленных ферментных препаратов отечественного производства: целловиридина ГЮХ и пеетофозтидина ГЮХ

Шдобраш условия, при которых данная логическая систека приводит к !.!агеимальнок<у выходу протопластов: варьировались рЯ инкубационной среды, тип и концентрация осмотического стабили-

автора (рас. í).

Ho-iuiäcmSo лрй/попп$.елю6 •/Qs/m

в 6 ^ та

~5 J ~ТрЯ / г 5 ¿>з qs /,о íKccj/i

Рис.! Зависимость вьссода протопластов ТПсШШпз lcnslbrscbiáimt oí: pH инкубационной среды (а), вида и концентрации осмотического стабилизатора (бив, соответственно).

Шксиьшшный выход протопластов 8-104/мл достигался при рЯ шкуйационной среды 7,0 и кспольвовании в качестве осмотического стабилизатора 0,7 И KCL. Изучение процесса протоп-ластированин во ареиани показано, что достаточна 2-3 часовая инкубацш в дашоЛ лштической сиетеыз.

Сдэхако сравнительное изучение протопластов, выходящих из .чащелия в первые и последующее 2 часа лизиса клеточкой стенки. Пскагако, что средний рагшр протопластов, освобоадавсдася в первыо 2 часа равен В utos, а в посла дуюэде 2 часа - 10 (¿км, тс есть вкачале освобождается Содеэ ыалккэ протопласта

Протопласты Г. longibrachiatum, получвЕНЫЗ с еомощьи дан jjofi, рааработааной в лаборатории литической сиатеш достаточно стабильно, тал при яранеши-кх в 0,S ii KCL при -4° С в течение 24 суток сохраняется Í7% протопластов.

S. Иолучап!«: протопластов из базгщиокщщ-ов .

Plcurotus saliereis и Ptvmzraclvtzbe cftrymspaviua.

Протопластирование Р. sal ignus начинали с подбора среды роста мице-лия и источника углерода. Показано, что замена глюкозы 2 -ной сорбозой увеличивает выход протопластов вдвое. Этот фага- хорошо согласуется с литературными данными о том, что введение сорбозы в среду культивирования нарушает процесс нормального биосинтеза клеточной стенки, превравря последнюю в более чувствительную к атаке литичэскими ферментами. Косвенным доказательством этого предположения служит тот факт, что врем роста мицелия на среде с сорбозой возрастает в 4-5 раз по сравнению с ростом на глюкозе.

Присутствие дитяотрейтола в среде культивирования Р. sal 1 gnus таклэ приводило к ревкому замедлению роста мицелия (до 6 суток - 0,01 - 0,05 7. дитиотрейтол и до 12 суток - 0,15% дитиотрейтол), что согласуется с литературными данными о нарушении биосинтеза клеточной стенки в присутствии меркаптосоеди-нений вследствие восстановления S-5 мостиков в белок-маннаио-вом комплексе клеточной стенки. Показано, что для данного гриба наличие 0,06 дитяотрейтола в среде роста■мицелия облегчает дальнейшее его протопластирование, увеличивает выход протопластов в 2'раза тогда как обработка готового мицелия дитиот-рейтолом не изменяла выход протопластов.

Подобраны рН инкубационной среды (7,0), тип и концентрация осмотического стабилизатора (0,7М NH*CL), в результате чего достигнут выход протопластов - 4*10'/мл.

Подобраны оптимальные условия протоп застировапия мицелия гриба Р. chrysosponum. Показано, что максимальный выход протопластов Ъ,А*10е/мл достигается при рН инкубационной среды, равном 6,0, и испольэоэайии 0,9 tí í^SOf в качестве осмотического стабилизатора.

ii. г'егшрация к из&юш даохоишсгш

Наиболее детально эти процесс« изучены для протопласта» Т. longibrachiatuiii. Использовались два типа регекоращюнных сред: жидкая и твердая с покрытием. Регенерацию и механизм реверсии протопластов исследовали в дадкой среде (среды Чапека и Гаги с добавками стабилизатора и N-ацетилглжозоашка), которая позволяет следить оа процессом под микроскопом. Через 6Ь часоз под микроскопом (х 400) наблюдали отдельные, но более крупные, чем исходные (в 2-3 раза), протопласты с темной плотной с ючкой и зернистыми внутренними структурами. Через Б суток отдельное протопласты были укл редкими, в основном -скопления по Í3 - 1Ь про-гапластоь. Некоторые протопласты имели неправильную шарообразнуи форму, другие - с вшячившшяьш. Имели ыесто и дродаеподосзные цепочки протопластов и аароадаж-шиеся молодые мицелии по типу образования ростовой трубки на регенерированного протопласта.

