Диссертации » Биологические науки » Молекулярная биология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5"



На правах рукописи

ТРАХТМАН НАТАЛИЯ ВИКТОРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНОВ АМ6ЕР-СУПРЕССОРНЫХ тРНК БАКТЕРИОФАГА Т5

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО-2004

Работа выполнена в лаборатории структурно-функционального анализа генетических систем микроорганизмов Института биохимии и физиология микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук В.Н. Ксенэекко

доктор биологических наук Я. И. Бурьянов

кандидат биологических наук O.A. Колесникова

Институт молекулярной генетики РАН

Зашита диссертации состоится "¿3 " де^а^^Я 200^ г- в 45 час. ЛО мин. на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН

по адресу: 142292, Московская обл., г, Пущине.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Автореферат разослан "4?" HÚA&j-JL 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кашщдат биологических наук

Он

Смолихнна Т.Н.

Актуальность проблемы. Установление взаимосвязи между структурой и функцией биомакромолекул представляет собой одну из ключевых задач молекулярной биологии, в рамках которой особо важное место занимает проблема специфического белок-нуклеинового взаимодействия. Значимость структурно-функциональных исследований на модели тРНК обусловлена тем, что: 1) в процессе функционирования молекула тРНК специфически взаимодействует не менее чем с 20-ю различными белками; 2) в ei структуре удивительным образом сочетаются консервативность элементов, определяющих функциональное единство всех тРНК в биосинтезе белка, и уникальность каждой нуклеотндной последовательности, что обеспечивает строгую специфичность биохимических реакций, протекающих с их участием. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый к настоящему времени в изучении первичной структуры тРНК я установлении их функционального разнообразия, молекулярные механизмы взаимодействия тРНК с компонентами белокснцтезнруюшего аппарата клетки и многочисленными ферментами процессии га остаются ещв во многом невыясненными.

Особый интерес представляет изучение элементов структуры тРНК, которые определяют строгую селективность процесса нхпшоацнлнровання соответствующими амнноацнл-гРНК-сннтетазами (АРСаза), с использованием в качестве модельных систем молекул тРНК н АРСаз Е. coli. Исходным этаном такого рода исследований является поиск консервативных элементов в изоакиепторных тРНК, которые, по всей видимости, и определяют специфичность этих взаимодействий. В случае Е coli структурная база подобного рода исследований может быть значительно расширена за счет привлечения информации о структурных особенностях тРНК, кодируемых бактериофагами, но испо.тьзующих тог же трансляционный аппарат. В этом отношении интересной моделью является бактериофаг Т5, который кодирует тРНК, специфичные ко всем 20-ти аминокислотам, участвующим в белковом синтезе, а также ряд изоакпепторов. Привлекательность данной модели обусловлена уникальными структурными особенностями этих тРНК. Подавляющее большинство из ник имеют существенные отклонения от стандартной мелели "клеверного листа" и низкий уровень структурного сходства с соответствующими тРНК Е, coli. Таким образом, изучение фагоспеиифнческих тРНК может в значительной степени прояснить вопрос о роли отдельных нуклеотидных оснований в структуре тРНК, а также о роли общей конформадии этих молекул в процессе их функционирования в клетке.

ЦНБ МСХА !

фонд научной литературу-1

3 МО ff

Цель н задачи исследования. Настоящая работа являлась частью проводимого в течение многих лег в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН комплексного исследования транспортных РНК, кодируемых бактериофагом Т5. Ее основная цель заключалась в изучении структурно-функциональных свойств тРНК бактериофага Т5. В соответствии с целью работы были определены следующие задачи:

• Завершить определение нуклеотидной последовательности области генов тРНК бактериофага Т5 и провести её анализ.

• Охарактеризовать регулягорные элементы транскрипции, обнаруженные в указанной области генома фага Т5,

• Апробировать метод ПЦР-опосредованного мутагенеза для направленного введения нуклеотщиых замен в гены тРНК н получить с его помощью полный набор клонированных генов амбер-супрессорньк тРНК бактериофага Т5.

