Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика линий эмбриональныхстволовых клеток американской норки (Mustela vison)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика линий эмбриональныхстволовых клеток американской норки (Mustela vison)"

е-'

v..

На правах рукописи УДК 575.16+577.218

Получение и характеристика линий эмбриональных стволовых клеток американской норки {Mustela vison).

Генетика-03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1997

Работа выполнена в Институте цитолопш и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

ОЛ.Серов, Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

И.И.Кикнадзе, Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

кандидат биологических наук Н.А.Попова, Новосибирский государственный университет, г.Новосибирск Ведущее учреждение: Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, г.Москва

Защита диссертации состоится " № " СбС 1997г.

на и ,7}о (Римё.-и заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Груздев А .Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Клетки, изолированные из эмбрионов млекопитающих, в специальных условиях культивирования на протяжении многих пассажей сохраняют плюрипотентность - способность дифференцироваться во все типы клеток как собственно зародыша, так и экстраэмбриональных тканей. Такие клетки получили название эмбриональных стволовых (ЭС) клеток.

Благодаря плюрипотентности, ЭС клетки, инъецированные в зародыши животного того же вида, могут инкорпорироваться во внутреннюю клеточную массу (ВКМ) зародыша-реципиента. Размножаясь совместно с его клетками, они образуют химерный эмбрион. Важно отметить, что зачастую ЭС клетки колонизируют зачатки зародышевого пути, тоща химерное животное может продуцировать гаметы генотипа ЭС клеток.

Способность ЭС клеток размножаться длительное время в культуре, сохраняя плюрипотентность, • делает возможными различные манипуляции с ними, как например, введение в них чужеродных генов или индуцирование направленных мутаций ("gene targeting" и "knock out") (Capecchi, 1989), с последующим отбором нужных вариантов. Это обеспечивает два основных аспекта использования ЭС клеток: 1) в качестве переносчиков чужеродных генов при получении трансгенных животных; 2) в качестве модельного объекта для исследования проблем генетики развития. Например, инкорпорированный в геном ЭС клеток "ген-репортер", по экспрессии которого определяются дериваты этих клеток в химерном зародыше, дает возможность прослеживать межклеточные взаимоотношения в процессе онтогенеза, изучать стадии закладки тех или иных тканей и решать другие подобные задачи.

Впервые возможность культивирования in vitro плюрипотентных эмбриональных клеток показали Evans и Kaufman (1981) и независимо от них Martin (1981), используя в качестве доноров бластоцисты мыши. Успешное развитие работ по получению ЭС клеток мышей и открытие методов направленного внедрения в геном чужеродных генов (gene targeting) и "выключения" дефектных генов (knock out) явилось стимулом для работ по получению ЭС клеток у других видов лабораторных

животных и у сельскохозяйственных животных: свиней и овец (Notarianni et al. 1990,1991; Piedrahita et al., 1990a,b), крупного рогатого скота (Anderson et al., 1992), кроликов (Giles et al., 1993). Но разнообразие видов животных, у которых делаются попытки получения плюрипотентных ЭС клеток, пока что невелико. Поэтому актуально расширение списка видов животных для получения ЭС клеток.

В Институте цитологии и генетики СО РАН на протяжении ряда лет ведутся исследования биологии, эмбриологии и генетики американской норки. Сотрудниками этого Института д.б.н. ОЛ.Серовым и д.б.н. Н.Б.Рубцовым с соавторами проведена большая работа по картированию хромосом норки. Благодаря их исследованиям этот вид выдвинут в ряд наиболее хорошо генетически изученных, и поэтому является подходящим кандидатом для опытов по получению ЭС клеток.

Как ценный пушной зверь норка разводится во многих хозяйствах нашей страны и за рубежом. Возможно, использование ЭС клеток и метода "gene targeting" открыло бы новые перспективы в селекции норки и в изучении ее эмбриологии.

