Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние однопотентных супрессоров SUP1 и SUP2 на белковый синтез в митохондриях у дрожжей Saccharomyces Cerevisiae

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние однопотентных супрессоров SUP1 и SUP2 на белковый синтез в митохондриях у дрожжей Saccharomyces Cerevisiae"

ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ .ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК: 575.1:582.282.23

ТРОИЦКАЯ Ольга Александровна

ВЛИЯНИЕ ОШЖОТЕКГННХ СУПРЕССОРОВ эир1 I! зирг НА БЕЛКОВЫЙ СИНТЕЗ В МИТОХОНДРИЯХ У ДРОЗЯЕЙ

ЗАССНАИОМУСЕЗ СЕЯЕУ131АЕ

03.00.15 - -Генетика"

Автореферат диссертации на соискание учаноЯ степени кандидата биологических наук

Ленинград 1991

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Ленинградского государственного университета.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент. Л.Н.Мирснова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор К.В.Квитко < ЛГУ ).

кандидат биологических наук А.А.Филатов ( Институт сельскохозяйственной микробиологии ВАСХНИЛ ).

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики АН СССР ( Москва )

Защита диссертации состоится -/О" ОАи-с. 1991 г. в часов && икнут на заседании специализированного Совета Д.063.57.21 при Ленинградском государственном университете по адресу: 199034 г.Ленинград, Университетская набережная, 7/9. ЛГУ, Оиолого-почвенныЯ ф-т, кафедра генетики и селекции, аудитория X.

О диссертацией мо»но ознакомиться в центральной научной библиотеке ЛГУ.

Автореферат разослан ¿-¿¿¿^ре 1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета Л.А.Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблем. Среди проблем, интенсивно изучаемых современной генетикой. центральное место затопляет исследование механизмов реализации генетической информации. Синтез белка (трансляция) представляет собой один из важнейших и наиболее сложных этапов этого процесса. В связи с этим изучение генетического контроля трансляции у организмов разных уровней сложности имеет большое значение для разработки этой фундаментальной проблемы.

Прогресс в исследовании структуры и функции белоксиитези-рутаего аппарата обусловлен наличием адекватных генетических подходов к выявлению и анализу генов, контролирующих процесс трансляции. Одним из таких подходов является изучение информационных супрессороз. С его помощью у дрожкеЯ-сзхаромкцетоз идентифицирован ряд генов, кодирующих структуру компонентов аппарата трансляции разной молекулярной природы. К числу таких генов относятся, в частности, гены sun и svp2, которые кодируют некие неизвестные ранее минорные фактору трансляции, участвующие в контроле точности работа вдтоплазматлческих рибосом.

Специфической особенностью генов supi и sopz является их полифункциональность. Мутации в imx могут нарушать не только трансляцию, но и другие жизненно важные клеточные процессы - в частности, метаболизм ДКК и митотическое деление (poouincton et si. 19901 Kiku^hi « si..ipasi. О полифункциональности этих генов свидетельствует также влияние мутаций вин и «ирг на функционирование митохондрий. Ранее было показано, что многие мутанта bupi(2), отобранные по эффекту супрессия ядерннх нонсенс-мутаций, ЯВЛЯЮТСЯ дыхательно-некомпетентными Cl>r-Avaneeyan et el.. i9R2). При биохимическом анализе таких мутантов выяснилось, что блок дакания обусловлен подавлением митохондриального (мтх) белкового синтеза.Это позволило предположить, что белки supi и пир? участвуют не только в цитоплазматической, но и мтх трансляции.

Общие компоненты белоксинтегирующих систем могут играть важную роль в функциональной интеграции процессов, протекающих в разных компартментах эукариотической клетки. Исследования в этой области тормозятся отсутствием адекватных экспериментальных моделей. В этой связи изучение механизмов влияния мутаций «uoi и supг на мтх трансляцию представляет несомненный интерес. Цель и задачи работа. Целью настоящей работы является изучение

механизма влияния супрессоршх мутаций в генах зир1 и эирг на белковый синтез в митохондриях. В качестве основного подала был выбран метод, связанный с анализом мутаций, компенсирующих дыхательную недостаточность у мутантов ачрг и вире. Его реализация требовала выполнения слэдуицт: задач: получения коллекции дыхательно-недостаточных мутантов по генам Бир1 и зирг, создают коллекции мутаций, восстанавливающих способность к дыханию, и их детального генетического анализа. Научная новизнз. В работе показано, что дыхательная недостаточность является облигатным эйектом супрессоршх мутаций в генах 5ир1 и зирг.Впервые исследованы закономерности внутригенной локализации мутаций еи£>1 и еир2 с разными спектрами плейотропных проявлений и разной степенью влияния на способность к дыханию.