• Определить эффективность супрессии и аминокислотную специфичность полученных амбер-супрессоров.

Научная новизна. Полученные в данной работе результаты являются приоритетными я имеют несомненную теоретическую ценность, В ходе работы завершено определение нуклеотидной последовательности области локализации генов тРНК фага Т5 (14530 п,н.). Показано, что эта область имеет мозаичную структуру, в которой гены 25 тРНК распределены между 9 генами, кодирующими РНК с неизвестными функциями, и 26 открытыми рамками считывания (ОРС). В ходе анализа секвенированного участка ДНК обнаружены яуклеотидные последовательности, характерные для промоторов и терминаторов транскрипции прокариот. Эти регулягорные элементы были клонированы в специализированных векторах и определена их эффективность в клетках £. соИ

Получена и охарактеризована коллекция генов амбер-супрес сорных тРНК бактериофага Т5, Выявлен ряд интересных особенностей в структуре тРНК> влияющих на эффективность супрессии. Результаты определения специфичности аминоацилирования амбер-супрес сорных тРНК позволили оценить вклад аигикодона в их узнавание соответствующими аминозцшг-тРНК-синтетазами. Полученные в ходе этих исследований результаты значительно обогащают базу данных о структурных основах взаимодействия тРНК с компонентами трансляционного аппарата £ соИ. Практическая значимость работы. Несмотря на то, что настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований, данные, полученные в ходе этой работы, могут найти практическое применение. Прежде всего полученная коллекция

фагоспецифичньн амбер-супрессоров может быть использована в экспериментах по белковой инженерии для быстрой проверки влияния тех дли иных аминокислотных замен на активность белков. Кроме того, рехомбанантяые плазмиды, содержащие гены фаговых тРНК, узнающих редкие для Е. coli кодояы, могут использоваться для оптимизации экспрессия генов, ОРС которых обогащены этими кодонами. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 16-ом и 17-ом Международных рабочих совещаниях по тРНК (США, 1995; Япония, 1997), атакже на научной конференции молодых ученых гЛущино (г, Пущнио, 1996). Публнкадни. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 3 тезисов. Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на

_ страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков и 16 таблиц. Список

литературы включает 162 источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1] ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нуклмпадши последовательность оСлмтв пво> тРНК я ci аямиз

Гены тРНК и других стабильных РНК с неизвестными функциями были картированы ранее на участке между 21,1% н 323% длины молекулы ДНК фага Т5 (Казанцев и др., 1979; Hunt et al., 1980), К началу данной работы была установлена нуклсотидная последовательность чуть более половины указанной области (8592 п.н.) (Ksenzenko et al., 1987; JCsenzeako el al,, 1992). Секвенирование остальной ее части проводили методом дидезокситерменирования, В качестве матриц использовали набор рекомбянанпшх шдамид и одноцепочечных бактериофагов с клонированными фрагментами ДНК из указанной области, полученных нами соответственно на основе векторов pUC18/t9 и фагов М13трШ19. На завершающей стадии секвеннрование проводили с использованием в качестве матрицы ДНК фага Т5 и специфических прайм еров, синтезированных на основе данных об уже установленной последовательности. На протяжении всей длины последовательность была прочитана по двум цепям. В результате была установлена полная нуклеотидная последовательность области генов тРНК фага TJ длиной 14530 п.н, которая была зарегистрирована в базе данных EMBL/GenBank/DDBJ под номером AJ585756. Организация генов в данной области схематически представлена на Ряс. 1.

tía ПЛ j »Mt rut MM

г* гтп^

»IMt

«n

«it níi + staati TjrT<teu cyi

34,ÏW «ww—~

tra I

Г» I I

*a ni* WAIVk Si« Ut fcjüilal T SerlWlill NUI1 ' OI k> 1711M

mit f t *«í.1if *nlUf f AWÏ14+ \ t t ¡rala »

eiU«|IW Pb ViÉJWWH luí №UI ffi. Ctatdil TV Ut!M»

Рис. 1. Схема области генов тРНК бактериофага Т5. Границы области указаны в процентах длины физической карго ДНК фага. Использованы следующие обозначения: гены тРНК (с указанием аминокислотной специфичности

соответствующих тРНК); ОРС; Ш- гены стабильных РНК с неизвестными функциями; ^ - промотор (флажок указывает направление транскрипции), Ш- -терминатор.