Мокао сделать вывод, что для протопластов Г. longibvachi а-tuni наблюдается многообразие форм реверсии, по крайней мере три типа: 1) через образование дрозшгподобнцх тел; '¿) через образование ростовой трубки от единичных , регенерированных протопластов- и 3) через "почкующейся" протопласт.

Из результатов таблицы 1 видно, что протопласты, освобождающиеся ь первые (i) и последующе СII) часы протопластирова-ниа обладают практически одинаковой способностью к регенерации меточной стенки.

Способность протопластов Т. longibi-achiatum восстанавливать шщелиальиуи форму, го есть степень их реверсии, изучали на твердой агариаованной среде с покрытием.

Данные таблицы 2 согласуются с литературными у. мгут еви • детельствовать о том, чю половила протопластов, освобоздаи-шдхся из мицелия в первые два часа протопластирования лишена ядер, поэтому эти протопласта кнехт степень реверси»; в два раза ыеньее, чем протопласт, освобоздактаеся в последующие часы протопластирования; тогда как на способность регенерировать клеточлуа стенку (степень регенерации) наличие ядер, по-видп i.-.ому, ко влияет.

. Таблица 1

Зависимость степени регенерации протопластов Т. longibra-еЛ*а£ит от состава .жидкой среда

N п/п ! ... .... Регене рационная среда Осмотический стабилизатор Добавки Степень регенерации протопластов,Z

1 11

1 Чапека 0.7М KCL 30 31

2 Чапека 0,9М KCL - 64 62

3 Гаги 0.7М KCL - 16 1Б

4 Гаги 0,9М KCL - 13 16

б Чапека 0,9М KCL 0,1 X 76 ВО

N-ацетил-

глкгазамин

Таблица 2

Зависимость степени реверсии протопластов Т. longibrachia-- tum от состава регенерационной среды.

N п/п Регенерационная среда Осмотический стабилизатор Добавки Степень реверсии протопластов, X

I II

1 Чапека 0,7Ы KCL 16 21

2 Чапека о,т kcl - 9 14

3 Гаги 0,7u kcl - 6 8

4 Гаги 0,9м kcl - 1 3

Б Чапека 0,9М kcl од % 18 аз

К-ацатил-

глхкозамия

ш. с15шшк ifforoillaciob щ1гкр0мщет0& tbiceodekisa viride, гтсиошш шшвялпщтш н елзвдюшцето&

РПАНЕЮОШГЕ CimrSOSPOSIUM, PLEUSOrUS OSTliEATUS.

1. Получение кжародоаого фуаанта.

Известно, что грибы рода Tnctoderma являются промышленными продуцентами целлюлаз, эффективно разрушакщиш целлюлозу, но при гидролизе лигнифицированного сырья они теряют свою активность вследствие инактивации лигнином.

Гриб . 5елой гнили, продуценты лигнинаа, а также целлюлаз, характеризуются способностью разрушать лигнин и целлюлозу, но в отношении последней их активность сильно уступает продуцентам рода Tri ctoderira.

Данные грибы выбраны в качестве родительских штаммов с целью конструирования нового продуцента, способного эффективно разрушать лигноцеллюлоау.

Принципиальное нововведение в общепринятую схему слияния протопластов в присутствии полизтиленгликоля состоит в обработке протопластов одного из родительских штаммов стероидным гликозидом. Надо отметить, что в отсутствие стероидного глико-аида образования межродового фуаанта не наблюдалось.

В результате из более чем 40 исследованных колоний были идентифицированы 4 продукта слияния на основании морфологических отличий от родительских штаммов и изучения секретируе-мых ими ферментативных активностей. Для штамма обладающего наиболее высокими ферментативными активностями, несколькими различными методами осуществлено доказательство получения фуаанта.

1) Исследованием морфологии колоний фуаантного и родительских штаммов.

2) Изучением целлюлолитических и лигнолитических активностей, секретируеыых родительокими и фуэантним штаммами (таблица 3).

