Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота"

На правах рукописи

ВИКТОРОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Выделение и характеристика мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота.

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на Соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково-2013

005051051

Работа выполнена в секторе стволовой клетки ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский инсппут экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» Россельхозакадемии (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Савченкова Ирина Петровна

Официальные оппоненты:

Кузнецова Светлана Владимировна - доктор биологических наук, профессор ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии (ВНИТИБП), ведущий научный сотрудник отдела молекулярной биологии и вирусологии Савенко Наталья Борисовна - кандидат биологических наук ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства» Россельхозакадемии (ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии), старший научный сотрудник отдела биологии воспроизводства и эндокринологии сельскохозяйственных животных

Ведущая организация: ГНУ «Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий» Россельхозакадемии (ГНУ ЦЭЭРБ Россельхозакадемии)

Защита состоится: 6 марта 2013 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии (ВНИТИБП) по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП) РАСХН.

Автореферат разослан 5 февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Фролов Ю.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Перспективность получения и применения мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) - стволовых клеток взрослого организма, определяется их основными свойствами и признаками. Во-первых, достоверно установлено, что ММСК стабильно самообновляются в клонах без анеуплоидии, генетической нестабильности и малигнизации. При этом они способны пролиферировать в культуре длительное время, формируя стабильные диплоидные клеточные линии. Во -вторых, при индукции к дифференцировке они способны дифференцироваться в нескольких направлениях, в пределах тканевых производных одного зародышевого листка, образуя in vitro клетки других тканей (Савченкова И.П., 2009; Minguell J. J., 2001; Pittenger M. F., 2004; Yamanaka, S., 2012). ММСК обладают способностью заселять матрицу-носитель, дифференцироваться в заданном направлении и формировать трехмерные структуры, которые позволяют моделировать ту или иную ткань in vitro. Это делает их уникальным материалом для создания новых клеточных систем, в том числе для изучения вирусов.

Известно, что в ветеринарной и медицинской биотехнологии существует необходимость в разработке эффективных способов культивирования и накопления вирусов на чувствительных клеточных культурах, обеспечивающих их размножение in vitro. Перевиваемые культуры клеток, которые используются в этих целях, как правило, малигнизированны, и в результате длительного культивирования теряют свою не только тканевую, но и видовую специфичность. Диплоидные культуры клеток, полученные из тканей и органов млекопитающих, сохраняют свою видовую и тканевую специфичность, однако имеют ограниченный период пролиферации вследствие старения. Известно, что такие клетки не могут преодолеть более 50 цитогенераций. В связи с этим

использование для этих целей ММСК является актуальным. Легкость их выделения и доступность биологического материала (подкожный жир, костный мозг, кожа), делает их, на сегодняшний момент, наиболее перспективной клеточной системой (Савченкова И.П., 2009).

Имеются сообщения о выделении ММСК из костного мозга (КМ) крупного рогатого скота (КРС) (Donofrio G. et al., 2005; Bosnakovski et al., 2005;), свиней (Bosch P. et al., 2006, Ringeje J. At al., 2002., Moscoso I. et al., 2005, Comiteab P. et al., 2010), лошадей (Arnhold et. al., 2007, Fortier LA et. al., 1998) и овец (McCarty et al., 2009), a также из подкожно-жировой ткани свиньи (Ringe et al., 2002; Wang et al., 2008, Williams K.J. et al.,2008). Во всех перечисленных работах получены клетки, имеющие разные морфофункциональные характеристики и принципиальные отличия по экспрессии поверхностных антигенов (Аг) в зависимости от условий выделения и культивирования. Это свидетельствует о том, что свойства и признаки ММСК сельскохозяйственных животных изучены недостаточно.

В связи с перспективностью использования ММСК в биотехнологии целью наших исследований было выделение из тканей взрослых особей КРС клеток с фенотипом, подобным ММСК, и изучение их свойств и признаков in vitro.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• оптимизировать существующие и разработать новые методы выделения ММСК из КМ и жировой ткани (ЖТ) КРС;

• охарактеризовать ММСК КРС в культуре;

• провести анализ экспрессии поверхностных Аг - маркеров фенотипа ММСК на клетках, выделенных из КМ и ЖТ КРС;

• изучить потенции полученных ММСК КРС, выделенных из КМ (ММСК КМ КРС) и ЖТ (ММСК ЖТ КРС) к направленной дифференцировке в клетки костной и жировой тканей in vitro;

• оценить чувствительность культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам: инфекционного ринотрахеита (ИРТ) КРС, диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС), герпеса КРС типа 4 (BHV-4), энцефаломиокардита мышей (ЕМС), парагриппа-3 (ПГ-3), ринопневмонии лошадей (РПЛ);

• депонировать культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН);

Научная новизна. Оптимизированы методы выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС. Впервые в России выделены культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, которые депонированы в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН). Научная новизна подтверждена получением приоритетов на 2 патента: «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крупного рогатого скота (medulla ossium Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии», Волкова И.М., Викторова Е.В., Савченкова И.П., Гулюкин М.И., в ФИПС № 2011149133/10 от 02.12.2011 г; «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани крупного рогатого скота (textus adiposus Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии», Викторова Е.В., Волкова И.М., Савченкова И.П., Гулюкин М.И., в ФИПС № 2011149132/10 от 02.12.2011 г. Впервые охарактеризованы морфологические свойства ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС. Проведен анализ Аг, экспрессия которых характерна для ММСК. Впервые изучены потенции ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, формировать клетки костной и жировой тканей in vitro. Дана оценка чувствительности клеточных культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам ИРТ, ВД-БС, BHV-4, ЕМС, ПГ-3, РПЛ.

Практическая значимость. Оптимизированы способы получения

биологического материала для выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС. Оптимизированы методы выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС, которые могут использоваться для получения и наращивания культур ММСК КРС и последующего их применения в клеточной биотехнологии. На основе экспериментальных данных разработаны Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков / И.П. Савченкова, JI.K. Эрнст, М.И. Гулюкин, Е.В. Викторова // М.: «Спутник +» -2010. - 23с. - ISBN 978-5-9973-0926-8.

В Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) депонированы культуры ММСК КМ КРС (№ 79) и ММСК ЖТ КРС (№ 80). Получены данные по чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, к вирусам: ИРТ, ВД-БС, BHV-4, ЕМС, ПГ-3, РПЛ.

Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно выполнял все этапы работы, в т.ч. анализ и обобщение полученных результатов исследований, написание статей, отчетов и докладов.

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие м.н.с. Волкова И.М., к.б.н. Кулешов К.В., в. н. сотрудник лаборатории вирусологии к.в.н. Шуляк А.Ф., за что автор им искренне благодарен.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены на: Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, (Москва, 1-2 июня 2011); П-й Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 15-18 ноября 2011); XII-ой Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 11 апреля 2012); Международной Интернет-конференции «Биотехнология взгляд в будущее», (Казань, 17-19 апреля 2012); Международной научно-практической конференции «Трансмиссивные

болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (Украина, Алушта, АР Крым, 21-25 мая 2012).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, б статей в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста, которые включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список литературы состоит из 177 библиографических источников, в т.ч. 146 на иностранных языках. Работа иллюстрируется 11-ю таблицами, 14-ю рисунками и содержит 6 страниц приложений.

Выносимые на защиту положения:

• методы выделения из КМ и ЖТ КРС клеток с фенотипом ММСК;

• свойства и признаки культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС;

• оценка чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к

вирусам ИРТ КРС, ВД-БС, герпеса КРС типа 4, ЕМС, ПГ-3, РПЛ;

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2008 по 2012 год в секторе стволовой клетки ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии.

В экспериментах использовали стандартные питательные среды и растворы отечественного и зарубежного производства. Культивирование клеток осуществляли в С02 инкубаторе фирмы АВТ-Тех (Китай).

Взятие пункций КМ и ЖТ КРС проводили на скотобойне, с соблюдением условий асептики и антисептики. От КРС Голштинской породы, в возрасте 1 месяца, 1, 2 и 3 лет, из благополучных по инфекционным болезням хозяйств. Послеубойные пункции осуществляли во

время обескровливания животного. Биоптаты ЖТ получали также прижизненно из подкожнй жировой клетчатки КРС в области основания хвоста, шеи и плеча.

Морфологическую оценку ММСК КРС проводили визуально с использованием фазово-контрастной микроскопии с помощью инвертированного микроскопа фирмы Carl Zeiss и программы Software Release 4.7.2 как в нативных препаратах, так и в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимза. Процент жизнеспособных клеток в суспензии определяли посредством окрашивания клеток 0,1% раствором трипанового синего, используя формулу, в которой соотношение количества окрашенных клеток к общему количеству подсчитанных клеток в %.

Эффективность клонообразования оценивали на 7-10-е сутки после посева клеток в концентрации 1х103 на культуральные флаконы объемом 25 см2. Эффективность рассчитывали как отношение общего числа посеянных клеток к числу образованных клонов.

Митотический индекс рассчитывали в фазе логарифмического роста, используя формулу: соотношение числа митозов к общему количеству подсчитанных клеток (не менее 1000) в %.

Для изучения способности популяции ММСК к направленной дифференцировке использовали клетки на 2-3 пассажах культивирования. Клетки высевали в концентрации ЗхЮ3 кл/см, в трех повторах, с использованием опытных и контрольных культуральных флаконов. После формирования 70-80 % монослоя в опытных флаконах меняли рабочую среду на индукционную, а в контрольных - на рабочую.