а) Локализация н анализ генов тРИК

Локализацию генов тРНК в сехвеняро ванной области проводили на основании наличия элементов первичной и вторичной структур, характерных для этих макромолекул. В результате были локализованы геаы для 25-ти тРНК. Оказалось, что фаг Т5 кодирует тРНК, специфичные ко всем 20-ти аминокислотам, учавствующим в белковом синтезе. В их числе были обнаружены 3 изоакцепторные сери новые, 2 изолейцнноаые и 2 глутаминовые тРНК. Кроме того, был локализован ген для иницизторной формилметиониновой тРНК. Следует отметить, что ген тРНК01"! по-видимому является псевдогеном поскольку в суммарном препарате фагоспецифичных стабильных РНК соответствующей тРНК обнаружено не было (Ksenzenko et ai,, 1982). Обращает на себя внимание, что все тРНК фага Т5, кроме тРНК*1®, тРНК^э и тРНК^0. имеют существенные отклонения от канонической модели "клеверного листа", заключающиеся 1) в замене консервативных и полуконсервативных оснований, многие из которых существенны при образовании трехмерной L-образной структуры; 2) в отсутствии комплсментарностн оснований в шпильках, а также 3) во вставке добавочных нуклеотндных остатков в некоторых участках молекулы. Кроме того, они обнаруживают низкий уровень гомологии с соответствующим и тРНК R coli, причем различия в ряде случаев касаются тех элементов структуры, которые были определены как элементы специфичности для АРСаз £ coli.

Анализ структуры антикодонов всех тРНК фага Т5 показывает строгие закономерности встречаемости оснований в "wobble" - положении, В частности, у всех

тРНК (за исключением тРНК^г). специфичных к аминокислотам, кодируемым кодоиаыи, относящимися к несмешанным семействам, в указанном положении всегда встречается уридин. Ранее было показано, что в случае тРНК фага Т5„ специфичных к лейцину, глицяну, сери ну (тРНК5"!) и пролину U в положении 34 не модифицирован (Shlyapnikov et al,, 1985; Шляпников и др. 1987; Щшшиков и Ксвнзенко, 1994). Можно предположить, что и в случае оставшихся тРНК из этого семейства (tPHK^Vjgc, tPHK^ugu и tPHKviiuac) сохраняется такая же ситуация. Согласно современным представлениям, основанным на изучении прежде всего митохондрнальных тРНК, отсутствие модификации U в положении 34, позволяет им декодировать все четыре ходона несмешанных семейств. С учетом этого обстоятельства, общий декодирующий потенциал фага Т5 делает возможным трансляцию всех кодонов, за исключением лейцшаовых (UUR) и аргинииовых (CGN) кодонов.

Роль фагоспецифкчных тРНК обычно рассматривают с точки зрения их участия в модуляции процесса трансляции фаговых мРНК. В этой связи обсуждается две идеи. Одна из них заключается в том, что фаговые тРНК дополняют количество пзоакцепторных минорных тРНК клетки-хозяина для адаптации трансляции фагоспеонфячных мРНК, содержащих редкие д.тя хозяйской клетки кодонь), Смысл второй идеи состоит в том, что фаговые тРНК необходимы дяя оптимизации трансляции фагоспецифичных мРНК, в тех случаях, когда частота встречаемости кодонов ОРС фага, отличается от таковой в геноме хозяина. Обе эти гипотезы находят очевидное подтверждение в случае фага Т4, который кодирует всего 8 тРНК (Kuitísawa, 2002). Гораздо менее однозначная ситуация возникает в тех случаях, когда бактериофаг кодирует почти полный набор тРНК, как например бактериофаг k.vp40.

