Получение и исследование лактоферрина человека, синтезируемого с молоком трансгенных мышей

Дейкин, Алексей Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и исследование лактоферрина человека, синтезируемого с молоком трансгенных мышей
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование лактоферрина человека, синтезируемого с молоком трансгенных мышей"

На правах рукописи

Дейкин Алексей Васильевич

Получение и исследование лактоферрина человека, синтезируемого с молоком

трансгенных мышей

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

- з ДЕК 2009

Москва 2009

003486864

Работа выполнена в лаборатории трансгенеза Учреждения Российской академии нау

Института биологии гена РАН.

Научный руководитель кандидат химических наук

Садчикова Елена Рубеновна

Научный консультант доктор биологических наук, профессор

Георгиева Софья Георгиевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Юдинкова Елена Станиславовна кандидат медицинских наук Городецкий Станислав Иванович

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институ

биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «'> (>> декабря 2009 года в {_{ часов на заседани Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан ноября 2009

года

Учёный секретарь диссертационного советД кандидат фармацевтических наук

Л.С. Грабовская

бщая характеристика работы

ктуальность проблемы

В современной медицине большое внимание уделяется биологически активным белкам ;ловека как лекарственным средствам. Такие белки принято называть лекарственными, они лсокоэффективны и биологически безопасны. К их числу относятся различные гормоны, ферменты, акторы свёртываемости крови, роста тканей и др. Существенным препятствием на пути развития звой области фармацевтики является практическая невозможность получения необходимых белков промышленных масштабах из жидкостей и тканей самого человека. В связи с этим в последние пятилетия для получения лекарственных белков человека использовались биотехнологические етоды, главным образом, микробный синтез. В качестве продуцентов лекарственных белков ;ловека также используются водоросли, высшие растения, грибы. Таким путём получаются кулин, интерфероны, некоторые факторы свёртываемости крови и ряд иммуномодуляторов. К >жалению, ни одна из этих биотехнологических систем не смогла в полной мере обеспечить центичность рекомбинантных белков человека природным, в частности, необходимые эсттрансляционные модификации структуры белка. Крайне сложным оказался процесс очистки 1ких рекомбинантных белков. Их применение нередко сопровождалось аллергическими реакциями пациентов. Кроме того, такое производство лекарственных белков человека оказалось сологически проблемным. В ряде стран оно выводится из хозяйственного обращения. Проблему мучения рекомбинантных белков человека также пытаются решить с использованием (■льтивируемых соматических клеток, однако этот путь длителен и дорогостоящ.

В связи с этим возникла идея в качестве биореакторов лекарственных белков человека :пользовать трансгенных сельскохозяйственных животных, в частности, продуцирующих эти белки молоком. Исследования в этом направлении ведутся в ряде индустриально развитых стран. В иработке находятся более 50 лекарственных белков человека, для одних из которых получены мнегенные животные, для других проводятся доклинические или клинические испытания.

Несмотря на отдельные практические достижения, проблема получения лекарственных белков :ловека с использованием трансгенных животных нуждается в глубокой научной проработке. В геле её актуальных вопросов находится генное конструирование, технология получения >ансгенных животных, обеспечение экспрессии генов интереса и передача трансгена в ряду зколений, получение промышленных стад животных-продуцентов.

Цель работы:

Получение и исследование ключевого белка человека - лактоферрина, обеспечивающего ггибактериальную защиту детей раннего возраста, из молока трансгенных мышей, а также выбор тгимальных генных конструкций, обеспечивающих продукцию полноценного лактоферрина гловека с молоком трансгенных животных и передачу рекомбинантного гена последующим зколениям.

Задачи:

1. Получить первичных трансгенных по различным конструкциям с геном лактоферрин человека мышей.

2. Выбрать генную конструкцию, обеспечивающую наибольшую продукцш рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных мышей.

3. Проследить передачу трансгена в ряду поколений животных.

4. Определить динамику продукции рекомбинантного лактоферрина человека н протяжении лактации.

5. Определить соответствие рекомбинантного лактоферрина человека природному п( физико-химическим и биологическим свойствам.

6. Определить влияние трансгена лактоферрина человека на состояние здоровье трансгенных мышей.

7. Определить перспективность получения первичных трансгенны: сельскохозяйственных животных - продуцентов рекомбинантного лактоферрина человека - н основе исследованных генетических конструкций.

Новизна и достоверность предложенных методов и решений материалов диссертационно! работы

Установлено, что выбранные генные конструкции обеспечивают высокий, экономически значимый уровень продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных мышей. Средний уровень продукции рекомбинантного лактоферрина человека для лучшей генной конструкции в ряду поколений трансгенных животных составил 16,7 г/л. У отдельных животных установлен высокий уровень продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком - до 40,0 г/л. В одной из линий трансгенных мышей обнаружены особи с необычно высоким уровнем продукции лактоферрина человека от 80,0 до 160,0 г/л. Определена динамика продукции рекомбинантного белка в течение периода лактации и исследована передача трансгена до 8-го поколения от первичных трансгенных животных. Для мышей, как вида многоплодных животных, установлено, что с использованием самцов и самок, трансгенных по наиболее удачным генным конструкциям, можно получить характеризующееся такими же свойствами потомство. Показано соответствие рекомбинантного лактоферрина природному по основным физико-химическим показателям и биологическим свойствам.

Практическая и научная значимость, положения, выносимые на защиту

Получены новые материалы, характеризующие экспрессию генов человека у трансгенных животных. Результаты работы реализованы при выполнении программ Союзного государства России и Беларуси «БелРосТрансген» и «БелРосТрансген-2». Усовершенствованные методы создания первичных трансгенных животных при личном участии соискателя использованы для получения первичных трансгенных сельскохозяйственных животных, что привело к рождению трансгенных

)злов Лак-1 и Лак-2, несущих в своем геноме ген лактоферрина человека. Популяционные ¡следования трансгенных мышей будут использованы при планировании создания стад >ансгенных сельскохозяйственных животных — промышленных продуцентов рекомбинантных ;лков человека.

В процессе выполнения диссертационной работы:

• Обследовано 67 первичных трансгенных по конструкциям с геном лактоферрина человека ьппей.

• Установлено, что использованные конструкции с геном лактоферрина человека обеспечивают санеспецифичную экспрессию трансгена.

• Получено 3885 потомков первичных трансгенных мышей до 8-го поколения.

• Определён уровень продукции рекомбинантного белка в зависимости от использованной :нетической конструкции, количества копий встроившегося трансгена, дня лактации и возраста истирующей самки мышей.

• Проведено сравнение свойств рекомбинантного лактоферрина, выделенного из молока >ансгенных мышей, и природного белка человека.

• Определена перспектива получения на основе исследованных конструкций первичных >ансгенных коз.

Апробация работы и личный вклад соискателя

Результаты работы представлены на 8-й и 9-й международных конференциях «Лактоферрин: груктура, функция и использование» (г. Ницца, Франция, 2007; г. Пекин, Китай, 2009) и на эссийском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Казань, Россия, 2009).

Соискатель проанализировал литературу по теме исследования, осуществил планирование сспериментов, их научный анализ и статистическую обработку полученных результатов, которые редставил в статьях и докладах на конференциях. В ходе выполнения диссертационной работы ¡тор овладел современной технологией получения трансгенных животных методом микроинъекции жомбинантной ДНК в мужской пронуклеус зигот, методами культивирования эмбрионов, а также редложил ряд оригинальных, практически значимых усовершенствований в технологию вымывания трансплантации эмбрионов животных. Соискателем созданы уникальные линии трансгенных ышей, позволившие изучить характер передачи трансгена и условия, обеспечивающие высокую родукцию рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных животных, которые гпонированы в «Трансгенбанке» ИБГ РАН.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 121 странице, состоит из следующих разделов: введение, обзо литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (22: источников). Работа содержит В таблиц и 31 рисунок.

Результаты и обсуждение

Генные конструкции

В лаборатории академика Ю.В. Ильина Учреждения Российской академии наук Институт биологии гена РАН были получены 9 генных конструкций, содержащих ген лактоферрина человек; Конструкции были созданы на основе вектора рВС1 из набора "pBCl Milk Expression Vector Kit (Invitrogen):

• LTF2 - кДНК лактоферрина размером 2100 п.н., клонирована в вектор рВС 1 по сайту Xhol;

• LTF3 - гибридная конструкция лактоферрина, первая часть которой - геномная копия с 1 по экзон (14479 bp, с ATG кодона до Smal сайта), а вторая часть - кДНК (1331 bp, от Smal сайта до Sto; кодона), клонирована в вектор pBCl по сайту Xhol. Эти две части состыкованы по Smal сайту, который находится в 7 экзоне. 3' некодируемая область из гена Р-казеина коз;

• LTF4 - кДНК лактоферрина размером 2100 п.н., клонирована в вектор pBCl по сайту Xhol, промотор заменён на а-казеиновый;

• LTF5 - геномная последовательность лактоферрина длиной 35013 bp, начиная с ATG кодона, клонирована в вектор pBCl по сайтам Xhol и NotI;

• LTF6 - геномная последовательность лактоферрина длиной 28672 bp, начиная с ATG кодона, клонирована в вектор pBCl по сайту Xhol, промотор заменён на а-казеиновый;

• LTF7 - геномная последовательность лактоферрина длиной 28672 bp, начиная с ATG кодона, клонирована в вектор pBCl по сайту Xhol;

• LTF8 - из конструкции LTF7 удалены инсуляторы перед р-казеиновым промотором;

• LTF10 - геномная последовательность лактоферрина длиной 35013 bp, начиная с ATG кодона, клонирована в вектор pBCl по сайтам Xhol и NotI, промотор заменён на собственный промотор гена лактоферрина человека;

• LTF11 - гибридная конструкция лактоферрина, первая часть которой - геномная копия с 1 по

7 экзон (14479 bp, с ATG кодона до Smal сайта), а вторая часть - кДНК (1331 bp, от Smal сайта до

Stop кодона), клонирована в вектор pBCl по сайту Xhol. Эти две части состыкованы по Smal

сайту, который находится в 7 экзоне. 3' некодируемая область из гена лактоферрина человека;

На рисунке 1 представлены наиболее удачные конструкции.

LTF2 -^рзжх^ЧИИИНН!—

LTF5 т==^Н I 1 I 1 I I I I I I I 1 I I I с—

LTF7 -ДВз^И I I I I I I I I I I I I I I I Ш-

LTF8 -сашН I I I I I I I I I I I I I I I Ш— LTF10 11 1 1 I I I I I I I I I I I 0-

LTFU -ЩдзеН I I I I I ШШ1-

?исунок 1. Структура наиболее удачных экспрессионных конструкций с геном лактоферрина человека. Две опии инсулятора отмечены крестами, серым цветом выделен ß-казеиновый промотор, серым со штриховкой -ромотор гена лактоферрина человека, чёрным отмечены кодирующие области лактоферрина, белым j отмечены нетранслируемые области.

I Получение переи чпых трансгепных мышей

1 В совокупности рекомбинантной ДНК было микроинъецировано в мужской пронуклеус 3905 зигот, которые пересадили 231 реципиенту. В результате было получено 324 животных-, рансплантатов, среди которых 1,72% оказались трансгенными. При этом было отмечено, что количество рождающегося потомства варьировало от сезона, когда проводились эксперименты.

Мы пытались увеличить количество трансплантируемых эмбрионов, однако это не давало соответствующего увеличения выхода мышат. Интересным оказался следующий факт: увеличение количества трансплантированных эмбрионов не приводит к увеличению выхода мышат (коэффициент ранговой корреляции Спирмена 0,13), как и выхода трансгенов (коэффициент ранговой корреляции -0,18). Среди родившихся трансгенных мышат отхода практически не было.

