Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и анализ мутантов Nicotiana Plumbaginifolia, стойких к действию соединений с антимикротрубочковой активностью

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ мутантов Nicotiana Plumbaginifolia, стойких к действию соединений с антимикротрубочковой активностью"

ЛКЛДКМ1Н ПАУК VKPAÏlItl 1ИСШТУТ KJUTHUIIOÏ ШОЛОПГТЛ [CIK.TII'IIIOÏ ШЖКПКИ!

pvs ОД

IIa 1>1>чьах iniKütHH-y

СП'ЛШШОК НидЫ MiixuiLitnmi

ОДЕРЖАН!! Я ТА AHAJ1I3 МУТАНТГВ NICOTIAN А PLUMBAG [NI FOLIA, СТГЙКИХ ДО ДП СПОЛУК 3 АНТИМ1КРОТРУБОЧКОВОЮ АКТИВШСТЮ

Cneniajthuie.mb Dil. III)./Л. - генетика

Л и т II (I <; ф с () м г

Hiicqnnuiï на :>i<<óyrin науьчшош сгунинн кандидата (Нолопчмнч наук

1! и 'i и

10 0 3

Робота виконана на кафедр! кл1тннно! б1олог11 та генетично! 1нженер11 61 олог1 много факультету Швського ун1верситету 1н. Тараса Шевченка

Науковий кер1вник - доктор б1олог1чних наук,

ст. н. сп1вр. Блюм Я. Б.

0ф1ц1Пн1 опоненти - доктор 61олог1чних наук.

професор Малюта С. С.

кандидат б1олог1чних наук, ст. н. сл1вр. Кучук М. В.

Пров1дна орган1зац1я - 1нститут Ф1з1олог11 росллн та

генетики АН Украш;

Захист дисертацН в!дбудеться оКсётиЛ 1993 р. 0 год. на зас1данн1 спец1ал1зовано! ради Д.01.19.01. в 1нститут1 кл1тинно1 СЮлогП та генетично! 1нженер1! АН Укра!ни /252143. м. Ки1в, вул. акад. Заболотного, 148/.

3 дисертац1ею можна ознаПомитись в б1бл1отец1 Гнституту кл1тин-но! б1олог11 та генетчно! 1нженерП АН Укра1ни

Автореферат роз1сланий "9" ^б^Ш^ЧЭЭЗ р.

Вчений секретар спец1ал1зовано! ради, кандидат б1олог!чних наук

А

/^ичл/)

Л. В. Малишева

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальн1сть проблем«. За останне десятил1ття ,пом1тне эростання 1нтересу вчених до вивчення цитоскелету. Одним 1з tiaftOlльш важливих структурних компонеит1в цитоскелету е м1кротрубочки, -як1- забезпечу-ють процеси кл1ТШ1Н01 рухливост1. Шдтримання форми кл1тини. форму-вання веретена под1лу, транспорт везикул або мембранно-зв"язаних ор-ганел, беруть участь у мЗграцП ядер тощо [Lloyd. 1982; Фултон, 1987).

Неэважаючи на значн! yonixn у вивченн! структури 1 функцШ м1кротрубочок. до цього часу так1 молекулярно-б1олог1чн1 аспекта 1х функц1онуваиня. як тонк1 механ1зми збирання-розбирання м1кротрубо-чок. IX взаеыод1я з 1ншими скелетними структурами кл1тини .1 органе-лами, взаемод1я з хромосомами i ix розд!лення в м1тоз1. вивчен1 не-достатньо. ВирИвення вс1х перел1чених вище проблем може бути в значн1й Mlpl полегшене при використанн1 для вивчення структури 1 Функц1й м1кротрубочок в1дпов!дних мутантних л1н1й кл1тин, що характеризуются наявн1стю мутантних форм б1лк1в м1кротрубочок 1. в першу чергу, тубул1ну.

Найб1льш поширеним прийомом отримання таких мутант1в е селекц1я л1н1й кл1тин. ст1йких до д1х сполук з антим1кротрубочковою активн1с-тю. На сьогодн1шн!й день так1 мутанта отриман1 у тварин 1 нищих еу-кар1от [Oakley, 1985]. Однак, кл1тинна селекц1я до цього часу не ви-користовувалась для одержання мутант1в за тубул1ном у представник1в вищих рослин.

Мета i завдання досл1дження. В зв'язку з викладеним вище. метою даног робота було отримання за допомогою метод1в кл1тинно! селекцП мутантних л1н1й рослин Nicotiana plumbaginifolia. ст1йких до дЦ сполук. що характеризуються антим1тотичною активнЮтю 1 при цьому або порушують процеси пол1меризацЦ тубул1ну (ам1профосметил 1 триф-люрал1н), або ж стабШзують м1кротрубочки (таксол).

В1дпов1дно до поставлено! мети в завдання експериментально! робота входило:

1. Вивчити tn vitro вплив ам1профосметилу (АПМ). трифлюрал1ну (ТФЛ) 1 таксолу (TAX) на протопласта, калусну тканину 1 рослини N. pimbaglnifolia з метою п1дбору оптимальних умов для сеяекцП ст1йких до даних сполук л1н1й N. pimbaglnifolia.

2. Отримати л1н11 рослин N. plumbaginifolia, ст1йк1 до д11 АПМ, ТФЛ и TAX.

3. Вивчити ст1йк1сть отриманих л1н1й N. plumbaginifolia до АПМ. ТФЛ 1 TAX пор!вняно з контролем.

4. Провести ПбридолоПчний анал1з отриманих мутант1в з метою

визначення генетично! природ» 1х ст1йкост1 до АПМ, ТФЛ i TAX.

5. Провести анал1з одержаних л1н1й на наявнють у них перехрес-но! crlilKocTl до сполук з аналог1чним механ1змон д11 на м1кротрубоч-ки.

6. Пор1вняти ст1йк1сть м1кротрубочок в протопластах отриманих Л1н1й та м1кротрубочок в протопластах контрольних рослин до АПМ, ТФЛ 1 TAX за допомогою методу непрямо! 1мунофлюоресцентно! м1кроскоп!!.

.7. Провести б1ох1м1чний анал1з отриманих л1н!й для 1ден-тиф1кац11 мутантних 1зоформ тубул1ну.

Наукова новизна i практична ц1нн!сть роботи. Вперше у вищих рослин за допомогою методу прямо! позитивно! селекцП in vitro отри-ман1 л1н1! N. plumbaglnifolia. ст1йк1 до д1! сполук, як1 руйнують м1кротрубочки - амШрофосметилу, трифлюрал!ну. Вперше у вищих рослин отриман1 л1нП JV. plumbagtnifolla, ст1йк1 до д1! сполуки, що стабШзуе м1кротрубочки - таксолу. Встановлено, що ст1йк1сть отриманих л1н!й до досл1джуваних речовин забезпечуеться за рахунок му-тац1й в генах, що кодують 1зоформи р-субодиниц! тубул!ну; Показано наявн1сть в отриманих л1н1ях перехресно! ст1йкост1 до сполук з ана-лог1чним механ1змом д1! на м1кротрубочки.

0триман1 нами мутанти N. plumbaginifolia, що характеризуються ст1йк!стю до герб1цид1в фосфороам1дного 1 дин1троанШнового рлд1в -АПМ 1 ТФЛ, можуть бути в майбутньому використан1 для 1дентиФ1кац1! гена р-тубул1ну, який забезпечус ст1йк1сть до данях герб1цид1в, його клонування 1 перенесения у важлив1 с!льськогосподарськ1 культури для отримання IX ст1йких сорт1в.

0триман1 нами ст1йк1 до АПМ, ТФЛ 1 TAX рослини N. plumbaginifolia. що мЮтять мутантний тубул1н, використовуються як один 1з партнер^, при соматичн1й г1бридизац1!. Наявн1сть молекулярного маркера у структур1 м1кротрубочок дозволить з'ясувати, яким чином в1дбуваеться реорган!зац1я систем МТ батьк1вських кл1тин при соматичн!й г!бриди-зац1! 1 за рахунок яких структурно-функцюналышх особлнвостей веретено под1лу забезпечус правильнЮть розходження в м!тоз1 хромосом, успадкованих в1д р1зних батьк!в.

