Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе костных структур

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе костных структур"

На правах рукописи

□ОЗОВ425В

ЧУПИКОВА Наталия Игоревна

Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе костных структур

03.00.23 - биотехнология 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 Шп 20(17

Москва-2007

003064256

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ) и ООО «Институт стволовой клетки».

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент РАХН Девришов Давудай Абдулсемедович;

доктор медицинских наук Тепляшин Александр Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович; доктор биологических наук, профессор Манько Виктор Михайлович

Ведущая организация - Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ ВНИТИБП).

Защита состоится 2007 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 220.042 01 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (495) 377-93-83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ

Автореферат разослан «^У» 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Т Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Особую актуальность в настоящее время приобрели методы клеточной биотехнологии, которые позволяют получать культуры стволовых клеток, обладающих уникальной свойствами Изучение физиологических особенностей, функций и локализации в организме различных типов стволовых клеток человека помогают понять механизмы регенерации и поддержания организма (Presnell S.C., 2002, Verfailhe С M., 2002)

В связи с этим, перспективным подходом является использование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) человека в качестве источника получения тканей мезодер-мального происхождения, с целью применения в качестве средства заместительной терапии при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата человека и животных (Bruder S.P., 1998, Kassem M, 2004).

Решение поставленных вопросов зависит от дальнейшего усовершенствования методов выделения, культивирования и дифференцировки m vitro, а также методов получения трехмерных структур на основе ММСК и минеральных или органических матриксов.

Таким образом, изучение ММСК человека является актуальным для применения в ветеринарной и медицинской практике

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - получение и биологическая характеристика ММСК КМ человека, а также разработка на основе этих клеток трехмерных трансплантатов костной ткани (ТТКТ).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Провести исследования по выделению и разработка оптимальных условий для долгосрочного культивирования ММСК КМ человека

2. Изучить морфологические и иммуногенетические особенности ММСК КМ человека в культуре.

3. Изучить распределение ММСК КМ при внутривенном введении на модельных животных (мыши)

4. Создать трехмерные структуры костной ткани с использованием ММСК КМ человека и кальций-фосфатного (КФ) матрикса.

5. Провести доклиническое изучение полученных костных трансплантатов на экспериментальных мышах и овцах

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов выделения ММСК и предложен усовершенствованный метод Для выделения популяции ММСК определен параметр центрифугирования Равный 3000 об/мин Разработаны оптимальные условия для длительного культивирования ММСК КМ человека Впервые в России проведен широкий анализ антигенов, характеризующих ММСК.

Впервые, с учетом морфологических особенностей клеток представлены данные об оптимальном соотношении количества клеток на объем матрикса с учетом пористости носителя. Впервые показана зависимость плотности заполнения матрикса на дифференцировку клеток. На основе гистологических и иммуногистохимических методов доказано, что в результате культивирования in vitro ММСК КМ в матриксе в дифференци-ровочной среде получены трехмерные структуры костной ткани. Показано, что при эктопическом введении полученных трансплантатов в организм мышей, они не являются токсичными и не проявляют свойств туморогенности.

Впервые в России проведены предклинические испытания по влиянию полученных костных трансплантатов на организм овцы при смоделированных костных травмах

Практическая значимость. Разработанный способ выделения ММСК КМ используется для получения и наращивания клеточной массы для последующей криоконсервации и длительного хранения для клинических целей (клиника «Бьюти Плаза»),

Метод получения и наращивания ММСК животных используется на

кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и учебном процессе

В ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН используются биотрансплантаты костной ткани для клинического изучения.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены на международном симпозиуме и европейской научно-практической конференции (Германия, 2004); международном симпозиуме по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2004); Российском симпозиуме «Лазерная медицина» (Москва, 2004), II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); на 4-ом ежегодном съезде Европейского общества по тканевой инженерии (Германия, 2005); международной конференции «Surface - Tissue Interaction» (Швейцария, 2005), Всемирной конференции по тканевой инженерии, 8-ом ежегодном съезде международного общества тканевой инженерии (Китай, 2006); 3-ем Московском международном конгрессе «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006); VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском Национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006), на XI съезде международного общества по тканевой инженерии, европейском международном симпозиуме (Нидерланды, 2006)

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Усовершенствованный метод выделения, физиологическая характеристика и условия культивирования ММСК.

2 Способ получения трехмерных структур костной ткани.

3 Доклиническое изучение полученных биоимплантов в организме иммунодефицитных животных и мелкого рогатого скота in vivo.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, 10 статей в сборниках научных трудов

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (167 источников, из которых 10 отечественных и 157 иностранных). Работа содержит 10 таблиц, 19 рисунков, 8 страниц приложений.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2003 по 2007 год на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ и ООО «Институт стволовой клетки».

В экспериментах использовали стандартные питательные среды и растворы отечественного и зарубежного производства Культивирование клеток проводили в инкубаторе фирмы Sanyo (Япония).

Костный мозг 20 здоровых доноров был получен в клинике «Бьюти Плаза», методом пунктирования гребня подвздошной кости. ММСК КМ получали методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла Полученную популяцию клеток переносили в кулыуральный матрас из расчета 1 млн. клеток на 1 см2.

Морфологическую оценку ММСК КМ проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Изучение клеточных популяций проводили путем анализа клеток, окрашенных иодитом пропидия по пяти клеточным культурам

Начиная с 1-го пассажа, анализировалось влияние подложек и ростовых факторов на длительность культивирования ММСК КМ

Подготовку проб для кариологического анализа проводили по стандартной методике с использование раствора колхицина. Хромосомные препараты анализировали методом GTG-окрашивания

Окрашивание поверхностных маркеров полученной культуры ММСК КМ проводили по методике, описанной Zeille G. (1980) и Collotta F. (1984). Было проанализировано 270 проб клеточной суспензии от 9 доноров

Анализ локализации ММСК КМ человека в организме животных проводили на 20 самках мышей линии Balb/C nude с помощью ПЦР-анализа по Y-хромосоме на 21-е сутки

Способность ММСК пяти клеточных линий к дифференцировке в клетки мезодермального ряда и специфическое окрашивание проводилось по Pittenger (1999) и Reyes (2001)

Окраска на специфические антитела проводилась с использованием коммерческого набора DAB-kit (Chemicon, США). Молекулярный анализ дифференцированных клеток проводился методом ОР-ПЦР.

Для создания ТТКТ использовали матриксы BD СаР (BD Biosciences, Германия) и СаР матриксы (Канада) и ММСК КМ человека. После насыщения матрикса клетками, трехмерные структуры культивировали в остеогенной среде в течение 4 недель.

Доклинические испытания проводились на 16 мышах (Balb/C nude). Для оценки токсичности и туморогенности, ТТКТ вшивали подкожно иммунодефицитным мышам в область спины на срок 8 недель.

Клиническое изучение ТТКТ проводили на 9 овцах романовской породы путем моделирования перелома плюсневой кости размером 3,5 см. В эксперименте исследовали 3 группы 1- контрольный перелом, 2 - в место перелома помещали КФ матрикс без клеток; 3 - в место дефекта помещали ТТКТ. Фиксацию проводили с помощью аппарата Илизарова. У овец в течение срока наблюдения (1 месяц) изучали динамику изменений гематологических и биохимических показателей периферической крови.

Экспериментальные данные обрабатывали методом среднестатистического анализа и с помощью программ СХР v. 2.1 и MultiCycle.

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие д б.н, проф. Савченкова И.П, к.б.н. Коржакова C.B., Шарифуллина С.З. (ООО «Институт стволовой клетки»), сотрудники кафедры иммунологии и кафедры хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, ГУ РОЩ им. Н-И Блохина РАМН и ИБХ им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН, за что автор им искренне благодарен.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Оптимизация условий выделения и культивирования ММСК КМ

При выделении ММСК КМ сравнивали несколько способов разделения в градиенте фиколла с разными параметрами осаждения клеток, результаты, которых представлены в таблице 1

Табл. 1 Зависимость количества полученных ММСК от параметров

центрифугирования

Параметры центрифугирования в градиенте фиколла, об/мин Кол-во клеток в моно-нукл фракции, млн. кл Кол-во клеток после лизиса, млн. кл Кол-во ММСК через 7 дней культивирования, млн.кл

2000 22,7 ±0,8 14,9 ±0,3 2,35 ±0,18

2500 27,2 ±1,3 14,2 ±0,9 2,55 ±0,14

3000 21,4 ±0,6 14,3 ± 0,3 3,25 ± 0,08

3500 23,8 ± 1,1 14,5 ±0,8 2,9 ±0,17

Сравнительный анализ эффективности выделения ММСК при различных параметрах центрифугирования показал, что режим, составляющий 3000 об /мин. является наиболее оптимальным При таких параметрах в получаемой мононуклеарной фракции содержится наименьшее количество клеток крови, мешающих росту культуры ММСК, а выделенная популяция ММСК к 10 суткам культивирования достигает монослоя.

При анализе влияния различных подложек, а также при добавлении к среде для культивирования ростовых факторов было установлено, что

культивирование на подложках на основе коллагена, фибропектина, желатина способствует поддержанию культуры в недифференцированном состояний. Добавление в среду для культивирования фактора роста фибропластов или его комбинации с фактором роста эндотелия усиливает эффект влияния подложек.

Таким Образом, получений« нами данные являются оптимальными для культивирования и позволяют пассировать клетки без спонтанной дифференцировки в культуре более 15 пассажей.

Морфологические особенности ММСК КМ в культуре

ММСК обладали фибробластоподобной морфологией, высокой адге-зивностью, клоногенностью, способностью многократно пролифериро-вать в культуре (более 60 генераций) (рисунок 1 ).

Рис.1 Морфология и особенности роста в культуре ММСК КМ

а) популяция ММСК через 7 дней после выделения; xl 00; б) образование колоний in vitro, х40

Бремя цитогенерации составило 56-60 часов, а митотический индекс -31%о. Полученные данные согласуются с данными, полученными в других лабораториях (Zohar et al., 1997; Coller et al., 2000; Hung et ai., 2002} и подтверждают, что полученная нами популяции клеток обладает основным характеристиками и особенностями роста ММСК в культуре in vilra.

Анализ ММСК КМ в динамике культивирования in vitro

Анализ клеточной линии на 3 пассаже, при прохождении клетками 32 цитогенераций, показал нормальный, диплоидный кариотип культуры Также культура клеток была проанализирована на 10 пассаже (клетки прошли 70 цитогенераций) Кариотип данной культуры клеток 46, XX, без анеуплоидии и структурных перестроек хромосом.