Отсутствие опубликованных работ по получению ЭС клеток не только у представителей сем. Mustelidae в частностино и у отряда Carnivora в целом, довольно хорошая генетическая изученность этого вида, перспектива практического применения ЭС клеток при селекционной работе с норкой явились предпосылками выбора норки для настоящего исследования.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы было получение набора линий ЭС клеток американской норки (Mustela vison) и детальная их характеристика, что в первую очередь касается такого важнейшего их качества, как плюрипотентность.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1.Оценка пригодности в качестве фидера для культивирования ЭС клеток норки первичных эмбриональных фибробластов мыши, первичных эмбриональных фибробластов норки, а также двух линий перевиваемых фибробластоподобных клеток норки.

2.Выделение линий ЭС клеток Из эмбрионов норки разных стадий развития: морулы, ранней бластоцисты и внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты.

З.Цитогенетическая характеристика полученных линий ЭС клеток с использованием G-дифференциальной окраски хромосом.

4.0ценка плюрипотентности ЭС клеток в условиях их дифференцировкн in vitro с использованием анализа активности X-хромосом и иммунофлюоресцентного анализа набора клеточных антигенов.

5.Оценка плюрипотентности ЭС клеток в условиях их дифференцировкн .in vivo с помощью гистологического анализа эмбриоидных тел (ЭТ) и тератом.

Научная новизна,

В результате проведенной работы была впервые получена из эмбрионов норки на разных стадиях развития серия линий эмбриональных клеток норки, адаптированных к культивированию in vitro.

Показано, что все линии имеют нормальный кариотип без видимых хромосомных перестроек. Установлено, что в некоторых линиях эмбриональных клеток, имеющих генотип XX, обе Х-хромосомы находятся в активном состоянии в большей части клеток, что подтверждается анализом активности сцепленного с Х-хромосомиой гена птюкозо-б-фосфатдепщрогеназы. В этих линиях ген Г6ФД активен в обеих Х-хромосомах. Показано, что полученные линии ЭС клеток норки яри дифференцировке in vitro способны давать производные всех трех зародышевых листков и образовывать простые и сложные эмбриоидные тельца. Две линии, имеющие генотип ХУ и происходящие из морулы и В КМ, при введении атимическим мышам образовывали опухоли типа тератом, что свидетельствует об их высокой плюрипотентности. Эти линии признаны пригодными для дальнейших экспериментов по переносу в них генов и для получения химер.

Таким образом, полученные данные содержат новую информацию о высокоплюрипотентных линиях ЭС клеток еще одного вида млекопитающих, представителя отряда хищников. Эти линии могут быть использованы в исследованиях эмбриологического и онтогенетического плана, а в перспективе - для получения трансгенных норок.

Основные результаты получены и описаны автором самостоятельно. Часть результатов и материалов получены совместно с Голубицей А.Н., Железовой А.И., Ватолиным С.Ю. и другими соавторами, которым, пользуясь случаем, автор приносит глубокую и искреннюю благодарность.

Апробация результатов.

Материалы диссертации были доложены на I Европейской конференции по достижениям в эмбриональной технологии и генетической инженерии, Краков, 1994 и представлены стендом на 42-ом Национальном генетическом конгрессе, г.Кашамбу, Бразилия, 1996.

Объем и структура работы.

Работа изложена на 74 страницах и состоит из введения, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 85 названий. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 7 таблицами.

СОДЁРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во "Введении " формулируются предпосылки и основные задачи исследования.

В главе 1. "Обзор лшерагуры" представлена история получения плюрипотентных линий тератокарцином и эмбриональных стволовых клеток, сопоставлены их свойства и возможности использования в научных исследованиях, а также дан краткий обзор работ по получению линий эмбриональных стволовых клеток у сельскохозяйственных животных.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал. Для получения ЭС линий американской норки использовали эмбрионы двух генотипов: дикого (+/+) и мутантного (р/р), на стадии морулы и предимплантационной бластоцисты, а также внутреннюю клеточную массу (ВКМ) ранних бластоцист. В общей сложности для получения линий ЭС клеток использовали 138 эмбрионов .