Как видно из таблицы 3, фузант объединяет все ферментативные активности, присущее родительским штаммам, при этом су-пэствешга (6 раз) повышается уровень целлобиазной активности. Последнее, со-видиноыу, можно объяснить формированием у фузан-

та качественно новой клеточной стенки, облегчающей секреции целлобиааы, которая е исходном штамме (Тп е/юс/егла) является в основном внутриклеточным ферментом (связана с клеточной стен-

1СОЙ).

Таблица 3.

Ферментативные активности, секретяруемые родительскими и фуэантной культурами.

Продуцент Ферментативные активности, ед/мл

эидоглюка-назная целлоби-азная лакказ-ная перонси-дазная

Т. 1оп&1ЬгасШаЬит Р. сЬтузузропит Фуааяг 2,0 1.6 1.8 0,20 0,04 1,00 0,7-10г 3,5-10* <10 1,8-10* 3,7- 10*

3) Изучением специфической реакции агглютинации конидий исходных родительских и фуаантного штаммов лектином чечевицы, показавшим различие в углеводном составе клеточной стенки данных культур.

4) Исследованием биохимических характеристик (термостабильности, способности адсорбироваться на цедлплозе и чувствительности к ингибироваяига продуктами гидролиза целлюлозы для эндо-1,4-_/?-глюканаз исходных родительских и фуэантной культур) » представленных в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, фузант секретирует эндоглюканазу с повышенной термостабильностью (при 65" С) и поникениой чувствительностью к ингибированим коне.чнш продуктом гидролиза целлюлозы, целлобиозой ( 26 мин и К;160 г/л, соответственно), по сравнению с эндоглгоканазами исходной родительской пары. Способность адсорбироваться на целлюлозе, выраженная через константу распределения Генри К,(7,1 д/г),. у эндоглюканазы фу-занта несколько выш, чем у зндоглюканазы Т. 1оп&1ЬгасЬ1а1ит и

в несколько раз превышает аналогичный показатель для Р.сЬгуво-яропит. Дать объяснение улучшению биохимических характеристик для эндоглюканазы фуаанта на данном этапе исследования не представляется возможным, так как ссылаясь на образование новой клеточной стенки, шжеы истолковать лябые факты, а для размышления на Солее глубоком уровне мы не располагаем достоверной информацией.

Таблица 4.

Биохимические характеристики эадо-1, 4-/-глхжанааи исследуемых культур.

Продуцент Время полу-инактивации, мин Константы

распределения ингибирования, К Ыихаз-лиса.Ц, г/л

К<} л/г К4, л/г г/л Ы

Т. 1оп£1Ьга-

сШаЬим 4,5 Б 40,2 0,11 4,0

Р. сЛгуноаро-

гчия ' 1.0 1,7 0,017 21,0 0,07 6,0

ЗузаНТ 26,0 7,1 0,030 106,8 0,30 3,3

6) Изучением динамики роста и секреции целлюлодитических и лигнолнтических ферментов исходных родительских и фузантной культур. Показано, что: а) рН-профиль роста фузанта в процессе культивирования отличается от рН профилей роста Т. 1оп£1ЬгааЫ-а1ит и Р. сЬтузоэроп ит, б) максимальная эндоглюканазная активность у Т. 1о^ЬгааШаЬт достигается на четвертые сутки, у Р.сЬгузоэропит - на седьмые сутки, у фуаанта - на четвертые сутки; в) максимальная целлобиазная активность достигается у Т. }оп^1ЬгасЬ1аЬит на четвертые сутки, у Р. с/тгуэозрог!ит и фуаанта - на седьмые сутки (при атом максимальный уровень секреция целлобиазы у фуаанта превышает родительский в б раз); г) дигводотические ферменты - лакказа и пероксидава секретиру-ются только культурами Р. сЛгузозропит и фузанта Шксииальные

и

лакказная и персжсидазная активности у фузанта выио, чем у Р. сЬгузозрогШт, в 5 и 1,5 раза, соответственно.

На основании этих данных можно констатировать тот факт, что динамика роста Фузанта отличается от исходных родительских штаммов и первый является более быстрорастущим грибом.