Таким образом, анализ хромосом позволил сделать заключение, что линия имеет диплоидный кариотип 46, XX, не меняющийся во время долгосрочного культивирования.

Культуры клеток были проанализированы по основным параметрам в фазе логарифмического роста. Данные приведены в таблице 2

Табл 2 Анализ клеточных культур в фазе log-роста

№ образца Количество делящихся клеток (S+G2+M) Индекс ДНК (G2/G1) Количество живых клеток (%) Количество клеток в апоптозе (%)

1 11,6% 1,96 91,7 7,2

2 12,3% 1,96 87,8 10,8

3 9,5% 1,958 90,0 5,7

По результатам анализа выявлено, что основной пул клеток находится в ОО-фазе, от 9,5 до 11,6% культуры постоянно делится, что соответствует характеристике ММСК Отношение количества ДНК для клеток, находящихся в 02-фазе к количеству ДНК в в 1-фазе клеточного цикла равно 1,96, что характеризует нормально развивающуюся культуру.

При длительном культивировании количество генетического материала не менялось. Коэффициент распределения ОI для культуры клеток ММСК КМ 2 пассажа - 1,3, ОI 9 пассажа - 1,32. Эти данные соответствуют норме и характеризуют стабильность количества ДНК при длительном пассировании полученной культуры.

Анализ поверхностных маркеров, выделенной популяции ММСК

Среднестатистические данные профиля экспрессии поверхностных антигенов по 9 образцам ММСК приведены в таблице 3.

Табл 3. Иммуннофенотипирование культуры ММСК костного мозга

CD-маркер ММСК CD-маркер MMCK

CD10 78,5 ± 3,2 CD73 96,7 ± 1,2

CD13 99,0 ±1,0 CD90 98,1 ± 1,1

CD25 1,7 ± 0,5 CD 105 97,7 ±1,5

CD29 98,5 ± 1,3 CD 106 60,0 ±2,4

CD31 3,2 ±0,1 CD117 2,9 ±0,4

CD34 3,5 ± 0,3 CD 120a 34,2 ± 1,3

CD44 98,7 ± 0,9 CD 124 3,8 ±0,3

CD45 4,5 ± 0,3 CD 133 1,7 ±0,1

CD49a 97,1 ±2,7 CD 166 99,1 ±0,5

CD49b 95,2 ±3,8 HLA ABC 99,5 ±0,5

CD49d 20,6 ± 1,4 HLADP 4,8 ± 0,8

CD49f 78,0 ±3,2 HLA DO 2,5 ±0,3

CD54 69,0 ±2,9 HLA DR 2,1 ±0,5

CD71 86,4 ± 4,3 Strol 2,2 ±0,7

Полученные данные иммуннофенотипирования свидетельствуют о наличии разнообразных поверхностных CD-кластеров. Наиболее типичными для ММСК являются CD13, CD29, CD44, CD49a и b, CD73, CD90, CD105, CD166, при этом на поверхности культуры отсутствовали маркеры гемопоэтических и эндотелиальных клеток, что согласуются с ранее полученными данными Minguell et al., (2001), Reyes et al. (2001), De Ugarte et al (2003).

Способность ММСК костного мозга к цитодифференцировке в клетки мезодермального происхождения

Окрашивание клеток после культивирования в адипогенной среде осуществляли с помощью специфического красителя Oil Red. Эффек-

тивность адиподифференцировки ММСК КМ составила порядка 20-30%. Возможно, это обусловлено наличием небольшого количества истинно стволовых клеток в полученной культуре клеток.

После 1-й недели культивирования в остеогенной среде в культуре ММСК КМ было выявлено изменение морфологии и накопление каль-ц и фи ци р о в ан но го матрикса. Для оценки остеодифференцировки через 14 дней после культивирования в остеогенной среде клетки окрашивали на щелочную фосфатазу (ЩФ) и на 28 день - ализариновым красным и по von Kossa (рис, 2). Эффективность остеодифференцировки составила 85-90%. Такая высокая эффективность может быть объяснена тканеспе-цифичностью полученной популяции клеток.

а) б)

Рис. 2. Этапы остеодифференцировки ММСК KM in vitro

а) через 14 дней гюслс внесения остеогенной среды, окраска на ЩФ, х200; б) через 28 дней после внесения остеогенной среды, окраска али-зорвдовым красным, х200

При моделировании хондроструктур на основе ММСК, так называемые pellet culture, было показано, что через 28 дней в присутствии хонд-рогенной среды клетки экс пресс яру ют основные маркеры хил дроге не та -коллаген И, аггрекан. Эффективность дифференцировки составила 6070%.

Таким образом, дифференцировочный потенциал полученных клеток, подтверждает их способность к образованию тканей мезодермального

происхождения.

Молекулярный анализ коммутированных ММСК направленных в дифференцировку в клетки костной и хрящевой тканей

Проведенный ОР-ПЦР-анализ остеоиндуцированных образцов ММСК КМ выявил экспрессию основных маркеров остеогенеза. В индуцированных образцах детектировалась экспрессия остеопонтина (ОП), остеокальцина (ОК), костного сиалопротеина II (КСП И) уже на 2-й неделе после внесения индукторов. Результаты молекулярного анализа отражены в таблице 4.

Табл. 4. Результаты ОТ-ПЦР-анализа ММСК КМ после культивирования в остеогенной среде

Маркер Последовательность прай-мера Размер продукта ММСК КМ |

опыт контроль

14 21 28 14 21 28

ОП 5 * ас ссИссаагааё&саас 3! 5,aggtgatgtcctcgtctgtaЗ' 355 н.п. ВВО ■ ■■

КСП 11 5' аесК^аа§ас аас 3' 5' ассаГс atagccatcgtagcЗ1 267 н.п. нан ■■■

ОК 5 'atgagagccctcacactccícЗ' 5' ccgtagaagc ataggc 3' 294 н.п. □но

ОАРРН 5'gggctcctШaactctggt31 5' tggcaggtttttc tagacggЗ' 702 н.п. НИИ □ИП

На основе полученных данных было сделано заключение, что ММСК КМ обладают большой потенцией к дифференцировке в клетки костной ткани.

ОТ-ПЦР-анализ образцов клеток после индукции в хондрогенном направлении, подтвердил наличие стойкой экспрессии маркеров специфичных для хрящевой ч-кани (коллаген II), начиная с 3 недели хондро диффереицировки. Ранний маркер хондрогенеза - аггрекан - появляется на 2-й неделе индукции. Экспрессия коллагена X, наличие которого свидетельствует о гипертрофии хондроцитов, практически не детектирует-

ся. Таким образом, было сделано заключение о дифференцировочном потенциале ММСК КМ в костную и хрящевую ткани.

Локализация ММСК in vivo в организме мыши при внутривенном введении

По результатам ПЦР-анализа присутствие донорских клеток было обнаружено в легких, печени, костном мозга и селезенке, что свидетельствует об относительно равномерном распределении ММСК КМ в паренхиматозных, а также кроветворных органах животного. ММСК не элиминируются, не являются токсичными и не обладают туморогенны-ми свойствами.

Получение ТТКТ на основе ММСК КМ и КФ матрикса in vitro

Для насыщения матриксов клетками были использованы рекомендуемые производителями условия Однако гистологический анализ полученных ЗО-структур выявил неравномерность и недостаточность заполнения пор матриксов. После культивирования в остеогенной среде по результатам иммуногистохимического анализа не было выявлено экспрессии специфических маркеров остеодифференцировки (ОП, ОК). Поэтому, был разработан метод эффективного и равномерного насыщения матриксов клетками, а также определено оптимальное количество клеток на 1см3 матрикса. Исследования по наполнению матриксов приведены в таблице 5.

Табл. 5. Определение количества ММСК КМ для эффективного заполнения матрикса

Кол-во клеток на матрикс 2,5x105 1,0х106 2,0x106

Кол-во клеток вне матрикса через 24 часа, тыс кл. 43,8 + 4,1 150,0 ± 6,3 740,0 ± 8,0

Для получения ТТКТ были определено значение 2x106 клеток на мат-рикс (Уматрикса = 0,058 см2) Проведенный иммуногистохимический анализ полученных структур после направленной дифференцировки выявил

наличие экспрессии специфических маркеров дифференцировки (ОП, ОК)

Таким образом, было показано, что плотность заполнения пор мат-рикса оказывает влияние на эффективность дифференцировки клеток в остеогенном направлении.

Гистологический и иммунногистохимический анализ ТТКТ, имплантированных в организм мыши

Полученные ТТКТ эктопически вшивали подкожно иммунодефицит-ным мышам. Гистологический анализ извлеченных через 8 недель ТТКТ выявил сохранение экспрессии основных маркеров остеодифференци-ровки, а также сохранение трехмерной структуры трансплантатов. ТТКТ после извлечения из организма животного были покрыты соединительнотканной капсулой, а гистологический анализ выявил наличие сосудистых образований в извлеченной структуре, что говорит о физиологическом соответствии и возможности приживления ТТКТ. Во время эксперимента погибло 3 животных, что составляет 19% от общего количества, и является нормой для данного типа животных.

Влияние полученных трансплантатов костной ткани на организм овец при остеосинтезе

После операций с имплантацией ТТКТ отмечается достоверное снижение основных параметров красной крови (Эр, НЬ) и их функциональной активности Аналогичные изменения отмечали и у животных контрольной группы, что указывает на реакцию организма, на травму

При анализе лейкоцитарной фракции во всех экспериментальных группах отмечали относительный нейтрофилез, моноцитоз и лимфопе-нию, что является адаптивной реакцией на травму

Таким образом, система крови участвует в адаптивных реакциях организма овец, которые мобилизуют клеточные резервы и, следовательно, сопровождаются выбросом клеток из депо, необходимых для активации

защитных механизмов организма.

