Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение посттрансляционных модификаций и структурных доменов тубулина растений с помощью специфичных антител

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение посттрансляционных модификаций и структурных доменов тубулина растений с помощью специфичных антител"

ГБ УН

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

На правах рукопису УДК 665.939.14:54-116+576.311.1

СМЕРТЕНКО АНДРІЙ ПЕТРОВИЧ

ВИВЧЕННЯ ПОСТТРАНСЛЯЦІЙНИХ МОДИФІКАЦІЙ ТА СТРУКТУРНИХ ДОМЕНІВ ТУБУЛІНУ РОСЛИН ЗА ДОПОМОГОЮ СПЕЦИФІЧНИХ АНТИТІЛ

03.00.25 — клітинна біологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1996

Дисертацією е рукопис

Роботу виконано у лабораторії фізиісо-хімічної біології клітини

Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України та у відділені біології цитоскелету Інституту молекулярної біології Чеської Академії Наук (Прага)

Наукові керівники — член-кореспонденг НАН України,

доктор біологічних наук БЛЮМ Ярослав Борисович

Офіційні опоненти — доктор біологічних наук, гол. наук. спів.

ТЮЛЕНЄВ Володимир Іванович

Провідна організація — Інститут молекулярної біології та генетики

НАН України, Київ

іасіданні спеціалізованої вченої ради Д.01.19.01 при Інституті <літинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: ¡52143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148, актовий зал.

і дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної Пології та генетичної інженерії НАН України.

і ґ\ V

Івтореферат розісланий " ^ " -іЛ 1996 р.

доктор біології ВІКЛІЦКІ Владімір

кандидат біологічних наук, ст. наук. спів. СОРОЧИНСЬКИЙ Борис Володимирович

Захист відбудеться " ( 1996 р. о 14— год. на

їчений секретар пеціалізованої ради, андидат біологічних наук

Малишева Л.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Мікротрубочкп (МТ) приймають участь у здійсненні таких найважливіших функцій рослинної клітини, як клітинний поділ, формування клітинної стінки, позиціювання органел, внутрішньоклітинний транспорт, морфогенез клітин, тощо (Goddard et al., 1994). Протягом клітинного циклу МТ можуть утворювати чотири основні типи структур: кортикальну сітку, препрофазну стрічку, веретено поділу та фрагмопласт. Кортикальна сітка, препрофазна стрічка та фрагмопласт утворюються лише в клітинах вищих рослин; проте в клітинах тварин функції, притамвнні кортикальній сітці та фрагмопласту, виконують інші структури. Основним білком МТ є тубулін - гетеродимер, що складається з а- та Р-субодиниць, кожна з яких має молекулярну масу біля 50 кД (Dustin, 1984). Тубуліну властива висока консервативність: гомологія між генами тубуліну тварин і рослин досягає 78% (Silflow et al., 1987). Незважаючи на великий обсяг даних щодо структури та функцій тубуліну, залишається багато питань стосовно механізмів, які дозволяють клітині будувати такі різноманітні за структурою молекулярні ансамблі, використовуючи лише один білок. '

Однією із основних причин мультифункціональності та гетероморфності МТ являється гетерогенність тубуліну. Як і в клітинах тварин, в клітинах рослин також були знайдені множинні ізоформи а— та р-тубуліну (Hussey et al., 1991). По-перше, гетерогенність тубуліну виникає внаслідок того, що кожна його субодипиця кодується родиною неоднакових за своїми послідовностями генів. Другою причиною гетерогенності тубуліну виступають посттрансляційні модифікації (Bulinsky & Gundersen, 1991), які змінюють його заряд та конформацію. Так, за рахунок посттрансляційних модифікацій із продукту одного гену а-тубуліну Tetrahymena pyriformis виникає сім ізоформ білку (Penque et al., 1991). Більшість з досліджених на сьогоднішній день модифікацій тубуліну відбуваються на С-кінцевих доменах його субодиниць. Це, наприклад, циклічне тирозилювання/детирозилюваїшя (Gundersen et al., 1984) та ацетилювання (L’Hernault & Rosenbaum, 1985) а-тубуліну, поліглютамілювання (Edde et al., 1990), фосфорилювашш (Diaz-Nido et al., 1988) та полігліцилювання (Redeker et al., 1994) а- та р-тубуліну. Вони можуть регулювати динаміку МТ та їх взаємодію з іншими білками. Ці дані корелюють з результатами досліджень просторового розташування доменів тубуліну. Якщо його N-кінцеві домени сховані у матриксі МТ та приймають безпосереднью участь у полімеризації МТ,

то С-кіндсві домени вільно експоновані на новерхні МТ (Draber et al. 1989).

До цих пір основна маса даних щодо носттрансляпійниг модифікацій та доменів тубуліну була накопичена при дослідженні МІ тваринних клітин. Що ж стосується рослин, такі дані залишаються обмеженими. Наявність тирозильованої форми для а-тубуліну росли! було продемонстровано за допомогою імунофлюорссцентної мікроскопі: (Wehland et al., 1984) та імуноблотингу (Dawson & Lloyd, 1985). Наявність ацетильованого тубуліну у рослин було показано лите зі допомогою імунофлюореспентної мікроскопії (Astrom, 1992), але антитіла проти ацетильованого тубуліну не впізнавали його в умовах імуноблотингу (Del-Casino et al., 1993). Фосфориліовання тубуліну рослин було продемонстровано в дослідах по включенню радіоактивно-міченого фосфору в пермеабілізовані протопласти (Blume et ai., 1991). Інші модифіковані форми рослинного тубуліну взагалі не вивчалися. Де цього слід додати, що незважаючи на наявність даних щодс консервативності доменної організації тубуліну рослин (Picquot el al.,

1988), до цих пір не вивчалась їх просторова орієнтація у стінці МТ. Це ускладнює розгляд можливих механізмів впливу посттрансляційгшх модифікацій тубуліну на функції МТ рослин. З іншої точки зору, наявність унікальних типів організації МТ в рослинних клітинах дозволяє сподіватись на відкриття особливостей механізмів, що регулюють їх утворення.