Методы. После удаления блестящей оболочки эмбрионы помещали на фидер - слой фибробластов, обработанных гамма-излучением для прекращения митозов. Среда для культивирования: альфа-модификация среды MEM с 20% сыворотки эмбрионов коров и 10^ М бета-меркаптоэтанола. Образовавшиеся колонии дезагрегировали смесью трипсин-ЭДТА и переносили на новый фидер. Далее пересевы проводили раз в 3-4 суток. Для оценки плюрипотентности ЭС клеток вызывали их спонтанную дифференцировку культивированием без фидера и

I

4

определяли дериваты дифференцировки с помощью непрямого иммунофлюо-ресцентного окрашивания. Плюрипотентность ЭС клеток оценивали также по морфологии эмбриоидных телец (ЭТ) и гистологическому составу опухолей, возникающих после инъекции ЭС клеток атомическим мышам. Степень плюрипотентности ЭС линий, имеющих генотип XX, оценивали по доле ЭС клеток, содержащих позднореплицирующуюся Х-хромосому, и по уровню активности маркера Х-хромосомы - гена шюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД). Позднореплицирующуюся Х-хромосому определяли по методу Kanda (1973), а активность Г6ФД - по методике Dao et al. (1979). Плюрипотентными считали линии ЭС клеток, образующих при дифференцировке производные трех зародышевых листков, сложные ЭТ, опухоли типа тератом, а среди линий с генотипом XX - те, которые имели низкий процент клеток с позднорепли-цирующейся Х-хромосомой.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Получение и цитогенетическая характеристика линий эмбриональных клеток из бластоцист, морул и ВКМ норки.

Бластоцисты, освобожденные от zona pellucida и помещенные в условия in vitro, обычно закреплялись на фидере в течение первых трех суток. Большая часть эксплантата ЭС клеток бластоцисты норки обычно состояла из крупных и средней величины клеток с цитоплазмой, заполненной темными включениями. Среди них были расположены компактными группами мелкие клетки с большим ядерно-цитоплазматическим индексом. По морфологическим признакам они были схожи с клетками ВКМ бластоцисты.

Клетки морул и ВКМ чаще всего прикреплялись на следующие сутки после помещения в ячейку с фидером. Эксплантаты морул и ВКМ по сравнению с эксплантатами бластоцист состояли из более однородных по морфологии клеток с большим ядерно-цитоплазматическим индексом.

Как правило, на пятые-седьмые сутки первичные колонии снимали, дезагрегировали и пересевали на новый фидер. Этот пассаж считали первым. Если популяция клеток увеличивалась и к третьему-четвертому пассажу достигала 1-2x106 клеток, ее "считали линией и давали ей название с порядковым номером, например, MES-1, MES-2 и т.д. (таблица

1). Расшифровка аббревиатуры MES - Mink Embryonic Stem. На этом этапе часть клеток криоконсервировали, а остальные размножали для анализа плюрипотентности. Всего было получено 18 линий (таблица 1).

Таблица 1. Линии ЭС клеток, полученные из бластоцист, морул и ВКМ норки.

Шифры линий Донор ЭС клеток Характеристики линий Ссылки

Генотип окраски Половые хромосомы Тип фидера

MES-1 бластоц +/+ XY MV,MF Sukoyan at

MES-2 бластоц +/+ XY MEF,MF al., 1992

MES-3 бластоц +/+ XY MEF,MF ibid.

MES-4 бластоц +/+ XX FMV,MF ibid.

MES-5 бластоц +/+ XX MEF,MF ibid.

MES-6 бластоц р/р XY MF ibid.

MES-7 бластоц р/р XY MF ibid.

MES-8 бластоц р/р XX MF ibid.

MES-9 бластоц р/р XX MF ibid.