При биохимических исследованиях максимальная активность ката-болических реакций была выявлена на 3-4 сутки после операции в контрольных группах и на 4-5-е сутки в опытной, при этом её проявлению предшествовала гиперпротеинемия, однако в общем пуле не изменялась доля альбуминов, глобулинов и А1Ь/С1 коэффициент, при усилении ци-толитической реакции гепатоцитов. На фоне изменения уровня синтетических процессов, достоверно повышался уровень содержания мочевины на фоне уменьшения концентрации креатинина и мочевой кислоты При этом концентрация мочевой кислоты в группе с ТТКТ была выше, чем в контрольных группах, что говорит о менее интенсивной фазе анаболизма нуклеопротеинов. Анаболическая фаза, характеризующаяся ги-перпротеинемией на фоне снижения альбумина, возрастания глобулинов и уменьшения коэффициента А1Ь/С1 в опытной группе наступала на 8-9 сутки, в отличие от контрольных (10-12 сутки).

Таким образом, ММСК КМ влияют на активации репаративного ос-теогенеза у овец, а также на состояние белкового обмена.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ эффективности выделения ММСК КМ показал, что режим центрифугирования, составляющий 3000 об./мин является оптимальным для получения популяции ММСК

2 ММСК КМ обладали способностью к клонообразованию. Время удвоения составило 56-60 час. Клетки характеризовались низким мито-тическим индексом (равен 31%о)

3. Культивирование на подложках на основе коллагена, фибронекти-на, желатина способствует поддержанию культуры в недифференцированном состоянии, добавление в среду для культивирования фактора роста фибробластов или его комбинации с фактором роста эндотелия также способствует сохранению культуры в некоммитированном со-

СТОЯНИИ.

4. Кариологический анализ клеточных линий на раннем и позднем пассажах показал нормальный, диплоидный кариотип культуры.

5. Показана экспрессия специфичных поверхностных антигенов ММСК КМ и отсутствие маркеров гемопоэтических и эндотелиальных клеток

6 При культивировании в адипогенной, остеогенной или хондроген-ной средах была показана дифференцировка в данных направления с эффективностью 30%, 90% и 70% соответственно.

7. Получены ЗО-структуры, подобные костной ткани, на основе ММСК КМ и кальций-фосфатного матрикса, разработан метод эффективного и равномерного насыщения матриксов клетками, а также определена их оптимальная концентрация на 1см3 матрикса, которая составляет 30 млн. клеток

8. Исследования в условиях in vivo на иммунодефицитных мышах и овцах показали, что полученные ТТКТ не оказывают токсического влияние на организм животных и не туморогенны

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1 Разработаны и утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (per. удостоверение №ФС-2006/266-у) методические рекомендации «Получение мезенхи-мальных стволовых клеток из костного мозга взрослого человека», в которых изложен метод получения ММСК КМ, приведены показания, противопоказания и материально-техническое обеспечение технологии, позволяющие рационализировать метод получения данных клеток.

2 Данный способ выделения используется для получения и наращивания клеточной массы для последующей криоконсервации и длительного хранения в клинике «Бьюти Плаза» (по лицензии Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на

применение новых клеточных технологий в здравоохранении №77-01000343 от 11 08,2005 г.).

3. Метод получения ТТКТ на основе ММСК КМ человека и животных используется в ГУ РОНЦ им Н.Н.Блохина РАМН для контроля полученных биоимплантов (договор №12/2005 от 16.09 2005 г.) и в ФГОУ ВПО МГАВМиБ для замещения костных дефектов у животных

4. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ для студентов факультета медицинской ветеринарии

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1 Рекомендовать метод выделения ММСК КМ для выделения и наращивания необходимого количества клеток для банкирования медицинским и ветеринарным учреждениям с целью сохранения клеточного материала для дальнейшего использования

2. Рекомендовать отработанные технологические параметры по получению ТТКТ на основе ММСК КМ для дальнейших экспериментов с целью разработки метода замещения поврежденной костной ткани для ускорения процесса регенерации у человека и животных.

3. Рекомендовать использовать в учебном процессе на базе высших учебных заведений, при изучении дисциплин «Иммунология», «Биотехнология», «Хирургия».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Teplyashin A S. Characterization of human MSC-like cells isolated from bone marrow, adipose tissue, skin and placenta /A.S. Teplyashin, N.I Tchupikova, S.Z. Sharifulhna et al. //Herbsttagung der Gesellschaft fur Biochemie und Molekularbiologie. - Munster GBM. - 2004. - P 24.

2. Чупикова Н.И Выделение мезенхимальных стволовых клеток из

костного мозга человека и их характеристика /Н И. Чупикова, М С Ростовская, С.З. Шарифуллина, А С. Тепляшин. //Цитология - 2004 - Т. 46 - № 10,-С 947.

3 Тепляшин А.С Возможности применения мезенхимальных стволовых клеток при лазерной дермабразии /А.С. Тепляшин, С.А Петрин, В С. Еременко, С 3. Шарифуллина, Н И Чупикова и др //Лазерная медицина - 2004. - Т 8 - № 3 - С. 48.

4. Тепляшин А С. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани /А С. Тепляшин, С В. Коржикова, С.З. Шарифуллина, Н.И. Чупикова и др. //Цитология. - 2005 - Т. 47. - № 2 - С. 130-135.

5. Тепляшин А С Создание трехмерных трансплантантов хрящевой ткани человека /А.С. Тепляшин, С.В Коржикова, С.З Шарифуллина, Н.И. Чупикова и др. //Биотехнология, состояние и перспективы развития: сб. науч. трудов. - М: Экспо-биохим-технологии. - 2005 - Ч 1 - С. 104

6. Teplyashm A.S. Formation of human three-dimensional transplants of bone tissue /A.S Teplyashin, N.I. Chupikova, S.V. Korjikova et al //4th Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society - Munich- Etes. -2005 -P.XC.

7 Teplyashin A.S Influence of seeding concentration of cells on efficiency of occupation of Ca-P 3D scaffolds with bone marrow stromal stem cells and differentiation in bone-like tissue /А S. Teplyashm, NI Chupikova, S.V. Korjikova et al. //Eur cell mater - 2005. - V. 10 (S. 5). - P STE13

8. Teplyashin A.S In vitro cartilage formation by bone marrow-derived mesenchymal stem cells in OPLA scaffolds /A.S Teplyashin, S.V Korjikova, NI Chupikova et al. //Tissue Engineering. - 2006. - V 12. - N4. - P. 1090

9. Тепляшин А С. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки человека - перспективный материал для моделирования остео- и хон-дрогенеза m vitro /А.С Тепляшин, Н.И Чупикова, С.З. Шарифуллина и

др. //Биотехнология и медицина, сб. науч трудов - М. Экспо-биохим-технологии - 2006. - Ч. 1. - С 294.

10 Тепляшин АС. Перспективы использования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и жировой ткани в регуляции регенерации опорных тканей /А.С. Тепляшин, С.З Шарифул-лина, Н И. Чупикова, Р.И Сепиашвили //Аллергология и иммунология -2006.-Т. 7 - № 2 - С. 189-198.

11. Чупикова Н И. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальные клеток костного мозга в клетки костной ткани при культивировании их в трехмерном кальций-фосфатном матриксе /Н.И. Чупикова //Аллергология и иммунология - 2006 - Т.7. - № 3 - С. 248.

12 Тимофеев С.В. О возможностях применения стволовых клеток в ветеринарии (4.1) /С,В. Тимофеев, Р.Р. Мамашева, А.В Кузнецов, СЮ. Концевая, Н.И. Чупикова и др. //Ветеринарная клиника - 2006. - № 9

(52).-С. 21-23.

13 Тимофеев С.В. О возможностях применения стволовых клеток в ветеринарии (ч 2) /С В Тимофеев, P.P. Мамашева, А.В Кузнецов, С.Ю Концевая, Н.И. Чупикова и др //Ветеринарная клиника - 2006 - № 10

(53).-С 5-8.

14 Teplyashin A.S A comparison of bone marrow-derived and adipose tissue-derived multipotent mesenchymal stromal cells as perspective material for engineering osteo- and chondrogenesis in vitro /A.S. Teplyashm, N I. Chupikova, SZ. Sharifullina et al. //Tissue Engineering and regenerative Medicine. - 2006 - № 95. - P. 80.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25 09.2000 г. Подписано в печать 25.05 07 Тираж 100 экз. Уел п.л. 1 Печать авторефератов (495) 730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чупикова, Наталия Игоревна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Открытие стволовых клеток взрослого организма.

1.2. Строение костного мозга человека.

1.3. Методы выделения ММСК костного мозга.

1.4. Особенности морфологии и роста ММСК in vitro.

1.5. Экспрессия поверхностных маркеров.

1.6. Направленная дифференцировка ММСК.

1.7. Пластичность ММСК костного мозга.

1.8. Иммунологические свойства ММСК.

1.9. Возможности клинического применения ММСК на примере трансплантации биоматриксов костной ткани.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе костных структур"

Актуальность темы. Быстрое развитие естественных наук, в частности клеточной биологии за последние годы явилось результатом разработки новых современных подходов для лечения различных приобретенных и врожденных заболеваний человека и животных.

Особую актуальность в настоящее время приобрели методы клеточной биологии, которые позволяют получать культуры стволовых клеток, обладающих уникальными свойствами. В настоящее время в ведущих научно-исследовательских институтах различных странах мира изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием физиологии и особенностей локализации стволовых клеток человека и животных. Изучение физиологических особенностей, функций и локализации в организме различных типов стволовых клеток помогает понять механизмы регенерации и поддержания организма. Знание механизмов возникновения различных заболеваний человека может быть использовано в различных областях медицины и ветеринарии [116].

Согласно общепринятому определению, стволовые клетки - это особая группа недифференцированных клеток организма, обладающих способностью к самовоспроизведению и к дифференцировке в специализированные ткани, кроме того, к основным свойствам стволовых клеток можно отнести значительный пролиферативный потенциал, позволяющий им многократно делиться и сохраняться как популяция в течение, как правило, всей жизни организма. В организме взрослого человека присутствуют несколько типов стволовых клеток, среди которых выделяют популяцию мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). В настоящее время активно изучается возможность использования этих клеток в лечение многих приобретенных и наследственных заболеваний [143, 147].

Выделение, длительное культивирование, возможность направленной дифференцировки стволовых клеток представляет собой одно из перспективных направлений в клеточной биологии, регенеративной медицине и ветеринарии, поскольку позволяет создать биологические конструкции для заместительной терапии поврежденных органов и тканей.

Достижения мировой и отечественной клеточной инженерии показали, что открывается возможность массового получения «живых» тканей и органов, что позволит на порядок увеличить темпы регенерации повреждений организма.

В связи с этим, альтернативным и перспективным подходом является использование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека в качестве источника получения тканей мезодермального происхождения.