Анализ поверхностных клеточных маркеров проводили на лазерном проточном цитофлуориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). В эксперименте использовали мышиные антитела (AT) против Аг мыши фирмы (Sigma, Гемания) и (BD Bioscience Pharmingen, США). В качестве вторичных антител, использовали козьи AT против Ig мыши, меченные FITC фирмы (BD Pharmingen, США). Подготовку и окраску клеток проводили по

методике, описанной нами ранее (Савченкова И.П., и др. 2010).

Анализ мРНК гена коллагена 1-го типа в культурах ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, проводили методом ПЦР-РВ на приборе RotorGene 6000 (Corbett Research, Австрия). Для проведения реакции были подобраны следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Праймеры, используемые в ПЦР-РВ

№ п/п Гены Нуклеотидная последовательность праймеров длинна Мол. масса

1 GAPDH Forward: TCA-TTG-ACC-TTC-ACT-ACA-TGG-TCT-A 25 7567

2 GAPDH Reverse: AAG-ATG-GTG-ATG-GCC-TTT-CCA-TTG 24 7399

3 Collagen type I Forward: TGC-TGG-CCA-ACC-ATG-CCT-CT 20 6029

4 Collagen type I Reverse: CGA-CAT-CAT-TGG-ATC-CTT-GCA-G 22 6711

Таблица 2. Зонды, используемые в ПЦР-РВ

№ п/п Гены Нуклеотидная последовательность зондов длинна Мол. масса

1 GAPDH FAM-CCA-GTA-TGA-TTC-CAC-CCA-CGG-C(RTQl) 22 7716

2 Collagen type I FAM-GAC-AGC-CTT-TTT-CAG-GTT-GCC-AG(RTQ 1 ) 23 8106

В экспериментах по изучению чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС использовали штаммы вирусов, хранившиесяв лиофилизированном состоянии в музее отдела вирусологии ВИЭВ им Я.Р. Коваленко: референтные штаммы «К-40» вируса ИРТ КРС, «Орегон» вируса ВД-БС, «Мовар» вируса BHV-4, вирус ЕМС, вакцинные штаммы «ВК-1» ВД-БС, «ПТК 45/86» вируса ПГ-3, «СВ/69» вируса РПЛ и штамм вируса ИРТ, выделенный из вакцины Bovilis IBR-marker (Интервет). Все штаммы обладали типичной для своего вида морфологией и антигенной структурой. До лиофилизации вирусы культивировали только в первичных культурах клеток или субкультурах.

Подготовка клеток для депонирования в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) проводилось согласно требованиям, представляемым к этой процедуре.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Выделение ММСК из КМ КРС и их культивирование

Для выделения из КМ КРС клеток с характеристиками ММСК использовали метод разделения клеток в градиенте плотности фиколла, который был нами модифицирован. К полученному пунктату КМ была добавлена среда, состоящая из ФСБ-2 с 5% сыворотки плода коров (СКПК). Затем разбавленный КМ наслаивали на градиент фиколла (р = 0,077 г/мл) в соотношении 1:4. Далее пробирки с наслоенным фиколлом центрифугировали при комнатной температуре. Во избежание перемешивания при центрифугировании, использовали медленное торможение ротора. Вследствие высокоскоростного центрифугирования клетки крови оседали на дно пробирки. На границе раздела фаз формировалась фракция моноядерных клеток в виде опалесцирующего слоя, который аккуратно собирали пипеткой. Раствор фиколла, позволил очистить полученные нами клетки от клеток крови. Эффективность разделения клеток в градиенте фиколла в зависимости от режима центрифугирования представлена в табл. 3. Основным критерием при оценке результатов являлась не только освобождение полученной популяции клеток от клеток крови, но и их жизнеспособность.

Как видно из результатов, представленных в табл. 3, режим, составляющий 1000 g в течение 30 минут является наиболее оптимальным. При этом в полученной мононуклеарной фракции содержится наименьшее количество клеток крови, мешающих росту культуры ММСК, а выделенная популяция ММСК КМ КРС обладает наибольшей жизнеспособностью.

Таблица 3. Зависимость количества полученных ММСК КМ КРС от режимов центрифугирования

Параметры осаждения в градиенте фиколла (время 30 мин) Общее кол-во клеток в мононукл. фракции, млн. кл. Из них жизнеспособных клеток (%).

4008 8±1 87

600g 12±1 87

20±1 85

1000я 27±1 80

1200ё 27±1 40

На следующий день после выделения клеток из КМ КРС и смены среды, на пластике визуализировались клетки, которые были прикреплены к пластику и располагались в виде колоний (рис. 1 В). По достижении монослоя на 10-е сутки (рис. 1 А), клетки субкультивировали в концентрации 1,1 х 10б в культуральный флакон объемом 25 см2 и рассевали в среде ДМЕМ-Ьв с низким содержанием глюкозы (1 г/л), дополненной 10%-ми СКПК, антибиотиками. Конечная концентрация в среде стрептомицина составляет 100 мкг/мл, пенициллина 100 МЕ/мл.

При получении ММСК КМ КРС была отмечена прямая корреляция между возрастом животного и количеством адипоцитов, содержащихся в КМ КРС. В связи с этим опытным путем было показано, что при выделении ММСК из КМ КРС в возрасте 1 года и более, в отличие от других видов животных, следует использовать методику, которую мы разработали для выделения ММСК ЖТ КРС.

Выделение ММСК ЖТ КРС и их культивирование

Выделение ММСК ЖТ КРС проводили в несколько этапов. Сначала ЖТ измельчали механически и подвергали ферментативной обработке 0,01%

раствором смеси коллагеназ 1 и 2-го типов, в соотношении 1:1. Далее использовали очистку фильтрацией. На первом этапе полученную популяцию клеток пропускали через фильтры с размером пор 80 мкм с целью получения стромально-васкулярной фракции (СВФ). Далее клетки СВФ пропускали через фильтры с размером пор 7 мкм для селекции клеток маленьких по размеру. В результате проведенных экспериментов была показана положительная корелляция числа выделенных клеток с фенотипом ММСК, с количеством кровеносных сосудов в отобранных биоптатах ЖТ КРС, что согласуется с данными полученными ранее (da Silva Meirelles et al., 2009). На следующий день после выделения клеток из ЖТ КРС и смены среды на пластике визуализировались клетки, которые были прикреплены к пластику и располагались в виде колоний (рис. 1 Г). По достижении монослоя на 14-е сутки (рис. 1 Б) клетки субкультивировали в концентрации 1,2 х 106 клеток на культуральный флакон 25 см2 и рассевали в среде ДМЕМ-LG с низким содержанием глюкозы (1 г/л), дополненной 10% СКПК, антибиотиками. Конечная концентрация в среде стрептомицина составила 100 мкг/мл, пенициллина 100 МЕ/мл.

Свойства и признаки культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС

в культуре

Культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС обладают фибробластоподобной морфологией, высокой адгезивностью, клоногенностью 93% и 88% соответственно (рис. 1), способностью многократно пролиферировать в культуре (более 80 цитогенераций).

Время цитогенераций для культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС составило 24 и 36 часов, а митотический индекс - 45 % и 34 % соответственно.

Полученные экспериментальные данные подтверждают, что выделенные нами популяции клеток обладают основными свойствами и признаками, характерными для ММСК в культуре in vitro.

Рисунок 1. Морфология и особенности роста в культуре ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС

А - популяция ММСК КМ КРС через 10 дней после выделения; Б - популяция ММСК ЖТ КРС через 14 дней после выделения; В - образование колонии ММСК КМ КРС in vitro,-, Г - образование колонии ММСК ЖТ КРС in vitro; Увеличение Ок А; Б; В; Г - х200.

Анализ экспрессии поверхностных Аг-маркеров фенотипа ММСК на клетках, выделенных из КМ и ЖТ КРС

Следует заметить, что на сегодняшний день отсутствуют данные об уникальном маркере для идентификации ММСК, выделенных из тканей и органов взрослых особей КРС. Поэтому в наших экспериментах анализ основан не только на подтверждении экспрессии Аг-маркеров ММСК, но и на отсутствии экспрессии Аг-маркеров других типов клеток. На рис. 2 представлены результаты анализа поверхностных маркеров, выделенных нами клеточных популяций из КМ и ЖТ КРС. Как видно из полученных данных, клетки с фенотипом ММСК, выделенные из КМ и ЖТ КРС, окрашивались АТ против Аг С044 , СБ90 и СШ9, чья экспрессия характерна для клеток с фенотипом ММСК. Клетки были отрицательны по экспрессии генов, характерных для гематопоэтических (СБ34) и эндотелиальных клеток (СБ31). Таким образом, полученные культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС не имеют примеси гематопоэтических и эндотелиальных клеток.

CD44

CD90

CD29

CD34

CD31

а б

CD Доля М Доля М

клеток, % клеток, %

CD44 CD90 CD29 CD34 CD31

97,10 97,70 97,80 2,90 2,90

15,20 33,70 14,90 1,36 1,36

97,10 97,20 97,70 0,30 0,30

11,80 38,10 12,10 2,95 2,95

Рисунок 2. Фенотип ММСК, выделенных из КМ (а) и ЖТ (б) КРС

Серым цветом выделены гистограммы, соответствующие контрольному окрашиванию клеток IgG, меченными FITC; белым - гистограммы, соответствующие окрашиванию специфическими антителами. М (таблица) - среднестатистическое значение интенсивности флуоресценции (Mean).

В результате проведенной ПЦР-РВ в выделенных из КМ и ЖТ КРС клеточных популяциях был обнаружен продукт мРНК гена коллагена 1-го типа, что также подтверждает принадлежность полученных популяций к ММСК.

