Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование транспозиции и использование транспозонного мутагенеза для получения REC мутантов у BACILLUS SUBTILIS

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование транспозиции и использование транспозонного мутагенеза для получения REC мутантов у BACILLUS SUBTILIS"



академия наук ссср институт общей генетики им. н.и.вавилова

На правах рукописи

удк 579.852.11:579.253

гаврилова елена владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ; ТРАНСПОЗИЦИИ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСПОЗОННОГО МУТАГЕНЕЗА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ REC МУТАНТОВ У BACILLUS SUBTILIS

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидат! биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов Института обшей генетики им. Н. И. Вавилова АН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ -

доктор биологических наук, профессор А. А. Прозоров

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Е Е Ильяшенко

кандидат биологических наук И. А. Егоров

ЕЕЛУИЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - кафедра генетики биологического факультета Московского государственного университета им. М.. Е. Ломоносова

Зашита диссертации состоится "Ысё^ 199г^г.,

в /Т~"~-час. /9 О мин. на заседании спеш ьшированного ученого совета Д002. 49.01 при Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова АН СССР по адресу: Москва, В-333, ул. Губкина, 3.

ч. " •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен АН СССР.

Автореферат разослан ПОЛ- ¿А^ 19э/_ г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Г. Н. Полухина

; , i Обшая характеристика работы

...... •• •! Актуальность прсСдеш. Одним из наиболее ватных достижений

в области молекулярной генетики за последнее десятилетие является открытия мобильных генетических элементов, способных менять свое месторасположение в пределах генома. Исследования генетического контроля процесса транспозиции и, в частности, механизма регуляции эффективности этого процесса, имеют не только Фундаментальное, ко и прикладное значение. Последнее обусловлено широким применением методов инсерционного мутагенеза при проведении генетических и генно-инженерных исследований, в частности, для получения различных инсершонных мутантов, картирования и клонирования соответствующих генов.

Для изучения одного из наиболее важных и сложных генетических явлений, рекомбинации, успешно применяются бактериальные мутанты с нарушениями различных стадий этого процесса - Reo мутанты. Изучение Ферментативных механизмов рекомбинации в настоящее время приобрело практическую значимость в связи с возникшей проблемой устойчивости генно-инженерных конструкций. Но сведений о конкретных механизмах осушебтвления рекомбинации у Bacillus subUlis явно недостаточно. Описано множество гес-гешЭв, мутации в которых приводят к нарушению рекомбинации, однако биохимическая природа кодируемых ими продуктов однозначно известна лишь ' для гена гесЕ. , ^

Цель работы. Целью данной работы являлось изучение генетического контроля процессов транспозиции и гомологичной рекомбинации у В.subtil1з, взаимосвязи рекомбинации с процессами репарации и транспозиции, использование инсе.ршюнного мутагенеза транспозснсм. Тг.917 для выделения новых Ree мутантов В. subtills, картирования и клонирования reo генов.

Задачи исследования. В соответствии с целыо работы были •

- г -

поставлены следующие задачи: изучить влияние различных известных гее мутаций В. subtil is на частоту перемещения Tn917, а также проследить зависимость частоты транспозиции от развития компетентности клеток В.subtilis на разных стадиях роста; подучить мутанты В. subtil is со сниженной способностью к рекомбинации за счет инсерционного мутагенеза; изучить у них степень нарушения процессов репарации и рекомбинации; картировать транспозонные вставки, вызвавшие гее мутации; клонировать гены, участвующие в рекомбинации В. subtil is; провести комплеыентационный анализ гес ыутаци.1 В. subtil is с помощью клонированного гена.

Научная новизна. Показано, что мутации генов гесР, гесВ, гес315 и gyrB В. subtil is снижают частоту транспозиции Тп917, тогда как мутация в гене recF, напротив, стимулирует процесс пе-,ремощеиия транспогона. На стадии максимальной компетентности клеток В.subtilis наблюдалась и наибольшая частота транспозиции Тп917. Впервые посредством инсерционного мутагенеза за счет тран-спозона Тп917 были получены гес мутации В. subtilis. б гес мутаций локализованы на генетической карте Е subtilis. По крайней мера две из них лежат в районах хромосомной карты, где еда не описаны гес мутации. Клояировгш гес ген, соответствующий вцде-ленной мутации гес223. При клонировании с помощью интегративного вектора в хромосому В.subtilis выделенный геи кпмпламантировал мутацию гес223. Однако, в составе многонооийной автономной плаз-миды он полностью подавлял- способность клеток к рекомбинации.