Показано, что дефект дыхания у мутантов яир1 и ви»г мож^т быть компенсирован мутациями различной природа. При анализе свойств этих мутаций выявлена слояшая система ядерных и мтх генов, взаимодействующих с генами зирг и зирг.

При изучении мтх мутаций, восстанавливающих дыхательную ком-петентость у мутантов гир1<г1, выявлен новый тип взаимодействия мевду белоксинтезирующими системами цитоплазмы и митохондрий у дрожжей. Показано, что дефект мтх трансляции, обусловленный мутациями виркг!, очевидно может быть.кошенсирован изменением белка малой суСчастивд мтх рибосомы.

Практическая ценность работа. Результаты, полученные в настоящей работе, вносят вклад в исследование молекулярных основ трансляции у дрожжей-сахаромицетов. Интерес к этой проблеме выходит за рамки фундаментальной науки и в значительной степени связан с необходимостью разработки проблем биотехнологии. Создание систем молекулярного клонирования в клетках дрожжей и биологические особенности этого объекта делают его одним из наиболее перспективных для Сиотехвологического получения гормонов, ферментов и других белковых лекарственных препаратов, неоОходамых в медицинской практике. В связи с этим исследование механизмов биосинтеза белка у дрожкей приобретает особое значение. Апробация работы. Результаты исследований были представлены на XII,Х1у и XV Международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Эдинбург, 1984; йшляндия, Эспуу,198Э; Гаага,1990), на XVI Международном генетическом конгрессе (То-

ронто,1983), на v съезде ВОГиС (Москва,I9S7), на v Всесоюзном биохимическом съезде (Москва.1987), на Международном совещании по генетике митохондрий (Вроцлав,1990), а такко на научных семинарах лаборатории физиологической генотики и отдела генетики Биологического НИИ ЛГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы II сообщений.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержи 19 таблиц, 14 рисунков и состоит из обзора литературы, экспериментальной части, ЕключающеЯ 3 главы, обсувдения, выводов и списка литературы ( 243 наименования).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. В работе использовали штаммы Петергофской генетанесксЯ

коллекции дрогшей Saccharomyees otsrevlela«, ШТаММЫ ИЗ КОЛЛвК-шя д-ра Р.Швейеиа (ФРГ), а также штаммы, полученные в настоящей работе. В качестве исходных для получения cynpeccopmix мутантов использовали штаммы:42Б-П3990 (МАТ» aaci-nmie7-iiya2-Ai2i 60Б-П3990 (МАТа »de l-iJjhis7-ime113-AIrhri-Bi?> И 2А-П4280 (MATc.

adel-ltthle7-llye2-Al?netl?-Al thf a-B151>?иг-1 c»nl-881.

Среды. Для культивирования дрожжей использовали стандартную полную среду yapp и полную среду СПГ (с глицерином и этанолом вместо глюкозы). При необходшости в среду yapd добавляли: пароыоми-цин (200МГ/Л), бромистый этидий (200мг/л), бенокил (50мг/л) и глицерин (ЗМ), а в ере®' СПГ - эритромицин (Змг/мл). Использовали такие минимальную и приготовленные на ее основе селективные среду. Канавашш добавляли в полную синтетическую среду (бОмг/л). Генетические методы. В работе использовали стандартные методы частной генетики дрожжей с Захаров и др.,19761. В качестве агента, индуцирующего цитодукцию, использовали беномил. Мтх ДНК элиминировали с помощью бромистого этидия.

Молекулярно-генетические методы. Выделение плазмидной ДНК из бактерий, трансформацию дрожжей и выделение мтх ДНК проводили согласно методикам Г Elrnboim, Doly. 19701 Itro et al..39831 Le-witt et el., 1978. соответственно) с небольшими модификациями. Во всех остальных экспериментах использовали стандартше методы [ Маниатис и др., 1984 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОбСУЖДЕШЕ Создание и характеристика коллекции дыхательно-недостаточных мутантов по генам supi и stipg.

Для получения супрессорных мутантов ш использоваж 3 штамма, генотипы которых позволяют осуществлять селекцию мутаций supkz) традиционным способом - по эффекту супрессии ядерных нонсенс-мутаций adai-mOTA) и ь1в?-1(УАА).

В общей сложности мы получили 259 мутантов eupi и 298 мутантов вчрг. У многих из них, как мы показали, супрессорная мутация приводит к гибели клеток при повышенной температуре (30 или 36°), поэтому тестирование способности к дыханию проводили при температуре инкубирования 20°С. Оказалось, что при данной температуре многие мутанты bupKzi ( 190 из 557 полученных ) являются в той или иной степени дыхательно-некомпетентными, что проявляется в полном или частичном подавлении роста на среде СПГ. У остальных мутантов, дыхательно-компетентных при 20°С, дыхательная недоста-точость, как выяснилось, может проявляться при температуре 30 или 36°С. Повышение температуры инкубирования позволило выявить наличие мтх эффекта у подавляющего большинства проанализированных мутаций eupi(2 >. Единственной группой мутантов, у которых не удается выявить дефект дыхания при 30 или 36°С, являются темпе-ратурочувствительные мутанты: у таких мутантов повышение температуры вызывает остановку цитоплазматического белкового синтеза и гибель клеток.