Результата дисертацШю! роботи можуть використовуватися в пе-дагоПчному процес! при вивченн1 окремих тем курс1в "Кл1тинна се-лекц1я", "Основи б1отехнолог1! рослин" та 1н. В даний час результата застосовуються у навчальному npoueci на кафедр! кл1тинно! б1олог11 та генетично! 1нженер1! Ки!вського ун1верситету 1м. Тараса Шевченка при вивченн1 окремих розд!л1в курсу "Кл1тинна селекц1я", "Скелетн1 структури кл1тини", а також на кафедр1 ботан1ки Тер-ноп1льського пед1нституту при вивченн! окремих розд1л!в курсу "Основи б!отехнологП рослин".

OciioBHl положения, що виносяться на захист. На ochobI пропеде-них досл1джень та узагальнення власних результата 1 л1тературних даних на захист виносяться наступн1 положения: —1.Специф1чна д1я АПМ, ТФЛ i TAX на м1кротру0очки кл1тин N. pliimbaginifolla фенотипТчно~виражаеться~у ирнгн!ченн1 росту тканин I кл1тин, зупинц! росту клп'ииних колом 1й, упов1льненн! утворення ко-рен1в. В експериментах по селекцП мутант1в N. plwnbaglntfolta. ст1йких до дП АПМ. ТФЛ 1 TAX, сл!д використовуватн наступи) концен-трацП кожно! 1з речовин; АПМ - 3-5 мкМ. ТФЛ - 5-12 мкМ 1 TAX - 1-2 мкМ.

2. Ст1йк1сть отриманих л1Шй N. plmbagtnlfolla до АПМ. ТФЛ 1 TAX е.насл1дком стаб1лышх генетичних зм1н 1 пов'язана з дом1нантни-ми ядерними Мутац1ями.

3. НаявШсть в отриианнх АПМ- 1 ТФЛ -стШих л!н1ях перехреожн ст1йкост1 до сполук з аналог1чним механ1змом д11 на м1кротрубочки е доказом того, що мутац1я пройшла в одному з ген1в; як1 кодують тубу-л1н.

4. За допомогою методу непрямо! 1мунофлюоресцентно1 м1кроскоп1г встановлено, що кортикальна с1тка м1кротрубочок в 1зольованих протопластах отриманих л1н1й характериэуеться п1двищеною ст1йк1стю до АПМ. ТФЛ 1 TAX, в1дпов1дно. Це може служити п1дтвердженням того, що ст!йк1сть с результатом мутац1Я у генах, що кодують тубул1н - основ-ний б1лок м1кротрубочок.

5. Ст1йк1сть отриманих л1н1й до досл1джуваних речовин пов'язана 1з зм1нами в 1зоформах р-субодиншЦ тубулШу, що можна пояснити му-тац1ями в генах, що кодують дан1 1зоформи.

Апробаи1я роботи: Результати дисертац1йно! роботи допов1дались на: 1. 8th International protoplast symposium. June 16-20, 1991. Uppsala, Sweden; 2. Satellite of the 15th International congress of biochemistry "Frontiers of Biotechnology in Agriculture - 1990", August 1-4, 1991, Sea of Galilee, Israel; 3. I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", 20-22 ноября 1991, Пущино, СССР; 4. Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу". 14-18 октября 1991, Черновцы, Украина; 5. IV Всесоюзной научной конференции "Экологическая генетика растений, животных, человека", 20-21 ноября 1991, Кишинев, Молдова; 6. Конференции молодых ученых "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики", 26-28 мая 1992, Киев, Украина; 7. II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", 18-20 мая, 1993, Пущино. Россия; 8. II 3"1зд1 товариства Ф1з1олог1в Украши, 4-8 жовтня 1993. Ки1в. Укра1на.

Публ1кац11. OchobhI результати дисертацП викладен! у 10 дру-

кованих роботах, список яких наведено у к1нц! автореферату.

Структура та об'ем роботи. Дисертац1я складасться 1з вступу, огляду л1тератури. опису матер!ал1в 1 метод1в досл!дження. викладен-ня результата досл!дження та ïx обговорення. заключения, висновк1в 1 списку л1тератури, який включае 250 нчйменувань. Робота м!стить 23 малюнки 1 10 таблиць.

МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ.

В робот1 використовували такий рослинний матер1ал: дипло!дн1 1 гапло!дн1 рослшш Nicotiana plumbaginifolia: калусну тканину N.plumbaglnifolia: нас1ния рослин N. plumbaginifolia. Як селективн1 агента використовували герб!циди: ам1профосметил (Cheniagro, Division, Вау-chemCorp., США), трифлюрал1н (DowElanco, США) .1 алкало!д таксол (¡¡CI. NUI, Bethesda, США).

Для 1ндукцП калусно! тканини нар1залк стерильне листя гапло!д-них рослин N. plumbaglnifolia 1 пом1цали ка поживне середовище МС [Hurashlge & Skoog, 1962], до складу якого входили ф1тогор.мони 1 мг/л ЕАП (6-бензиламинопурин) 1 1 мг/л НОК (I-нафтилоцтова кислота). Чашки з рослиннпм матер1алом культивували в термостат1 при тем-ператур1 +25°С. Протопласта вид1ляли 1 культивували за Е1дпрацьова-ною ран1ше методикою [Сидоров и др., 1985а]. Для регенерацП рослин використовували середовище РМОР [Sldorov et al.. 1982]. Стебла вко-р1нювали на безгормональному середовищ1 КС, ;. 1нколи з 0,1 мг/л НОК.

Для визначення концектраШ речовин, як1 1нг1бують р1ст калусу, кусочки калусно! тканини масою 0.35-0,46 г пом1щали на середовище МСмод (1 мг/л. БАП, 1 мг/л НОК), що мютило р1зн1 концентрац1! досл1джуваних речовин: АПМ - lxlO"7- IxlO"5 M; ТФЛ - IxlO"7 7 lxlO"4 M; TAX - IxíO"7- IxlO"5 M. Через 4 тижн1 калусну тканину зважували'1 визначали в!дносний прир1ст ïi маси. .

Для оц1нки впливу АПМ, ТФЛ 1 TAX на мезоф1льн1 протопласта N. plumbaginifolia 1зольован1 протопласта п!сля вид1лення культивували в р1дких поживних серэдовищах К3-КМ CNagy & Mallga, 1Э76] або КМ8р [Као & Michayluk. 1975], що мЮтили р!зн1 концентрацП досл1д-жуваних речовин: АПМ - lxlO"7 - lxlO"5 M; ТФЛ - lxlO"7- IxlO"4 M; TAX - lxlO"7- lxlO"5. M. К1льк1сну оц1нку вижизання проводили на основ!-репродуктивного г,отенц1алу одиничних кл1тин (здатн1сть к.л!ткн до утворення колон1й).

Для виГлення мутант1в 1з ст1йк1стю до дП -АПМ, ТФЛ 1 TAX як вих1дний матер1ал використовували калусну тканину 1 мезоф1льн1 протопласта гапло!дних рослин N. plumbaginifolia. П1дбираючи селективн1 концентрацП досл1джуваних речовин, прймали до уваги той факт, що

вмЮт кожного 1з них у середовищ! не повинен перевищувати т1 концентрацП, при яких повн1стю !нг!буеться pier тканини.

3 метою 1ндукц1! мутацШ як мутаген використовували у-опром1-нення в доз1 1.5.крад. Щоб запсб1гти утворенню в середсвшц! токсич-них речовин п!д д1ею 1он!зуючого опром!нення. ~ протопласта в1дмивали в1д середовища, в якому проводили опромтення. 0пром1нен1 протопласта культивували у р1дкому поживному середовищ! К3-КМ у неселск-тивнях умовах. Селективнпл тнск зд1Пснювали на стадII трьох-п'яти цикл1в КЛ1ТИННОГО под1лу. П1сля 2-3 тяжи!в культивування колон11 переносили для регенерац!i на агарпзоване середовище RM0P, що м1сти-ло селективн1 концентрат! АПМ, ТРФ 1 TAX, в1дпов!дно. Роелини, як! регенерували на селективних середовищах. переносили на середовище RU0P без селективних агент1в, а дал! на середовище мс.

