Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и анализ симбиотических свойств Tn5-мутантов клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti, обладающих повышенной дыхательной активностью

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ симбиотических свойств Tn5-мутантов клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti, обладающих повышенной дыхательной активностью"

всероссийский н/1учно-исследовлтешжш институт сельскохозяйственной микробиологии расхн

Р Г Б ОД На правах рукописи

2 5 НОН ^НО

ЮРГЕЛЬ Светлана Николаевна

УДК: 576.851.155:576.24

получение и анализ симбиотических свойств тпб-мутантов клубеньковых бактерий ШяоМит теШоИ,

обладащях повышенной дыхательной активностью

Специальность: 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 19%

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики и солвкции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН,

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Б.В.Симарои.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

С.В.Каменева,

кандидат биологических наук Л.Н.Пароменская Ведущее учреждение - С.-Петербургский Государственный

Университет

Ззцр<та состоится «%0» ¡¿¿КоЗр1996 г. в //"' час на заседании Специализированного совета К 020.25.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по

адресу:

С.-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «/? 1ЭЭ6 г.

Ученый секретарь

Диссертационного сонета кандидат биологических наук А.Н.Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Азот входит в состав многих биологических молекул и является одним из макроэлементов, необходимых для развития и роста всех живых организмов. Однако молекулярный азот воздуха доступен для использования только, небольшой группе микроорганизмов. Бактерии, относящиеся к видам Rhlsioblum и Bradyrhl20bium, могут осуществлять фиксацию азота в симбиозе с бобовыми растениями. В основе этих симбиотических взаимоотношений лежит обмен фиксированным рмзобиями азотом и содержащими углерод соединениями, синтезированными растением-хозяином. Одной из наиболее интересных черт симбиотичекой фиксации азота является конфликт меззду высокой чувствительностью нитрогеназного комплекса к кислороду и потребностью в больших затратах анергии в процессе его функционирования. Основная часть этой энергии может быть получена только в результате окислительного фосфорилирования, а значит в процессе дыхания« На данный момент достаточно активно ведутся работы по изучению энергетических аспектов симбиотической азотфиксации и, в частности, по изучению влияния дыхательной активности ризобий. на их способность вступать в эффективный симбиоз с растениеы-хозяиноа. Исследована роль различных ветвей цепи транспорта электронов ризобий в процессе симбиотической азотфиксации (Boit et al., 1992, Batut et al., 1989, Gabel et al., 1994, Préieig et al., 1993, Tully, Ritz et al, 1993). Однако четкой корреляции между активностью дыхания и симбиотической . эффективностью у различных видов и штампов клубеньковых бактерий до сих пор обнаружено не было. Кроме того, не доказана возможность получения высоко эффективных штаммов ризобий при селекции их по дыхательной активности чистых культур. Цель и задачи исследования. ~

Целью нашей работы являлось изучение взаимосвязей между клеточным редокс-потонциалом R.meliloti и их дыхательной и симбиотической активностью. 6 задачу исследований входило!

- разработать методику получения мутантов клубеньковых бактерий, обладающих повышенной способностью восстанавливать бромид трифе-нйлтетразолия, являющегося индикатором клеточного редокс-потенци-

ала, и получить коллекцию мутантов такого типа у штаима СХМ1-188 Я-ггоШои!

- доказать транспоэоиовую природу возникновения мутаций и определить их локализацию в геноме Н.теШоИ;

изучить дыхательную активность чистых культур н эндосимбиотических форм полученных мутантов, а также их симОиотические свойства;

выявить корреляции между дыхательной и симбиотической активностью близкородственных штаммов К.теШоП, штаммов, имещих независимое происхождение, а также мутантов с измененным окислительно-восстановительным потенциалом;

~-:на основе штамма СХМ1-188 П.теШои получено 29 мутантов с повышенной способностью восстанавливать бромид трифенилтетразо-лил (Г;ей++ч2юнотип);

- определена локализация полученных мутаций и показано, что у 23 из 29 мутантов инсерции Тп5, вызывающие возникновение Ке<1++-фенотипа, произошли в мегаплазмиду 2;

- выявлена корреляция между интенсивностью дыхания бактероидов и сиыОиотической активностью у близкородственных штаммов, а также показано отсутствие корреляции между этими признаками у итаммов И-шеШоН, имепцих независимое происхозденне;

- анализ симбиотической и дыхательной активности Яес1+4-мутантов показал, что большинство из них характеризуются повышенной симбиотической эффективностью и дыхательной активностью как свободно-живущих клеток, так и их эндосимбиотических форм.

