Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и некоторые характеристики мутаций, индуцирующих компетентность у бацилл

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и некоторые характеристики мутаций, индуцирующих компетентность у бацилл"

О

^ Государственный комитет Российской Федерации

V

©5 по высшему образованию

%

Казанский государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина

На правах рукописи

ВАФИН РАУФ АЛМАСОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МУТАЦИЙ, ИНДУЦИРУЮЩИХ КОМПЕТЕНТНОСТЬ У БАЦИЛЛ

03.00.07 - микробиология

Автор еферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 1997 г.

Работа выполнена в лаборатории кафедры генетики Казанского государственного университета

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Барабанщиков Б. И.

кандидат биологических наук, доцент Малков С. В.

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов КГУ Куприянова-Ашина Ф. Г.

доктор медицинских наук, доцент кафедры медицинской биологии и генетики КГМУ Семенов В. В.

Казанский институт биологии Казанского Научного Центра Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится 2. С1 ^1997 г. с I I Ч на заседании диссертационного Совета К 053.29.19. при Казанском государственном университете имени В. И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул. Ленина, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан 2 Ц -к/у 1997 ]

Ученый секретарь диссертационного Совета

Аскарова А. Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной из интересных физиологических особенностей |еток некоторых видов бацилл, и прежде всего отдельных штаммов В. subtilis, ляется способность развивать состояние компетентности. Компетентные етки способны поглощать чужеродную ДНК с последующим ее встраиванием в мологичный участок собственной хромосомы. Подобный способ обмена следственной информацией получил название генетической трансформации, звивать компетентное состояние способны лишь некоторые штаммы бацилл, [иболсс ярко этот феномен выражен у штаммов производных от Bacillus subtilis 8М. Подавляющее большинство других штаммов Bacillus subtilis ансформируется плохо или не трансформируется совсем. То же характерно и я других представителей рода Bacillus, у большинства видов которого тетическая трансформация вовсе не обнаружена. Процесс развития мпетентного состояния, его клеточный контроль и биологический смысл /чены недостаточно. Несмотря на то, что известно довольно много мутаций и зико-химических воздействий снижающих, вплоть до полного отсутствия, ;тоту генетической трансформации, нам не встречалось ни одного сообщения о ¡можности индукции компетентного состояния у видов и штаммов, в норме не тадаюших такой способностью. На кафедре генетики КГУ было показано, что аавление специфическими ингибиторами метаболизма кремния и алюминия у ;illus subtilis 168М и Bacillus mesentericus ВКМВ-74 значительно увеличивает :тоту генетической трансформации. Это позволяет предполагать, что те или 3ie нарушения метаболизма кремния и алюминия, вызванные, например, геветствующими мутациями, могут влиять на способность бацилл к етической трансформации. Для дальнейшего углубления представлений о щессах генетической трансформации, представляло значительный интерес чить возможность получения мутаций, увеличивающих частоту генетической нсформации у слаботрансформирующихся штаммов бацилл, и мутаций,

индуцирующих компетентное состояние у бацилл, в норме не способных к трансформации.

Цель исследования. Целью настоящей работы было изучение связи метаболизма кремния и алюминия с процессами генетической трансформации у бацилл.

Задачи исследования :

1.Получение мутаций, нарушающих метаболизм кремния и алюминия у В. subtilis.

2. Выяснение взаимосвязи между мутациями, нарушающими метаболизм кремния и алюминия у В. subtilis и их влиянием на процессы генетической трансформации.

3.Выяснение возможности получения мутаций, индуцирующих развитие компетентного состояния у других представителей рода Bacillus.

Научная новизна:

• Получены мутации, нарушающие метаболизм кремния и алюминия у Bacillus subtilis и показана возможность их влияния на процессы генетической трансформации.

• Обнаружен локус, обозначенный как CIN-локус, тесно сцепленный с опероном биосинтеза треонина у Bacillus subtilis , мутации по которому затрагивают развитие компетентного состояния.