Индукция культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к дифференцировке в клетки костной и жировой тканей

Для изучения способности популяций ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к направленной дифференцировке мы использовали индукционные среды, указанные в табл. 4.

Оценку эффективности индукции клеточных культур проводили посредствам подсчета клеток, окрашенных специфическими красителями, к общему числу посеянных клеток. В результате было установлено, что культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС способны под действием индукторов формировать клетки как костной, так и жировой тканей.

После культивирования в адипогенной среде в культурах ММСК КМ КРС (на 14-е сут) и ММСК ЖТ КРС (на 10-е сут) было выявлено изменение морфологии и накопление липидных пузырьков.

Таблица 4. Индукция ММСК КРС к направленной дифференцировки

Направление индукционной среды Индукционные среды Эффективность индукции

ММСК КМ КРС ММСК ЖТКРС

Адипогенная БМЕМ-ЬО, 10% СПК, 1 % антибиотик, 10"7М дексаметазона, 10'9М инсулина 60-70% 90-95%

Остеогенная ОМЕМ-1Х}, 10% СПК, 1% антибиотик, 10"7 М дексаметазона, 0.2 мМ аскорбиновой кислоты 90-95 % 65-70%

Рисунок 3. Дифференцировка культур ММСК KM KPC и ММСК ЖТ КРС в остео - и адипогенном направлениях

А - ММСК КМ КРС - контроль (нативный препарат); Б -ММСК ЖТ КРС - контроль (нативный препарат); В - ММСК КМ КРС, окраска Oil Red О; Г - ММСК ЖТ КРС, окраска Oil Red О; Д - 21 день после внесения остеоиндукционной среды, окраска Alizarin Red ММСК КМ КРС; Е - 21 день после внесения остеоиндукционной среды, окраска Alizarin Red ММСК ЖТ КРС; Ж - 28 дней после внесения остеоиндукционной среды, окраска по von Kossa ММСК КМ КРС; 3 - 28 дней после внесения остеоиндукционной среды, окраска по von Kossa ММСК ЖТ КРС; Увеличение Ок А; Б; В; Д; Е; Ж; 3 - х200, Г - х400.

Характеристику ММСК после культивирования в адипогенной среде, осуществляли окраской на 28 день с помощью специфического красителя Oil Red О (рис. 3 В, Г), которая показывала наличие липидных структур.

После культивирования в остеогенной среде в культурах ММСК КМ КРС (на 10-е сут) и ММСК ЖТ КРС (на 18-21 сут) было выявлено изменение морфологии и накопление кальцифицированного матрикса. Для оценки остеодифференцировки через 21 день после культивирования в остеогенной среде клетки окрашивали Alizarin Red (рис. 3 Д, Е), который окрасил остеобласты, начинающие продуцировать неорганический матрикс, образующий костные пластинки на ранних этапах остеодифференцировки. Более поздняя стадия остеодифференцировки на 28 день выявлялась окраской по von Kossa (рис. 3 Ж, 3), которая выявляла наличие остеоцитов и кальцифицированного матрикса.

Наиболее высокая эффективность адипо-дифференцировки была в культуре ММСК ЖТ КРС, а остео-дифференцировки в культуре ММСК КМ КРС, что отображено на рис. 3 и в табл. 4.

Таким образом, дифференцировочный потенциал полученных клеток показывает их способность к образованию тканей мезодермального происхождения, что также относиться к основным свойствам ММСК. Оценка чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к

вирусам животных

Клеточные популяции ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС были проверены на чувствительность к ряду ДНК- и РНК- вирусов. Исследования показали, что культуры клеток ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС проявляли различную чувствительность к включенным в опыты вирусам.

Вирус ИРТ (референтный штамм «К-40») репродуцировался в культурах ММСК, проявляя признаки ЦПД через 48-72 ч, а полная дегенерация монослоя происходила через 4-5 сут после инфицирования. В контрольной клеточной культуре - почки теленка (МДВК), этот процесс занимал на 1-2 сут меньше.

В культурах ММСК, инфицированных вирусом ИРТ (К-40), наблюдали характерное ЦПД: округление и увеличение отдельных клеток, формирование цитоагломератов, отслоение клеток от культуральной поверхности и образование пустот в монослое (рис. 4 В, Г). В отличие от культуры клеток МДВК, ЦПД в культуре ММСК КРС формировалось большое количество очень крупных, с нарушенным светопреломлением, клеток и меньше - цитоагломератов («гроздьев» клеток).

В первых пассажах модифицированный вакцинный штамм ИРТ заметно быстрее поражал клетки, по сравнению с патогенным (рис. 4 Д, Е), но к 4-му пассажу это различие исчезало. В процессе пассирования сроки проявления ЦПД сокращались и на 4-м пассаже были сравнимы с наблюдаемыми в инфицированной контрольной культуре МДВК. Инфекционный титр на уровне пятого пассажа в культурах ММСК КМ КРС для вакцинного вируса ИРТ составлял более 2x106'5 ТЦДд/мл, для ММСК ЖТ КРС ТЩЫмл 2x106 ТЦДзо/мл, и 1х106 ТЦДо/мл в МДВК. Результаты реакции нейтрализации (РН), также свидетельствуют о высокой чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС: выявленный уровень АТ к вирусу ИРТ был значительно выше, чем в контрольной культуре клеток - МДВК (табл. 6).

Вирус РПЛ репродуцировался в культуре ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС также с первого пассажа. Признаки ЦПД наблюдали через 24 ч после инфицирования, а через 3-4 сут - полную дегенерацию культуры. Динамика инфекционного процесса была схожа с динамикой, наблюдаемой в контрольной культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). ЦПД характеризовалось появлением по всему полю увеличенных округленных клеток, количество которых со временем нарастало, отдельных синцитиальных образований, отслоением клеток от культуральной поверхности (рис. 5 А, Б). С 3-го пассажа скорость развития ЦПД замедлялась и полного поражения культуры не наблюдали. Инфекционный титр на уровне пятого пассажа в ММСК КМ КРС для вируса РПЛ составлял

2x103 ТЦДзо/мл, для ММСК ЖТ КРС 2х104 ТЦДзо/мл, 1х106 ТЩЫмл СПЭВ.

Вирус герпеса КРС типа 4 размножался в культурах ММСК с проявлением типичного ЦПД: появление отдельных округленных клеток на 3-4 сут, количество которых со временем нарастало. При этом сохранялось значительное число внешне неизмененных клеток в течение всего периода наблюдения (20 сут). В процессе пассирования эта картина сохранялась, что согласуется с данными, полученными другими авторами (Donofrio G. et al., 2005).

Культивирование вируса ВД-БС, представленного в наших экспериментах двумя штаммами, сопровождалось развитием ЦПД (Рис. 5 В, Г). Характерными признаками являлось очаговое округление и пикноз клеток, нарастание количества и площади подобных очагов, отслоение клеток от культуральной поверхности. В отличие от контрольной субкультуры почки теленка (СПТ), ЦПД проявлялось раньше (через 48 и 72 ч, соответственно), но завершалось полным разрушением монослоя одновременно (через 5-6 сут после заражения). Штаммовых различий в культивировании не обнаружено.

Вирус ЕМС репродуцировался в ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, вызывая ЦПД в первых пассажах через 24 ч после инфицирования, а через 48 ч полностью разрушал монослой. Изменения клеток заключались в появлении большого числа округлых, неправильной формы отдельных клеток, пикноза, образования клеточного дебриса и отслоения клеток от поверхности культурального флакона (рис. 5 Д, Е). Характер ЦПД вируса ЕМС в ММСК был вполне сопоставим с наблюдаемой картиной в контрольной культуре фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ). С 3-го пассажа скорость развития ЦПД замедлялась и полного поражения культуры не наблюдали, а к 5-му пассажу прекращалась полностью. Процесс замедления репродукции вирусов на культурах ММСК КРС может быть связан с нарушением полноценности вирогенеза.

Репродукции вируса ПГ-3 в культуре ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ

Депонирование клеточных культур ММСК КМ КРС и ММСК

ЖТ КРС

Пополнение Коллекций культурами стволовых клеток млекопитающих является актуальной задачей, в связи с их уникальными свойствами.

В результате проведенной работы, нами были отработанны методы получения, культивирования и глубокого замораживания культур мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных как из костного мозга (ММСК КМ КРС), так и из жировой ткани крупного рогатого скота (ММСК ЖТ КРС). Также были проведены многочисленные исследования, по изучению свойств и признаков данных клеточных культур. Все полученные данные позволили нам депонировать полученные клеточные культуры в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под № 79 - (ММСК КМ КРС) и под № 80 - (ММСК ЖТ КРС). Депонирование ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС в Коллекцию проводилось согласно правилам депонирования клеточных культур.

Материал исследований по изучению свойств и признаков ММСК КРС входят в состав буклета, подготовленного в качестве дополнительной информации к Каталогу Коллекции: Дополнительная информация к каталогу Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) / И.П. Савченкова, И.М. Волкова, Е.В. Викторова, М.В. Полякова; ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии. - М., 2012. - 5 с. ISBN 978-5-9903649-1-2.

ВЫВОДЫ

1. Предложен способ выделения из ЖТ КРС мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК), с использованием раствора коллагеназ 1-го и 2-го типа, в соотношении 1:1 (конечная концентрация коллагеназы 0,01%) и дальнейшей селекцией клеток по размеру с помощью фильтров 80 и 7 мкм.