Мета та завдання роботи. Метою даної роботи було дослідження посттрансляційних модифікацій тубуліну, їх зв’язку з гетерогенністю тубуліну та участі в утворенні та функціонуванні різних структур МТ вищих рослин. Згідно з поставленою мстою,, в задачі експериментальної роботи входило:

1. Вивчити гетерогенність тубуліну N. tabacum за допомогою ізоелектричного фокусування з високою роздільною здатністю (ІФВРЗ).

2. Визначити наявність поліглютамільовапої, тирозильованої, иетнрозильоізаної, ацетильованої та А2 (форма a-тубуліну, що не тирозилюється) форм тубуліну в клітинах рослин походження за допомогою специфічних антитіл.

3. Проаналізувати локалізацію спітопів антитіл проти модифікованих форм тубуліну на ного ізоформах, розділених за допомогою ІФВРЗ.

4. Розробити методику імунофлюоресцентного фарбування МТ в фіксованих та нефіксонаних параформальдегідом клітинах N. tabacum.

5. Вивчити участь модифікованих форм тубуліну у формуванні різних

типів структур МТ протягом клітинного циклу. _________ ___________

6. Визначити консервативність структурних доменів тубуліну рослин за допомогою антитіл - маркерів доменів тубуліну тварин.

7. Порівняти розташування структурних доменів тубуліну на поверхні нативиих МТ рослин.

Наукова новизна. Вперше було проведено систематичний аналіз гетерогенності тубуліну вищих рослин за допомогою ІФВРЗ та імуноблотингу із специфічними антитілами. В результаті цих досліджень було встановлено, гцо клітини суспензійної культури N. tabacum мають високий рівень гетерогенності тубуліну, який знаходиться на одному рівні з гетерогенністю тубуліну мозку ссавців.

Вперше було доведено присутність поліглютамільованого, нетирозильованого та Д2-тубуліну у складі МТ вищих рослин. Наявність ацетильованого тубуліну вперше було продемонстровано шляхом імуноблотингу. Вперше було порівняно локалізацію снітопів п’яти антитіл - маркерів модифікованих форм тубуліну, на ізоформах а-тубуліну N. іаЬасиш. Знайдено, що одна ізоформа тубуліну може нести до трьох таких епітогіів.

Експериментально було доведено, що С-кінцєві домени обох субодиниць тубуліну, де знаходяться сайти чотирьох з п’яти вивчених модифікацій, локалізовані на поверхні МТ, в той час як ^кінцеві домени обох субодиниць сховані у матриксі МТ.

Практична пінність. В ході виконання роботи були розроблені методичні підходи використання ІФВРЗ для вивчення гетерогенності губулічу рослинного походження та його посттрансляційних модифікацій, що може бути застосопано для дослідження змін цих параметрів протягом розвитку рослини або під впливом фізіологічних факторів (гормони, світло, температура, тощо). Також розроблена методика імунофлюоресцентного фарбування МТ н суспензійних клітинах N. ІаЬасит, яка використовується у дослідженнях структури та складу МТ п Інституті рослинництва (Прага, Чеська Республіка) та Університеті ім. Альберта-Людвіга (Фрайбург, Німеччина).

Серед антитіл, специфічних до тубуліну тварин, були виявлені такі, які можуть бути використані як маркери рослинного а- (Ти-01 та ТІІ-09) та р- (Ти-06) тубуліну у біохімічних або імуноцитохімічних дослідах. До того ж була відібрана панель антитіл, застосування якої дозволяє проводити імунохімічне картування ізоформ рослинного тубуліну.

Результати роботи використовуються при читанні спецкурсу "Скелетні структури клітини та їх функції" на кафедрі клітинної

біології та генетичної інженерії Київського університету ім. Тараса Шевченка.

Основні положення, шо виносяться на захист.

1. Для тубуліну суспензійних клітин N. ІаЬасиш характерна "висока гетерогенність.

2. Тубулін вищих рослин має иоліглютамільовану, тирозильовану, нетирозильовану, ацетильовану та Д2 форми.

3. Епітопи, що .впізнаються антитілами проти модифікованих форм тубуліну, специфічно локалізуються на його ізоформах. Одна ізоформа може нести до трьох таких епітопів. Посттрансляційні модифікації, таким чином, беруть участь у генерації високої гетерогенності тубуліну N. ІаЬасига.

4. Кожна з модифікованих форм тубуліну задіяна у формуванні усіх субпопуляцій МТ кортикальної сітки, препрофазної стрічки, мітотичноі’о веретена та фрагмопласту, за виключенням ацетильованого та А2 тубуліну, які концентруються переважно на полюсах мітотичного веретена та не детектуються у кіпетохорних МТ.

5. Як і у випадку тубуліну тварин, С-кінцеві домени а- та (3-субодиниць тубуліну рослин, де знаходяться сайти більшості з досліджених модифікацій, експоновані на поверхні МТ і тому є вільно доступними для ферментів, що їх здійснюють, ^кінцеві домени обох субодиниць сховані у матриксі МТ.

Апробація роботи. Результати досліджень було представлено на 15-му Міжнародному ботанічному конгресі (Йокогама, Японія, 1993); 8му Європейському цитоскелетиому форумі (Асізі, Італія, 1993); 4-му Європейському конгресі а клітинної біології (Прага, Чеська Республіка, 1994); Міжнародному симпозиумі "Біотехнологія та генетична інженерія рослин" (Київ, 1994); Чесько-Словацькому симпозиумі з цигоскелету (Броно, Чеська республіка, 1995); 10-ому Європейському цитоскелетиому форумі (Стокгольм, Швеція, 1995); Семінарі Європейського товариства молекулярної біології "Контроль циклу клітинного поділу вищих рослин" (Сегед, Угорщина, 1995).

Публікації. Основні положення дисертації викладені у 10 роботах.

