Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота"

На правах рукописи

005050993

ВИКТОРОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Выделение и характеристика мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота.

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на Соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 ПАР 2013

Щелково-2013

005050993

Работа выполнена в секторе стволовой клетки ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» Россельхозакадемии (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии).

Официальные оппоненты:

Кузнецова Светлана Владимировна - доктор биологических наук, профессор ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии (ВНИТИБП), ведущий научный сотрудник отдела молекулярной биологии и вирусологии Савенко Наталья Борисовна - кандидат биологических наук ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства» Россельхозакадемии (ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии), старший научный сотрудник отдела биологии воспроизводства и эндокринологии сельскохозяйственных животных

Ведущая организация: ГНУ «Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий» Россельхозакадемии (ГНУ ЦЭЭРБ Россельхозакадемии)

Защита состоится: 6 марта 2013 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии (ВНИТИБП) по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП) РАСХН.

Автореферат разослан 5 февраля 2013 г.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Савченкова Ирина Петровна

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Фролов Ю.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Перспективность получения и применения мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) - стволовых клеток взрослого организма, определяется их основными свойствами и признаками. Во-первых, достоверно установлено, что ММСК стабильно самообновляются в клонах без анеуплоидии, генетической нестабильности и малигнизации. При этом они способны пролиферировать в культуре длительное время, формируя стабильные диплоидные клеточные линии. Во -вторых, при индукции к дифференцировке они способны дифференцироваться в нескольких направлениях, в пределах тканевых производных одного зародышевого листка, образуя in vitro клетки других тканей (Савченкова И.П., 2009; Minguell J. J., 2001; Pittenger M. F., 2004; Yamanaka, S., 2012). ММСК обладают способностью заселять матрицу-носитель, дифференцироваться в заданном направлении и формировать трехмерные структуры, которые позволяют моделировать ту или иную ткань in vitro. Это делает их уникальным материалом для создания новых клеточных систем, в том числе для изучения вирусов.

Известно, что в ветеринарной и медицинской биотехнологии существует необходимость в разработке эффективных способов культивирования и накопления вирусов на чувствительных клеточных культурах, обеспечивающих их размножение in vitro. Перевиваемые культуры клеток, которые используются в этих целях, как правило, малигнизированны, и в результате длительного культивирования теряют свою не только тканевую, но и видовую специфичность. Диплоидные культуры клеток, полученные из тканей и органов млекопитающих, сохраняют свою видовую и тканевую специфичность, однако имеют ограниченный период пролиферации вследствие старения. Известно, что такие клетки не могут преодолеть более 50 цитогенераций. В связи с этим

использование для этих целей ММСК является актуальным. Легкость их выделения и доступность биологического материала (подкожный жир, костный мозг, кожа), делает их, на сегодняшний момент, наиболее перспективной клеточной системой (Савченкова И.П., 2009).

Имеются сообщения о выделении ММСК из костного мозга (КМ) крупного рогатого скота (КРС) (Donofrio G. et al., 2005; Bosnakovski et al., 2005;), свиней (Bosch P. et al., 2006, Ringeje J. At al., 2002., Moscoso I. et al., 2005, Comiteab P. et al., 2010), лошадей (Arnhold et. al., 2007, Fortier LA et. al., 1998) и овец (McCarty et al., 2009), a также из подкожно-жировой ткани свиньи (Ringe et al., 2002; Wang et al., 2008, Williams K.J. et al.,2008). Во всех перечисленных работах получены клетки, имеющие разные морфофункциональные характеристики и принципиальные отличия по экспрессии поверхностных антигенов (Аг) в зависимости от условий выделения и культивирования. Это свидетельствует о том, что свойства и признаки ММСК сельскохозяйственных животных изучены недостаточно.

В связи с перспективностью использования ММСК в биотехнологии целью наших исследований было выделение из тканей взрослых особей КРС клеток с фенотипом, подобным ММСК, и изучение их свойств и признаков in vitro.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• оптимизировать существующие и разработать новые методы выделения ММСК из КМ и жировой ткани (ЖТ) КРС;

• охарактеризовать ММСК КРС в культуре;

• провести анализ экспрессии поверхностных Аг - маркеров фенотипа ММСК на клетках, выделенных из КМ и ЖТ КРС;

• изучить потенции полученных ММСК КРС, выделенных из КМ (ММСК КМ КРС) и ЖТ (ММСК ЖТ КРС) к направленной дифференцировке в клетки костной и жировой тканей in vitro;

• оценить чувствительность культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам: инфекционного рйнотрахеита (ИРТ) КРС, диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС), герпеса КРС типа 4 (BHV-4), энцефаломиокардита мышей (ЕМС), парагриппа-3 (ПГ-3), ринопневмонии лошадей (РПЛ);

• депонировать культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН);