В 60-х годах 20-го века удалось выделить клетки-предшественники костной ткани, обладающих способностью самоподдержания и дифференцировки в остеогенные, хондрогенные и адипогенные типы клеток. При этом исходным материалом служили клетки костного мозга мыши [9]. В настоящее время ведутся успешные попытки использования данного типа клеток для получения всех перечисленных типов тканей с использованием биодеградируемых носителей [24, 79].

Решение поставленных вопросов зависит от дальнейшего усовершенствования методов выделения, культивирования и дифференцировки in vitro.

Таким образом, изучение ММСК человека является актуальным для применения в ветеринарной и медицинской практике.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека, а также создание на их основе костных структур. Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Оптимизировать способ разделения клеток в градиенте плотности фиколла с фенотипом подобным ММСК костного мозга и охарактеризовать их.

2. Разработать условия для длительного культивирования ММСК костного мозга.

3. Изучить потенции ММСК костного мозга к дифференцировке in vitro.

4. Оптимизировать известный способ загрузки клеток в пористый кальций-фосфатный матрикс для создания ТТКТ человека in vitro и охарактеризовать их.

5. Провести доклиническое изучение полученных костных трансплантатов на экспериментальных мышах и овцах.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов выделения ММСК и предложен усовершенствованный метод. Для выделения популяции ММСК определен параметр центрифугирования Равный 3000 об/мин. Разработаны оптимальные условия для длительного культивирования ММСК костного мозга человека. Впервые в России проведен широкий анализ антигенов, характеризующих ММСК.

Впервые, с учетом морфологических особенностей клеток представлены данные об оптимальном соотношении количества клеток на объем матрикса с учетом пористости носителя. Впервые показана зависимость плотности заполнения матрикса на дифференцировку клеток. На основе гистологических и иммуногистохимических методов доказано, что в результате культивирования in vitro ММСК костного мозга в матриксе в дифференцировочной среде получены трехмерные структуры костной ткани. Показано, что при эктопическом введении полученных трансплантатов в организм мышей, они не являются токсичными и не проявляют свойств туморогенности.

Впервые в России проведены предклинические испытания по влиянию полученных костных трансплантатов на организм овцы при смоделированных костных травмах.

Практическая значимость. Разработанный способ выделения ММСК костного мозга используется для получения и наращивания клеточной массы для последующей криоконсервации и длительного хранения для клинических целей (клиника «Бьюти Плаза»).

Метод получения и наращивания ММСК животных используется на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и учебном процессе.

В ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН используются биотрансплантаты костной ткани для клинического изучения.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены на международном симпозиуме и европейской научно-практической конференции (Германия, 2004); международном симпозиуме по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2004); Российском симпозиуме «Лазерная медицина» (Москва,

2004); II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); на 4-ом ежегодном съезде Европейского общества по тканевой инженерии (Германия, 2005); международной конференции «Surface - Tissue Interaction» (Швейцария,

2005); Всемирной конференции по тканевой инженерии, 8-ом ежегодном съезде международного общества тканевой инженерии (Китай, 2006); 3-ем Московском международном конгрессе «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006); VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском Национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006); на XI съезде международного общества по тканевой инженерии, европейском международном симпозиуме (Нидерланды, 2006).

На защиту выносятся следующие положения и результаты: 1. Усовершенствованный метод выделения ММСК костного мозга и их характеристика.

2. Условия длительного культивирования ММСК костного мозга.

3. Зависимость дифференцировки ММСК костного мозга в трехмерных пористых структурах от концентрации клеток.

4. Доклиническое изучение полученных биоимплантов в организме иммунодефицитных животных и мелкого рогатого скота in vivo.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, 10 статей в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (163 источников, из которых 13 отечественных и 150 иностранных). Работа содержит 13 таблиц, 17 рисунков, 9 страниц приложений.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Чупикова, Наталия Игоревна

4. ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован способ разделения клеток в градиентах плотности фиколла. Нанесение разбавленного в 4 раза в ФБС костного мозга на фиколл и осаждение высокоскоростным центрифугированием (950 g, 30 мин. ) позволяет получить из костного мозга популяцию клеток с фенотипом ММСК, свободную от примеси клеток крови.

2. Показано, что ММСК костного мозга имеют фибробластоподобную морфологию, обладают высокой адгезивной и клонообразующей способностью. Клетки имеют диплоидный кариотип, который сохраняется на протяжении длительного культивирования (70 цитогенераций).

3. Установлено, что ММСК костного мозга положительно окрашивались AT к CD 44 - 99,7%, CD 54 - 69,0%, CD 71 - 86,4%, CD 73 -100,0%, CD 90 - 99,9%, CD105 - 100,0%, CD 166 - 99,9%, HLA ABC -100,0%. Они умеренно позитивны по аб интегрину (CD49d), но высоко позитивны по другим интегринам, таким как (31интегрин (CD29), а 1,2,4 интегринам (CD49a, CD49b). Клетки были отрицательны по маркерам, свойственным ранним гематопоэтическим стволовым клеткам - по сиаламуцину (CD 34), CD 133 и маркеру более поздних форм этих клеток -общему для лейкоцитов антигену (CD 45), маркеру эндотелиальным клеток CD31 - 0,1% , а также CD117 - 2,9%, HLA DR, DP, DQ. Культура клеток была отрицательной (2,2 %) при окраске AT к Stro-1, экспрессия которого характерна для стромальных клеток.

4. Использование коллагена (конц. 10мг/см ) в качестве матрикса и добавление в ростовую среду фактора роста фибробластов (конечная концентрация Юнг/мл) способствуют поддержанию недифференцированного фенотипа ММСК костного мозга при длительном культивировании (более 15 пассажей).

5. Установлено, что при культивировании в адипогенной среде в присутствии индукторов (инсулин, дексаметазон, IBMX), в остеогенной дексаметазон, Р-глицерофосфат, аскорбат-2-фосфат), хондрогенной (HSA, дексаметазон, аскорбат-2-фосфат, ITS, линолиевой кислоты, TGF-Pi) была показана дифференцировка в данных направления с эффективностью 30%, 90% и 70% соответственно. В реакции ОТ-ПЦР выявлена экспрессия основных маркеров остеогенеза - остеопонтина, остеокальцина, костного сиалопротеина II типа на 14 сутки культивирования в остеогенной среде; после культивирования в хондрогенной среде ранний маркер хондрогенеза -аггрекан, был выявлен на 2-й неделе индукции, коллаген II типа - на 3-ей неделе хондродифференцировки.

6. Выявлено влияние концентрации клеток на дифференцировку ММСК костного мозга в трехмерных носителях, представленных порообразными (размер пор 200-400 мкм) кальций-фосфатными матриксами. Загрузка клеток в концентрации 3x107 клеток на 1 см3 является оптимальной для равномерного заполнения пор матрикса и дифференцировки ММСК в направлении остеогенеза.

7. Анализ ТТКТ, имплантированных эктопически в организм 16 мышам показал, что полученные структуры не оказывают токсического влияния на организм животных и не туморогенны.

8. Предварительные данные, проведенные на поголовье из 9 овец при моделировании перелома плюсневой кости размером 3,5 и переносе полученных нами трансплантантов показали, что они влияют на активность остеогенеза и состояние белкового обмена. ТТКТ не оказывают токсического и туморогенного действия на организм овцы, а также не вызывают иммунного отторжения ТТКТ на основе ксеногенных ММСК костного мозга.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработаны и утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (per. удостоверение №ФС-2006/266-у) методические рекомендации «Получение мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга взрослого человека», в которых изложен метод получения ММСК КМ, приведены показания, противопоказания и материально-техническое обеспечение технологии, позволяющие рационализировать метод получения данных клеток.

2. Данный способ выделения используется для получения и наращивания клеточной массы для последующей криоконсервации и длительного хранения в клинике «Бьюти Плаза» (по лицензии Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на применение новых клеточных технологий в здравоохранении №77-01-000343 от 11.08.2005 г.).

3. Метод получения ТТКТ на основе ММСК КМ человека и животных используется в ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН для контроля полученных биоимплантов (договор №12/2005 от 16.09.2005 г.) и в ФГОУ ВПО МГАВМиБ для замещения костных дефектов у животных.

4. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ для студентов факультета медицинской ветеринарии.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать метод выделения ММСК КМ для выделения и наращивания необходимого количества клеток для банкирования медицинским и ветеринарным учреждениям с целью сохранения клеточного материала для дальнейшего использования.

2. Рекомендовать отработанные технологические параметры по получению ТТКТ на основе ММСК КМ для дальнейших экспериментов с целью разработки метода замещения поврежденной костной ткани для ускорения процесса регенерации у человека и животных.

3. Рекомендовать использовать в учебном процессе на базе высших учебных заведений, при изучении дисциплин «Иммунология», «Биотехнология», «Хирургия».

1.10. Заключение

В настоящее время выделены различные типы стволовых клеток взрослого организма - гемопоэтические (предшественники клеток крови), нейрональные (предшественники клеток нервной ткани), мезенхимные (клетки, способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимного происхождения, а также других зародышевых листков), эпидермальные и др. Стволовые клетки в организме занимают определенные ниши, в которых сохраняются в течение всей жизни. Особенностью стволовых клеток взрослого организма является способность реагировать на сигналы при различных повреждениях тканей или органов, активироваться и замещать поврежденные или погибшие клетки. Однако ресурсы стволовых клеток с возрастом сокращается. Так постепенно начинаются процессы старения, как отдельных органов, так и всего организма в целом. Организм становится подверженным к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, и, как следствие, повышается риск возникновения различного рода заболеваний.

В современной медицине и ветеринарии широко используются новые подходы в лечении различных заболеваний человека, в том числе нарушения нормального гемопоэза, повреждения покровных тканей, нарушения структуры и функций опорно-двигательного аппарата и др. Это новое направление, которое изучает вопросы восстановления/замены поврежденных тканей и органов.

Ввиду активного и подвижного образа жизни человека и животных, наиболее подверженным к повреждениям является опорно-двигательный аппарат, в частности костная ткань. Данные разработки позволяют усовершенствовать процесс восстановления тканей, тем самым резко сократить реабилитационный период после травм, а также компенсировать костные дефекты у человека и животных.