Практическая ценность. Полученные результаты о влиянии некоторых генов В. subtilis, а также физиологического состояния клетки на .частоту транспозиции Тп917 могут оказаться полезными при учете распространения лекарственной устойчивости у патогенных бактерий. Выделение новых гес мутаций В. subtilis .за счет инсерционного мутагенеза позволит составить более полную картину

генетического контроля в процессе гомологичной рекомбинации у В. subtilis. Полученные новые данные могут быть использованы при проведении генно-инженерных и селекционных работ, осуществляемых на этом промышленном микроорганизме.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" ( Москва, 1990) ; на II Рабочем совещании "Генные манипуляции в бациллах" (ГДР,1990); межлабораторном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен АН СССР (1991).

Структура и обьем диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов, экспериментальную часть, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и содержит 17 рисунков и 10 таблиц. Списо:: литературы включает 142 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ йгамцц бактерий и фагов, плазмиды. В работе были использованы штаммы В. subtilis: SHGW, полученный от Бреслера С. Е. (ЛИЯФ АН СССР, Ленинград); SB25,лабораторный музей; РВ3373, PY350, полученные от Польсинелли М. (Флорентийский университет,Италия);RUB830,полученный ОТ Суеоки а (Булдер, США); BD170, SB202, BD163, GG109, BD191, BD193, BD224, BD241, BD246, GQ1-10, GG111, РВ1640, g3y908. gsyl615, mms315 (лабораторный музей); КУ817,полученный от Еарабанщикова В. И. (Университет,Казань); QB944, QB928, QB934, QB922, QB935, QB936, QB917, QB693, полученные от Дедонде РЛИнститут молекулярной биологии, Париж) ; Е. coli: ВМН71/18 лабораторный музей.

Саги: AR9 получен от Р.Р.Азизбекяна (ВНИИ Генетика, Москва); ÁR1, AR3 лабораторный музей.

Плазмиды: pTV32: : Tn917, pTV51: : Tn917, pTV20: : Tn917, pTVl: : Tn917

полученные от Польсинелли М. С Флорентийский университет,Италия); pUClQ, pUBllO, pHV60 - лабораторный музей.

Среди я реактивы. При работе с бактериальным^ культурами Е.coli и В.subtilis в качестве полноценной среды ий.ользовали мясо -пептонный бульон (ЫПБ), приготовленный в институте эпидемиологии и микробиологии им. Е Ф. Гамалеи АМН СССР, или среду LB ( Цаниатис и др. ,1984). В качестве твёрдых полноценных сред использовали мясо-г.ептонный агар или агаризованную среду LB ( 1,5-2 Z агара). В качестве -минимальных сред для В. subtilis использовали среды Спицайзена (Spizizen, 1958). Перед использованием в среды добавляли необходимые антибиотики в следующих концентрациях : для В.subtilis -эритромицин (1 мкг/мл), линкомицин (25 мкг/мл), хлорамфеникол (5 мкг/мл), канамицин (30 мкг/мл); для Е. coli - ампицилин (75 мкг/мл), тетрациклин (15 ист/мл), хлорамфеникол (20 мкг/ыл).

При работе с фагом ARS'b качестве твердой питательной среды использовали триптозный агар, а в качестве вег,Л*Л'о слоя мягкого агара - 0.5Z агар. 'Vr

В работе были использованы рёстрикционные зндонуклеазы производства НПО "Фермент" и фирмы "Boehringer Mannhei m",ДНК-лигааа ( НПО "Фермент"), ^ ДНК-полимераза I (фрагмент Кленова) фирмы "Boehrmger Mannheim",ДНКага .1, РНКазаА, пронаге и лизоцим("Serva").

Трансформация клеток Е. col i плазмидной ДНК проводилась по ме- • тодико, предложенной Кушнером в 1878году ( Маниатис и др., 1984). Трансформация клеток * В. subtilis проводилась по модифицированной методике Анагностопулоса и Спицайзена, принятой в лаборатории генетики мшфеорганизмов ИОГен АН СССР (.Прозоров, 1SS8 ).

Траксдукция В. subtilis. Получение транедуцирущего фага и транедукцию проводили так, как это описано в работах Азизбекяна с соавторами (Беляева,Азизбекян,1967).