• Показано, что у почвенных бацилл, в норме не трансформирующихся, возможно получение мутантов, развивающих компетентное состояние. Научно-практическая значимость. В диссертационной работе впервые

продемонстрирована возможность получения мутаций почвенных бацилл, индуцирующих состояние компетентности, показана их связь с нарушениями метаболизма кремния и алюминия, обнаружен и картирован соответствующий локус у Bacillus subtilis . Результаты работы позволяют глубже понять процессы генетической трансформации у бацилл; на их основе на кафедре генетики КГ> введен соответствующий раздел в программу большого практикума по генетт« микроорганизмов, позволяющий студентам самим получать мутантные клонь

cillus subtilis var. niger и Bacillus mycoides, развивающих компетентность, и шить с ними трансформационные скрещивания.

Из-за безвредности для человека большинства бацилл, нетребовательнности к ювиям роста и способности выделять в среду широкий спектр белков, они зают важную роль в биотехнологии. Знание механизмов индукции япетентного состояния может помочь введению в промышленную практику адв и штаммов у которых обмен генетической информацией в норме затруднен. Положения выносимые на защиту :

• Мутации, нарушающие метаболизм кремния и алюминия у Bacillus subtilis, могут влиять на процессы генетической трансформации.

• Локус CIN, мутации по которому затрагивают процессы генетической трансформации, метаболизм кремния и алюминия и ряд других свойств бациллярной клетки, тесно сцеплен у Bacillus subtilis с локусом оперона биосинтеза треонина.

» У почвенных бацилл, в норме не развивающих состояние компетентности,

возможно получение CIN-мутаций, обуславливающих его индукцию. Апробация работы. Результаты исследований были доложены на X нференции по проекту "Ферменты микроорганизмов"(Казань, 1994), на I Съезде виловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), на итоговых (Гчных конференциях КГУ (Казань, 1994, 1995, 1996).

Публикации по теме диссертации. По материалам' диссертации опубликовано 5 эот.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованные штаммы и плазмиды: В. subtilis 168М прототроф, В. subtilis 3MpurA16raetC3. В. subtilis 168MhisB2trpCj, В. subtilis SB 39-22 прототроф, В. rtilis SB 39-22 hisB2trpC2leuB, В. subtilis RUB830 pheAthyAthyBtrpC2, B. subtilis )366 tTpC2thrB5, B. mesentericus BKMB-74 прототроф, В. mesentericus BKMB-74 5"TrpB' , B. oligonitrophilus KU-1 прототроф, плазмцды pSMl(KmrTrpD"CF),

pUB 110(Kmr), pBDl 2 (Kiv'Cnf) - взяты из лабораторного музея. В. subtilis var. nig KU-3 прототроф - выделен на кафедре генетики КГУ из почв г. Себха (Ливия) данной работе. В. mycoides KU-4 Thi" - выделен из почв г. Казани на кафед] генетики КГУ в данной работе.

Выделение хромосомной ДНК проводили по модифицированному методу Кир£ (Прозоров, 1988), выделение плазмидной ДНК - щелочным способом (Birnboii Doly, 1979).

Постановку опытов по трансформации проводили по общепринятым метода (Прозоров, 1988). Картирование проводили no (Carlton, 1966). В качесп источника Si использовали кварц и кварцевый песок, AI - коммерческий препар; AJ^Oj для хроматографии (Chemapol, ЧССР), Ge - двуокись германия (ГИПО, Казань).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение штамма Bacillus subtilis var. niger KU-3 из почв г. Себха (Ливия) и изучение его способности к генетической трансформации

Путем посева почвенной суспензии на агаризованную среду Спицайзена нал бьш выделен клон, активно выделяющий в среду черный пигмент меланиновс природы. По культурально-морфологическим свойствам полученнь: микроорганизм был отнесен к группе продуцентов меланина - В. subtilis var. nigei В. mesentericus var. niger. Оказалось, что хромосомная' ДНК, выделенная i имеющегося у нас штамма-продуцента меланина, с высокой эффективность трансформирует штамм В. subtilis SB39-22 по ауксотрофным маркерам с такой и частотой, что и ДНК из прототрофного штамма В. subtilis 168М. Таким образо: имеющийся штамм-продуцент меланина был отнесен нами к В. subtilis обозначен как штамм В. subtilis var. .niger KU-3.