Достаточно полно изучены восстановительные процессы костной ткани после механического повреждения кости (различные типы переломов). Регенерационный остеогенез протекает в результате активации процессов, характерных для физиологической регенерации костной ткани. В образовании костного регенерата участвуют детерминированные остеогенные элементы, являющиеся потомками мультипотентных мезенхимных стромальных клеток. Существует несколько типов костных имплантов, например, остеоимпланты на основе гидроксиапатита и/или фосфата кальция в оптимальном соотношении. Пористая структура подобного остеоимпланта, облегчает врастание внутрь новосформированной кости. Однако отсутствие дополнительной индукции остеообразования ограничивает их использование для серьезных повреждений.

В настоящее время разработаны разнообразные подходы для лечения повреждений опорных тканей с применением ауто- и аллогенных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток. Трансплантация аллогенных ММСК сопряжена с низкой иммунной реакцией. Низкая антигенная активность ММСК связана с отсутствием экспрессии белков комплекса гистосовместимости и наличием целого ряда иммуносупрессорных белков. В частности, для усиления эффективности

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА керамических имплантов, в них внедряют ММСК, и затем направляют в остеодифференцировку в условиях in vitro.

Таким образом, разработка биоимплантов костной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в сочетании с подходящим бионосителем является перспективным направлением в современной медицине и ветеринарии. г

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2003 по 2007 год на кафедре иммунологии и кафедре хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ и лаборатории тканевой инженерии ООО «Институт стволовой клетки», ГУ РОНЦ им. Н.И. Блохина РАМН и ИБХ им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН.

2.1.1. Культуральная посуда

Для сбора костного мозга человека использовали одноразовые пробирки с напылением из LiHe, объемом 9 мл, изготовленных фирмой Sarshtatd, Германия. Выделение ММСК костного мозга, центрифугирование клеточных суспензий проводили в стерильных центрифужных пробирках объемом 15 и 50 мл фирмы Corning-Costar, США.

Культивирование ММСК костного мозга осуществляли в пластиковых вентилированных флаконах площадью 75см и 150см , 6-ти и 24-х луночных планшетах, чашках Петри 60мм и 100мм, Corning-Costar, США.

Криоконсервирование МСК из костного мозга человека производили в в пластиковых криопробирках объемом 2мл фирмы Corning-Costar, США.

Для различных манипуляций с клетками и приготовления растворов и сред использовали пастеровские пипетки объемом 5, 10, 25 и 50мл Costar-Corning, США.

Все расходные материалы одноразового использования.

2.1.2. Приборы и оборудование

Манипуляции с клетками производили в ламинарных боксах II класс защиты подающих вертикальный стерильный поток воздуха, производства фирмы HetoHolten, Дания. Бокс оборудовали сенсорной установкой подачи газа Integra Biosciences, США; автоматическими дозаторами жидкости

Eppendorf, Германия. Культивирование клеток проводили в инкубаторе Sanyo, Япония, обеспечивающим влажность воздуха, температурный режим (+37°С) и содержание СО2 (5%) в воздухе. Центрифугирование клеточных суспензий осуществляли в центрифуге Eppendorf, Германия. Все растворы, среды, реактивы хранили при оптимальной температуре в холодильнике Sanyo, Япония. Микроскопирование культур клеток производили под инвертированным микроскопом Olympus, Германия. Просмотр и микрофотографирование нативных и окрашенных препаратов осуществляли на инвертированном микроскопе с флуоресцентной насадкой и подогреваемым предметным столиком Leica, Германия, оборудованном цифровой фотокамерой Leica, Германия. Взвешивание реагентов производили на электронных весах Mettler Toledo, Германия. Все работы с вредными веществами проводились в вытяжном шкафу Labconco, США. Для получения дистиллированной, сверхчистой деионизированной и апирогенной воды применяли установку MilliPore, Германия. Растворы стерилизовали путем пропускания их через фильтры фирмы Corning-Costar, США, с диаметром пор 0,22 мкм с использованием перистальтического насоса Millipore, Германия.

Кратковременное хранение ММСК костного мозга осуществляли в низкотемпературном холодильнике New Brunswick, Англия. С целью длительного хранения использовали сосуд Дюара с жидким азотом New Brunswick, Англия.

Анализ поверхностных клеточных маркеров проводили на лазерном проточном цитофлуориметре Cytomics® FC500 (Beckman Coulter, США), оборудованном аргоновым лазером CYONICS (Uniphase, США) с длинной волны возбуждения 488 нм и мощностью луча 15 мВт. Распределение ДНК по фазам клеточного цикла и количество клеток находящихся в состоянии спонтанного апоптоза определяли по распределению клеток, окрашенных иодитом пропидия, в логарифмическом канале флуоресценции с использованием барьерных фильтров 488ВК, 488ВР и 625ВР. Для удаления из анализа агрегатов клеток в программу вводили логические ограничения.

Полученные гистограммы подвергали математической обработке с использованием программ СХР v. 2.1 (Beckman-Coulter, США) и MultiCycIe (Phoenix Flow Systems, США).

Гистологический анализ, полученных образцов костной ткани проводили с помощью установки для проводки и парафинизации гистологических образцов Leica, Германия, установки для депарафинизации и автоматической покраски гистологических срезов Leica, Германия, программируемого микротома Leica, Германия.

2.1.3. Специальные среды и растворы

ММСК костного мозга культивировали в жидкой среде DMEM-LG (среда Игла в модификации Дюльбекко), с низким содержанием глюкозы (1 г/л) (Gibco, США), дополненной 10 %-ми сыворотки плода коров (СПК; fetal bovine serum, FBS) (HyClone Perbio, Бельгия), однократным раствором незаменимых аминокислот (Gibco, США) и антибиотиками (Gibco, США). Конечная концентрация стрептомицина была 100 мкг/мл, а пенициллина 100 Ед./мл.

Фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без ионов Са2+ и Mg2+ (ФБС; Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS; Gibco, США) использовали для разбавления полученного костного мозга, для промывки клеточных культур перед трипсинизацией, а также для промывания культур клеток при окрашивании их антителами.

Перед посевом, после выделения, клетки помещали в буфер, лизирующий эритроциты (155 mM NH4C1,10mM КНСОз, 0,lmM Na2EDTA).

Для криоконсервации ММСК из костного мозга человека в качестве криопротектора использовали диметилсульфоксид (DMSO, Sigma, США). В состав криозащитной среды входили: 10% DMSO, 20% FBS, 70% DMEM-LG.

Для направленной дифференцировки in vitro использовались следующие добавки к основной питательной среде: дексаметазон (KRKA, Slovenia), аскорбат-2-фосфат, аскорбиновая кислота, р-глицерофосфат (Sigma, USA), TGF-pi (Transforming Growth Factor - betal) (BD Bioscience, Germany), ITS (lg/L инсулина, 0,67 mg/L селена, 0,55g/L трансферрина) (Gibco, USA), линолиевая кислота (Sigma, USA), HSA (Биомед, Россия), IGF-1 (Insulin-like Growth Factor -1) (BD Bioscience, Germany).

Окраска на специфические антитела проводилась с использованием коммерческого набора DAB-kit (Chemicon, США). 1% раствор параформальдегида (Sigma, USA) в 0.85% NaCl (Baxter, Germany).

Для получения трехмерных трансплантатов костной ткани в качестве матрикса использовали 3D Са-Р Scaffold (BD Bioscience, Germany) и Skelite (Millenium Biologix Inc., Канада) и ММСК костного мозга человека.

При анализе поверхностных маркеров ММСК использовали следующие антитела: mouse anti-human CD10, 13, 25, 29, 31, 34, 44, 45, 49а, 49b, 49d, 49f, 54, 71, 73, 90, 105, 106, 117, 120a, 124, 166, HLA-ABC, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR-II, goat anti-mouse FITC-conjugated (BD Bioscience, Germany), а также CD133, STRO-1 (Chemicon, USA), IB 10 (Sigma, Germany).

При анализе дифференцированных клеток использовали следующие антитела: остеопонтин, остеокальцин (R&D, США), коллаген I и X типов, аггрекан (Chemicon, США).

2.1.4. Методы исследований Выделение ММСК костного мозга человека.

Костный мозг 20 здоровых доноров был получен в клинике «Бьюти Плаза», методом пунктирования гребня подвздошной кости. ММСК КМ получали методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла в течение 30 мин., с последующими промывками в ФБС и лизированием в специальном буфере. Полученную популяцию клеток переносили в культуральный матрас из расчета 1 млн. клеток на 1 см2.

Длительное культивирование клеток проводили путем периодического пассирования. Снятие клеток с субстрата осуществлялось с помощью 0,05%-ного раствора трипсина-ЭДТА в течение 5-6 мин. (Gibco, США) по мере формирования полного монослоя.

Тест на жизнеспособность проводили после ферментативного снятия клеток с культурального флакона. Клетки суспендировали в физиологическом растворе, помещали в ч. Петри для окраски, добавляли эквивалентный объем 4% раствора трипанового синего, время экспозиции 5 минут. 10 мкл полученной клеточной суспензии после окраски переносили в камеру Горяева и производили оценку сразу после ферментативной обработки клеток. В пяти больших квадратах камеры подсчитывали количество окрашенных (погибших) клеток путем прямого микроскопического наблюдения. Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли по стандартной формуле: п (кол-во окраш. клеток в 5-ти кв.) витальность (%) =-х 100%

N (общее кол-во клеток в 5-ти кв.)

Морфологические особенности ММСК костного мозга в культуре

Характеристику ММСК проводили визуально, с помощью фазово-контрастной микроскопии на инвертированном микроскопе Leica DMIRB. В качестве основных критериев использовали размер и форму клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, гомогенность цитоплазмы и наличие ядрышек в ядре.

Митотический индекс (интенсивность митотического размножения клеток в культуре, МИ) для каждой популяции клеток рассчитывали в фазе логарифмического роста как соотношение числа митозов к общему количеству подсчитанных клеток (не менее 1000), умноженное на 1000 (в %о).

МИ=(количество митозов/общее количество клеток) ■ 100%о.

Время генерации (удвоения), интервал между следующими друг за другом делениями клеток проводили путем подсчета количества клеток в десяти выбранных и отмеченных квадратах (2x2 мм) культуральной чашки через 18, 24, 36, 48 и 60 часов. Время удвоения было рассчитано относительно первой точки подсчета (18 часов). л

Через 7 дней после посева клеток (500 клеток/см ) проводился анализ на клоногенность. Клетки фиксировали и окрашивали по Гимза. Образование колоний ММСК оценивали с помощью микроскопа.