Транспозицию Тп917 в клетках В.subtilis проводили по мето-

ду, предложенному Янгманом и соавт. (Youngman et al. ,1984).

Получение препаратов ДНК. Хромосомную ДНК В.subtilis получали по модифицированному методу Кирби, принятому в нашей лаборатории (Прозоров, 1988). Для получения хромосомной ДНК из небольших сбъо-мов,использовали метод, предложенный Жаннером и Пги на курсах ЕМВО (ЕМВО, 1985). Для выделения плазмидной ДНК Е.coli применяли метод температурного лизиса (Holmes, Qugley, 1981; цитировано по книге Маниатиса и др., 1934) с некоторыми модификациями. Плазмиднув ДНК из клеток В.subtilis получали методом щелочной денатурации Еирн-Сойма и Доли (Birnbolm.Doly, 1979). Выделение ДНК Бактериофага проводили по методике,предложенной Ианиатисом (Маниатис и др. , 1У84).

Рестрикцию, обработку ДШ-полиыеразой1,дотирование,ник-транс-ляцию ДНК проводили по общепринятым методикам! Маниатис и др. ,1984).

Электрофорез вели в атарозных гелях (0,7Х) при юзмнатной температуре в горизонтальных'камерах в трис-боратном буфере в течение 14-16 часов при напряжении 2-7,5 B/cMÎ

Едоттинг-гибридизация ДНК. Перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры осуществляли по методу Смита и' Саммерса (Smith, Summers, 1980). Гибридизации ДНК с меченой пробой проводили по общепринятой методике (Маниатис и др. ,1984). ■

Проверку активности ДНК-подимеразы I у штаммов В.subtilis проводили по методике, предложенной Мартинес и'соавт. (Martinez et al. ,1986).

Иммуноблоттинг белков проводили по методу Ловетт(1.оуеи,1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние различных reo мутаций на частоту транспозиции Tr.017 в ;слетках В.subtilis. Перемещение транспозона Тп917 не зависит от функции гена гесЕ,ключевого гена гомологичной рекомбинации е клетках В. subtilis (Youngman et al. ,1984). Однако в литературе описано большое количество других гее генов В. subtilis, участвует;»' в

процессе гомологичной рекомбинации при трансформации, трансдук-аии, а также е процессе "спасения" плазмидного маркера (Alonso et al. ,1288).Удалось показать,что частоты трансформации Тп917 в клетках штаммов с мутациями гесЕ4, recB2, recL16, reclOJ, recH342, recG40, recN4, приблизительно равны частотам транспозиции Тп917 в клетках изогенных штаммов с ненарушенной системой гомологичной рекомбинации. Исключением оказались штаммы с мутациями гесР149, гесВЗ и гес315, частоты транспозиции у которых снижены в 6-7 раз, по сравнению с контролем. В клетках штамма с мутацией recFIS, напротив, наблюдалась стимуляция процесса транспозиции примерно в 6 раз. В клетках .мутанта КУ817, с нарушенной функцией gyrB субъединицы ЛНК-гиразы, наблюдалось снижение частоты перемещения Тп917 больше, чем в 20 раз.

Таким образом, несмотря на ренликативный механизм транспозиции Тп917, в процессе перемещения транспозона также задействованы белковые продукты ряда генов системы гомологичной рекомбинации В. subtilis, таких как гесР, гесВ, recF, о^АБ.

Мутация в gyrB субъединице ДНК-гиразы приводит к значительному снижению как частоты хромосомной трансформации, так и частоты транспозиции Тп917 в клетках В. subtilis. Еозможно, что суперспирализованное состояние реципиёнтной ДНК необходимо для локального расплетекия ДНК в месте встраивания мобильного элемента. В пользу этого предположения свидетельствуют также результаты. показывающие, что «встраивание многих мобильных элементов происходит предпочтительно в А-Т богатые участки ДНК, характеризующиеся пониженной температурой плавления и, следовательно, облегченным расплетением ДНК (Смирнов и-По[3тянко,1983).

Z. Транспозиция и компетентность. Известно, что развитие компетентности у В.subtilis коррелирует с активацией SOS системы (Yas-bin,1974). Мы предположили,что если митомицин С индуцирует перемеща-

ние Тп917,то и состояние компетентности клеток к моменту транспози-шш может повышать частоту перемещения Тп917. Максимум компетентности обычно достигается при инкубации 1,5-2 часа после конца зкс-< потенциального роста (Dubnau et al. ,1987). В наших экспериментах частота перемещения Тп917 в конце экспоненциальной фазы роста увеличивалась в 2,2 раза. При максимальной же компетентности клеток (6-6,5 часов инкубации) частота транспозиции отличается от таксвой в середине log фазы в 7,6 раз.