Научная новизна. Оптимизированы методы выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС. Впервые в России выделены культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, которые депонированы в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН). Научная новизна подтверждена получением приоритетов на 2 патента: «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крупного рогатого скота (medulla ossium Bos tauras), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии», Волкова И.М., Викторова Е.В., Савченкова И.П., Гулюкин М.И., в ФИПС № 2011149133/10 от 02.12.2011 г; «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани крупного рогатого скота (textus adiposus Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии», Викторова Е.В., Волкова И.М., Савченкова И.П., Гулюкин М.И., в ФИПС № 2011149132/10 от 02.12.2011 г. Впервые охарактеризованы морфологические свойства ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС. Проведен анализ Аг, экспрессия которых характерна для ММСК. Впервые изучены потенции ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, формировать клетки костной и жировой тканей in vitro. Дана оценка чувствительности клеточных культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам ИРТ, ВД-БС, BHV-4, ЕМС, ПГ-3, РПЛ.

Практическая значимость. Оптимизированы способы получения

биологического материала для выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС. Оптимизированы методы выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС, которые могут использоваться для получения и наращивания культур ММСК КРС и последующего их применения в клеточной биотехнологии. На основе экспериментальных данных разработаны Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков / И.П. Савченкова, JI.K. Эрнст, М.И. Гулюкин, Е.В. Викторова // М.: «Спутник +» -2010. - 23с. - ISBN 978-5-9973-0926-8.

В Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) депонированы культуры ММСК КМ КРС (№ 79) и ММСК ЖТ КРС (№ 80). Получены данные по чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, к вирусам: ИРТ, ВД-БС, BHV-4, ЕМС, ПГ-3, РПЛ.

Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно выполнял все этапы работы, в т.ч. анализ и обобщение полученных результатов исследований, написание статей, отчетов и докладов.

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие м.н.с. Волкова И.М., к.б.н. Кулешов К.В., в. н. сотрудник лаборатории вирусологии к.в.н. Шуляк А.Ф., за что автор им искренне благодарен.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены на: Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, (Москва, 1-2 июня 2011); Н-й Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 15-18 ноября 2011); ХП-ой Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 11 апреля 2012); Международной Интернет-конференции «Биотехнология взгляд в будущее», (Казань, 17-19 апреля 2012); Международной научно-практической конференции «Трансмиссивные

болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (Украина, Алушта, АР Крым, 21-25 мая 2012).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, 6 статей в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста, которые включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список литературы состоит из 177 библиографических источников, в т.ч. 146 на иностранных языках. Работа иллюстрируется 11-ю таблицами, 14-ю рисунками и содержит б страниц приложений.

Выносимые на защиту положения:

• методы выделения из КМ и ЖТ КРС клеток с фенотипом ММСК;

• свойства и признаки культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС;

• оценка чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к

вирусам ИРТ КРС, ВД-БС, герпеса КРС типа 4, ЕМС, ПГ-3, РПЛ;

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2008 по 2012 год в секторе стволовой клетки ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии.

В экспериментах использовали стандартные питательные среды и растворы отечественного и зарубежного производства. Культивирование клеток осуществляли в С02 инкубаторе фирмы АВТ-Тех (Китай).

Взятие пункций КМ и ЖТ КРС проводили на скотобойне, с соблюдением условий асептики и антисептики. От КРС Голштинской породы, в возрасте 1 месяца, 1, 2 и 3 лет, из благополучных по инфекционным болезням хозяйств. Послеубойные пункции осуществляли во

время обескровливания животного. Биоптаты ЖТ получали также прижизненно из подкожнй жировой клетчатки КРС в области основания хвоста, шеи и плеча.

Морфологическую оценку ММСК КРС проводили визуально с использованием фазово-контрастной микроскопии с помощью инвертированного микроскопа фирмы Carl Zeiss и программы Software Release 4.7.2 как в нативных препаратах, так и в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимза. Процент жизнеспособных клеток в суспензии определяли посредством окрашивания клеток 0,1% раствором трипанового синего, используя формулу, в которой соотношение количества окрашенных клеток к общему количеству подсчитанных клеток в %.

Эффективность клонообразования оценивали на 7-10-е сутки после посева клеток в концентрации 1х103 на культуральные флаконы объемом 25 см2. Эффективность рассчитывали как отношение общего числа посеянных клеток к числу образованных клонов.

Митотический индекс рассчитывали в фазе логарифмического роста, используя формулу: соотношение числа митозов к общему количеству подсчитанных клеток (не менее 1000) в %.

Для изучения способности популяции ММСК к направленной дифференцировке использовали клетки на 2-3 пассажах культивирования. Клетки высевали в концентрации ЗхЮ3 кл/см, в трех повторах, с использованием опытных и контрольных культуральных флаконов. После формирования 70-80 % монослоя в опытных флаконах меняли рабочую среду на индукционную, а в контрольных - на рабочую.