MES-10 бл'астоц +/+ XX MF ibid.

MES-11 морула +/+ XY MF Sukoyan at

MES-12 морула +/+ XY MF al., 1993

MES-13 морула р/р XX MF ibid.

MES-14 ВКМ р/р XY MF ibid.

MES-15 бластоц р/р XX MF ibid.

MES-16 ВКМ р/р XY MF ibid.

MES-17 ВКМ р/р XX MF ibid.

MES-19 бластоц P/P XX MF ibid.

Гены окраски меха: +/+ - дикий фенотип, стандартная коричневая окраска; р/р - мутантный фенотип (мутация platinum). Линии клеток, использовавшихся в качестве фидера: MF - первичные эмбриональные фибробласты норки; MEF - первичные эмбриональные фибробласты мыши; MV, FMV - постоянные линии фибробластоподобных клеток норки.

При сравнении - числа эксплантатов, полученных из зародышей генотипов +/+ и р/р, была обнаружена тенденция эмбрионов генотипа +/+ образовывать эксплантаты в большем проценте случаев, чем у эмбрионов генотипа р/р (таблица 2). Так, бластоцисты генотипа +/+ образовывали первичные эксплантаты в 36% случаев, тогда как р/р - в 26%, а морулы +/+ - в 41% случаев, против 25% у морул генотипа р/р.

Из результатов, представленных в таблице 2 также можно сделать вывод, что ВКМ являлись лучшими донорами ЭС клеток, т.к. образовывали первичные эксплантаты с частотой, более чем в 2 раза превышающей таковую у бластоцист и морул.

При попытках получать ЭС линии без применения фцдера, но с добавлением в среду mLIF, как это зачастую делается при получении ЭС линий у мышей, ни одного эксплантата не образовалось ни из бластоцист, пи из ВКМ.

Различные линии фибробластов были испробованы для поддержания ЭС клеток в недифференцированном состоянии. Лучшими в этом отношении оказались первичные эмбриональные фибробласты норки.

Таблица 2. Частота образования первичных эксплантатов в зависимости от стадии развития и генотипа эмбриона.

Донор ЭС- Генотип донора Число эмбрионов Число

клеток эксплант.(%)

+/+ 28 10 (36)

Бластоцисты р/р 47 12 (26) -

Оба генотипа 75 22 (30)

+/+ 7 3 (41)

Морулы р/р 4 1 (25)

Оба генотипа 11 4 (36)

ВКМ +/+ 0 0

р/р 5 4 (80)

На ранней стадии становления линий, в промежутке между восьмым и шестнадцатым пассажами, был проведен цитогенетический анализ всех

восемнадцати линий ЭС клеток норки. Результаты подсчета G-дифференциальноокрашенных метафазных хромосом показали, что у всех линий присутствует нормальный хромосомный набор американской норки - 2N=30. Видимых хромосомных перестроек не было выявлено ни в одной из исследованных линий (при просмотре не менее 50 метафазных пластинок). Девять линий клеток имели генотип XX, а девять других -ХУ, что говорит об одинаковой способности образования линий зародышами обоих полов..

Кариотип ряда линий был повторно проанализирован на более поздних пассажах: на 30-ом пассаже был проведен цитогенетический анализ линий MES-1 и MES-8, на 36-ом - MES-15, на 31-ом - MES-17. Важно отметить, что при этом мы не наблюдали каких-либо нарушений в кариотипе: не было найдено ни изменения числа хромосом, ни каких-либо видимых перестроек.

3.2.Характеристика плюрипотентности ЭС линий норки.

3.2.1 .Обзор методов опенки плюрипотентности ЭС клеток.

В данной работе мы использовали несколько подходов для характеристики плюрипотентности ЭС клеток норки.