6) Изучением скорости гидролиза микрокристаллической целлюлозы и лигноцеллюлозы исходными родительскими и фузантной культурами. Как видно из таблицы 5, фузант гидролиэует МКЦ хуже, чем Т. 1ощ1ЬгасЫа1ит, но лучпе, чем Я сЬгузояропит, а лигноцеллкшозу - лучше обоих родительских штаммов. При этом показано, что продуктом гидролиаа лигноцеллюлозы культурами Р. сЪгузозрогНлп и Фузанта являются производные ванилина, тогда как в гидролизате лигноцеллюлозы, полученной действием Т. ¡огфЬгасЫаЬит, аналогичные продукты обнаружены не были.

Таблица Б.

Гидролиз микрокристаллической целлюлог ч СШО и лигноцеллюлозы (ЛЦ) родительскими и фузантной культурами.

Культура Степень конверсии субстрата за 2 суг. , 7.

МКЦ Щ

Г. 1оп21ЬгасЫа1ат 39 7

Р. сЬгузоврогтт 8 4

Фузант 19 10

Т. Jon8r. + Р. сЛгуз. 22 Б

Из литературы известно, что производные ванилина являются продуктами гидролиза дигноцеллшозы под действие« грибов бедой гнили (в том числе Р.сЬгузозропит), та есть фузант дейетая-телъно вобрал в себя свойства одного из родительских штаммов (Р. сЬтуБогрэП ит).

Таким образом, путем межродового слияния протопластов ми-целиалькых грибов нам удалось получить новый микроорганизм (фузант), отличавшийся от родительских штаммов морфологическими характеристиками, который по фенотипу схок с Т. 1оп^1ЬгасШ-аЬит, но при этом вобрал в себя способность секретировать лиг-нолитические активности, присущие Р. сЬгузоврогШт.

Кратко характеризуя новый микроорганизм, можно сказать, что фуаачт секретирует повышенный уровень лигнолитических и целлшолитических активностей, обладает улучшенными биохимическими характеристиками, гидролиаует лнгноцеллюлозу эффективнее, чем исходные родительские культуры.

Полученный нами фузантный штамм оказался жизнеспособным, стабильным и не наблюдалось реверсии в исходные родительские штаммы в течение более, чем двух лет. Соотношение лигнолити-чесютх и целлюлолигических активностей, секретируемых фузан-тоы, не менялось (»10%) за данный период исследования.

Решение задачи конструирования нового микроорганизма тем ке менее не уменьшает актуальности исследования фундаментальных проблем кинетики ферментативного гидролиза лигноцеллгалозы.

iv. необычные кинетические зйшшереосгн «кшштапшшго гидролиза цкллалоза и нуги ускорения шркгаюя стедки

процесса.

Кинетика ферментативного гидролиза целлюлозы являлась объектом исследований в ряде работ. При атом неоднократно указывалось, что она носит сложный характер и наблюдается быстрое уменьшение скорости реакции уже на небольших глубинах гидролиза, которое объясняли инактивацией фермента, ингибиро-ванием продуктам реакции, уменьшением реакционной способности субстрата. Как правило, в реальных условиях все эти причины имеют место, усложняя картину. В данной работе выбраны модельные условия процесса гидролиза, исключающие ингибирование продуктами реакции,. а также термоянагагивацшо целлшазного комплекса. В результате показано, что ферментативный гидролиз целлюлозы является двухстадийным процессом с двуш линейными участками и формально может быть описан наличием "начального

выброса", аа которым следует более медленная "стационарная стадия". При атом обнаружены две необычные гагаетические закономерности фэрмэнтативного гидролиза целлюлозы, состоящие в том, что величина начального выброса продукта (УО зависит в определенных пределах от начальной концентрации фермента по законам первого порядка (табл. 6), что исключает возможность простого трактования его как процесса разложения легкогидроли-зуемой части субстрата (ЛГЧ, 1 закономерность). "Стационарная" жч скорость (Устац.), напротив, практически не зависит от концентрации фермента (то есть наблюдается нулевой порядок по ферменту), но она прямо пропорциональна остаточной ( аа вычетом "начального выброса") концентрации субстрата.

Данные закономерности установлены как путем изменения исходных концентраций реагентов (субстрата и ферментов), так и путем добавления и удаления реагентов в ходе реакции (на медленной ее стадии).

Изучение энергии активации показало, что обе стадии не контролируются диффузионными процессами (Еают. - 8 газл/мол и 9 ккал/мол для первой и второй стадий, соответственно).

Таблица б

Кинетические закономерности гидролиза ШЦ целлшазным комплексом.