Специфичность экспрессии трансгена

Продукция лактоферрина человека в целом была тканеспецифичной в молочной железе. Для анализа были взяты образцы тканей и органов трансгенных по конструкциям LTF5, LTF10 и LTF11 мышей.

Передача трансгена в ряду поколений трансгенных мышей

Из 67 первичных трансгенных мышей потомство было получено от 54 (80,6%), а трансгенные потомки были только у 44 (81,5%) из них, 23 (34,3%) первичных трансгена не оставили трансгенного потомства. Размножались, но не передали трансген потомству 8 первичных трансгенных самок и 2 первичных трансгенных самца, от которых было получено 152 потомка. I От 18 (56,3%) передающих трансген потомкам первичных трансгенных самок в Fl было | получено 360 мышат: из них 157 (43,6%) самцы, 203 (56,4%) самки; трансгенными оказались 118 (32,8%) животных: 51 самец (32,5%) и 67 самок (33%). Внутри различных линий эффективность передачи трансгена в 1-ом поколении значительно варьировала: от 85,7% в линии LTF5 146 до 6,8% влинии1ЛТ11 126.

От 26 (74,3%) передающих трансген потомкам первичных трансгенных самцов в Fl было

получено 1023 мышонка: из них 494 (48,3%) были самцами, 529 (51,7%) самками; трансгенными

оказались 295 (28,8%) животных: 129 самцов (26,1%) и 166 самок (31,4%). Внутри различных линий эффективность передачи трансгена в 1-ом поколении также варьировала от 73,3% в линии 1ЛТ5 138 до 3,4% в линии ЬТИб 728. Эти значения были рассчитаны для популяции в целом, но, поскольку речь идёт о размножении значительного числа первичных трансгенных животных, мы статистически обработали данные по отдельным линиям. Результат такого анализа представлен на рисунке 2.

1 Потомство первичных трансгенных самцов

3 Потомство первичных трансгенных самок

¿7

Рисунок 2. Статистический анализ результатов размножения первичных трансгенных мышей.

Из рисунка 2 видно, что для всех случаев отличия в количестве трансгенных потомков первичных трансгенных самцов и самок являются статистически недостоверными. Интересно отметить, что в целом для популяции и для потомков, как самцов, так и самок достоверно отличаются значения количества самцов и самок в Р1; это, по-видимому, отражает биологическую закономерность репродукции этого вида в данных условиях содержания. В то же время достоверных различий между долями трансгенов среди самцов и самок в Б1 нет, что указывает на не зависимое от пола наследование рекомбинантного гена, а большее количество трансгенных самок связано с большим количеством самок в И1.

В базе данных мы имеем записи о размножении отдельных первичных трансгенов до Р8 (линия 1ЛТ2 219), в-среднем же, первичные трансгены были размножены до 2-3-го поколения. До Р5 результаты размножения первичных трансгенов могут быть статистически обработаны, до Р6-Р8

азмножены только отдельные линии. Результат нашего анализа представлен на рисунке 3. Для равнения приведён результат для Р1, но при расчёте среднего для всех поколений он не учитывался, оскольку значительные отклонения (особенно для самцов) связаны с индивидуальными : собенностями первичных трансгенных животных-родителей, в частности, с их возможной :озаичностью.

ш 40,0%

30,0%

20,0%

10,0%

0,0%

Eli" Потомство первичных трансгенных самцов

Потомство первичных трансгенных самок

»—»««Среднее для F2-F5

Рисунок 3. Передача трансгена в поколениях.

Из рисунка 3 видно, что, во-первых, значимых различий в эффективности передачи трансгена в околениях в линиях первичных трансгенных самцов и самок нет, во-вторых, нет значимых ~ азличий между эффективностью передачи трансгена в F2-F5 и средним для всех поколений уровнем ^0%. Показатель этот является крайне важным, поскольку определяет возможность получения на :снове исследованных конструкций с помощью использованного метода первичных трансгенных " ельскохозяйственных животных и стад их потомков без риска значительного снижения уровня передачи трансгена в поколениях и без необходимости получения гомозиготных по трансгену животных.

Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком первичных трансгенных самок и дочерей первичных трансгенных самцов мыши

В экспериментах по гену лактоферрина человека было получено 67 первичных трансгенных мышей. Из них самок - 32 (48%). У 25 (78%) из них были взяты пробы молока, всего 46 образцов. Из 7 первичных трансгенных самок, не охарактеризованных по продукции рекомбинантного белка с молоком, 6 потомства не дали и не лактировали.

Первичные трансгенные самки получены для всех исследованных ДНК-конструкций с генок: лактоферрина человека, кроме 1ЛТ6. Максимальный уровень продукции рекомбинантного белка с молоком этих мышей составил 40,0 г/л (1ЛТ5), средний для всех конструкций 7,1±1,43 г/л, средний для лучшей из конструкций ЬТР5 - 27,0±5,58 г/л (рисунок 4.).

^ 30

? о 25 х = о 5 5

о и 20

г и

а. х

3 -е-

Ш средний уровень продукции Ш максимальный уровень продукции

1ТРЗ 1ЛТ5 1ЛТ7

Конструкция

Рисунок 4. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком первичных трансгенных самок.

На рисунке 4 сравниваются максимальные и средние уровни продукции рекомбинантного белка в молоке первичных трансгенных по гену лактоферрина человека мышей в зависимости от использованной генной конструкции. Приведены результаты только для конструкций, для которых первичные трансгенные мыши продуцировали этот белок с молоком. Первичные трансгенные самки по конструкциям 1ЛТ4, 1ЛТ10 и 1ЛТ11 не показали продукции рекомбинантного белка в молоке, и в диаграмме их результаты не указаны, но при расчёте среднего уровня продукции для всех конструкций они учитывались. Из диаграммы видно, что продукция лактоферрина человека с молоком первичных трансгенных по конструкции 1ЛТ5 мышей значительно превосходила как по максимальному, так и по среднему значению остальные варианты, даже с учётом значительных колебаний индивидуальных значений для разных животных.

Тут же надо отметить, что уровень продукции рекомбинантного белка мышами, трансгенными по конструкции 1ЛТЗ, практически соответствует среднему для всех конструкций, а фактически выше всех, кроме 1ЛТ5, и значительно более стабилен. Максимальный результат для конструкции ЬТРЗ также уступает только таковому для 1ЛТ5. Остальные конструкции продемонстрировали средний результат от 2,0 г/л до 4,11 г/л. Из 25 охарактеризованных по продукции лактоферрина человека с молоком первичных трансгенных мышей 6 (24%) рекомбинантного белка не

родуцировали; в то же время в молоке самок и ¥2, полученных от одной из этих мышей, онцентрация рекомбинантного белка достигала 18,7 г/л. Большое количество трансгенных, но не редуцирующих белок с молоком животных можно объяснить, во-первых, высокой вероятностью ождения животных-мозаиков при использовании метода микроинъекции ДНК в пронуклеус зигот )ни, неся трансген в коже, могут не иметь его в молочной железе); во-вторых, из-за неспецифичного страивания трансгена в геном возможна ситуация, когда генетическое окружение препятствует кспрессии гена, несмотря на наличие инсуляторов в составе конструкции.

На рисунке 5 сравниваются индивидуальные значения максимального уровня продукции екомбинантного белка и количество копий трансгена в геноме мыши. Мы располагаем такими езультатами для 9 животных. В эту выборку не вошла самка, показавшая максимальный уровень родукции рекомбинантного белка (160,0 г/л), так же как и первичные трансгепные мыши, не родуцирующие лактоферрин человека в молоке.

И 11 ч I

О и

♦

/......

♦ индивидуальные результаты для первичных трансгенных по разным конструкциям мышей

20 30 40

Количество копий трансгена

Рисунок 5. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком первичных трансгенных самок в зависимости от количества встроившихся копий трансгена.

Коэффициент ранговой корреляции оказался равен 0,6, что соответствует умеренной корреляции, причём корреляция оказалась положительной.

Из рисунка 5 видно, что наибольшему уровню продукции рекомбинантного белка у первичных трансгенных самок соответствует наибольшее количество встроившихся копий трансгена, в то время как 1 копия в среднем обеспечивает продукцию рекомбинантного белка на уровне 7,03±2,8 г/л.

Сравнивая этот результат с данными по всей популяции, можно отметить, что на большей выборке средняя продукция рекомбинантного белка при встроившейся 1 копии трансгена составила 5,88±1,2 г/л, а максимальному значению продукции в 160,0 г/л соответствует максимальное количество копий встроившегося трансгена - 230.

Охарактеризовать первичных трансгенных самцов мыши по продукции рекомбинантного лактоферрина человека можно, исследуя молоко их дочерей. Такая постановка задачи - единственно возможная, и это удлиняет время получения результата, но в итоге мы имеем значительное число образцов для анализа.

Из 67 первичных трансгенных по гену лактоферрина человека мышей 35 (52%) оказались самцами. Трансгенные самцы получены для всех конструкций. Из них 7 (20%) не оставили потомства, а из 28 размноженных 3 (11%) не дали трансгенного потомства. У 4 первичных трансгенных самцов (в том числе, у всех трансгенных по конструкции 1ЛТ4 самцов) трансгенные дочери были получены, молоко от них мы не брали. Таким образом, по продукции рекомбинантного белка с молоком дочерей был охарактеризован 21 первичный трансгенный самец. Проанализировано 130 проб молока от 90 трансгенных дочерей первичных трансгенных самцов.

Конструкция

Рисунок 6. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком дочерей первичных трансгенных самцов.

Максимальный уровень продукции рекомбинантного белка с молоком дочерей первичных трансгенных самцов, зарегистрированный в наших экспериментах, составил 160,0 г/л (1ЛТ5),

средний для всех конструкций - 13,95±1,68 г/л, средний для лучшей конструкции ЬТР5 -25,26±5,0 г/л (рисунок 6). На рисунке 6 для удобства анализа не указан максимальный результат для конструкции 1ЛТ5, а для конструкции 1ЛТ8 не приводится средний результат, поскольку была взята только одна проба молока и материала для статистической обработки недостаточно. На рисунке 6 можно видеть, что продукция лактоферрина человека с молоком дочерей первичных трансгенных по конструкции 1ЛТ5 самцов, как и в случае первичных трансгенных самок, значительно превосходила как по максимальному (160,0 г/л для 1ЛТ5), так и по среднему значению остальные варианты. Результат для трансгенов по конструкции ЬТР5 можно объяснить особенностями генетической конструкции и её объективным превосходством по функциональности. Высокий средний результат продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком дочерей связан с индивидуальными особенностями полученных первичных трансгенных самцов, в частности, с большим количеством встроившихся в их геном копий трансгена.

Результат сопоставления количества копий трансгена в геноме дочерей первичных трансгенных самцов и уровня продукции рекомбинантного белка в их молоке представлен на рисунке 7А. Главным аргументом в пользу состоятельности выдвинутой гипотезы о связи уровня продукции рекомбинантного белка с количеством трансгена, как и ранее, может быть статистический анализ. Коэффициент ранговой корреляции для индивидуальных значений, полученных для отдельных трансгенных мышей Р1 от первичных трансгенных самцов, составил 0,47, что соответствует, как и в случае первичных трансгенных самок, умеренной положительной корреляции. Точки на рисунке 7А можно разделить на четыре группы: первая группа значений образует облако в районе от 1 до 22 копий трансгена и от 1,71 до 21,0 г/л рекомбинантного белка в молоке (коэффициент ранговой корреляции 0,82); вторая группа точек - 39-43 копий трансгена и 8,06-18,15 г/л рекомбинантного белка (коэффициент ранговой корреляции 1,0); третья зона — 44-60 копий трансгена и 6,0-20,2 г/л рекомбинантного белка (коэффициент ранговой корреляции 0,5), четвёртая группа - 62-77 копий трансгена и 12,6-20,7 г/л рекомбинантного белка (коэффициент ранговой корреляции 0,47), пятая группа - 74-93 копий трансгена и 4,9-20,3 г/л рекомбинантного белка (коэффициент ранговой корреляции 0,5). Приведённые результаты необходимо рассматривать с известной долей осторожности, поскольку при определении количества копий трансгена ошибка метода составляла 10-15%, что несколько «смазывает» отмеченную тенденцию (особенно для группы 2).