3. Получение и характеристика инсерционных Rec мутантов В. subtil is.

3. Шзлученке rec мутаций за счет транспозонного мутагенеза. Основной целью нашей работы было выделение мутантов В. subtil is, дефектных по рекомбинации,за счет инсерционного мутагенеза, и их последующее изучение. Для этой цели мы' использовали температурочув-ствительную по репликации плазмиду pTV32 (Youngman et al. ,1984), несущую в своем составе транспозон Тп917. Было проверено 20000 ЕпГ колоний штамма SB25,содержащих инсерции Тп917 в различные сайты хромосомы В. subtil is; мы отобрали 87 клонов,чувствительность к ми-томицину С которых отличалась от исходного штамма SB25. Чтобы найти среди этих 87 мутантов штаммы с нарушениями рекомбинации,мы проверили у них частоту хромосомной трансформации. Было отобрано 12 мутантов, у которых инсерция транспозона в хромосому привела не только к повышению чувствительности клеток к митомицину.но и снижению частоты гомологичной рекомбинации при трансформации.

Уменьшение способности к трансформации у мутантов могло возникнуть, по крайней мэре, по двум причинам: из-га нарушения структуры клеточной оболочки, что препятствует связыванию и про-:!:;кноевнип трансформирующей ДНК в клетку, и из-за нарушения процессов секомбинации. Ыы проверили способность поглощать и связч-. чть трансформирующую ДНК, меченую тритием (Habn et al. ,1987).

Данные этих опытов представлены в таблице 1. Во всех случаях компетентные клетки изученных нами мутантов поглощали примерно такое же количество ДНК, что и клетки исходного штамма дикого

Таблица 1. Эффективность трансформации по локугам His или ига митомицинчувтвительных мутантов

Штамм Число Количество Частота трансформации Фено-

трансфор- 3Н-ДНК (имп/мин) Абсолют- Относи- тип "мантов/мл поглощенной связанной мая (а) тельная (в)

SB25 26500 1900 17000 13,92 1 Rec+

mms9 83600 7671 10650 10,9 0,79 Rec-

иг.5118 4300 1400 15000 3,07 o.'zs ' Rec-

mm1127 46100 2892 29055 15,94 1,16 Rec+

1 оо ilUtl il»U 500 5500 27800 0,09 0,006 Rec-

mms215 1800 2200 22900 . 0,82 . Rec-

mm®220 4800 1900 18300 2,53 '¿,18 Rec-

mms223 , 4963 1320 14013 3.V5 0,27 Rec-

mm' 273 1900 • 2700 13400 0,704 . . 0,05 ' Rec-

mm'277 22600 **B992 14210 2,51 0,18 " Rec-

PB3373 33000 2200 30700 15- 1 Rec+

mm'301 7600 5800 15700 1,31 0,09 Rec-

mm1303 2200 6900, 31800 • 0,32 0,02 Rec-

mm5 304 2500 3800 28900 0,66 0,044 Rec-

а .'*■'.■

Отношение числа возникших трансформантов к-количеству поглощенной ДНК

в

Отношение абсолютных частот к уровню контрольного штамма

типа. Не обнаружились больше различия так же и в адсорбции ДНК клетками. Таким образом, у всех мутантов, кроме тт*127, были нарушены процессы рекомбинации. Соизмерение количества полученных трансформантов с количеством поглощенной ДНК в этих опытах позволяет характеризовать штаммы mms9, ш5118, пта4128, mm? 223, mms 215, mns220, mm5273, nm'277, rmi301, :ros303, ms304 как Rec-му-танты (табл.1).

3.2. Картирование транспозонных вставок, вызвавших гее мутации. Для определения местоположения полученных мутаций на хромосоме мы провели эксперименты по генетическому картированию вставок,вызвавших инсерционньй мутагенез. Бактериофаг AR9 выращивали на клетках штаммов инсерционных мутантов, содержащих Тп917. Полученными препаратами фага транедуцировали набор штаммов с различными ауксотроф-ными мутациями, предложенный Дедонде и др. (Dedondor et al. ,1977) для быстрого картирования новых мутаций на хромосомной карте В. subtil is. Данные по котранедукции ауксотрофных "реперных" маркеров и признака устойчивости к эритромицину, обусловленного инсерцией транспозона Тп917,для каждого из мутантов суммированы в таблице 2.