Анализ ММСК костного мозга в динамике культивирования in vitro

Изучение клеточных популяций проводили путем анализа клеток в фазе логарифмического роста, окрашенных иодитом пропидия, по пяти клеточным культурам.

Клетки фиксировали 70%-м этанолом, промывали в ФБС и ресуспендировали в ФБС с добавлением 40 мкг/мл иодита пропидия (Calbiochem, США), инкубировали 1 час и анализировали методом проточной цитометрии.

Для кариологического анализа клеток раннего и позднего пассажей к клеткам на стадии логарифмического роста добавляли раствор колхицина (0.1 мг/мл) в стерильной дистиллированной воде и инкубировали 2ч. Затем клетки промывали DMEM-LG и снимали 0,05% раствора трипсина, промывали и растворяли в 0,56% раствора КС1 и инкубировали 15 минут. Затем клетки отмывали и фиксировали в метаноле : ледяной уксусной кислоте = 3:1, отмывали и снова фиксировали клетки течение 30 минут. 60-70мкл клеточной суспензии наносили по каплям на влажное холодное стекло, поджигали в пламени горелки, затем досушивали в верхней части пламени. Для окраски для G-бэндинга на стекло наносили 0.25% раствор трипсина, выдерживали 30 секунд, промывали дистиллированной водой и окрашивали по Гимза.

Кариологический анализ препаратов выполнен совместно с лабораторией общей цитогенетики МГНЦ РАМН.

Подбор условий для длительного культивирования ММСК костного мозга.

Начиная с 1 -го пассажа, анализировалось влияние подложек, ростовых факторов и их сочетаний, при добавлении в среду для культивирования на морфологию и длительность культивирования ММСК из костного мозга человека. Для этого проводился эксперимент по схеме представленной в таблице 2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чупикова, Наталия Игоревна, Москва

1. Баринов С.М. Биокерамика на основе фосфатов кальция / С.М. Баринов, B.C. Комлев. М.: Наука. - 2005. - С. 98-180.

2. Дерхо М.А. Особенности реакции красной крови при травмах трубчатых костей / М.А. Дерхо, С.Ю. Концевая // Ветеринарная клиника. -2004.-№ 1.-С. 18-20.

3. Дерхо М.А. Некоторые стороны фосфорно-кальциевого обмена у собак на разных стадиях остеогенеза / М.А. Дерхо, С.Ю. Концевая // Ветеринарная клиника. 2004. - № 4. - С. 18-20.

4. Кавалерский Г.М. Травматология и ортопедия / Г.М. Кавалерский, JI.JI. Силин, А.В. Гаркави и др. М.: Академия. - 2005. - 624 с.

5. Кузнецов C.JI. Гистология, цитология и эмбриология / C.JI. Кузнецов, Н.Н. Мушкамбаров // М.: МИА. 2003. - 544 с.

6. Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике / А.А. Покровский. М: Наука. - 1969. - 200 с.

7. Тепляшин А.С. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани /А.С. Тепляшин, С.В. Коржикова, С.З. Шарифуллина, Н.Н. Чупикова и др. //Цитология. 2005. -Т. 47.-№2.-С. 130-135.

8. Фриденштейн А.Я. Клетки-предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантатов косного мозга / А.Я. Фриденштейн, К.В. Петракова, А.И. Куралесова, Г.П. Фролова // Цитология. 1968. - № 5. с. 557-567.

9. Фриденштейн А .Я. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга радиохимер. Анализ методом гетеротопной трансплантации / А .Я. Фриденштейн, А.И. Куралесова // Онтогенез. 1971. - № 2(5). - С. 458-465.

10. Фриденштейн А.Я. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники / А.Я. Фриденштейн, К.С. Лалыкина // М.: Медицина. -1973.

11. Чайлахян Р.К. Клонообразование в монослойных культурах костного мозга / Р.К. Чайлахян, А.Я. Фриденштейн, А.В. Васильев // Бюлл. эксп. биол. мед.- 1970.-№2.-С. 94-96.

12. Чайлахян Р.К. Перенос костномозгового микроокружения клонами стромальных механоцитов / Р.К. Чайлахян, Ю.В. Герасимов, А.Я. Фриденштейн // Бюлл. эксп. биол. мед. 1978. - № 2. - С. 705-707.

13. Arinzeh T.L. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect / T.L. Arinzeh, S.J. Peter, M.P. Archambault et al. // J Bone Joint Surg Am. 2003. - № 85 (10). - P. 1927-1935.

14. Arinzeh T.L. A comparative study of biphasic calcium phosphate ceramics for human mesenchymal stem-cell-induced bone formation / T.L. Arinzeh, T. Tran, J. McAlary et al. // Biomaterials. 2005. - № 26 (17). - P. 3631-3638.

15. Aust L. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates / L. Aust, B. Delvin, S. Foster et al. // Cytotherapy. 2004. - № 6. - P. 714.

16. Awad H.A. Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon / H.A. Awad, D.L. Butler, G.P. Boivin et al. // Tissue Eng. 1999. - № 5. - P. 267277.

17. Badylak S.F. The extracellular matrix as ascaffold for tissue reconstruction / S.F. Badylak // Cell&Developmental Biology. 2002. - № 13. - P. 377-383.

18. Bartholomew A. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo / A. Bartholomew, C. Sturgeon, M. Siatskas et al. // Exp Hematol. 2002. - № 30. - P. 42-48.

19. Bianchi G. Ex vivo enrichment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2 / G. Bianchi, A. Banfi, M. Mastrogiacomo et al. // Exp cell res. 2003. - № 287. - P. 98-105.

20. Bianco P. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications / P. Bianco, M. Riminucci, S. Gronthos et al. // Stem Cells. 2001. -№ 19.-P. 180-192.

21. Bjornson C.R. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo / C.R. Bjornson, R.L. Rietze, B.A. Reynolds et al. // Science. 1999. - № 283. - P. 534-537.

22. Bruder S.P. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells / S.P. Bruder, A.A. Kurth, M. Shea et al. // J Orthop Res. 1998. - № 16 (2).-P. 155-162.

23. Cancedda R. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone / R. Cancedda, B. Dozin, P. Giannoni et al. // Matrix Biology. 2003. - № 22. - P. 8191.

24. Cancedda R. Cell therapy for bone deseasera rewiew of current status / R. Cancedda, G. Bianchi, R. Quarto // Stem cells. 2003. - № 21. - P. 610-619.

25. Castro-Malaspina H. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny / H. Castro-Malaspina, R.E. Gay, G. Resnick et al. // Blood. 1980. - № 56. - P. 289-301.

26. Castro-Malaspina H. Human bone marrow fibroblast colony-forming units (CFU-F) / H. Castro-Malaspina, W. Ebell, S. Wang // Prog Clin. Biol. Res. 1984. - № 154. - P. 209-236.

27. Chamberlain J.R. Gene targeting in stem cells from individuals with osteogenesis imperfecta / J.R. Chamberlain, U. Schwarze, P.R. Wang et al. // Science. 2004. - № 303. - P. 1198-1201.

28. Chaudhary L.R. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation / L.R. Chaudhary, A.M. Hofmeister, K.A. Hruska // Bone. 2004. - № 34. - P. 402-411.

29. Clarce D. Differentiation potential of adult stem cells / D. Clarce, J. Frisen // Current Opin. In Genet. And Develop. 2001. - № 11. - P. 575-580.

30. Collotta F. Rapid killing of actinomycin D-treated tumor cells by human mononuclear cells. Effectors belong to the monocyte-macrophage lineage / F. Colotta, G. Peri, A. Villa et al. //.J Immunol. 1984. - № 132(2). - P. 936-44.

31. Colter D.C. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow / D.C. Colter, R. Class, C.M. DiGirolamo et al. // PNAS. 2000. - № 97. - P. 3213-3218.

32. Colter D.C. Identification of subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells / D.C. Colter, I. Sekiya, D.J. Proctop // PNAS. 2001. - № 98. - P.7841-7845.

33. Conget P. A. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells / P.A. Conget, J.J. Minguell // J. Cell Physiol. -1999.-№ 181.-P. 67-73.

34. Cousin B. Reconstitution of lethally irradiated mice by cells isolated from adipose tissue / B. Cousin, M. Andre, E. Arnaud et al. // Biochemical and Biophysical Research Communications. -2003. № 301. - P. 1016-1022.

35. Danet G.H. Dissociation between stem cell phenotype and NOD/SCID repopulating activity in human peripheral blood CD34(+) cells after ex vivo expansion / G.H. Danet, H.W. Lee, J.L. Luongo et al. // Exp Hematol. 2001. - № 29(12).-P. 1465-1473.

36. Deans R.J. Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical uses / R.J. Deans, A.B. Moseley // Exp. Hematology. 2000. - № 28. - P. 875-884.

37. Dejbakhsh-Jones S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells / S. Dejbakhsh-Jones, Jerabek L., I.L. Weissman et al. // J Immunol. 1995. - № 155. - P. 3338-3344.

38. Dennis J. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of am adult mouse / J. Dennis, A. Merriam, A. Awadallah et al. // J bone miner res. 1999. - № 14. - P. 700-709.

39. De Ugarte D.A. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow / D.A. De Ugarte, Z.C. Alfonso, P.A. Zuk et al.// Imm. letters. 2003. - № 89. - P. 267-270.

40. De Ugarte D.A. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow / D.A. De Ugarte, K. Morizono, A. Elbarbary et al. // Cells Tissues Organs. 2003. - № 174. - P. 101-109.

41. Devine S. M. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates / S.M. Devine, C. Cobbs, M. Jennings et al. // Blood. 2003. - № 101 (8). - P. 2999-3001.

42. Di Nicola M. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli / M. Di Nicola C. Carlo-Stella, M. Magni et al.// Blood. 2002. - № 99. - P. 3838-3843.

43. Djouad F. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals / F. Djouad, P. Plence, C. Bony et al. // Blood. 2003. - № 102. - P. 3837-3844.

44. Ferrari G. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors / G. Ferrari, G. Cussella-De Angelis, M. Coletta et al. // Science. -1998.-№279.-P. 1528-1530.

45. Ferari S.L. A role for N-cadherin in the development of the differetiared osteoblastic phenotype / S.L. Ferari, K. Traianedes, M. Thorne // J bone miner res / 2000.-№ 15.-P. 198-208.