Обратимся к рисунку 7Б, на котором рассмотрены точки этих групп. Точки из группы 1 характеризуют потомков трёх самцов: 1ЛТ5 138, 1ЛТ7 704 и 1ЛТ7 803 (за исключением мыши 1906 Р1 704, из-за аномального для этой линии количества копий трансгена). Группа 2 образована результатами для потомков первичного трансгенного самца ЬТР7 864, группа 3 -1ЛТЗ 373, группа 4 -1ЛТЗ 281, группа 5 -1ЛТ5 145. В группы не вошли мыши 1304 Р1 281 и 1723 Р1 864 из-за нехарактерных для данных линий отклонений в уровне продукции рекомбинантного белка. Из диаграммы видно, что, во-первых, большему количеству копий трансгена в пределах конкретной

линии соответствует большая продукция рекомбинантного белка; во-вторых, в пределах одной линии конкретному количеству копий трансгена соответствует определённое, с незначительными колебаниями, характерными для продукции рекомбинантного белка в разные дни лактации, значение количества лактоферрина человека в молоке. Остальные точки рисунка 7А представляют индивидуальные данные для одиночных потомков отдельных линий, и, как сказано ниже, лишь предоставляют возможность определить соотношение копийности к продукции белка, но не позволяют судить о тенденциях, обозначенных выше.

♦ индивидуальные значения для трансгенных дочерей первичных трансгенных по разным конструкциям самцов

Количество копий трансгена

Рисунок 7А. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком дочерей первичных трансгенных самцов в зависимости от количества встроившихся копий трансгена.

Количество копий грансгена

Рисунок 7Б. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком некоторых дочерей первичных трансгенных самцов в зависимости от количества встроившихся копий трансгена.

Вернувшись к рисунку 7А, можно обнаружить несколько тенденций. Во-первых, выбранный нами способ опосредованной оценки «качества» трансгенных самцов адекватен. Он позволяет охарактеризовать животное по исследованному признаку и сделать объективное предположение о перспективности линии. Во-вторых, доза рекомбинантного гена по-разному проявляется фенотипически и для каждой линии первичных самцов (145 линия - 1,3 (г/л)/копию, 138 линия - 0,12 (г/л)/копию). Это связано как с различными сайтами интеграции трансгена, контролировать которые при использовании применяющегося у нас метода микроинъекции в пронуклеус зигот не представляется возможным, так и с феноменом снижения вклада копий в уровень продукции рекомбинантного белка с увеличением их количества, рисунок 8. В-третьих, в целом для выборки повторяется закономерное внутри групп распределение - большему количеству копий соответствует большая продукция рекомбинантного белка, особенно в случае экстремальных значений.

1 1

£ 1

" 8

-е- * о

Ь- X

£ 4

™ о X

К 1» с

О I о

О Я ^

X °

Р о 5

20 18 16 14 12 10

х « "

Ю 3 I

г о £

о ! и

* 5 1

щ га

а. с о.

♦ Индивидуальные результаты для трансгенных мышей

100

150

200

Количество копий трансгена

Рисунок 8. Фенотипическое проявление дозы трансгена.

Экстраполируя результаты, полученные на дочерях первичных трансгенных самцов, необходимо учитывать характер распределения трансгена в 1-ом поколении. В связи с тем, что интеграция трансгена происходит неконтролируемо в произвольные сайты встраивания, в 1-ом поколении количество трансгенов в потомстве может значительно варьироваться, и конкретные показатели передачи трансгена потомству могут указывать на мозаичность, встраивание в один или несколько сайтов в геноме, встраивание в половые хромосомы. В случае первичных трансгенных самок мы можем анализировать непосредственно результаты определения копийности встроившегося трансгена (хотя и без учёта возможной мозаичности) и уровень продукции рекомбинантного белка. Поскольку копийность встроившегося трансгена не определялась без привязки к уровню продукции рекомбинантного белка, мы не располагаем прямыми данными по

самцам, и характеризовать первичных трансгенных самцов по копийности трансгена и продукции рекомбинаптного белка в Р1 необходимо с учётом обозначенных оговорок.

Животные с необычно высоким уровнем продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком

В процессе выполнения исследований регистрировались животные, уровень продукции лактоферрина человека с молоком у которых превышал 20,0 г/л. Прежде всего, такие мыши были выявлены среди первичных трансгенных самок, полученных с использованием конструкции 1ЛТ5 (№116 - 33,0 г/л и №146 - 40,0 г/л). В потомстве этих самок максимальное значение продукции 28,0 г/л у самки №159 Р11ЛТ5 116 и 27,2 г/л у самки №1058 Р21ЛТ2 146.

Среди дочерей первичных трансгенных самцов по конструкции ЬТР5 также имелось большое количество животных, показавших высокий уровень продукции рекомбинантного лактоферрина с молоком.

Среди потомков первичного трансгенного самца 1ЛТ5 113 были обнаружены самки с необычно высоким уровнем продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком. Была зарегистрирована самка № 3190 Р1 1ЛТ5 113, в молоке которой оказалось наивысшее для всех исследованных ранее животных количество рекомбинантного белка с молоком - 160,0 г/л по первой лактации. Во второй и третьей лактации уровень продукции рекомбинантного лактоферрина у данной самки снизился, однако продолжал оставаться высоким - 102,95 г/л. Эта самка привлекла наше внимание и была взята в размножение. Были получены дочери, уровень продукции лактоферрина человека в молоке которых достигал 117,0 г/л, таблица 1. Все эти животные характеризовались многокопийностью встроенного гена. Так, у самки № 3190 П ЬТР5 113 выявлено 230 копий трансгена.

Наибольшее количество работ по получению животных-продуцентов рекомбинантных белков было выполнено на трансгенных мышах, полученных с использованием традиционного метода микроинъекции ДНК в пронукпеус зигот, на которых отрабатывался дизайн генных конструктов. Как известно, уровень продукции рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных существенно варьирует в зависимости от использованных генных конструктов и места их интеграции в геном. Для возможности сравнения опубликованных материалов нами были взяты максимально достигнутые показатели продукции рекомбинантного лактоферрина человека, отражающие некую идеальную ситуацию. Тем более что в ряде работ авторы представляли единичных первичных трансгенных животных. Наивысший показатель продукции рекомбинантного лактоферрина человека в молоке трансгенных мышей не превышал 29,8 г/л. Соответственно этому низкими были и средние показатели экспрессии, варьирующие около 5,4 г/л.

Таблица 1. Уровень продукции рекомбинантного лактоферрина человека в молоке трансгенных самок -

ЬТР5

113

Р1

^омер лактация 1, г/л лактация 2, г/л лактация 3, г/л |

121 13,0 20,5 24,5

127 32,0 33,1

164 16,4

167 8,1

175 33,0

185 22,3

3143 38,6 41,0

3145 23,7

3147 34,2 31,7

3190 160,0 102,0 95,0

Р2

номер лактация 1, г/л лактация 2, г/л

3084 30,0

3081 32,8

3596 6,96

3093 30,3

4804 89,0

4607 80,9 77,3

4606 117,0

РЗ

Я и

номер те К Я га н га

4851 41,3

4794 86,0

4876 19,4

4875 44,6

4856 97,0

Имеется много литературных данных о необычно высоком уровне продукции рекомбинантных белков в молоке различных видов трансгенных животных, в их ряду можно указать на синтез а-антитрипсина с молоком трансгенных овец - 60,0 г/л.

Продукция рекомбинантного лактоферрина человека в поколениях трансгенных по гену лактоферрина человека мышей в зависимости от линии, конструкции, копийности встроившегося трансгена

Всего от 229 трансгенных самок-потомков первичных трансгенных мышей получено 315 проб молока, средний уровень продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком составил 12,55 г/л. Результаты статистического анализа среднего уровня продукции рекомбинантного белка с молоком в зависимости от внедрённой генетической конструкции представлены на рисунке 9. Из диаграммы видно, что явными аутсайдерами являются конструкции ЬТИб (1,2 г/л) и 1ЛТ2 (5,2 г/л), максимальный уровень продукции рекомбинантного белка с молоком обеспечивает конструкция 1ЛТ5 (16,7 г/л). Группа конструкций 1ЛТ7-1ЛТ11 обеспечивает близкий и стабильный уровень продукции рекомбинантного белка с молоком, отстаёт от них по среднему уровню продукции 1ЛТЗ (он достоверно ниже, чем у 1ЛТ7 и 1ЛТ11).

Рассматривая колебание уровня продукции рекомбинантного белка в поколениях, необходимо отметить, что хотя колебания индивидуальных значений оказались значительными, от 30% для Р2 1ЛТ8 до 173% для Р4 1ЛТ7, для всей популяции уровень продукции рекомбинантного белка во всех поколениях в среднем был близок к 100% и корреляции между уровнем продукции рекомбинантного белка и поколением мышей не обнаружено (коэффициент ранговой корреляции 0,07).

Рисунок 9. Продукция лактоферрина человека в поколениях трансгенных мышей в зависимости от использованной генной конструкции.

Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных самок мыши в течение периода лактации

Важным фактором для оценки работоспособности ДНК-конструкции с геном лактоферрина является динамика продукции рекомбинантного белка в период лактации. Особую значимость этот показатель имеет в случае организации промышленного производства рекомбинантных белков. Сложность оценки этого параметра у мышей состоит в том, что лактация у этого вида животных продолжается, в среднем, 21 день. Практика показывает, что отбирать молоко более двух раз и с периодом менее трёх дней опасно как для самой лактирующей самки, так и для её потомства. Мышь может отказаться выкармливать детёнышей из-за перенесённого стресса или же съесть их. Кроме того, лактирующая самка может погибнуть из-за аллергической реакции на наркоз. Этот риск повышается при повторной наркотизации через короткий промежуток времени. В сочетании с технической сложностью процесса доения это привело к тому, что, даже располагая значительной популяцией трансгенных мышей, мы можем привести сравнительно небольшое количество таких экспериментов. Тем не менее, они позволили достоверно судить о динамике продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных самок. График изменения уровня продукции рекомбинантного белка в течение лактации строился на основании следующих расчётов: рассматривались только мыши, пробы молока у которых брались несколько раз в разные дни лактации (как в течение одной, так и нескольких лактаций). Для каждой мыши определялось среднее значение продукции рекомбинантного белка и индивидуальные значения продукции в конкретный день лактации; эти значения определялись как процентная доля от среднего для данной мыши, рисунок 10.

Хотя индивидуальные колебания уровня продукции рекомбинантного белка в молоке были весьма значительными - от 9,5% до 190%, в среднем для популяции уровень продукции с 4 по 17

день лактации был наиболее высоким и сохранялся на уровне 100%. С 1 по 4 день лактации наблюдался рост продукции лактоферрина человека, а с 17 по 20 день - снижение продукции рекомбинантного белка.

Также мы обнаружили, что мыши в течение всего репродуктивного периода показывали относительно постоянный уровень продукции рекомбинантного белка; хотя индивидуальные колебания подчас были значительными, с возрастом они уменьшались. Эти результаты в известной степени оригинальны, поскольку для многих других белков ранее была показана неравномерность продукции, выражающаяся в высоком уровне в начале и снижении этого показателя к концу лактации.