Мутации гес118, гес220, гес273 и гес277 мы не картировали на хромосомной карте В. subtil is, поскольку ко интегрированная в составе генома плазмида pTV32 не позволяет применить простой способ клонирования мутаций, используя интегративные вектора PTV20, PTV21 и PTV2U2 (Youngmgn et al. ,1985). То обстоятельство, что в составе гена находится плазмида размером 15 т. п. н. затрудняет и точную локализацию нарушенного интеграцией сайта на хромосомной карте.

6 вставок,которые привели к возникновению гес мутаций,с помощью трансдукции были локализованы на хромосомной карте В. subtil is

(табл.2). Это не удалось в отношении мутанта Recl28: выращивание трансдуцируюшего (бага на этом штамме по приводило к образованию фаговых бляшек,в отличие от других Ree мутантов. Видимо,рекомбина-ционные дефекты, вызванные мутацией, влияют на раа^гие умеренного Фага AR9. Вирулентные фаги AR1 и AR3, однако, могли расти на атом штамме.

Таблица 2. Котрансдукция маркера Emr и "реперных" маркеров при использовании в качестве доноров инсерционных Ree мутантов

Мутация (Z котранедукции)4

гесЭ iretC3(8,7); pyrDl(27,6); thyAthyB(49)

гас215 purB33(4,l); сузА14(4,8); aroI906(33,l)

гес223 аго190б( 10,4); purA16(26,5); 07^4(62,1)

гес?01 . purB33(32,7); tro 12(84,3) { ,/

гесЗОЗ gltA292(39,9)

гес304 aroG932(35,5); leuA8(63,l)

'Число в скобках определяет Z котранедукции гес-мутаций с указанными ауксотрофными маркерам)!

Три вставки, вызвавшие мутации,'лежат в районе хромосомы, где уже описаны гес мутации. Так, мутация гес223 расположена между мутациями гес041, гесМ13 и гесР149, поблизости от точки начала репликации; мутация гес215 'Лежит недалеко от мутации гес1Л6; мутация гес9 картируется в' области .хромосомной карты, где определена локализация генов гесЕ и гесИ.

Наиболее подходящими кандидатами на мутации, затрагивающие • функции новых гес генов, являются мутации гесЗО! и гес304. Мута-

ция recSOl, хотя и лежит недалеко от гена гесН, находится по другую сторону от мутации trel2.

Мутация гес304 располагается в близком соседстве с мутацией ро}А5. Мутация ро1А5 приводит к снижению активности ДНК-полиме-рази I и нарушает гомологичную рекомбинацию. Экзонуклеазная и политразная активности фермента ДНК-полимеразы I у мутанта FtecSOl не нарушены, и это позволяет предположить, что мутации гес204 и ро1А5 различны.-

Мутация гесЗОЗ располагается в районе, где отсутствуют гес мутации. Но, к сожалению, точная локализация гена затруднена, поскольку . зта область (-IVO*) хромосомной карты В.subttlis перекрывается областью проäara SPß и там нет удобных маркеров для картирования.

Ш не выделили инсершюнных мутаций, соответствующих некоторым, ул® известным reo мутациям В.subtills. Возможно, это связано с тем, что шиззчение транспозона Тп917 в хромосому не носит абсолютно случайного характера и имеет определенную специфичность (Vandeyar and Zahler,1986). Однако данные, полученные нами, все ля позволяют судить об относительном количестве сайтов на хромосоме В. subtil is, мутации в которых приводят к снижению естественной устойчивости клеток к ыитомицину С и нарушению процессов рекомбинации.. Клонирование получеТшых гес генов позволило бы более однозначно судить- о локализации и идентичности (?озых гес мутаций с описанными ранее.

3. 3. Клонирование гес генов

3 ai. Клонирование хромосомной ДНК, фланкирующей инсерции транспозона Тп917. Для клонирования выделенАых гес генов были получены плазмиды, содержание последовательности хромосомой ДНК В. subtil is,фланкируюеие инсершш транспозона Тп917 в геном,которые привели к появлению мутаций rec9,recl28,rec223.rec301,rec304. Эти

участки хромосомной ДНК на плазмидах использовались в качестве меченых зондов для скрининга .геномной библиотеки и. выделения полноразмерных копий генов рекомбинации В. subtilis.