Струкура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів та їх обговорення, заключения, висновків та списку літератури, який містить 212 бібліографічних посилань. Робота викладена па 130 сторінках машинопису, і містить 5 таблиц та 14 малюнків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

— -Для --досліджень -використовували'”'клітини' "“5-8-ми'""'денної суспензійної культури (у лог-фазі росту) Nicotiana tabacum штаму VBI-

0, що вирощувалася на середовищі V4 (Opatrny & Opatrna, 1976) у темряві, при температурі 23-25°С та постійному перемішуванні.

Тубулін виділяли із суспензійніх клітин N. tabacum за класичною методикою з використанням йоно-обмінної хроматографії на ДЕАЕ Сефадексі А-50 (Morejohn et al., 1984) з модифікаціями. Чистота отриманого тубуліну складала 80-85%, як було показано шляхом денснтометричного сканування електрофореграм, після його електрофоретичного розділення. Цей білок використовували для карбоксиамідометилювашія (George et al., 1981), що дозволяло запобігти окисленню білків при ІФВРЗ.

ІФВРЗ тубуліну, що був очищений та ісарбоксиамідометильова-ний, здійснювали у поліакриламідному гелі (ПААГ; 230x110x0,5 мм), що містив амфоліни ByoLytes (BioRad, Richmond, СА) з діапазоном pi 3,5-10 при 2500V та температурі 15°С протягом 11 год. (Linharlova et al., 1992). Гелі аналізували на лазерному денситометрі LKB 2202 Uitroscan (LKB, Швеція). Після ІФВРЗ білки переносили на нітроцелюлозні мембрани шляхом капілярного переносу (Albaugh et al., 1987).

Електрофоретичне розділення білків здійснювали у 7,5-10,0%-ному ПААГ, що містив 0,1%-ниий додсцилсульфат натрію (ДСН), згідно методу Леммлі (Laemmli, 1970). Для двомірного електрофорезу стрічку шириною 2-4 мм., що містила ізоформи тубуліну, вирізали з гелю після ІФВРЗ, промивали два рази по 5 хв. у буфері для розчинення зразку (Laemmli, 1970) та поміщали у концентруючий гель. Після електрофорезу білки переносили на нітроцелюлозні мембрани шляхом електроелюції (Towbin et al., 1979). Фарбування білків колоїдним сріблом проводили згідно з методикою Драбера (Draber et al., 1991). Білки у гелях фарбували розчином 0,25%-ного Кумассі діамантового блакитного R-250 у 25%-ному етанолі та 7%-ній оцетовій кислоті протягом ЗО хв.

В експериментах з імуноблотингом (Draber ct al., 1991) використовували антитіла отримані у лабораторії доктора В. Вікліцкі: TU-01, TU-02, TU-03, TU-04, TU-07 та TU-09 проти а-тубуліну мозку свині, антйтіла TU-06, TU-12 та TU-14 проти ß- тубуліну мозку свині, кролячі поліклональні антитіла проти а- та ß-тубуліну, антитіла VI-01 проти віментину. 'Останні використовували як негативний контроль. Модифіковані форми тубуліну вивчали за допомогою антитіл Туг проти

тирозильованого а-тубуліну, Glu проти детирозильованого а-тубуліну (люб'язно надані доктором J. Bulinski, Колумбійський університет, США), 6-11В-1 проти ацетильованого а-тубуліну (люб'язно надані доктором J. Рірегпо, університет Рокфеллера, США),' GT335 проти поліглютамільовапого а- та ß-тубуліну (люб'язно надані доктором А. Wolff, Парижський університет, Франція), L7 проти форми а-тубуліну, що не може бути тирозильована (Л'2-форма; люб'язно надані доктором L. Paturle-Lafancchere, Центр ядерних досліджень, Гренобль, Франція).

Для візуалізації МТ клітини оброблялися протягом 5 хв. ферментами для руйнування клітинної стінки (1%-ний Мацерозим Р-10 та 0,2%-на псктипаза), які розчинювали у БСМТ (буфері для стабілізації мікротрубочок), до складу якого входили 25 мМ ПІПЕС-КОН, pH 6,9, 2 мМ.ЕГТА, 1 мМ MgS04, та фіксувалися протягом ЗО хв. розчином 3,7%-ного параформальдегіду у БСМТ, що містив 1%-ний Тритон Х-100. Після цього клітини поміщали на покривні скельця, котрі були покриті полі-Ь-лізином та фарбували первинними та вторинними антитілами. В деяких випадках клітини після фіксації параформальдегідом переносили до метанолу та ацетону', які були охолоджені до температури -20°С, на 10 та б хв. відповідно. ДНК в клітинах фарбували за допомогою Хехст 33258 (Hoechst 33258), який розчинювали у фосфатному буфері до концентрації 0,4 мкг/мл. Зразки проглядали та фотографували на флюоресцентному мікроскопі Лайтц Ортоплан (Leitz Orthoplan).

Для приготування нефіксованого цитоскелету клітини після мацерації клітинної стінки екстрагували 10 хв. 0,1%-ним розчином Тритону Х-100, у БСМТ, до складу котрого входив також 0,4 М гліцерин та 10 цМ таксол (люб'язно наданий Національним Інститутом Раку, Бетесда, США). Після одноразового промивання у БСМТ+0,4 М гліцерин, клітини переносили до того ж буферу, який містив первинні антитіла. Через 50 хв. клітини одминалися у БСМТ+0.4 М гліцерин, фіксували параформальдегідом. МТ в них фарбували, як описувалося вище. В цьому випадку інкубацію з первинними антитілами не проводили.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

/. Дослідження посттрансляційиих модифікацій тубуліну рослин

Моноклональні антитіла JU-01 та TU-06 впізнають консервативні антигенні детермінанти, що локалізовані відповідно на N-кінцевому

структурному домені а-тубуліну та Н-кінцепому структурному домені Р-тубуліиу (БгаЬег еі аі., 1989). Тому вони були використані як маркери рослинного тубуліну. На загальному екстракті цитоплазматичних білків N. ІаЬасит ці антитіла реагували з білками, що мали відносну молекулярну масу біля 50 кД (Рис. 1а, треки 2 та 3). Не спостерігалася їх реакція з інтими білками; вторинні антитіла також не давали неспецифічної реакції. На відміну від твариного тубуліпу, який при даних умовах електрофорезу розділявся на а- та р-субодиниці, тубулін N. іаЬасит залишався нерозділеним. Але тубулін, який був очищений та карбоксиамідометильований, при електрофорезі розділявся на дві смужки (Рис. 16, трек 1). Результати імуноблотингу зі антитілами ТІІ-01 та Ти-06 продемонстрували, що верхня смужка належала а-тубуліну, в той час як нижня смужка належала р-тубуліну (Рис. 1, треки 2 та 3). Антитіла також фарбували всі типи структур МТ протягом клітинного циклу: кортикальні МТ, препрофазну стрічку, веретено та фрагмопласт.