Разработан метод отбора мутантов клубеньковых бактерий Н.теШоИ с повышенной дыхательной активностью, основанный на использовании индикатора -неточного редокс-потенциала - бромида трифенилтетразолия. Частота возникновения мутантов такого типа составила 3x10-3. . Используя этот метод, был получен 21 мутант с повышенной симбиотической активностью. Следовательно, показана возможность его использования для отбора высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий люцерны.

Результаты работы докладывались на VI с'езде

ВОГКС (Минск, 4992.) , I Европейской конференции по аэот<^иксац«ш (Сегед, Венгрия, 1994), I с*езде ВОГИС (Саратов, 1994), на IX Ваковской коллоквиуме по биологической фиксации молекулярного азота (Москва, 1595), на X Международном конгрессе по биологической фиксации азота (С.-Петербург, 1995). Публикации^ По теме диссертации опубликовано 7 работ. Стр2Ктща_и_об^еу_рБботы1 Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов и обсуждения; выводов и списка литературы. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 16 рисунков. Список литературы состоит из 177 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Основными об'ектами исследований служили штаммы клубеньковых бактерий люцерны R.mellloti из коллекции лаборатории генетики и селекции микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (Зарецкая, 1976, Федоров и др. 1983, Шарыпова и др., 1987), штамм R.tnelilotl ZB121 (KondoroBi et al.,I984) и штамп E.coll S17 (Simon et al.,I993), несущий плазмиды pRP4-4 (Simon et al., 1993) и pSUP5011 (Simon 1994).

Для проведения кон'югаций культуры штаммов донора и реципиента выращивали до поздней лог-фазы, смешивали и осаждали Центрифугированием. Кон'югацйоннув смесь переносили на твердую среду TY и культивировали в течение 18 часов. Выросшие бактерии суспендировали В 5 ил воды « приготавливали последовательные 10 или 100-кратшв разведения. Из каждого разведения высевали по 0,1 ил суспензии на чаши с селективной средой.

Для проведения трансаозонового мутагенеза штамм R.meliloti скрещивали со штаммом В»coli, несущим вектор-переносчик Тп5 -PSUP5011. Отбор трзнспозактов осуществляли на среде с канамшдином И стрептомицином. Все клойы, появившиеся на селективной среде через 4 суток после высепа на нее кон'югативной сыеси, снова пересевали на среду с канашщином и стрептомицином.

Препаративное выделение ДНК, расщепление ■ ДНК эндонуклеазами рестрикции, электрофорез ity кленовых кислот, а такяе капиллярный перенос на йитроцеллюлозную мембрану и гибридизационный анализ ДНК, проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984).

Мотод норадиактивной гибридизации проводили согласно стандартной методик* с DIG-системой (Holtke et al,, 1989). Анализ плазыидного состава бактерий осуществляли с помощью метода Экхардта (Eckhardt, 1978) в модификации (Hynee et al., 1985).

Оценку сиыбиотическкх свойств штаммов проводили в условиях микровегетационного опыта. Растения люцерны Medicado eatlva (сорт Вега) выращивали в стерильных условиях в пробирках с вермикулитом (Федоров и др., 1983). Эффективность симбиоза оценивали по сухой массе растений, инокулированных нсследуемЬш штаммом.

Клубеньки, образованные изучаемыми штаммами R.melilotl, собирали с корней люцерны Medlcago sativa сорт Вега через два месяца после их инокуляции. Растения люцерны выращивали в условиях вегетационного опыта. Для выделение бактероидов клубеньки гомогене-зирооали, гомогенаты подвергали фракционированию в градиенте пер-колла, бактероидные фракции замораживали в жидком азоте. Для получения гомогенатов бактероидов суспензию бактероидов после размораживания в атмосфере азота обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-1 3 раза по 15 сек с интервалом 45 сек при охлаждении в бане со льдом. Содержание белка в гомогена-тах определяли путем измерения спектров поглощения при 260 и 280 ни, расчитывали концентрацию белка по формуле Калькара (Мешков, Северин, 1979):

• мг/мл=1,45 х D280 - 0,74 х D260.