46. Fridenshtein A.J. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method / A.J. Fridenshtein, U.F. Deriglazova, N.N. Kulagina et al. // Exp. Hematol. 1974. - № 2.- P. 83-92.

47. Friedenstein A.J. Radiosensitivity and postirradiation changes of bone marrow clonogenic stromal mechanocytes / A.J. Friedenstein, N.V. Latzinik, Y.F. Gorskaya et al. // International Radiobiol. 1981. - № 3(5). - P. 537-546.

48. Fridenstein A.J. Marrow microenviroment transfer by geterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges / A.J. Fridenstein, N.W. Latzinik, A.G. Grosheva et al. // Exp. Hematol. 1982. - № 10. -P. 217-227.

49. Friedenstein A.J. Osteogenic stem cells in bone marrow / A.J. Friedenstein, J.N.M. Heersche, J.A. Kanis // Bone and mineral research. 1990. - № 24. - P. 32 -37.

50. Friedenstein A.J. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs / A.J. Friedenstein, U. Gorskaja, N.N. Kulagina // Exp. Hematol. 1976. - № 4. - P. 267-274.

51. Gao J. Tissue-engeneered fabrication of an osteochondral composite graft using rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells / J. Gao, J.E. Dennis, L.A. Solchaga // Tissue Eng. 2001. - № 7 (4). - P. 363-367.

52. Grinnemo K. Xenoreactivity and engraftment of human mesenchymal stem cells transplanted into infarcted rat myocardium / K. Grinnemo, A. Mansson, G. Dellgren et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. 2004. - № 127. - P. 1293-1300.

53. Gronthos S. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors / S. Gronthos, S.E. Graves, S. Ohta et al. // Blood. -1994.-№84.-P. 4164-4173.

54. Gronthos S. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells / S. Gronthos, D.M. Franklin, H.A. Leddy et al. // J. Cell Physiol. 2001. - № 189. - P. 54-63.

55. Gronthos S. Integrin-mediated Interactions Between Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells and the Extracellular Matrix / S. Gronthos, P.J. Simmons, S.E. Graves et al. // Bone. 2001. - № 28 (2). - P. 174-181.

56. Gronthos S. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow / S. Gronthos, A.C. Zannettino, S.J. Hay et al. // J. Cell Sci.- 2003. № 116. - P. 827-1835.

57. Grundel, R. E. Autogeneic bone marrow and porous biphasic calcium phosphate ceramic for segmental bone defects in the canine ulna / R. E. Grundel, M. W. Chapman, T. Yee et al. // Clin. Orthop. Rel. Res. 1991. - № 266. - P. 244258.

58. Gumbiner B.M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis / B.M. Gumbiner // Cell. 1996. - № 84. - P. 345-357.

59. Harada S. Control of osteoblast function and regulation of bone mass / S. Harada, G.A. Rodan //Nature. 2003. - № 423. - P. 349-355.

60. Haynesworth S.E. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies / S.E. Haynesworth, M.A. Baber, A.I. Caplan // Bone. 1992. - № 13. - P. 69-80.

61. Heynesworth S.E. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow / S.E. Heynesworth, J. Goshima, V. M. Goldberg et al. // Bone. 1995,-№ 13.-P. 81-95.

62. Horwitz E.M. Clarification of the nomenclature for MSC: the International Society for Cellular Therapy position statement / E.M. Horwitz, K. Le Blanc, M. Dominici et al. // Cytotherapy. 2005. - № 7 (5). - P. 393-395.

63. Hughes F.J. Effects of growth factors and cytokines on osteoblast differentiation / F.J. Hughes, W. Turner, G. Belibasakis et al. // Periodontology 2000. 2006. - № 41. - P. 48-72.

64. Hung S.-C. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow / S.-C. Hung, N.-J. Chen, S.-L. Hsieh et al. //Stem Cells.2002.-№20.-P. 249-258.

65. Ianus A. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion / A. Ianus, G.G. Holz, N.D. Theise et al. // J. Clin. Invest. 2003. - № 111 (6). - P. 843-850.

66. Ishikawa F. Transplanted human cord blood cells give rise to hepatocytes in engrafted mice / F. Ishikawa, C. J. Drake, S. Yang et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci.2003.-№996.-P. 174-185.

67. Jiang Y. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow / Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. // Nature. 2002. - № 418. -P. 41-49.

68. Jorgensen С. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy / C. Jorgensen, F. Djouad, F. Apparailly et al. // Gene Therapy. 2003. - № 10. - P. 928-931.

69. Kadiyala S. Culture expandedcanine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro / S. Kadiyala, R. Young, M. Thiede et al. // Cell transplant. 1997. - № 6. - P. 125-134.

70. Kahn A. Age-related bone loss: A hypothesis and initial assessment in mice / A. Kahn, R. Gibbons, S. Perkins // Clin. Orthop. Rel. Res. 1995. - № 313. - P. 69-75.

71. Kan I. Integral Therapeutic Potential of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells / I. Kan, E. Melamed, D. Offen // Current Drug Targets. 2005. - № 6. - P. 31-41.

72. Kassem M. Mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential clinical applications / M. Kassem // Cloning Stem Cells. 2004. - № 6(4). - P. 369-374.

73. Katz A.J. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells / A.J. Katz, A. Tholpady, S.S. Tholpady et al. // Stem Cells. 2005. - № 23. - P. 412-423.

74. Klees R.F. Laminin-5 induces osteogenic gene expression in human mesenchymal stem cells through an ERC-dependent pathway / Klees R.F., Salasznyk R.M., Kingsley K. et al. // Mol biol cell. 2005. - № 16. - P. 881-890.

75. Коп E. Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones / E. Kon, A. Muraglia, A. Corsi et al. // J Biomed Mater Res. 2000. - № 49(3).-P. 328-337.

76. Kopen G.C. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiateinto astrocytes after injection into neonatal mouse brains / G.C. Kopen, D.J. Prockop, D.G. Phinney // PNAS. 1999. - № 96. -P. 10711-10716.

77. Korbling M. Adult stem cells for tissue repair a new therapeutic concept / M. Korbling, Z. Estrov // N. Engl. J. Med. - 2003. - № 349 (6). - P. 570-582.

78. Krampera M. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide / M. Krampera, S. Glennie, J. Dyson et al. // Blood. 2003. - № 101. - P. 3722-3729.

79. Kuznetsov S.A. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo / S.A. Kuznetsov, P.H. Krebsbach, K.J. Satomura et al. / Bone Miner. Res. 1997. - № 12. - P. 1335-1347.

80. Lane J.M. Orthopedic application of BMP-2 in fracture healing / J.M. Lane, A. Yasko, E. Tomin // Bone Morphogenic Proteins. 1994. - № 5. - 8-11.

81. Lange C. High-potential of human mesenchymal stem cells / Lange C., Schroeder J., Lioznov M.V.et al. // Stem Cells And Development. 2005. - № 14. -P. 70-80.

82. Laurencin C.T. Tissue Engineering: Orthopedic Application / C.T. Laurencin, A.M.A. Ambrosio, M.D. Borden et al. // Annu. Rev. Biomed. Eng. -1999.-№ l.-P. 19-46.

83. Le Blanc K. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells / K. Le Blanc, C. Tammik, K. Rosendahl et al. // Exp Hematol. 2003. - № 31. - P. 890-896.

84. Le Blanc K. Mesenchymal stem cells inhibit the expression of CD25 (interleukin-2 receptor) and CD38 on phytohaemagglutinin-activated lymphocytes

85. К. Le Blanc, I. Rasmusson, C. Gotherstrom et al. // Scand J Immunol. 2004. -№60.-P. 307-315.

86. Le Blanc K. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells / K. Le Blanc, I. Rasmusson, B. Sundberg et al. // Lancet. 2004. - № 363. - P. 1439-1441.

87. LeBoy P.S. Dexamethasone induction of osteoblast mRNAs in rat marrow stromal cell cultures / P.S. LeBoy, J. Beresford, С.J. Devlin et al. // Cell Physiol. -1991.-№ 146.-P. 370-378.

88. Lendeckel S. Autologous stem cells (adipose) and fibrin glue used to treat widespread traumatic calvarial defects: case report / S. Lendeckel, A. Jodicke, P.J. Christophis et al. // Craniomaxillofac. Surg. 2004. - № 32. - P. 370-373.

89. Liechty K. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep / K. Liechty, T.C. MacKenzie, A.F. Shaaban et al. //Nat Med. 2000. - № 11. - P. 1282-1286.

90. Lucas P.A. Isolation of putative mesenchymal stem cells from embryonic and adult skeletal muscle / P.A. Lucas, A.F. Calcutt, D.J. Mulvaney et al. // In Vitro Cell Biol. 1992. - № 28. - P. 154-156.

91. Majumdar M.K. Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells / M.K. Majumdar, V. Banks, D.P. Peluso //J. Cell. Physiol. 2000. - № 185. - P. 98-106.

92. Mastrogiacomo M. Tissue engineering of bone: search for a better scaffold / M Mastrogiacomo, A. Muraglia, V. Komlev et al. // Orthod Craniofacial Res. 2005. - № 8. - P. 277-284.

93. Maximov A.A. Der Lymphozyt als gemeinsame Stammcelle der verchidenen Blutelemente in der embrionalen Entwicklung und im postfetalen Leben den Slugetiere. 1909.

94. Meisel R. Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation / R. Meisel, A. Zibert, M. Laryea et al. // Blood. 2004. -№ 103. - P. 4619-4621.

95. Muller-Sieburg C.E. The stromal cells' guide to the stem cells universe / C.E. Muller-Sieburg, E. Derugina // Stem cells. 1995. - № 13(5). - P. 477-486.

96. Minguell J. Mesenchymal stem cells / J. Minguell, A. Erices, P. Conget // Exp Biol Med. 2001. - № 226 (6). - P. 507-520.

97. Muraglia A. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model / A. Muraglia, R. Cancedda, R. Quarto //J Cell Sci. 2000. - № 113. - P. 1161-1166.

98. Niemeyer P. Allogenic transplantation of human mesenchymal stem cells for tissue engineering purposes: an in vitro study / P. Niemeyer, A. Seckinger, H.G. Simank et al. // Orthopade. 2004. - № 33 (12). - P. 1346-1353.

99. Newsome P. N. Human cord blood-derived cells can differentiate into hepatocytes in yhe mouse liver with no evidence of cell fusion / P.N. Newsome, I. Johannessen, S. Boyle et al. // Gastroenterology. 2003. - № 124 (7). - P. 18911900.