"а ' ..г ”.. б

Рис. 1. Результати імуноблотингу екстракту цитоплазматичних білків N. tabaeum та білкової фракції, що була збагачена тубуліном, з антитілами проти тубулшу після електрофоретичного розділення у 10%-му ПЛЛГ-ДСН (а) та 7,5-му ПЛЛГ-ДСН.

(а) Реакція антитіл проти тубуліну з екстрактом цитоплазматичних білків. Трек 1, фарбування Кумассі. Треки 2-8, імунофарбувашія з аіггитілами TU-01, TU-06, GT33S, Tyr, Glu, L7 та 6-11В-1 відповідно. Відрізки та числа на лівому краю показують позиції та молекулярну масу специфічних маркерів.

(б) Реакція антитіл проти тубуліну з фракцією білків, збагаченою тубуліном. Трек 1, фарбування Кумассі. Треки 2 - 5, імунофарбування з антитілами TU-01, TU-06, L7 та 6-11В-1 відповідно.

Антитіла GT335, Tyr, Glu, 6-11B-1 та L7 виізиавали лише смужку білку, що відповідає позиції тубуліну (Рис. 1а, треки 4-8). Коли для імуноблотингу брали зразки, в яких субодиниці тубуліну були розділені, антитіла Tyr, Glu, L7, 6-11В-1 реагували з а-тубуліном; антитіла GT335 реагували як з а-, так і з ß-субодиницями. Реакція з антитілами L7 та 6-11В-1 представлена на Рис. 16 (треки 4 та 5). Відсутність реакції з іншими білками в експериментах з імуноблотингом свідчить про специфічність впізнавання антитілами рослинного тубуліну.

2. Гетерогенність тубуліну N. tabacum

За допомогою ІФВРЗ було розділено 22 ізоформи тубуліну N. tabacum (Рис. 2а). Як показало фарбування колоїдним сріблом, після перенесення на нітроцелюлозні мембрани, профіль розділених ІФВРЗ тубулінових ізоформ не змінювався (Рис. 26, трек 2). Кожне з моноклональних антитіл TU-01 (Рис. 26, трек 1) та TU-06 (Рис. 26, трек 3) фабували по 11 ізоформ тубуліну, що відносилися відповідно до а- чи ß-субодиниць. В аналогічних умовах тубуліп мозку свині розділявся по заряду на 23 варіанти (Linhartova et al., 1992), тобто гетерогенність тубуліну N. tabacum відповідає такій мозку ссавців.

Коли білки, що були розділені методом ІФВРЗ, послідовно розділяли згідно молекулярної маси за допомогою методу ПААГ-ДСН електрофорезу, залишалося п’ять ізоформ а-тубуліну та шість ізоформ ß-тубуліну (Рис. 2в) лри тому, що протеолітичні фрагменти тубуліну були відсутні. Розташування ізоформ тубуліну після двомірного електрофорезу свідчило на користь того, що майже всі вони складалися з декількох ізоформ, що розділялися ІФВРЗ. Найбільш ймовірно, що протягом електрофорезу в другому вимірі, відбувається дифузія сусідніх ізоформ. Імуноблотииг з антитілами TU-01 та TU-06 підтвердив належність всіх нижніх ізоформ до ß-тубуліну, а всіх верхніх - до а-тубуліну. Для того, щоб виключити можливість виникнення додаткових ізоформ тубуліну в результаті взаємодії тубуліну з амфолінами під час розділення білків в умовах високої напруги, було проведено ІФВРЗ у другому вимірі. Після цього білки розподілялися по діагоналі гелю, що говорить про неймовірність виникнення артефактних ізоформ цим шляхом (George et al., 1982). Отже, всі контрольні експерименти свідчать про об'єктивність високого числа ізоформ тубуліну, що було визначено ІФВРЗ. Це дає змогу зробити висновок, що у порівнянні з двомірним електрофорезом, ІФВРЗ дозволяє досягти більш чіткого розділення та імунологічної характеристики ізоформ тубуліну.

Рис. 2. Результати вивчення гетерогенності тубуліну в клітинах N. іаЬасит за допомогою ТФВРЗ.

(а) Ізоформи тубуліну N. і:аЬасшп, розділені за допомогою ІФВРЗ та забарвлені Кумассі ЇІ-250 з відповідною денситограмою. Окремі ізоформи тубуліну позначені підрізками під 1-го до 11 для а-тубуліну та під 12 до 22 для ¡3-тубуліну.

(б) Імуноблот ізоформ тубуліну з антитілами проти а- та р-тубуліну. Трек 1, реакція з антитілами 'Ш-01 проти ос-тубуліну. Трек 2, фарбування білків, перенесених на нітроцелюлозну мембрану, за допомогою колоїдного срібла. Трек 3, реакція з антитілами ТІІ-06 проти р-тубуліну.

(в) Двумірний електрофорез тубуліну N. ЬаЬасит.. Білки після розділення шляхом ІФВРЗ, • розділялися згідно молекулярної вата ПААГ-ДСН електрофорезом та фарбувалися Кумассі И-250.