Указанные результаты относятся к тем генным конструкциям, в которых использовался Р-казеиновый промотор из гена коз. Кроме того, мы имели две генные конструкции, в одной из которых использовался а-казеиновый промотор из гена коз (ЬТРб), а в другой (1ЛТ10) -собственный промотор гена лактоферрина человека. Для этих групп динамика продукции рекомбинантного белка в течение лактации носит аналогичный выявленной тенденции характер.

На основе популяционного анализа мы можем сделать вывод, что предложенные конструкции обеспечивают стабильную продукцию в течение всего репродуктивного периода и всей лактации как в целом для популяции, так и для конкретных животных. Разницы по этим параметрам для отдельных конструкций мы не обнаружили, что вполне предсказуемо, поскольку регуляторные последовательности созданы на основе высокоэффективных молочных промоторов, а структура кодирующей последовательности влияет, как оказалось, на уровень продукции, но не на его стабильность.

Рисунок 10. Динамика продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных самок мыши в течение лактации.

Физико-химические и биологические свойства рекомбинантного лактоферрина человека из молока трансгенных мышей

Для оценки физико-химических и биологических свойств рекомбинантного лактоферрина человека из молока трансгенных мышей совместно с отделом молекулярной генетики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН была выполнена серия физико-химических исследований.

Выделенный нами рекомбинантный лактоферрин человека насыщен Fe3+ в среднем на 50%. В грудном молоке лактоферрина человека на 75-88 % представлен апо-формой.

Для полностью насыщенных Fe3+ и апо-форм лактоферрина человека и рекомбинантного лактоферрина человека были получены спектры кругового дихроизма. Значения содержания а-спиралей - 0,40, ß-слоев - 0,2 и ß-поворотов - 0,18. Полученные результаты свидетельствуют в пользу нативной конформации рекЛФ и его апо-формы.

Рекомбинантный и природный лактоферрины человека различались по характеру взаимодействия с лектином (конканавалин А). При хроматографии этих препаратов на СопА-Сефарозе рекомбинантный белок сорбировался на смоле и эффективно элюировался 50-250 мМ а-метил-О-маннозидом, а природный лактоферрин человека не взаимодействовал со смолой. Такой результат говорит о различном характере гликозилирования рекомбинантного и природного лактоферринов человека.

При сравнении кинетики трипсинолиза природного и рекомбинантного лактоферринов человека, разделенных электрофорезом в ПААГ, для рекомбинантного лактоферрина человека наблюдали появление дополнительных фрагментов, постепенно исчезавших в ходе протеолиза. Поскольку известно, что на подверженность лактоферрина трипсинолизу влияет степень гликозилирования белка и степень насыщения железом, наши результаты еще раз указывают на необходимость тщательного анализа пост-трансляционных модификаций.

По характеру взаимодействия с ДНК, ЛПС и гепарином природный и рекомбинантный лактоферрины человека не отличались. Рекомбинантный лактоферрин человека образовывал с ЦП комплекс, который выявлялся по задержке оксидазной ЦП-содержащей зоны при электрофорезе в ПААГ в щелочных неденатурирующих условиях. Добавление к такому комплексу гепарина, ДНК и ЛПС приводило к восстановлению электрофоретической подвижности ЦП, что позволяет говорить о взаимодействии рекомбинантного лактоферрина человека с этими веществами и о вытеснении ими ЦП из комплекса. Также показано, что природный и рекомбинантный лактоферрин человека связываются с гепарином, иммобилизованным на Сефарозе 4В.

Показано, что характер агглютинации протопластов М. luteus природного и рекомбинантного лактоферринов человека не различался.

Бактерицидную активность против Е. coli и Listeria monocytogenes, а также фунгицидную активность против Candida albicans выявляли методом радиальной диффузии в агарозном геле после электрофореза в ПААГ в присутствии мочевины и уксусной кислоты. Отмечено, что природный и рекомбинантный лактоферрин человека проявляли активность, препятствующую развитию микроорганизмов, тогда как лактоферрин мыши не проявлял такой активности.

Таким образом, рекомбинантный белок проявлял свойства, присущие лактоферрину человека, а именно: связывался с полианионами (ДНК, ЛИС и гепарином), проявлял антимикробную активность, эффективно связывал ионы железа. Выявленные нами отличия в характере гликозилирования не сказались на функциональной активности рекомбинантного лактоферрина человека.

Патоморфологический и гистологический анализ трансгенных мышей

Для оценки состояния здоровья подопытных животных совместно с лабораторией биологических испытаний филиала Института биоорганической химии им. академиков Л.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова был выполнен патоморфологический и гистологический анализ 4 (2 самца и 2 самки) трансгенных мышей с конструкцией LTF5 (давшей наибольший уровень продукции лактоферрина человека с молоком) в сравнении с 4 (2 самца и 2 самки) интактными мышами. Обследовались половозрелые животные, находящиеся на стандартном рационе кормления.

В процессе наружного осмотра мышей, а также визуальной оценки органов брюшной и грудной полостей, органов шеи, головного и спинного мозга каких-либо патологических отклонений, характеризующих каждую из групп обследованных животных, отмечено не было, что позволило сделать заключение об их удовлетворительном состоянии.

При проведении гистологического исследования тканей и органов опытных и контрольных животных были изучены следующие внутренние органы и ткани мышей: головной мозг, спинной мозг, селезёнка, брыжеечные лимфоузлы, тимус, лёгкие, сердце, почки, надпочечники, кожа, кожа с молочной железой, двуглавая мышца бедра, щитовидная железа, мочевой пузырь, поджелудочная железа, печень, желудок, кишечник, двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, слепая кишка, ободочная кишка, прямая кишка; яичники и матка (у самок); семенные придатки, предстательная железа, семенники (у самцов).

На основании патоморфологического исследования сделано общее заключение о том, что мыши, трансгенные по гену лактоферрина человека, соответствуют физиологической норме для этого вида животных, поскольку единичные цитологические изменения, обнаруживаемые на гистологических препаратах, в равной мере были присущи как опытным, так и контрольным животным.

Выводы

1. Выбрана оптимальная из 9 исследованных генная конструкция, обеспечивающая наибольшую (в среднем 16,7 г/л и максимум 160,0 г/л) продукцию рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных мышей - 1ЛТ5. Она состоит из геномной копии гена лактоферрина человека и находится под контролем р-казеинового промотора, инсуляторов кластера р-глобиновых генов кур.

2. Прослежена передача трансгена в ряду 8-ми поколений 3885 потомков 67 первичных трансгенных мышей. Количество трансгенных потомков в 1-ом поколении колебалось от 3,4% (линия 1ЛТ6 728) до 85,7% (линия 1ЛТ5 146), во 2-ом и последующих поколениях средний уровень передачи трансгена потомству приближался к 50% и его колебания уменьшились.

3. Установлено, что продукция рекомбинантного лактоферрина человека тканеспецифична и с 4 по 17 день лактации остаётся стабильной, находясь на уровне среднего для мыши в разные дни лактации.

4. Установлено, что рекомбинантный лактоферрин человека, выделенный из молока трансгенных мышей, аналогичен лактоферрину молочной железы женщин по физико-химическим и биологическим свойствам; некоторое отличие состоит в уровне гликозилирования рекомбинантного белка.

5. Определено, что трансген лактоферрина человека не влияет на состояние здоровья и репродуктивную способность трансгенных мышей.

6. Показана перспективность использования исследованных генетических конструкций для получения трансгенных сельскохозяйственных животных - продуцентов рекомбинантного лактоферрина человека с молоком.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи:

A.B. Дейкин, Т.Г. Ермолкевич, И.Л. Гольдман, Я.Г. Гурский, А.Н. Краснов, А.Н. Попов, :.Г. Георгиева, С.Л. Кузнецов, В.Г. Деревянно, Н.И. Новикова, А.Н. Мурашёв, Е.Р. Садчикова. Состояние здоровья и воспроизводительная способность трансгенных мышей, продуцирующих с юлоком рекомбинантный белок человека лактоферрин. ДАН. 2009;427(4),545-548.

Материалы научных конференций:

Goldman I.L., Krasnov A.N., Kadulin S.G., Ermolkevich T.G., Gursky Ya.G., Deikin A.V.. ieorgieva S.G., Sadchikova E.R. High level of lactoferrin in milk of transgenic animals. 8th International Conference on Lactoferrin, Structure, Function and Applications, 2007, p.16

Sadchikova E.R., Gursky Ya.G., Krasnov A.N., Ermolkevich T.G., Deikin A.V.. Sokolov A.V., ulina M.O., Vasiliev V.B., Georgieva S.G., Goldman l.L. Research of Two isoforms of recombinant uman lactoferrin. 8th International Conference on Lactoferrin, Structure, Function and Applications, 007, p.9

A.B. Дейкин. Т.Г. Ермолкевич, Я.Г. Гурский, А.Н. Краснов, С.Г. Георгиева, И.Л. Гольдман, ..Р. Садчикова. Создание высокоэффективных и биологически безопасных лекарственных репаратов нового поколения на основе белков человека, получаемых из молока трансгенных :ивотных. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». 2009, с.386

Goldman I.L., Deikin A.V.. Ermolkevich T.G., Gursky Ya.G., Minashkin M.M., Krasnov A.N., ieorgieva S.G., Sadchikova E.R. Recombinant human lactoferrin in milk of transgenic animals, th International Conference on Lactoferrin, Structure, Function and Applications, 2009, p.59

Budzevich A., Sheiko I., Budzevich I., Chartaryiski V., Shautsou I., Kazlou S., Kirykovich Y., aitserau S., Zaremba N. Bandarenka V., Lukashevich Т., Piatrushka A., Mikhedava I., Sakhonchyk P., apsaliou S., Rzhepishevski O., Mironov A., Barilko S., Deikin A.. Krasnov A., Georgieva S., Aybazov M., oldman I., Sadchikova E.. Human lactoferrin transgenic goat breeding. 9th International Conference on actoferrin, Structure, Function and Applications, 2009, p.58

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, Д.37А Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дейкин, Алексей Васильевич

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Трансгенные животные. Способы получения и использования.

1.2. Лактоферрин. Структура и функции.

1.3. Перспективы и актуальность темы диссертации.

2. Материалы и методы исследований.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Получение первичных трансгенных мышей.

3.2. Тканеспецифичность экспрессии трансгена.

3.3. Передача трансгена в ряду поколений трансгенных мышей.

3.4. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком первичных трансгенных самок и дочерей от первичных трансгенных самцов мыши.

3.5. Животные с необычно высоким уровнем продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком.

3.6. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека в поколениях трансгенных по гену лактоферрина человека мышей в зависимости от линии, конструкции, копийности встроившегося трансгена.

3.7. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных самок мыши в течение периода лактации.

3.8. Физико-химические и биологические свойства рекомбинантного лактоферрина человека из молока трансгенных мышей.

3.9. Патоморфологический и гистологический анализ трансгенных мышей.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и исследование лактоферрина человека, синтезируемого с молоком трансгенных мышей"

В современной медицине большое внимание уделяется биологически активным белкам человека как лекарственным средствам. Такие белки высокоэффективны и биологически безопасны. К их числу относятся различные гормоны, ферменты, факторы свёртываемости крови, роста тканей и др. Существенным препятствием на пути развития новой области фармацевтики является практическая невозможность получения необходимых белков из жидкостей и тканей самого человека в промышленных масштабах. В связи с этим в последние десятилетия для получения лекарственных белков человека использовались биотехнологические методы, главным образом, микробный синтез. В качестве продуцентов лекарственных белков человека также используют водоросли, высшие растения, грибы. Таким путём были получены инсулин, интерфероны, некоторые факторы свёртываемости крови и ряд иммуномодуляторов. К сожалению, ни одна из этих биотехнологических систем не смогла в полной мере обеспечить идентичность рекомбинантных белков человека природным, в частности, необходимые посттрансляционные модификации структуры белка. Крайне сложным оказался процесс очистки таких рекомбинантных белков. Их применение нередко сопровождалось аллергическими реакциями у пациентов. Кроме того, такое производство лекарственных белков человека оказалось экологически проблемным. В ряде стран оно постепенно выводится из хозяйственного обращения. Проблему получения рекомбинантных белков человека пытаются решить с использованием культивируемых соматических клеток, однако этот путь длителен и дорогостоящ.