Для этого мы использовали плазмиду pTV20, у которой часть последовательности Тп917 замещена последовательностью плазмиды Е. coli pBR322, включаюшэй маркер устойчивости к ампицилину (Арг) и точку начала репликации, а такжв маркер устойчивости к хлорам-фениколу (Стг) плазмиды Staphylococcus aureus рС194,необходимый для селекции в клетках сенной палочки (Youneman et al. ,1984). Плазмиду pTV20 разрезали' рестриктазой Xbal и трансформировали компетентные клетки штаммов В. subtilis гес:Тп917 по признаку устойчивости к хлорамфениколу при 50*С. Полученные линейные молекулы при проникновении в бактериальную клетку становились одно-цепочечными и происходило их встраивание в гомологичный район бактериальной клетки по механизму двойного кроссинговера (Davidoff-Abelson and Dubnau,1971). Гомологичные области обеспечивались последовательностями ДНК транспозона, . присутствующими на обеих взаимодействующих молекулах. В результате происходила интеграция pTV20 в хромосому В.sübtilis в пределах Тп917 (рис.1). Мы получили ряд Стгтрансформантив,гибридизация которых с Тп917 показала соответствие той структуре, которая представлена на рисунке 1. Наличие двух фрагментов после рестрикции по EcoRI сайтам свидетельствовало об интеграции pTV20 в хромосом по. гомологии с Тп317. Хромосомные ДНК, выделенные из Cm'"трансформантов, расщепляли рестриктазой EcoRI. Полученные рестрикционные фрагменты лиги-ровали ДНК-лигазой фага Т4 в условиях низкой концентрации ДНК (10 мкг/мл). Лигирование рестрикционных фрагментов "самих на себя" в этих условиях происходило с большей, вероятностью. Этими плаамидами трансформировали штамм Е.coll ВМН71/18 по признаку устойчивости к ампицилину. Из клеток трансформантов выделяли

ХТ"917 V

EcoRI _j_—

EcoRI cat |amp

EcoRI

... ,TSrPThI Hindi11 HindiII sUw EcoRI

HîndIII

HîndIII

HîndIII

Рис. 1. Стратегия встраивания pTV20 в хромосому Reo223 и получение плазмиды,. содерлипрй участок геномной ДНК В.subtills.

плазмидную ДНК. Рестрикционный анализ полученных плазмид р9,р127, р128,р223,р301,р304, показал, что они содержат последовательности хромосомной ДНК В. subtil is, фланкирующю инсерцшо Тп917.

itiw удалось, нсгзльзуя скрининг хромосомной библиотеки В. subi 1 lis, созданной на основе фагаА ЕШ1.4, выделить EcoRl Фрагмент ДНК, включающий в себя полноразмерную копию гена гес223.

3. 3. 2. Клонирование гена В. subtil is гес223. Срагмеит рекомби-налтной фаговой ДНК размером 2,7 т. п. н. и гомологичный последовательности хромосомной ДНК В. subtil is,фланкирукдад инсерцию транс-пояона с образованием гес223 мутации,клонировали по сайту EcoRI в область полилинкера плаамиды pUC19. Эту плазкиду обозначили pGE223. На последовательности хромосомной ДНК В. subtil is, клонированной в плазииде pSB223,расположены сайты узнавания для рестриктаз HindiII, Spfil.Pstl.PvuII,Avail (рис.2). Рестрикционный анализ позволил нам предположить,что при инсерции в хромосому штамма SB25rec+B.subtilîf транспоаон Тп917 встроился между сайтами для рестриктаз Hindlll и Pstl. При этом произошло нарушение работы гена, ответственного за протекание рексмбинационных процессов в клетке бактерии с образованием мутации гес223.

3. 3. 3.. Влияние увеличенного количества копий гена гес223 на генетическую рекомбинацию.. Поскольку у мутанта SB25rec223 снижена частота гомологичной рекомбинации при хромосомной трансформации, иолноразморная копия соответствующего хромосомного гена, не несущего мутации, клонированная на плазмиде pGB223,должна восстанавливать частоту хромосомной трансформации в клетках мутанта до уровня исходного штамма Ь'В25гес+.