Анализ природы дыхательной недостаточности проводили путем скрещивания мутантов eupici со штаммами [rr,o°i. Дыхательная компетентность большинства полученных гибридов свидетельствовала о том, что подавление способности к дыханию у анализируемых мутантов, как правило, не связано с возникновением мтх мутаций и является проявлением рецессивной ядерной мутации. Для окончательного доказательства того, что дефект дыхания обусловлен супрес-сорпой мутацией, мы провели гибридологический анализ наследования этого признака в мейотическом потомстве 15 таких гибридов, 9 из которых были гетерозиготны то мутации «upi и 6 - по мутации ■ирг. Гомозиготность гибридов по супрессируемой мутации m»7-i позволяла следить за расщеплением по супрессорной мутации. В гаплоидном потомстве всех гибридов отсутствовала рекомбинация су-прессорного и дыхательно-недостаточного фенотипов, что свиде-

тельствует о моногенном характере наследования этих признаков. Эти мутанты были использованы в дальнейшем для получения мута-Ш1й, компенсирующих дыхательную недостаточность.

Итогом данной части работы яз::лось создание коллекции дыха-тельно-недостаточлых мутантов по генам supi и sup?, дополнительная характеристика которой была получена при внутрипшом картировании супрессорных мутаций.

Внутригенное картирование мутрчнй gu^i и ииг-1,

Несмотря па то, что гены supi и sup? являются объектом более чем 20-летних исследований, в ходе которых проанализированы сотни супрессорных. мутаций, закономерности их внутригенной локализации не исследованы. При гтом вахно отметить, что анализ нукле-отидней последовательности генов supi и sups позволил выявить участки, которые могут иметь определенное функциональное зпа-значение. К км, в частности, относится участок rem sирг. соответствующий области гомологии факторам элонгации трансляции семейства ep-tu, а также участок этого гена, который кодирует фрагмент белка, обладахздй! структурой, типичной для лидерных пептидов белков, импортируемых в митохондрии CKuahnlrov ot al.. 1988]. В связи с этим кы реями исследовать закономерности рас-пределвния супрессорных мутаций в генах supi и supz.

Для этого мы разработали ор:ггиналышй экспресс-метод делеци-онного картирования мутаций вчркгк Метод основан на использовании набора плазмид, несущих перекрывающиеся фрагменты аллелей дикого типа генов supi и supz. Эти плазмидо были сконструированы и предоставлены нам В.В.Кушнировым и С.А.Дидаченко ( ВНИИЭК ВКНЦ. Москва ). Опи содержат бактериальный и дрожжевой оридаины репликации, а также бактериальный (арг> и дрояотевой (leu21 селективные маркеры, необходимые для отбора трансформантов.

В экспериментах по внутригелному картированию использовали мутантов eupKz). полученных у стажа 2А-П4280 и предварительно охарактеризованных по фенотшпиеским проявлениям супрессорной мутации. При этом анализировали: способность к дыханию, чувствительность к повыпенной и пониженной температуре, паромемицину, повышенному осмотическому давлению.

Принципиальная схема метода картирования (рис.Х) включает в себя несколько этапов:

eupK г 1-2А-П4280

adel-lit hia7-l csnl-8 leu2-l eupl(2)-x

трансформант- Ю-П4305

adel-14 hls7-l canl-88 leu2-l ( a SUP1<2) LEU21

гибридизация

adel-lll hls7-l canl-88 leu2-l supl(2>-x

adel-14 hln7-J canl-88 leu2-l

fasupl(2) leu2]

китотичвская гомозиготизация

a-1«4l-lU hls7-l canl-88 l«u2-l eupl ( 2 1-х

--- - - f asuplf2) I.eu2]

adel-1« hla-7-1 eenl-88 3eu2-l вирКг)-*

(отбор на среда без аденииа и гистидииа, проверка фенотипа)

рекомбинация

.del-IE hl»7-l canl-в» l«u2-l .uHlil-» (Л SUP1(2> LEU2) adel-lll hl*7-l ounl-88 leu2-l *

fотбор на среде с канаванином, проверка фэнотипа*

РисЛ. Принципиальная схема картирования супрессорннх мутаций в генах supi и sup2.