Для отримання АПМ-, ТФЛ- 1 ТАХ-ст1йки'х л1н!й через калус оп-ром1нений матер1ал культивували на середовищ1 МСмод. яке мЮтило селективн!. концентрацП антим1кротрубочкових агент!в. Д1лянки калусу, як! не загинули внасл1док дП АПМ. ТФЛ 1 TAX, в1дпов1дно. для 1ндукц1! органогенезу переносили на середовище RM0P, що також мЮтило' селективн! концентрацП даних речовин. Остр1вки тканини, яка позеленена. переносили на середовище RMOP-без селективних агент1в для подальшоТ регенерат! та органогенезу. Отриман! рослшш-регенеранти переносили ка середовище МС.

Для первикно! перев1рки регенерант1в на ст1йк!сть до АПМ. ТФЛ 1 ТАК. б!дпов!дно, ix листов! пластинки 1 дистсз1 пластинки контрольна рослин висаджузали на середовища RK0P, «о Ml стали селективн 1 ко.чцентрзц!! досл!джуваних речовин. За здат:-;1ств утворювати калус з каступноы регенерац1ею визначали ст!йк!сть стриманих клон!в до е1дг.ов1дккх селективних агснт:й. Перринну перев;ркч, зд1йснювали такой на piBiil ;:сслин. Г.ор1вк»вапи ьдлтяЮть кокгрольних 1 одержаних рослин до росту i ксреаеут&с^е!«:! иа безгормональнкх середовищах МС. що м!стили селективн! концентрацП АПМ. ТФЛ 1 TAX, в!дпов1дно. Пор1вн:-оьд/.:-> прир!ст : -уг/су контрольнкх 1 отриманих рослин на селективних cepfe£osas;ax КСмод чер~з i тижн! пЮля посадки калусних тканин. П1д час робота з протопластами виживання клИин, вид1лених :з одержаних в результат! селекцП клон!в. пор!внювали з таким в конт-рсд1. культивуючи обидва види протопласт!в в середовищ! К -NM. що ххстило еелткьк: концентрацП досл!дауьаних речовин. Виживання клШн визначали як процентне в1диоаекня клон1в, як! вижили, до за-галыш кЬ".ькоот1 вис!кни>, кгЛтан.

гсл саиозашлення : перехреского запилення насПшя коктролъних !"ст!йких рослин стершизували ! висаджували на в!дно-si дн! селективн! середовища. Анал!зуючи процент проростання нас!ння.

одержаного в1д самозапилення 1 перехресного запилення, робили висно-ьок щодо генетично! природи ст1йкост1 отриманих л1н1й.

3 метою з'ясування ст1йкост1 м1кротрубочок до д11 використову-ваних речовин в протопластах досл1джуваних л1к1й готовили препарата за стандартним протоколом Мейджер i С1ммондс [[Meljer & Slmmonds, 1988]. Як первинн1 антит1ла вшсористовуьали мишинi моноклональн1 ан-тит1ла Ти-01 проти а-тубулину 1 Tu-13 проти р-тубул1ну, надан1 д-ром В. В1кл1цьким (1нститут молекулярно! генетики, Прага, Чеська Рес-публ1ка).

Вид1лення 1 очистку тубул1ну 1з мезоф1лу Ñ. plumbagintfolia проводили за методом Morejohn та 1н. (Morejohn & Fosket, 1986] з внесеними нами эм1нами. Двом1рний електрофорез проводили за методом O'Farrell [O'Farrell. 1975]. 1муноблот1нг субодиниць тубул1ну проводили за методом Towbin та 1н. [Towbln et al., 1979].

П1д час статистично! обробки експернментальних даних використо-вували стандартн1 методи обробки результата [Деркач, 1963; Урбах, 1964].

РЕЗУЛЬТАТИ Д0СЛ1ДЖЕНЬ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

I. Одержання мутант1в рослин N. plmbagínifolia, ст!йких до дЦ ам1-профосметилу, трифлюрал1ну i таксолу.

Вивчення впливу ам1проФо?мет:1ЛУ. триФл»рал!ну 1 таксолу на рос-лини N. vlumbazlnifolla. калус та протопласта. В1домо, що АПМ 1 ТФЛ с одними з найб1льш ефективних антим1кротрубочкових сполук, як1 руйну-ють с1тку м1кротрубочок рослинних kjiIthh [Morejohn & FosKet, 1984; Vaughn & Vaughan, 1938]. Вккористання TAX як одного 1з с-елективних агент1в п1д час отримання мутант1в ст1йкост! зумовлене тим, що TAX е поки що единим продуктом природнього похождения, який 1нг1буе про-цеси депол1меризацП м1кротр.'бочок [Stilff et al.. 1980]. Однак, чут-лив1сть до цих речовин може ьар1ювати в залежност1 в1д об'ект1в, на як1 вони впливають. Току на першому етап1 досл1дження вивчали вопив даних герб1цид1в 1 алкало!да на рослнни N. plumbaglnifolia, калусну культуру 1 протопласт«, визна"ити концентратí досл1джуваних речовин, як1 гальмують р!ст рослин,. 1 концентрацП. що повн!стю подав-ляють його. Було виявлено, що вже при концентрацП lxlO"7 М АПМ. ТФЛ 1 TAX гальмують р1ст стебла 1 перешкоджають росту корен1в. При п1двищенн1 концентрацП герб1цид1в 1 алкало!да у поживному середо-вищ1 до 10~6 М р1ст стебла значно спов!льн»вався, а утворення коре-н1в припйчувалось повн1стю. Найб1льи сильнод1ючим на процес росту стебла 1 утворення корен!в серед досл1джуваних речовин е TAX: вже при концентрацП 8х10~7 М в1нповн1стю пригн1чуе утворення корен1в.

Специф1чна д1я АПМ, ТФЛ 1 TAX на калусну тканину Фенотипово

проявляеться в пригн1ченн1 Ii росту - калус починае темн1ти 1 гину-ти. Результата досл!дження впливу АПМ. ТФЛ 1 TAX на калусну тканину

N. plumbaginifalla показан1 на нал. 1а. 2а. За. в1дпов1дно. -Виходячн з отриманих результат^, нами були визначен1 селективи1 концентрацП досл1джуваних речовшГдля ~калусу~М:~ ptumbagtnt/oUa: -АПМ, як1 лежать в межах 3-5 мкМ. ТФЛ - 5-12 мкМ. TAX - 1-2 мкМ.

В результат! вивчення впливу АПМ. ТФЛ 1 TAX на протолласти N. plumbagiriifollü було встановлено. що, незважаючи на незначну р1зницю чутливост1 протопласт^ 1 калусу до дП зазначених вище речовин, в експериментах 1з селекцП через протопласта сл1д викориотовувати так1 ж концентрацП, як 1 у випадку селекцП через калус, а саме: АПМ - 3-5 мкМ, ТФЛ - 5-12 мкМ. TAX - 1-2 мкМ.

0тримап1 нами результата визначення д1апазон1в селективних концентрацП АПМ, ТФЛ 1 TAX для W. plmbaglnlfolla узгоджуються з дани-ми, в1домими з л1тературних джерел. Так, показано, що при обробц1 АПМ в концентраЩях 1-3 мкМ на протяз1 1 год кл1тин рослин, як1 культивуються в суспензП. в1н повн1стю депол1меризуе кортикальн! 1 м1тотичн1 м1кротрубочки [Falconer & Seagul 1987]. Встановлено, що порушення проходження м1тозу у коренев1й меристем1 пшениц1 (Triticum aestlvum) в1дбуваеться при дН 1 мкМ ТФЛ, а повне порушення м1тозу -при концентрацП 4 мкМ [Llgnovskl & Scott, 1972). TAX ефективно сгабШзус м1кротрубочки у р.^слинних кл1тинах при концентрации 1-10 мкМ [Weerctenburg Seagull. 198н].