Поставленные нами эксперименты показали, что штамм В. subtilis var. niger Kl 3 не способен к генетической трансформации по плазмидным маркера

ггабиотикоустойчивости. С целью изучения способности штамма Ки-3 ^сформироваться посредством хромосомной ДНК нами был получен ряд ксотрофных мутантов. Лишь один из отобранных мутантов, нуждавшийся для оего роста в добавках аргинина или треонина, был способен к генетической |ансформации, хотя и с весьма низкой частотой - 1,5 х10"5. Он был обозначен как БиЫШБ \гаг. пщег ки-33.

Нашей дальнейшей задачей было получение мутантных клонов штамма В. [ЫШэ уаг. ш^ег Ки-33 с нарушением метаболизма кремния. Нам удалось ¿делить клон, который не мог расти на средах с добавками силиката (ЭЮг). Этот юн, обозначенный как В. БиЫШэ уаг. ш£ег Ки-338, кроме того, стал нуждаться га своего нормального роста в одновременной добавке аргинина и треонина, хотя отсутствии аргинина в селективной среде слабый рост и наблюдался. В гсутствии треонина размножение клеток этого клона блокировалось полностью.

Рис. 1. Влияние лизоцима на количество трансформантов у штаммов Ки-33 и

Мутация у В. эиЫШэ уаг. гнйег 1Ш-3 и ее влияние на генетическую трансформацию

6000

1 5000 . Ки-33 ;

• ки-338.

• Ки-338 ,

:и-зз8.

Оказалось, что вновь полученный мугантный клон, обозначенный нами как В бцЫШб \'аг. г^ег Ки-338, обладает довольно высокой частотой трансформации ■ 1,5 х 10"4, что на порядок больше, чем у штамма В. виЬиШ \аг. шger К11-33 Добавки лизоцима еще более увеличивали частоту трансформации (см. рис. 1).

Дальнейший анализ, проведенный с помощью трансформационны> скрещиваний, показал, что образующиеся трансформанты ТИг" одновременнс приобретали устойчивость к силикатам, сохранив слабую потребность в аргинине Это говорит о тесном сцеплении локуса ТЬг'В. эиЫШз уаг. niger К11-338 и локус; чувствительности к силикатам. Отсутствие -трансформантов и сохранение 5 ТЪг'-трансформантов аргининзависимости говорит в пользу того, что этот приз на? наследуется у В. зиЫШэ уаг. г^ег по типу длительной модификации.

Следует отметить, что в течение последующих 4-х месяцев и соответствующие пересевов культуры, штамм Ки-338 проявил тенденцию к одновременному постепенному снижению способности к трансформации и чувствительности 1 диоксиду кремния. В конце концов, спустя четыре месяца он полностью потеря; оба этих признака. Возможно, что мутация по этому локусу приводит 1 значительному снижению жизнеспособности и происходит постепенна элиминация мутантных клеток из популяции. Штамм К11-33 хотя и пoкaзывaJ меньшие величины частоты генетической трансформации, чем штамм ки-338, и в был чувствителен к диоксиду кремния, также постепенно потерял способност] трансформироваться. Выше уже говорилось о тесном сцеплении локусо: силикатчувствительности и потребности в треонине. Возможно, штамм КЬТ-33 не мутацию не только в локусе зависимости от треонина, но ив рядом расположенно; участке, влияющем на индукцию компетентности. Вероятно, штамм Ки-338 не дополнительную мутацию в этом блоке, что проявилось в чувствительности диоксиду кремния и повышенной частоте генетической трансформации.

Мутации, нарушающие метаболизм кремния и алюминия у В. эиЫШя \аг. ш£ег К11-338, и их влияние на генетическую трансформацию

На следующем этапе работы ставилась задача получения новых мугантных [иний, т.к. штаммы КЬ'-ЗЗ и Ки-338 полностью потеряли способность к енетической трансформации.

Первоначально было отобрано 24 клона штамма В. эиЫШз \'аг. шдег Ки-338 с юзличными нарушениями роста на селективных средах с диоксидом кремния и 1кисью алюминия. Все отобранные клоны проявили значительную нестабильность [ризнаков в ходе последующих пассажей. Большая часть из них ревертировала к юрме. После нескольких проверок было отобрано 8 клонов проявляющих увствительность к диоксиду кремния и 2 алюминийчувствительных клона. Далее, [роводились опыты по их трансформации.