Табл. 1. Реакція антитіл проти модифікованих форм та різних структурних доменів тубуліну з ізоформами тубуліну N. ІаЬасит

Ізоформа________________________Антитіла_______________________

ти-ти-ти-ти-ти-ти-Туг аи 1,7 б-пв-1 тззз ти- ти ти-

01 02 03 04 07 09 Об 12 14

аі + + + + + + ± - - - -

а2 + + + + + + + - - - -

аЗ + - - - - + - + - + ' -

а4 + + + + + + - - - - +

а5 4* ’ + 4- + + ‘ + + - - +

аб + + + + + + + - - 4 4

а7 + + + - - _ ' +

а8 4* - - - - + - - + -

а9 + + ■ + + + + ± - - + +

аЮ + + + + + + + - - ' - +

аіі + - - - - + ± _ _ +

012 + + - -

різ - + - -

014 + + - +

015 + + + -

016 + + + +

р17 + + - -

018 , + + + -

рі9 ' + + + -

020 + + + -

р21 - + + -

Р22 - + - -

+, реакція сильна; +, реакція слабка; -, реакція відсутня

3. Розподіл епітопів - маркерів модифікованих форм тубуліну на його ізоформах

Епітопи, що впізнаються антитілами проти модифікованих форм' тубуліну специфічно розташовувалися на окремих його ізоформах (Табл. 1). Епітопи антитіл проти поліглютамільопаного тубуліну були знайдені на ізоформах обох а- та (3-субодипиць, а епітопи антитіл

проти тирозильованого, нетирозильопапого, ацстильованого та Д2-тубуліпу локалізувалися лише на ізоформах а-субодиниці тубуліну. Антитіла Glu та L7 реагували лише з однією ізоформою кожне (Табл.— ї). Антитіла Tyr, GT335 та 6-11В-1 давали реакцію з п’ятьма та більше ізоформами тубуліну (Табл. 1). Оскільки 14 з 22 ізоформ тубуліну N. tabacum було поліглютамільовано, це може свідчити на користь того, що дана модифікація відіграє роль, важливу для регуляції властивостей МТ рослин. Так було показано, що поліглютамілювання в клітинах тварин регулює зв'язування тубуліну та т-білку (Boucher et al., 1994). Білок, імунологічно гомологічний тваринному т-білтеу, був знайдений в клітинах кукурудзи (Vantard et al., 1991). Цілком вірогідно, що поліглютамілювання тубуліну у вищих рослин може відігравати аналогічні функції. ,

Три ізоформи а-тубуліну (аб, а9, all) були поліглютамільовані, ацетильовані та тирозильовані одночасно (Табл. 1). Це може бути наслідком трьох ситуацій: а) ізоформи тубуліну не розділилися остаточно; б) декілька типів по-різному модифікованих молекул змішані у одній смужці білку; в) одна ізоформа дійсно може нести декілька модифікацій. Edde et al. (1992) показали, що тирозилювання/ детирозилювання може відбуватись на тій же молекулі тубуліну, що лоліглютамілюється. Очевидно, що рівень гетерогенності тубуліну може зростати саме внаслідок комбінації багатьох посттрансляційних модифікацій на продукті одного гену.

4. Локалізація модифікованих форм тубуліну а клітинах N. tabacum протягом різних стадій клітинного циклу

Роль модифікованих форм тубуліну у формуванні різних тшііи структур МТ рослин протягом клітинного циклу вивчалася за допомогою непрямої імунофлюоресцентної мікроскопії. Антитіла GT335 фарбували всі інтерфазні МТ, МТ препрофазної стрічки, веретена та фрагмоїіласту (Рис. За,б). Однакову з цією реакцію давали антитіла проти тирозильованого a-тубуліну (Рис. Зв,г). Детирозильований а-тубулін також був знайдений у МТ протягом усіх стадій клітинного циклу (Рис. 4д,е). Але характер фарбування відрізнявся під того, котрий давали антитіла GT335 та Туг. Імуношшшівшш матеріал для цих антитіл був накопичений у дискретних кластерах з різною інтенсивністю свічення вздовж МТ, в той час як інші ділянки МТ не давали реакції з антитілами.

Локалізація Д2-тубуліну була схожа на локалізацію детирозильо-лаиого тубуліну. Інтерфазні МТ так само характеризувалися кластсрним типом імунофарбування (Рис 4а,б). Подвійне фарбування з антитілами

"ГО-ОІ та 1-7 підтвердило розташування кожно кластеру на МТ. Дослідження за допомогою імуноелектроннох мікроскопії реакції антитіл Туг та Оіи з МТ клітин ліній СУ1 та РІК2 виявило, шо кожна МТ включала в себе як тирозильований, так і нетирозильований тубулін (ОеиепБ еі аі., 1986). При цьому ці форми тубуліну також могли утворювати дискретні кластери та зустрічалися в МТ не у однакових кількостях. Приймаючи до уваги ці дані, можна зробити висновок, що імунофлюоресцентна мікроскопія виявляє лише місця переважного накопичення модифікованих форм тубуліну, а їх кількість в окремих місцях МТ може бути низчою за поріг чутливості методу. Тому можливо, що в клітинах N. ІаЬасиїп детирозильований та Д2-тубулін також присутні й у інших місцях МТ, але у кількості, яка виходить па межі чутливості методу імунофлюоресцентної мікроскопії. Д2-тубулін також був ідентифікований у пренрофазній стрічці, мітотичному веретені та фрагмонласті. В мітотичному веретені антитіла 1.7 впізнавали переважно антигени на полюсі веретена та майже зовсім не реагували з кінетохорними МТ. Ацстильована форма також була знайдена у складі МТ протягом всіх стадій клітинного циклу. У мітотичному веретені антигени антитіл 6-11В-1 переважно концентрувалися на полюсах (Рис. 4в,г).

Рис. 3. Локалізація поліглютамільопаного та тирозильованого тубуліну в клітинах N. іаЬасит.

(а,б) подвійне фарбування кортикальних МТ поліклональними антитілами проти тубулну (а) та антитілами СТ335 проти поліглютамілбоианого а- та р-тубуліну (б).

(в-д) Потрійне фарбування фрагмопласту антитілами Ти-01 (в), антитілами 'Гуг(г) проти тирозильованого а-тубуліну та ДПК-спецнфічшім барвником (д). Відрізки відповідають 10 мкм.

?::с. 4. Локалізація Д2-форми, ацетильоваиого та дегиролкльованого а-тубуліпу у клітинах N. tabacuni.

(а,б) Подвійне фарбування кортикальних МТ антитілами TU-01 (а) та

антитілами L7 проти Д2-форми а-тубуліну(б).

(с,г) Лодиііше фарбування мітотичного веретена иоліклональними антитілами проти тубуліну (в) та мшнинимн антитілами 6-11В-1 протти ацетильованого а-тубуліну (г).

(д,е) Подвійне фарбування фрагмопласту антитілами TU-01 (Д) та антитілами GIu проти детирозильованото а-тубуліну (е).

Відрізки відповідають 10 мкм.

Аналогічні дані щодо тирозильованого а-тубуліну були отримані на клітинах інших видів квіткових рослин (Wehland et al., 1984; Astrom, 1991; Del-Casino ct al., 1993). Наявність у МТках тирозильованої форми тубуліну відповідає динамічному статусу МТ (Buiinsky & Gunderscn, 1991). Висока динамічність рослинних МТ була показана у експериментах з фотовицвітанням мікроін'єкованого у рослинні клітини флюоресцентного тубуліну з мозку ссавців (Hush et а!., 1994). З іншого боку вважається, що детирозильонаний (Buiinsky & Gundersen, 1991), ацетильований (Webster & Borisy, 1989) та Д2-(Paturle-Lafanechere et al., 1994) тубуліни виступають як маркери більш стабільних МТ. У попередніх експериментах було показано, що орієнтація МТ та лозшііговання целюлозних мікрофібрил клітинної стінки являють собою взаємозв’язані процеси. При цьому, як МТ, так і целюлозні мікрофіламенти звичайно орієнтуються перпендикулярно до

осі елонгації (Суг, 1994). Стабілізація кортикальних поперечних МІ може сприяти формуванню целюлозних мікрофібрил у такому ж .напрямку та, таким чином, вести до видовження клітин N. ЬаЬасиш. іншими словами, стабілізація поперечних кортикальних мікротрубочок може бути елементом поляризації клітин та брати участь у визначенні напрямку їх експансії.

5. Дослідження структурних доменів тубуліиу вищих рослин

Для аналізу структурних доменів тубуліну була використана панель специфічних антитіл (Табл. 2). В експериментах з імуноблотингом екстракту цитоплазматичних білків всі антитіла реагували з білком з молекулярною масою біля 50 кД. Оскільки такий самий білок впізнавали й антитіла Ти-01 та Ти-06, можна зробити висновок, що вони специфічно реагують з тубуліном рослин.

Далі, ми вивчили реакцію антитіл з ізоформами тубуліну, що були розілені за допомогою ІФВРЗ. Реакція одних антитіл відрізнялася, тоді як реакція другої частини співпадала з такою антитіл-маркерів. Згідно з реактивністю ізоформ а-тубуліну з антитілами (Табл. 1), їх було віднесено до двох груп. До першої групи були віднесені ізоформи, яки впізнавалися всіма антитілами з Ти-панелі, тобто Ти-01, Ти-02, Ти-03, Ти-04, ти-07 та ТТЛ-ОЭ. До другої групи були віднесені ізоформи, яки впізнавалися лише антитілами ТІІ-01 та ТІЛ-09. Реакція антитіл проти [3-тубуліну була більш гетерогенною і дозволила виділити принаймні чотири групи ізоформ: 1) ті, що впізнавалися лише антитілами ТІІ-06; 2) ті, що впізнавалися антитілами Ти-06 та Ти-12; 3) ті, що впізнавалися антитілами ТО-Об та Ти-14; 4) ті, що впізнавалися антитілами Ти-06, Ти-12 та ТО-14 (Табл. 1). Збільшення панелі антитіл приведе до такої ситуації,, коли кожна ізоформа буде впізнаватися унікальною скупиною антитіл, що. дозволить їх "паспортизацію". Наприклад, застосування антитіл проти посттрансляційних модифікацій тубуліиу: тирозильованої,

ацетильованої та поліглютамільованої форм підвищувало кількість груп ізоформ а-тубуліну до восьми (Таб. 1).

Далі реакція антитіл ТІІ-панелі з кортикальними МТ, прсцрофазпою стрічкою, мітотичним веретеном та фрагмопластом порівнювалася на фіксованих параформальдегідом клітинах. У цілому, розбіжності в реакції антитіл з ізоформами тубуліиу, що спостерігалися у експериментах з імуноблотингом, не співпадали з результатам цитологічного аналізу. Антитіла Ти-04, ТІ/-07, Ти-09, Ти-12 та ТІМ4 фарбували всі типи МТ, так само як антитіла Ти-01 та ТІІ-06. На відміну від цього, антитіла Ти-02 та Ти-03 реагували лише з тубуліном

у складі препрофазної стрічки, веретена та фрагмопласту, і не реагували з кортикальними МТ. Постфіксація клітин N. tabacum

- метанолом та ацетоном -при- -20°С не змінювала характеру-реакції антитіл. Ці дані свідчать на користь того, що відсутність реакції з кортикальними МТ не виникає за рахунок конформаційного маскування епітопів для цих антитіл. Відомо, що антитіла TU-03 фарбують базальний шар епідермісу шкіри людини та миші, де відбуваються процеси інтенсивного поділу клітин (Draber et al., 1987, 1988). Дві гіпотези можуть бути запропоновані для пояснення даного феномену. Перша, кількість антигену антитіл дуже мала на протязі інтерфази та його кількість пакопичуюється при вході клітини до М-фази. Друга, антиген(и) антитіл на протязі інтерфази можуть бути замасковані специфічними білками. Оскільки антитіла TU-02, TU-03, TU-04 та TU-07 впізнавали одні і тіж самі ізоформи тубуліну, найбільш вірогідною виглядяє друга гіпотеза.

Різна специфічність реакції антитіл з МТ також спостерігалася в експериментах з нефіксованими параформальдегідом кліти них.. Згідно цієї специфічності, антитіла можуть бути розділені на дві групи. До першої групи відносяться антитіла TU-01, TU-02, TU-03, TU-04, TU-09 та 6-11В-1 проти N-кінцевого домену а-тубуліну та TU-06 проти N-кінцевого домену р-тубуліну, які фарбували МТ тільки після фіксації параформальдегідом та зовсім не реагували з таксол-стабілізопаними МТ, що не були фіксовані. До другої групи слід віднести антитіла TU-07 проти а-тубуліну, антитіла Туг проти С-кіїщевого домену а-тубуліну, TU-12 та TU-14 проти С-кінцевого домену Р-тубуліну та GT335 проти С-кінценого домену обох субодиниць, які в протилежність антитілам, що були віднесені до першої групи, фарбували як фіксовані, так і нефіксовані параформальдегідом МТ. В цих дослідах таксол навряд чи міг впливати на реакцію МТ з антитілами. По-перше, з МТ, які були стабілізовані таксолом, а потім фіксовані параформальдегідом, антитіла першої групи давали позитивну реакцію. По-друге, мікроін'єковані у тваринні клітини антитіла також не фарбували МТ (Draber et al.,

1989).

Про те, що негативна реакція антитіл проти епітопів N-кінцсвого домену тубуліну з нефіксованими МТ не виникає в результаті маскування епітопів специфічними білками свідчать дослідження Оки з співавт. (Oka et al., 1995). В їх експериментах обробка МТ, стабілізованих таксолом, буфером з 0,4 М КС1, який спричиняє дисоціацію комнлекса МТ-ассоційовані білки in vitro, не змінювала характеру реакції антитіл, які не реагували з нефіксованими МТ. Таким чином, різниця u реакції антитіл, яка спостерігається у . наших

експериментах, відображає структурні особливості організації МТ іп vivo. Це відповідає моделі, що С-кінцеві домени обох субодиниць знаходяться на поверхні стінки МТ, в той час,, як N-кінцеві домени сховані у матриксі МТ. Вважається, що домени тубуліну дуже мобільні та можуть змінювати свою орієнтацію під дією денатуруючих агентів, наприклад, фіксаторів. Тому фіксація призводить до релаксації нативної конформації тубуліну, після чого антитіла можуть впізнавати відповідні спітопи (Draber et al., 1989; Oka et al., 1995).

Табл. 2. Реакція аитітил проти структурних доменів тубуліну з мікротрубочками N. tábacum

Антитіла Доменна специфічність3 MT

Фіксовані Нефіксовані

TU-01 «N • + -

TU-02 °К + -

TU-03 «N + -

TU-04 «с +

TU-06 К + -

TU-07 a + +

TU-09 «N ' + -

TU-12 Pc + +

TU-13 Pn + - .

TU-14 Pc + +

Тут ac + ■ +

GT335 “cPc + +

6-11-В1 “n + -

аа[ч( - N-кінцевий домен a-тубуліну; ac - С- кінцевіш домен а- тубуліну; pN - N-кінцевий домен р- тубуліну; рс - С- кінцевий домен (3- тубуліну. ■

Нативна орієнтація доменів тубуліну корелює з їх функціями. N-кінцеві домени є суттєвими для процесів полімеризації тубуліну та формування МТ, тому логічно, що вони сховані у стінці МТ або знаходяться з її внутрішньої сторони. В протилежність, С-кінці не так важливі для полімеризації МТ іп vitro (Saoudi et al., 1995), але вони відіграють важливу, роль в регуляції взаємодії МТ та ассоційованих білків (принаймні т-білку Boucher et al., 1994). Сайти багатьох посттрансляційних модифікацій (тирозилювання/детирозилювання,

поліглютамілювання, полігліцилювання та фосфорилюванпя)

знаходяться саме на С-кінцевих доменах. Як ці домени доступні для антитіл у иативних МТ, так вони доступні для ферментів, котрі приймають участь у посттрансляційішх модифікаціях. Тобто у вищих рослин варіабельні С-кіпцеві домени тубуліну мають всі атрибути, щоб вважатися регуляторами функціювання МТ.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що тубулін вищих рослин характеризується наявністю

поліглютамільованої, тирозильованої, нетирозильованої,

ацетильованої та А2 (форма а-тубуліну, що не може тирозилюватися) форм.

2. Гетерогенність тубуліну N. ІаЬасит є високою та знаходиться на рівні гетерогенності тубуліну мозку ссавців. •

3. Одна ізоформа тубуліну рослин може нести до трьох посттрансляційних модифікацій. Посттрансляційні модифікації, таким чином, с однією з причин високої гетерогенності тубуліну N. ІаЬасиш.

4. Усі модифіковані форми тубуліну є важливими для функціювання кортикальної сітки МТ, препрофазної стрічки, мітотичного веретена та фрагмошгасту. Жодна форма не накопичується у окремих субпопуляціях МТ протягом інтерфази.

5. С-кінцеві домени а- та ¡З-тубуліну, де знаходяться сайти багатьох посттрансляційних модифікацій, розташовані на поверхні стінки МТ, де вони можуть приймати участь у регуляції динаміки МТ та (чи) взаємодії МТ з іншими білками, ^кінцеві домени обох субодиниць сховані у матриксі МТ.

6. Панель антитіл, що була протестована, може бути використована для картування окремих ізоформ а- та р-тубуліну та дослідження . динаміки їх експресії під час різноманітних фізіологічних процесів.

7. Знайдені моноклональні антитіла ТІГ-02 та ТІІ-03, які впізнають спітоп(и) а-тубуліну росліш тільки в тих клітинах, що діляться.

8. Проведені експерименти дають підстави вважати, що шляхи регуляції динаміки та організації МТ, котрі базуються на посттрансляційшіх модифікаціях тубуліну, в клітинах рослин та тварин характеризуються еволюційною консервативністю.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Smertenko А.Р., Blume Ya.B., Viklicky V., Opatrny Z., Draber P. High charge heterogeneity of Nicotiana tabacum tubulin // Дон. HAH України. - 1996. - Mb 6, - прийнято до друку.