Определение уровня дыхания гомогенатов бактероидов проводили полярографическим методом с использованием электрода Кларка типа ОН-100 (Полевой и др., 1986). В полярографическую ячейку, заполненную до краев реакционной средой, содержащей 0,06М трис-НС1-буфер, рН7,2; 0,1 М глюкозу; 6 гпМ MgCl2, опускали электрод Кларка. С помощью шприца в ячейку, вносили гомогенаты 'актероидов в об'еме 0,4 мл; смесь растворов сукцината и НАДН (1:1) в об'еме 0,2 мл до конечной концентрации 8 мМ. Опыт проводили при-30° три минуты. Ошибка метода составляет 5%. Скорость дыхания определяли по начальному линейному участку кривых дыхания.

Уровнь дыхания чистых культур ризобий оценивали по интенсивности выделения ими в атмосферу С02. Для этого в пузырьки об'емом 100 мл, содержащие по 50 мл ММ среды, вносили по 1 мл ночной куль-

туры тестируемых штампов. Титр культуры составлял 10 . Пузырьки герметично закрывали и инкубировали в течение 3 дней при 1=28°С. В конца периода культивирования измеряли титр культур. Содержание С02 в атмосфере определяли с помощью газового хроматографа.

Электрофорез а полиакриламидном геле, с додецилсульфятом натрия (вСБ-ПААТ-электрофорез): бактерии выращивали в жидкой среде ТУ до поздней лог-фазы, культуры центрифугировали, осажденные клетки промывали 1 мл буфера (10пА! Трис; 5 Ш 10 тМ 2-меркаптогтанол, рН=7,5), переосаждали. Осадки ресуспендн-ровали в 130 мкл буфера с БЮ (62,5 шН Трис; 10%-ный глицерин; 2%-шй 51)5; 5%-шй 2 Меркаптоэтанол), добавляли 16 мкл раствора протеиназы К (1 мкл в буфере с БШ), инкубировали 2 ч. при 37°С. Далее пробы кипятили на водяной бане 7 юш, охлаждали и еще раз обрабатывали протеиназой К. Перед нанесением на гель пробы центрифугировали 4 шш при 10 тыс. g. Электрофорез выполняли по стандартной методике (ЬаегтаП, 1987). Гели обрабатывали перийодатной кислотой и окрашвали нитратом серебра (Т1ав, РгаесЬ, 1982).

Статистическую обработку экспериментальных дашгых проводили, используя общепринятые методы: "X2", ^-критерий Ст'юдента и дйспэрсиошшй анализ (Лакин, 1980).

результаты И обсуждение

восстанавливать бромид грифе нилтетразолия.

В нааей работа бал использован один" из распространенных индикаторов окислительно-восстановительного потенциала клетки -брслвд трифенилтетразолия (ТТВ). Поскольку методики отбора мутантов й.{!йэШо*1 с измененным редокс-потенциалом клетки с Использованием ТТВ разработано не было, нам пришлось начинать работу с подбора сред й условий проведения эксперимента. Нами учитывалось Несколько факторов: а первую очередь - источники азота й углерода» их концентрация, а также концентрация ТТВ. Для проведения Тп5-мутагенеза штамма СХМ1-188 использовали плазмиду рБЦРБОИ. В качестве источников азота мы использовали глутамат (0,17 г/л) йли сульфат аммония (0,1 г/л); в качестве источников углерода - лактат натрия (1,2 г/л) или маннит (1,6 г/л). ТТВ в среду добавляли в количестве 0,03 г/л, 0,06 г/л и 0,09 г/л.

Наиболее четко окрашенные колонии розового цвзта появлялись на среде, содоржащей 1,2 г/л лактата натрия, 0,17 г/л глутаиата и 0,003% ТТВ, При этом некоторые из них отягчались более светлой окраской по сравнении с основной массой трэнспоэантов. Клоны с более темной окраской возникали значительно реже. Мы отбирали именно такие клоны. Всего было отобрано 29 клонов с более темной окраской. В дальнейшем такой фенотип мы будем обозначать как Pod4 + . Частота возникновения мутантов с Ие^-фенотипом составила 0,29% (Табл.1). Мутанты получили название ТЬ, с порядковым;: номерами от \ до 29.