С«лйкШЯ- [¡1..-ü.LLl'JL-...üiüiИ.Л____hH'MkmLiiUoНа. ст1йких до л!!

АПМ. ТФЛ t TAX В результат! селекцП через протолласти нами стрима-но 14 я!н1й j иьридбачуваною ¿тшк1сты до ам1профосметилу. 23 л!н!1 з пц'цдончуваною от1йк1ств ди трифлюрал1ну 1 7 л1н1й з передбачува-нию >.т1ик11:тю дч таксолу. Як в!домо, значка к1лыс1сть отриманих на свлек1'ивних сьродовшцах кл!тинних Л1н1й н^ с стаб1льними 1 певна частина з них втрачае свою ст1йк1сть при тривалому пасивуванн1 [Сидоров. 1990; Левенко. 1991). Для в1дбору стаб1льних л1н1й необх1дно Шдвищувати р1вень селиктиького фактора. Калусн! л1нП з передбачу-ваною от!йкЛстю до АПМ, ТФЛ 1 TAX. вШюыдно, отриман1 в результат! селекцП через протопласта. пров1ряли на стао1льн1сть ст1йкост1 1 ст1йк1сть до п1двищених концентрацШ досл1джуваних речовин. П1сля цього в1д1бран! калусн1 Л1Н11 переносили на середовище для регене-рацП, я к I- мЮтило ^елективн! концентрацП АПМ, ТФЛ 1 TAX, в1дпов1дни.

Сл1д в1дзначити. що о;ш1ею 1з няйбзльш складних прийлем д!д час одерж-лння мутанпв ctiumi.ti е .^¡.яШить ¡Пд^електованих калусних л1н1й ди рсГенерацП. Поршшн! pt лклентн! кл!тинн1 л1н1х п1д час иерев!рки на стаб1льн1сть експресп i¡знаки ст!йкост1 на протяз! ряду

Мал. 3. Крив) приросту <%) калусу Nicotiana plumiaginifolia в присутиосп ранга концентрашй такголу (TAX): а - контроль;

б - лжи, стшка до 2 мкМ TAX.

Мал. 1. Крив, приросту (%) калусу Nicotiana plumbagini/blia в вприсутносп ринит концентрашй амшрофооиегалу (АПМ)-а - контроль;

б - лМя, Crimea до 5 мкМ АПМ.

пасаж1в втрачають златн1сть до регенерацП рослин. Так, п1сля первинно! перев1рки л1н1й, отриманих у результат! селекцП через протопласта, на стаб1льн1сть ст!йкост1 до антим1кротрубочкових сполук, нами було в1д1брано 8 1з 14 АПМ-ст1йких л1н1й. 1з яких у 4 збер1га-лась здатн1сть до регенерацП: 12 1з 23 ТФЛ-ст1йких л1н1й, де здатн1сть регенерувати мали 7 л1н1й; 5 1з 7 ТАХ-ст1йких л1н1й, здатн1сть до регенерацП у даному випадку збер1галась у 2 л1н1й.

У результат! через калус нами було отримано 22 л1н1! з передба-чуваною ст1йк1стю до АПМ, 29 л1н1й з передбачуваною ст1йк1стю до ТФЛ, 12 л!н1й з передбачуваною ст1йк1стю до TAX. П1сля первинно! пров1рки на стаб1льн1сть ст1йкост1 було в1д1брано 8 АПМ-ст1йких л1-н1й. у 5 1з яких збер1галась здатн1сть до регенерацП; 14 ТФЛ-ст1йких л1н1й, де здатнЮть до регенерацП мали 10 л1н1й; 9 ТАХ-ст1йких Л1Н1Я, здатнЮть до регенерацП у даному випадку збер1галась у 3 л1н1й.

Анал1з результата селекцП мутант1в," ст1йких до АПМ. ТФЛ, 1 TAX через протопласта 1 через калус показав, що к1льк1сть Л1н1й з передбачуваною ст!йк1стю до даних речовин при селекцП через калус 61льша у пор1внянн1 з такою ж, але одержаною за допомогою селекцП через протопласта. П1д час проведения первинного тестування було встановлено, що значна к1льк1сть Л1н1й, отриманих через калус, не е стаб1льною. Це можна пояснити тим, що калусна культура характеризуемся значною цитолог1чною гетерогеннЮтю. Вид1лення в процес1 селекцП окремих мутантних клГгин може маскуватися немутантними. поряд 1з ст1йкими можливе виживання чутливих кл1тин, вид1лення химерних л1н1й [Сидоров, 1990; Левенко, 1991]. Поряд з цим, 1зольован1 протопласта с кращим матер1алом для селекцП, !х використання дозволяе клонувати повнютю сепарован1 кл1тини рослинно! тканини 1 регенерувати 1з них рослини.

II. Характеристика одержаних л!н1й Nicotiana plmbaginifolia.

Вивчення ст1йкост! отриманих л!н!й до досл!джуваних речовин. В результат! проведено! первинно! перев1рки на р1вн1 рослин-регене-рант1в, п1д час яко! листков1 пластинки контрольних 1 одержаних рослин культивували на поживних. середовищах RM0P, як1 мостили селек-тивн1 концентрацП досл1джуваних речовин' (АПМ - 5'мкМ, ТФЛ - 12 мкМ, TAX - 2 мкМ), було встановлено, що на листкових пластинках отриманих регенерант1в утворювався на селективних середовищах калус з наступ-ною регенерацию на в1дм1ну- в1д контрольних рослин. Ц1. результата дозволили нам зробити попередн1й внсновок про ст1йк!сть отриманих рослин-регенерант1в до АПМ, ТФЛ l TAX, в1дпов1дно.

П1д час перев!рки на р1вн! рослин ст1йкост! отриманих регене-

paHTlB в1дпов1дно до АПМ, ТФЛ 1 TAX. було виявлено. що у вс1х випад-ках в отриманих регенерантах, за виключенням л1н1й аршг 3(к) (л1н1я, ст!йка до дП 3 мкМ АПМ, отримана через калус), tflr3(k). tflr8(k), taxrl,8(k), на середовищах, як1 мютили селективн! концентрацП АПИ, ТФЛ 1 TAX, в1дпов1дно, pier стебла 1 утворення корен1в проходило так. як 1 у випадку з контрольними рослинами, висадженими на середо-вища без селективних агент1в. В той час як у випадку контрольних рослин, висаджених на середовища. що м1стили селективн1 концентрацП використовуваних речовин, значно спов1льнювалися р1ст стебла 1 утво-рення корен1в. НаявнЮть ст1йкост1 отриманих л1н1й до АПМ, ТФЛ 1 TAX було п1дтверджено 1 п1д час тестування мезоф1льних протопласт1в, вид1лених 1з л1н1й з передбачуваною ст1йк1стю до цих речовин.

Калусн1 тканини, 1ндукован1 1з л1н!й з передбачуваною ст1йк!стю до АПМ, ТФЛ 1 TAX, мали здатн1сть до росту на селективних середовищах. При цьому утворений калус був б1лого кольору 1 пухко! консис-тенцП, тод1 як п1д час тестування контрольного калусу спостер1гали його потемн1ння 1 гальмування росту. Пор1внюючн в1дносн1 прироста сиро! маси калус1в контрольних та отриманих рослин через 4 тижн1 п1сля посадки калусних тканин, робили висновок про зб1льшення • cTlfiKocTl одержаних л1н1й до досл1джуваних речовин пор1вняно з контролем. Таким чином, було встановлено. що одержана АПМ-ст1йка л1н!я характеризуешься ст1йк1стю до АПМ в.10 раз вшцою пор1вняно з контролем (Мал. 1); отримана ТФЛ-ст1йка л1н1я N. plumbaglnlfolia характе-ризуеться ст1йк1стю до ТФЛ в 8 раз вшцою в пор1внянн1 з контролем (Мал. 2); ТАХ-ст1йка л1н1я в 5 ст1йк1ша до TAX. н1ж контрольна (Мал. 3).