2. Сравнительный анализ эффективности выделения ММСК из КМ КРС показал, что режим центрифугирования в градиенте фиколла, составляющий 1000 g в течение 30 мин, является оптимальным. Выделение ММСК из КМ КРС в возрасте 1 года и более, в связи с большой концентрацией адипоцитов в пунктате, следует проводить по методике предложенной для выделения ММСК КРС из ЖТ.

3. Из КМ и ЖТ КРС получены клетки с фенотипом ММСК, которые обладали фибробласто-подобной морфологией, высокими адгезивными и клонообразующими способностями. Эффективность клонообразования для ММСК, выделенных из КМ и ЖТ, составила 93% и 88%, митотический индекс - 45 % и 34 %, а время удвоения 24 и 36 ч, соответственно.

4. Клетки, выделенные как из КМ, так и из ЖТ КРС, были положительны по экспрессии CD44, CD90, CD29. Клетки были отрицательны по экспрессии генов, чья экспрессия характерна для гематопоэтических (CD34) и эндотелиальных (CD31) клеток. В культурах ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС обнаружена экспрессия мРНК гена коллагена 1-го типа.

5. При культивировании в адипогенной среде, морфологические изменения в культурах ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, наблюдали на 14-е и 10-е сут культивирования, соответственно. Дифференцировка в адипогенном направлении сопровождалась появлением кластеров клеток, в которых были выявлены липидные везикулы при окраске Oil Red О.

6. При культивировании в среде, индуцирующей дифференцировку в клетки костной ткани, морфологические изменения в культуре ММСК КМ КРС наблюдали на 10-е сут, в то время как в культуре ММСК ЖТ КРС эти

изменения были обнаружены только на 21-е сут культивирования. Визуальная оценка подтверждалась окраской экспериментальных образцов по von Kossa.

7. Установлено, что культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС с первого пассажа обеспечивали репродукцию вирусов: ИРТ, ВД-БС, РПЛ, BHV-4, ЕМС. Репродукции вируса ПГ-3 в культурах ММСК КРС не было выявлено.

8. В процессе пассирования в культурах ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС уровень репродукции вирусов ИРТ повышался (до 2х106 '5ТЦД5о/мл), ВД-БС и BHV-4 сохранялся на постоянном уровне, РПЛ снижался (до 2хЮ3 ТЦДзо/мл). А репродукция вируса ЕМС полностью прекращалась.

9. Экспериментально установлено, что культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС высоко - чувствительны к вирусу ИРТ и могут быть использованы в научно исследовательских целях, получении препаративных количеств вируса, а также, при проведении диагностических исследований, в частности, при постановке РН, эффективность которой в 2-8 раз превышала традиционно используемые для этого клеточные системы.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. На основе экспериментальных данных разработаны методические наставления по выделению ММСК из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков in vitro для использования в научных и биотехнологических исследованиях. Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков / И.П. Савченкова, Л.К. Эрнст, М.И. Гулюкин, Е.В. Викторова // М.: «Спутник +» - 2010. - 23с. - ISBN 978-5-9973-0926-8.

2. В Специализированную Коллекцию перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) депонированы культуры ММСК КМ КРС (№ 79) и ММСК ЖТ КРС (№ 80), с целью дальнейшего применения их в вирусологии, клеточной и тканевой терапии животных.

Подана заявка № 2011149133/10 от 02.12.2011 г. на выдачу патента РФ «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крупного рогатого скота (medulla ossium Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии».

Подана заявка № 2011149132/10 от 02.12.2011 г. на выдачу патента РФ «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани крупного рогатого скота (textus adiposus Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии».

3. Культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС могут использоваться в качестве лабораторной модели в экспериментах с вирусами ИРТ, ВД-БС, РПЛ, в частности, для их репродукции, накопления, постановки PH.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 1. Рекомендовать оптимизированные способы отбора и транспортировки биологического материала для дальнейшего выделения из КМ и ЖТ КРС популяции ММСК.

2. Рекомендовать оптимизированные методы выделения ММСК из КМ и ЖТ для получения и наращивания необходимого количества клеток, для последующего депонирования ветеринарными учреждениями, с целью сохранения клеточного материала и дальнейшего их использования.

3. Рекомендовать клеточные культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС для дальнейших экспериментов по изучению вирусов животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Викторова Е.В. Костный мозг и подкожный жир крупного рогатого скота как источник мультипотентных мезенхимных стволовых клеток / Е.В. Викторова, И.М. Волкова, И.П. Савченкова, Гулюкин М.И. // Сборник трудов Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, г. Москва, 1-2 июня 2011 года.: тез. конф./ Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, 2012. - С. 10-12.

2. Волкова И.М Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота / И.М. Волкова, Е.В. Викторова, И.П. Савченкова, М.И. Гулюкин //Сельскохозяйственная биология. - 2012,- № 2. - С. 32-38.

3. Викторова Е.В. Изучение чувствительности мультипотентных мезенхимных стволовых клеток выделенных, из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота, к вирусам / Е.В. Викторова, А.Ф. Шуляк, И.П. Савченкова // Веткорм. - 2012. - № 3. - С. 16-17.

4. Викторова Е.В. Получение биологического материала для выделения мультипотентных мезенхимных стволовых клеток у сельскохозяйственных животных / Е.В. Викторова, И.П. Савченкова // Веткорм. - 2012. - № 4. - С. 28-29.

5. Викторова Е.В. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) крупного рогатого скота как перспективный материал для создания новых клеточных систем в биотехнологии / Е.В. Викторова, И.П. Савченкова // Сборник трудов II Международной Интернет-конференции «Актуальные

проблемы биохимии и бионанотехнологии», Казань, 15-18 ноября 2011 г.: тез. конф./ ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный Университет». - Казанский университет, 2012. - С. 58-61.

6. Викторова Е.В. Оценка чувствительности мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота к вирусам животных Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки крупного рогатого скота как новая клеточная система для вирусологии / Е.В. Викторова // Сборник трудов Международной Интернет-конференции «Биотехнология взгляд в будущее», Казань, 17-19 апреля 2012 г.: тез. конф./ ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный Университет». -Казанский университет, 2012. Том 1 - С. 56-58.

7. Викторова Е.В. Оценка чувствительности мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота к вирусам животных / Е.В. Викторова, А.Ф. Шуляк, И.П. Савченкова // ХП Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» 11 апреля 2012 г.: тез. конф. / Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, 2012. - С. 19-20.

8. Викторова Е.В. Чувствительность мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота, к вирусам in vitro / Е.В. Викторова, А.Ф. Шуляк, И.П. Савченкова // Международная научно-практическая конференция «Трансмиссивные болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контролю» 21-25 мая 2012 г: тез. конф. / Харьков - 2012. - С. 82-84.

9. Дополнительная информация к каталогу Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН)/ И.П. Савченкова, И.М. Волкова, Е.В. Викторова, М.В. Полякова; ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии. - М., 2012. - 5 с. ISBN 9785-9903649-1-2.

Отпечатано в ООО «Издательство Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 01.02.2013 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,75 Печать авторефератов (495)730-47-74, 778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Викторова, Екатерина Владимировна

Список сокращений.

Введение.

1.Обзор литературы.

1.1. Открытие стволовых клеток взрослого организма.

1.2. Характеристика стволовых клеток взрослого организма.

1.2.1. Потентность к дифференцировке стволовых клеток взрослого организма.:'.

1.2.2. Проблемы стандартизации стволовых клеток взрослого рганизма.

1.2.3. Иммунофенотип ММСК.:

1.3. Основные этапы выделения ММСК костного мозга и жировой ткани.

1.4 Функции и потенциальное применение ММСК в ветеринарной медицине.

1.5. Использование ММСК в вирусологии.

1.5.1 Актуальность использования ММСК в вирусологии.

1.5.2. Цитопатогенное действие вирусов в культурах клеток.

1.5.2.1. Вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ).

1.5.2.2. Герпес вирус крупного рогатого скота - 4 типа (BHV-4).

1.5.2.3. Вирус парагриппа (ПГ-З).

1.5.2.4. Вирус ринопневмонии лошадей (РПЛ).

1.5.2.5. Вирус диареи-болезни слизистых (ВД-БС).

1.5.2.6. Вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и характеристика мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота"

Актуальность темы. Перспективность получения и применения мультипотеитных мезеихимных стволовых клеток (ММСК) - стволовых клеток взрослого организма, определяется их основными свойствами и признаками. Во-первых, достоверно установлено, что ММСК стабильно самообновляются в клонах без анеуплоидии, генетической нестабильности и малигнизации. При этом они способны пролиферировать в культуре длительное время, формируя стабильные диплоидные клеточные линии. Во -вторых, при индукции к дифферепцировке они способны дифференцироваться в нескольких направлениях, в пределах тканевых производных одного зародышевого листка, образуя in vitro клетки других тканей [19, 20, 116, 130, 147, 172]. ММСК обладают способностью заселять матрицу-носитель, дифференцироваться в заданном направлении и формировать трехмерные структуры, которые позволяют моделировать ту или иную ткань in vitro. Это делает их уникальным материалом для создания новых клеточных систем, в том числе для изучения вирусов.

Известно, что в ветеринарной и медицинской биотехнологии существует необходимость в разработке эффективных способов культивирования и накопления вирусов па чувствительных клеточных культурах, обеспечивающих их размножение in vitro. Перевиваемые культуры клеток, которые используются в этих целях, как правило, иммортализированны, и в результате длительного культивирования теряют свою не только тканевую, но и видовую специфичность. Диплоидные культуры клеток, полученные из тканей и органов млекопитающих, сохраняют свою видовую и тканевую специфичность, однако имеют ограниченный период пролиферации вследствие старения. Известно, что такие клетки не могут преодолеть более 50 цитогенераций. В связи с этим использование для этих целей ММСК является актуальным. Легкость их выделения и доступность биологического материала (подкожный жир, костный мозг, кожа), делает их, делает их, на сегодняшний момент, наиболее перспективной клеточной системой [18].