Анализ поверхностных клеточных маркеров проводили на лазерном проточном цитофлуориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). В эксперименте использовали мышиные антитела (AT) против Аг мыши фирмы (Sigma, Гемания) и (BD Bioscience Pharmingen, США). В качестве вторичных антител, использовали козьи AT против Ig мыши, меченные FITC фирмы (BD Pharmingen, США). Подготовку и окраску клеток проводили по

методике, описанной нами ранее (Савченкова И.П., и др. 2010).

Анализ мРНК гена коллагена 1-го типа в культурах ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, проводили методом ПЦР-РВ на приборе RotorGene 6000 (Corbett Research, Австрия). Для проведения реакции были подобраны следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Праймеры, используемые в ПЦР-РВ

№ п/п Гены Нуклеотидная последовательность праймеров длинна Мол. масса

1 GAPDH Forward: TCA-TTG-ACC-TTC-ACT-ACA-TGG-TCT-A 25 7567

2 GAPDH Reverse: AAG-ATG-GTG-ATG-GCC-TTT-CCA-TTG 24 7399

3 Collagen type I Forward: TGC-TGG-CCA-ACC-ATG-CCT-CT 20 6029

4 Collagen type I Reverse: CGA-CAT-CAT-TGG-ATC-CTT-GCA-G 22 6711

Таблица 2. Зонды, используемые в ПЦР-РВ

№ п/п Гены Нуклеотидная последовательность зондов длинна Мол. масса

1 GAPDH FAM-CCA-GTA-TGA-TTC-CAC-CCA-CGG-C(RTQl) 22 7716

2 Collagen type I FAM-GAC-AGC-CTT-TTT-CAG-GTT-GCC-AG(RTQ 1 ) 23 8106

В экспериментах по изучению чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС использовали штаммы вирусов, хранившиесяв лиофилизированном состоянии в музее отдела вирусологии ВИЭВ им Я.Р. Коваленко: референтные штаммы «К-40» вируса ИРТ КРС, «Орегон» вируса ВД-БС, «Мовар» вируса BHV-4, вирус ЕМС, вакцинные штаммы «ВК-1» ВД-БС, «ПТК 45/86» вируса ПГ-3, «СВ/69» вируса РПЛ и штамм вируса ИРТ, выделенный из вакцины Bovilis IBR-marker (Интервет). Все штаммы обладали типичной для своего вида морфологией и антигенной структурой. До лиофилизации вирусы культивировали только в первичных культурах клеток или субкультурах.

Подготовка клеток для депонирования в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) проводилось согласно требованиям, представляемым к этой процедуре.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Выделение ММСК из КМ КРС и их культивирование

Для выделения из КМ КРС клеток с характеристиками ММСК использовали метод разделения клеток в градиенте плотности фиколла, который был нами модифицирован. К полученному пунктату КМ была добавлена среда, состоящая из ФСБ-2 с 5% сыворотки плода коров (СКПК). Затем разбавленный КМ наслаивали на градиент фиколла (р = 0,077 г/мл) в соотношении 1:4. Далее пробирки с наслоенным фиколлом центрифугировали при комнатной температуре. Во избежание перемешивания при центрифугировании, использовали медленное торможение ротора. Вследствие высокоскоростного центрифугирования клетки крови оседали на дно пробирки. На границе раздела фаз формировалась фракция моноядерных клеток в виде опалесцирующего слоя, который аккуратно собирали пипеткой. Раствор фиколла, позволил очистить полученные нами клетки от клеток крови. Эффективность разделения клеток в градиенте фиколла в зависимости от режима центрифугирования представлена в табл. 3. Основным критерием при оценке результатов являлась не только освобождение полученной популяции клеток от клеток крови, но и их жизнеспособность.

Как видно из результатов, представленных в табл. 3, режим, составляющий 1000 % в течение 30 минут является наиболее оптимальным. При этом в полученной мононуклеарной фракции содержится наименьшее количество клеток крови, мешающих росту культуры ММСК, а выделенная популяция ММСК КМ КРС обладает наибольшей жизнеспособностью.

Таблица 3. Зависимость количества полученных ММСК КМ КРС от режимов центрифугирования

Параметры осаждения в градиенте фиколла (время 30 мин) Общее кол-во клеток в мононукл. фракции, млн. кл. Из них жизнеспособных клеток (%).

400ё 8±1 87

600я 12±1 87

800ё 20±1 85

10008 27±1 80

1200ё 27±1 40

На следующий день после выделения клеток из КМ КРС и смены среды, на пластике визуализировались клетки, которые были прикреплены к пластику и располагались в виде колоний (рис. 1 В). По достижении монослоя на 10-е сутки (рис. 1 А), клетки субкультивировали в концентрации 1,1 х 106 в культуральный флакон объемом 25 см2 и рассевали в среде ДМЕМ-Ьв с низким содержанием глюкозы (1 г/л), дополненной 10%-ми СКПК, антибиотиками. Конечная концентрация в среде стрептомицина составляет 100 мкг/мл, пенициллина 100 МЕ/мл.