2. Smertenko A., Opatrny Z., Blume Ya., Viklicky V., Draber P. Probing Nicotiana tabacum microtubules with monoclonal anti-tubuiin antibodies // Cell Biol. Int. - 1994. - v. 18, N 5. - P. 450.

3. Smertenko A. P., Strashnyuk N. М., Blume Ya. B. Taxol action on microtubules of control and taxol-resistant plants of Nicotiana plumbaginifolia // Cell Biol. Int. - 1994. - v. 18, N 5. - P. 447.

4. Страшнюк H.M., Блюм Я.Б., Смертснко А.П., Сидоров В.А., Глеба Ю.Ю. Получение амипрофосмелілустойчивьіх линий Nicotiana plumbaginifolia, содержащих мутантный тубулин // Докл. Акад. Наук (Россия) - 1993. - т. 332, № 2. - С. 240-243.

5. Чабан Х.И., Смергенко А.П., Рипецкий Р.Т., Блюм Я.Б. Исследование роли микротрубочек в гравитропизме протонематических клеток мхов // Цитология и генетика - 1995. - т. 29, N 4. - С. 3-11.

6. Yemets A.I., Smertenko А.Р., Solodushko V.G., Kundel'chuk O.P., Blume Ya.B. Asymmetric somatic hybrids with mutant p-tubulin resistant to amiprophosmethyl// Proc. of Int. Symp. "Plant Mol. Biol. & Biotech.” (New Delhi, December 14-17, 1994). - 1995. - P. 45-51.

7.Smertenko A.P., Blume Ya.B., Opatrny Z., Draber P., Viklicky V. Posltranslational modifications of Nicotiana tabacum tubulin // Abstr. of 10th Eur. Cytoskeletal Forum (27-31 May, 1995, Stockholm, Sweden). - 1995. - P. 15.

8. Snjertenko A., Blume Ya., Viclicky V., Draber P. Distribution of tubulin modifications in the Nicotiana tabacum microtubules // Abstr. of EMBO Workshop "Control of Cell Division Cycle in Higher Plants", (October 5-7, 1995, Szeged, Hungary). - 1995. - P. 65.

9. Smertenko A. P., Blume Ya. B. Taxol effects on mitotic spindles of dividing protoplasts // Abstr. of 8lh Eur. Cytoskeletal Forum (September 12-16, 1993, Assisi, Italy), p.46.

lO.Strashnyuk N. М., Smcretenko A. P., Solodushko V. G., Blume Ya. B. Taxol-resistant mutants of Nicotiana plumbaginifolia as a tool for investigation of plant microtubules //Abstr. of XV Int. Botanical Congress (August 28-September 3, 1993, Yokohama, Japan).- 1993. - P. 336.

Smertenko A. P. Studying of posttranslational modifications and structural domains of plant tubulin using specific antibodies..

Scientific Degree Candidate of Biological Sciences Thesis; speciality

03.00.25 - Cell Biology. Institute, of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of the Ukraine, Kiyiv, 1996.

The results of 10 scientific publications are defended. '

Tyrosinated, detyrosinacd, acetylated and Д-2 (nontyrosinable) forms of a-tubulin as well as polyglutamylated forms of a- and p-tubulin are involved in the organization of plant microtubules (MTs). High resolution isoelectric focusing revealed that tubulin in N. tabacum cclls is represented by 11 charge variants for a-subunit and 11 charge variants for P-subunit. Each of modified epitopes is localized on the unique pattern of tubulin isoforms, moreover, one isoform can carry up to three different modifications. Thus, modification is a cause of high tubulin heterogeneity in N. tabacum. All modified. forms of tubulin are involved in the organization of cortical MTs, preprophase band, mitotic spindle and phragmoplast. However, antibodies against acetylated and A2-tubulin gave no reaction with kinetochore MTs of mitotic spindle. The C-terminal domains of both tubulin subunits, where are localized the sites of all modifications except acétylation, are exposed on the surface of native MX and potentially can be involved in the regulation of properties and functions of MTs. In contrast, N-terminal domains are hidden in the MTs lattice. The results obtained revealed evolutional conscrvativity of mechanisms for the regulation of MTs functions.

Смертенко А.П. Изучение посггрансляпионных модификаций и

структурных доменов тубулнна растений при помощи моноклональных антител.

•Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.25 - клеточная биология, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1996.

Защищается 10 научных работ по теме диссертации, в которых было показано, что в функционировании микротрубочек (МТ) высших растений задействованы тирози лированная, ацетилированная, детирозилированная, Д2 (нетирозилируемая) формы а-тубулина и полиглютамилированная форма а- и р-тубулина. Используя метод высокоразрешающего изоэлектрофокусирования было установлено, что тубулин а клетках N. tabacum представлен 22-мя изоформами. Одна изоформа может нести до трех модификаций. Следовательно, посттрансляционпые модификации ' способствуют высокой

гетерогенности тубулина N. ЬаЬасиш. Каждая из форм тубулин, участвовала в формированиии всех типов организации МТ кортикальной сети, препрофазной ленте, митотическом веретене і фрагмопласте. При этом, антитела против ацетилированной и Д2'фор? а-тубулина не реагировали с кинетохорпыми МТ веретена Экспериментально продемонстрировано, что С-концевые сгруктурньк домены обеих субъединиц тубулина, где находятся, исключа; ацетилирование, сайты остальных проанализированных модификаций располагаются на поверхности нативной МТ и, таким образом, могут принимать участие в регуляции их функций. Ы-концевые домснь спрятаны в матриксе МТ. Результаты работы свидетельствуют об эволюционной консервативности механизмов регуляции функциональных аспектов МТ.

Ключові слова: мікротрубочки, тубулін, рослини,

пострансляційні модифікації, гетерогенність, структурні домеии, антитіла, клітинний цикл. . •