Генетичний анал!з отоиманих Л1н1й. Результата проведеного гене-тичного анал1зу дають можлив1сть припустити. що отриман1 рослини л1-Hll apmr5 е гомозиготними за одиничною дом1нантною ядерною мутац1-ею, яка несе ст1йк1сть до АПМ. При тестуванн1 нас1нневого потомства Rj (номенклатура, запропонована Р. Чалеффом [Chaleff, 1981]), отри-маного в1д самозапилення рослин л1нП артг5, визначили, що його процент проростання на середовищ1 MC, що мЮтило 5 мкМ АПМ. складав 97,0% (Таб. 1). В той час як аналоПчний показник для -контрольних рослин складав 4, 955. Процент проростання нас1ння, отриманого в1д ре-дапрокних схрещувань аршг5 х k 1 к х артг5, на середовищ1, що м1-стило 5мкМ АПМ, складав 95,6% 1 95,5%. Але в даному випадку нас1ння на середовищ1, яке м1стило АПМ. проростало 1з затримкою 1 темп його росту був нищий у пор1внянн1 з нас1нням, отриманим в!д самозапилення артг5 (Таб. 1). Можливо. це пояснюеться тим, що ознака ст1йкост1 у даному випадку знаходиться у гетерозиготному стан1.

Генетичний анал1з tflr12 л!н11 показав, що отриман! рослини 6.

- И -

Та"5. 1. ГеигшчкиЯ ш&ш отриманп ь»ут*чт1* л. ривпЬодглиоИа. стШких ю аШгтрофосмегилу

\ РОСГИНЯ. СТ1ЙК1 5 «кХ «1* ВО Коятрольн! росли НИ

а \ N п/ /п Я|ЛЬЯ1с7Ь висаие- нэго на-сЫня на середови-«е.во И-стять ли* кишеть пророс-лого не-С1ИНЯ X про рос гая-ня N п/ /п К1ЛЬК1СТЪ Н8С1ННЯ, вигале-ного на середови-яв.«о N1-стять Агм К1ЛЬК1с ь ПрОСОСЛОГО чяс.ння I пророс тач-ня

V «• т»

Росли- 1. 47 46 47 97.9 1 48 48 4Я 100

ии. г. 56 54 Ьв 96.4 2. .■>8 52 66 92.9

СТ1Я«1 3 63 60 63 95. г 3 «7 62 67 92.5

По 4 72 70 72 97.2 4 72 59 72 95.6

5 »<« 5. 68 в? ее Э3.5 5. 77 74 77 35.1

АПК ср - - - 97.0 ср - " 95.5

Кон- 1 53 г* Чв. 1 1 58 2 0 3,4

троль- г. 67 64 67 95.5 2. 69 3 0 4. Э

Н1 3. 81 78 81 96.3 3. 73 « 0 5.5

росля- 4 7« 70 74 94.8 4. 84 8 0 7.1

ни 5. ср 11 58 61 95.1 95.6 5. ср 72 Э 0 «.г 4.9

Тлб. 2. Генетичнк! виал!э отриманих мугмПв Л. р1игЬа£1л1/оМа,

спяких до трифлорми»/ ГШ;

\ <? РОСЛЯНИ. СГ1ЯК1 до 12 ик* ТФЛ Контрольн1 роелнни

С? \ к п/ /п К1ЛЬК1СТЬ рисадае-нэго наснял на сервловя-ие яо я1-стнть ТМ К1ЛЬ-Х1СТЬ пророс-лого на- С1ННЯ 1 лро-рос-тан-кя Н (1/ п К1ЛЬК1СТЬ вясадяе нога на-с1ння на середсви-ие.чо м1-стять ТФЛ К1ЛЬК1СТЪ гтророслого К&С1КНЯ I проростей -ня

4- т» Т.

Рослм- 1. 43 31 32.25 12. 1 1 41 21 20.5 51.2

НЙ. г. 51 за 38, 25 74.5 2. 40 22 24.5 44.9

СТ1 я - 3. 48 35 30 72.9 3 63 31 31.5 49.2

КГ АО 4. 57 41 42.75 71.9 4. 69 30 29 51.7

12 ик« 5. «3 45 47.25 71.4 5. 45 21 22.5 48.7

тот ср - " 72.5 ср - - 48,7

Конт- 1. 52 28 26 53.8 1. 53 3 0 5.3

ре Л ЬН1 2. 81 38 40.5 46.9 2. за 0 0 0

росли- э. 22 24 45.8 3. 48 1 0 2.2

НИ 4. 63 31 31.5 49.2 4. 72 В 0 • в.э

5 54 г5 27 46.2 5. 64 4 0 6.3

ср - - 48.4 * ■ "

* - Млыс1сть пророслого иас1нм: т - теоретично оч1кувана:

фвктхчна. тка: у вс 1* шиполках р > 0. С5

- 12 -

Т»а. 3. r«n«TN<owa аыы1> отрмшхих к/гакт!в и. piumtxylnl/otta. crllxu ю тмсолу (Ш)

V Росши. ет ¡мш Ixl J0 контрошИ росши

\ к п/ /в XlJIbXlCTb MCAJIU-ИОП) XI-С1ИКИ кя сорадох-«а.«о И1-етнтъ Ш XI»-xicn проросло ГО ха-elmu I про-рое-т«х-хя » л/ /п XlAKlCTb вхсслм- НОГО И4- с1>и! ка сер«*»*-w!«o «1-спь TU XlIbXlCTb ороросмпв НХС1ККХ « про-й: к»

\ «• т* *• т»

Росли- 1. 39 21 29.» 11.« I. во за 40 47.9

ни. г. <3 30 32.25 69.7 2. 53 30 31.3 «7.«

СТИК1 3. и 10 40,9 74.1 1. 79 37 38.3 4«. а

JN 1 V гв 27.75 70.1 4. 96 31 за 63.4

2 ШХ 5. я м 1» 73,1 5. 46 24 23 52.2

TAX ср • - - ?М CP - - - 49.5

«окт- ). м 18 11 47.4 ). 4В 0 0 0

pojblll г. о 25 23.5 53.3 г. 72 3 0 4.2

росли - 3. и 24 и 4в.г 3. «3 2 0 3.2

ИИ 4. «1 21 21.9 49, в 4. 81 1 0 1.2

S. и 33 32.5 ill. а 5. 96 г 0 3.6

ср - - > 49.3 ер - - - 2.4

• - IlJbulCTb пророем» mcimm: т - тмролгао оч|хуым:

* - #ЙКТЯЧМ.

Лршитм: у леи ипцдюис р > 0.05

очевидно, гетерозиготними за одиничною ядерною иутац1ею. П1д час анал1зу нас1нневого потомства R . отриманого в1д самозапилення tflrl2 виявлено, що в. даному випадку характер розщеплення на ст1йке 1 чут-ливе нас1ння узгоджуеться з оч1куваними менделевським 3:1 (Таб.2). На ochobI тестування нас1нневого потомства F(, отриманого в1д анал1зуючих схрещувань. було встановлено, що розщеплення на чутливе 1 ст1йке нас1ння складае l : 1 (Таб.2). Отриманий результат е л1д-твердженням того, що одинична ядерна мутац1я, яка забезпечуе ст1йк1сть отриманих рослин до ТФЛ. е гетерозиготною.

На ochobi генетичного анал1зу рослин~регенерант1в л1н11 taxr2 мокна припустити, що вони е гетерозиготами за дом1нантною ядерною мутац1ею. що забезпечуе ст1йк1сть до TAX (Таб. 3).

Виходячи 1з результат^ генетичного анализу рослин-регенерант1в аршг 5, а також, враховуючи те, що джерелом матер1алу для селекцП служили гапло!дн1 рослини N. piumbaginifoUa, можна припустити, що мутац1я. яка забезпечуе ст1йк1сть до АПМ, пройшла в гапло1дних юитинах, як1 посл1довно диплоТдиэувались. Аналог1чн1 результата буди отриман1 Р. Чаллеффом [Chaleff, 1984] п1д час генетичного анал1зу мутант1в Nicotiana tabacm. ст1йких до хлорсульфурону 1 сульфомету-ронметилу. МутацП, що забезпечують ст1йк1сть до ТФЛ' и TAX. в1дпов1дно, очевидно, пройшли п1сля диплоШзацП гапло!дних кл1тин.