Ш сконструировали гибридную илазмиду pGB230 (рис. 2). Аналогичным способом била сконструирована и плазмида pGB232,включающая лишь полные копии плазмид pUC19 и pUBUO (рис.2).Эти гибридные плаамиды в клетках В. subtil is реплицировались га счет входящей в их состав

Рис. 2. Схема гашсто^хрования плввмид pGB23Q, pGB232, pGB229 Двойное линией обозначена клонированная последовательность хромосомной ДНК В.subtilis.

pUBl10,количество копий на клетку которой составляет приблизительно 50. Способность к рекомбинации у штаммов, несущих плазмиды р0В230 и PGB232, проверили, измерив частоту трансформации хромосомной ДНК в клетках штаммов SB25rзс223(рВВ230),SB25rec223(pGB232),по сравнению с SB25rec+ и SB25rec223. В таблице 3 представлены результаты средних значений трех опытов г.о рекомбинационкой комплементации гибридными плазмидами мутации гес223. Ыы наблюдали полное отсутствие рекомбинан тов при трансформации клеток, несущих эту плазмиду, хромосомной ДНК, выделенной из штамма дикого типа ( табл. 3). Хромосомную трансформацию проводили с использованием меченой ДНК, что позволяло производить пересчет числа полученных трансформантов на количество поглощенной ДНК. Аналогичные результаты были получены и после введения плазмиды PGB230 в клетки штамма SB25rec+ ( табл. 3). Скорость роста клеток с введенной в них многокопийной рекомбинантной плазмидой была снижена примерно вдвое по сравнению с аналогичными показателями бесплазмид-ного штамма. После введения в клетки штаммоЕ SB25rec+ и SB25rec223 плазмиды pGB232 частота хромосомной трансформации в клетках снижалась незначительно (табл.3). По-видимому, отсутствие рекомбинантов при введении в клетки плазмиды pGB230,было вызвано присутствием избыточного количества белка,продуцируемого клонированным на ней геном.

3.3. 4. Комплементация мутации гес223. Для проверки того, как ген гес223 влияет на хромосомную трансформацию в одной копии, мы сконструировали интегративную плазмиду pG3229 {рис.2).Она включает в себя целую плазмиду pGB223 и маркер устойчивости к хлорамфениколу из плазмиды pGG51,необходимый для селекции в клетках В. subtilis. При зтом, pGB229 не была способна автономно реплицироваться в клетках сенной палочки из-за отсутствия на ней необходимых элементов репд'и-кационного аппарата,т. е. эта плазмида была интегративной. При использовании в качестве реципиента штамм SB25rec223, со встроенной плазмидой pGB229 мы наблюдали комплементацию гес мутации, даже с

Таблица 3. Влияние клонированного на плазмидах гона на частоту хромосомной трансформации В. subtilis

Удельная активность Кол-во His+ Частота трансформации Игами 'Н-ДНК, поглотанной трансформа- Абсолют- Относитель-клетками нтов в 1 мл ная ная

SB25roc+ 24422 45178 1,85 1

SB25rec223 12399 6075 0,49 0,27

SB25rec223

(pG3230) 20160 0 0 0

SB25rec223

(PGB232) 40442 8082 0,2 0,11 •

SB25rec+

(PGB230) 63570 0 0 0

SB25rec+

- (pGB232) 45610 73432 1,61 0,87

SB25rec223

(pGB229) 13232 ' 45319 „ 3,43 1,9.

'»г

небольшим превышением частоты трансформации, по сравнения с гес+ штаммом. Репарационная активность, связанная с исправлением повреждений ДНК при действии митомицина'С, восстанавливалась до уровня контрольного штамма 1?ес+. Результаты этих опытов показывают присутствие полной копии гена на клонированном фрагменте; этот ген ксмплвментирует гес-мутацию, вызванную инсерцией Тп917(та.<У. -5).

3.3. 5. Комплементация мутаций, расположенных по соседству с мутацией гео223. Мутация гес223 картируется в районе purA-cysA хромосомной карты В. subtilis, поблизости от точки начала репликации бактериальной хромосомы. В этой области ранее были выделены гее мутации - гесР, гесМ и recD. Мутации в этих генах в разной степени влияют на рекомбинацию и репарацию ДНК (Alonso et al., 1388). Для доказательства отличия выделенной нами мутации гес223 и уже известных reo-мутаций,расположенных в том жв районе,мы ввели плазмиду pGB229,несущую клонированный фрагмент,в штаммы В. subtil is SB25recF и BD246recM.