В связи с этим возникла идея использовать в качестве биореакторов лекарственных белков человека трансгенных сельскохозяйственных животных, в частности, продуцирующих эти белки с молоком. Исследования в этом направлении широким фронтом ведутся в ряде индустриально развитых стран. В разработке находятся более 50 лекарственных белков 3 человека, для одних из которых получены трансгенные животные, для других проводятся доклинические или клинические испытания.

Несмотря на отдельные практические достижения, проблема получения лекарственных белков человека с использованием трансгенных животных нуждается в глубокой научной проработке. В числе её актуальных вопросов находится генное конструирование, технология получения трансгенных животных, обеспечение экспрессии генов интереса и передача этого признака в ряду поколений, получение промышленных стад животных-продуцентов.

Цель работы:

Получение и исследование ключевого белка человека, обеспечивающего антибактериальную защиту детей раннего возраста - лактоферрина из молока трансгенных мышей, выбор оптимальных генных конструкций, обеспечивающих максимальную продукцию полноценного лактоферрина человека с молоком трансгенных животных и передачу рекомбинантного гена последующим поколениям при сохранении здоровья животных-продуцентов.

Задачи:

1. Получить первичных трансгенных по различным конструкциям с геном лактоферрина человека мышей.

2. Выбрать генную конструкцию, обеспечивающую наибольшую продукцию рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных мышей.

3. Проследить передачу трансгена в ряду поколений животных.

4. Определить динамику продукции рекомбинантного лактоферрина человека на протяжении периода лактации.

5. Определить соответствие рекомбинантного лактоферрина к человека природному по физико-химическим и биологическим свойствам.

6. Определить влияние трансгена лактоферрина человека на состояние здоровья трансгенных мышей.

7. Определить перспективность получения первичных трансгенных сельскохозяйственных животных — продуцентов рекомбинантного лактоферрина человека — на основе исследованных генетических конструкций.

Новизна и достоверность предложенных методов и решений материалов диссертационной работы

Установлено, что выбранные генные конструкции обеспечивают высокий, экономически значимый уровень продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных мышей. Средний уровень продукции рекомбинантного лактоферрина человека для лучшей генной конструкции в ряду поколений трансгенных животных составил 16,7 г/л. У отдельных животных установлен высокий уровень продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком до 40 г/л. В одной из линий трансгенных мышей обнаружены особи с необычно высоким уровнем продукции лактоферрина человека от 80 до 160 г/л. Определена динамика продукции рекомбинантного белка в течение периода лактации и исследована передача трансгена до 8-го поколения от первичных трансгенных животных. Для мышей, как вида многоплодных животных, установлено, что с использованием самцов и самок, трансгенных по наиболее удачным генным конструкциям, можно получить характеризующееся такими же свойствами потомство. Показано соответствие рекомбинантного лактоферрина природному по основным физико-химическим показателям и биологическим свойствам.

Практическая и научная значимость, положения, выносимые на защиту

БелРосТрансген» и «БелРосТрансген-2». Усовершенствованные методы создания первичных трансгенных животных при личном участии соискателя 5 использованы при получении первичных трансгенных сельскохозяйственных животных, что привело к рождению трансгенных козлов Лак-1 и Лак-2, несущих в своём геноме ген лактоферрина человека. Популяционные исследования трансгенных мышей будут использованы при планировании создания стад трансгенных сельскохозяйственных животных -промышленных продуцентов рекомбинантных белков человека.

В процессе выполнения диссертационной работы:

• Обследовано 67 первичных трансгенных по конструкциям с геном лактоферрина человека мышей.

• Установлено, что использованные конструкции с геном лактоферрина человека обеспечивают тканеспецифичную экспрессию трансгена.

• Получено 3885 потомков первичных трансгенных мышей до 8-го поколения.

• Определён уровень продукции рекомбинантного белка в зависимости от использованной генетической конструкции, количества копий встроившегося трансгена, дня лактации и возраста лактирующей самки мышей.

• Проведено сравнение свойств рекомбинантного лактоферрина, выделенного из молока трансгенных мышей и природного белка человека.

• Определена перспектива получения на основе исследованных конструкций первичных трансгенных коз.

Апробация работы и личный вклад соискателя

Результаты работы представлены на международной конференции «Лактоферрин» (г. Ницца, Франция, 2007), «Лактоферрин» (г. Пекин, Китай, 2009) и на Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Казань, Россия, 2009).

Соискатель проанализировал литературу по теме исследования, осуществил планирование экспериментов, их научный анализ и статистическую обработку полученных результатов, которые представил в статьях и докладах на конференциях. В ходе выполнения диссертационной работы автор овладел современной технологией получения трансгенных животных, методом микроинъекции рекомбинантной ДНК в мужской пронуклеус зигот, методами культивирования эмбрионов, а также предложил ряд оригинальных, практически значимых усовершенствований в технологию вымывания и трансплантации эмбрионов животных. Соискателем созданы уникальные линии трансгенных мышей, позволившие изучить характер передачи трансгена и условия, обеспечивающие высокую продукцию рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных животных, которые депонированы в «Трансгенбанке» ИБГ РАН.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 121 странице, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (228 источников). Работа содержит 8 таблиц и 31 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Дейкин, Алексей Васильевич

Выводы

1. Выбрана оптимальная из 9 исследованных генная конструкция, обеспечивающая наибольшую (в среднем 16,7 г/л и максимум 160,0 г/л) продукцию рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных мышей — LTF5. Она состоит из геномной копии гена лактоферрина человека и находится под контролем (3-казеинового промотора, инсуляторов кластера Р-глобиновых генов кур.

2. Прослежена передача трансгена в ряду 8-ми поколений 3885 потомков 67 первичных трансгенных мышей. Количество трансгенных потомков в 1-ом поколении колебалось от 3,4% (линия LTF6 728) до 85,7% (линия LTF5 146), во 2-ом и последующих поколениях средний уровень передачи трансгена потомству приближался к 50% и его колебания уменьшились.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дейкин, Алексей Васильевич, Москва

1. Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB, (1973). Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 70: 3240-3244

2. Jaenisch R, Fan H, Croker B. (1975) Infection of preimplantation mouse embryos and of newborn mice with leukemia virus: tissue distribution of viral DNAandRNAand leukemogenesis in the adult animal Proc Natl Acad Sci USA 72: 4008-4012.

3. Waterston RH, Lindblad-Toh K, Bimey E, Rogers J, Abril JF, Agarwal P, et al. (2002). Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420: 520562

4. Hammer RE, Pursel VG, Rexroad CE, Jr., Wall RJ, Bolt DJ, Ebert KM, et al. (1985). Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 315: 680-683.

5. Willadsen SM, (1986). Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 320: 63-65.

6. Krimpenfort P, Rademakers A, Eyestone W, van der Schans A, van den Broek S, Kooiman P, et al. (1991). Generation of transgenic dairy cattle using 'in vitro' embryo production. Biotechnology (NY) 9: 844-847.

7. Wright G, Carver A, Cottom D, Reeves D, Scot A, Simons P, et al. (1991). High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Biotechnology (NY) 9: 830-834.

8. Muller M, Brenig B, Winnacker EL, Brem G, (1992). Transgenic pigs carrying cDNA copies encoding the murine Mxl protein which confers resistance to influenza virus infection. Gene 121: 263-270.

9. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH, (1997). Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-813.

10. Petters RM, Alexander CA, Wells KD, Collins EB, Sommer JR, Blanton MR, et al. (1997). Genetically engineered large animal model for studying cone photoreceptor survival and degeneration in retinitis pigmentosa. Nat Biotechnol 15: 965—970.

11. Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, et al. (1998). Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280: 12561258.

12. McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KH, Colman A, Schnieke AE, Kind AJ, (2000). Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature 405: 1066-1069.

13. Lazaris A, Arcidiacono S, Huang Y, Zhou JF, Duguay F, Chretien N, et al. (2002). Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science 295: 472—476.

14. Kuroiwa Y, Kasinathan P, Matsushita H, Sathiyaselan J, Sullivan EJ, Kakitani M, et al. (2004). Sequential targeting of the genes encoding immunoglobulin- mu and prion protein in cattle. Nat Genet 36: 775-780.

15. Brophy B, Smolenski G, Wheeler T, Wells D, L'Huillier P, Laible G, (2003). Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of beta-casein and kappa-casein. Nat Biotechnol 21: 157-162.

16. Phelps CJ, Koike C, Vaught TD, Boone J, Wells KD, Chen SH, et al. (2003). Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science 299: 411—414.

17. Wall RJ, Powell AM, Paape MJ, Kerr DE, Bannerman DD, Pursel VG, (2005). Genetically enhanced cows resist intramammary Staphylococcus aureus infection. Nat Biotechnol 23: 445^151.

18. Polejaeva IA, Campbell KH, (2000). New advances in somatic cell nuclear transfer: application in transgenesis. Theriogenology 53: 117-126.

19. Chan AW, Homan EJ, Ballou LU, Burns JC, Bremel RD, (1998). Transgenic cattle produced by reverse-transcribed gene transfer in oocytes. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14028-14033.

20. Clark J, Whitelaw B, (2003). A future for transgenic livestock. Nat Rev Genet. C)ct;4(10):825-33.

21. Brackett BG, Baranska W, Sawicki W, Koprowski H, (1971) Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Proc Natl Acad Sci USA 68: 353-357.

22. Maione B, Lavitrano M, Spadafora C, Kiessling AA, (1998). Sperm-mediated gene transfer in mice. Mol Reprod Dev 50: 406—409.

23. Rieth A, Pothier F, Sirard MA, (2000). Electroporation of bovine spermatozoa to carry DNA containing highly repetitive sequences into oocytes and detection of homologous recombination events. Molecular Reproduction and Development 57: 338—345.

24. Celebi C, Guillaudeux T, Auvray P, Vallet- Erdtmann V, Jegou B,( 2003). The Making of "Transgenic Spermatozoa". Biol Reprod 68: 1477—1483.

25. Nagano M, Brinster С J, Orwig KE, Ryu BY, Avarbock MR, Brinster RL, (2001). Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 98: 13090-13095.

26. Honaramooz A, Megee SO, Dobrinski I, (2002). Germ cell transplantation in pigs. Biol Reprod 66: 21-28.

27. Honaramooz A, Behboodi E, Blash S, Megee SO, Dobrinski I, (2003). Germ cell transplantation in goats. Mol Reprod Dev 64: 422-428.

28. Robertson E, Bradley A, Kuehn M, Evans M, (1986). Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature 323: 445—448.

29. Evans MJ, Kaufman MH, (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292: 154-156.

30. Martin GR, (1981). Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium condiyioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78: 7634—7638.

31. Gorodetsky, S.I. , Bremel, R. The factors of tissue-specific expression of the bovine b-casein gene.(1998) In Mammary Gland Transgenesis. Therapeutic Protein Production.ed. F.O.Castro,and J. Janne, Springer, 19-40.

32. Gorodetsky,S.I.,and Bremel, R.D. (1996) Post-transcriptional regulation of bovine b-casein gene expression. Posttranscriptional RNA processing. Keystone Symposia,28,308.