Известно, что вначале у эмбрионов млекопитающих генотипа XX обе Х-хромосомы активны, и лишь в конце предимплантационного периода имеет место инактивация одной из Х-хромосом (Lyon, 1961). Вполне понятно, что активность обеих Х-хромосом в клетках эмбриона отражает состояние большей плюрипотентности по сравнению с клетками, где одна из Х-хромосом неактивна. То же справедливо и для ЭС клеток in vitro, как показано на стволовых клетках тератокарцином мышей (Martín, 1978; Takagi and Martin, 1984). Так как репликация неактивной Х-хромосомы происходит позже, чем у активной, существующими методами можно определить ее на метафазных пластинках. Анализ соотношения метафазных пластинок с синхронно и асинхронно реплицирующимися X-хромосомами может дать информацию о плюрипотентности ЭС линий. Параллельно возможно проведение анализа активности одного или нескольких сцепленных с Х-хромосомой биохимических маркеров. Примером может служить ген глюкозо-6-фосфатдегадрогеназы. При этом уровень активности фермента дает информацию о состоянии X-

хромосомы: вдвое более высокая активность фермента (отсутствие дозовой компенсации) будет характеризовать клетки с обеими активными Х-хромосомами, по сравнению с клетками, в которых имеет место инактивация одной из Х-хромосом.

Другой способ оценки плюрипотентности основан на анализе разнообразия дериватов ЭС клеток при их дифференцировке in vitro и in vivo. Прежде всего, это оценка типа эмбриоидных телец, которые могут образовывать клетки тестируемой линии при спонтанной, дифференцировке (ш vitro - в суспензионной культуре и in vivo - при инъекции внутрибрюшинно экспериментальным животным). При этом степень разнообразия клеточных дериватов, возникающих в результате дифференцировки, может дать информацию о проспективных способностях ЭС клеток.

Применялся также метод оценки плюрипотентности по способности клеток тестируемой линии образовывать опухоли типа тератом при подкожном введении экспериментальным животным.

3.2.2,Опенка плюрипотентности ЭС линий, имеющих генотип XX, по активности Х-хромосом.

Выявлены отличия линий разного происхождения (из морул, бластоцист или ВКМ) при сравнении в них доли клеток с позднореплицирующейся Х-хромосомой и дозы гена Г6ФД.

В таблице 3 приведены данные по количественному соотношению метафазных пластинок с одной темноокрашенной и с обеими одинаково окрашенными Х-хромосомами в линиях ЭС клеток различного происхождения, при длительном культивировании- и после дифференцировки.

Так, в линиях MES-13 (из морулы) и MES-17 (из ВКМ) клеток с темноокрашенной Х-хромосомой 22% и 24% соответственно, а в линиях, полученных из бластоцист, их от 41% до 60% (таблица 3). Внося поправку на чувствительность использованного нами метода Kanda (1973) определения неактивной Х-хромосомы (около 60%), можно предположить, что в линиях из морулы и ВКМ около 2/3 клеток имеют обе Х-хромосомы в активном состоянии, а в линиях бластоцистного происхождения таких клеток не более 1/3 или же совсем нет.

Таблица 3. Количественный анализ позднореплицирующейся X-хромосомы и экспрессии связанного с Х-хромосомой маркера (Г6ФД) в ЭС линиях норки.

Линия ЭС клеток Донор ЭС клеток Пол Номер пасс. Число метафаз % метафаз с темноокраш. Х-хромосом. Активность Г6ФД(х10)а (xlS)

MES-13 морула XX 8 73 22 0,13210,017

MES-17 ВКМ XX 18 66 24 0,13210,008

31 51 39 0,17510,021

-"-17.1b " " 21 51 57 0,05410,0il

-"-17.2b 16 48 58 0,04310,004

MES-15 бластоц XX 6 114 45 0,10110,010

" " 36 50 44 -

MES-19 бластоц XX 10 80 56 -

MES-4 бластоц. XX 16 41 61 -

MES-8 бластоц. XX 9 71 41 0,16010,015

MES-9 бластоц. XX 10 54 59 -

MES-10 бластоц XX 10 43 58 0,08110,010

В7(контроль)с XX 250 47 62 ~

Контроль Г6ФД

MES-12 морула XY 17 ~ ~ 0,06710,014

MES-16 ВКМ XY 11 0,06810,008

MES-6 бластоц. XY 10 -- 0,06010.023

а Количество нг продукта (NADH), образующегося в мин./мкг белка. Результат 2 независимых измерений.