Для оценки возможного вклада тРНК в оптимизацию трансляции фагоспецнфичных мРНК нами была проанализирована частота встречаемости кодонов всех ОРС в геноме фага Т5 (недавно аннатирована под номером AY543070 в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ), Известно, что фаг Г5 имеет двустадийный механизм ввода ДНК в хозяйскую клетку и на первой стадии вводится только участок ДНК, содержащий предраииие гены (McCorqiiodale and Warner, 1988), Поскольку гены тРНК относятся к ранним генам и их экспрессия начинается уже после выключения экспрессии предранних генов, анализ проводился раздельно для ОРС из области предранних генов и ОРС ранних и поздних генов. Из сравнения полученных данных с данными по частоте встречаемости кодонов в ОРС £, coli (Kunisawa, 2002) можно

сделать вывод, что рассматриваемые выше гипотезы подтверждаются прежде всего в случае арпшиновых кодонов AGR, являющихся одними из наиболее редких у Е. colt и в лредраниих генах фага TS, ко весьма часто встречающихся в ранвмх и поздних генах этого фага, а также, хотя и в меньшей степени, лейцкнового кодона CUA и изолейцинового кодона AUA, В случае тРНК Asn, Glu, Gly, Lys, Pro, Thr, Туг и Val мы также наблюдаем корреляцию между присутствием этих тРНК в геноме и более высокой частотой использования соответствующих кодонов в ОРС ранних и поздних генов фага. Из этих наблюдений можно выдвинуть предположение, что и в случае фага Т5 кодируемые им тРНК принимают участие в модуляции трансляционного аппарата клетки в ходе фаговой инфекции. Однако, принципы этой модуляция, по-видимому, имеют более сложные закономерности, чем простая компенсация тРНК, присутствующих в клеткке-хозяине в недостаточных количествах. Такой вывод может быть сделан хотя бы на основания того, что, как указывалось выше, тРНК фага TS обладают практически полным декодирующим потенциалом.

б) Гены стабильных РНК с неизвестной функцией и ОРС

В области генов тРНК фага Т5 расположены также гены для девяти стабильных РНК с неизвесткой функцией. Эти РНК могут быть подразделены на два типа: не содержащие минорные компоненты (обозначены римскими цифрами, а также 2Н и X) и тРНК-подобные РНК, некоторые из которых содержат модифицированные основания Ти^ (обозначены арабскими цифрами) (Казанцев и др., 1979). Гены семи из девяти указанных РНК были локализованы ранее (Ksenzenko et al., 1987; Ksenzenko et al,, 1992). Границы 5'-концов генов РНКХ и РНК1 были определены методом S1-картироеания В.Н. Ксензенко (неопубликованные данные). Для всех стабильных РНК с неизвестной функцией может быть предложены модели вторичной структуры с высоким уровнем спаривания оснований.

Помимо генов тРНК и стабильных РНК с неизвестной функцией в анализируемой области обнаружено 26 ОРС. Аминокислотные последовательности трех из них (обозначены как гены hegA, hegC и hegD) гомологичны известным H-N-H хоуминг-нуклеазам - I-B&sl, I-TWoI, I-//muII и \-Нти\ - и ряду других предполагаемых H-N-H-нуклеаз, Недавно было экспериментально подтверждено, что указанные гены действительно кодируют сайт-специфические эндонуклеазы (Акупенко и др., 2004).