ГЭГ] VI Умедл.

м« ИЕ/мл МЕ/мл' г/л-час г/л■час 7. ЛГЧ

1 0,05 0,10 0,30 0,11 8

2 0,10 0,20 0,42 0,16 10

3 0,20 0,40 0,77 0,12 25

4 0,50 1,00 1,25 0,14 35

5 0,76 1,60 1,33 0,14 39

6 1,00 2,00 1,30 0,11 43

Полученные закономерности мокнс обменить на основании предположения; высказанного Клэсовым с соавт. о том, что ферменты (прежде всего, зндоглкканазы), адсорбируясь на цэллюло-ге, в первую очередь гидролизуот участки субстрата, находящиеся в непосредственной близости от места дислокации фермента. Развивая эту.идею, можно допустить, что так как прочносорбиру-гациеся ферменты обладают малой подвижностью на поверхности целлюлозы, то гидролиз вокруг песта дислокации молекул ферментов приводит к их проникновению вглубь матрицы целлюлозы. При этом причину нулевого порядка на медленной стадии реакции можно объяснить тем, что, по-видимому, происходит локальное концентрирование ферментов.

Нами экспериментально показано, что прочиоадсорОирушиеся ферменты действительно имеют малую подвижность на поверхности целлюлоза Опыт проводился при низкой (0,2 ед/мл зндоглюканаз-ной активности) и высокой, насыщающей (1,0 ед/мл) концентрациях фермента, при которых поверхностные дефекты целлюлозы были, соответственно, частично или полностью заполнены ферментом. После выхода гидролиза на медленную стадии в систему добавляли фермент с андоглюканаяиой активностью 0,2 ед/мл (рис.2). При атом наблюдалось резкое увеличение накопления продукта в первом случае (кривая а) и отсутствие изменений во втором случае (кривая б), V

12

10

8

б

4

2

О

глюкоза, г/л*час

„ Рис. 2. Накопление jEr продукта при гидролизе ЩЩ целлвлазнш Д4'комплексом с активностью зндоглккаяаэ! 0,2 ед/нл (<а) и 1,< ед/мл (©). Через I часов гидролиза до бавлек фермент с are тивностью ЗГ О,: ед/мл (и иХ).

12

16 20 24 20 час

По-видимому, ферменты, заполняя дефект ь структура ■ целлюлозы, гидролизуот их, проникая при этом Еглубь матрицы, что осложняет их переход на ноьыз, легкогидролиэуемые участки целлюлозы, тогда как добавка свежей порции фермента приводит к заполнению вакантных дефектных областей субстрата и, как следствие, к новому всплеску накопления продуктов (кривая а). Причина отсутствия подобного всплеска для насыщающей концентрации фермента (кривая б) состоит вероятно в том, что все дефектные области кристаллической целлюлозы уле изначально заполнены ферментом.

Эта модель позволяет объяснить таккэ зависимость скорости реакции гидролиза на медленной его стадии от концентрации субстрата, которая является линейной в интервала исследованных концентраций ШЩ (до 30 г/л) тем, что количество дефектных областей на поверхности целлюлозы, в которых затем концентрируется фермент, пропорционально количеству цэллшоаы.

Обнаружение зависимости нулевого порядка по феркенту на медленной стадии ферментативного гидролиза очень вагено с технологической тоща! зрения, так как позволяет отделять ферменты, находякиеся в неадсорбировашгом состоянии в растворе и использовать их повторно по завершении быстрой стадии процесса. Для проверки этого предположения Сил сделан следующий опыт. Ка медленной стадии реакции, через В часов гидролиза, фермзнты, находящиеся в растворе, были отделены вместе с продуктами реакции (следует капсьягать, что опыты проводились в условиях отсутствия ингибирования продукта»« реакции), и к непрореагировавшеыу остатку субстрата с адсорбированными на нем ферментами был добавлен буфер с целлобиаэой (так как основное ее количество остается в растворе) и продолжен гидролиз, результаты которого представлены в таблице 6. После приведения стационарных скоростей к единой начальной концентрации субстрата видно, что на второй стадии нуязн только адсорбированный на субстрате фэрькнт. Отделенный от непрореагироваваэго остатка субстрата фа рентный раствор мохе? быть эффективно использован для новой порции субстрата.