При получении ММСК КМ КРС была отмечена прямая корреляция между возрастом животного и количеством адипоцитов, содержащихся в КМ КРС. В связи с этим опытным путем было показано, что при выделении ММСК из КМ КРС в возрасте 1 года и более, в отличие от других видов животных, следует использовать методику, которую мы разработали для выделения ММСК ЖТ КРС.

Выделение ММСК ЖТ КРС и их культивирование

Выделение ММСК ЖТ КРС проводили в несколько этапов. Сначала ЖТ измельчали механически и подвергали ферментативной обработке 0,01%

раствором смеси коллагеназ 1 и 2-го типов, в соотношении 1:1. Далее использовали очистку фильтрацией. На первом этапе полученную популяцию клеток пропускали через фильтры с размером пор 80 мкм с целью получения стромально-васкулярной фракции (СВФ). Далее клетки СВФ пропускали через фильтры с размером пор 7 мкм для селекции клеток маленьких по размеру. В результате проведенных экспериментов была показана положительная корелляция числа выделенных клеток с фенотипом ММСК, с количеством кровеносных сосудов в отобранных биоптатах ЖТ КРС, что согласуется с данными полученными ранее (da Silva Meirelles et al., 2009). На следующий день после выделения клеток из ЖТ КРС и смены среды на пластике визуализировались клетки, которые были прикреплены к пластику и располагались в виде колоний (рис. 1 Г). По достижении монослоя на 14-е сутки (рис. 1 Б) клетки субкультивировали в концентрации 1,2 х 106 клеток на культуральный флакон 25 см2 и рассевали в среде ДМЕМ-LG с низким содержанием глюкозы (1 г/л), дополненной 10% СКПК, антибиотиками. Конечная концентрация в среде стрептомицина составила 100 мкг/мл, пенициллина 100 МЕ/мл.

Свойства и признаки культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС

в культуре

Культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС обладают фибробластоподобной морфологией, высокой адгезивностью, клоногенностью 93% и 88% соответственно (рис. 1), способностью многократно пролиферировать в культуре (более 80 цитогенераций).

Время цитогенераций для культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС составило 24 и 36 часов, а митотический индекс - 45 % и 34 % соответственно.

Полученные экспериментальные данные подтверждают, что выделенные нами популяции клеток обладают основными свойствами и признаками, характерными для ММСК в культуре in vitro.

ШИШЯЯШШк шашниш ВШШНнПНШ

... ШШШШ Ш ШвШИВг шШШ

Рисунок 1. Морфология и особенности роста в культуре ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС

А - популяция ММСК КМ КРС через 10 дней после выделения; Б - популяция ММСК ЖТ КРС через 14 дней после выделения; В - образование колонии ММСК КМ КРС in vitro,; Г - образование колонии ММСК ЖТ КРС in vitro; Увеличение Ок А; Б; В; Г - х200.

Анализ экспрессии поверхностных Аг-маркеров фенотипа ММСК на клетках, выделенных из КМ и ЖТ КРС

Следует заметить, что на сегодняшний день отсутствуют данные об уникальном маркере для идентификации ММСК, выделенных из тканей и органов взрослых особей КРС. Поэтому в наших экспериментах анализ основан не только на подтверждении экспрессии Аг-маркеров ММСК, но и на отсутствии экспрессии Аг-маркеров других типов клеток. На рис. 2 представлены результаты анализа поверхностных маркеров, выделенных нами клеточных популяций из КМ и ЖТ КРС. Как видно из полученных данных, клетки с фенотипом ММСК, выделенные из КМ и ЖТ КРС, окрашивались AT против Аг CD44 , CD90 и CD29, чья экспрессия характерна для клеток с фенотипом ММСК. Клетки были отрицательны по экспрессии генов, характерных для гематопоэтических (CD34) и эндотелиальных клеток (CD31). Таким образом, полученные культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС не имеют примеси гематопоэтических и эндотелиальных клеток.

CD44

CD90

CD29

CD34

CD31

_а_б

CD Доля М Доля М _клеток, %_клеток, %_

CD44 97,10 15,20 97,10 11,80

CD90 97,70 33,70 97,20 38,10

CD29 97,80 14,90 97,70 12,10

CD34 2,90 1,36 0,30 2,95

CD31 2,90 1,36 0,30 2,95

Рисунок 2. Фенотип ММСК, выделенных из КМ (а) и ЖТ (б) КРС

Серым цветом выделены гистограммы, соответствующие контрольному окрашиванию клеток IgG, меченными FITC; белым - гистограммы, соответствующие окрашиванию специфическими антителами. М (таблица) - среднестатистическое значение интенсивности флуоресценции (Mean).

В результате проведенной ПЦР-РВ в выделенных из КМ и ЖТ КРС клеточных популяциях был обнаружен продукт мРНК гена коллагена 1-го типа, что также подтверждает принадлежность полученных популяций к ММСК.