1. Скрещивание мутантов nciizi с набором трансформантов штамма 10-П4305, несущих плазмиды, содержащие фрагменты аллелей дикого типа генов supitzi. Б качестве контрольной использовали плазмиду cviз.

2. Индукция митотической рекомбинации и отбор диплоидных клонов, гомозиготных по супрессорной мутации. Такая возможность определяется гомозиготностью гибридов по супрессируемым мутациям ad«i-iu,ht«7-i и oe.m-88 (эта мутация вызывает устойч1шость к канаванину, а ее взаимодействие с супрессорной мутацией приводит к появлению чувствительности). В качестве гомозиготных по мутации виркг) клонов отбирали клоны, фенотип которых совпадал с фенотипом исходного супрессорного мутанта по всем проявлениям мутации eupHzi-x.

3 .Качественный тест на появление канаванин-резистентных клонов в митотическом потомстве гибридов, гомозиготных по картируемой мутации eupi<z)-x. Выявление таких клопов проводили селек-

тивно на :реда с канавангаюм. Появление устойчивости к канавани-ну может быть результатом различных генетических событий, и в том «теле рекомбинации между хромосомной (мутантной) копией гена и его фрагментом на плазмиде. Поскольку частота появления кана-вгнин-резистентных клонов у всех контрольных гибридов (еиркг)// «иркг) [cvi3n Сила равна нулю, ми считали что вероятностью других событий можно пренебречь. Рексмбипашм, приводящая к восстановлению аллели дикого тина гена sun (2 >, долгам сопровождаться исчезновением суирессоргого эффекта и всех других проявлений картируемой мутации. Поэтому во всех комбинациях, где частота появления канг.вашш-резистенткь'х клонов была отлична от нуля, ш проводили детальный анализ фенотипа таких клонов.

Этот метод позволил получить качественные результаты, оценка которых сводилась к регистрации наличия пли отсутствия канаватш-резистентных клонов в митотическом потомства гибридов, несущих ту или иную плазмнду. Появление таких клонов свидетельствует о наличии гомологии мезду участком гена, затронутым картируемой мутацией и фрагментом гена из соответствующей плазмиде.

Гргфическая интерпретация результатов, полученных в экспериментах по внутригегаюму картировании, изображена на рис.2 и 3.

i—-supi-

АТГ

Xfcal -t—

тпо -

EcoRV

F.coRI

од—,— 0.2э —

Рис.2.Распределение мутаций на делецион-ной карте гена Бир1. Нижний ряд цифр соответствует количеству мутаций, локализованных в каждом участке; в скобках - количество мутаций, влияющих на способность к ДЫХЕКИМ.

pSVS

р.ТУЗ

pSV7

pSVJS

г<г)

6(6) (1(3)

8(6)

з(з>

Как видно из рисунков, использованный набор плазмид позволил разбить ген ечр1 на 5, а ген эирг - на 4 контролируемых участка разной протяженности.

23 мутации вир1 с разными спектрами плейотрогашх эффектов . распределились по всем пяти контролируемым участкам гена (рис.2).

Особо следует отметить, что 20 из 23 картированных мутаций eupi приводят к подавлению способности к дыханию. Локализация их на делеционной карте свидетельствует о том, что супрессорше мутация с разными плейотрошшми проявлениями и разной степенью влияния на дыхательную компетентность могут возникать в любом из контролируемых участков гена sun.

Анализ данных, полученных при внутригенном картировании мутаций euz>2 (рис.3), не позволяет пока сделать определенных выводов о закономерностях их распределения. С одной стороны, 33 из 34 проанализированных мутаций виг? локализованы в in и iv участках гена, полностью перекрывающих фрагмент гена, соответствующий области гомологии факторам элонгации трансляцм! семейства ег-tu. Данный факт mosho рассматривать как свидетельство того, что супрессорше мутации возникают преимущественно в этом участке гена. В то же время одна мутация локализована во и участке гена sup2, что говорит о еозмокности возникновения супрессорных мутаций и вне области, гомологичной факторам семейства ef-tu.

-WW-

(¿А

Рис.3. Распреде-Лбшю мутаций на делеционной карте гена Бирг. т:

Низший ряд цифр соответствует количеству мутаций, локализованных в каадом участке; в скобках - количество мутаций, влияющих на способность к дыханию.

АТГ

АТГ

Hlndlll i_

АГГ

I

pSTR2|

pSTRO

I

II

pSTRl

pSTR13

1 21(20) 12(10) 30 из 34 картированных мутаций приводят к подавлению способности к дыханию. Все они локализованы в III и Iv участках гена вирг. Остальные мутации «ирг имеют летальный эффект при повышенной температуре, что не позволяет выявить дыхательную недостаточность у соответственцих мутантов. К этой группе относится и единственная мутация, локализованная во II участке гена вирг. В связи с этим вопрос о том, может ли супрессорная мутация в этом

Sail

III

участке гена приводить к дыхательной недостаточности, остается открытым.