Таблица б

Сравнение скоростей гидролиза ЫКЦ на медленной стадии полным целлюлаэнш комплексом (Н 1,2) и только прочно сорбирующейся его фракцией (И 3,4).

Умедл. ,

N £ЭП [ЦБ1 Особые условия- Умедл. привед. к

п/п ед/мд ед/мл из опыта СБЗисх. =1бг/л

1 0,2 0,4 0,19 0,23

г 1,0 2,0 - 0,20 0,28

фермент отделен

3 0,2 0,4 через 8 часов 0,24 0,2?

фермент отделен

4 1.0 2,0 через 8 часов 0,15 0,25

Исходя из того, что скорость ферментативного гидролиза на медленной стадии линейно зависит от концентрации субстрата (в изученном диапазоне концентраций) и не зависит от концентрации фермента, было логичным испытать возможность ускорения медленной стадии путем концентрирования субстрата. .Для этого па окончании Выстрой стадии гидролиза и отделения раствора фермента от остатка целлшоаы последний был сконцентрирован в 5,5 раза и дальнейший гидролиз осуществлялся с участием только адсорбированного на субстрате фермента. Из данных, представленных на рисунке 3, ~ видно, что скорость гидролиза при этой возросла в Б раз (кривая, а) по сравнения с ячейкой, в которой фермент не отделялся и концентрация субстрата не изменялась (кривая С). 0а 26 часов гидролиза в ячейке с исходной концентрацией ЫКЦ 65 хул под действием только адсорбированных ферментов достигнута степень конверсии, равная 60Х (кривая б).

Рис. 3 Сравнение гидролиза 1ШЦ на медленной стадии:

а) полным целлшазным комплексом, С1ОД] в начале этой стадии равна 7,3 г/л

б) только адсорбированный на остатке целлюлозы ферментным комплексом, субстрат сконцентрирован при это« а 5,5 раз, г. е. ПЛОД равна 40 г/л.

Бее вышеизложенное было сделано на модельном субстрате -ЩЩ. Затем эти приемы были перенесены на ферментативный гидролиз естественного сырья - предобработанной методом сульфитной варки, частично делигнифицированной древесины тополя. Показано, что закономерности, полученные на чистой целлюлозе, в целом сохранятся для натурального целлюловоссдеркшдего сырья (небольшие нарушения закономерностей вызваны, по-видимому, наличием лигнина, который является необратимым ингибитором эн-доглюканавы).

вшода

1. Разработаны эффективные методы получения протопластов из мицелия грибов, относящихся к классам дейгеромицзтов С ТП-с/вСеглв ¡ог.^ЬгасМаЬит ) и базидиошцетов ( РЫпзгосЬаёЬэ сЬтувоёропит, PJeurotus заЦрпиз ), в результате чего достигнут достаточно высокий выход протопластов: 8-105/мл-3 часа, 5,4- 10в/мл-3 часа и 4-10?/мл-2 часа, соответственно.

2. Осуществлено межродовое слияние протопластов грибов, принадлежащих к разним масса«: дейтеромицетам (Г. 1оп.£1ЬгасШ-Ьиа ) и багидиоыицетам (Р. с£гу$озропит ). Показано, что подученный фузангный игами стабилен, жизнеспособен и не распадается на исходные родительские н-гаммы в течение более, чем двух лет.

10 8 б 4 2

40г глюкоза, г/л час

- 20

У/

/ ъ/

- в р

J_1_I_I_I_1_1_1_I_и_ц

10

20

3. Получение рекомОинантной культуры доказано изучением морфологических свойств, скорости агглютинации конидий лекти-нами, ферментативных активностей и биохимических характеристик исходных родительских и фуагштаого. итаммов.

Рекомбинантнал культура секретирует сбалансированный по цеялхыголитическим; и лигнолитическим активностям ферментный комплекс, который деградирует лигноцеллюлозу эффективнее, чем ферментные комплексы родительских культур.

4. Показано, что ферментативный гидролиэ целлюлозы носит двухстадийный характер, причем зависимость скорости реакции от концентрации фермента и субстрата на рааных стадиях различна. Наличие зависимости нулевого порядка по ферменту и первого порядка по субстрату ка медленной стадии гидролиза позволяет ускорять процесс путем концентрирования субстрата.

Б. Продемонстрировано, что на медленной стадии гидролиза целлюлозы необходим только адсорбированный на субстрате фермент, тогда как неадсорбироваяЕЫй фермент мо.чат быть отделен и использован повторно.