Надо отметить, что клоны с наибольшей чувствительностью к диоксиду кремния рансформантов не дали. Алюминийчувствительные клоны трансформировались с изкой частотой - 1x10"6. К эффективной трансформации проявили способность лоны со слабой силикатчувствительностью, которые, кроме того, обладали сниженной жизнеспособностью. Частота трансформации в этом случае достигала х10"3. В качестве реципиентов эти клоны оказались способными и к спонтанной рансформации, в том числе и по плазмидным маркерам (табл. 1).

Изложенные данные позволяют заключить, что способность развивать омпетентное состояние у В. здЫШб \'аг. коррелирует с признаком

иликатчувствительности и алюминийчувствительности. Чувствительность клонов силикатам и окиси алюминия быстро снижается, вероятно, вследствие егативного влияния этого признака на жизнеспособность клеток, одновременно адает способность к генетической трансформации, вплоть до полного отсутствия азвития компетентного состояния.

Таблица 1

Перенос хромосомных и плазмидных маркеров при спонтанной трансформации между силикатчувствитсльными клонами В. БиЫШэ уаг. ш§ег К1Г-3 и В. БиЫШэ {ШВ830.

Реципиент Число трансформантов в 1 мл по маркерам

Km' Cm' Thr+

KU-387 62 0 2617

KU-3815 3024 40 .400120

KU-3831 713 0 40080

Генетический блок, мутации по которому приводят к нарушению метаболизма кремния и алюминия, к появлению способности развивать компетентное состояние , у В. subtilis var. niger и тесно сцепленный с опероном биосинтеза треонина (см. . ниже), мы обозначили как CIN-локус (от англ. "competence induction").

Перенос мутантиого блока CIN-Thr* В. subtilis var. niger KU-3 в штамм В. subtilis SB39-22 и его влияние на развитие компетентности у последнего

Нами были проведены эксперименты по переносу изучаемых мутаций в типовой штамм В. subtilis и анализу их влияния на частоту генетической трансформации у него. В качестве реципиента использовался штамм В. subtilis SB39-22 hisBatrpCjIeuB, в качестве доноров - штаммы В. subtilis var. niger KU-3820 и KU-3815, проявлявшие сшшкатчувствительность, аргинин- и треонинпотребность, и высокую частоту генетической трансформации.

Анализ полученных нами рекомбинантных клонов В. subtilis SB39-22, получивших маркеры ArgThr и Sis от В. subtilis var. niger, показал, что первое время частота трансформации у них практически не изменялась. Через четыре месяца хранения из 10 полученных нами клонов лишь один сохранил переданный

от В. subtilis van niger маркер Thr". Маркеры Arg" и Si! при этом не сохранились. У остальных 9 клонов маркеры Arg'Thr ревергировали к прототрофности, отношение к S1O2 также вернулось к норме. Маркеры HisB+, ТгрС+ и LeuB+, переданные от В. subtilis var. niger сохранились стабильно.

Оставшийся у нас клон В. subtilis SB39-22 фенотипа HisBj'LeuB' TrpC2+Thr" постепенно потерял способность расти на КА без добавок А12Оз, т.е. вел себя, как имеющий маркер AI". Введение в КА А120з приводило к тому, что его субклоны получали взможность при ряде дальнейших пересевов расти на полноценной агаризованной среде без окиси алюминия. Отношение к SiOj было нейтральным. Интересно, что у одного из трех AI" субклонов (которые мы изучали параллельно) частота трансформации по сравнению с исходным штаммом В. subtilis SB39-22 и двумя остальными субклонами возрастала в 15-20 раз (в то время, как число жизнеспособных клеток падало до 2x107 в 1 мл).

Надо отметить, что спустя еще полтора месяца, все три субклона В. subtilis SB39-22, несущие мутантный CIN-локус В. subtilis var. niger, полностью потеряли способность трансформироваться и больше ее не восстанавливали.

Некоторые характеристики мутантов по локусу CIN В. subtilis SB39-22

Нами было показано, что мутации, затрагивающие метаболизм кремния и алюминия и изменяющие способность к развитию компетентного состояния у В. subtilis var. niger, коррелируют с нарушениями метаболизма аргинина и треонина.