Имеются сообщения о выделении ММСК из костного мозга (КМ) крупного рогатого скота (КРС) [43, 56, 90], из КМ [42, 50, 141], жировой ткани (ЖТ) и [133, 166, 167] кожи свиней [101], из КМ [64, 95, 150] и ЖТ [92, 160, 161] лошадей, из КМ овцы [110], КМ козы [154], КМ кролика [176], КМ [106, 168] и ЖТ собаки [139], КМ кошки [107]. Появились данные о выделении клеток со свойствами и признаками ММСК из пуповинной крови лошадей [94], периферической крови лошадей [96] пуповинной крови КРС [137] овцы [85], а также из пульпы зуба собак [55] и рогов оленя [37]. Во всех перечисленных работах получены клетки, имеющие разные морфофункциональные характеристики и принципиальные отличия по экспрессии поверхностных антигенов (Аг) в зависимости от условий выделения и культивирования. Все это свидетельствует о том, что свойства и признаки ММСК сельскохозяйственных животных изучены недостаточно.

В связи с перспективностью использования ММСК в биотехнологии целыо наших исследований было выделение из тканей взрослых особей КРС клетки с фенотипом, подобным ММСК, и изучить их свойства и признаки in vitro.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• оптимизировать существующие и разработать новые методы выделения ММСК из КМ и жировой ткани (ЖТ) КРС;

• охарактеризовать ММСК КРС в культуре;

• провести анализ экспрессии поверхностных Аг - маркеров фенотипа ММСК па клетках, выделенных из КМ и ЖТ КРС;

• изучить потенции полученных ММСК КРС, выделенных из КМ (ММСК КМ КРС) и ЖТ (ММСК ЖТ КРС) к направленной дифферепцировке в клетки костной и жировой тканей in vitro;

• оценить чувствительность культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам: инфекционного ршкпрахеита (ИРТ) КРС, диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС), герпеса КРС типа 4 (BHV-4), энцефаломиокардита мышей (ЕМС), парагриппа-3 (ПГ-3), ринопиевмоиии лошадей (РПЛ);

• депонировать культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН);

Научная новизна. Оптимизированы методы выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС. Впервые в России выделены культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, которые депонированы в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН). Научная новизна подтверждена получением приоритетов на 2 патента: «Культура мультипотептпых мезепхимпых стволовых клеток, выделенных из костного мозга крупного рогатого скота (medulla ossium Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии», Волкова И.М., Викторова Е.В., Савченкова И.П., Гулюкин М.И., в ФИПС № 2011149133/10 от 02.12.2011 г; «Культура мультипотептпых мезепхимпых стволовых клеток, выделенных из жировой ткани крупного рогатого скота (textus acliposus Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии», Викторова Е.В., Волкова И.М., Савченкова И.П., Гулюкин М.И., в ФИПС № 2011149132/10 от 02.12.2011 г. Впервые охарактеризованы морфологические свойства ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС. Проведен анализ Аг, экспрессия которых характерна для ММСК. Впервые изучены потенции ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, формировать клетки костной и жировой тканей in vitro. Дана оценка чувствительности клеточных культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам ИРТ, ВД-БС, BIiV-4, ЕМС, ПГ-3, РПЛ.

Практическая значимость. Оптимизированы способы получения биологического материала для выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС. Оптимизированы методы выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС, которые могут использоваться для получения и наращивания культур ММСК КРС и последующего их применения в клеточной биотехнологии. На основе экспериментальных данных разработаны Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков / И.Г1. Савченкова, Л.К. Эрнст, М.И. Гулюкин, Е.В. Викторова // М.: «Спутник +» -2010. - 23с. - ISBN 978-5-9973-0926-8.

В Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) депонированы культуры ММСК КМ КРС (№i 79) и ММСК ЖТ КРС (№ 80). Получены данные по чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, к вирусам: ИРТ, ВД-БС, BHV-4, ЕМС, ПГ-3, РГШ.

Выносимые на защиту положения:

• методы выделения из КМ и ЖТ КРС клеток с фенотипом ММСК;

• свойства и признаки культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС;

• оценка чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам ИРТ КРС, ВД-БС, герпеса КРС типа 4, ЕМС, ГГГ-3, РПЛ;

Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно выполнял все этапы работы, в т.ч. анализ и обобщение полученных результатов исследований, написание статей, отчетов и докладов.

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие м.н.с. Волкова И.М., к.б.п. Кулешов К.В., в. п. сотрудник лаборатории вирусологии к.в.п. Шуляк А.Ф., за что автор им искренне благодарен.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на: Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, (Москва, 1-2 июня 2011); П-й Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и биопанотехпологии» (Казань, 15-18 ноября 2011); ХП-ой Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 11 апреля 2012); Международной Интернет-конференции «Биотехнология взгляд в будущее», (Казань, 17-19 апреля 2012); Международной научно-практической конференции «Трансмиссивные болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (Украина, Алушта, АР Крым, 21-25 мая 2012).

Публикации, По теме диссертации было опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, 6 статей в сборниках трудов.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста, которые включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список литературы состоит из 177 библиографических источников, в т.ч. 146 на иностранных языках. Работа иллюстрируется 11-ю таблицами, 14-ю рисунками и содержит 6 страниц приложений.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Викторова, Екатерина Владимировна

ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать оптимизированные способы отбора и транспортировки биологического материала для дальнейшего выделения из КМ и ЖТ КРС популяции ММСК.

2. Рекомендовать оптимизированные методы выделения ММСК из КМ и ЖТ для получения и наращивания необходимого количества клеток, для последующего депонирования ветеринарными учреждениями, с целью сохранения клеточного материала и дальнейшего их использования.

3. Рекомендовать клеточные культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС для дальнейших экспериментов по изучению вирусов животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Викторова, Екатерина Владимировна, Щёлково

1. Аспаиидзе, Б. П. Первичные и диплоидные культуры клеток легкого плода коровы для вирусологических исследований. Дисс. Канд. биологических наук: 03.00.23 / Б. П. Аспанидзе. — М., 1987. — 168 с.

2. Белкина, Н. М. Сравнительное изучение морфологических изменений в культуре клеток под действием вирусов группы герпеса / Н. М Белкина // Бюлл. ВИЭВ. 1972,- № 14. - С. 25-28.

3. Волкова, И. М Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота / И. М. Волкова и др. // Сельскохозяйственная биология. -2012.-№ 2.-С. 32-38.

4. Гальнбек, Т. В. Животная клетка в культуре: монография / Т. В. Гальнбек и др.; под. общ. ред. Проф. Дьяконова JI. П. М.: Издательство «Спутник +», 2009.- С. 110-163.

5. Данишевский, Д. А. Цитопатогенное действие вирусов инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и парафиппа-3 в культуре клеток, дисс. канд. ветерин. наук: 16.00.03. / Д. А. Данишевский. М., 1981.- 168 с.

6. Деев, Р. В. Научное наследие Александра Максимова и современность. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2005.- № 1. -С. 4-8.

7. Зудилина, 3. Ф. Изучение биологических свойств парамиксовируса и вирусов группы герпес крупного рогатого скота: автореф. дисс. кандид. биолог, наук: 16.00.03. / 3. Ф. Зудилина. М., 1970.- 21 с.

8. Кругляков, П. В. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток. / П. В. Кругляков и др. // Цитология. 2004,- № 46 (12). - С. 1043-1054.

9. Крюков, Н. Н. Выделение вируса инфекционного ринотрахеита на культуре перевиваемых клеток. / Н. Н. Крюков и др. // Ветеринария. -1977,-№9.-С. 46-48.

10. Матюков, А. А. Сравнение влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации различных клеток костного мозга на репарацию миокарда кроликов после инфаркта / А. А. Матюков и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007.- № 1. - С. 48-55.

11. Николаенко, Н. С. Методы культивирования клеток: стволовые клетки взрослого организма в культуре / Ii. С. Николаенко; под общ. ред.: Т.П. Пинаева, М.С. Богдановой. СПб.: Изд-во Политехи. Ун-та, 2008.-278с.

12. Николаенко, Ii. С. Выделение и культивирование стромальных клеток костного мозга с целью их дальнейшего использования в лечениидефектов костной ткани. / Н. С. Николаенко и др. // Трансплантология.- 2003.-№4(1).-С. 169—171.

13. Поздняков, А. А. Получение перевиваемых культур клеток из лимфоидной ткани / А. А. Поздняков и др. // Ветеринария. 1975.-№7. - С. 37.

14. Романов, 10. А. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга и жировой ткани человека: получение, характеристика, возможности дифференцировки / 10. А. Романов и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005.- №3. - С. 158-163.

15. Савчеикова, И. П. Стволовые клетки перспективный материал для изучения некоторых инфекций in vitro / И. П. Савченкова // Труды ВИЭВ. -2009,-№-75. -С.-558-563.

16. Савченкова, И. П. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека, в клетки костной ткани /И. П. Савченкова и др. // Цитология. 2008. - №50 (10).- С. 855-860.

17. Савченкова, И. П. Перспективы использования стволовых клеток в ветеринарии. /И. П. Савчеикова, М.И. Гулюкин // Ветеринария. 2011.- №7.- С. 3-5.