Дишго!дизац1я могла пройти п1д впливом умов культивування. Так, встановлено [Глеба и др., 19781, що на протяз1 5-7 цикл1в б1льша частина популяцП дипло!дних та гапло!дних кл1тин переходять на - р1вень пло1дност1 в 2 рази б1.пьший пор1вняно з вих1дним.Довготри-вале пасивування кл1тин in vitro сприяе п1двищ;нню генетично! р1зно-ман1тност1 як серед кл1тин, що культивуються, так 1 отриманих 1з них , рослин [Кунах, 1978, 1980; Сидоров, Сидорова, 1987].

На основ! анал1зу одержаних даних можна зробити висновок, що в кожному 1з випадк!в ст1йк1сть до АПМ, ТФЛ 1 TAX пов'язана з дом1нан-тною ядерною мутац1ею.

Анал1з м.утант!в на перехресну ст!йк!сть до речовин з ан-тим1кротрубочковою активн!стю. При проведенн! тестування на на-явн1сть перехресно! ст1Пкост1 отриманих л1н1П до сполук, як1 харак-теризуються под1бним механ1змом д1! на м1кротрубочки. спостер1гали утворення калусу з наступною регенерацию на листкових пластинках АПМ-ст1йких рослин на середовищ1, що м1стило ТФЛ в концентрацП 12 мкМ 1 вище. Прир1ст калусу, одержаного 1з АПМ-ст1йких рослин на се-редовищ1 МСмод, яке м1стило 12 мкМ ТФЛ, складав 39,5% по в1дношенню до контролю, тод! як прир1ст контрольного калусу на аналог1чному се-редовищ! складав всього 5,4%. Прир1ст калусу ТФЛ-ст1йко! . л1н1! на середовищ1, яке м1стило 5 мкМ АПМ, складав 83.5% по в1дношенню до приросту контрольного калусу, тимчасом як прир1ст контрольного калусу на середовищ1, яке м1стило 5 мкМ АПМ складав т1льки 11,4%. Як видно з результате тестування, у даному випадку отриман! л1н1! ха-рактеризуються перехресною ст1йк1стю.

Немас н1чого дивного в тому, що мутанти проявляють перехресну ст!йк1сть до спор1днених антим1кротрубочкових сполук, як1 характери-зуються однаковими сайтами зв'язування на молекулах б1лк1в-м1шеней. В1домо, що дуже часто мутанти, ст1йк1 до д1! одн1е! антим1кротрубоч-ко! сполуки, характеризуються ст1йк1стю до 1нших антим1кротрубочко-вих агент1в. Так, показано, що мутац1я за л1з-350 в р-суболиниц1 -ту-бул1ну забезпечус ст1йк1сть мутант1в Chlamydomonas reinhardtii Colr4 1 CoLr15 як до АПМ, так 1 до ТФЛ [Lee & Huang. 1990]. ДшИтроанШн-ст1йкий б1отип Eleusine indica характеризеться ст1йк1стю до АПМс [Vaughn et al., 1987]. Такою ж властив1си характеризуються дин1тро-ан1л1н-ст1йк1 кл1тини коренево! меристеми. моркви [Vaughan & Vaughn, 1988]. 0ск1льки обидва герб1циди: АПМ 1 ТФЛ мають под1бн1 сайта зв'язування на молекул! тубул1ну [Bolduc et al., 1988; Vaughn et al., 1987; Vaughan & Vaughn, 1988], це е. на наш погляд, одним 1з доказ1в наявност! мутац11 за одним 1з ген1в, що кодують д-убул1п.

III. Докази природи мутац1й.

Анал1з одержаних л!н!й за допомогою непрямо!_3 муноФлюоресцент-

цо! MlKpocKonlí. При вивченн1 ст1йкост1 м!кротрубочок до д1! АПМ в одержаних л1н1ях N. plumbagini folia пор1вняно з контрольними за допомогою Шунофлюоресцентно! м1кроскоп1! було встановлено. що при концентрацП АПМ вищ1й н1ж 3 мкМ вс! м1кротрубочки 1 в мутантних, 1 в контрольних кл1тинах руйнувались. Сл1д зазначити, що у вс1х випад-ках концентрац1я ДМСО не перевищувала 0.\%. Саме таку концентраций багато автор1в вважають граничною в таких експериментах [Serlln &. Ferren, 1989; Seagull, 1990; Sctlwuchow et al.. 1990; Wacker et al., 1987]. У цитоплазм! можна було спостер1гати т!льки уламки м1кротру-бочок або накопичення тубул!ну. При використанн! АПМ у концентрацН

3 мкМ, в б1льшост1 протопласт1в, вид1лених 1з АПМ-ст1йких рослин. с1тка м1кротрубочок збер1галась, тимчасом як в протопластах контрольно! л!н!! при аналог!чних умовах спостер!гали руйнування м1крот-рубочок в yclx кл1тинах.

П1д час анал!зу контрольно! та ст!йко! до 12 мкМ ТФЛ л!н1й було встановлено, що при концентрац!! ТФЛ 12 мкМ у ст!йк1й л!н1! м1крот-рубочки збер1гались (Мал. 4в). тод! як в контрольн!й л1н1! при ц1й же концентрацИ вс1 м!кротрубочки руйнувались (Мал. 46).

За допомогою !мунофлюоресцентно! М1кроскоп1! було також показано, що в протопластах. вид1лених 1з рослин, ст!йких до 2 мкМ TAX, п1сля обробки протягом 3-х годин TAX тако! ж концентрац!! збер!га-•лась нативна кортикальна с!тка м1кротрубочок. тимчасом як в контрольних кл1тинах нормальна орган!зац!я кортикально! с1тки м!кротру-бочок порушувалась. Внасл1док стаб1л!зац1! м1кротрубочок таксолом, в цитоплазм1 контрольних кл!тин вони представлен! у вигляд1 товстих парадельних пучк1в.

Д1я сполук з антим!тотинною активн1стю на м1кротрубочки рослин-них кл1тин уже достагньо добре вивчена. Вакер !з сп1вавторами [Wacker et al., 1988] виявили. що ор!зал1н в концентрац!! 0,5 мкМ сильно рукнував м!кротрубочки в Штинах протонеми моху Fuñaría hyg-rometrica. 0.1 мкМ ор!зал!н через 3 години, а 1 мкМ АПМ уже через J.0-15 хвилин повн1стю руйнували цитоскелет в протонем1 1ншого моху Ceratodon purpureum [Schwuchov et al., 1990 ]. П1д час обробки волокон бавовника Gossypium hirsutum ТФЛ. в концентрац!! 1 мкМ на протяз!

4 дн!в корта.чальна elтка м1кротрубочок повШстю руйнувалась [Seagull. 1990]. Ооробка 10 мкМ TAX приводить до зб!льшення к!ль-koctí к!кротрубочок у волокнах бавовника, що розвиваються [Seagull. 1990].

На основ! результата анализу одержаних мутант1в за допомогою непрямо! !мунофл:ооресцентно! м!кроскоп1! можна зробити.висновок, що

Мал. 4. Результат« 1мунофлюоресцентного анал1зу ст1йкост1 кортикальних м!кротрубочок протопласт!в М1со11апа. .

р1ишРг1.1$1п1Го11а до трифлюрал1ну (ТФЛ):

а) протопласт 1з контрольного калусу;

б) протопласт 1з контрольного градусу п!сля обробки ТФЛ (12 мкМ) на протяз1 2 годин.

в) протопласт з ТФЛ-ст1йкого калусу ¡псля обробки ТФЛ (12 мкМ) на протяз! 2 годин.

кортикальна с1тка м1кротрубочок в 1зольованих протопластах, вид1ле-них 1з л1н1П, ст1йких до АПМ, ТФЛ 1 TAX. в1дпов1дно, характеризуемся п1двищеною ст1йк!стю до даних антим1тотичних речовин у пор1внянн1 з контролем.