В тоже время, согласно генетической карте Е. coli (Bachman, 1983; Gusalus et al., 1979; Lemer, Zinder, 1981; Roeder, Somerville, 1979) с районом оперона биосинтеза треонина тесно сцеплен полифункциональный локус, контролирующий ряд признаков. Это: fex А- контроль синтеза F - волосков, коньюгационной активности донора и феномена поверхностного исключения; sfrA - измененные свойства клеточной оболочки, включая устойчивость к некоторым антибиотикам и детергентам; dye - устойчивость или чувствительность к метиленовому синему;

msp - устойчивость или чувствительность штаммов к фагам R17 и Ми2, специфическим к мужским клеткам, cet - устойчивость к колицину Е2; seg -контроль репликации факторов F. Исходя из закона гомологических рядов Н. И. Вавилова, можно было с известной долей вероятности предполагать, что подобный полифункциональный локус имеется и у В. subtilis , возможно также в тесной связи с локусом оперона треонина. При этом детерминируемая этим локусом функция fexA Е. coli, возможно, гомологична функции "контроля индукции компетентности" у В. subtilis var. niger или CIN - детерминанту ( от английского "competence induction")- Если справедливо это предположение, то у штаммов В. subtilis , несущих мутантный локус CIN, высока вероятность обнаружения и остальных мутантных признаков, гомологичных функциям Е. coli.

Оказалось, что мутации по CIN-локусу В. subtilis var. niger при переносе их (совместно с Tbr'J в типовой штамм В. subtilis SB39-22 могут быть причиной появления у рекомбинантных клонов следующих фенотипических признаков: силикат-чувствительность, через определенное время сменяющаяся алюминийзависимостъю; устойчивость к метиленовому синему и способность интенсивно окрашиваться им на агаризованной среде; выделение в среду кристаллических образований; слабая устойчивость к хлорамфениколу, слабая потребность в аргинине, устойчивость к стрептомицину. Причем два последних признака можно рассматривать, как результат нарушения обмена гуанидиновых производных. Кроме того, клоны В. subtilis SB39-22, несущие мутантный СШ-блок В. subtilis var. niger полностью потеряли способность к трансформации.

Наличие у CIN-мутантов признака стрептомицинустойчивости, тесно сцепленного с треониновым опероном, позволило нам отбирать ClN-мутации по удобному маркеру Strr (с последующей проверкой по маркеру Thr"). Отобранные таким образом непосредственно у В. subtilis SB39-22 CIN-мутации также приводили к постепенной потере способности развивать компетентное состояние: через 2,5 месяца отобранные нами клоны полностью потеряли способность трансформироваться

Картирование СШ-локуса у В. виЫШв

Чтобы удостовериться в сделанных нами выводах о тесном сцеплении СШ-локуса и оперона биосинтеза треонина у В. виЬпИв, мы провели ряд экспериментов по картированию у полученных нами СШ-мутантов В. виЬпНз 5В39-22 и В. яиЫШв уаг. г^ег Ки-3. Все они показали сцепленное наследование треонинзависимости и признаков, определяемых мутациями по СШ-локусу, при трансформационных скрещиваниях. Сами мутации треонинзависимости были картированы в районе оперона биосинтеза треонина (см. рис.. 2).

81гг Шг^ -10% (ЬгВ^ -10% <Ьг^я Ит<)_ Рис. 2. Линейное расположение полученных нами мутаций на хромосоме

Выделение В. шусо1Йе8 К11-4

Путем рассева почвенной суспензии на полноценную среду (КА) нами был выделен клон, идентифицированный по морфологическим свойствам, как В. туеске. Он получил обозначение В. тусо{с1е5 К11-4. Этот штамм, как и большинство штаммов В. ту^ёев, выделяемых из природных источников, был гиаминзависимым. Кроме того, данный штамм не был способен к росту на жидких и твердых средах, применяемых в лаборатории, при температуре +37 С, хотя хорошо рос при +28°С. У В. тусо1(1ез способность развивать компетентное состояние не известна.