Индукция культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к дифференцировке в клетки костной и жировой тканей

Для изучения способности популяций ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к направленной дифференцировке мы использовали индукционные среды, указанные в табл. 4.

Оценку эффективности индукции клеточных культур проводили посредствам подсчета клеток, окрашенных специфическими красителями, к общему числу посеянных клеток. В результате было установлено, что культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС способны под действием индукторов формировать клетки как костной, так и жировой тканей.

После культивирования в адипогенной среде в культурах ММСК КМ КРС (на 14-е сут) и ММСК ЖТ КРС (на 10-е сут) было выявлено изменение морфологии и накопление липидных пузырьков.

Таблица 4. Индукция ММСК КРС к направленной дифференцировки

Направление индукционной среды Индукционные среды Эффективность индукции

ММСК КМ КРС ММСК ЖТКРС

Адипогенная БМЕМ-ЬО, 10% СПК, 1% антибиотик, 10'7М дексаметазона, 10'9М инсулина 60-70% 90-95%

Остеогенная БМЕМ-ЬО, 10% СПК, 1% антибиотик, 10"7 М дексаметазона, 0.2 мМ аскорбиновой кислоты 90-95% 65-70%

Рисунок 3. Дифференцировка культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС в остео - и адипогенном направлениях

А - ММСК КМ КРС - контроль (нативный препарат); Б -ММСК ЖТ КРС - контроль (нативный препарат); В - ММСК КМ КРС, окраска Oil Red О; Г - ММСК ЖТ КРС, окраска Oil Red О; Д - 21 день после внесения остеоиндукционной среды, окраска Alizarin Red ММСК КМ КРС; Е - 21 день после внесения остеоиндукционной среды, окраска Alizarin Red ММСК ЖТ КРС; Ж - 28 дней после внесения остеоиндукционной среды, окраска по von Kossa ММСК КМ КРС; 3 - 28 дней после внесения остеоиндукционной среды, окраска по von Kossa ММСК ЖТ КРС; Увеличение Ок А; Б; В; Д; Е; Ж; 3 - х200, Г - х400.

Характеристику ММСК после культивирования в адипогенной среде, осуществляли окраской на 28 день с помощью специфического красителя Oil Red О (рис. 3 В, Г), которая показывала наличие липидных структур.

После культивирования в остеогенной среде в культурах ММСК КМ КРС (на 10-е сут) и ММСК ЖТ КРС (на 18-21 сут) было выявлено изменение морфологии и накопление кальцифицированного матрикса. Для оценки остеодифференцировки через 21 день после культивирования в остеогенной среде клетки окрашивали Alizarin Red (рис. 3 Д, Е), который окрасил остеобласты, начинающие продуцировать неорганический матрикс, образующий костные пластинки на ранних этапах остеодифференцировки. Более поздняя стадия остеодифференцировки на 28 день выявлялась окраской по von Kossa (рис. 3 Ж, 3), которая выявляла наличие остеоцитов и кальцифицированного матрикса.

Наиболее высокая эффективность адипо-дифференцировки была в культуре ММСК ЖТ КРС, а остео-дифференцировки в культуре ММСК КМ КРС, что отображено на рис. 3 и в табл. 4.

Таким образом, дифференцировочный потенциал полученных клеток показывает их способность к образованию тканей мезодермального происхождения, что также относиться к основным свойствам ММСК. Оценка чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к

вирусам животных

Клеточные популяции ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС были проверены на чувствительность к ряду ДНК- и РНК- вирусов. Исследования показали, что культуры клеток ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС проявляли различную чувствительность к включенным в опыты вирусам.

Вирус ИРТ (референтный штамм «К-40») репродуцировался в культурах ММСК, проявляя признаки ЦПД через 48-72 ч, а полная дегенерация монослоя происходила через 4-5 сут после инфицирования. В контрольной клеточной культуре - почки теленка (МДВК), этот процесс занимал на 1-2 сут меньше.

Рисунок 4. Репродукция вируса ИРТ в культурах ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС (нативные препараты)

А - ММСК КМ КРС (контроль); Б - ММСК ЖТ КРС (контроль); В - 3-й сут заражения ММСК КМ КРС штаммом «К-40»; Г - 3-й сут заражения ММСК ЖТ КРС штаммом «К-40»; Д - 3-й сут заражения ММСК КМ КРС вакцинным штаммом ВоуШв ЮЯ-тагкег; Е -3-й сут заражения ММСК ЖТ КРС вакцинным штаммом ВоуШв ШЯ-тагкег; Увеличение Ок А; Б; В; Г; Д; Е - х200.