33. Shim H, Gutierrez-Adan A, Chen LR, BonDurant RH, Behboodi E, Anderson GB, (1997). Isolation of pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells. Biol Reprod 57: 1089-1095.

34. Saito S, Sawai K, Ugai H, Moriyasu S, Minamihashi A, Yamamoto Y, et al. (2003). Generation of cloned calves and transgenic chimeric embryos from bovine embryonic stemlike cells. Biochem Biophys Res Commun 309: 104—113.

35. Gordon JW, Ruddle FH, (1981). Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science 214: 1244—1246.

36. Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME, Rosenfeld MG, Birnberg NC, Evans RM, (1982). Dramatic growth of mice that develop from eggs micro injected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature 300: 611—615.

37. Nottle MB, Haskard KA, Verma PJ, Du ZT, Grupen CG, Mcllfatrick SM, et al. (2001). Effect of DNA concentration on transgenesis rates in mice and pigs. Transgenic Res 10: 523-531.

38. Keefer CL,( 2004). Production of bioproducts through the use of transgenic animal models. Anim Reprod Sci 82-83: 5-12.

39. Seidel GE, Jr., (1993). Resource requirements for transgenic livestock research. J Anim Sci 71: 26-33.

40. Kasinathan P, Knott JG, Moreira PN, Burnside AS, Jerry DJ, RobI JM, (2001). Effect of fibroblast donor cell age and cell cycle on development of bovine nuclear transfer embryos in vitro. Biol Reprod 64: 1487-1493.

41. Iguma LT, Lisauskas SF, Melo EO, Franco MM, Pivato I, Vianna GR, et al. (2005). Development of bovine embryos reconstructed by nuclear transfer of transfected and non-transfected adult fibroblast cells. Genet Mol Res 4: 55-66.

42. Melo EO, Sousa RV, Iguma LT, Franco MM, Rech EL, Rumpf R, (2005). Isolation of transfected fibroblast clones for use in nuclear transfer and transgene detection in cattle embryos. Genet Mol Res 4: 812-821.

43. Sikes ML, O'Malley BW, Jr., Finegold MJ, Ledley FD, (1994). In vivo gene transfer into rabbit thyroid follicular cells by direct DNA injection. Hum Gene Ther 5: 837— 844.

44. Williams RS, Johnston SA, Riedy M, DeVit MJ, McElligott SG, Sanford JC, (1991). Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc Natl Acad Sci USA 88: 2726-2730.

45. Grosjean F, Bertschinger M, Hacker DL, Wurm FM. (2006) Multiple glycerol shocks increase the calcium phosphate transfection of non-synchronized CHO cells. Biotechnol Lett. Nov;28(22): 1827-33. Epub 2006 Sep 29.

46. Kovesdi I, Brough DE, Bruder JT, Wickham TJ, (1997). Adenoviral vectors for gene transfer. Curr Opin Biotechnol 8: 583-589.

47. Caplen NJ, Kinrade E, Sorgi F, Gao X, Gruenert D, Geddes D, et al. (1995) In vitro liposome-mediated DNA transfection of epithelial cell lines using the cationic liposome DC-Chol/DOPE. Gene Ther 2: 603-613.

48. Oliveira RR, Carvalho DM, Lisauskas S, Mello E, Vianna GR, Dode MA, et al. (2005). Effectiveness of liposomes to transfect livestock fibroblasts. Genet Mol Res 4: 185196.

49. Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, Mycock K, Scott AR, Ritchie M, Wilmut I, et al. (1997). Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 278: 2130-2133.

50. Kues WA, Niemann H, (2004). The contribution of farm animals to human health. Trends Biotechnol 22: 286-294.

51. Kasinathan P, Knott JG, Wang Z, Jerry DJ, Robl JM, (2001b). Production of calves from G1 fibroblasts. Nat Biotechnol 19: 1176-1178.

52. Gibbons J, Arat S, Rzucidlo J, Miyoshi K, Waltenburg R, Respess D, et al. (2002). Enhanced survivability of cloned calves derived from roscovitine-treated adult somatic cells. Biol Reprod 66: 895-900.

53. Sullivan EJ, Kasinathan S, Kasinathan P, Robl JM, Collas P, (2004). Cloned calves from chromatin remodeled in vitro. Biol Reprod 70: 146-153.

54. Wall RJ, Kerr DE, Bondioli KR, (1997). Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. J Dairy Sci 80: 2213-2224.

55. Miller HI, (2002). As biotech turns 20. Nat Rev Drug Discov 1: 1007-1008.

56. Dyck MK, Lacroix D, Pothier F, Sirard MA, (2003). Making recombinant proteins in animals different systems, different applications. Trends Biotechnol 21: 394-399.

57. Zbikowska HM, Soukhareva N, Behnam R, Chang R, Drews R, Lubon H, et al. (2002). The use of the uromodulin promoter to target production of recombinant proteins into urine of transgenic animals. Transgenic Res 11: 425-435.

58. Zbikowska HM, Soukhareva N, Behnam R, Lubon H, Hammond D, Soukharev S, (2002). Uromodulin promoter directs high-level expression of biologically active human alphal- antitrypsin into mouse urine. Biochem J 365: 7-11.

59. Velander WH, Johnson JL, Page RL, Russell CG, Subramanian A, Wilkins TD, et al. (1992). High-level expression of a heterologous protein in the milk of transgenic swine using the cDNA encoding human protein C. Proe Natl Acad Sci USA 89: 12003-12007.

60. Van Berkel PH, Welling MM, Geerts M, van Veen HA, Ravensbergen B, Salaheddine M, et al. (2002). Large scale production of recombinant human laetoferrin in the milk of transgenic cows. Nat Biotechnol 20: 484-487.

61. Rudolph NS, (1999). Biopharmaceutical production in transgenic livestock. Trends Biotechnol 17: 367-374.

62. Lipinski D, Jura J, Kalak R, Plawski A, Kala M, Szalata M, et al. (2003). Transgenic rabbit producing human growth hormone in milk. J Appl Genet 44: 165—174.

63. Michalak E, Lipinski D, Slomski R, (2006). Loop formation by the transgene WAP: 6 x ITishGH in transgenic rabbit fibroblast, revealed by fluorescence in situ hybridization to nuclear halos. J Appl Genet 47: 247-249.

64. Kling J. (2009)First US approval for a transgenic animal drug. Nat Biotechnol. Apr;27(4):302-4.

65. Massoud M, Attal J, Thepot D, Pointu H, Stinnakre MG, Theron MC, et al. (1996). The deleterious effects of human erythropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promoter in transgenic rabbits. Reprod Nutr Dev 36: 555-563.

66. Ebert KM, DiTullio P, Barry CA, Schindler JE, Ayres SL, Smith ТЕ, et al. (1994). Induction of human tissue plasminogen activator in the mammary gland of transgenic goats. Biotechnology (NY) 12: 699-702.

67. Niemann H, Halter R, Carnwath JW, Herrmann D, Lemme E, Paul D, (1999). Expression of human blood clotting factor VIII in the mammary gland of transgenic sheep. Transgenic Res 8: 237-247.

68. Karatzas CN, (2003). Designer milk from transgenic clones. Nat Biotechnol 21: 138-139.

69. Karatzas CN, Turner JD, (1997). Toward altering milk composition by genetic manipulation: current status and challenges. J Dairy Sci 80: 2225-2232.

70. Kang Y, Jimenez-Flores R, Richardson T, (1986). Casein genes and genctic engineering of the caseins. Basic Life Sci 37: 95-111.

71. Stacey A, Schnieke A, Kerr M, Scott A, McKee C, Cottingham I, et al. (1995). Lactation is disrupted by alpha-lactalbumin deficiency and can be restored by human alpha-lactalbumin gene replacement in mice. Proc Natl Acad Sci USA 92: 2835-2839.

72. Jost B, Vilotte JL, Duluc I, Rodeau JL, Freund JN, (1999). Production of low-lactose milk by ectopic expression of intestinal lactase in the mouse mammary gland. Nat Biotechnol 17: 160-164.

73. Wheeler MB, (2003). Production of transgenic livestock: promise fulfilled. J Anim Sci 81: 32-37.

74. Soukka T, Tenovuo J, Lenander-Lumikari M, (1992). Fungicidal effect of human lactoferrin against Candida albicans. FEMS Microbiol Lett 69: 223-228.

75. Hasegawa K, Motsuchi W, Tanaka S, Dosako S, (1994). Inhibition with lactoferrin of in nitro infection with human herpes virus. Jpn J Med Sci Biol 47: 73-85.

76. Nuijens JH, van Berkel PH, Geerts ME, Hartevelt PP, de Boer HA, van Veen HA, Pieper FR, (1997). Characterization of recombinant human lactoferrin secreted in milk of transgenic mice. J Biol Chem 272: 8802-8807.

77. Platenburg G.J., Kootwijk E.P., Kooiman P.M., Woloshuk S.L., Nuijens J.H., Krimpenfort P.J., Pieper F.R., de Boer H.A., Strijker R., (1994) Expression of human lactoferrin in milk of transgenic mice, Transgenic research 3: 99-108.

78. Kim S.J., Lee К., Yu D., Han Y., Lee C., Nam M., Moon H., Lee K., Expression Analysis of a Bovine P-Casein/Human Lactoferrin Hybrid Gene in Transgenic Mice, The Journal of reproduction and development 43 (1997) 143-149

79. Liu Z., Zhao C., Fan В., Dai Y., Zhao Z., Wang L., Zheng M., Feng J., Chen Y., Duan Y., Li N., (2004) Variable expression of human lactoferrin gene in mice milk driven by its 90 KB upstream flanking sequences, Animal biotechnology 15: 21-31.

80. Shi G, Chen H, Wu X, Zhou Y, Liu Z, Zheng T, Huang P. (2009) A mWAP-hLF hybrid gene locus gave extremely high level expression of human lactoferrin in the milk of transgenic mice.Transgenic Res. 2009 Aug;18(4):573-82.

81. Zhang J, Li L, Cai Y, Xu X, Chen J, Wu Y, Yu H, Yu G, Liu S, Zhang A, Chen J, Cheng G. (2008) Expression of active recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic goats.Protein Expr Purif. Feb;57(2): 127-35. Epub 2007 Nov 20.

82. Li L., Shen W., Min L., Dong H., Sun Y., Pan Q., (2006)Human lactoferrin transgenic rabbits produced efficiently using dimethylsulfoxide-sperm-mediated gene transfer, Reproduction, fertility, and development 18 : 689-695.

83. Kerr DE, Wellnitz O, (2003). Mammary expression of new genes to combat mastitis. J Anim Sci 81: 38^47.

84. Kerr DE, Plaut K, Branley AJ, Williamson CM, Lax AJ, Moore K, et al. (2001). Lysostaphin expression in mammary glands confers protection against staphylococcal infection in transgenic mice. Nat Biotechnol 19: 66-70.

85. Detwiler LA, Rubenstein R, (2000). Bovine spongiform encephalopathy: an overview. Asaio J 46: S73—79.

86. Weissmann C, Enari M, Klohn PC, Rossi D, Flechsing E, (2002). Transmission of prions. Proc Natl Acad Sci USA 99: 16378-16383.

87. Bueler H, Fischer M, Lang Y, Bluethmann H, Lipp HP, DeArmond SJ, et al. (1992). Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature 356: 577-582.

88. Bueler H, Aguzzi A, Sailer A, Greiner RA, Autenried P, Aguet M, Weissmann C, (1993). Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell 73: 1339-1347.