ь Субкультуры линии МЕБ-П после 1 и 2 недель (соответственно) культивирования без фидера.

' Постоянная линия фибробластоподобных дифференцированных клеток легкого норки.

Анализ активности Г6ФД показал, что в тех линиях, где доля клеток с темноокрашенной Х-хромосомой ниже 40%, активность гена близка к двум дозам (таблица 3). Это линии MES-13 (из морулы), MES-17 (из ВКМ) и MES-8 (из ранней бластоцисты). В линиях MES-15 и MES-10 (обе получены из бластоцист, доля клеток с темноокрашенными X-хромосомами равна 45% и 58% соответственно), уровень активности Г6ФД близок к одной дозе гена.

В линии MES-17 состояние Х-хромосом было проанализировано после длительного культивирования на фидере и без фидера. На 18-ом пассаже культивирования на фидере в этой линии присутствовало 24% клеток с темноокрашенной Х-хромосомой, а на 31-ом пассаже их количество увеличилось до 39%. Промежуток времени между этими измерениями был равен 38 суткам. Культивирование этой линии в течение двух недель без фидера привело к инактивации одной X-хромосомы почти во всех клетках. Соответственно, и активность Г6ФД снизилась до уровня одной дозы (таблица 3). Этот факт является хорошим подтверждением связи состояния Х-хромосомы и уровня коммитирования клеток.

3.2.3. Пифференпировкя ЭС клеток норки in vitro.

3.2.3.1.Получение эмбриоидных телец.

ЭТ, формировавшиеся в суспензионной культуре ЭС клеток норки, представляли собой полые структуры шаровидной или неправильной формы. Они были двух типов. ЭТ первого типа формировались быстро, в первые-вторые сутки после помещения ЭС клеток в условия суспензионного культивирования в отсутствии фидера. Их стенки состояли из одного слоя клеток - крупных, с обширной цитоплазмой, заполненной темными включениями, сконцентрированными у ядерной мембраны. Такое строение типично для эндодермальных клеток. При дальнейшем культивировании такие эмбриоидные тельца увеличивались в диаметре за счет пролиферации клеток, но их стенки оставались однослойными. Такие ЭТ мы назвали "простыми", следуя классификации, предложенной Robertson (1987) для ЭТ мыши.

Иного, более сложного строения ЭТ иногда формировались в суспензии дифференцирующихся клеток после длительного

культивирования в отсутствии фидера. Они выглядели более плотными и непрозрачными по сравнению с простыми ЭТ. Их стенка местами или полностью была многослойной. В ней хорошо различались клетки внешнего слоя, похожие на вышеописанные эндодермоподобные, внутренний слой уплощенных клеток (вероятно, подобный висцеральной эндодерме), граничащих с полостью и рыхлая масса мезенхимоподобных клеток между этими двумя слоями. Такие тельца мы назвали "сложными", или "цистическими", согласно определению Robertson (1987). Однако, островков первичного зародышевого кроветворения, которые характерны для цистических эмбриоидных телец мыши, в таких ЭТ норки не было обнаружено.

3.2.3.2. Исследование дифференцировки ЭС клеток в монослое при помощи иммунофлюоресцентного анализа.

С помощью антител к белкам, маркирующим разные типы тканей, была исследована тканевая принадлежность дериватов дифференцировки ЭС клеток в монослое. Показано, что эти дериваты принадлежат к различным зародышевым листкам. Например, антителами против виментина выявляли фибробластоподобные клетки (производные мезодермы). Островки эпителиальных клеток выявлялись антителами против цитокератина.