18. Сюрин, В. 11. Ветеринарная вирусология / В. Н. Сюрин, И. В. Фомина, Р. Р. Белоусова.- М.: Колос, 1984. -376 с.

19. Тепляшин, А. С. Характеристика мезенхимальпых стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани / А. С. Тепляшин и др. // Цитология. 2005. - № 47 (2).- С. 130-135.

20. Ткачук, В. А. Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения / Под ред. В. А. Ткачука. Руководство для врачей. — М.: Литтерра, 2009. — С. 222233.

21. Фриденштейн, А. Я. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники / А. Я. Фриденштейн и др. // М.: Медицина. -1973.- С. 221.

22. Фриденштейн, А. Я. Клонирование стромальных клеток-предшественников: Сборник научных трудов "Методы культивирования клеток" / А. Я Фриденштейн; под общ. ред. Г. П. Пинаева. Ленинград: Наука, 1988.- 257-265 с.

23. Фриденштейн, А. Я. Клеточные основы кроветворного микроокружения / А. Я. Фриденштейн, Е. А Лурия // М.: Медицина. -1980.-С. 221.

24. Хубутия, М. Ш. Низкомолекулярные пептидпые препараты, полученные из культивированных стволовых клеток, при лечении острой почечной недостаточности / М. Ш. Хубутия и др. //Трансплантология. 2011. - № 4. - С. 20-25.

25. Хубутия, М. Ш. Паракринные механизмы противовоспалительного и оргапопротективного действия при трансплантации мезенхимных стволовых клеток. Обзор литературы / М. 111. Хубутия и др. //Трансплантология. 2012. - № 1-2. - С. 20-32.

26. Чайлахян, Р. К. Перенос костномозгового микроокружения клонами стромальных механоцитов / Р. К. Чайлахян и др.. Бюлл. эксп. биол. мед. - 1978. -№ 2.- 705-707 с.

27. ЗО.Чевелев, С. Ф. Цитологические изменения в культуре клеток почки телят, зараженных вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота: Вопросы ветер, вирусол., микробиологии., эпизотологии / С. Ф. Чевелев. Покров, 1973. - 40 с.

28. ЗЬЯрилин, А. А. Основы иммунологии / А. А Ярилин // М.: Медицина. -1999.-608 с.

29. Aggarwal, S. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cells responses / S. Aggarwal, M. F. Pittenger // Blood. 2005. Vol. 105 (4). -P. 1815- 1822.

30. Asahara, T. Accelerated restitution of endothelial integrity and endothelium-dependent function after phVEGF165 gene transfer / T. Asahara et al. // Circulation. 1996. - Vol. 94 (12). -P. 3291-3302.

31. Aycardi, E. Infections bovine rhinotracheitis survey in range cattle. / E. Aycardi et al. //X X World Vet. Congress, Summaries. 1975, - Vol. 1, P. 573.

32. Baker, R. M. Bovine viral diarhea virus: a review. / R. M. Baker et al. // J. Am. vet. med. Ass. 1987. - Vol. 190.-P. 1449-1458.

33. Bartha, A. Isolation of a bovine herpesvirus from calves with respiratory disease and keratoconjunctivitis. / A. Bartha et al. // Acta Vet Acad Sei Hung. 1966. - Vol. 16(3). -P. 357-358.

34. Berg, D. K. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. / D. K. Berg et al. // Biol Reprod. 2007. - Vol. 77(3). -P. 384394.

35. Bi B. Stromal Cells Protect against Acute Tubular Injury via an Endocrine Effect / B. Bi et al. //J. Am. Soc. Nepfrol. 2007.- Vol. 18 (9). - P. 26482659.

36. Blau, II. M. Differentiation requires continuous regulation. / H. M. Blau et al.//J. Cell Biol. 1991.-Vol. 112.-P. 781-783.

37. Blau, H. M. The evolving concept of a stem cell: entity or function? / FI. M. Blau et al. //Cell. 2001. - Vol. 105.-P. 829-841.

38. Blundell, C.D. The link module from ovulation and inflammation-associated protein TSG-6 changes conformation on hyaluronan binding. / C. D. Blundell et al. //J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278 (49). - P. 49261-49270.

39. Bosch, P. Isolation, characterization, gene modification, and nuclear reprogramming of porcine mesenchymal stem cells. / P. Bosch et al. // Biology of Reproduction. 2006. - Vol. 74 (1). - P. 46-57.

40. Bosnakovski, D. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells. / D. Bosnalcovski et al. // Cell Tissue Res. 2005. - Vol. 319 (2). - P. 243-253.

41. Bruck, C. Monoclonal antibodies define eight independent antigens regions on the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein. /C. Bruck et al. //Virology 1982.-Vol. 122.-P. 342-352.

42. Bublot, M. Bovine herpesvirus 4 genome: cloning, mapping and strain variation analysis. /M. Bublot et al. // J Gen Virol 1990. - Vol. 71 (1). -P. 133-142.

43. Bublot, M. Genetic relationships between bovine herpesvirus 4 and the gammaherpesviruses Epstein-Barr virus and herpesvirus saimiri. /M. Bublot et al.//Virology 1992.-Vol. 190(2).-P. 654-665.

44. Colter, D. C. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. /D. C. Colter et al. // PNAS. J -2000. Vol. 97. - P. 3213-3218.

45. Covas, D. T. Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells. / D. T. Covas et al. // Brazilian Journal of Medical and Biological Research 2003,-Vol. 36.-P. 1179-1183.

46. Da Silva Meirelles, L. MSC frequency correlates with blood vessel density in equine adipose tissue. / L. Da Silva Meirelles et al. // Tissue Eng Part A.- 2009.-Vol. 15 (2).-P. 221-229.

47. Da Silva Meirelles, L. Murine marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, in vitro expansion, and characterization. / L. Da Silva Meirelles et al. // British Journal of Hematology 2003. - Vol. 123 (4). - P. 702-711.

48. Danchuk, S. Human multipotent stromal cells attenuate lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice via secretion of tumor necrosis factor-ainduced protein. / S. Danchuk et al. // Stem Cell Research Therapy. -2011.-Vol. 2(3).-P. 2-27.

49. Dissanayalca, W. L. Characterization of dental pulp stem cells isolated from canine premolars. / W. L. Dissanayaka et al. // J Endod. 2011. - Vol. 37(8).-P. 1074-1080.

50. Donofrio, G. Bovine Endometrial stromal cells display osteogenic properties. / G. Donofrio et al. // Reproductive Biology and Endocrinology. 2008. - V. 16. - P. 60-65.

51. Donofrio, G. Susceptibility of bovine mesenchymal stem cells to bovine herpesvirus 4. / G. Donofrio et al. // J Virol Methods. 2005. -V. 127 (2). -P. 168-170.

52. Donofrio, G. Swine adipose stromal cells loaded with recombinant bovine herpesvirus 4 virions expressing a foreign antigen induce potent humoral immune responses in pigs / G. Donofrio et al. // Vaccine. 2011. - V. 29 (5). - P. 867-872.

53. Dubuisson, J. Biological and biochemical comparison of bovid herpesvirus-4 strains. / J. Dubuisson et al. // Vet Microbiol. 1988. - V. 16 (4). - P. 339-349.

54. Ehlers, B. Analysis of bovine cytomegalovirus genome structure: cloning and mapping of the monomeric polyrepetitive DNA unit, and comparison of European and American strains. / B. Ehlers et al. // J Gen Virol. 1985. -V. 66(1).-P. 55-68.

55. Fortier, L. A. Isolation and chondrocytic differentiation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells. / L. A. Fortier et al. // Am J Vet Res. 1998-Vol. 59 (9).-P. 1182-1187.

56. Fridenshtein, A. J. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method / A. J. Fridenshtein et al. // Exp. Hematol. 1974. - Vol. 2. - P. 83-92.

57. Fridenstein, A. J. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. / Fridenshtein et al. // Exp. Hematol. 1976. - Vol. 5 (5). - P. 267-274.

58. Friedenstein, A. J. Osteogenic stem cells in bone marrow / A.J. Friedenstein et al. // Bone and mineral research. 1990. - Vol. 24. - P. 32 -37.

59. Gamett, FI. M. Fusion of citomegalivirus infected fibroblasts to from multinucleasa giant cells. / H. M. Gamett // J. Med. Virol. 1979. - Vol. 3 (4). - P. 271-274.

60. Garcia-Fernandez, M. Low doses of insulinlike growth factor I improve insulin resistance, lipid metabolism, and oxidative damage in aging rats / M. Garcia-Fernandez et al. // Endocrinology. 2008. - Vol. 149 (5). - P. 2433-2442.

61. Gard, S. Hemagglutination by Col-MM-Virus. / S. Gard et al. // Proc Soc Exp Biol Med. 1951. - Vol. 76 (1). - P. 68-73.

62. Goyal, S. M. Bovid herpesvirus-4: a review. Yet. Bull. / S. M. Goyal et al. //Vet. Bull. 1992.-Vol. 62.-P. 181-201.

63. Gregory, C. A. Adult bone marrow stem/progenitor cells (MSCs) are preconditioned by microenvironmental "niches" in culture: a two-stage hypothesis for regulation of MSC fate. / C. A. Gregory et al. // Sci STKE. -2005,- Vol. 294.-P. 26-37.

64. Groh, M. E Human Mesenchymal stem cells require monocyte-mediated activation to suppress alloreactive T Cells. / M. E. Groh et al. // Exp. Hematol. 2005. - Vol. 33 (8). -P. 928 - 934.