Рисунок 5. Репродукция вирусов в культурах ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС (нативные препараты)

А - 4-е сут заражения ММСК КМ КРС вирусом РПЛ - «СВ/69»; Б - 4-е сут заражения ММСК ЖТ КРС вирусом РПЛ - «СВ/69»; В - 3-й сут заражения ММСК КМ КРС вирусом ВД-БС; Г - 3-й сут заражения ММСК ЖТ КРС вирусом ВД-БС; Д - 3-й сут заражения ММСК КМ КРС вирусом EMC; Е - 3-й сут заражения ММС ЖТ КРС вирусом ЕМС; Увеличение Ок А; Б; В; Г; Д; Е - х200.

В культурах ММСК, инфицированных вирусом ИРТ (К-40), наблюдали характерное ЦПД: округление и увеличение отдельных клеток, формирование цитоагломератов, отслоение клеток от культуральной поверхности и образование пустот в монослое (рис. 4 В, Г). В отличие от культуры клеток МДВК, ЦПД в культуре ММСК КРС формировалось большое количество очень крупных, с нарушенным светопреломлением, клеток и меньше - цитоагломератов («гроздьев» клеток).

В первых пассажах модифицированный вакцинный штамм ИРТ заметно быстрее поражал клетки, по сравнению с патогенным (рис. 4 Д, Е), но к 4-му пассажу это различие исчезало. В процессе пассирования сроки проявления ЦПД сокращались и на 4-м пассаже были сравнимы с наблюдаемыми в инфицированной контрольной культуре МДВК. Инфекционный титр на уровне пятого пассажа в культурах ММСК КМ КРС для вакцинного вируса ИРТ составлял более 2x106'5 ТЩЫмл, для ММСК ЖТ КРС ТЦД50/МЛ 2х106 ТЦПго/мл, и 1x10® ТЦДзо/мл в МДВК. Результаты реакции нейтрализации (РН), также свидетельствуют о высокой чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС: выявленный уровень АТ к вирусу ИРТ был значительно выше, чем в контрольной культуре клеток - МДВК (табл. 6).

Вирус РПЛ репродуцировался в культуре ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС также с первого пассажа. Признаки ЦПД наблюдали через 24 ч после инфицирования, а через 3-4 сут - полную дегенерацию культуры. Динамика инфекционного процесса была схожа с динамикой, наблюдаемой в контрольной культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). ЦПД характеризовалось появлением по всему полю увеличенных округленных клеток, количество которых со временем нарастало, отдельных синцитиальных образований, отслоением клеток от культуральной поверхности (рис. 5 А, Б). С 3-го пассажа скорость развития ЦПД замедлялась и полного поражения культуры не наблюдали. Инфекционный титр на уровне пятого пассажа в ММСК КМ КРС для вируса РПЛ составлял

2x103 ТЦДзо/мл, для ММСК ЖТ КРС 2х104 ТЩЬ/мл, 1х10б ТЩЫмл СПЭВ.

Вирус герпеса КРС типа 4 размножался в культурах ММСК с проявлением типичного ЦПД: появление отдельных округленных клеток на 3-4 сут, количество которых со временем нарастало. При этом сохранялось значительное число внешне неизмененных клеток в течение всего периода наблюдения (20 сут). В процессе пассирования эта картина сохранялась, что согласуется с данными, полученными другими авторами (Donofrio G. et al., 2005).

Культивирование вируса ВД-БС, представленного в наших экспериментах двумя штаммами, сопровождалось развитием ЦПД (Рис. 5 В, Г). Характерными признаками являлось очаговое округление и пикноз клеток, нарастание количества и площади подобных очагов, отслоение клеток от культуральной поверхности. В отличие от контрольной субкультуры почки теленка (СПТ), ЦПД проявлялось раньше (через 48 и 72 ч, соответственно), но завершалось полным разрушением монослоя одновременно (через 5-6 сут после заражения). Штаммовых различий в культивировании не обнаружено.

Вирус ЕМС репродуцировался в ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, вызывая ЦПД в первых пассажах через 24 ч после инфицирования, а через 48 ч полностью разрушал монослой. Изменения клеток заключались в появлении большого числа округлых, неправильной формы отдельных клеток, пикноза, образования клеточного дебриса и отслоения клеток от поверхности культурального флакона (рис. 5 Д, Е). Характер ЦПД вируса ЕМС в ММСК был вполне сопоставим с наблюдаемой картиной в контрольной культуре фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ). С 3-го пассажа скорость развития ЦПД замедлялась и полного поражения культуры не наблюдали, а к 5-му пассажу прекращалась полностью. Процесс замедления репродукции вирусов на культурах ММСК КРС может быть связан с нарушением полноценности вирогенеза.

Репродукции вируса ПГ-3 в культуре ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ

КРС не было выявлено.