100. Ohgushi H. Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineering / H. Ohgushi, A.I. Caplan // J. Biomed. Mater.Res. 1999. - № 48. -P. 913-927.

101. Olsen B.R. Bone development / B.R. Olsen, A.M. Reginato, W. Wang // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000. - № 16. - P. 191-220.

102. Owen M. Marrow stromal stem cells / M. Owen // J Cell Sci. 1988. -№ 10.-P. 63-76.

103. Pereira R.F. Cultured adherent cells from bone marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice / R.F. Pereira, K.W. Halford, M.D. O'Hara et al. // PNAS. 1995. - № 92. - P. 48574861.

104. Pereira R. F. Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesisimperfecta / R.F. Pereira, M.D. O'Hara, A.V. Laptev et al. // PNAS. 1998. - № 95.-P. 1142-1147.

105. Petite H. Tissue-engineered bone regeneration / H. Petite, V. Viateau, W. Bensaid et al. // Nat. Biotechnol. 2000. - № 18. - P. 959-963.

106. Phinney D.G. Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells / D.G. Phinney, G. Kopen, W. Righter // J. Cell. Biochemistry. 1999. - № 75. - P. 424-436.

107. Pittenger M.F. Multilineage Potential of adult human mesenchymal stem cells / M.F. Pittenger, A.M. Mackay, S.C. Beck // Science. 1999. - № 284(2). - P. 143-147.

108. Presnell S.C. Stem cells in adult tissues / S.C. Presnell, B. Petersen, Heidaran M. // Cell and developmental biology. 2002. - № 13. - P. 369-376.

109. Prockop D. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues / D. Prockop // Science. 1997. - № 276. - P. 71-74.

110. Qi H. Identification of genes responsible for osteoblast differentiation from human mesodermal progenitor cells / H. Qi, D. Aguiar, S. Williams et al. // PNAS. 2003. - № 100. - P. 3305-3310.

111. Quarto R. Bone progenitor cell deficits and the age-associated decline in bone repair capacity / R. Quarto, D. Thomas, T. Liang // Calcif. Tissue Int. -1995.-№56.-P. 123-129.

112. Quirici N. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies / N. Quirici, D. Soligo, P. Bossolasco // Exp Hematol. -2002. № 30. - P. 783-791.

113. Rasmusson I. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cytotoxic T lymphocytes or natural killer cells / I. Rasmusson, O. Ringden, B. Sundberg et al. // Transplantation. -2003.-№76.-P. 1208-1213.

114. Reyes M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells / M. Reyes, T. Lund, T. Lenvik et al. // Blood. 2001. - № 98. - P.2615-2625.

115. Reyes M. Turning marrow into brain: generation of glial and neuronal cells from adult bone marrow mesenchymal stem cells / M. Reyes, C.M. Verfaillie // Blood. 1999. - № 94 (10). - P.377.

116. Reyes M. Characterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells / M. Reyes, C.M. Verfaillie // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2001. № 938. - P. 231-233.

117. Roelen B.A. Controlling mesenchymal stem cell differentiation by TGFbeta family members / B.A. Roelen, P. Dijke // J Orthop. Sci. 2003. - № 8. -P. 740-748.

118. Saito T. Xenotransplant cardiac chimera: immune tolerance of adult stem cells / T. Saito, J.Q. Kuang, B. Bittira et al. // Ann. Thorac Surg. 2002. - № 74. - P. 19-24.

119. Sandhu J. S. Human hematopoiesis in SCID mice implanted with human adult cancellous bone / J.S. Sandhu, B.R. Clark, E.L. Boynton et al. // Blood. 1996. - № 88. - P. 1973-1982.

120. Schridde H. Die Entwickelungsgeschichte des menschlichen Speisrwhnenepitheles und ihre Bedeutung fur die Metaplaselehre / H. Schridde // Weis.: Verlag von J.F Bergmann; 1907.

121. Schwartz R. E. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells / R.E. Schwartz, M. Reyes, L. Koodie et al. // JCI. 2002. - № 109 (10). - P. 1291-1302.

122. Sekiya I. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality /1. Sekiya, B.L. Larson, J.R. Smith et al. // Stem cells. 2002. - № 20. - P. 530-541.

123. Sharma B. Engineering Structurally Organized Cartilage and Bone Tissues / B. Sharma, J.H. Elisseeff // Annals of Biomedical Engineering. 2004. -№32(1).-P. 148-159.

124. Short B. Mesenchymal stem cells / B. Short, N. Brouard, T. Occhiodoro-Scott et al. // Arch Med Res. 2003. - № 34(6). - P. 565-571.

125. Simmons P.J. Identification of stromal cell precursor in human bone marrow by novel monoclonal antibody Stro-1 / P.J. Simmons, B. Torok-Storb // Blood. 1991. - № 78. - P. 55-62.

126. Simmons P.J. CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow / P.J. Simmons, B. Torok-Storb // Blood. 1991. - № 78. - P. 2848-2853.

127. Song L. Transdiiferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow / Song L., Tuan R. // FASEB J. 2004. - № 18. -P. 980-982.

128. Spees J. L. Differentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair of epitelium by human stem cells from bone marrow storma // J.L. Spees, S.D. Olson, J. Ylostalo et al. // PNAS. 2003. - № 100 (5). - P. 2397-2402.

129. Stain J.P.Cell-cell interactions in regulating osteogenesis and osteoblast function / J.P. Stain, R. Civitelli // Defects Research. 2005. - № 75. -P. 72-80.

130. Stevenson S. The effect of osteogenin (a bone morphogenic protein) on the formation of bone in orthotopic segmental defects in rats / S. Stevenson, N. Cunningham, J. Toth et al. / J. Bone Joint Surg. 1994. - № 76(11). - P. 16761687.

131. Suva D. Non-hematopoietic human bone marrow contains long-lasting, pluripotential mesenchymal stem cells / D. Suva, G. Garavaglia, J.J. Menetrey // Cell Physiol. 2004. - № 198. - P. 110-118.

132. Teplyashin A.S. Formation of human three-dimensional transplants of bone tissue / A.S. Teplyashin, N.I. Chupikova, S.V. Korjikova et al. // 4th Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society Munich: Etes. - 2005. - P. XC.

133. Terada N. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion / N. Terada, T. Hamazaki, M. Oka et al. // Nature. 2002. -№416.-P. 542-545.

134. Tocci A. Mesenchymal stem cell: use and perspectives / A. Tocci, L. Forte // Hematol. J. 2003. - № 4. - P. 92-96.

135. Toma J.G. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin / J.G. Toma, M. Akhavan, K.J. Fernandes et al. // Nat. Cell Biol. -2001.-№3.-P. 778-784.

136. Tse W. Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation / W. Tse, J.D. Pendleton, W.M. Beyer et al. // Transplantation. 2003. - № 75. - P. 389-397.

137. Tuan R.S. Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering / R.S. Tuan, G. Boland, R. Tuli // Arthritis Res. Ther. 2003. - № 5. -P. 32-45.

138. Verfaillie C.M. Stem cells: hype and reality / C.M. Verfaillie, M.F. Pera, P.M. Lansdorp // Hematology. 2002. - P. 369-391.

139. Vleminckx K. Cadherins and tissue formation: integrating adhesion and signaling / K. Vleminckx, R. Kemler // Bioessays. 1999. - № 21. - P. 211220.

140. Yang J-W. Evalution of human MSCs cell cycle, viability and differentiation in micromass / J-W. Yang, N. Isla, C. Huselstein et al. // Biorheology. 2006. - № 43. - P. 489-496.

141. Yoon Y.S. Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction / Y.S. Yoon, A. Wecker, LJ. Heyd et al. // Clin. Invest. 2005. - № 115. - P. 326-338.

142. Young H.E. Mesenchymal stem cells reside within the connective tissues of many organs / H.E. Young, M.L. Mancini, M.L. Wright et al. // Dev. Dyn. 1995. - № 202. - P. 137-144.

143. Young H.E. Human pluripotent and progenitor cells display cell surface claster differentiation markers CD 10, CD13, CD56 and MHC class I / H.E. Young, T.A. Steele., R.A. Bray et al. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1999. - № 221.-P. 63-71.

144. Wang X. Cell fusion is a principal source of bone-marrow-derived hepatocytes / X. Wang, H. Willenbring, Y. Akkari et al. // Nature. 2003. - № 422 (6934).-P. 897-901.

145. Werntz J.R.Qualitative and quantitative analysis of orthotopic bone regeneration by marrow / J.R. Werntz, J.M. Lane, A.H. Burstein et al. // J. Orthop. Res.-1996.-№ 14.-P. 85-93.

146. Wolff D. Histomorphometric analysis of the repair of a segmental diaphyseal defect with ceramic and titanium fibermetal implants: Effects of bone marrow / D. Wolff, V.M. Goldberg, S. Stevenson // J. Orthop. Res. 1994. - № 12. - P. 439-446.

147. Wozney J.M. Novel regulators of bone formation: Molecular clones and activities / J.M. Wozney, V. Rosen, A.J. Celeste // Science. 1988. - № 242. -P. 1528-1534.

148. Zeille G. Intracytoplasmic immunofluorescence in multiple myeloma / G. Zeille // Cytometry. 1980. - № 1(1). - P. 37-41.

149. Zhang Z.-X. Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro / Z.-X. Zhang, L.-X. Guan, K. Zhang et al. // Cell Biology International. 2007. - № 1. - P. 1-4.

150. Zohar B.R. Characterization of stromal progenitor cells enriched by flow cytometry / B.R. Zohar, J. Sodek, C.A.G. McCulloch // Blood. 1997. - № 90.-P. 3471-3481.

151. Zuk P.A. Human adipose tissue is source of multipotent stem cells / P.A. Zuk, M. Zhu, P. Ashjian et al. // Molecular Biology of the Cell. 2002. - № 13.-P. 4279-4295.

152. Zvaifler NJ. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals / N.J. Zvaifler, L. Marinova-Mutafchieva, G. Adams // Arthritis Res. -2000. № 2. - P. 477-488.

153. Zvi N.A. The manipulated mesenchymal stem cells in regenerated skeletal tissues / A.N. Zvi, D. Robinson, S. Horowitz et al. // Cell Transplant. -1998. -№7(1). -P. 63-70.