Интересные результаты получены при дифференцировке клеток линий MES-8 и MES-9. Через 20 и 50 суток культивирования без фидера среди хаотически дифференцирующихся клеток были отмечены нейроноподобные структуры с длинными отростками, образующими характерную сеть. Эти структуры обнаруживали специфическое свечение после обработки антителами к энолазе В - маркеру нейронов. Эти данные позволяют сделать вывод, что клетки линий MES-8 и MES-9 способны дифференцироваться в нейроноподобные типы клеток, то есть производные эктодермы.

3.2.4. Пифференпировка in vivo ЭС клеток норки

3.2.4.1.Получение опухолей у атимических мышей.

Клетки ЭС линий вводили подкожно мышам nude. Через 12-15 дней после инъекций клеток линий MES-1 (из бластоцисты), MES-12 (из морулы) и MES-16 (из ВКМ) в местах введения были отмечены быстро растущие опухоли. Клетки остальных линий не образовали опухолей. Опухоли, возникшие после введения клеток MES-1, состояли в основном из фибробластоподобных клеток, что позволяет их отнести к типу фибросарком. Изредка среди фибробластов встречались островки иных клеток - атипичного эпителия, шадкомышечных клеток и поперечнополосатые волокна. Однако, ни в одной опухоли не было отмечено эпителиальных клеток кератинового типа или неироглиальных клеток - производных эктодермы. Ограниченное разнообразие клеточного состава опухолей из клеток линии MES-1 и отсутствие опухолей у других линий, говорит, скорее всего, о суженном спектре плюрипотентности этих линий.

Клетки линий MES-12 и MES-16 дали начало опухолям, в которых, как в истинной тератоме, присутствовали такие элементы первичного органогенеза, как первичная кишка, хорда, зачаток сердца, а также участки мезенхимальных клеток. Присутствие производных всех трех зародышевых листков говорит о плюрипотентности клеток линий MES-16 и MES-12.

Глава 4.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Насколько нам известно, норка является единственным представителем отряда хищников, у которого получены в настоящее время линии ЭС клеток. Ранее были опубликованы данные о получении ЭС клеточных линий для ограниченного числа видов: четырех видов грызунов (мышь, китайский хомячок, кролик и крыса), трех видов парнокопытных (корова, овца и свинья) и у двух видов приматов.

Нами был проведен детальный анализ ЭС линий норки при помощи нескольких методов. Метод анализа состояния Х-хромосом в ЭС линиях, имеющих генотип XX, был широко применен нами для тестирования

плюрипотентностц линий. По аналогии с развитием эмбриона на первых стадиях, когда процесс дифференцировки идет параллельно с инактивацией одной из Х-хромое ом, мы предположили, что в ЭС линиях действует тот же механизм. Соответственно этому линии с большим числом клеток, имеющих обе активные Х-хромосомы, более шиорипотентны, и наоборот, чем меньше таких клеток в линии, тем меньшие потенции она может проявить при дифференцировке. Согласно этому, линии ЭС клеток с генотипом XX, имеющие менее 1/3 клеток с позднореплицирующейся Х-хромосомой (т.е. линии из морулы и В КМ) отнесены нами к высокоплюрипотентным, а линии из бластоцист, имеющие более 2/3 клеток с позднореплицирующейся Х-хромосомой, рассматриваются нами как ЭС-подобные.

Результаты тестирования ЭС линий с помощью анализа эмбриоидных телец и опухолей, возникающих из ЭС клеток после их введения атимическим мышам, согласуются с данными анализа активности X-хромосом. Они также подтверждают, что ЭС линии, полученные из морул и ВКМ, более шиорипотентны, чем линии из бластоцист.

Принимая во внимание данные всех проведенных тестов, мы выделили среди ЭС линий две (МЕ8-12, ХУ, из морулы и МЕЗ-16, ХУ, из ВКМ) наиболее перспективные для использования в эмбриологических и онтогенетических экспериментах.