Таблица 5. Определение чувствительности ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам

Вирусы Культуры клеток

ММСК КМ КРС (ТЦДзо/мл) ММСКЖТ КРС (ТЦЦзо/мл) Контрольные культуры клеток

ИРТ (К-40) Более 2x10" 2x103 1х105,5вМДВК

ИРТ (маркерный вакцинный штамм) Более 2х106,5 2х105 1x10" в МДВК

РПЛ 2х103 2х104 1х106 в СПЭВ

Для более полной характеристики чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС изучали возможность их использования, определения уровня специфических вируснейтрализующих АТ. РН ставили на 96 луночных планшетах методом двукратных разведений сыворотки против 100 ТЦД5о/лунку вируса ИРТ. Учет РН проводили через 48 часов, после проявления ЦПД в контроле рабочей дозы вируса.

Таблица 6. Результаты реакции нейтрализации на модели вируса ИРТ

КРС

Название клеточной культуры 1 сыворотка 2 сыворотка 3 сыворотка

ММСК КМ КРС 1:64 1:32 1:32

ММСКЖТ КРС 1:16 1:16 1:32

МДВК 1:8 1:8 1:16

Из данных табл. 6 можно сделать вывод, что результаты РН на культурах ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, значительно выше, чем на контрольной культуре клеток МДВК, обычно использующейся в этих целях, что подтверждает высокую чувствительность полученных культур ММСК КРС к вирусу ИРТ.

Депонирование клеточных культур ММСК КМ КРС и ММСК

ЖТ КРС

Пополнение Коллекций культурами стволовых клеток млекопитающих является актуальной задачей, в связи с их уникальными свойствами.

В результате проведенной работы, нами были отработанны методы получения, культивирования и глубокого замораживания культур мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных как из костного мозга (ММСК КМ КРС), так и из жировой ткани крупного рогатого скота (ММСК ЖТ КРС). Также были проведены многочисленные исследования, по изучению свойств и признаков данных клеточных культур. Все полученные данные позволили нам депонировать полученные клеточные культуры в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под № 79. (ММСК КМ КРС) и под № 80 - (ММСК ЖТ КРС). Депонирование ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС в Коллекцию проводилось согласно правилам депонирования клеточных культур.

Материал исследований по изучению свойств и признаков ММСК КРС входят в состав буклета, подготовленного в качестве дополнительной информации к Каталогу Коллекции: Дополнительная информация к каталогу Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) / И.П. Савченкова, И.М. Волкова, Е.В. Викторова, М.В. Полякова; ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии. - М., 2012. - 5 с. ISBN 978-5-9903649-1-2.

ВЫВОДЫ

1. Предложен способ выделения из ЖТ КРС мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК), с использованием раствора коллагеназ 1-го и 2-го типа, в соотношении 1:1 (конечная концентрация коллагеназы 0,01%) и дальнейшей селекцией клеток по размеру с помощью фильтров 80 и 7 мкм.

2. Сравнительный анализ эффективности выделения ММСК из КМ КРС показал, что режим центрифугирования в градиенте фиколла, составляющий 1000 g в течение 30 мин, является оптимальным. Выделение ММСК из КМ КРС в возрасте 1 года и более, в связи с большой концентрацией адипоцитов в пунктате, следует проводить по методике предложенной для выделения ММСК КРС из ЖТ.

3. Из КМ и ЖТ КРС получены клетки с фенотипом ММСК, которые обладали фибробласто-подобной морфологией, высокими адгезивными и клонообразующими способностями. Эффективность клонообразования для ММСК, выделенных из КМ и ЖТ, составила 93% и 88%, митотический индекс - 45 % и 34 %, а время удвоения 24 и 36 ч, соответственно.

4. Клетки, выделенные как из КМ, так и из ЖТ КРС, были положительны по экспрессии CD44, CD90, CD29. Клетки были отрицательны по экспрессии генов, чья экспрессия характерна для гематопоэтических (CD34) и эндотелиальных (CD31) клеток. В культурах ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС обнаружена экспрессия мРНК гена коллагена 1-го типа.

5. При культивировании в адипогенной среде, морфологические изменения в культурах ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, наблюдали на 14-е и 10-е сут культивирования, соответственно. Дифференцировка в адипогенном направлении сопровождалась появлением кластеров клеток, в которых были выявлены липидные везикулы при окраске Oil Red О.

6. При культивировании в среде, индуцирующей дифференцировку в клетки костной ткани, морфологические изменения в культуре ММСК КМ КРС наблюдали на 10-е сут, в то время как в культуре ММСК ЖТ КРС эти

изменения были обнаружены только на 21-е сут культивирования. Визуальная оценка подтверждалась окраской экспериментальных образцов по von Kossa.

7. Установлено, что культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС с первого пассажа обеспечивали репродукцию вирусов: ИРТ, ВД-БС, РПЛ, BHV-4, ЕМС. Репродукции вируса ПГ-3 в культурах ММСК КРС не было выявлено.

8. В процессе пассирования в культурах ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС уровень репродукции вирусов ИРТ повышался (до 2х10б"5ТЦЦ5о/мл), ВД-БС и BHV-4 сохранялся на постоянном уровне, РПЛ снижался (до 2х103 ТЦ Дзо/мл). А репродукция вируса ЕМС полностью прекращалась.