При анализе приведенных данных следует учитывать, что использованный набор плазмпд позволил осуществить лсть грубую оценку локализации мутаций на картах генов sufi и sup? и, вероятно, при секвенировшгаи мугантных аллелей внутри контролггруемых участков удастся выявить горячие точки или области, в которых су-прессорше мутации определенного типа возникают с повышенной частотой.

Получение и анализ мутаций, компенсирувзих дыхательную недостаточность у мутантов виг.. 1 И ачпг.

Для отбора спонтанных ресертаптов к дыхательной компетентности использовали 9 мутантов и 7 мутантов «ирг, у которых супрэссорная мутация прхпзодат к полному подавлению роста на среде СПГ при температуре 20°С.

В ходе фенотипического и генетического анализа ревортантов выяснилось, что у большинства из них (у 671 из 963) восстановление способности к дыханию обусловлено возникновением ядарной (доминантной или рецессивной) антисупрессорной мутации, т.е. мутации, подавляющей все проявления исходной мутации aupic>>. У осталышх ревертантов восстановление дыхательной компетентности не сопровождалось утратой супрессорного эффекта. Возможность отбора мутаций, компенсирующих дыхательную недостаточность без изменения других свойств супрессорных мутантов, свидетельствует о специфичности мтх эффекта мутаций eupii?«, поэтому данный класс ревертантов представлял для нас наибольший интерес.

Результаты анализа ревертантов этого типа представлены в таблице I. Мы показали, что мутации, восстанавливающие дыхательную компетентность у таких ревертантов, могут обладать как рецессивным. так и доминантным проявлением на фоне гомозиготное™ по супрессорной мутации, вызывающей блок дыхания. При этом оказалось, что у части ревертантов, полученных у мутантов eupi и несущих доминантную мутацию, эффект компенсации дыхательной недостаточности исчезает при элиминации мтх ДНК. Это проявляется в дыхательной некомпетентности гибридов, полученных в результате скрещивания таких ревертантов (после обработки бромистым этиди-ем) с тестерами «upi tr-ho*). Ha основании этих данных мы про дно-

дожили, что у этой группы ревертантов восстановление способности к дыхания, вероятнее всего, обусловлено возникновением мтх мутации. Мы обозначили такие мутации как icrd) - от англ. сотгепаа-

tlon of respiratory deflclericy.

Таблица I.

Природа мутаций, компенсирующих дыхательную недостаточность у мутантов вин и виРг.

исходный мутант исследовано рев-зреяя вызвана мутацией

айн (г > ровертантов рец.ядэр. дом.ядер. MTX

3-42Б-П39Э0 48 35 0 13

6-42Б- 198 104 31 63

10-42Б- 83 58 14 II

П8-42Б- 8 8 0 0

I33-42S- 15 4 II 0

4-60Б-П3990 II 4 4 3

5-60В- 7 2 3 2

82-2Л-П4280 3 3 0 0

I4I-2A- 35 28 3 4

eupl 421 246 66 96

37-42Б-П39ЭО 46 45 I 0

58-42Б- 21 21 0 0

64-42Б- 19 19 0 0

32-60Б-113ЭЭ0 со 31 О 0

48-2А-П4280 36 36 0 0

52-2А- 18 16 2 0

®up2 172 169 3 0

Шггогошзматическгш природа 6 мутаций этого типа была подтверждена в ходе гибридологического анализа. В мейотическом потомстве гибридов генотипа м»7-1//м>7-1 вир!// +, несущих мутации [СИРЛв], ССВ050), ССЯОвб), Г.-ЯПг»), [СР0115) и Гсгадо), полученные у 3-х мутантов вин, полностью отсутствовало расщепление по дыхательной компетентности.

Дополнительным подтверждением вдтоплазматической природа мутаций [снп] явилась их способность передаваться при цитодукции. При этом передача детерминанты гсрю) от донора (ревертанта к да-

- и -

хательной компетентности) к реципиенту (мутанту сопровож-

дается восстановлением способности к дыханию.

Таким образом, мы показали, что компенсация дыхательной недостаточности у супрессорных мутантов может быть вызвана не только ядерными (в том числе антисупрессорнши). но и мтх мутациями. При этом суммарные спектры ядерных мутаций, возникающих у мутантов üupi и «ирг, идентичны. В то ке время мтх мутации [crdj по-видимому, могут возникать только у мутантов eupl (см.табл.1).

В этой связи актуальным представлялось изучение аллельной и генной специфичности мутаций tcno). При анализе взаимодействия мутаций (csd) с мутациями supksi мы использовали их способность передаваться при цитодукции.

66-6-42Б-П3990 50-6-42Е-П39Э0 43-6-42Б-ГО9Э0 24-Ю-42Б-ПЗЭ90

rCRD66/supl-5) (CR D5P/SUP1-«) fCRDIIi/supl-6J [CRDZb/a upl-lO)

Рис.4. Изучение специфичности мутаций гсгт) методом цитодукции.

В экспериментах по цитодукции (рис.4) в качестве доноров использовали 4 ревертанта, несущие мутации гсяо), а в качестве реципиентов - 5 штаммов, маркированных мутациями вир1 или «ирг. У штаммов реципиентов предварительно элиминировали мтх ДНК. Восстановление дыхательной компетентности, обусловленное передачей мутантных митохондрий, наблюдалось не только в тех случаях, когда донор и реципиент несли одну и ту ке мутация вип, но и в тех комбинациях, где реципиент нес другую аллель аиР1 или был мутантом «ирг. У цитодуктантов, получивших детерминанту итю). ,щгха~ дахательная компетентность является стабильной характеристикой. Это свидетельствует об отсутствии строгой аллельной и генной специфичности во взаимодействии мутаций сено) и еижгк Следует отметить, что отбор цитодуктантов проводит по эффекту восстановления дыхательной компетентности. Это не позволяло различать комбинации, в которых цитодукция не происходит или происходит о низкой частотой, и случаи, в которых взаимодействие анализируе-

них мутаций не приводит к восстановлению способности к дыханию ( 9 комбинаций на рис.4). Поэтому для подтвзрждения вывода об отсутствии специфичности мы провели гибридологический анализ взаимодействия трех мутаций [спо), полученных у мутанта еип-б. с мутацией аиы-ю и разным;! аллелями вирг. Во всех проанализированных случаях в мейотическом потомстве гибридов, гетерозиготных по супрессорной мутации и несущих детерминанту [ср.о] , отсутствовало расщепление по дыхательной компетентности (табл.2). Результаты гибридологического анализа уточняют и дополняют информацию, полученную в экспериментах по цитодукции: гибриды П4244 и П4246 несут комбинации мутаций, для которых способность взаимодействовать ч восстановлением дыхательной компетентности не была выявлена методом цитодукции.

Таблица 2.

Гибридологический анализ взаимодействия мутаций (croi

с мутация}® suri и вир2.

родительские штаммы гибрид изучено исследовано

штамм с [crd] мутант вирк 2 > полных сегрегантов

тетрад всего дых.комп.

10-42Б-ПЗЭ90 П4243 8 56 56

БГ-П4241 eupt-10

[crd50) 37-42Б-П3990 П4244 24 126 126

6up2-37

10-42Б-ПЗЭЭ(Г" П4245 10 58 58

20А-П4239 eupl-10

tCRDÜfi] 37-42Б-П3990 П4246 15 75 75

eup2-37

Ю-42Б-П3990 П4248 23 97 97.

eupl-10

сегреганты 37-42Б-П3990 П4249 3 24 24

П4218

fcrd66] 48-2А-П4280 П4297 14 82 82

sup2-U8

141-2А-П4280 П4296 32 144 144

out>2-141

Таким образом, мтх мутации <сяв1 могут компенсировать дефект дыхания, обусловленный нэ только мутациями в гене БиР1. но и мутациями аирг. Это обстоятельство, очевидно, указывает на то, что гены эир1 и гир? вовлечены в контроль одной и той «е мтх функции, дефект которой может Сыть компенсирован изменением какого-то из компонентов митохондрий.

Картирование мтх мутаций, компенсирующая дыхательную недостаточность у мутантов supi и sijpg.

Для выяснения природы компонента митохондрий, измененного у мутантов tcRD], мы провели генетическое и физическое картирование этих мутаций в мтх геноме.

При генетическом картировании использовали два классических метода. Один из них основан на изучении совместного сохранения мтх маркеров у мю'-кутантов, утративших часть мтх ДНК. Такой анализ проводили у специально полученного нами штамма, маркированного двумя мтх мутациями - мутацией [скрбб] и мутацией устойчивости к эритромицину в гене mi, кодирующем структуру 21з рРНК. Мы получили и проанализировали IS9 спонтанных ггю'-мутан-тов.Ни у одного из них не было выявлено сохранения двух мутаций одновременно. Таким образом, стация [crd56] и мутация устойчивости к эритромицину при получении гло"-мутантов разделяются в 100« случаев. На этом основании мы за:<л!очили, что локализация мутаций (cRDj в гене mi маловероятна.

Второй метод был использован при изучении возмокностя лока- ■ лизации мутаций ccrdi в одном из 4-х генов, кодирующих ферменты дыхательной цепи. Он основан на исследовании способности гпо"-мутантов, несущих анализируемую мутацию в составе сохранившегося участка мтх ДНК, компенсировать дыхательную недостаточность, вызванную точковыми мтх мутациями с известной локализацией. В нашем распоряжении имелся набор из 30 таких мутантов по генам

eoxl.coxî, еохЗ И сой (СМ.рИС.5).

В этих экспериментах было проанализировано 1307 rho'-мутантов, отобранных у 4-х мутантов ccrd). В 74 случаях с помощью специального теста было выявлено присутствие мутации tcRDi в составе фрагмента мтх генома, сохранившегося у . гьо"-мутанта. Подавлящее большинство (59 из 74) fг,о"-мутантов, несущих мутацию [CR0], не образовывало дыхательно-компетентных гибридов НИ с одним из 30 мутантов ПО генам eoxl, сох2. еохЭ и ооь, что свидетельствует об отсутствии гомологии между этими генами и участком генома, несущим мутацию (crdj.

Итогом экспериментов по гене лггескому картировании явился вывод о том, что мутации ccrdi затрагивают один из пяти участков мтх генома, разделяющих гены «oxi, сохг, и mi (рис.5).

Физическое картирование мутаций сскго подтвердило зтот вывод. В экспериментах го гибридизации в качестве радиоактивных зондов использовали мтх ДНК, выделенную из восьми гио~-мутантов, 3 из которых несли мутацию [сг^еб) и 5 - мутацию [01*050). Обе мутации были получены у мутанта вир1-б. Зонды гибридизовали с рестрикционными фрагментами мтх генома штамма ш«-»а, полученными с помощью зндонуклеаз шпстт и ваших. Результаты этих экспериментов представлены'в таблице 3.

Таблица 3.

Гибридизация мтх ДНК rno'-мутантов с рестрикционными фрагментам! мтх генома штамма klii-»a.

исходный штамм номер гпо~-мутанта фрагменты, с которыми отмечена гибридизация

50-6-42Б-П3990 61 BamHI-ü HincII-10

(CRD50/'eupl-6I 52 BamHI-й HlnoII-10.-7,-8

90 BamHI-tt HlneII-10.-8

66-6-игБ-ПЗЭЭО 33 BaniHI-1 HInelI-10

[CRD66/sup1-6] 140 BamKX-ll HlncII-10, -7. -8

141 BamHI-ü HlncII-10,-7

148 BamHI-ll HineII-10. -7

51 BamHI-ü HincII- 8

Анализ этих данных позволяет сделать вывод о том, что типичной чертой ггеномов, сохранивших мутацию [crdi, является наличие гомологии с фрагментами ватш-a и nineii-ю. При этом у некоторых rho"-мутантов отмечена гибридизация только с этими фрагментами, у других выявлены зоны, соответствующие прилежащим к Hiñen —1.0 фразтлентам l!lneII-7 И HlnoII-8 (рис.5 и 6).

Фрагменты паи«-* и Híneii-io частично перекрываются. Общий их участок содержит два гена: ген vari и ген, кодирующий структуру . TPHKg06^, который расположен на границе фрагментов Hincii-e и Hinoit-io (см.рис.5). Оба гена кодируют компоненты аппарата трансляции, тем не менее более вероятным кандидатом на роль гена, в котором возникают мутации (crdi, является, очевидно, ген vari, кодирующий белок малой субчастицы мтх рибосомы. С этим , выводом хорошо согласуется тот факт, что дыхательная компетентность мутантов *upi(z) может восстанавливаться при взаимодейст-

ВИИ MTX рибосом с антибиотиками tTer-Avaneayan et »1., 1932). В обоих случаях влияние супрессорных мутаций на дахательную компетентность, по-видимому, может быть компенсировано изменением мтх рибосомы.

tffflAS

atp9

сохЗ

Рис.5. Генетическая и физическая карты мтх генома

Дрожжей эаесЬаротусев

cer>evlвlae [1Г0 работе

ВиЗоп. 1981].

-7 -8

•10

Рис.6. Максимальный и минимальный спектры гибридизации ¡-по -геномов, песта мутации

tCRDSO) и [СРР66)•

Обнаруженное нами взаимодействие ядерных и митохондриальных генов, контролирующих процессы трансляции в разных компартментах клетки, является новым типом ядерно-митохондриальных взаимодействий у дрожжей.

вывода

1. При анализе коллекции супрессорных мутантов по генам svpl и зирг, полученной в настоящей работе, показано, что подавляющее большинство этих мутантов проявляет ту или иную степень дыхательной некомпетентности, которая часто имеет условное . темпера-турозависимое проявление.

2. Разработан оригинальный экспресс-метод делеционного картирования супрессорных мутаций, основанный на использовании набора плазмид, несущих перекрывающиеся фрагменты аллелей дикого типа генов бир! и эигз.