65. Guest, D. J. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. / D. J. Guest et al. // Equine Vet J.- 2008. Vol. 40 (2). -P. 178-181.

66. Henry, B. E. Genetic relatedness of disease-associated field isolates of bovid herpesvirus type 4. / B. E. Henry et al. // Am J Vet Res. -1986. Vol. 47 (10).-P. 2242-2246.

67. Heynesworth, S.E. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow. / S.E. Heynesworth et al. // Bone. 1995. - Vol. 13.-P. 81-95.

68. Iioglund, S. A morphological study of outfolded and released parainfluenza tyre 3 virus. / S. Hoglund et al. // J. Gen.Virol. 1973. - Vol. 21.-P. 359

69. Ip, J. E. Mesenchymal stem cells use integrin betal not CXC chemokine receptor 4 for myocardial migration and engraftment. / J. E. Ip et al. // Mol. Biol. Cell. 2007 - Vol. 18 (8).-P. 2873-2882.

70. Jacobs, R. M. Monoclonal gammopathy in a horse with defective hemostasis. / R. M. Jacobs et al. // Vet Pathol. 1983 - Vol. 20 (5).-P. 643-647.

71. Jäger, M. Ovine cord blood accommodates multipotent mesenchymal progenitor cells. / M. Jäger et al. // In Vivo. 2006 - Vol. 20 (2).-P. 205214.

72. Janjanin, S. Human palatine tonsil: a new potential tissue source of multipotent mesenchymal progenitor cells. / S. Janjanin et al. // Arthritis Res Ther. 2008 - Vol. 10 (4).-P. 83-95

73. Kálmán, D. Role of bovine herpesvirus 4 in bacterial bovine mastitis. / D. Kálmán et al. // Microb Pathog. 2004 - Vol. 37 (3).-P. 125-129.

74. Karihaloo, A. Vascular endothelial growth factor induces branching morphogenesis tubulogenesis in renal epithelial cells in a neuropilin-dependent fashion. / A. Karihaloo et al. // Mol. Cell Biol. 2005. - Vol. 25 (17). P. 7441-7448.

75. Kasashima, Y. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. / Y. Kasashima et al. // EquineVet J. 2011. - Vol. 43 (3). P. 288-294.

76. Kato, Y. Nuclear transfer of adult bone marrow mesenchymal stem cells: developmental totipotency of tissue-specific stem cells from an adult mammal. / Y. Kato et al. // Biology of Reproduction. 2004. - Vol. 70 (3). P. 415-418.

77. Kay, H. E. How many cell generations? / H. E. Kay et al. // Lancet. -1965,-Vol. 28 (2). P. 418-419.

78. Kisiday, J. D. Evaluation of adult equine bone marrow- and adipose-derived progenitor cell chondrogenesis in hydrogel cultures. / J. D. Kisiday et al. // J Orthop Res. 2008. - Vol. 26 (3). P. 322-331.

79. Koch, T. G. Isolation of mesenchymal stem cells from equine umbilical cord blood. / T. G. Koch et al. // BMC Biotechnology. 2007. - Vol. 7. P. 2635.

80. Koch, T. G. Current and future regenerative medicine principles, concepts, and therapeutic use of stem cell therapy and tissue engineering in equine medicine. / T. G. Koch et al. // Can Vet J. - 2009. - Vol. 50 (2). P. 155165.

81. Koerner, J. Equine peripheral blood-derived progenitors in comparison to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. / J. Koerner et al. // Stem Cells. -2006. Vol. 24 (6). P. 1613-1619.

82. Kuwana, H. The phosphoinositide-3 kinase gamma-Akt pathway mediates rena! tubular ihjury in cisplatin nephrotoxicity / H. Kuwana et al. // Kidney Int. 2008. - Vol. 73 (4). P. 430-455.

83. Lee, W. Allogenic human mesenchymal stem cells for treatment of E. coli endotoxininduced acuter lung injury in the ex vivo perfused human lung / W. Lee et al. // PNAS. 2009. - Vol. 106 (38). P. 16357-16362.

84. Lennon, D. P. Isolation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells. / D. P. Lennon et a!. // Experimental Hematology. 2006. - Vol. 34 (11). P. 1606-1607.

85. Lermen, D. Neuro-muscular differentiation of adult porcine skin derived stem cell-like cells. / D. Lennon et al. // PLoS One. 2010. - Vol. 5 (l).:e8968.

86. Lieberthal, W. Mechanisms of death induced by cisplatin in proximal tubular epithelial cells: Apoptosis vs necrosis / W. Lieberthal et al. //Am. J. Pisiol. 1996. - Vol. 270 (4 Pt 2). - P. 700-708.

87. Liebhaber, H. The Basis for the Size Differences in Plaques Produced by Wariants of Encephalomyocarditis (EMC) Virus. / FI. Liebhaber et al. // Virology. 1963.-Vol. 20.-P. 559-566.

88. Lucas, P. A. Isolation of putative mesenchymal stem cells from embryonic and adult skeletal muscle. / P. A. Lucas et al. // In VitroCell Biol. 1992.-Vol. 28.-P. 154-159.

89. Madin, S. H. Isolation of infections bovine rhinotracheitis vims. / S. H. Madin et al. // Science. 1956. -Vol. 124. - P. 721-722.

90. Mankani, M. H. Canine cranial reconstruction using autologous bone marrow stromal cells. / M. H Mankani et al. // Am J Pathol. 2006. -Vol. 168 (2).-P. 542-550.

91. Martin, D. R. Isolation and characterization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow. / D. R. Martin et al. // Exp Llematol. 2002. -Vol. 30 (8). - P. 879-886.

92. Majumdar, M. K. Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells. / M. K. Majumdar et al. //J. Cell. Physiol. 2000. - Vol. 185. - P. 98-106.

93. Maximow, A. Der Lymphozyt als gemeinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen Entwicklung und im postfetalen Leben der. / A. Maximow // ITaematologica. 1909. - Vol. 8. - P. 125-134.

94. McCarty, R. C. Characterisation and developmental potential of ovine bone marrow derived mesenchymal stem cells. / R. C McCarty et al. // J Cell Physiol. 2009. - Vol. 219 (2). - P. 324-333.

95. Meirelles, S. L. MSC frequency correlates with blood vessel density in equine adipose tissue. / S. L. Meirelles et al. // Tissue Eng Part A. -2009.-Vol. 15(2).-P. 221-229.

96. Metealf, D. Haemopoietic cells. / D. Metealf et al. // Elsevier. -1971. Vol. 24. - P. 15-54.

97. Millir, S. B. Hepatocyte growth factor accelerates recovery from acute ischemic renal injury in rats / S. B. Millir et.al. // Am. J. Physiol. 1994.-Vol. 266(1 Pt 2). P. 129-134.

98. Millir, S. B. Insulin-like growth factor 1 accelerates recovery from ischemic acute tubular necrosis in the rat / S. B. Millir et.al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992.-Vol. 89 (24).-P. 1 1876-11880.

99. Milner, C. M. TGF-6: a pluripotent inflammatory mediator? / C. M. Milner // Biochem. Soc. Trans. 2006. - Vol. 34 (Pt 3). - P. 446-450.

100. Minguell, J. J. Mesenchymal stem cells. / J. J. Minguell et.al. // Experimental Biology and Medicine. 2001. - Vol. 226 (6). - P. 507-520.

101. Miyano, H. Mammary lesions associated with bovine herpesvirus type 4 in a cow with clinical mastitis. / H. Miyano // J Vet Med Sei. 2004. -Vol. 66 (4).-P. 457-460.

102. Moscoso, I. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for celltransplantation. / I. Moscoso et.al. // Transplant Proc. 2005. - Vol. 37 (l).-P. 481-482.

103. Montzka, K. Growth factor and cytokine expression of human mesenchymal stromal cells is not altered in an in vitro model of tissue damage / Montzka K. et.al. // Cytotherapy. 2010. - Vol. 12 (7). P. 870880.

104. Morigi, M. Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Accelerate Recovery of Acute Renal Injury and Prolong Survival in Mice / M. Morigi et al. // STEM CELLS. 2008. - Vol. 26 (8). -P. 2075 - 2082.

105. Morigi, M. Life-Sparing Effects of Human Cord Blood-Mesenchymal Stem Cells Accelerate Recovery of Acute Kidney / M. Morigi et al. // STEM CELLS. 2010. -Vol. 28 (3). - P. 513-522.

106. Murnane, T. G. Fetal Disease of Swine Due to Encephalomyocarditis Virus. / T. G. Murnane et al. //Science. 1960. - Vol. 131. -P. 498-499.

107. Nemeth, K. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-depenclent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin -10 production / K. Nemeth ct al. // Nat. Med. -2009. Vol. 15 (l).-P. 42-49.

108. Oh, J. Y. Cytokine secretion by human mesenchymal stem cells cocultured with damaged corneal epithelial cells / J. Y. Oh et al. // Cytokine. 2009. - Vol. 46 (1). - P. 100-103.

109. Okada, M. Hepatocyte growth factor protects small airway epithelial cells from apoptosis induced by tumor necrosis factor -alpha or oxidative stress / M. Okada et al. // Pediatr. Res. 2004. Vol. 56 (3). - P. 336-334

110. Olafson, P. An apparently new transmissible disease of cattle. / P. Olafson et al. // Cornell Vet. 1946. - Vol. 36. - P. 205-213.