9. Экспериментально установлено, что культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС высоко - чувствительны к вирусу ИРТ и могут быть использованы в научно исследовательских целях, получении препаративных количеств вируса, а также, при проведении диагностических исследований, в частности, при постановке РН, эффективность которой в 2-8 раз превышала традиционно используемые для этого клеточные системы.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. На основе экспериментальных данных разработаны методические наставления по выделению ММСК из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков in vitro для использования в научных и биотехнологических исследованиях. Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков / И.П. Савченкова, Л.К. Эрнст, М.И. Гулюкин, Е.В. Викторова// М.: «Спутник +» - 2010. - 23с. - ISBN 978-5-9973-0926-8.

2. В Специализированную Коллекцию перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) депонированы культуры ММСК КМ КРС (№ 79) и ММСК ЖТ КРС (№ 80), с целью дальнейшего применения их в вирусологии, клеточной и тканевой терапии животных.

Подана заявка № 2011149133/10 от 02.12.2011 г. на выдачу патента РФ «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крупного рогатого скота (medulla ossium Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии».

Подана заявка № 2011149132/10 от 02.12.2011 г. на выдачу патента РФ «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани крупного рогатого скота (textus adiposus Bos tauras), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии».

3. Культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС могут использоваться в качестве лабораторной модели в экспериментах с вирусами ИРТ, ВД-БС, РПЛ, в частности, для их репродукции, накопления, постановки PH.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 1. Рекомендовать оптимизированные способы отбора и транспортировки биологического материала для дальнейшего выделения из КМ и ЖТ КРС популяции ММСК.

2. Рекомендовать оптимизированные методы выделения ММСК из КМ и ЖТ для получения и наращивания необходимого количества клеток, для последующего депонирования ветеринарными учреждениями, с целью сохранения клеточного материала и дальнейшего их использования.

3. Рекомендовать клеточные культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС для дальнейших экспериментов по изучению вирусов животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Викторова Е.В. Костный мозг и подкожный жир крупного рогатого скота как источник мультипотентных мезенхимных стволовых клеток / Е.В. Викторова, И.М. Волкова, И.П. Савченкова, Гулюкин М.И. // Сборник трудов Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, г. Москва, 1-2 июня 2011 года.: тез. конф./ Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, 2012. - С. 10-12.

2. Волкова И.М Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота / И.М. Волкова, Е.В. Викторова, И.П. Савченкова, М.И. Гулюкин //Сельскохозяйственная биология. - 2012.- № 2. - С. 32-38.

3. Викторова Е.В. Изучение чувствительности мультипотентных мезенхимных стволовых клеток выделенных, из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота, к вирусам / Е.В. Викторова, А.Ф. Шуляк, И.П. Савченкова // Веткорм. - 2012. - № 3. - С. 16-17.

4. Викторова Е.В. Получение биологического материала для выделения мультипотентных мезенхимных стволовых клеток у сельскохозяйственных животных / Е.В. Викторова, И.П. Савченкова // Веткорм. - 2012. - № 4. - С. 28-29.

5. Викторова Е.В. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) крупного рогатого скота как перспективный материал для создания новых клеточных систем в биотехнологии / Е.В. Викторова, И.П. Савченкова // Сборник трудов II Международной Интернет-конференции «Актуальные

проблемы биохимии и бионанотехнологии», Казань, 15-18 ноября 2011 г.: тез. конф./ ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный Университет». - Казанский университет, 2012. - С. 58-61.

6. Викторова Е.В. Оценка чувствительности мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота к вирусам животных Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки крупного рогатого скота как новая клеточная система для вирусологии / Е.В. Викторова // Сборник трудов Международной Интернет-конференции «Биотехнология взгляд в будущее», Казань, 17-19 апреля 2012 г.: тез. конф./ ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный Университет». -Казанский университет, 2012. Том 1 - С. 56-58.

7. Викторова Е.В. Оценка чувствительности мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота к вирусам животных / Е.В. Викторова, А.Ф. Шуляк, И.П. Савченкова // ХП Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» И апреля 2012 г.: тез. конф. / Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, 2012. - С. 19-20.

8. Викторова Е.В. Чувствительность мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота, к вирусам in vitro / Е.В. Викторова, А.Ф. Шуляк, И.П. Савченкова // Международная научно-практическая конференция «Трансмиссивные болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контролю» 21-25 мая 2012 г: тез. конф. / Харьков - 2012. - С. 82-84.

9. Дополнительная информация к каталогу Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН)/ И.П. Савченкова, И.М. Волкова, Е.В. Викторова, М.В. Полякова; ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии. - М., 2012. - 5 с. ISBN 9785-9903649-1-2.

Отпечатано в ООО «Издательство Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 01.02.2013 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,75 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60