Таблица 1. Частота возникновения ЕП и/или Red мутантов у штамма СХШ-188.

Проанализировано Получено Частота возникновения

Штамм Фенотип Ктг-клонов мутантов мутантов, S

СХШ-188 EÍX44 250 6 2,4 ± 0,98

Red++ 10000 29 0,29 - 0,05

Параллельно получению мутантов с Redf+- фенотипом нами был прооеден отбор мутантов штамма СХМ1-188 с повышенной симбиотичес-кой эффективностью (ЕП++-фенотш1), полученных при проведении транспозонового мутагенеза с использованием того же вектора. Это позволило нам провести сравнительный анализ частот возникновения мутантов с Red++- и Е114+-фенотипом и характера распределения инсерцкй Тп5, выэывавдих их возникновения в геноме R.melilotl

Для отбора мутантов с повышенной симОиотической эффективностью в 3-х независимых микровегетационных опытах было проанализировано 250 транспозантов штамма СХМ1-188. В результате было отобрано шесть независимых мутантов, вызываодих статистически достоверное повышение массы инокулироьакных ими растений по сравнению с родительскими штаммами. Таким образом, частота возникновения мутантов с Eíí++-Фенотипом составила 2,41, что статистически достоверно выше частоты возникновения мутантов с Red++-Kt>eH0THn0M (0.29Ж) (табл.1)

R результате проведения гибридазационного анализа EcoRI- и HindlII- рестриктов тота-

льной ДНК, применяя в качестве зонда плазмида pSUP5011 и pBR325, меченные дигсксигеншюы, у 6 ЕГГ++- и 28 Кеа++~мутантов штамма CXi.11-188 были идентифицированы уникальные фрагмента.ДНК, содержащие Тп5. Показано, что, за исключением мутанта Tß16 (ЕП^-фено-тип), у которого произоала интеграция вектора в геном, все остальные полученные мутанты являются истинными транспоэант'ами. Од^ин из Ней++-аутато9 (ТЫ 2) содержал две копки трансиозона.

приводящих к возникновения Eif++- и Яей^-Фэнотипоэ, плаз;гздноя и хроиосониап ДНК всех получениях цутантов была разделена элоктрофоретическшл методом, перенесена на нейлоновый фильтр и обработана гг.бридиза-циониой неткой, содержащей Тп5. В результате показано, что у 3-х эффективных н б-ти Пей++-транспозантов инсерцяя Тп5 произошла в хроьюсоетуа ДНК, у остальинх 26 - в плазииднув. Для выяснения, в какую из цогаплазмид произоала встройка Тп5, они были перенесены в делецпсншй мутант ZB121 R.melilotl, который гагроко используется в этих целдз, что позволило локализовать инсерции Тп5 у 6 Eil"4" и 29 Неа^-иутайтов (табл.2). У иутанта ТЫ2 обе инсерции Тп5 локализованы на хрокосомз. В результате можно заключить, что мутации, приводядае к возникновению Eli++-феноткпа, распределены по геному ризобий более-менее равномерно. В отличие от ЕИ4+- мутаций, мутации вызываетщэ Ней++~фенотип, локализованы преимущественно на мегзплвзииде ß (табл.2).

Таблица 2. Локализация инсерций Тп5 в геноме различных типов Цутантов штамма СХМ1-188*

Штааи Фенотип Получено мутантов Локализация Тп5 мутаций хромосоиа M1 М2

СХМ1-188 ЕГГ14" б 3 1 2

, ++

Red 29 6 - 23

2. Анализ культуральных, фкзиолого-биохимических н симбиотических свойств Ие^^-мутантов.

Поскольку повыиение способности ризобий восстанавливать ТТВ Моает быть обусловлено изменением клеточной стенки мутантов, вся

полученная коллекция била проверена на способность к росту на средах, использующихся для отбора мутантов с измененной клеточной поверхностью (0,02 % Конго красный, 0,1X дезокскхолат натрия). В результате било отобрано 9 мутантов (ТЫ, ТЬ2, ТЬ9, ТМ2, ТЬ13, №16, ТЬ17, ТЬ28, ТЬ29) с четкими отличиями по форме и окраске колоний ог колоний, образуемых итаммом дикого типа.

была проанализирована в двух кикровегетационных опытах (Табл.3). По данным опытов среднее значение массы растений, инокулированнш 21 мутантом, превышало массу растений, инокулированных штаммом СХМ1-188, на 20 % и более. Кроме того было обнаружено, что один Redf+-MyTairr, тъгв, имо(;т пониженную симбиотическую активность. Таким образом было установлено, что большинство Red++-MyTaKTOB обладают повышоиной симбиотической активностью.

Таблица 3. Симбиотическая активность Red44-мутантов (средние значения по двум опытам).

Масса инокулировашшх растений превышает контроль (инокуляция штаммом СХМ1-188) на

0-20% 20-30% 30-40% 40-56%

Red4'- ТЬ6,ТЬ8,ТЫ2 Tb5.Tt)7,Tb10,Tb14, ТЫ.ГЬЗ, ТЬЗ,ТЬ4, мутанты ТЬ13,ТЫ 9 ТЬ15,ТЫ7,ТЫ8, ТЫ1,ТЫ6, ТЬ9,ТЬ21 _Tbg3,Tb29 ТЬ20,ТЬ24,ТЬ27 ТЬ22 ТЬ25,ТЬ2б

Учитывая то, что способность микроорганизмов восстанавливать ТТВ во многих случаях зависит от величины потока электронов от ЦТК в дыхательную цепь, мы оценивали активность функционирования ЦГК по интенсивности выделения ими COg в атмосферу.

Напервом_этапе_ш_1фоанажзи1ювада

1) всех полученных нами Redf+-мутантов (Табл.4); 2) штамма СХМ1-180, на основе которого получены Red4+-MyT8HTii, его эффек-

тивного транспозанта Т798; 3) штамма СХМ1-105 и его эффективного

транспозанта Т482; 4) двух природных йзолятов 105-2tr И 105-2* из коллекции лаборатории (Табл.5).

Полученные результаты показали, что, за исключением двух мутантов , ТЫ б и тьгв. все остальные ТЪ-мутанты обладали

Таблица 4. Активность выделения С02 статическими культурами Йе<1+4"-мутантов.

Содержание С02 в атмосфере сосуда при выращивании Иес1+4мутанта, превышает СХМ1-188 на

___ 20-30% 30-43%

Нес1"н'- ТЫ6.ТМ8, ТЬ5,ТЬ9,ТЬ10,ТЬ11,ТЪ12 ТЫ ,ТЪ2,ТЬЗ, мутанты ТЬ20,ТЬ2б, ТЬ13,ТМ4,ТЫ5,ТЫ7,ТЬ21 ТЬ4,ТЬ6,ТЬ7, тьгв ТЬг2,ТЬ23,ТЬ24,ТЬг5,ТЬ27 ТЬ8,ТЬ19

статистически достоверно повышенной активность» выделение С02 в чистой культуре. В то ае время, эффективные транспозанты штаммов СХМ1-188 и СХМ1-105 на отличались по активности выделения С02 от родительских штаммов. Природные изоляты 105-2» и 105-2гг Я.теШои существенно различались между собой по этому признаку.

Таблица 5. Активность дыхания чистых культур штаммов К.теШоИ

Штаммы Ие<1-фенотип Концентрация С02 в атмосфере сосуда

СХЫ1-188 2,34

Т67 ++ 3,06

Т619 ++ 2,92

Т624 ++ 2,81

Т626 ++ 2,66

Т798 + 2,41

СХМ1-105 + 2,20

Т482 + 2,38

105-2гг + 1,94

105-2« 3,31

НСР0,0 5 0,28

Вызывает интерес тот факт, что штаммы Я.теШои, имеющие общее происхождение со штаммом СХМ1-188 и не обладающие Иег1++-фе-

нотипом, не различаются по активности даьшш в чистой культуре» несмотря на то» что среда этих близкородственных иташов имелись транспозанты с повышенной симбиотической эффективностью.

Полученные результаты позволяют предположить, что у большинства Red++- мутантов возникновение Неа++-фенотипа не связано с изменением структуры клеточной поверхности, поскольку их пошшен-ная способность восстанавливать ТТБ сопровождается повышением их симбиотической эффективности и дыхательной активности.

Возможным исключением являются цутантн ТЫ6 и ТЬ28, у которых не наблюдалось изменение дыхательной и симбиотической активности и у которых произошли нгг.онекия в способности к росту на среде с Конго красным и дезокенхолатои натрия. Вероятно в данном случае способность восстанавливать ТТВ вызвана изменением в структуре их клеточной поверхности.

Дыхательная активность трех Red^-MyTairroB, ТЫ6, ТЫ 9, TL24 и их транедуктантов, полученных в результате переноса маркера Кга** в пггаым независимого происхождения 15-1, была проверена более детально (табл.6).

Таблица 6. Дыхательная активность мутантов и их транедуктантов.

Содержание СО«, в атмосфере сосуда

Штамм--±-Z.-

% В % К СХМ1-189 В % К 15-1

CXMI-I88 2,44 100 134

I5-I 1,81 74 100

ТЬ7 3,04 124 168*

ТдТЬ? 4,25 1?4+ 235*

ТЫ9 3,56 146+ 197*

ТдТЫЭ 3,33 136 184*

ТЬ24 3,58 147+ 198*

ТдТЪ'24 3,11 -127 172*

НСР0,05 0,95

содержание С02 в атмосфере сосуда при выращивании

мутанта достоверно выше, чей при выращивании исходного штамма СХМ1-18в (15-1), Р<0,05.

Анализ способности рецишентного штамма и трансдуктантов восстанавливать ТТВ показал, что штамм 15-1 обладает Веб+-фенотнпом, как и штамм СХМ1-188, а тренспозанты приобретают йей++-фенотип. Как транспозанты, так и трансдуктанты, характеризуются повышенной активностью выделения С02 в атмосферу по сравнению с СХМ1-188. Эти результаты подтверждают транспозоновую природу полученных мутаций и говорят о том, что возникновение Кес1++-фенотипа не является свойством одного конкретного штамма.

Для поиска взаимосвязи между дыхательной и скмбиотической активностью бактероидов И.теШои на следующем этапе работы мы использовали, кроне четырех Бей^-мутантов, четыре генетически родственные им штамма и два штамма независимого происхозвдегая. Все 10 штаммов различались либо по симбиотической эффективности, либо по восстановительному потенциалу клеток, либо по обоим признакам одновременно. На первом этапе был проанализирован на среде с ТТБ характер росте 4-х генетически близких штаммов Я.теШои: штамм СХМ1-188 и его эффективный транспозант Т798{ штамм СпМ1-105 и его эффективный транспозант Т482; два природных изолята 105-2и и 105-2*г из коллекции лаборатории, также имеющих разную сиыбиотическую эффективность. Оказалось, что все эти штаммы не различаются по способности к восстановлению ТТБ. причем их способность восстанавливить ТТВ была значительно ниже, чем у Кей^-ыутантов. Для изучения дыхательной активности бактероидов мы использовали в качестве субстратов как сукцинат, так и НАДН+, который непосредственно участвует в окислительно-восстановительных реакциях дыхательной цепи. В результате было показано, что у мутантов с Яей^-фенотипом скорость дыхания была в 2-5 раз выше, чем у исходного штамма (таблица 7). В то же время ЕП4"4"-мутанты Т798 и Т482 не отличались от родителей. Оба природных изолята, 105-2гг и 105-2*, проявляли дыхательную активность на уровне Ией^-мутантов, несмотря на то, что по реакции с ТТВ они не отличались от штаммов СХМ1-105 и СХМ1-188. Таким образом, показано, что мутвнты, отобранные на среде с ТТВ, действительно обладали более высокой дыхательной активностью в симбиозе с люцерной, чем исходный штамм.

Таблица 7. Активность дыхания чистых культур и гоаогеиатов

бактероидов шташов И-теШои.

Шташы Дыхательная вктивность чистых культур ризобий Скорость дыхания, мкМ 02/мин.мг.белка, (ср.зн.З-х повтори)

СХМ1-188 + 3,2 ± 0,15

ТОТ ++ 14,2 ± 0,7

Т619 ++ 15,5 ± 0,75

Т624 . ++ 6,8 ± 0,3

Т626 ■н 13,4 ± 0,6

Т798 + 3,5 ± 0,15

СХМ1-105 + 5,0 ± 0,25

Т482 + 5,2 - 0,25

105-2*Г + 10,3 ± 0,5

105-2»» . 4- 16,1 ± 0,8

Исходя из зтого, можно заключить« что повышенная дыхательная активность бактероидов не является необходимым и достаточным условием их повышенной сиыбиотической активности. Другими словами, одним из большого числа факторов, влияющих на симбиотическую активность ризобий, является активность их эндосимбиотического дакания. Однако следует учитывать, что все это верно только для генетически близких штаммов, например для мутантов одного штамма, поскольку и дыхательная активность бактероидов, и их симбиотичес-кая эффективность, являются полигонными признаками и при сопоставлении их проявления у генетически неродственных штаммов, далеко не всегда можно выявить прямые корреляции между ниш.

В заключение хочется остановиться на результатах анализа цитохромного состава группы ТЬ-мутанков, предоставленных нами группе др.М.Соберона, (Мексика). В рёзультате этой работа бал проанализирован состав цитохрс«ов целых клеток штамма СХМ1-188 и девяти Иес1++-нутантов, полученных на его основе (ТЫ, ТЬ2, ТЬ7, ТЬ9, ТЫ2. ТЫб, ТЫ7, ТЫ9 й ШЬ24) В стационарных культурах. %

В клетках стационарных культур штамма СХМ1Т188 происходит ■ репрессия терминальной оксидази аа3-тйпа. Эти результаты согласу-

ются с данными о том, что 7 различных видов риэобий в стационарных культурах происходит репрессия цитохромоксидазы аа3-типа.

Основываясь на результатах спектрального анализа, все мутанты были разбиты на три группы, в зависимости от обнаруженных в их спектрах изменениях. Так, У мутантов ТЫ и ТЫ2 произошла дереп-рессия терминальной оксидазы аа^-типа; у мутантов ТЬ2, ТЬ7, ТЬ9, ТЫ? и ТЬ24 произошла дерепрессия терминальной оксидазы Ь-типа. Эта оксидаза не экспрессируется в свободно-живущих клетках ризобий и, по всей видимости, является цитохромоксидазой сЬЬд-типа, на которую оканчивается симбиотическая цепь транспорта электронов. У мутантов ТЫ б и ТЫ 9 произошла дерепрессия терминальных оксидаз аа3-типа и сЬЬ^-типа.

Косвенным доказательством того, что у Кес^-иутантов имеются качественные изменения в составе клеточных оксидаз говорит тот факт, что большинство из них, за исключением ТЫ и ТЬ13, приобрели чувствительность к гербициду 2М-4ХМ (2-метил-4-хлорфенок-снмасляная кислота), который относится к группе разобщителей окислительного фосфорялирования микроорганизмов.

Эти данные полностью подтверждают наши предположения, что у группы Ве<1++-мутантов изменение клеточного окислительно-восстановительного потенциала вызвано изменением активности функционирования дыхательной цепи транспорта электронов.

ВЫВОДЫ

1. С помощью Тп5-ыутагенеза у штамма СХМ1-188 И.теШои получена коллекция транспозантов, содержащая 29 мутантов с повышенной способностью восстанавливать индикатор клеточного редокс-потекциала, бромид трифенилтетразолия (Еес^-фенотип) и 6 мутантов с повышенной симбиотической эффективностью (Е1 £++-фенотип). Частота возникновения Тп5-мутантов с НесГ^-феНотипом составила 3x10-3, что статистически достоверно ниже частоты возникновения мутантов с ЕХГ^-фенотипом (2,4х10~2).

2. Генетический анализ получвкшх цухантоь показал, что Есе полученные Eff++- и Red++- мутанты, за исключением одного ЕП++-мутанта (Те16), являются истинными трааспозантами. Выявлен один Red++-MyTaHT, ТЫ2, содержащий в своем геноме две копии транспо-зона. 23 из 29 мутаций, вызывающих Кей++-фенотип, локализованы на мегашшзмидв 2, остальные 6 - на хромосоме.

++

3. На основании анализа распределения Red -транспозантов по грушам, в зависимости от размеров фрашзнтов тотальной ДНК (рестрикция Hlndlll), гибридазущихся с зондов Тп5, показано, что в геноме R.meliloti на кегаплазвддй 2 находятся, по крайней мере, девять локусов, мутации в которых приводят к изменению окислительно-восстановительного потенциала свободно-живущих ризобий.