111. Parekkadan, B. Immunomodulation of activated hepatic stellate cells by mesenchymal stem cells / B. Parekkadan et al. // Biochem Biophys. Ree. Commun. 2007. - Vol. 363 (2). - P. 247-252.

112. Park, H. C. Treatment of complete spinal cord injury patients by autologous bone marrow cells transplantation and administration of granulocyte -macrophage colony stimulating factor / H. C. Park et al. // Tissue Eng.-2005.-Vol. 11 (5).-P. 9013-922.

113. Pittenger, M. F. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. / M. F. Pittenger et al. // Circulation research. 2004. - Vol. 95.-P. 9-20.

114. Pittenger, M. F. Mesenchymal Stem Cells. / M. F. Pittenger et al. // Human Cell Culture. 2002. - Vol. 5. -P. 189-207.

115. Pittenger, M. F. Multilineage Potential of adult human mesenchymal stem cells. / M. F. Pittenger et al. // Science. 1999. - Vol. 284 (5411). -P. 143-147.

116. Qu, C. Q. Osteogenic and adipogenic potential of porcine adipose mesenchymal stem cells. / C. Q. Qu et al. // In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2007. - Vol. 43 (2). -P. 95-100.

117. Quirici, N. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by antinerve growth factor receptor antibodies. / N. Quirici et al. // Exp Hematol. -2002. Vol. 30. - P. 783-791.

118. Ramalho-Santos, M. "Stemness":transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells. / M. Ramalho-Santos et al. // Science. -2002.-Vol. 298.-P. 597-600.

119. Ramesch, G. TNF-alfa mediates chemokine and cytocine expression and renal injury in cisplatin nehprotoxicity. / G. Ramesch et al. // J.Clin. Invest. 2002. - Vol. 110. - P. 835-842.

120. Raoufi, M. F. Isolation and differentiation of mesenchymal stem cells from bovine umbilical cord blood. / M. F. Raoufi et al. // Reproduction in Domestic Animals. -2011,- Vol. 46. P. 95-99.

121. Reich, С. M. Isolation, culture and chondrogenic differentiation of canine adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells a comparative study. / С. M. Reich et al. // Vet Res Commun. 2012. - Vol. 36 (2).-P. 139-148.

122. Reyes, M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. / M. Reyes et al. //Blood. 2001. -Vol. 98 (9).-P. 2615-2625.

123. Ringe, J. Porcine mesenchymal stem cells: induction of distinct mesenchymal cell lineages. / J. Ringe et al. // Cell and Tissue Research. -2002. Vol. 307 (3). - P. 321-327.

124. Rocha, M. A. A high sensitivity-nested PCR assay for BHV-1 detection in semen of naturally infected bulls. / Rocha, M. A. et al. // Vet Microbiol. 1998.-Vol. 63 (l).-P. 1-11.

125. Roeder, I. Asymmetry of stem cell fate and the potential impact of the niche. /1. Roeder et al. // Stem Cell Rev. 2006. - Vol. 2. - P. 171-180.

126. Ruth, G. R. Bovine viral diarrhea: a difficult infection to diagnose. / G. R. Ruth et al. // Vet. Med. 1986. - Vol. 81. - P. 870-874.

127. Safford, К. M. Tissue culture of adipose-derived stem cells. / К. M. Safford et al. // Culture of human stem cells. 2007. - P. 303-315.

128. Sanchez-Ramos, J. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. / J. Sanchez-Ramos et al. // EXP. Newrol. 2000. -Vol. 164 (2).-P. 247-256.

129. Savchenkova, I. P. Osteogenic differentiation of multipotent mesenchymal stromal cells isolated from human bone marrow and subcutaneous adipose tissue. /1. P. Savchenkova et al. // Cell and Tissue Biology. 2008. - V. 2 (6). - P. 556-571.

130. Schridde, H. Die Entwicklungsgeschichte des menschlichen Speisrwhnenepitheles und ihre Bedeutung fur die Metaplaselehre. / H. Schridde // Weis.: Verlag von J.F Bergmann; 1907.

131. Sell, S. Adult stem cell plasticity. / S. Sell // Stem Cell Rev. 2005. -V. 1. - P. 1-8.

132. Sotiropoulou, P. A. Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells. / P. A. Sotiropoulou et al. // Stem Cell. -2006.-Vol. 24(1).-P. 74 85.

133. Storz, J. Bovine cytomegaloviruses: identification and differential properties. / J. Storz Let al. // J Gen Virol. 1984. - Vol. 65 (Pt 4). - P. 697-706.

134. Su, Z. Y. All-trans retinoic acid promotes smooth muscle cell differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. / Z. Y. Su et al. // J Zhejiang Univ Sei B.- 2010. Vol. 11 (7). - P. 489-496.

135. Sykova, E. Autologues bone marrow transplantation in patients with subcute and chronic spinal cord injury. / E. Sykova et al. // Cell. Transplant. 2006. - Vol. 15 (8). - P. 675-687.

136. Taylor, S. E. Collection and Propagation Methods for Mesenchymal Stromal Cells. / S. E Taylor et al. // Vet Clin North Am Equine Pract. -2011,-V. 27 (2).-P. 263-274.

137. Thiry, E. Molecular biology of bovine herpesvirus type 4. / E. Thiry et al. // Vet Microbiol. 1992. - V. 33 (1). - P. 79-92.

138. Till, J. E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. / J. E. Till et al. // Rad. Res. 1961. - V. 14. - P. 213—222.

139. Tintut, Y. Multilineage potential of cells from the artery wall. / Y. Tintut et al. // Circulation. 2003. - V. 108 (20). - P. 2505-2510.

140. Torna, J. G. Isolation of multipotent adalt stem cells frome the dermis of mammalian skin. / J. G. Torna et al. //Nat. Cell Biol. 2001. - V. 3. - P. 778-784.

141. Toupadakis, C. A. Comparison of the osteogenic potential of equine mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, and umbilical cord tissue. / C. A. Toupadakis et al. // Am J Vet Res. -2010. V. 71 (10). - P. 1237-1245.

142. Vidal, M. A. Characterization of equine adipose tissue-derived stromal cells: adipogenic and osteogenic capacity and comparison with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. / M. A. Vidal et al. // Vet Surg. 2007. - V. 36 (7). - P. 613-622.

143. Wang, Y. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture. / Y. Wang et al. // Cytotherapy. 2005. - V. 7 (6). - P. 509-519.

144. Warren, J. Neutralizing Antibody against. Viruses of the Encephalomyocarditis Group in the Sera of Wild Rats. / J. Warren et al. // Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). 1949. - V. 71. - P. 376-378.

145. Warren, J. The Family Relationship of Encephalomyocarditis, Colombia SK, MM, and Mengo Encephalomyocarditis Viruses. / J. Warren et al. // J Immunol. - 1949. - V. 62. - P. 387-398.

146. Wisnjewski, H. G. Cytokine induced gene expression at the crossroads of innate immunity inflammation and fertility: TSG-6 and PTX3/TSG-14. / H. G. Wisnjewski et al. // Cytokine Growth Factor Rev. 2004. - Vol. 15 (2-3).-P. 129-146.

147. Williams, K. J. Isolation and characterization of porcine adipose tissue-derived adult stem cells. / K. J. Williams et al. // Cells Tissues Organs.-2008.-Vol. 188 (3).-P. 251-258.

148. Williams, K. J. Isolation and culture of porcine adipose tissue-derived somatic stem cells. / K. J. Williams et al. // Methods Mol Biol. 2011. -Vol. 702. -P. 77-86.

149. Wu, W. Bone marrow-derived osteoblasts seeded into porous beta-tricalcium phosphate to repair segmental defect in canine's mandibula. / W. Wu et al. // Ulus Travma Acil Cerrahi Derg.- 2006. -Vol. 12 (4). P. 268276.

150. Wu, Y. Mesenchymal Stem Cell Enhance Wound Healing Trough Differentiation and Angiogenesis. / Y. Wu et al. // Stem Cells. 2007. -Vol. 25 (10).-P. 2648-2659.

151. Yagi, H. Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Attenuate Organ Injury Induced by LPS and Burn. / H. Yagi et al. // Cells Transplant. -2010.-Vol. 19(6).-P. 823-830.

152. Yagi, H. Reactive Bone Marrow Stromal Cells Attenuate Systemic Inflammation via sTNFRl. / Fl. Yagi et al. // Molecular Therapy. 2010. -Vol. 18(10).-P. 1857-1864.

153. Yamanalca, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. /S. Yamanaka et al. //Cell Stem Cell. 2012. - Vol. 14 (6). - P. 678-684.

154. Yamamoto, Y. Characterization of a bovine herpesvirus type 4 isolated from the spinal cord of a cow with astasia. / Y. Yamamoto et al. // Arch Virol. 2000. - Vol. 145 (11). - P. 2363-2370.

155. Young, H. E. Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived fromfetal, adult geriatric donors. / H. E. Young et al. // Anat. Rec. 2001. -Vol. 264.-P. 51-62.

156. Zhang, B. Cisplatin-induced nehprotoxicity is mediated by tumor necrosis factor- alpha produced by renal parenchymal cells. / B. Zhang et al. // Kidney Int. 2007. - Vol. 72 (1). - P. 37-44.

157. Zhang, X. Q. Isolation, culture and chondrogenic differentiation of goat bone marrow mesenchymal stem cells. / X. Q. Zhang et al. // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2009. - Vol. 29 (3). - P. 419-422.

158. Zuk, P. A. Human adipose tissue is source of multipotent stem cells. / P. A. Zuk et al. // Molecular Biology of the Cell. 2002. - Vol. 13 (1). -P. 4279-4295.