Б1ох1м1чний анал!з отриманих л!н1й. В результат1 проведеного двом1рного електрофоретичного анал1зу фракц1й б1лк1в. як1 м1стять тубул1н 1з мутантних Л1н1й рослин, ст1йких до АПМ, ТФЛ 1 TAX, показано. що у вс1х випадках спостер1гались зм1ни в окремих 1зоформах р-субодинищ тубул1ну.

Як видно з Мал. 5, як у контроле так 1 в мутантах W. plumba-ginifolia. a-субодиниця тубул1ну представлена трьома 1зоформам1 (а , аз), як1 давали позитивну реакц1ю з моноклональними антит1лами Tu-Ol проти а-субодиниц1 ту0ул1ну. Що ж стосуеться (5-субодиниц1 ту-бул1ну, то у контрол1 N. plumbaginifolia, вона представлена трьома основними 1зоформами . Рг, ). як1 1дентиф1кувались за допомогою моноклональних антит1л Ти-13 проти |$-тубул1ну, 1, мо'жливо, трьома м1норними 1зоформами, котр1 не давали реакц1ю з даними антит1лами.

У рослин, ст1йких до 5 мкМ АПМ, виявлено три 1зоформи (5-субоди-ниц1 тубул1ну. 1з яких Р2- 1 Р3-1зоформи на двом!рному електрофорез1 мають таку к рухл1в1сть, як 1 в контрол1, ¡до стосуеться р -1зоформи. то вона лерем1щуеться у б1лыи лужну область, що. мокливо, зумовлене Мутац1ев саме за цим б1лком (Мал. 56). У рослин, стШких до 12 мкМ ТФЛ, спостер1гаеться зникнення р^зоформи тубул1ну у пор!внянн1 з •И м1сцем 1дентиф1кац11 в контрол1 1 в той же час зб1лыибння к1ль-кост1 б1лка в област1 Рй-1зоформи тубул1ну (Мал. 5в). У рослин. ст!йких до 2 мкМ таксолу, виявлено три 1зоформи р-субодикиц! ту-бул1ну, при цьому одна з них (0г'-1зоформа) мае 1зоелектричну точку в б1льш кислШ област1, а масу меншу, пор1вняно з 1ншими 1зсформами £-субодиниц1 тубул1ну (Мал. 5r). Bel перел1чен1 вице 1зоформи р-су-Оодиниц! тубул1ну давали позитивну реакт» з 'моноклональними антителами проти р-субодиниц1 тубул1ну.

Поява зм1нено! (J-субодиншц тубул1ну характерна для багатьох кутаятних л1н1й кл1тин нищих еукар!от i ссавц1в, ст1йких до ак-ткм1крструбо.чкових сполук. Так. вид1лен1 Кабралом 1 сп1вроб1тккками _1;утантн1 гЛнП кл1тин СКО, ст1йк1 до колх1цину. калцемш 1 rpiseo-фульв!ку, характеризувалися наявн1стю р-тубул1ну 1з 'зм1неков елект-рофоритичною рухливЮтю [Cabral et, al.. 19801.

При анадШ за допомою двсм!ркого електрофорезу ¡¿утактхв Са. reintardtit Со 1г й к Co'Jlo, як1 с ст1йкими до Шдвищэких концант-рац1й колх!цину 1 при цьому збер1гають джгутики, та нормальных кл1тин було встаковлело. цо кутаЩя пройшла в одному и ген!в, що кодуе р2-тубул1н [Bolduc .et al.; 1988]. Поряд з 0-ту'Зул1ном. ха-

ß?

"Äff5

! I i

&г I

dU'Ms

■ i ' 1 * • i

О

Д

f ^f3 i 1. *

А

t ¿¡'Лъ

ft,

В

Мал. 5. Електрофореграми 1зоформ тубул!ну îJicotlana plumbaginifolia,-вид1лених 1з; .

а) контрольних рослин; '

б) рослин, от1йких до 5 мкМ ам!профосметилу; '

в) рослин, ст1йких до 12 мкМ трифлюрал1ну;

г) рослин, CTiïlKiix до 2 мкМ таксолу; а - а-тубул;к;

ß - р-тубул!н;

рактерним для дикого типу, джгутики мутантних кл1тин м1стять додат-ковий кислий 1эовар1ант Д-ту6ул1ну.

При електрофоретичному анал1з1 а- 1 р-субодиниць тубул1ну, вид1-леного 1з знайдено! у природ1 резистентно! до дин!троан1л1н1в л1н1! гусячо! трави Е. indica, було виявлено, що розм1р р-тубул1ну 1з ст1йкого виду був б1льшим пор1вняно з тим. який присутн1й в дикому тип1 гусячо! трави [Vaughn L Vaughan. 1987].

Тому, можна припустити. що в отриманих нами рослинах,ст1йких до АПМ, ТФЛ 1 TAX, наявн1сть зм1н в 1зоформах fJ-субодишщ! тубул1ну пов'язана з набуттям рослинами ст1йкост1 до даних антим1кротрубочко-вих агент!в.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ

Таким чином, за допомогою методу селекцП in vitro нами вперше серед вищих рослин отриман1 мутанти N. plumbaginifolia, ст1йк1 до д1! сполук з антим1кротрубочковою активнЮтю - ам1профосметилу, трифлюрал1ну 1 таксолу. Встановлено, що ст1йк1сть до даних речовин в отриманих л1н1ях пов'язана з дом1нантною ядерною мутац1ею. При про-веденн! електрофоретичного анал!зу Фракц1й б!лк1в. що мЮтять ту-бул1н 1з мутантних рослин, було виявлено в кожному 1з випадк1в зм1ни в 1зоформах ($-субодиниц1 тубул1ну. 0держан1 результата св1дчать на користь того, що мутац1я, ak¿ забезпечуе ст1йк1сть отриманих рослин до даних антим1кротрубочкових агент1в, пройшла в одному 1з ген1в, який кодуе р-субодиницю тубул1ну. НаявнЮть перехресно! ст1йкост1 АПМ- 1 ТФЛ-ст1йких л1н1й до сполук. як1 характеризуються одинаковим механ1змом д1! на м1кротрубочки, може служите одним 1з доказ1в того.■ що ст1йк1сть до даних речовин забезпечуеться мутац1ею в одному 1з ген1в, що кодуе тубул1н.

Наявн1сть мутантного тубул1ну в кл1тинах отриманих рослин N. plumbaginifolia в1дкривае широк1 перспективи !х використання з метою вивчення структури 1 молекулярно-бЮлоПчних аспект1в функц1онування м!кротрубочок у кл!тин1 (механ1зми збирання-розбирання м1кротрубо-чок, IX взаемод1я з 1ншими скелетними структурами кл1тини 1 органе-лами, взаемод1я з хромосомами та ix розпод1лення в м1тоз1 та 1н.). Одержан1 нами мутанти використовуються як один 1з партнер1в для от-римання соматичних г1брид1в, як1 м1стили б ген мутантного тубул1ну. Отримання м1жвидових. м1жродових 1 м1жродинних г1брид1в дозволить вивчити функц1онування мутантного тубул1ну 1 його ген1в у р1зних Пбридних системах, а також допоможе в1дпов1сти на актуальш питания про те. чи формуються г1бридн1 м1кротрубочки в таких г1бридах; яаск1льки специф!чн1 взаемод!! ниток веретена 1 хромосом в1д р1зних

батьк1в; чи мае значения специф!ка формування с1тки м1кротрубочок при г1бридизацП для сегрега'цП певних хромосом.