Получение CIN-мутантов у В. mycoides KU-4 и изучение их способности к генетическом трансформации

После обработки нитрозогуанидином штамма В. mycoides KU-4, мы отбирали мутантные клоны с фенотипическими признаками, характерными для CIN-мутантов. Из 32 Str'-клонов,: устойчивых к невысоким концентрациям стрептомицина в среде (7 мкг/мл),пять клонов оказались зависимыми от добавок в питательную среду аргинина и треонина. Изменений чувствительности к метиленовому синему и хлорамфениколу не наблюдалось, поскольку исходный штамм KU-4 активно разрушает Метиленовый синий и выдерживает до 10 мкг/мл хлорамфеникола в агаризованной среде.

Предполагая, что у клонов, несущих признаки стрептомицинустойчивости, аргинин- и треонинзависимости, изменен локус CIN, можно было предполагать и изменения в способности развивать компетентное состояние. Как показала проверка, то 5 отобранных мутантов 3 клона оказались способными к генетической трансформации посредством хромосомной ДНК по маркеру Str1 (30 мкг/мл) (см. табл. 2). .

Необходимо отметить, что способность развивать компетентность у мутантных клонов В. mycoides KU-4 быстро падала. К исходу второй недели анализа, клоны В. mycoides KU-41 и KU-415 полностью потеряли способность трансформироваться. Клон В. mycoides KU-43 проявлял только очень низкую компетентность - частота трансформации цри этом у него упала до 0,2 х10-6 (40-45 трансформантов в 1 мл). В дальнейшем, клон полностью потерял способность трансформироваться. При этом, хотя устойчивость к стрептомицину (7 мкг/мл ) и сохранилась, аргинин- и треонинзависимость исчезли. Сходные феномены наблюдались ранее у CIN-мутантов В. subtilis var. niger KU-3 и клонов-рекомбинантов В. subtilis 168М. несущих CIN-локус этой почвенной бациллы, а также CIN-мутантов В. subtilis 168М (хотя у них способность развивать компетентность падает гораздс медленнее).

Таким образом, способность клона В, туамскз развивать компетентность быстро падала и к исходу второй недели анализа практически полностью исчезла.

Таблица 2

Способность к генетической трансформации посредством хромосомной гомологичной ДНК мутантных клонов В. тусо1(1е8 К11-4, проявляющих фенотипические признаки характерные для СШ-локуса.

Клон Число Частота Число Частота

трансформантов трансформации трансформантов трансформации

Би-' (15 мкг/мл) в ТЬг+ в 1 мл 1 мл

Кй-41 ...........140.........:...............................07x10^..............................................'0..................................-.........0.......................

Ки-42 0 0 0 0

Ки-43 420 0,2 хЮ"5 0 0

Ки-410 0 0 0 0

Ки-415 620 0,3 хЮ"5 0 0

Примечание: 1) использовали хромосомную ДНК клона В. ту^йеэ Ки-44 (30 мкг/мл), Сксн=10 мкг/мл;

Получение С11Ч-мутантов у В. теве^епсив и изучение их способности к генетической трансформации

Нами было отобрано и проверено на способность к генетической трансформации 33 мутантных клона В. теэемепсш ВКМВ-74 Н^ТгрВ', имеющих фенотипические признаки характерные для СШ-мутантов.

Оказалось, что большая часть таких клонов имеет пониженную на 1-2 порядка способность к генетической трансформации, или не трансформируется совсем. Лишь 4 мутантных клона из 33 отобранных показывали частоту генетической трансформации, сравнимую с таковой у исходного штамма - 0,7-1 хЮ . В течение месяца признаки зависимости от аргинина и треонина у всех изученных мутантов

вернулись к норме, в то время как признак устойчивости к стрептомицину был более стабильным. Способность к генетической трансформации у CIN-мутантов В. mesentericus, при реверсиях к прототрофности по аргинину и треонину и сохранении устойчивости к стрептомицину, не восстанавливалась. Суммируя выше изложенное, можно сказать, что CIN-мутангы у В. mesentericus ВКМВ-74 имеют пониженную частоту генетической трансформации или не трансформируются совсем.

Получение CIN-мутантов у В. oligonitrophilus и изучение их способности к генетической трансформации.