89. Oria R., Alvarez-Hernandez X., Liceaga J. and Brock J. H. (1988) Uptake and handling of iron from transferrin, lactoferrin and immune complexes by a macrophage cell line. Biochem. J. 252: 221-225

90. Denning C, Burl S, Ainslie A, Bracken J, Dinnyes A, Fletcher J, et al. (2001). Deletion of the alpha (1,3) galactosyl transferase (GGTA1) gene and the prion protein (PrP) gene in sheep. Nat Biotechnol 19: 559-562.

91. Barthel R, Feng J, Piedrahita JA, McMurray DN, Templeton JW, Adams LG,2001) Stable transfection of the bovine NRAMP1 gene into murine RAW264.7 cells: effect on Brucella abortus survival. Infect Immun 69: 3110—3119.

92. Pursel VG, Pinkert CA, Miller KF, Bolt DJ, Campbell RG, Palmiter RD, 1989. Genetic engineering of livestock. Science 244: 1281—1288.

93. Grobet L, Martin LJ, Poncelet D, Pirottin D, Brouwers B, Riquet J, et al. (1997). A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nat Genet 17: 71-74.

94. McPherron AC, Lee SJ, (1997). Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc Natl Acad Sci USA 94: 12457-12461.

95. McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ, (1997). Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature 387: 83—90.

96. Souza T, MacDougall C, Campbell BK, McNeilly AS, Baird DT, (2001). The Booroola (FecB) phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1 В (BMPR1B) gene. J Endocrinol 169: Rl-6.

97. Juengel JL, Hudson NL, Heath DA, Smith P, Reader KL, Lawrence SB, et al.2002). Growth differentiation factor 9 and bone morphogenetic protein 15 are essential for ovarian follicular development in sheep. Biol Reprod 67: 1777—1789

98. Powell ВС, Walker SK, Bawden CS, Sivaprasad AV, Rogers GE, (1994). Transgenic sheep and wool growth: possibilities and current status. Reprod Fertil Dev 6: 615-623.

99. Auchincloss H, Jr., Sachs DH, (1998) Xenogeneic transplantation. Annu Rev Immunol 16: 433^470.

100. Diamond LE, Quinn CM, Martin MJ, Lawson J, Piatt JL, Logan JS, (2001). A human CD46 transgenic pig model system for the study of discordant xenotransplantation. Transplantation 71: 132-142.

101. Zaidi A, Schmoeckel M, Bhatti F, Waterworth P, Tolan M, Cozzi E, et al. (1998). Life-supporting pig-to-primate renal xenotransplantation using genetically modified donors. Transplantation 65: 1584-1590.

102. Zawada WM, Cibelli JB, Choi PK, Clarkson ED, Golueke PJ, Witta SE, et al.1998). Somatic cell cloned transgenic bovine neurons for transplantation in parkinsonian rats. Nat Med 4: 569-574.

103. Imaizumi T, Lankford KL, Burton WV, Fodor WL, Kocsis JD, (2000). Xenotransplantation of transgenic pig olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration in rat spinal cord. Nat Biotechnol 18: 949—953.

104. Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA, (1997). Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs. Nat Med 3: 282-286.

105. Patience C, Patton GS, Takeuchi Y, Weiss RA, McClure MO, Rydberg L, Breimer ME, (1998). No evidence of pig DNA or retroviral infection in patients with short-term extracorporeal connection to pig kidneys. Lancet 352: 699-701.

106. Paradis K, Langford G, Long Z, Heneine W, Sandstrom P, Switzer WM, et al.1999). Search for cross-species transmission of porcine endogenous retrovirus in patients treated with living pig tissue. The XEN 111 Study Group. Science 285: 1236-1241.

107. Wobus AM, Boheler KR, ( 2005). Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy. Physiol Rev 85: 635-678.

108. International Human Genome Sequencing Consortium, (2004). Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431: 931-945.

109. Marx J, (2003). Medicine. Building better mouse models for studying cancer. Science 299: 1972-1975.

110. Draghia-Akli R, Fiorotto ML, Hill LA, Malone PB, Deaver DR, Schwartz RJ, (1999). Myogenic expression of an injectable protease-resistant growth hormone- releasing hormone augments long-term growth in pigs. Nat Biotechnol 17: 1179-1183.

111. Djojosubroto MW, Choi YS, Lee HW, Rudolph KL, (2003). Telomeres and telomerase in aging, regeneration and cancer. Mol Cells 15: 164-175.

112. Mogford JE, Liu WR, Reid R, Chiu CP, Said H, Chen SJ, et al. (2006). Adenoviral human telomerase reverse transcriptase dramatically improves ischemic wound healing without detrimental immune response in an aged rabbit model. Hum Gene Ther 17: 651-660.

113. Rudolph KL, Millard M, Bosenberg MW, DePinho RA, (2001). Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans. Nat Genet 28: 155— 159.

114. Cawthon RM, Smith KR, O'Brien E, Sivatchenko A, Kerber RA, (2003). Association between telomere length in blood and mortality in people aged 60 years or older. Lancet 361: 393-395.

115. Shicls PG, Kind AJ, Campbell KH, Waddington D, Wilmut I, Colman A, Schnieke AE, (1999). Analysis of telomere lengths in cloned sheep. Nature 399: 316-317.

116. Lanza RP, Cibelli JB, Blackwell C, Cristofalo VJ, Francis MK, Baerlocher GM, et al. (2000). Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science 288: 665-669.

117. Wakayama T, Shinkai Y, Tamashiro KL, Niida H, Blanchard DC, Blanchard RJ, et al. (2000). Cloning of mice to six generations. Nature 407: 318-319.

118. Betts D, Bordignon V, Hill J, Winger Q, Westhusin M, Smith L, King W, (2001) Reprogramming of telomerase activity and rebuilding of telomere length in cloned cattle. Proc Natl Acad Sci USA 98: 1077-1082.

119. Suda O, Smith LA, d'Uscio LV, Peterson ТЕ, Katusic ZS, (2005). In vivo expression of recombinant vascular endothelial growth factor in rabbit carotid artery increases production of superoxide anion. Arterioscler Thromb Vase Biol 25: 506-511.

120. Metz-Boutigue M. H., Jolles J., Mazurier J., Schoentgen F., Legrand D., Spik G. et al. (1984) Human lactotransferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins. Eur. J. Biochem. 145: 659-676

121. Woodbury RG, Brown JP, Yeh MY, Hellstrom I, Hellstrom KE (1980) Identification of a cell surface protein, p97, in human melanomas and certain other neoplasms. Proc Natl Acad Sci USA 77:2183-2187

122. Anderson B. F., Baker H. M., Norris G. E., Rice D. W. and Baker E. N. (1989) Structure of human lactoferrin: crystallographic structure analysis and refi nement at 2.8 A resolution. J. Mol. Biol. 209: 711-734

123. Baker H. M., Anderson B. F. and Baker E. N. (2003) Dealing with iron: common structural principles in proteins that transport iron and heme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 3579-3583

124. Ward P. P., Mendoza-Meneses M., Mulac-Jericevic В., Cunningham G. A., Saucedo-Cardenas O., Teng С. T. et al. (1999) Restricted spatiotemporal expression of lactoferrin during murine embryonic development. Endocrinology 140: 1852—1860

125. Teng С. Т., Beard C. and Gladwell W. (2002) Differential expression and estrogen response of lactoferrin gene in the female reproductive tract of mouse, rat and hamster. Biol. Reprod. 67: 1439-1449

126. Masson P. L., Heremans J. F. and Schonne E. (1969) Lactoferrin, an iron-binding protein in neutrophilic leukocytes. J. Exp. Med. 130: 643-658

127. Montreuil J., Tonnelat J. and Mullet S. (1960) Preparation et proprietes de la lactosiderophiline (lactotransferrine) du lait de femme. Biochim. Biophys. Acta 45: 413-421

128. Bennett R. M., Eddie-Quartey A. C. and Holt P. (1973) Lactoferrin an iron binding protein in synovial fl uid. Arthritis Rheum. 16: 186-190

129. Maaks S., Yan II. Z. and Wood W. G. (1989) Development and evaluation of luminescence based sandwich assay for plasma lactoferrin as a marker for sepsis and bacterial infections in pediatric medicine. J. Biolumines. Chemilumines. 3: 221-226

130. Debanne M.T., Regoeczi E., Sweeney G.D. and Krestynski F. (1985) Interaction of human lactoferrin with the rat liver. Am. J. Physiol. 248: G463—469

131. Thomas L. L., Xu W. and Ardon Т. T. (2002) Immobilized lactoferrin is a stimulus for eosinophil activation. J. Immunol. 169: 993-999

132. Teng С. Т. (2002) Lactoferrin gene expression and regulation: an overview. Biochem. Cell Biol. 80: 7-16

133. Liu, D., Wang, X., Zhang, Z., & Teng, С. T. (2003). An intronic alternative promoter of the human lactoferrin gene is activated by Ets. Biochemical and Biophysical Research Communications, 301, 472—479.

134. Teng, С. T. (2006). Factors regulating lactoferrin gene expression. Biochemistry and Cell Biology, 84, 263-267.

135. Ward, P. P., Paz, E., & Conneely, О. M. (2005). Multifunctional roles of lactoferrin: A critical overview. Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 2540-2548.

136. Rey, M. W., Woloshuk, S. L., deBoer, H. A., & Pieper, F. R. (1990). Complete nucleotide sequence of human mammary gland lactoferrin. Nucleic Acids Research, 18, 5288.

137. Baker, E. N.,&Baker, H. M. (2005). Molecular structure, binding properties and dynamics of lactoferrin. Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 2531—2539.

138. Teng, С. Т., and Gladwell, W. (2006). Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in human lactoferrin gene. Biochemistry and Cell Biology, 84, 381-384.

139. Spik, G., Coddeville, В., & Montreuil, J. (1988). Comparative study of the primary structures of sero-, lacto- and ovotransferrin glycans from different species. Biochimie, 70, 1459-1469.

140. Wally J, Halbrooks PJ, Vonrhein С et al (2006) The crystal structure of iron-free human serum transferrin provides insight into inter-lobe communication and receptor binding. J Biol Chem 281:24934-24944

141. Okamoto I, Mizutani K, Hirose M (2004) Iron-binding process in the amino- and carboxyl-terminal lobes of ovotransferrin: quantitative studies utilizing single Fe3(-binding mutants. Biochemistry 43:11118-11125

142. Frazer D. M. and Anderson G. J. (2003) The orchestration of body iron intake: how and where do enterocytes receive their cues? Blood Cells Mol. Dis. 30: 288—297

143. Iyer S. and Lonnerdal B. (1993) Lactoferrin, lactoferrin receptors and iron metabolism. Eur. J. Clin. Nutr. 47: 232-241

144. Fleming M. D., Trenor С. C. 3rd, Su M.A., Foernzler D., Beier D. R., Dietrich W. F. et al. (1997) Microcytic anaemia mice have a mutation in Nramp2, a candidate iron transporter gene. Nat. Genet. 16: 383-386

145. Suzuki Y. A., Shin K. and Lonnerdal B. (2001) Molecular cloning and functional expression of a human intestinal lactoferrin receptor. Biochemistry 40: 15771-15779

146. Andrews N. C. (2000) Iron homeostasis: insights from genetics and animal models. Nat. Rev. Genet. 1: 208-217

147. Sanchez L., Calvo M. and Brock J. H. (1992) Biological role of lactoferrin. Arch. Dis. Child. 67: 657-661 38. Davidson L. A. and Lonnerdal B. (1987) Persistence of human milk proteins in the breast-fed infant. Acta Paediatr. Scand. 76: 733-740

148. Davidsson L., Kastenmayer P., Yuen M., Lonnerdal B. and Hurrell R. F. (1994) Infl uence of lactoferrin on iron absorption from human milk in infants. Pediatr. Res. 35: 117-124