сшш отуишкпв&шшх рдшг.

1. Нуцубидзе Е Е , Прабакаран К, Образцова НЕ, Демина &А., Юн Дек Су, Гернет М. В. , Элисашвили Е Я , Клесов А. А. Получение протопластов базидиомицетоз Р1еигоЫ5 ostгeatus, РЬа-г&гссЬаеЬе сПгузозропил и дейтеромицетов ТпОткЗегт гееве!, Тпс1хх1ег1ш 1оп?1ЬггсЫаЫ1п // Прикл. биохим. микробиол. - 1990. - т. 26, в. а - С. 409 - 413.

2. Нуцубидзе II Е , Дахтин В. И., Обраацова И. Е , Демина В. А., Щрикова Д. II О возиожости вдеятификащи микроорганизмов по старости их агглютинации лектинами. // Прикл. биохим. микроОвол. - 1991. - т. 27, Б. 2. - О. 274 - 278.

3. Цуцубидзе II Е , Прабакаран К., Образцова И. Е , Демина В. А., Куликова • И. В., Клесов А. А. Кзхродовое слияние протопластов ТПс1хх1егт 1оп&1ЬгасЫа1ит и РЬапегосЬазЬо сЬгувозро-г.'шя // Докл. АН ССОР. - 1991. - т. 316,Ко. - С. 143 - 145.

4. Образцова И. Е , Цуцубидаё Е Е , Прабакаран К., Дем5ша Б. А., Гернет !£ В. излучение и слияние протопластов грибов, продуцентов лягколитйчвеких я целлшолитических ферментов //

Биохимия. - 1991. - т. 56,п. б. - С. 1018 - 102Г).

5. Шевич Е. И. , Советников К П., Шпошрешта Е Е , Плюсов к. А. , Образцова 11 Н., Вондаревсгля S. Г., Горгельчаи ¡1 <0зрмаи-тативная гидролизуемость целязсдозно - буиаиной пшш, обработанной мощными импульсами тока // В сб.: Сольскохоэ. ».»ашшгаетр.

- 1990. - т. 62, в. 1. - С. 25 - 32.

о. Пуцубидае Н. Е , Прабакаран 1С , Д?афзрава А. П., Образцова IIIL , Дешша Е А., Клесов А. А. Способ получения гибридных 1сультур грибов // Авторское свидетельство СССР N 1БМ799 Ш N 7, 1990 г.

7. Образцова И. 11 , Нуцубидзе IL Н , Демииа Е А. Получение и слияние протопластов целлюлолиигааских и лигнолитичееких грибов // В сб,: Тезисы докладов VI Всесоюзного симпозиума по инженерной знзиыологии. - Каунас, 1988. - С. 121.

8. Образцова It IL Аномальные закономерности гидролиза микрокристаллической целлюлозы целлилазным препаратом Г. reesei // В сб.: Тезисы докладов конференции молодых ученых "Современные проблемы биотехнологии шкрооргаяизмов". - Рига, 1987.

- С. 63.

9. Образцова И. Е, Нуцубндге ЕЕ,' Джафарова А. Е , Демина Е А., Юн Дек Су, Клесов А. А. Получение и слияние протопластов различных грибов // В сб.: Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами", - Таз-тент, 1088. - С. 118.

10. Nutsubidze N., Prabakaran К., Obraztsova I., Jafarova A., Dyomina V., Klyosov A. The intergenetic fusion between protoplasts of taxonomically distant fungal organisms // In ргсю. V-th Sci. Syix Soc. Countries Bictecnology, Hungary, Sept., 1989, KffESZ Hazinyonda, Budapest. P. 129.

11. Образцова И. К., Дешша 3. А., te Дек Су, Прабакаран К., Еуцубидзе a It Получение и слияние протопластов лигнолити-чешетх и целлгалолитических грибов // В сб.: Теаисы докладов III Международной школы молодых ученых. - Варна, Болгария. -1983.

12. Нуцубидве ЕЕ, Образцова И. Е , Дкафарова А. Е , Клесов А. А. Получение и слияние протопластов из различных грибов /7 В сб.: Теаисы докладов Ыаждучародвой конференции по проблемам, и перспективам биотехнологии. - Братислава, Чзхо - Словакия. -1989. - С. 3-4.