Bacillus oligonitrophilus - представитель так называемых силикатных бактерий, разновидности Bacillus mucilaginosus. Эти микроорганизмы, как считают некоторые авторы (Харвуд, 1992), стоят на филогенетическом древе бацилл достаточно далеко от группы В. subtilis - В. mesentericus. В результате обработки нитрозогуакидином исходного штамма В. oligonitrophilus KU-1, нами был отобран мутантный клон KU-14, имевший следующие, характерные для CIN-мутантов, признаки: слабая потребность в аргинине и облигатная зависимость от треонина, устойчивость к стрептомицину и невысоким концентрациям хлорамфеникола. У этого клона при помощи нитрозогуанидина, мы индуцировали несколько десятков мутантов с измененным метаболизмом кремния и алюминия (потребность при росте на агаризованной среде в S1O2 или АЦСЬ или чувствительность к ним) и проверили их на способность трансформироваться прототрофной гомологичной ДНК. Ни один из 42 мутантных клонов не проявил способности к трансформации. По всей вероятности, это отражает особенности данной группы бацилл, отстоящих, как говорилось выше, достаточно далеко на эволюционном древе от группы В. subtilis - В. mesentericus.

ВЫВОДЫ

1. Получены мутации, влияющие на метаболизм алюминия и кремния в клетках Bacillus subtilis. Показано, что такие мутации могут индуцировать развитие компетентности у штамма Bacillus subtilis var. niger KU-3, исходно не способного к трансформации. "У лабораторного штамма Bacillus subtilis 168М подобные мутации вызывали постепенное снижение частоты генетической трансформации и, в дальнейшем, полное подавление этого процесса.

2. У различных штаммов Bacillus subtilis впервые были индуцированы с помощью нитрозогуанидина мутации в локусе CIN, тесно сцепленные с опероном биосинтеза треонина и обладающие плейотропным действием, что проявляется в изменении чувствительности клеток к стрептомицину, хлорамфениколу и 'метиленовому синему, нарушениях метаболизма кремния и алюминия и изменeiam способности к генетической трансформации.

3. Мутации CIN были индуцированы в клетках различных представителей рода Bacillus и было показано их влияние на развитие состояния компетентности, В клетках штамма Bacillus mycoides KU-4, исходно не способного к генетической трансформации, эти мутации индуцировали развитие компетентности. У штамма Bacillus mesentericus ВКМВ-74 при наличии мутации CIN снижалась частота трансформации. Мутации CIN не индуцировали развитие состояния компетентности у штамма Bacillus oligonitrophilus KU-1, в норме не обладающего такой способностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Вафин Р. А. Генетическая трансформация у В. зцЫШб уаг. niger //Материалы 1 съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС).-1994- с.25.

2. Малков С. В., Барабанщиков Б. И., Вафин Р. А., Хисаметдинов М. Р., Джанга А. А. Генетическая трансформация у В. виЫШв уаг. 1%ег / Казанск. гос. ун-т. Казань, 1995. 11с., библиограф. 7 назв. (Рукопись депонирована в ВИНИТИ 31.01.96г., №349-В96) УДК 579,254.24.

3. Малков С. В., Вафин Р. А., Барабанщиков Б. И. Способность к генетической трансформации мутантов В. зиЫШэ уаг. шдег с измененным метаболизмом

и А1 / Казанск. гос. ун-т. Казань, 1995. Юс., библиограф. 4 назв. (Рукопись депонирована в ВИНИТИ 31.01.96г„ М347-В96) УДК 579.254.24.

4. Малков С. В., Вафин Р. А., Барабанщиков Б. И. Новый локус В. бнЫШэ , влияющий на индукцию компетентности/ Казанск. гос. ун-т. Казань, 1995. Юс., библиограф. 10 назв. (Рукопись депонирована в ВИНИТИ 31.01.96г., №348-В96) УДК 579.254.24.

5. Малков С. В., Вафин Р. А., Ермольева В. В. Получение и некоторые свойства СШ-мутантов В- тусо1<1е5 и В. тезегйепсив / Казанск. гос. ун-т. Казань, 1996. 8 С., библиограф. 5 назв. (Рукопись депонирована в ВИНИТИ 30.10.96г., №3156-В96) УДК 579.254.24.