149. Ward P. P., Mendoza-Meneses M., Cunningham G. A. and Conneely О. M. (2003) Iron status in mice carrying a targeted disruption of lactoferrin. Mol. Cell. Biol. 23: 178-185

150. Orsi N. (2004) The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives. Biometals 17: 189-196

151. Levay P. F. and Viljoen M. (1995) Lactoferrin: a general review. Haematologica 80: 252-267

152. Arnold R. R., Cole M. F. and McGhee J. R. (1977) A bactericidal effect for human lactoferrin. Science 197: 263-265

153. Ellison R. T. 3rd, Giehl T. J. and LaForce F. M. (1988) Damage of the outer membrane of enteric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin. Infect. Immun. 56: 2774-2781

154. Wakabayashi H., Takase M. and Tomita M. (2003) Lactoferricin derived from milk protein lactoferrin. Curr. Pharm. Des. 9: 1277-1287

155. Singh P. K., Parsek M. R., Greenberg E. P. and Welsh M. J. (2002) A component of innate immunity prevents bacterial biofi lm development. Nature 417: 552—555

156. Britigan В. E., Hayek M. В., Doebbeling B. N. and Fick R. B. Jr (1993) Transferrin and lactoferrin undergo proteolytic cleavage in the Pseudomonas aeruginosa-infected lungs of patients with cystic fl brosis. Infect. Immun. 61: 5049-5055

157. Gomez H. F., Ochoa T. J., Carlin L. G. and Cleary T. G. (2003) Human lactoferrin impairs virulence of Shigella fl exneri. J. Infect. Dis. 187: 87—95

158. Hendrixson D. R., Qiu J., Shewry S. C., Fink D. L., Petty S., Baker E. N. et al. (2003) Human milk lactoferrin is a serine protease that cleaves Haemophilus surface proteins at arginine-rich sites. Mol. Microbiol. 47: 607-617

159. Guillen C., Mclnnes I. В., Vaughan D. M., Kommajosyula S., Van Berkel P. H., Leung B. P. et al. (2002) Enhanced Thl response to Staphylococcus aureus infection in human lactoferrin- transgenic mice. J. Immunol. 168: 3950-3957

160. Shaper M., Hollingshead S. K., Benjamin W. H. Jr and Briles D. E. (2004) PspA protects Streptococcus pneumoniae from killing by apolactoferrin, and antibody to PspA enhances killing of pneumococci by apolactoferrin. Infect. Immun. 72: 5031-5040

161. Schryvers А. В., Bonnah R., Yu R. H., Wong H. and Retzer M. (1998) Bacterial lactoferrin receptors. Adv. Exp. Med. Biol. 443: 123—133

162. Dial E. J. and Lichtenberger L. M. (2002) Effect of lactoferrin on Helicobacter felis induced gastritis. Biochem. Cell Biol. 80: 113-117

163. Kruzel M. L., Harari Y., Chen C. Y. and Castro G. A. (2000) Lactoferrin protects gut mucosal integrity during endotoxemia induced by lipopolysaccharide in mice. Infl animation 24: 33-44

164. Lee W. J., Farmer J. L., Hilty M. and Kim Y. B. (1998) The protective effects of lactoferrin feeding against endotoxin lethal shock in germfree piglets. Infect. Immun. 66: 1421-1426

165. Haversen L., Ohlsson B. G., Hahn-Zoric M., Hanson L. A. and Mattsby-Baltzer I. (2002) Lactoferrin down-regulates the LPSinduced cytokine production in monocytic cells viaNF-kappa B. Cell. Immunol. 220: 83-95

166. Kaisho T. and Akira S. (2004) Pleiotropic function of Toll-like receptors. Microbes Infect. 6: 1388-1394

167. Britigan В. E., Lewis T. S., Waldschmidt M., McCormick M. L. and Krieg A. M. (2001) Lactoferrin binds CpG-containing oligonucleotides and inhibits their immunostimulatory effects on human В cells. J. Immunol. 167: 2921-2928

168. Cumberbatch M., Bhushan M., Dearman R. J., Kimber I. and Griffi ths С. E. (2003) IL-lbeta-induced Langerhans' cell migration and TNF-alpha production in human skin: regulation by lactoferrin. Clin. Exp. Immunol. 132: 352-359

169. Haversen L. A., Baltzer L., Dolphin G., Hanson L. A. and Mattsby-Baltzer I.2003) Anti-infl ammatory activities of human lactoferrin in acute dextran sulphate-induced colitis in mice. Scand. J. Immunol. 57: 2-10

170. Dial E. J., Dohrman A. J., Romero J. J. and Lichtenberger L. M. (2005) Recombinant human lactoferrin prevents NSAIDinduced intestinal bleeding in rodents. J. Pharm. Pharmacol. 57: 93-99

171. Hayashida К., Kaneko Т., Takeuchi Т., Shimizu H., Ando K. and Harada E.2004) Oral administration of lactoferrin inhibits infl ammation and nociception in rat adjuvant-induced arthritis. J. Vet. Med. Sci. 66: 149-154

172. Birgens H. S., Karle H., Hansen N. E. and Ostergaard Kristensen L. (1984) Lactoferrin receptors in normal and leukaemic human blood cells. Scand. J. Haematol. 33: 275-280

173. Birgens H. S., Hansen N. E., Karle H. and Kristensen L. O. (1983) Receptor binding of lactoferrin by human monocytes. Br. J. Haematol. 54: 383-391

174. Van Snick J. L. and Masson P. L. (1976) The binding of human lactoferrin to mouse peritoneal cells. J. Exp. Med. 144: 1568-1580

175. Ward P. P., Uribe-Luna S. and Conneely О. M. (2002) Lactoferrin and host defense. Biochem. Cell Biol. 80: 95-102

176. Guillen C., Mclnnes I. В., Vaughan D., Speekenbrink A. B. and Brock J. H. (2000) The effects of local administration of lactoferrin on infl ammation in murine autoimmune and infectious arthritis. Arthritis Rheum. 43: 2073-2080

177. Elrod К. C., Moore W. R., Abraham W. M. and Tanaka R. D. (1997) Lactoferrin, a potent tryptase inhibitor, abolishes latephase airway responses in allergic sheep. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156: 375-381

178. Wolf J. S., Li D., Taylor R. J. and O'Malley B. W. Jr (2003) Lactoferrin inhibits growth of malignant tumors of the head and neck. ORL J. Otorhinolaryngol Relat. Spec. 65: 245-249

179. Shimamura M., Yamamoto Y., Ashino H., Oikawa Т., Hazato Т., Tsuda H. et al.2004) Bovine lactoferrin inhibits tumorinduced angiogenesis. Int. J. Cancer. Ill: 111-116

180. Tsuda H., Sekine K., Fujita K. and Ligo M. (2002) Cancer prevention by bovine lactoferrin and underlying mechanisms — a review of experimental and clinical studies. Biochem. Cell Biol. 80: 131-136

181. Tanaka Т., Kawabata K., Kohno H., Honjo S., Murakami M., Ota T. et al. (2000) Chemopreventive effect of bovine lactoferrin on 4-nitroquinoline 1-oxide-induced tongue carcinogenesisin male F344 rats. Jpn. J. Cancer Res. 91: 25—33

182. Masuda C., Wanibuchi H., Sekine K., Yano Y., Otani S., Kishimoto T. et al. (2000) Chemopreventive effects of bovine lactoferrin on N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced rat bladder carcinogenesis. Jpn. J. Cancer Res. 91: 582588

183. Varadhachary A., Wolf J. S., Petrak K., O'Malley B. W. Jr, Spadaro M., Curcio C. et al. (2004) Oral lactoferrin inhibits growth of established tumors and potentiates conventional chemotherapy. Int. J. Cancer 111: 398-403

184. Kuhara Т., Iigo M., Itoh Т., Ushida Y., Sekine K., Terada N. et al. (2000) Orally administered lactoferrin exerts an antimetastatic effect and enhances production of IL-18 in the intestinal epithelium. Nutr. Cancer 38: 192-199

185. Benaissa M, Peyrat JP, Hornez L, Mariller C, Mazurier J, Pierce A.2005)Expression and prognostic value of lactoferrin mRNA isoforms in human breast cancer. Int J Cancer. (2005) Mar 20; 114(2):299-306.

186. Xiao Y., Monitto C. L., Minhas К. M. and Sidransky D. (2004) Lactoferrin down-regulates G1 cyclin-dependent kinases during growth arrest of head and neck cancer cells. Clin. Cancer Res. 10: 8683-8686

187. Oh S. M., Pyo C. W., Kim Y. and Choi S. Y. (2004) Neutrophil lactoferrin upregulates the human p53 gene through induction of NF-kappaB activation cascade. Oncogene 23: 8282-8291

188. Fujita K., Matsuda E., Sekine K., Iigo M. and Tsuda H. (2004) Lactoferrin enhances Fas expression and apoptosis in the colon mucosa of azoxymethane-treated rats. Carcinogenesis 25: 1961-1966

189. Legrand D., Vigie K., Said E. A., Elass E., Masson M., Slomianny M. C. et al. (2004) Surface nucleolin participates in both the binding and endocytosis of lactoferrin in target cells. Eur. J. Biochem. 271: 303—317

190. Damiens E., Mazurier J., el Yazidi I., Masson M., Duthille I., Spik G. et al. (1998) Effects of human lactoferrin on NK cell cytotoxicity against haematopoietic and epithelial tumour cells. Biochim. Biophys. Acta 1402: 277-287

191. Bezault J., Bhimani R., Wiprovnick J. and Furmanski P. (1994) Human lactoferrin inhibits growth of solid tumors and development of experimental metastases in mice. Cancer Res. 54: 2310-2312

192. Wang B, Fujisawa H, Zhuang L, Freed I, Howell BG, Shahid S, Shivji GM, Мак TW, Sauder DN, (2000). CD4+ Thl and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. J Immunol. 15;165(12):6783-90.

193. Reddy P. (2004) Interleukin-18: recent advances. Curr. Opin. Hematol. 11: 405410

194. Lorget F, Clough J, Oliveira M, Daury MC, Sabokbar A, Offord E, (2002). Lactoferrin reduces in vitro osteoclast differentiation and resorbing activity. Biochem Biophys Res Commun. 16;296(2):261-6.

195. Cornish J., Callon К. E., Naot D., Palmano K. P., Banovic Т., Bava U. et al. (2004) Lactoferrin is a potent regulator of bone cell activity and increases bone formation in vivo. Endocrinology 145: 4366-4374

196. Grey A., Banovic Т., Zhu Q., Watson M., Callon K., Palmano K. et al. (2004) The low-density lipoprotein receptor-related protein 1 is a mitogenic receptor for lactoferrin in osteoblastic cells. Mol. Endocrinol. 18: 2268-2278

197. Hashizume S., Kuroda K. and Murakami H. (1983) Identifi cation of lactoferrin as an essential growth factor for human lymphocyticcell lines in serum-free medium. Biochim. Вiophys.Acta 763: 377-382

198. Zakharova ET, Shavlovski MM, Bass MG, Gridasova AA, Pulina MO, De Filippis V,Beltramini M, Di Muro P, Salvato B, Fontana A, Vasilyev VB, Gaitskhoki VS.(2000)Interaction of lactoferrin with ceruloplasmin. Arch Biochem Biophys. 15;374(2):222-8.

199. Perraudin JP, Prieels JP. (1982) Lactoferrin binding to lysozyme-treated Micrococcus luteus. Biochim Biophys Acta. 17;718(l):42-8.

200. Lehrer RI, Rosenman M, Harwig SS, Jackson R, Eisenhauer P.(1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides.J Immunol Methods. 1991 Mar 21;137(2):167-73.

Информация о работе

Дейкин, Алексей Васильевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Получение и исследование лактоферрина человека, синтезируемого с молоком трансгенных мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы