Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль бета-тубулина в устойчивости мутантных линий растений Nicotiana plumbaginifolia к действию соединений с антимикротрубочковой активностью

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль бета-тубулина в устойчивости мутантных линий растений Nicotiana plumbaginifolia к действию соединений с антимикротрубочковой активностью"

КИ'ОСЬКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ¡м. ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

« (

2 О МАЙ

На правах рукопису

УДК 655.939.14:54-116+576.311.1

СОЛОДУШКО ЕКктор Григорович

РОЛЬ Р-ТУБУЛ1НУ У СТ1ЙКОСТ! МУТАНТНИХ Л1Н1Й АПсоНапа р!итЬадШоНа ДО Д|Т СПОЛУК 3 АНТИМ1КРОТРУБОЧКОВОЮ АКТИВН1СТЮ

03.00.04 — бюхтя

АВТОРЕФЕРАТ дисертацм на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

КиТв-1997

Дисертац|'ею е рукопис

Роботу виконано на кафедр1 кпггинно! öionorii та генетичноТ ¡нженери бюлопчного факультету КиТвського ушверситету ¡мен! Тараса Шевченка

Науковий кертник — член-кореспондент HAH УкраУни, доктор бюлопчних наук БЛЮМ Ярослав Борисович

Офщмж опоненти — доктор бюлопчних наук, професор KAJ11HIH Фед|р Леонтжович

кандидат бюлопчних наук, ст. наук. спш. СОРОЧИНСЬКИЙ Борис Володимирович

Пров|дна орган'!зац:я — 1нститут öioxiMii ¡м. О. В. Палладша HAH УкраУни, Ки'Гв

Захист в!дбудеться "29" травня 1997 р. о 14ш год. на зааданж спец|'ал13ованоТ вченоТ ради Д.01.01.07 при КиТвському уш'еерситет! ¡м. Тараса Шевченка за адресою: 252127, м. КиТв, проспект Глушкова, 2, корпус 12 (бюфак), ауд. 215.

Поштова адреса: 252033, Ки'/в-ЗЗ, вул. Володимерська, 64, спецрада Д.01.01.07, бюлопчний факультет.

3 дисертац1сга можна ознайомитися в б.'блютец! КиТвського университету iMeni Тараса Шевченка

Автореферат розюланий "_"_1997 р.

Вчений секретар спец1алЬовано'| ради,

кандидат бюлопчних наук, професор

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальниггь проблеми. М1кротрубочки е важливими структурними компонентами цитоскелету еукарют, осгальки вони В1д1грають ключову роль в здмсненж таких фундаментальна процеа'в життедшльносл кл!тин, як Ух млотичний i мейотичний подт, внутршньоклггинний транспорт речовин, рух джгутигав i емок, визначения i п'щтримка форми кл'ггини, розм1щення в клггинл ряду органел (в першу чергу ядра), тощо [Fosket & Morejohn, 1992]. KpiM цього, у рослинжй клггин! м1кротрубочки виконують ряд додаткових функцм: формування клггинноТ спнки, утворення фрагмопласту пщ .час подту кл'ггини, приймають участь у П розтягненн1 [Hussey, 1991; Hepler & Kush, 1996; Goddard et al., 1994]. Дослщження функцм м1кротрубочок викликае значний ¡нтентерес, осюльки, змшюючи структурно-функцюнальж властивост! мжротрубочок (наприклад, при допомоз|' речовин, що порушують або стабт1зують мкротрубочки), можна влливати як на фун/сцп окремих кллини, так i всього оргажзму. [Correia, 1991]. На сьогоджшнм день ряд речовин з антимкротрубочковор активн!стго вже використовуються як гербщиди, протипухлинш, фунпцидж, антигельм!нтнозн1 засоби [Страшнюк и Блюм, 1993; Morejohn & Fosket, 1991]. Встановлено, що у бшьшосл випздпв внутрошьоклггиннога мшенню для цих речовин е тубулЫ — 6inoK, який формуе лротофшаменти мкротрубочок [Correia, 1991]. Специф1чне зв'язування антимжротрубочкових речовин з цим бшком приводить до загибел! КЛ1ТИН, однак не виключено, що спонтанн1 чи ¡ндукован! мутацп у молекул! тубу л ¡ну можуть забезпечувати Гх спйкклъ до таких речовин [Страшнюк и Блюм, 1993; Oakley, 1985].

. ' Особливий ¡нтерес викликаюгь рослинн! органами з "лриродною л)двищеною слйюстю до антимкротрубочкових речовин, яю використовуються як гербщиди: димтроантЫи, фосфороамщи i феншкарбамати [Страшнюк и Блюм, 1993]. До нэдазнього часу серед вищих рослин були ввдом) лише мутанта Eleusine indica, яю були спйкими до динпгроаншшових герб1цид1в; встановлено, що дана CTiiiKiCTb визначалась мугац!ега в одному ¡з гетв тубулну [Vaughn & Vaughan, 1990; Vaughn et al., 1987; Waldin et al., 1992]. На початку 90-х рою'в, використовуючи селекц1ю in vitro, були отриман! мутанти Nicotiana plumbaginifolia, спйга до амтрофосметилу (АПМ) [Страшнюк и др., 1993, Blume et al., 1991, 1997] i трифлюралму [Блюм и др.. 1996;. Blume et al., 1991] - герб|цидщ фосфороамадного i димтроантжового ряд^в з високою антимжротрубочковою ахтивн1стю. У наступних дослгдженнях шляхом соматичноТ пбридизац'Г! автори продемонстрували можлив'сть перенесения ознак стшкост до АПМ i трифлюралжу в(д отриманих мутанпв в iHiui види рослин родини Пасльонових

[Емец, 1996; Емец и др., 1996; Yemets et al., 1994]. На основ! результате цих досл'йжень було висунуто припущення, що стшюсть отриманих мутантш N. plumbaginifolia до АПМ i трифлюралжу визначаеться мутац1ею(ями) в одному 1з reHiB тубу л ¡ну. Тому, пошук 6ioxiwi4Hktx доказ1'в участи мутантного тубул!н,у у формуванн стшкосгп вищезгаданих рослин до антим1кротрубочкових речовин е актуальним питаниям. Вир1шення qiei лроблеми дозволить видтити i клонувати вщпов1дн'| гени тубулжу та переноси™ ix у важлив'| сшьськогослодарсью рослини з метою пщвищення ¡'х стмкосп* до гербицид ¡в нового поколшня.

Мета i завдання дослщження. Метою даноТ роботи е анал!3 рол! ß-тубу л ¡ну у фармуванш criikocri мутантних рослин Nicotiana plumbaginifolia да flii речовин з антиммротрубочковою активного - амшрофосметилу i трифлюралЫу - гербицид'ш фосфороамщного i дин!троан1л'жового ряд'|в. Зпдно ¡з поставленою метою, до конкретних завдань роботи входило:

' - проведения поршняльного електрофоретичного анализу ¡зоформ а- i р-тубул1ну у представниив двох триб родини Пасльонових (Atropa belladonna; Nicotiana sylvestris i N. plumbaginifolia);

- пор!вняння спектру ¡зоформ тубу л ¡ну, видтеного ¡з контрольних та сп'йких до АПМ i трифлюралжу рослин N. plumbaginifolia, з метою виявлення можливих змж в електрофоретичн!й рухливосп даних бшюв;

- пор!вняння здатносп тубугину \г контрольних та слйких рослин N. plumbaginifolia зв'язувати АПМ i трифлюралм;

- лоршняння здатносп тубулжу ¡з контрольних та спйких рослин N. plumbaginifolia пдропзувати ГТФ в присутносп АПМ i трифлюралжу;

- вмачити здатн1сть тубулну ¡з сп'йких рослин N. plumbaginifolia, перехресно зв'язувати АПМ i трифлюралН а також ¡наи динггроант1нов1 гербщиди; провести електрофоретичний анал1з ¡зоформ тубулжу ¡з п'брид1в сгпйких до АПМ (Л/, plumbaginifolia к А. belladonna) та трифлюралжу (N. plumbaginifolia х N. sylvestris) на наявжсть мутантних форм даного бшку та гюршняти здатжсть тубул!ну ¡з даних рослин зв'язувати АПМ i трифлюралм;

- вивчити здатн1сть тубулшу ¡з контрольних та стойких рослин N. plumbaginifolia зв'язувати АПМ i трифлюрал1н в присутносл таксолу -слолуки, що crra6ini3ye мкротрубочки.

Наукова новизна. Вперше проведений пор1вняльний електрофоретичний анализ ¡зоформ тубулшу у представниюв двох триб родини Пасльонових: А. belladonna, N. sylvestris i N. plumbaginifolia. Виявлено] що на вщмжу вщ N. sylvestris i N. plumbaginifolia а- i р-тубулм з рослин А. belladonna хзрактеризуються вищою молекулярной масою i 61'лыи кислими значениями pl.

Встановлено, що спйю до АПМ i трифлюрал!ну рослини N. plumbaginifolia, харакгеризуютъся наявнстю мутантно! ¡зоформи р-тубулЫу, 3i змженим значениям pl, що може бути наслщком одинично? амшокиспотно! замши в його пол1пептидн1Й послщовносп. Показано, що наявн'гсгъ такоТ мутантно! форми тубулЫу приводить до зниження його здатносп зв'язуватм АПМ i трифлюралш. •

Встановлено, що в присутносп антимкротрубочкових сполук, тубул!н ¡з спйких рослин активнше, пор1вняно з контролем, гщролйуе ГТФ. Даний факт може бути ще одним доказом учасп' тубулжу у формуванж спикосп' мжротрубочок мутантних рослин до АПМ i трифлюралшу. Показано, що спйгасть соматичних пбрид1в N. plumbaginifolia х А. belladonna та N. plumbaginifolia х N. sylvestris до АПМ i трифлюралиу, визначаетья наявнютю мутантноГ форми тубулжу, отриманоТ oifl oflHiei ¡з батьювських форм - стшких до даних сполук рослин N. plumbaginifolia.

Таким чином, отриман! результата свщчать на корпеть того, що змши в структур! р-субодиниц1 тубулжу вдаграють визначальну роль у формуванн'г спйкосп рослин до речовин з антимкротрубочковою акгивн1стю.

Практична щннкмъ. Залропоновано спектрофотометричний метод вивчення зв'язування тубулну з антимжротрубочковими речовинами, якйй грунтуеться на портнянн1 показнию'в логлинання светла вшьним бтком i його комплексами з дослщжуваняш речовкнамя. Розроблений юлькгсний метод опосередкованоТ оцЫки ефективносп взаемоди мономера а- i (5--тубул1ну шляхом виг.фювання змм у вмкгп юню водню {значена pH середовища) при пдролЫ ГТФ тубуппом. Використання даних методичних П|'дход1в вщкривас ширил можливост! для дослщження ефективносп впливу р1зних речовин на мкротрубочки (наприкпад для виявлення нозих речовин з антимжротрубочковою активною).

З'ясування рол! мутантного р-тубулму в спйкосп до фосфороамщш та динггроантмв. вщкривае можливгслъ виявлення i клонування гену, що кодуе даний бшок, з метою переносу його в iHUji рослин» органами.

. Результата роботи використозуються при викладанж спецкурсу «Скелетж - структури клггини i ix функцн», а розроблен1 методичн! прийоми використовуються лд час проведения прэктичних занять з роздшу «Методи видтення цитоскелетних структур» на кафедр! кллинноТ бюлогм i генетичноТ ¡нженерп КиТвського ун!верситету ¡м. Тараса Шевченка.

Ochobhi положения, ям виносяться на захист. На основ) лроведених' досгнджень i узагальнення лгтературних.даних на захист виносяться наступн'1 положения:.

1. Рослини двох р|'зних триб N. plumbaginifolia; N, sylvestris i A. belladonna характеризуются наявн1стк> тубу л ¡ну з рЬною рухлив1спо ¡зоформ на двомфному електрофорезГ А. belladonna мостить бшьш кислий нк а-, так i ß-TyöyniH з бшьшою молекулярной масою, лор^вняно з аналопчними бшками представниюв роду Nicotiana.

2. ТубулН видшений з АПМ i трифлюралж-стшких рослин N. plumbaginifolia, мае зммену, пср1вняно з тубут'ном чутливих рослин, композиц'по ¡зоформ його р-субодиниц'|, про що св'щчать змни у рухливосп цих ¡зоформ при двом1'рному елекгрофорез1 в бшьш кислу область.

3. Наявжсть в склад| тубулму з АПМ- i трифлюралЫ-стшких рослин 3M'weHOi ¡зоформи його р-субодиниц! приводить до того, що специфична зв'язування цих речовин тубулЫом ¡з дослщжуваних мутанпв N. plumbaginifolia знижуеться б|'льше ж'ж в два рази пороняно з аналопчним показником для контрольних рослин.

А. Антимжротрубочко81 сполуки прип-ичують пдрол1з ГТФ тубулшом, необхщний для пол'1меризацп мкротрубочок. Тубулм ¡з рослин, стжких до даних спопук, в йльшм Mipi 3Öepirae здатжсть до пдрол!зу ГТФ в присутност1 АПМ i трифлюрал1ну, пор|Вняно з тубулном ¡з контрольних рослин.

5. Наявн!сть тубулЫу ¡з АПМ- i трифлюралЫ-сшких рослин N. plumbaginifolia перехресноТ спйкосп до даних сполук, а також сшкосп до шших дижтроантшових герб|Цидш з р!зною будовою, с доказом ¡снування в цьому б|лку одного або деылькох спорщнених сайтт для зв'язування даних гербщидв.

6. АлкалоТд, що cra6ini3ye м1кротрубочки - таксол - не впливае на швидю'сть гщрол!зу ГТФ тубулжом, що дозволяв припускати ¡снування на молекул! даного бшку р!зних сайт ¡в зв'язування таксолу i доспщжуваних гербщид'т.

7. Наявнють мутантноТ форми тубутну в соматичних пбридах, отриманих при використанн! в якосгп одного з батьыв мутантш, спйких до АПМ i трифлюралшу, забезлечуе спйисть Miкротрубочок цих пбридт до дослщжуваних гербщид^в.

Апробзцш роботи. Результати дисертацмно! роботи. доповщались на 11-му з'1зд| УкраТнського товариства ф|зюлопв рослин (Киш, 1993), Vlll-му (Acci3i, 1тал1Я, 1993) i Х-му (Стокгольм, ШвецЫ, 1995) Свролейських цитоскелетних форумах, lV-му бвропейському KOHrpeci по кл'иинжй б'юлогц (Прага, Чеська Республ!ка, 1994); М(жнародному симпозум! «Бгатехнолопя i генетична ¡нженер1я рослин» (КиТв, 1994), М^жнародному симпоз!ум1 «Молекулярна бюлопя рослин i бютехнолопя» (Нью-Дел1, 1S94), Мжнародному симпозиум'! по бур'янах i

культурних рослинах, сшких до герб1цид1в (Кордова, !спан1я, 1995), Х-му Мвкнародному конфеа по штиннм бюлогн (Сан-Францюко, США, 1996).

Публ1кацГ|'. OcHOBHi положения дисертацн викладеы в 15 публ1кац|ях.

Структура та обсяг роботи. Дисертац!я складаеться ¡з вступу, огляду лтератури, Marepiania i метод®, результата та Тх обговорення, заключения, висновюв та списку ллерэтури, який мстить 279 б|блюграф|чних посилань. Робота викладена на 156 сторжках машинопису, i wicnrrb 1 таблицю та 17 рисунк!В.

Матер1али i методи.

Як об'екти дослщження в робот! були використан! рослини N. plumbaginifolia, N. sylvestris, А. belladona, мутантж niHii N. plumbaginifolia, спйю до дн 5 мкМ АПМ [Blume et а!.. 1991; Strashnyuk et ai, 1993] та N. plumbaginifolia, сп'йга до дп 12мкМ трифлюралжу [Blume et al., 1991b], а також пбридш niHii (NpAb-107, yNN-9), отримаьн при використанн1 в якосл батькшських форм АПМ i трифлюрал1н-сшк'| рослини N. plumbaginifolia та неслйю до цих речовин рослини N. sylvestris и А. belladona [Емец, 1996].

Вид1лення i очистку тубулжу з мезофшу N. plumbaginifolia зд!йснювали за методом Мореджона i Фоскета [Morejohn & Fosket, 1986], ¡з внесеними нами модификациями. Листя рослин розтарали в рщкому азол i гомогемзували в буфер1 А (0,5 мМ MgCI2, 0,1 мМ ЕГТА, 1 мМ ДТТ, 2 мМ ГТФ, 50 мМ HEPES, ЮмкМ лейлептин, 10 мкМ пепстатин А, pH 6,8) для солюбтЬацн тубулжу. Гомогенат ф1льтруеали i центрифугували при 13000 g на протяз1 25 хв. при температур! 4 "С. Пюля цього розчин бтку зм'ниуаали в колб! з ДЕАЕ-сефадексом А-50, попередньо зршноваженого буфером А. Сумш перемшували при 0—+4 "С на протяз!' 30 хв,, деаерували i наносили на колонку (1,5x12 см) з ДЕАЕ-сефадексом А-50. Бток, який не зв'язався ¡з смолою, змивали буфером А, який додатково М1стив 0,35 М KCl.

Елюцю зв'язаних б|лш проводили буфером А, який додатково мютив 0,8 М KCl. Фракц!я, яка вимивалась останньою, м)стила приблизно 70% тубулжу. Тубулж ¡з розчинуосаджували 50%-ним насиченням (Ж^гЭгО/ на протяз1 1,5 год i вщдшяли цектрифугуванням. Пюля цього тубуган обезсолювали, пропускаючи через колонку, наповнену сефадексом G-25 (0,5x4 см) з необхвдним (залежно в1д екслерименту) буфером. Ктьюсть öinxy е пробах визначали за методом Бредфорда [Bradford, 1976].

Двом^рний гель-електрафорез проводили за методом О'Фаррелла [O'FarrelZ, 1975]. Для ¡зофокусуеання використовували амфолжи з д1апазоном pH 4-6. Перенос бтш з гелю на штроцелюлозу здмснювали або шляхом

електропереносу [Towbin et al., 1979], або за допомогою методу пасивного переносу [Albaugh et al., 1987]. Яюсть перенесения б ¡ли в контролювали забарвленням нтроцелюлозноТ мембрани амщочорним [Wojtkowiak et а!., 1983]. 1муноблоттинг тубулну проводили за методом Toy6iHa та ¡н. [Towbin et al., 1979], використовуючи Мишин! антитта TU-01 проти а-тубулжу i TU-06 проти р-тубулшу, а також вторинж козяч'| антатта (проти мишиних lg G) з ковалентно зв'язаною лужною фосфатазою. Фарбування бтюв колощним срйлом проводили за методом Драбера i ¡н. [Draber et al., 1991].

Для вивчення зв'язування тубугйну ¡з сполуками з антим'жротрубочковою активнютю отримували комплекси даних речовин ¡з тубулшом на ДЕАЕ-сефароз1 [Borisy, 1972; Hugdahl & Morejohn, 1993; Morejohn et al., 1987]. В розчинному б'шковому екстрат визначали загальний bm'ict б'тку i bmict тубулшу. Буфер видтення А додатково mi'cthb. 2%-ний розчин ДМСО [Hugdahl & Morejohn, 1993; Murthy et al., 1994]. Зразки роздтяли на ДВ1 pisHi частини. В одну з них, для утворення комплексу м!ж тубул'мом i антимкротрубочковим агентом, додавали 20 мМ розчин АПМ або трифлюралжу в ДМСО i витримували протягом 20 хв. В другу контрольну часгину вносили однакову кшьюсть розчинника (ДМСО). Отриман! комплекси, а також контрольна зразки наносили на колонку з ДЕАЕ-сефарозою для видтення ТубулЫу. Вивчення р]вня зв'язування вщпов!дного л1'ганду з тубулмом вимфували спектроскоп1чно.

Для вивчення ГТФ-азноТ активнссп -тубул'му розчин даного бшку д1ал1зували проти буферу D (5 мМ PIPES, рН 6,8, 0,5 мМ MgCi2i 0,1 мМ ЕГТА, 0,2 мМ ДТТ, 5 ыМ ГТФ, 2% ДМСО) [Hugdahl & Morejohn, 1993; Murthy et al., 1994]. Загальний ewiicr бтку доводили до коицентраци 0,1 мг/мл. П\сля цього выбирали ал1квоти розчинв тубулЫу i пом!щали в кювета для вимфювання значения рН. В розчини добавляли pi3Hi концентрацм АПМ i трифлюралЫу, або вщповщну KinbKicrb ДМСО для контролю. Для перерахунку ДрН в показник наколичення нергажчного фосфату використовували калйровочну криву. Bci експерименти проводили в ¡HTepBani рН 6,7-6,9.

Статистичну обробку отриманих результатт та регреайний анап!з проводили на комп'ютер1, використовуючи стандартний пакет профам SigmaPlot.

РЕЗУЛЬТАТИ IIX ОБГОВОРЕННЯ

1. Електрофоретичний анат'з тубулЫу у представниюв родини Пасльонових, АПМ-1 трифлюралм-спйких тнм N. р1итЬадЫЫа та Ух пбридт

Анализ тубулну ¡з дикого типу N. р1йтЬадШоНа (рис. 1а) показав, що його а- и р-субодиниц~1 характеризуются подобною рухпив1стю при елекгрофоретичному роздтенм, що е наслщком близьких значень Тх молекулярних мае \ незначних вщмжностей в ¡зоелектричних точках. Порюняно з а-субодиницею р-субодиниця тубу л ¡ну цих рослин мае дещо бтыиу молекулярну масу 1 бшьш кислу ¡зоелекгричну точку, що е характерним для бшьшосп рослин [Роэке^1992].

S Ф %Г $ „

м f 4

с >

Рис. 1. Результати елекгрофоретичного аналЬу тубулЫу, видшеного ¡з N. plumbaginifolia (а), N. sylvestris (б) i А. belladonna (в): а - ¡зоформи а-субодиниф тубугану; р - (ß,, ß2) - ¡зоформи р-субодиниц1 тубугнну.

1з представлено!' на рис. 16 електрофореграми видно, що тубулм N. sylvestris, на вщмту вгд тубулму N. plumbaginifolia, характеризуемся практично однаковою pyxnnsicTK) обох тубутжв i ¡зоформ, що Тх утворюють. Це евщчить про деяю В1ДМ1нност1 м!ж тубулжами цих двох вид1в тютюну. Тубулш. видшений з лредставника ¡ншоТ' триби родини Пасльонових - А. belladonna (рис. 1 в), характеризуемся ще бшьшими вщмшностями в рухлив'осл обох субодиниць, пор!вняно з описаними вище рослинами роду Nicotiana. Так, а-тубули белладонни звичайноТ мае приблизно на 2 кД б('льшу молекулярну масу i бшьш кислу ¡зоелекгричну точку, Н1Ж о-тубулж Nicotiana. ß-TyöyniH белладонни звичайноТ на електрофорэграм! (рис. 1в) представлений двома бтковими

плямами з однаковими ¡зоелекгричними точками, апе з разними молекулярними масами. Одна лляма (ßi) значно домнуе i перекриваеться з мюцезнаходженням а-тубул|'ну. Друга ппяма (ß2) представлена вщносно невеликою юльюстю б1лка i м1стить тубулН молекулярна маса якого приблизно на 2 кД менша, н1ж у ßi-i3ocpopMM, i дор1внюе молекулярнм Maci ¡зоформ ß-тубулшу ¡з N. plumbaginifolia i N. sylvestris (рис. 1а,б). В той же час ß-тубулЫи обох дослдокуваних вид1в тютюн1в характеризуются бтыи лужними ¡зоеяектричними точками.

Таким чином показано, що, не дивлячись на еволюцшну близьюсть вид'ш N. plumbaginifolia, N. sylvestris i А. belladonna, субодиниц! тубулмв, видтених ¡з цих рослин, характеризуються р13ною рухлив1стю на двомфному електрофорез!,

ЩО СВЩЧИТЬ ПрО ВЩМННОСП В IX буДОВ!, i, . Б1ДПОВ1ДНО, ф|ЗИКО-Х1М1ЧНИХ

характеристиках.

Наступним етапом даноТ роботи було вивчення можливих змш в електрофоретичнй рухливосл тубутну з рослин N. plumbaginifolia, стойких до АПМ [Blume et а!., 1991а; Strashnyuk et al., 1993J i до трифлюралшу [Blume et al., 1991Ь]. Проведений ранше генетичний анал13 показав, що АПМ-спйм рослини характеризуються Яаявн'клю домжантних, а в трифлюралм-спйких -сем!дом1нантних ядерних мутацш, котр| забезпечують спйкють до антим1кротрубочкових речовин. Дан|' ¡мунофлюоресцентноТ мкросколп продемонстрували пдвищену стабтьжсть мжротрубочок в клггинах цих спйких лмй до вщповщних антим|"кротрубочкових речовин [Страшнюк и др., 1993,1996].

Результата анализу тубул1ну ¡з АПМ-сгшких рослин N. plumbaginifolia продемонстували наявн!сть змж в рухливосл частини ß-тyбyлiнy (рис. 2r (ß2)), яю характеризуються зм'нценням ü ¡зоелектричноТ точки в бтьш кислу область (кралками вказаш орюнтири). Рухлив1сть OflHiei MlHopnoi ¡зоформи ß-тyбyлiнy (ßi) запишалась без зм'и i була такою ж, як i у контрольных рослин. Ц1 дан! свщчать про те, що в ргчзоформах тубулжу ¡з АПМ-спйких рослин вщбулись змЫи, можливо лише на р!вн1 однюТ або декшькох амшокислот.

На рис 2ж представлен! результата анал1зу тубулшу, видтеного з трифлюралм-слйких рослин N. plumbaginifolia. а-Субодиниця тубул1'ну представлена одн!ею ¡зоформою (¡дентичноУ до тако'Г ж ¡зоформи ¡з контрольних рослин), в той час як ß-субодиниця представлена двома ¡зоформами. Р)-1зоформа тубулшу ¡з трифлюралм-сгпйких рослин характеризуемся такою ж рухлив1стю, як i Bei ¡зоформи р-тубул1ну ¡з контрольно'! лпни N. plumbaginifolia, в той час як ргнзоформа характеризуемся битьш кислим значениям pl i Bonoflie рухливютю, под!бною до рухливосл р2-тубул1ну ¡з АПМ-спйких мутанпв.

Наявжсть мутантного ß-тубулму було дослужено i в ¡нших, сгпйких до р!3них антимкротрубочкових речовин, видш [Страшнюк и Блюм, 1993]. Таким

чином, отримам результата шдтверджують ранше висунуте припущення, що можливо основною причиною шдвищення спйкосп" Л1Н1Й N. р1итЬадШоПа до АПМ I трифлюралму с змЫи в структур! Тх р-тубулшу.

£ Р

I

£ Р А

?

1 [

£

Р

+ - +

Г-

* » •

а б / в

4- - + _ ' +

г д е

+ - .+ - '

ж

Рис.2. Результати електрофоретичного аналЬу та ¡мукоблотинг субодиниць тубулшу ¡з контрольних рослин N. рШЬадтНоИа (а, б, в) та рослин, стойких до АПМ (г, д, е) 1 трифлюралму (с, ж, з): а, г, е - електрофореграми субодиниць тубулжу; в, д, ж - ¡муноблоттинг а -субодийиць тубулшу; в, е, з - ¡муноблотинг р -субодиниць тубулжу; а - а-субодиниц| тубулЫу; р, р,, р2,- р-субодиниц|' тубулму;

Осюльки дослщжуваж мутан™ niHit N. plumbaginifolia були використан! для одержання соматичних пбридш ¡з несшкими рослинами N. sylvestris i А. belladonna, наступним етапом дослщжень було визначення наявносп мутантного тубу л ¡ну в даних пбридах. Для анализу використовувались асиметричн! пбриди Mix трифлюралж-стшкими л!н|'ями N. plumbaginifolia i рослинами N. sylvestris (yNN-9), а також mix АПМ-сшкими л!н!ями N. plumbaginifolia i рослинами А. belladonna (NpAb-107). Пбрид yNN-9 виявляв спйюсть до трифлюралжу, а NpAb-107 - до АПМ [Емец и др., 1995, 1996].

Встановлено, що у пбрида yNN-9 як а-, так i ß-тубулжи характеризувались практично однаковою рухлив1стю на електрофореграм! (рис. За). Даний факт може бути наогидком наявносп тубулжу, успадкованого як з N. plumbaginifolia, так i з N. sylvestris. Однак нам не вдалось електрофоретично ловн1Стю роздтити OKpeMi субодиниц! даного б!лку, що не дозволило зробити припущення про участь окремих ¡зоформ тубул!ну у форму ванн! слйкосл дослщжуваного пбриду до трифпюралиу.

f

& -

»

Ai

Рис. 3. Результати електрофоретичного анал1зу субодиниць тубулшу ¡з стшкого до трифлюрап1ну п'брида yNN-9 (а) i стшкого до АПМ пбрида NpAb-107 (б): а - ¡зоформи а-субодиниц'| тубулшу; ß, (ßt, ß2) - ¡зоформи рсубодиниц'] тубул!н у

Анал1з ¡зоформ тубулиу ¡з пбрида NpAb-107 показав, що поряд з yciMa ¡зоформами, притаманними белладонн! з'вичайнй, у даного пбрида лрисутня додаткова ¡зоформа (ß2) тубугану ¡з такою ж молекулярною масою та ¡зоелектричною точкою, як i у мутантноТ форми ß-тубулЫу ¡з АПМ-спйкоТ л.'нп

N. р!итЬадШоНа (рис. 36). На нашу думку, це с доказом експресн в геном1 пбридноТ роспини гену р-тубулжу ¡з N. р1итЬадМоНа.

2. Оценка зв'язування антимжротрубочкових речовин з тубулином ¡з мутантних росли« N. р1итЬидШоИа

Осктьки в попереджх експериментах у слйких до АПМ 1 трифлюрал!ну рослин N. р!итЬидШоНа були виявлен! ¡зоформи мутантного тубул!ну, нами було здмснено спробу за допомогою прямих експерименпв виявити можлив1 вщмшносл в здатност! тубулжу ¡з контрольних та мутантних рослин-зв'язувати дослщжуваж антим1кротрубочков1 речовини.

Як вцдно з даних, лредставлених на рис. 4.1 а, тубул'/н ¡з АПМ-спйких рослин N. р1итЬидШоНа зв'язував приблизно в три рази менше (37,1 ±9,8%) АПМ, н1ж тубулш ¡з контрольних рослин. Аналопчж показники отримаж \ для трифлюралм-спйко! Л1нГ| N. р!итЬадШоИа при звязуванн1 трифлюралЫу -45,3±10,9%, пор1вняно з контролем (рис. 4.26).

Особливосп зв'язування динпроан1лшових I фосфороам'вдних герб'щид1в з тубулиом ¡з рослин, слйких до цих антимжротрубочкових речовин, практично не виэчались. Беручи до уваги той факт, що АПМ-спйк'| рослини N. рШтЬадШоНа проявляли ст|йк1сть до трифлюрагану, а трифлюрапж-сши рослини - до АПМ [В1ите е( а!., 1993], нами було дослщжено перехресне зв'язування тубул!н1в ¡з цих рослин з АПМ, трифлюрагшом, а також ¡ншими динггроажлжовими гербщидами (пендиметалшом, бенефЫом, оризал:ном \ еталфлюралжом).

а ют

£ И

8 П

Ч 80 -1 ;

•а и

\ бо ;

I п

I 40 :

к

I 20 - '

ш I О.

0 —

П

л

. | I | I ! I

| юо ^

.5 80 -н

40

«ч а а

? 20

! Ь,

т

Рис. 4 Р^вн! зв'язування тубулжом ¡з контрольно! (л1В| колонки), а також АПМ-(1, прав! колонки) I трифлюрэлЫ-сп'йких (2, прав! колонки) лМй N. р/итЬадШоПа лп-пй амтрофосметилу (а), трифлюралму (б), пендиметалЫу (в). бенеф|'ну (г), оризалшу (д). т еталфлюралжу (е)

Як видно з даних, представлених на рис. 4.1, тубутнн, видшений ¡з АПМ-слйкоТ л'|н'|Т N. plumbaginifoüa, харакгеризувався зниженою здатн'ютю зв'язувати yci дослщжуван! дин1троан!л1нов1 гербщиди. Ртень зв'язуважя тубулму ¡з АПМ-сгпйких рослин з трифлюралжом складав лише 42±12%, пендиметалшом -48,2±14,6%, бенефшом - 59,6±27,7%, оризалЫом - 44,8±9,3%, а еталтрифлюрал1ном - 36,4±10,7% вд аналопчного показника для тубулшу ¡з контрольних рослин N. plumbaginifoüa. Аналопчж дан! були отримаж i для тубулЫу, видтеного ¡з трифлюрал^н-стшких рослин N. plumbaginifolia (рис. 4.2). Ршень зв'язування тубу л ¡ну ¡з даних рослин, складав для АПМ - 35±15%, пендиметал1'ну - 48+9%, бенефшу - 60+20%, оризагином - 45±12%, еталтрифлюрал'1ном - 36±4% в!д аналопчного показника для тубулму ¡з контрольних рослин.

юо -

во -|

60

40

20 -

100

£ ВО -

60 -40

20

ТФЛ-N.p. N.s. gNN-9

АЛМ-N-p. А-Ь. NpAb-107 2

Рис. 5. PiBHi зв'язування тубугином ¡з сгпйкоТ до трифлюралму л¡HiV N. plumbaginifoiia (ТФЛ-N.p.), W. sylvestris (N.s.), yNN-9, пбриду (-yNN-9) трифлюрал1ну (1) i тубулжом ¡з АПМ-стшко'Т л!нП" N. plumbaginifolia (АПМ-N.p), А. belladonna (Ab.) i пбриду NpAb-107 (NpAb-107)-АПМ (2)

Отримаж нами результати свщчать про те, що на молекул! тубулЫу е або один сайт зв'язування, сп'тьний для уах досл!джуваних антимкротрубочкових речовин, або ж деюлька таких сайта, ям перекриваються. Не виключено, що мутацн в молекулах тубулну в спйкмх рослинах зачепили сайги зв'язування цих речовин. Цим можна пояснити той факт, що спйисть рослин до одного гербициду з високога долею ймов!рносп прояаляеться ! по вщношенню до ¡нших дослщжуваних гербщидщ.

I

о

Пбридн! niHii 7NN-9 i NpAb-107 також бупи використаж для вивчення poni присугнього в них мутантного р-тубул'1ну у формуванж сгпйкосл до даних антим1кротрубочкових речовин. Показано, що р:вень зв'язування трифлюралжу з тубул(ном ¡з рослин N. plumbaginifolia, сп'йких до даного гербщиду, становить 64,6±10,9% в|'д аналоп'чного показника для дикого типу N. sylvestris. В асиметричному пбрид! ^¡ж двома цими видами рослин (yNN-9) ¡3 переважагочим карютипом N. sylvestris [Емец, 1996] присутнм тубулт, рвень зв'язування якого ¡з трифлюрал!ном становить 87,8±7,4% вщ аналопчного показника для N. sylvestris (рис. 5.1).

Р1вень зв'язування АПМ з тубулЫом, видтеним з АПМ-спйкоТ niHii N. plumbaginifolia, становив 28,0+9,6% вщ з аналопчного показника для тубулжу, видшеного ¡з дикого типу А. belladonna (рис. 5.2).. В riöpnfli м1ж даними видами рослин (NpAb-107) приблизно половина вд усього тубулжу вщповщае [}-тубул!ну з АПМ-спйкоТ niHii N. plumbaginifolia, а решту - тубулжу ¡з А. belladonna (рис. 36). Р1вень зв'язування АПМ зтубулиом ¡з пбриду NpAb-107 становив 64,6±11,1% в!д аналопчного показника для тубулжу, видшеного ¡з. дикого типу А. belladonna.

Таким чином нами показано, що в формуванж спйкосп досшджуваних рослин до фосфороамщних i дижтроажлжових гербщидт приймае участь ß-субодиниця тубулжу. Дана субодиниця М1стить принайм! один спшьний сайт (або декшька сайтов, що перекриваються) зв'язування ¡з даними гербщидами. Принайм! деяк1 мутацн (мутац!я) в даному сайт! можуть приводи™ до зниження у зв'язуванж тубулном антимжротрубочкових речовин, що, однак, не позначаеться на його здатносп виконувати ochobhI функц!й.

3. ОцЫка специф!чност1 зв'язування антим1кротрубочкових речовин тубулмом за його здатнютю гщрол1зувати ПГФ Осюльки у стойких до АПМ i трифлюрагшу рослин N. plumbaginifolia був виявлений тубулж ¡з зниженою здатмстю зв'язувати антимкротрубочков! речовини, ми висунули припущення, що даний 6inoK може також характеризуватись i шдвищеною здатжстю до полмеризацП в присутносп АПМ i трифлюрат'ну. Взаемод;я субодиниць тубулжу мЬк собою в процес! пол1меризацм мжротрубочок приводить до riflponisy молекули ГТФ [Fontalda et а!., 1993]. Енерля, що при цьому видшяеться йде на пвдтримку даноТ реакцп, а неоргажчний фосфат, який при цьому накопичусться, закислюе середовище. Антим1кротрубочков1 речовини пригнжують пол!меризац!Ю мжротрубочок, що приводить до зменшення ктькосп елементарнйх акпв взаемодн мономерю тубулжу мЬк собою i знижуе ГТФ-азну активнють даного бтку [David-Pfeuty et ai,

1979; Нате!, 1985]. Не виключено, що рослини, яю М1сгять тубулш ¡з зниженою слорщнеж'стю до ангилнкротрубочкових речовин, можуть М1стити мйфотрубочками з п'щвищеною здатнютю до гюшмеризацм в присутносп цих речовин, а значить I тдвищеною ГТФ-азною активжстю.

Нами запропонована методика к'тькосноТ оцЫки елементарних акт взаемодп мок молекулами тубулжу, яю вщбуваються в процеа полшеризацм М!кротрубачок, за стуленем закислення середовища (внаслщок накопичення неорганмного фосфату [РогЛаМа е( а!., 1993]). Для перев!рки залролонованноТ методики ми дослщили вплив вжбластину, алкалоТду з антим!кротрубочковою активн'гстю, на на ГТФ-азну активнсть тубулну з уах дослщжуваних лмй N. р1итЬад1пИоНа. Нами не було виявлено достов1рноТ розниц! мЬк ГТФ-азними активностями тубулжш ¡з контрольних та спйких до АЛМ трифлюралиу рослин N. р1итЬадШоИа в присутносп вжбластину. Внесения вЫбластину в концентрацГГ 500 мкМ знижуе швидюсть пдрол1зу ГТФ тубулном з уах дослщжуваних Л1Н1Й N. р1итЬадтИоПа майже в два рази \ становить приблизно 55% вщ аналогнного показника у вщсутносп вжбластину.

На рис. ба представлен'1 показники р'юнв пдролЬу ГТФ тубулжами ¡з контрольних та слйких до АПМ рослин N. р1итЬадМоПа в залежносл вщ концентраци АПМ через 2 год. ¡нкубацй'. Як видно з представлених результате, ¡снус чггка запежш'сть р1вня п'дролЬу ГТФ тубул'иом в!д концентраци гербщиду. ГТФ-азна актиеисть тубулжу ¡з АПМ-спйких рослин (рис. 6а, 2) в значно мэньшй М1р| пщдаеться ¡нгубуючому впливу АПМ, ш'ж ГГФ-азна активжсть тубулЫу ¡з контрольних рослин (рис. 6а, 1). Можна зробити висновок, ицо АПМ ¡стотно пригнмуе полшеризац1ю тубул¡ну, однак пол!меризац1я тубулжу ¡з слйких до АПМ рослин в меншш м!р1 т'ддаеться такому впливу.

Под'|бн! результата були отримат I при досл'|дженн'| ГТФ-азно! активносл тубул!ну ¡з трифлюралЫ-слйких рослин N. р'.итЬад'тИоНа в, присутност) трифлюрапму (рис. 66). Тобто трифлюралж, як I АПМ, здатний ¡нпбувати пдрол!3 ГТФ. Осюльки характеристики пригннення пдролюу ГТФ тубулжами були подйними \ для трифлюралжу, I для АПМ, можна допустити, що ц| гербщиди, не дивлячись на рюницю в будов! 1х молекул, характирузуються приблизно одинаковим впливом на пол!меризац1ю тубулЫу.

Як показано на рис. 6в, в лрисутносп АПМ тубул!н ¡з трифлгаралж-спйких рослин N. рШтЬадмЫа пдрол!зував ГТФ з такою ж швидюстю, як I в присутносп трифлюралжу. Вщповщно в присутносл трифлюралЫу швидкость пдролЬу ГТФ тубулмом ¡з АПМ-стмких рослин була такою ж, як I в присутносп АПМ (рис. 6г).

Заключним етапом даноТ роботи було вивчення впливу таксолу на жпбування АПМ \ трифлюралжом ГТФ-азно'| а:<тивноот тубулжу ¡з контрольних I

спйких до даних гербщид1в рослин N. plumbaginifolia. Таксол е алкалоТдом, який сгабтюуе м1кротрубочки, тобто його д1я на м1кротрубочки в протилежною дм АПМ i трифлюралшу [Falconer & Seagull, 1986]. Таксол потенцмно Mir би мати близкий э деякими антим!кротрубочковими сполуками сайт зв'язування, однак даний факт не доказаний. 1снують лише непрям! докази ¡снування такого сайту лише для колхщину [Perez-Ramirez & Timasheff, 1994].

80

\

\

-2-10 1 2 Концентрац1я АПМ, мкМ, lg

100 80 60 40 20

ч

Vn

\

-2-10 1 2 Концентрац[я трифлюралшу, мкМ, lg

S

г

е t

40 -

Ч\

100

80 60 40 -I 20

-2-1012 Концентрац!Я АПМ, мкМ, lg

-2

О

1

2

Концентрац1я трифлюралму, мкМ, lg г

Рис. 6 Залежн1сть piBHie пдр.ол1зу ГТФ тубулмом is контрольних (1), i слйких до АПМ (а2, г2) i трифлюралЫу (62, в2) рослин N. plumbaginifolia в залежносл В1д кончентрацм АПМ (а, в) i трифлюралшу (б, г).

Як представлено на рис. 7, в присутносп 10 мкМ таксолу швидм'сть riflponiey ГТФ тубул!ном i3 контрольних i спйких рослин не змЫюеться. Також не

о

cnocrepiranocb зм'ш. у швидкосп пдролЬу ГТФ тубул!ном ¡з уйх досл'щжуваних niHifi в присутносл одночасно ЮмкМ таксолу та 1 мкМ АПМ (I) або 1 мкМ трифлюрал1ну (II). Тобто можна зробити висновок, що таксол не впливае на ГТФ-азну активн!сть тубулшу ¡з жодноТ дослджуваноТ Jiinii.

На сьогодншнй день немае едино!" думки щодо ¡снування конкурентного зв'язування з окремими молекулами тубулЫу (чи з ц1л1сними мжротрубочками) таксолу i' антим!кротрубочкових слолук. В'щомо, лише, що in vitro фйюлопчний вллив антим'|кротрубочкових речовин значно домЫуе над з впливом таксолу {Morejohn & Foskei, 1984]. Отриман'1 результати свщчать, що на вщмщу В(д колхщину, АПМ i трифлюралЫ не мають стального сайту зв'язування з таксолом на молекул! тубулжу.

1,4 -

1,2 -! -5 1.0 ч ' •Ч- 0,8 "i .

О

Ъ 05:

х ;,

0,4 !

; I 0,2 -j .

0,0 -' :

Г-Н

12 3 4

а

12 3 4

б I

1,4 1,2 2 1.0

I

•ч- о,в н О

0.6

т

~ 0,4

0,2 i 0,0

I !

12 3 4 а

12 3 4 б

Рис. 7. Вплив АПМ (I), трифлюралжу (II) i таксолу (I, II) на швидюстъ накопичення неорганичного фосфату при пдролЫ ГТФ тубулЫом, видтеним ¡з контрольно!" (la, lia), АПМ- (16) i трифлюрапи-стшких (II6) niMiw N. plumbaginifolia. Накопичення неорганЫного фосфату в лрисутносп: 1) -тубу л ¡ну; 2) - тубулшу i гербЩиду; 3) - тубулшу, гербщиду i таксолу; 4) -тубулшу i таксолу

висновки

1. Тубулжи представникш двох р1зних триб родини Пасльонових Nicotiana. plumbaginifolia; N. sylvestris та Atropa belladonna характеризуються рЬною pyxnnBicTK) при flBOMipHOMy электрофорез!, що свщчить про наявн!сть Б1дм1'нностей у будов1 цих бткв.

2. Тубул1ни, видшен) ¡з ам1профосметил- i трифлюралГн-сгпйких рослин N. plumbaginifolia, вщрйняються в!д тубулжш чутливих рослин наявж'стю бтьш киспих ¡зоформ р-субодиниц!.

3. TyöyniH ¡з сп'йких до аы1профосметилу i трифлюралнну рослин N. plumbaginifolia лроявляе знижену (бтьше, н!ж в два рази пор!вняно ¡з контролем) здатжсть до зв'язування цих речовин, а також ¡нших динпроаншшових гербщид1е (пенд1менал1ну, бенефжу, оризалму та еталфлюралшу). Даний факт е доказом ¡снування на молекул! тубулшу одного або деюлькох слорщнених сайпв для зв'язування даних гербщидт, що може бути причиною nepexpecHoí ctíhkoctí рослин до цих речовин.

4. Ам1профосметил i трифлюралЫ в менший Mipi лригжчують пдрол"13 ГТФ тубул!ном ¡з снйких до даних герб:цид1В рослин, пор1вняно ¡з аналопчним показником для тубу л ¡ну ¡з дикого типу N. plumbaginifolia.

5. Вжбластин прип-пчуе ГТФазну актизжсть тубулму ¡з контрольних та сп'йких до амтрофосметилу i трифлюралшу рослин N. plumbaginifolia в однаковм Mipi, що св!дчить про ¡снування р1зних сайлв зв'язування на молекул! тубулжу В|'нбластину та дослщжуваних гербщид1з

6.- Алкало'Гд, що стаб!Л1зуе мжротрубочки - таксол - не впливае на швидюсть пдрол1зу ГТФ тубулжом, що дозволяе припустити ¡сАування на молекул! даного 6inKy piSHHx сайта зв'язування таксолу i дослщжуваних герб(цид!в.

7. CoMaTH4H¡ пбриди (Л/, plumbaginifolia х N. sylvestris та N. plumbaginifolia х A. belladona), ям успадкували мутантну ¡зоформу р-тубул!ну в'щ ам1профосметил- i трифлюрал'ж-спйких N. plumbaginifolia, характеризуються зниженною здатжстю !х тубул|'н!в зв'язувати qi герб!циди, що свщчить про ключову роль саме р-тубулЫу у формуванн данноТ спйкосп'.

СПИСОК РОБ1Т, ОПУБЛ1КОВАНИХ ПО TEMIДИСЕРТАЦН

1.Блюм Я.Б., Страшнюк Н.М., Смертенко А.П., Солодушко В.Г., академик НАН Украины Глеба Ю.Ю. Изменения р-тубулина обеспечивают устойчивость к трифлюралину мутантов Nicotiana plumbaginifolia, полученных in vitro И Доп. НАН УкраТни, - 1996, - №7, сс.132-137.

1 *

2.Емец А.И., Солодушко В.Г., Кундельчук О.П., Блюм Я.Б., Глеба Ю.Ю. Соматические гибриды высших растений с использованием амипрофосметил-устойчивого мутанта Nicotiana plumbaginifolia // Генетика. - 1996. - Т.32, № 8. -сс. 1104-1111.

3.Yemets A.I., Smertenko А.Р., Solodushko V.G., Kundel'chuk O.P., Blume Ya.B. Asymmetric somatic hybrids with mutant ^-tubulin resistant to amiprophosmethyl // Proc. of Int. Symp. "Plant Mol. Biol. & Biotech." Narosa Publishing House, New Delhi, India, -1997, - p. 220-234.

4.Blume Ya.B., Kundel'chuk O.P., Solodushko V.G., Sulimenko V.V., Yemets

A.I. Asymmetric somatic hybrids of higher plants resistant to trifluralin. // Proc. of Int. Symp. on Weed & Crop Resistance to Herbicides, Cordoba, Spain, -1995, - p.182-185.

б.Емец А.И., Смертенко А.П. Солодушко В.Г., Кундельчук О.П., Рудас

B.А., Блюм Я.Б. Получение у-гибридов высших растений с мутантным р-тубулином //Докл. Академии наук. Россия, 1997, в печати.

6.Солодушко В. Г., Блюм Я. Б. Сниженное сродство тубулина к амипрофосметилу и трифлюралину у мутантов N. plumbaginifolia с устойчивостью к этим соединениям //Доп. НАН УкраТни, - 1997, в печати.

7.B!ume Ya. В., Solodushko V. G, linhartova I., ViklickyV. Nicotiana plumbaginifolia mutants resistant to amiprophosmethyl or trifluralin have an altered subunit of p-tubulin // Abstr. of Eight Annual Meeting of the European Cytoskeletal Forum (September 12-16, 1993, Assisi, Italy), p. 47.

8.Страшнюк H.M., бмець A.I, Солодушко В.Г., Смертенко А.П., Блюм Я. Б. Отримання соматичних пбрид!в з використанням мутантщ по тубулму для вивчення особливостей функц10нування цитоскелету в пбридних кл!тинах. П-й з"|'зд Укр. товариства ф13!0Л0г1в рослин // Тези доповщей. т. II. Ки1в, 1993, с. 90-91.

9.Yemets A.I., Solodushko, V.G. Kundelchuk О.Р., А Р. Smertenko, Blume Ya.B. Somatic hybrids with mutant tubulin II Abstr. of Int. Symp. "Plant Biotech. & Genet. Engineering" (Kiev, Ukraine, October 3-6, 1994), p.71.

lO.BIume Ya.B., Yemets A.I., Kundelchuk O.P., Solodushko V.G. Asymmetric somatic hybrids of higher plants with mutant tubulin. // Abstr. of Int. Symp. "Plant Mol. Biol. & Biotech." (New Delhi, December 14-17,1994), p. 58.

11 .Yemets A.I., Rudas V.A., Smertenko A.P., Solodushko V.G., Blume Ya.B., Producing of plant somatic hybrids with resistance to amiprophosmethyl. II Abstr. of Int. Symp. on Weed 8c Crop Resistance to Herbicides (3-6 April 1995, Cordoba, , Spain), p. 159.

12.Kundelchuk O.P., Solodushko V.G., Yemets Al., Blume Ya.B. Asymmetric somatic hybrids of higher plant resistant to trifluralin // Abstr. of Int. Symp. on-Weed & Crop Resistance to Herbicides (3-6 April 1995, Cordoba, Spain), p.177.

13.Solodushko V.G., Blume Ya.B. Peculiarities of tubulin property to hydrolyze GTP in the presence of antimicrotubule substance // Abstr. of 10th European Cytoskeletal Forum (Stockholm, Sweden, 27-31 May, 1995), p.63.

14.Yemets A.I., Solodushko V.G., Smertenko A.P., Kundelchuk O.P., Blume Ya.B. Aniimicrotubular drug-resistant plants & their somatic hybrids with mutant p-tubulin // Abstr. of 1Qth European Cytoskeletal Forum (Stockholm, Sweden, 27-31 May, 1995), p.71.

15.Solodushko V.G., Kovalenko N.V., Yemets A.I., Blume Ya.B. Expression of mutant tubulin with deceased affinity to amiprophos-methyl in heterological plant cell II Abstr. of the 6th Int. Congress on Cell Biology and 36th American Society for Cell Biology Annual Meeting (San Francisco, California, December 7-11,1996), p. 46a

Solodushko V.G. Role of p-tubuiin in Nicotiana plumbaginifolia mutant plants resistance to the influence of some antimicrotubule agents.

Scientific Degree CSidate of Biological Sciences Thesis; speciality 03.00.04 -Biochemistry. Institute of Cell Biology & Genetic Engineering, National Academy of Sciences of the Ukraine, Kyiv, 1997.

The results of 15 scientific publications are defended.

It was shown the APM- & trifluralin-resistant mutant lines of Nicotiana plumbaginifolia had p-tubulin with more acid pi as compared to p-tubulin of susceptible plants. Using spectroscopic methods we have discovered that the APM-, trifluralin-resistant plants had tubulin with about 3 times decreased affinity to APM, trifluralin, pendimethaline, benephine, orizaline & ethalfluraline. Hybrid plants, that expressed p-tubulin of resistant plants & possessed resistance to these compounds, had tubulin with average affinity as compared to tubulin of the parents. We showed that tubulin from different resistant plants saved increased ability to hydrolyse GTP in the presence of these compounds as compared to this protein from control line. The

results obtained indicate that p-tubulin is involved in acquirement of resistance of higher plants to investigated antimicrotubule agents

Солодушко В. Г. Роль р-тубулина в устойчивости мугантных линий растений Nicotiana plumbaginifolia к действию соединений с антимикро-трубочковой активностью.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1996.

Защищается 15 научных работ по теме диссертации, в которых было показано, что устойчивые к амипрофосметилу (АПМ) и трифлюралину растения N. plumbaginifolia имели р-субъединицу тубулина с более кислой изоэлектрической точкой по сравнению с р-тубулином чувствительных растений. Используя спектроскопические методы исследований было установлено, что АПМ- и трифлюралин-устойчивые растения имели тубулин с пониженным сродством к АПМ, трифлюралину, пендиметалину, бенефину, оризалину и эталфлюралину, Гибридные растения, экспрессирующие р-тубулин устойчивых родителей и проявляющие устойчисть к данным соединениям, имели также пониженное сродство тубулина к ним. Экспериментально продемонстрировано, что тубулин, выделенный из всех исследуемых устойчивых растений в отличие от тубулина чувствительной линии, сохранял повышенную способность к гидролизу ГТФ в присутствии антимикротрубочковых веществ. Результаты работы свидетельствуют о причастности р-тубулина в формировании устойчивости высших растений к исследуемым антимикротрубочковым агентам.

KntOMOBi слова: рослини, «¡кротрубочки, тубулж, мутацП, ¡зоформи, антимжротрубочков! сполуки, слйюсть, riAponi3 ГТФ.