Чувствительность к митомицину С клеток штаммов В.subtilis BD246recM и SB25recP, содержащих pQB229, не отличается от контролен BD246recM и SB25recP соответственно и превышает таковую у исходных Rec+ штаммов . Следовательно,продукт гена гес223 не способен комплементировать нарушения репарационных функций мутантов RùcM и RecP. Эти данные,наряду с результатами картирования,позволяют считать гес223 либо ноеой мутацией, отличной от гесМ и гесР, либо мутацией гесЬ.

3.3.6. Обнаружение с помощью иммуноблоттинга бедка RecE в клетках В. subti1 is. Присутствие в штамме В. subtilis SB25rec+ многокопий-ной илазмиды pGB230, несущей в своем составе клонированный рекомби-нацнонный ген,приводило к полному прекращению генетической трансформации. Одной из причин, объясняющих этот эффект, могло бы бить снижение клеточного уровня белка RecE в клетках В. subtilis, играющего основную роль на ферментативном уровне в образовании донор-реципиентного комплекса . ИммуноСлоттинг белков показал, что базальный уровень белка RecE в клетках, содержащих клонированный на плазмиде pGB230 ген гес223, равен таковому в контрольных штаммах. Амллифшгация RecE белка при SOS индукции также не была нарушена( рис. 3). По-видимому, влияние гена гес223, клониро-

ванного на многокопийном векторе pGB230,Ha хромосомную трансформа цию связано с гиперпродукцией бедка гена гес223.

1 2 3 4 5 6 7

<" .........- „ "" '--"»Я

45 КД 38,75 КД

Рис. 3 Определение количества белка RecE в штаммах В. subLilia с помощью иммуноблоттинга. Белок RecE в экстрактах обработанных митомицином клеток штаммов l.SB25rec+;2. SB25rec+( pGB232) ; 3. SB25rec+( pGB230) и необработанных митомицином клеток штаммов 4. SB25rec+;5. SB25rec+(pGB232) ; 6. SB2Srec+(pQB230). 7. белок RecA E. coli.

Наши результаты могут быть объяснены предположением, что клонированный нами ген гес223 кодирует белок, подобный по своим функциям SSB белку (белок,связывающийся с одноцепочечной ДНК) Е.coli (Egner et al. ,1987). В присутствии избыточного количества продукта гена ssb в клетках Е.coli образование длинных нуклеопротеиновых фи ламентов, активных для синапса, и Д-петель уменьшается, а при нормальном уровне ssb - повышается (Мзгеаи, 1987).

Выше приведенное предположение согласуется со значительным снижением частоты трансформации в наших опытах, где при нормальном уровне белка RecE Ъ клетках штамма В. subtil is SB25rec+, содержащем иногокопийнуп плазмиду pGB2S0 с клонированным геном 'гес223, по-видкмому, образование донор-реципиентного комплекса не происходит из-за избыточного присутствия в реципиентной тетке a subtil is белка Rec223 (SSB).

ВЫВОДЫ

1. Посредством инсерционного мутагенеза за счет транспогона Тп917 били получены и локализованы 6 ^с-мутаций

В. subtilis.no крайней мере две из них, судя по локализации, лежат в еше не описанных гес-генах.

2. Клонирован reo ген, которому соответствовала выделенная мутация гес223. Будучи включенным, в составе интегратив-ной плазмиды, в хромосому, он комплементировал мутацию гес223. Однако, в составе многокопийяой автономной плзз-миды он подавлял способность клетки к рекомбинации. Видимо, это было связано с гиперпродукцией соответствующе' го белка.

3. Показано,что на частоту транспозиции Тп917 в клетках

В.subtilis влияют мутации генов гесР, гесВ, recF, гес315 и gyrß. г.

4. Наибольшая частота транспозиции Тп917 4acj .вдалась в стадии наступления максимальной компетентности В. subtilis.

ч

Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Гаврилова Е. Е, Хасанов Ф. Ii., Прозоров А. А. Влияние различных гес мутаций на частоту транспозиции Тп917 в клетках RsubtUis. - Мо-лек. генетика микровиол, и вирусология, 1989, ы 10,стр. 33-40. Z. Гаприлова Е. а , Хасанов Ф. К , Прозоров А. А. Получение Ree мутантов В. subtil is с помощью инсерционного мутагенеза. - Генетика, 1991, Т. 27, N 2,стр. 222-228. • *

3. Гаврилова Е. Е , Мехедов С. Л., Прозоров А. А., Хасанов Ф. К. Ген гес223 В. subtilis: молекулярное клонирование и предполагаемые