Отринаш нами мутанти N. plumbaginifolia характеризуються ст1йк1стю до герб1цид1в фосФороам1дного 1 дин1троан1л1нового ряд1в -- - АПН- 1- ТФЛ. Як в1домо; застосування "гёрб]цидГв"," як 1 1нших х1м!чних препарат1в для захтту рослин. породжуе ряд проблем. Одна 1з них -еколог1чна. Друга проблема зв'язана з виникненням у живих орган1зм1в cTlfiKocTi до герб1цид1в. У cbítI иалШуеться уже десятки бур'ян1в. як! набули cTlfiKocTi до д!1 герб!цид1в. Тому т1льки зб1льшення об'ем1в використовуваних х1м1чних препарат1в уже недостатнс для за-хисту рослин в!д бур'ян!в. Одним 1з шлях1в вир1шення цих проблем е створення за допемогою метод1в сучасно! б1отехнолог11 сорт1в куль-турних рослин. ст1йких до промислових герб!цид!в. Отримания ст1Йких до гер51цид1в рослин ' ведеться в двох напрямках: перший полягас у прям1й селекцП резистентних до герб1цид1в мутант1в рослин; другий передбачае використання генно-!нженерних п1дход1в до конструювання рослин шляхом введения ген1в будь-якого походження. як1 забезпечують проявления ознаки ст1йкост1 до даного герб1циду. Отриман! нами мутанти N. plumbaginifolia. як! характеризуються ст1йк!стю до герб1цид1в АПМ 1 ТФЛ, можуть у майбутньому використовуватися для 1дентиф1кац11 гену р-тубул1ну, який забезпечуе ст1йк1сть до даних ■ герб!цид1в, його клонування 1 перенесения у Бажлив1 с!льськогоспо-дароьк! культури для одержання ix CTifnaix сорт1в.

висновки

1. За допомогою методу прямо! позитивно i селекцП in vitro отриман! л 1 н i i рослин Ni cot iana plumbaginifolia., ст1йк1 до дП спо-лук з антим1тотичною активн1стю, що порушують процеси пол1меризацП тубул!ну в м1кротрубочки; - герб!цид1в фосфороам!дного i дин1тро-анШнового ряд1в • (ам1профосметилу 1 трифлюрал1ну). 0дер.жан1 ам1про-Фосметил-от1йк1 л1Ш I характеризуються ст1йк1стю до ам!профосметилу в 10 раз вищою пор!вняпо з контролем, а трнфлюрал1н-ст1йк1 л1н11 характеризуються cTlíiKlcTfo до трифлюрал1ну в 8 раз вищою у пор1внянн1» з контролем.

2. Вперше за допомогою селекцП in vitro одержан1 л1н11-рослин N. piumhoginifolia !з ст1йк1стю до таксолу. алкалохду 1з рослин роду Taxus, який 1нг1буе процеси депол1меризацП тубул!ну. 0триман1 так-сол-резистентн1 л1н11 в 5 раз ст1йк1ш1 до таксолу пор1вняно з контролем .

3. За допомогою г1бридолог1чного анал1зу доведено, що ст1йк!сть стриманих л1н1й N. plumbaginifolia до ам1профосметилу. трифлюрал1ну

1 таксолу, в1дпов1дно. с насл1дком стаб1льних генетичних зм1н 1 пов'язана з дом!нантними ядерними мутац!ями.

4. Встановлено. що для отриманих амШрофосметил- 1 трифлюрал1н-ст1йких л1н1Й характерна перехресна ст1йк1сть до сполук, як1 мають однаков1 сайтн зв'язування на молекул1 тубул!ну. Це може розц1шова-тись як один 1з доказ1в того, що мутац1я пройшла в одному 1з ген1в,

. який кодуе тубул1н.

5. Показано, що кортикальна с1тка м!кротрубочок в 1з'ольованих протопластах, вид!лених 1з л1н!й. ст1йких до антим1кротрубочкових речовин. характеризуеться п1двищеною ст!йк1стю до ам1профосметилу, трифлюрал1ну та таксолу у кожному випадку. Це також може служити п1дтвердженням того, що отримана ст!йк1сть с результатом мутац1йних зм1н у молекул1 тубул1ну - основного б1лка. що формуе м1кротрубочки.

6. За допомогою електрофоретичного анал1зу встановлено. що набуття ст1йкост1 отриманими л1н1ми до АПМ, ТФЛ 1 TAX пов'язане 1з зм1нами в 1зоформах (Ьсубодиниц! тубул1ну, що можна пояснити му-тац!ями в генах, що кодують дан! !зоформи.

За матер!алами дисертацП опубл!кован1 наступи 1 роботи:

1. Blume Ya. В.. Strashnyuk N. М., Sldorov V. A.. Gleba Yu. Yu. Producing and analysis of amlprophosmethy1-resistant mutants with altered tubulin from mesophyll protoplasts of Nicotiana plumbagini-folia // Abstr. of the 8th internat. Protoplast Symposium. Physiol. 'Plant. - 1991. - V. 82 N 1. - P. A35

2. Blume 'Ya. B., Strashnyuk W. M.. Gleba Yu. Yu. Selection and analysis of trlfluralln-reslstant mutants of Nicotiana ptumbaglnt/o-lia // Frontiers of Biotechnology In Agriculture - 1991. Satellite of the 15th Internat. Congress or Biochemistry. Sea of Galilee, Israel, August 1-4, 1991. - P. 41.

3. Страшнюк H. M.. Блюм Я. Б., Сидоров В. А., Глеба Ю. Ю. Селекция и анализ мутантов Nicotiana plumbaginifoiia, устойчивых к гербицидам с антимикротрубочковым действием // Достижения биотехнологии -агропромышленному комплексу: Тез. докл. Всесоюз. конф. (Черновцы, 14-18 октября 1991 г.). - Черновцы, Украина, 1991. - с. 60.

4. Страшнюк Н. М.. Блюм Я. Б.. Сидоров В. А.. Глеба Ю. ¡0. Выделение и характеристика клеточных линий и растений-регенерантов Nicotiana plumbaginifoiia, устойчивых к действию амипрофосметила // Экологическая генетика растений, животных, человека: Тез. докл. IV

.Всесоюз. науч. конф. (Кишинев. 20-21 ноября 1991 г.). - Кишинев: Штиинца, 1991. - Т. 2. - с. 432-433.

5. Блюм Я. Б., Страшнюк Н. М.. Сидоров В. А., Глеба Ю. Ю. Получение и анализ линий Nicotiana plumbaginifoiia, устойчивых к соединениям с антимикротрубочковой активностью // Новые методы биотехнологии растений: Тез. докл. I Всесоюз. симп. (Пущино, 20-22 ноября 1991 г.). - Пущино, СРСР, 1991. - с. 55-56.

6. Страшнюк Н. М.. Блюм Я. Б. Получение и анализ мутантов растений Nicotiana plumbaginifoiia с устойчивостью к таксолу // Актуальные проблемы физиологии растений и генетики: Тез. докл. конф. молодых ученых (Киев, 26-28 мая 1992 г.). -Киев, Украина. 1992. -

С. 142.

7. Микицей Б. В., Страшнкж Н. М.. Блюм Я. Б. Реакция антител МРМ-13. которые узнают центры организации микротрубочек в протопластах растений // Актуальные проблемы физиологии растений и генетики: Тез. докл. конф. молодых ученых (Киев. 26-28 мая 1992 г.). - Киев, Украина. 1992. - с. 148. .......

8,. .Емец.А, И.. Страшнюк Н. М. , Блюм Я.~ Б. Получение соматических гибридов высших растений с использованием мутантов по тубулину // Новые методы биотехнологии растений: Тез. докл. II Рос. симп. (Пущи-но, 18-20 мая 1993 г.). - Пущино, Россия, 1993. - с. 138.

9. Страьикж Н. К.. Блюм Я. Б., Смертенко А. П., Сидоров В. А., Глеба Ю. 0. Получение амипрофосметкл-устойчивнх линий ШсоЫапа р1ит!ла%1п1/о11а. содержащих мутантный тубулин // Доклады Российской АН. - 1993. - Т. 332, N 2. - прийНЯТО до друку.

10. Блюм Я. Б., Страшнюк Н. К. Получение мутантов по генам белков микротрубочек // Цитология и генетика. - 1993. - т. 27, N 6. - прий-нято до друку.

1! ми- :ш друку. и / о/ 14. Друк. ифс. Умош^ друк. арк. 1,/ь Лам. Л-И?,.

Формат ьо^ы/и |1ап1ре^с Обл.-вид. арк. Р,13 хнр./Ю-

К и 5 (. ^ ышжкпи;! друкарпя наукопо! кщнн КмТв, Реппи, 4.