Получение высокоплюрипотентных линий норки открывает перспективу манипулирования геномом норки, обеспечивая базу для получения трансгенных норок с помощью конструирования химер или пересадки ядер ЭС клеток в энуклеированные ооциты или яйца.

выводы

1. Впервые получены линии эмбриональных стволовых клеток американской норки из бластоцист (12 линий), морул (3 линии) и ВКМ (3 линии) методом имплантации эмбрионов in vitro на фидер из эмбриональных фибробластов норки.

2. Цитогенетический анализ с помощью метода G-дифференциальной окраски показал, что все 18 линий имеют нормальный диплоидный набор аутосом и XX (у девяти линий) или ХУ (у других девяти) половые хромосомы, при этом не обнаружено видимых хромосомных перестроек.

З.Определение тканевой принадлежности дериватов дифференцировки in vitro ЭС клеток ряда полученных линий, проведенное методом непрямой иммунофлюоресценции антител, показало, что ЭС клетки дифференцируются в производные эктодермы (энолаза-В позитивные нейропгаальные клетки,), мезодермы (фибробластоподобные виментин- позитивные клетки) и в эпителиоподобные клетки, выявляемые антителами к цитокератину.

4. Тестирование плюрипотентности линий разного происхождения, имеющих генотип XX, проведенное путем анализа соотношения клеток с синхронно и асинхронно реплицирующимися Х-хромосомами и определением уровня активности фермента Г6ФД показало, что линии, полученные из морулы и ВКМ (MES-13 и MES-17) имеют более высокий уровень плюрипотентности, чем линии MES-10 и MES-15, полученные из бластоцист; в линиях MES-13 и MES-17 около 2/3 клеток имеют синхронно реплицирующиеся Х-хромосомы и величину активности Г6ФД, близкую к двум дозам, в то время как в линиях MES-10 и MES-15 менее 1/3 клеток с активными Х-хромосомами и величина активности Г6ФД, соответствующая одной дозе гена.

5. Показано методом анализа эмбриоидных телец (ЭТ) и опухолей, возникающих у атомических мышей из инъецированных в них ЭС клеток норки, что линии, произошедшие из морулы (MES-12) и ВКМ (MES-16), обладают высоким уровнем плюрипотентности, в то время как у линий из бластоцист плюрипотентность снижена; клетки MES-12 и MES-16 формировали простые и сложные ЭТ, а также опухоли типа истинных тератом, состоявшие из производных трех зародышевых листков. Клетки бластоцистных линий формировали только простые ЭТ и не образовывали тератом.

6. Предложены способы культивирования эмбрионов, позволяющие повысить частоту образования первичных эксплантатов и, таким образом, увеличить эффективность получения ЭС клеток с высокими плюрипотентными характеристиками.

7. Полученные высокоплюрипотентные ЭС линии норки являются базой для дальнейшего развития эмбриологических и онтогенетических исследованийи открывают перспективу создания химер норки.

Основные публикации по теме диссертации.

l.Sukoyan, М.А., Golubitsa, A.N., Zhelezova, A.I., Shilov, A.G., Vatolin, S.Y., Maximovsky, L.P., Andreeva, L.E., McWhire, J., Pack, S.D., Bayborodin, S.I., Kerkis, A.Y., Kizilova, H.I. and Serov, O.L. Isolation and cultivation of blastocyst-derived stern cell lines from american mink (Mustela vison).// Mol. Repr. Dev.(1992) 33:418-431

2.Sukoyan, M.A., Vatolin, S.Y., Golubitsa, A.N., Zhelezova, A.I., Semenova, L.A. and Serov, O.L. Embryonic stem cells derived from morulae, inner cell mass, and blastocysts of mink: Comparisons of their pluripotencies. // Mol. Repr. Dev. (1993) 36:148-158