Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Подходы к созданию новых продуцентов целлюлолитических и лигнолитических ферментов на основе слияния грибных протопластов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Подходы к созданию новых продуцентов целлюлолитических и лигнолитических ферментов на основе слияния грибных протопластов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК. ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ км. А.Н. БАХА.

Л

о

061 #41) V с .. 1/0 93(1 ДЕМИНА

На правах рукописи

Вера Алексеевна

УДК 577.154

ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ НОВЫХ ПРОДУЦУЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ И ЛИГНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА ОСНОВЕ СЛИЯНИЯ ГРИБНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ.

( 03.00.04-бшшшия)

Автореферат диссертации ва совсхание ученой степени

.кандидата биологических паук

Москва - 1993

Работа выполнена в лаборатории углеводов а лаборатории регуляции клеточного метаболизма ; Института биохимии им. АД. Баха РАН.

Научные руководители:

кандидат химических наук Н.Н; Нуцуб»вдзе кандвдат биоясгэтегхах наук Т.А. Белозерская Официальные оппоненты:

доктор биологэтесыа наук Оаерецковская О Л. >

доктор химических наук Румш Л.Д. Ведущее учреждение

Московский государственный университет «а. М.В. Ломоносова, Химический факультет

Защита диссертации соскипсч ¿ъ^Ь& А/У? 1993 года в 10 час. на заседании спецнализарованзого совета К 002.96.01 по присуждению учеаой степени кандидата наук в Институте бяохюлш вы. А.Н. Бахг РАН (117071, Москва, Леншозш проспект, 33, корп. 2)

С диссертацией ыожпо озагхожться с библиотеке биологической литературы РАН (Москва,Ленинский проспект, 33, кора.1).

Автореферат разослан 1993 года.

Ученый секретгрь след. совета

доктор биологпчесзж наух М.М. Молчанов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМА Одной из актуальных проблем, современной биотехнологии ¡maseres утилизация лвгноцеллгалозных сельскохозяйственных и промышленных отходов и превращение их путем микробной хонверски s метаболиты для пищевой, химической и целлюлозно-бумажной промыголенвостк, к вей тесно примыхает и другая задача - получение обогащенных белками, легхоусваяваемыми углеводами и физиологически активными веществами кормов для животных. Успешная реализация вышеуказанной задачи затруднена рядом недостатков, присущих лнгнолитвческим и дсллюлолнтичгским ферментам, участвующим в процессе биоконверсии: низкой тер-мостабальностъю, низким сродством к субстрату и повышенной чувствительностью к инпгбированию продуктами гидролиза, несбалансированностью по компонентному составу лигноцедлкхлолитичесхих комплексов и т.д.

В свози с этим, возникает необходимость конструирования новых продуцентов. Среди возможных подходов перспективным является метод слияния протопластов. Дсрсворазрушающве базвдилльные грибы являются наиболее адаптированными к росту на растительном сырье, они обладают высокой проникающей способностью в древесину и внеклеточными ферментными системами, необходимыми для разложения всех ■ биополимеров субстрата, включая лигнин, который ими полностью минерализуется. Поэтому целесообразно их использование дяя получения новых продуцентов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: Целью работы являлось изучение подходов к проведению процесса слияния протопластов прототрофных культур для конструирования продуцентов, обладающих ферментным комплексом, сбалансированным по лигнолитическим и целлюлолитичесхим активностям, а также решение ряда экспериментально-методических вопросов, связанных с клеточной инженерией грибов.

Для достижения поставленных целей необходимо было реплпъ следующие задачи:

- исследовать влияние ряда стероидных сапонинов на функциональные характеристики мембран грибов на примере Н^-АТФазы Neurospora arassa, ках тест-ферментного объекта; . ,

- исследовать литопеялюлалвттесаш комплекс ферментов базиднальньэ; грибов белой гнили: Panas tigrinus, Pleurotus ostreatus в Phanerochaele chtysosporiumr,

- подобрать оптимальные условия культивирования продуцента Р. tigrinus, обеспечивающие максимальный уровень секреции изучаемых ферментов;

d

^ -

Í

- подобрать оптимальные условия протопласгврования ыицелиальньсс грибов Р. tigrinus и PL ostrcztus;

- исследовлп» изогнзгмиыи состав эндо-1,4-^'-глнкавгз клэто» родительских и фузангных культур, г тагже кинетики их агглютинации лектином чечевицы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ: Впервые изучено влияние стероидных глихо-зидоз (дшитошша, деяьтошша, дельтофолнна в дельтозвда) на Н+-АТФазяую активность как плазматической, так и ьаггохсндркальной мембран jV. crassa.

Исследовав литоцеялюлсдятическяй комплекс фермеитоз базидиокицетов Р. tigrinus, PL ostreaUis я Ph. chysasporium.

Разработаны оптимальные условия культивирования гриба Р. tigrinus, обеспечивающие максимальней уровень секреци: изучаемых ферментов.

Подобран оптнмажоые условия получения протопластов из мицелия Р. tigrinus и PL osireaius.

Показано, что эгсспресс-мегод изучения кинетики агглютинации и метод иссле-дозания изозизпм^ого состава родительских культур и продуктов их слияния с уезехом мохегт был применен для скразкпга и пдентификации полученных фузаютых культур.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБО ТЫ: Разработаны пояхепы выявления партнеров для получения продуцентов ферментных комплексов, сбалансированных по . лигаалитическим с целлюлолигачески.« ферменты, которые мог/т быть в дальнейшем ч;епсльзован±4 ь лаборвгорвей простяке. ' *.. :

. Результаты изучения влияла стере вдикхсаюкхЕов аа плазматическую мемб-. ■ рану могут быть применены для овпют эацагя' процесса слияязм протопластов гргбов, относящихсяктаксошмапсскяовдлеЕХымродам. ' .

' АПРОБАЦИЯ РАВОТЫ: Осшмвые результаты работа были представлены '■■¡12 III Международной шхоле кедодщ учельос "Автоматизация бяотехнологвчесхих процессоз и биотехнологичеспа экспериментов" (Варна, Болгария .1988), IV Всесоюзной козференции 'Беосикгез ферменте? микроорганизма»«" (Ташкент, 1588), VI Всесоюзном симпозиуме по апжеаерпей эвзгкояогни ( Каунас, 198S), V-tb Sci.Syznp.Soc.Coun tries Biotechocíogy ( Hungsry, Budapest, 1989), Всесоюзной конференции "Дсспскекая биотехнологии Агропромышленному комплексу" (Черпоп'к, 1Э91).

£

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам днссертгции огту&тикомяо 12 печатных рзбот ( 5 статей, б тезисов и 1 азторсхол свидетелылко N 1544799 ПИ N.7,1990 г.).

ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертаяиозная работа состоит вз введения, трех глав обзора литературы, экспериментальной части, четырех клав, в которых излагаются результаты исследования и юс обсухдение, выводов, списка литературы (242 жшменования). Работа изложена на 143 страницах, включает 15 рисунков, 14 таблиц и 1 схему.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛНАК ЧАСТЬ.

■МЛТРРИЛДНЛ МЕТРДМИСШДОЕАЩЯ-

Объектами исследования были базидиомицеты, относящиеся к грибам белой гнили и обладающие широким спектром лигнолитяческих и целлюлолитических ферментативных агпшностей. Наин была исследованы P. tigrmus, PL ostreatus и Ph. chrysosporium, • относящиеся к этой группе базидиалъных грибов. А таххе дейтеро-мицеты рода Tnchoderma: Т. reesel QM9414, Т. reeseiM7, Т. longihrackiatum, аскомяце-ты N. сrassa R-2, N. crassa slime и фузантные культуры, полученные при слиянии протопластов N. crassa slime и Т. reesei QM 9414, Ph. chrysosporium и Т. tongibrachiatum.

Выделение мембран, обогащенных плазматическими и митохондриальными мембранами проводили из протопластов N. crassa R-2 по. модифицированному методу Бовмая с соавторами ( Bowman E-J.etal. 1981).

Способность конидий грибов к агглютинации лектинамм определяли по методу, предложенному Флемингом с соавторами (Flemming et.a).1985).

Эддоглюкавазную активность определяли вискозиметрическим методом (Рабинович и др. 1977), и по расщеплению растворимой окрашенной КМЦ в соответствии с методикой, описанной в работе Тихомирова с соавторами (Тихомиров и др. 1989).

За единицу целлобиазвой активности принимали активность такого количества фермента, которое приводит к гидролизу 1 мкМоль целлобиозы или образованию 2 мкМоль глюкозы за 1 минуту при инкубации с 2 мМ раствором деялобиоаы при рН 4.5 и 40? С. Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидазно-пероксидазным методом (Клесов и др. 1980). >

Активность по фильтровальной бумаге (АФБ) определяли методом Мандеяьс-

Вебера с определением восстанавливающих Сахаров по Шомодьи-Нелъсону (Клесов и др.1980).

Лигнолитячесхсе активности (лакказную, пероксидазную, Мо2+-перохсидаз-нуга) определяли на основании нзмереавя схорости накопления продуктов окисления хянона феасоп 1^34, Ганбаров, Мурадов 1987), и колориметрической реакции окисления сирингалдазява (Harlan, Obst 1973).

Определение активности Н -АТФазы во фракции, обсгащеной плазматическими и митоховдриальаыми мембранами, измерзли по методу (Белозерская-в др. 1988) с некоторыми модификациями.

Колцеа-грацшо белга определяли по методу Лоури, в соответствии с методикой (Lowiyetai. 1951).

Поскольку разработка и анализ новых методических приемов были одной Йз задач работы, использованные приемы подробнее рассмотрены в ходе изложения.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Я ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. СКРИНИНГ БАЗИДИОМИЦЕТОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ПРОДУЦЕНТОВ.

Таблица 1.

Ферментативные активности базядиомицетов Р. iigrinus, PL cstrealus, "h-chrysosporium. в сравнении с истинной цгллюлшттичесхой культурой Т. reesei.

Ферментативные активности

Продуцент целяюлоялтичесгиг лигнсяитачесжие

эндоппоканаза целлобваза лакказа, _ нероксидаза

ед/мл ед/г-л ед/ыл ед/мл

Р. iigrinus Z5xl0"3 1.7 хЮ"3 U х 10"3 0.05

PL cstreatus 7.5 х КГ* 2.2 х10"2 20.0 0.70

Ph. chrysosparium 0.10 1.8 х 10"4 5-4x10"4 2.7 х 10"2

Т. reesei . 0.46 2.0 хЮ"2 0 0

Сравнивая Р. ^пли^ и Р1 ы/геаки с модельным штаммом РК скгу$а$ропигп, необходимо отметить, что у этих культур повышен уровень лигаслвтичсских агтаево-

, _4

стей : лахказвая 1.3 х 10 и 20.0 ед/ыл, соотве1ственно, по сравнению с 5.4 х 10 ед/мл; пероксидазвая - 0.05 и 0.70 ед/мл, соответственно , против 0.027 ед/млу РИ. chrysosporiu.ni (активности измерялись по окислению гидрохинона). Необходимо отметить, что у рассматриваемых базвдиомицетов, по сравнению с истинно целлюло-литачесхим грибом Т. геехе1, существенно понижена ахтявность ключевого фермента целлюлазного комплекса - эндоглкжаяазы, но при этом в ферментном комплексе Т. гее$е '1 отсутствуют лигниназы.

Таблицах

о

Соотношение целлюлолитических и лигнолитнческих активностей Р. Ивгтиз> выращенного на средах с различными источниками угаерода.

Ферментативные активности, ед/мл

Среда Белок целлюлолитические лигнолитнческие

г/л мкг/мл АФБ ЭГ ЦБ ЛК пх

1 2 3 4 5 6 7

I

пептон 4.0

дрохзкетр. 4.0 38.6 0.01 1.4 х10"3 5.1 х 10~3 4.0 х 10"3 2.2 х 10"3 цитрус. 10.0 глюкоза 5.0 . . . П

пептон 4:0

дрох.экстр. 4.0 38.2 7.8 х Ю"3 1.6 х 10"2 9.0 х 10~2 4.0 х Ю"3 2.5 х Ю"3 цитрус. 10.0

целлобиоза 5.0 \

•д

1 г 2 3 4 ; 5 6 7

III '

пептон 4.0

дрож-охстр. 4.0 803 0.07 1.3 13 х 10"2 3.0 хЮ'2 034

цитрус. 10.0

МКЦ 10.0

IV

пептон 4.0

дрож-экстр. 4.0 22.0 0 3.9 х КГ5 3.9 х 10~3 3.8 х 10~3 0

МКЦ 10.0

АФБ - актЕЗЕОСгь по фильтровальной бумаге, ЭГ - эндоглюканаззая активность, ЦБ - целлсбиазяая активаосгь, ЛК - лакказная гк»ивность, ПХ - пероксида^Еаз активность.

Таким образом, из представленных данных явдно, что фермеятативные^хомл-лексы деррворазтгзюгающах грибов К tigrin'ts и PL ostrcatus обладают лнгнолитически-ми активностями. Уровень секреция этих комплексов*может быть повышел введением в среду различных ледукшров. - „ "

Оптимизированы условия культивирования штамма Р. tigrinus. Сравнивая полученные результаты, представленные в таблице 2,'mozho отметить, что при выращивании А tigrinus ва среде с цятруссз^м жомом.и глюкозой ( среда I), активности всех ферментов были выше, чем на контрольной среде. -Целлобиоза, внесенная вместо глюкозы ( среда Ю, приводит к значительному повышению выхода цеялобаазной я лакказной активностей ( в 17.6 и 20-0 раз, соответственно). А при замене глюкозы на МКЦ (среда III) происходит максимальная секреция всех измеряемых нами ферментов лжъоцсллюлолитического комплекса Р. tigrinus. Б качестве контроля использовали среду IV с МКЦ к качестве единственного источника углерода.

Штаммы Р. tigrinus и PI ostreatus целесообразно вспользсвак. в качестве одной из родительских культур вмбле с целлюлолитической культурой рода Trichoderma дав получения микроорганизма, способного эффективно разрушать ли. ноцеллюлозные материалы.

Поэтому следующей задачей капалось изучение возможности получения доста-очяого количества протопластов из мицелия Л //¿гшш и Р1 о$1геаш и их способно-ти регенерировать мзделий с нормальной корфалогией. -

И. ПОЛУЧЕНИЕ И РЕВЕРСИЯ ПРОТОПЛАСТОВ ИЗ ВЫСШИХ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ.

1. Получение протопластов.

Для протопласгировання брали мицелий в экспоненциальной фазе роста (40-асовой), кода еще не сформирована вторичная клеточпая стеига, прядающая клетке кесхкость, и когда он наиболее чувствителен к атаке логическими ферментами.

Для лизиса клеточной стенки использовали разработанную в лабо ратории угле-иодов Института биохимии имА-Н.Баха РАН литическую систему, созданную на основе промышленных ферментных препаратов отечественного производства: целлови-эидннаПОХ ипектофоетидинаПОХ.

Таблица 3.

Оптимальные условия протопластирования высших базндиальных грибов Р. и/рти* и Р1 о$&еа1и$.

Объект Источник Возраст рН инку- Тип и Выход

исследо- угле- мицелия, бационной конц-ция протоплаегм

вания. рода ч. среды осм. /млхЗч

стаб-ра.

Рапиз 4%-ная 40 5.0 0.7 М ' 5-5 х 106

Иёпгии глюкоза мпянит

Р1еуто1и5 4%-вая 40 6.5 0.7 М 6.8x106

озЬ-еаПи глюкоза 1 КС1

Подобраны условия, при которых данпач литгяескак система приводит к максимальному выходу протопласгох варьароьали состав среды роста мицелия, источник углерода, рН инкубационной среды, тип и концентрацию осмотического стабилизатора (табл.3). Как для Р. Чцппиз,та% и для Р1 о&еаЬя предобработка мицелия меркаптосо-едиыеииями (0.01 Ммеркаптоэтанол, 0.01 М дитиотрейтол) или добавление их в среду

роста не приводила к заметному повышению выхода протопластов.

Полученные протопласты Р. iigrinus и PL ostrearus жизнеспособны в течение 5 суток при 4° С. <; ' ■

Реверсия вгагоп-дастов-

Известно, что на процесс регенерации клеточной стенки и формирования нормального мицелия оказывают влияние разливные фгзторы: состав среды роста мнцелия, применяемая литическаясасгемз, природа осмотического стабилизатора как в ляти-ч ее ¡сой смеси, так и в регеверационней среде, введение различных добавок в среду регенерации, предобработгл кзцелия ыеркаптосоедивениями.

Процесс резерсии протопластов исследогали в лодкой и на авизованной среде Гаги с различными д;5авхам2 и осмотическими стабилизаторами.

Среда, на которой выраповамт югцслий, оказывает значительное влияние на процесс реверсии. Ссрбозз, добавленная в среду роста, оказ^лет отрицательное влияние как на процесс протопластнревання, так и на регерсню протопластов Р. iigrinus. Наилучшие результаты получена при знесеник ~ среду роста не' гшгабито-роз синтеза клеточной стеши: грябов, а есзцйсгв, стимулирующих рост мицелия, например, растворимых ллгносульфонатов (Na+солей).

Состав среды рггенергдии танке влияет аа реверсию протопластов. В качестве индукторов процесса реверсии использовали бумажную пыль, растворимые Nn+ и NH<+ соли сульфонойвс кислот (РЛС). Оптимальной для реверсии протопластов Р. iigrinus является питательная среда Гаги с 2%-ной глюкозой в качестве источника углерода, 0.05 % РЛС (На+соль) и 1-5% агара. Причем надо отметить, что образование пових колоний на среде для регенерации с добавлением солей сульфоновых кислот происходило быстрее и рея- колоний был интенсивнее, чем на среде без них. Данные показывают, что вЕесгнне бумажной пыла не влияло на реверсию протопластов. Степень реверсии как и зкоитреле для Гага+0.5 Мз*анпитсоставила 1%. Использование приема покрытия сроды (2% дли J_5 % агара) с нанесенными протопластами 0.5 %-ной агарисованной средой положительного эффекта ве дало.

В качестве осмотических стабилизаторов в среде для регенерации исследовали сахарозу, маннит, KCl и NH4C1. Степень реверсии при использовании сахарозы и KCl составила менее 1 %. При протеаластироваяии мнцелия Р. iigrinus как с JJHiCl, так и с маншггом в качестве осмотического стабилизатора в литической системе выход протопластов примерно одинаков. Однако, поскольку степень реверсци выше при использо-

вянии маннита, то для работы рекомендуется брать последний.

В таблице 4 представлено влияние состава среды роста культуры, среды для регенерации к предобработки мицелия А ¡¿¿гглиз меркаптосоедивениямн на процесс реверсии.

Таблица 4.

Влияние добавок в среду роста и в регенерационную среду и обработки мицелия Р. йрттв меркалтосоединениями на степень реверсии протопластов.

N Добавки в среде Предобработка меркалтосоединениями

п/п регене- росте без 0.01 М 0.01 м

рации обработки меркаптоэтанол 30 мин. дитиотрейтол 30 мин.

1. 0.7МШ4С1 --- <1 % <1% <1 %

2. 0.7 М

маннит ---- 1 % <1% 2%

3. 0.05%

РЛС --- 2% 2% ,1 %

4. 0.05%

РЛС - <1 % <1% <1 %

.7 М 0.05%

маннит . РЛС 7.8 % 2.7 % —

с покрытием

б. 0.7 М 0.05%

маннит РЛС 10% зл % —

Ш. СЛИЯНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ ДЕЙТЕРОМИЦЕТОВ И БАЗИДИОМИЦЕТОВ. .

Ранее иаъ&. было осуществлено межродовое слияние протопластов грибов: Т. [опрЬгасИШит к РХ (¿иуьозрогшт, N. сгаиа и 'Г. геюеь Получить стабзльные межродовые фугавты удалось благодаря введению стадии обработки стероидным рпасозвдом протопластов одного из родительских ппаммсв в общепринятую схему слияния протопластов. Поэтому в данной работе была поставлена задача - изучить влияние стероидных гликозидов иг мембраны грзбов в концентрациях, применяемых для слияния протопластов. В качестве модельного объекта исследования был выбран граб-асхо-мгцет N. сга$$а, мембраны которого изучены наиболее подробно. В качестзе тест-фср-мснток были использованы Н+-АТФазы плазматических и митохондриальнь'х мембран, которые являются превалирующими кнтегрглъш-аш белками мембран и могут слут^го показателем интаиЕэста и жизнеспособности последних (Осгрозсхяй к др. 1983, Slayman.et.al. 3959).

роз воздействии стероидных гликозидов:

Н*-АТФазы гак тесг-Фесмеятыстбглеточных структур.

На рис. 1 показано влияние исследованных спкростаноловых стероидных гликозидов - дигитоиива, дельтофолвна, деяьтонина и фуростанслового аналога последнего - дельтозада на активность К+-АТФазы метохондрий N. crassa. Как видно на рисунке, действие дельтозида на фермер существенно отличается от влияния спиростансловых сапониаов: нет акгазацьи Н+-АТФазы при малых концентрациях дельтозада и наблюдается лишь Егчначгггельное внгибароваязе фермента при концентрации сапонина 1.010.0 мкМ (махспздлъно на (14±S)%). Действие спироскшоловых сапонинов нг. фермент в исследуемых пределах концентраций (0.1 - 40.0 мхМ) носит двухфазный характер.

Молекула делыофолина также существенно отличается от молекул дигатонина и

дельтояина тем, что она более полярна за счет J5 -окси- р -метилглутаровой кислоты

Шасешнячежо и др. 1980). Этому соединению Ее свошпггкна зысохаз способность к

комплексообразоваяюо с р -оксистерикгми (Пасешначеиго и др. 1981) а, задимо, / . 1 поэтому наблюдается более слабое влияние его на Н -АТФазную активность митохонд-

риалькой мембраны при малых концентрациях (до 5.0 мхМ), показателем чего является

отсутствие выраженного пика активации (рис.1).

Í0

Рпс. 1. Влзяннг стеооидных сапонинов: дельтозида, д^ лггияина, дгльтофэлина и

дельтоклнг. ли И^-АТ Фазнуюалстненс-'.^ь ытохоидраИ Л', сгааа.

0.1 1.0 10.0 юнц-ция СГ. к«М

Рис. 2. Влияние спярспалоловых сапонинов: дигнтонина и дельтонина на

Н^-АТ Фазную ахтивность плазмалеммы N. сгоио.

Как видно на рис. 2, где показано влияние спкросганоловых сапонинов - дитато-нина и дельтонина на Н+-АТФазную активность плазиалеммы N. crassa, дигитонин в исследуемых концентрациях (0.1-30.0 мхМ) -слабее влияет на этот фермент.

Изучена кинетика взаимодействия Н+-АТФазы шшзмалеммы N. crassa дигито-нином и дельтонииом. Исследование иигибировааая АТФазвой активности дигитони-ном и дельтонииом показало, что эти сапонины не влияют на величину константы Михаэлиса, а снижают только скорость реакция. Следовательно, в обоих случаях имеет место нетривиальное (неконкурентное ) ингибироваиае. Наличие этого типа торможения, довольно редко наблюдаемого при ферментативных превращениях растворимых субстратов ( М^-АТФ для Н+-АТФазы), указывает на тот факт, что дигитонин и дель-тонин не связываются с сорбционнЫм участком актового центра, а влияют ва сам каталитический акт. Константы интибирования, определенные для дельтонина и диги-тонива близки в составляют IZO мкМ ж 13.0 мхМ.

Предположение об аналогичном действии дигктонина и дельтонина на плазма-лемму экспериментально подтверждается изучением двухкомпонентного ингабирования Н+-АТФазы N.crassa этими сапонинами. При сравнении трафика совместного ингиби- -рования фермента дититонивом и дельтонином с теоретическими прямыми, построенными по формулам зависимого я независимого цвгибироваиия ферментативной реакции (Клесов и др. 1977) можно сделать вывод о том, что наблюдается взаимозависимое торможение, т.е. оба стероидных гликозида влияют на каталитический участок активного центра Н+-АТФазы N.crassa (рис. 3).

На основании предсгавлечяых данных исследования ангибярования Н+-АТФаз-яой реахция плазмалекмы N.crassa можно заключить, что дагитонта и дельтояйи, по-видимому, злишэт на тест-фермент одинаково. Однако, судя по изменениям активности Н+-АТФазы под влиянием этих сапонинов, можно предположить, что дигктонин в конце« грациях, применявшихся нами пли слияния грибных протопластов, с наибольшей аероятпоспло сохраняет натизпостьцитоплазматической мембраны.

IV. СКРИНИНГИ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФУЗАНТОВ.

1. Изучение уччетики агглютинации клетдк

/<>.:. гипом чечевицы.

Изучена способность к агппотипацаа клетох ряда мицелиалькых грибов (Т. longibrachialum,T.reesei QM 9414, T.reesei MJ, Ph. chryscsponvra и фузантиого штамма A2-S0) , а также деух культур грибов; существующих без клеточной стеши 6V. crassa slima и фугантного ппгмш, полученного при слияние протопластов N. crassa slirm и Т. recsei) с покощыо легтина чечевицы.

На рг»с. 4 представлены кривые, характеризующие кичеткку агглютиня-гна т.о-нидий разлпчккх таиммов ро^а Tridiodemis. Как задко, скорости атглюттшацин клеток штаммов одне о рода и дахе лида О ', recsei QM 94¡4, Т. reesei MP, ргзяича-'ится меж,чу собой.

Нг риг. 5 показано нсследозаттие агглютинация клеток Т. reesei QM9414, штамма N. dime, существухяцгго без клеточаой стенки, и фузанта, полученного путг:* сле£н::х протопластоз этих двух кулиус. Видно, что фузантньш лтамм обладагт способностью к агглютинации, отличающейся от способносгл родительских культур.

Как Ридно ка рис. 5, ишетшк агглюташм лектяаоы чечевицы фузантного

штакмл А2-80 и род^.гедъетчой пары Т. ioiigtbrachiatum, Ph. chrysosporiani существенно различается между собой.

Таким образом, метод изучения процесса агглютинации -пектином чечевицы, шробироганяьш ваш, позволяет, во-первых, выявлять мехштаммовые вааличия в пределах вида для мицелиального гриба T.reesei (рис. •?), а во-вторых, проводить быстрый фузангны:: ху.тглур , 'те^/чепны^ дута* слиянии грибных протопластоз (рис. 5кб).

Специфичность взаимодействия лектииа чечевицы с поверхностью клеток грибов была доказана в экспериментах с добавлением в суспензия ¿б-метил-О-глюкопира-нозида - актаметабалита этого лектвна. Данный углевод пря конечной концентрации

а™

, 0.8 _

и 0.7

о.е .

0.5

«0.8 _

X 01 3

о с с* о

е0.7

0.6

0.5

Чи-„0.8 _

с 0.7 _

0.6 _

0.5

Рис. 4. Изучение агглютинации конидий грнбаз различных штаммов рода ТпсЬЫегта лектином чечеснцы. Условия опыта: Т.гвв5а'| ОМ 9414 25° С, концентрация лекти-

Т.гее$е1 М7 Т.(опд|ЬгасЫо!иш

Т.гввзв! аи 9414

Н.спдоа

6 вреиа, шш.

"!—I—I--- .

4 5 6 время, уин.

на-г5х)0"'М.

6 время, юн.

Рис. 5. Изучение агглютинации клеток Т. геехЦ Мсга&а и фузан-та лестном чечевицы. Условия опыта: 25 0 С, концентрация лектива - х 10*7М.

__ фузакт А2-80

РЬ.сЬгуюзропит Т.1опд1ЬгасЫо1ит

Рис. 6. Изучение агглютинации клеток фу-занта А2-80, Рк сА/уяи-опшп, Т. 1опг1Ьгаск1аХшп.

Услозия ош гтрг 25 ° С, концентрация лектина -ИхЮГ'м.

20 мМ ораггически полностью госсхзнааяивал первоначальную устойчивость суспензий конидий к агглютюыпни, т.е. процесс самопроизвольной агрегадшусоторая лаблю-далгсь до добавления лгктана.

Результаты, полученные с пгмощью изучения кривых агтлютинашя, укаывают ла перспективность использования лектаиов в работах с мяцеяиальными грибаьга для быстрого стсринкнга михрпсрганизмов.

7. Изучение изознзкмногд состава зядо-1Л-Р -ггоокзназ

тюэтателъсгтгку фузавтяого штаммов.

Выделение и частичная очасгка зкдо-1,4- ^ -глюканаз ( ЭГ) кулмуральннх жидкостей Т.1опд1ЬгссЫоЫт, РИ-скг^чо^рогтт и фузанта А2-80 проводилось по схеме 1.

Схема 1.

Общая схема выделения и очкетяя эндоглюканаз.

культургльная жидкость ----!-.--

! ттеятрнфугаровзвие 20 мин. при 40С0 об/мкя I _________1

концедтрйроишяг удырафнлырацией

Г

дегптментадаа на ДЗАЭ-сфероне

обессиливание ш акрилексе Р-6

г хрсматофокусирование на Мопо-Р

явдивидуаяышг шг^и ферлентоз, разделенных по р!

электрофорез по Лэммли в присутсгею! ДДС-Ма (анализ гомогенности, определение молекулярных масс Мг)

¿Г

Культуральные жидкости, освобожденные от мицелия и содержащие 032 ед/мл, 0.24 ед/мл и 0,52 ед/мл эндоглюканазной активности для Т. longibrachiatum, Ph. chrysosporium и фузанта А2-80, соответственно, концентрировали ультрафильтрацией; пропускали через колонку с ДЭАЭ-сферовом; а затем обессоливали хроматографией на колонхе с акрилексом Р-6. Обессоленные растворы ферментов хроматофокусировали на установке FPLC фирмы Phannacia.

Измерение эндоглюканазной активности во всех фракциях проводили с использованием окрашенной целлюлозы (ОЦ-41). Для корректности во фракциях, имеющих активность по ОЦ-41, эндоглюканазвую активность определяли вискозиметрическим методом.

Молекулярную массу и гомогенность ферментов определяли с помощью электрофореза в ПЛАТ (общая концентрация 10%) по Лэммли в присутствии додецилсуль-фата натрия.

Таблица 4.

Биохимические характеристики зндо-1,4-^ -глюканаз.

Объект Изоэлектричесхая Молсклярвая

точка масса, Mr.

Trichodema ' 4.20 78.0

longibrachiatum 4.50 57.0

4.85 47.0

5.06 42.0

Phanerochaete 4.19 44.0

chrysosporium 4.83 38.0

5.64 39.0

5.79 35.0

фузант A2-80 4.24 79.0

■v «

4.43 57-5

• 4.83 38.0

5.08 42.0

Биохимические характеристики гомогенных по данным электрофореза эндоглю-ханаз Т .1оп$1ЬгасЫаиип, Рк с/иу^охроп'цт и фузантного пггамма А2-80 даны в таблице 5.

Молекулярную массу ферментов определилп яа основании калибровочного графика. построенного в координатах ¡е Мг - длнна пробега (мм). В работе использовались маркеры молекулярной массы фирмы РЬашааа.

Как ечдео цз таблицы 5, где приведены нзоэлестркческие точки и молекулярные пассы эндоглюкаваз, секретируемых всеми тремя исследуемыми продуцентами, в изогнзимьом спектре эноглюканаз фуаанта прису гс! вук:т формы, присущие обоим родительским хуяьтурам: нзоферменты с р1 4.24, 4.43 и 5.08 идентичные нзофермьятэм Т. ¡оп&ЬгасЫМик с р! 4.20,4-50 и 5.06, и изофермент с р14.83'идектячный 'изоферменту РН. сктуъозрстглт с р14.83.

Таким образом, для подтверждения получения фугасных культур¡может быть с успехом применен анализ сзе:яра изоэнзимов эвдо-1,4-^ -глюкаяяз родительских (Т. ит&ЬгасЬШигя, РН. ckrysospcrvj.ni) п фузантного штаммов.

ВЫВОДЫ.

1. Изучение «шишяя усливий хуль—яилования на пгюдуцарозание лы-нолктаче-ос-.х л целлкзло.,штачесхях ферментои Р. и-ггЫм позволило подобрать озгамальний ссяа:. среды его культивирована*. Подобраны оптимальные условия протоплгстирова-ник уг^сгул Р. И&ииы и Р1 о&гглт, а такхг реверсии протопластами Р. иуЬгиз мидг;г?ыл:-;:ой формы. Выход пр;,~ош1астои составил 5.5 х 10® /мл х Зч и 6.8 х 106 /ыд х Зч для Р. '.¡¿ппих и РА озкемиз, соответственно; максимальный процент реверсии протопластов Р. НегЬиа -10 %. Исследовано влияние меркгптосоеди-гений на прочего регергап протопластов Р. ¡¡¿'п/ух.

2. Изучено влигние стероадйых сапонинов ашрсстанолсгого ряда (дЕгитонина, дельтониаа) на плазматическую и гдагохондргальную мембраны //.сггта помощью тест-ферментов этих мембраа, Н+-АТФаз. Показано, что дигитонин и дельтонив £вля-¡отся неконкурентными ::згвСагорямг Н+-А.ТФазк плгзмалем>.:ы. Сразиеиие :>змгнения активности Н+-.\ТФа;н под влиянием этих саяони-лов, дает оснсвдкие предполоуопъ; что д^пп-онин в когят~ятрацшсс, прямеизплхся для сляяниг грибных прптечластоя, с наибольшей вероятностью сохраняет иативность детоплазматяческой мембраны.

3. С целью скрининга и идентификации полученных фузантвых культур предаю-

жекы з^спрссс-метод изучения кинетики агглютинации клеток лектш.ом и метод исследования изаэнзимного состава родительских и фузантиых культур. Изучение изоэнзим-ного состава эндо-1,4-£ -глюканаз родительских (Г. Ьп#и>гас1ца (ит, Рк. скгу$о$ропшч) и фузантпой ( А2-80 ) культур показало, что в изоэнзи&ном спектре фузанта присутствуют 3 изоформы ЭГ с р14.24; 4.43 и 5.08, Мг которых совпадают или очень близки Мг ЭГ Т. Ьж&ЫгасЬШшп с р! 4.20; 4-50 и 5.06 и одна изэформа ЭГ с р1 4.83, Мг которой равна Мг ЭГ РК с/иузо$рогшт (р1 4.83). Т.е., по-видимому, все выделенные изоформы ЭГ фузантной культуры наследованы от родительских штаммов.

4. Изучены ферментативные лигноцеллюлолитические комплексы базидиомице-тов Р. йДОпш,' Р1 охреаии и Рк. Ыиухозроггшп. Показано, что для конструврозания нового микроорганизма, способного эффективно разрушать лигноцедлюлозу целесообразно использовать протопласты штаммов Р. И°гЬшз и Р1 ояйгеаШ, в качестве одной из родительских культур для слияния с протопластами целдюлолитического штамма Т. тееэей

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Нуцубидзе Н JL, Прабакаран К., Образцова И.Н., Дёмина В Л., Юн Дек Су, Гернет М.В., Элисашвили В.И., Клёсов АЛ. Получение протопластов базндиомицетов Pleurotus ostreatus, Phanerochaete chrysosporium и дейтеромицетов Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum. // Прикл.биохим.микробиол.-1990.- T.26.- Вьш.З.-C. 409-412.

2. Нуцубидзе H.H., Прабакаран К., Образцова И.Н., Дёмина В А., Куликова Ю.Б., Клёсов A.A. Межродовое слияние грибных протопластов Trichoderma longibrachiaium и Phanerochaete chrysosporium. II Докл-АН СССР.- 1991.- Т.316.-N б.- С. 1491-1493.

3. Нуцубидзе H.H., ЛахтинВ.М., Дёмина В.А., Образцова ИЛ., МаривозаД.Н. О возможности идентификации микроорганизмов по скорости их агглютинации лекти-нами. // Прикл-биохимликробиол.-1991.-Т.27.-ВЫП.2.-С.274-278. >

4. Образцова И.Н., Нуцубидзе H.H., Прабакаран К., Дёмина В .А., Гернет М.В. Получение и слияние протопластов грибов - продуцентов лигнолитичесхих н целлюло-литических ферментов. Биохикичесхие характеристики ферментного комплекса фузанта. //Биохимия.- 1991.- TJ6.- Вып. 6.- С. 1018-1025.

5. Нуцубидзе H.H., Образцова И.Н., Дёмина В Л., Зверева ЕЛ. Получение

протопластов базидиошздгян. белой п:илл и биохимические хараятерисгша: секретзру-îmhx фермаЕтнъ»-£ комплексов. // Пргхл.биохзм.тпсробиоя.- 1992.- T.2S.- Вып.З.-С.409-415.

6. Нуцубидзе H.H., Прабакаран К., Джафарсва А.Н., Образцова И.Н., Дём;:-на В .А., Клёсов АЛ. Способ получения гибридных культур грибоз. / / Авторское свидетельство СССР tf 1544799 БИ N7.- 1990.

7. Образцова И.Н., Дёмина В.А., Юн Дек Су, Ярабакаран К., Нуцубпдзе H.H. Получение и слгагаге протопластов лигнолзггаческих и целлмлолитическюс грибов. // В сб.: Тезисы дэклэдоз Ш Международной школы молодых ученых " Автоматизация биотехиапогачесхах процессов и биотехнологачгсхях эхсперимеятоя",- Варна, Болгария.- 1988.

8. Джафарова А.Н., Дёмина З.А., Нуцубидзе H.H. Межродовое слияние протопластов T. rcesei и N. crassa. // В сб.: Тезисы докладов Ш Международной виолы

голодьк ученых "Автоматизация бжтгхнолсгачйскях процессов и биотеддологячесхах эксперимент >з". - Еар«а, BojU'apnsr.- C.2S.

9. Образцова Й.Н., пуаубь-лзе И.К, Д-Ааф^рова A.Û., Дёмина Б.А., Юг &гг. Су, Клёсов A.A. Получение и слиякиг îr;. ггогиастов раа-"ичнкх грибов. // В сб.: Тзз:<сь( дисладо; IV Зс.-^омзноч конферечи*:: "Сно":ктез ферментов мтрооргаяиэш13!".-Тапкент,- 5388,-С. ils.

10. Образцова И.Н., Нуцубидзе H.H., Дёмкза В.А., Получение и слияние протопластов цгядахчаплгачесх^х и липкшзтичесхих грябов. // В сб.: Тезисы докладов VI Всгсоюзаого симпозиум по инженерной эйзамолегая.- Ка;ияс.- 19S8.- С. 121.

. 11. Nutîubidze N., Pmbftvaran К., Oi;razöcva L, Jafarova A., Dyomina V., Klyosov A. The iatergenetic fusion between protoplasts of îaxcnomkrily distant fungal organisms. / / In Pres. V-th Sei. Syrap. Soc. Countries Eiafcrnctojcy.- Budapest, Hungary.- 1989.- P.129.

12. Нуцубидзе H.H., Образцова ИЛ., Дёмнва S.A., Звгрева Е.А., Маринова Д.Н., Кулжсва Ю.Б. Получение и сляаЕие промиластов тахсовоыэтески отдаленних грабоз. // В сб.: Тезисы догладэс Всесоюзной гепфереадни "Достижения биотехнологии Агропромышленному soMinçzcy^Чержкэды.- 1991,- Т.1.- С. 187.