3. С помощью этого метода показано, что супрессорные мутации с различными фенотипичесними проявлениями и разной степенью влияния на способность к дыханию могут возникать в любом из контро-

лируемых участков кодирующей последовательности гена supi.

4. Подавляющее большинство (33 из 34) мутаций, картированных б гене suri, локализовано в участке гена, перекрывающем область гомологии факторам элонгации трансляции семейства ef-tu. Окончательный вывод о неслучайном распределении супрессорных мутаций в гене sup2 требует увеличения выборки картированных мутаций и се-квенирования мутантшх аллелей.

5. Получена коллекция мутаций, восстанавливающих способность к дыханию у мутантов eupi и «ирг. Анализ реЕертантов к дыхательной компетентности позволил выявить сложную систему ядерных и митохондриальных генов, взаимодействующих с генами supi и sup2.

, 6. Изучение взашодействия митохондриальных мутаций с мутациями supi и еир2 выявило отсутствие аллельной и генной специфичности этих взаимодействий.

7. Генетическое и физическое картирование независимо полученных митохондриальных мутаций, восстанавливающих способность к дыханию у мутантов виркг), позволило локализовать их во фрагменте генома, содержащем ген vari.

8. Локализация мутаций, способных подавлять эффект мутаций ядерных генов supi и sup2, в митохондриальном гене, кодирующем белок малой субчастицы рибосомы, свидетельствует о том, что влияние мутаций »upi и вирг на митохондриальнуп трансляцию опосредовано через митохондриальную рибосому.

Основные публикации по теме диссертации:

1. Миронова Л.Н., Золеная O.A. (Троицкая O.A.),Тер-Аванесян М.Д. Ядерно-митохондриальвне взаимодействия у дрожжей: митохон-дриалышэ мутации, компенсирующие дыхательную недостаточность мутантов вирi и «ирг // Генетика. -IS86. -Т.22. -г»2. -с.200-208.

2. Миронова Л.Н., Зеленая O.A.. Судариков А.Б., Тер-Аванесяя М.Д. Взаимосвязь цитоплазматического и митохондриального белкового синтеза у дрожхей // Тез. докл. съезда ВОГиС. -M..I987. -С.53.

3. Миронова Л.Н.. Зеленая O.A.. Судариков А.Б., Тер-Аванесян М.Д. Связь цитоплазматического и митохондриального белкового синтеза у дрожжей: картирование митохондриальных мутаций, подавляющих проявление ядерных омншготентвых супрессоров // Генетика. -1988. .- Т.24. - кв. - C.I008-I0I7.

ft. Mironova L.N.. Zelenaya О.Л.. Ter-Avenesyan M.D. The interaction between mitochondrial mutations and nuclear riboeomsl suppressors in yeast // Abetr.of XII Int.Conf.on yesst ceniit.and mol.biol. - Edinburgh•19&1• - P.12.

5. Mlronova L.N., Zelenaya O.A., Sudarikov A.B,, Ter-Avane-syan M.D. Mitochondrial mutations compensating for respiratory deficiency caused by nuclear omnipotent suppressors in yeast // Genome. - 1988. - V.30. - Suppl.1.1. - P.314.

6. Ter-Avanesyan M.D., Kuahnirov V.V..Smirnov V.N.. Mlronov» L.N., Zelenaya O.A.» Inje-Veehtomov S.O. The structure and possible functions of the SUP2 (SUP35) gene of yeaet Saccharomycee cerevlslae //Genome. - 1988. - V.30. - Suppl.1.1.- P.51.

7. Mlronova L.N. * Zelenaya 0.A. Nucleo~mitochondrial inter-actlone t reversions of respiratory deficient supl and sup? mu-tenia // Yeast. - 1988. - V.4. - P.232.

8. Mlronova L.N. . Solovan S. P, .Zelenaya O.A..Zhourftvleva G. A. Nucleo-mitochonriri&l interactional nuclear mutations compensating for respiratory def lcieney in supl( sup!»5) mutants // Abstr. of XV Int. oonf. on ye&st genet. and mol,biol.- Hague«1990.- Late eubn.

9. Zelenaya 0.A.« Mlronova L.N. Localization of mutations within SUP1 (SVPtt$) gene // Abstr. XV Int. conf.on yeast genet, and mol. biol. - Hague. 1990. - Late aubtn.

10. Mlronova L.N..Zelenaya O.A. Nuclear and mitochondrial mutations neutralizing the influence of omnipotent soppreeeora on »nitochondrial translation // Materials of Int. Conf. "Genetics of respiratory enzyme« in yeast".-Wroclaw. Wroclaw Univ.Preea.- 1990 - P.86-90.