4. В условиях микроьегетацнонных опытов был проведен анализ сиибиотическмх свойств всех 29 Red++-MyTaHTOB. Установлено, что 21 из них обладает повышенной симбнотической активностью по сравнению с родительский штаммом СХМ1-188. Обнаруженный нами факт связи между способностью свободно-живущих клеток R.meliloti восстанавливать ТТВ и симбиотической эффективностью позволяет осуществлять направленный отбор мутантов ризобий с повышенной синбиотической активностью.

5. Анализ активности выделения С02 свободно-живущими клетками 29 Неа++-мутантов показал, что 27 из них отличаются от родительского штамма повышенной дыхательной активностью в чистых культурах. Анализ активности поглощения 02 эндосимбиотическиыи формат четырех Red^-мутантов, ТЬ7, ТЬ19, ТЬ24 и ТЬ26, обладающих повышенной . симбиотической эффективностью и дыхательной активностью в чистых культурах, показал, что и бактероида этих мутантов имеют значительно более высокий уровень дыхательной активности. Это позволяет заключить, что возникновение Еей++-фенотипа у данной группы мутантов связано с одновременным повышением дыхательной активности свободно-живущих клеток, их эндосимбиотических форм, а также с увеличением симбиотической эффективностью.

г

6. При переноса при трансдукции маркера Кга из трех Red -мутантов штамма СХМ1-188 (ТЬ7, TW9, ТЬ24) в штамм независимого происхождения, 15-1, било показано, что во всех случаях трансдуктанты наследуют Red-фенотип и уровень дыхательной активности донорного штамма. Это подтверждает транспозоновую природу полученных мутаций, а также говорит о том, что возникновение

Неб^^-фенотипа не является свойством одного конкретного штамма.

++

7. Анализ цитохроыного состава стационарных культур Red -мутантов показал, что изменение их клеточного редокс-потенцизла вызвано присутствием в клетках терминальных оксидаз аа3- и b-типа, отсутствующих в клетках штамма родительского типа.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Шарыпова Л.А., Чеснокова О.Н., Фомина-Ещенко Ю.Г., Юргель' С.Н., Скмаров Б.В. 1992. Локализация и клонирование факторов симбнотической эффективности у R.melllotl. Материалы VI с'езда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Генетика, 1992.

2. Юргель С.Н., Симаров Б.В. Получение Тп5-мутантов R.raelilotl с измененным редокс-потенциалом и анализ их симбиоти-ческой эффективности. Генетика, приложение, 1994, т.30, с.188.

3. Сргель С.Н., Шарыпова Л.А., Симаров Б.В., Сырцова Л.А., Дружинин C.D., Садков А.П., Шкондина Н.И., Кононихина O.K. Получение мутантов R.melllotl с повышенной способностью восстанавливать ТТВ и анализ их симбиотической и дыхательной активности. Тезисы докладов. 9-й Баховский коллоквиум по азотфиксации, 1995, Москва. Пущино. с.30.

4. Yurgel.S.N., Sharypova.L.A,, Syrtsova.L.A., Sinjarov,B.V. Ieolation of R.melllotl mutants with Increased TTB reducing activity. Study of their symbiotic properties and respiration. 1-et European Nitrogen Fixation Conference. Rise,G.В., Endre.C. eda., Officlna Frees, Szeged, Hungary, 1994, c,299.

5. Yurgel.S.N., Sharypova.L.A., Syrtoova.I.A., Slnarov.B.v. Study of R.meliloti mutants with increased respiratory activity. Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. I.A.Tikhonovich et al., ede., Kluwer Academic Pibliehere, 1995, 424.

6. Zatovska.T.V., Kosenko.b.V., Ushakov.K.V., Yurgel.S.N., Simarov.B.V. LPS-R.mellloti mutante with altered surface and their eymblotic. properties. Nitrogen Fixations Fundamentals and Applications. I.A.ïlkhonovich et al., ede., Kluwer Academic Piblishers, 1995, 425.

7. Юргель С.H., Шарыпова Л.А., Сырцова Л.А., Грудикин С.Ю., Садков А.Р., Сиыаров Б.В. Дыхательная активность и симбиотическая эффективность у клубеньковых бактерий R.meliloti. Микробиология, 1996, N4, р.517-521.

Тип В НЧи#4,ЗоЬ. ¿m. WH/xl -9С>