в) Промоторы в терминаторы области генов тРНК

Ранее в работе Бужзра в сотр., было показано, что промоторы фага TS узнаются in vitro немодифщдарованной РНК-полнмеразой £ coli и относятся к разряду наиболее сильных прокариотических промоторов (von СаЬаш and Bujard, 1979). Их отличительной особенностью является высокое содержание А-Т-нар (примерно 80%), наличие помимо консервативных участков -10, -35 также поли-А участка в оозшти • 43. В участках между генами РНК и О PC анализируемой области нами были обнаружены подобные йуклеотидные последовательности. Для тестирования обнаруженных нами предполагаемых промоторов РП, Р12, Р13а, Р13Ь, Р14а, Р14Ъ, PI Sa, PI 5b, PISc и PI 6-17 (Рис. 1) мы клонировали их в виде ПЦР фрагментов в специализированном векторе pKWHI. В данном векторе ген ß-лактамазы находится под контролем промотора Р46.7 фага Т4, н при клонировании происходит его замещение на тестируемый промотор. Силу промоторов определяли m vivo по соотношению активности ß-лактамазы к активности внутреннего контроля (б-фосфо-ß-галактозндазы), принимая за единицу силу промотора Р46.7 фага Т4, Полученные в ходе этих экспериментов данные представлены в таблице 1.

Таблица 1» Активность промоторов области генов тРНК бактериофага Т5.

-43 35 -10 +1 ¿»пвоегь

fu сассааасттдлаалт гса г т тсстттстс т стт at tt ati g с htm т атттатат aagttaa tûaçagggaaa 1, «

pi 2 ^gc^aatttttftaagaccccltgfccibttrtctcc^gggtagtgtaaactfttatgttatgcmgrgtsarcajafib 1.4

МЭ» 2.3

р13в аа 5ааат tt caaaaacgcagttscttaa tgc t tааттгс ttgttataata? tt at at а^чаytca t ga sc agaaat 1,0

f14* caagtpc 1тсаааат ttgactt 5cc t taaaac гт5ст»дхк1 agt t atctaat t га^аасататстс 2.2

flab çaaaîtgttаалааатста^ттостtagtttсслаааотгста*АТААТaattacataaattgaactgcagaasç 1. э

f1m taaaargttaaaaaatt сааттостт saatççt aaatt ctctgtataatat at tt at aaat ttca ¿agaggaatç 0, »

pi«-« gac tttttc taaaaa t t catttco taaatgct t at aaa t tc tgtatfcatata tt cat aaat tagag*g taat tct 1,0

•Последовательности соответствующие позициям -35 и -10 выделены жирным шрифтом,; -43 - подчеркнута.

Наши эксперименты показали, что наиболее аггнеяыми промоторами являются промоторы Р13а, Р14а и Р14Ь, сила которых примерно в два раза превышает силу промотора Р46.7 фага Т4, Наиболее слабым из тестируемых промоторов оказался

промотор PI5а. Активность остальных проанализированных промоторов сопоставима с активностью контрольного промотора.

В отличие от промоторов, терминаторы транскрипции фага Т5 практически не были изучены. Анализ ДНК секвениро ванной области выявил наличие двух палнндромных последовательностей, характерных для Rho-независимых терминаторов транскрипции: terl н ter2 (Рис. 1). Обе эти последовательности были клонированы в двух ориентацнях по отношению к гену галактокиназы в специализированном векторе pFDIOO. Их эффективность определяли in vtvo по снижению синтеза гадактокиказы. Показано, что terl обладает 100% эффективностью как в прямой, так и в обратной ориентации. Таким образом, terl является двунаправленным Rho-независнмым терминатором транскрипции. Терминатор 1ег2 оказался активным только в прямой ориентации по отношению к репортерному гену.

Конструирование генов амбер-супрессорных т РНК бактериофага Т5

Для введения необходимых нуклеотидных замен в гены тРНК нами предложен и апробирован метод направленного мутагенеза с использованием двустадийной ПЦР. Для этого были использованы праймеры, комплементарные 5'- и З1-концам генов тРНК, а также олкгонуклеотяд, несущий необходимые замены (мутагенный праймер). На первом этапе в ПЦР вводили только 5*-концевой и мутагенный праймеры в соотношении 50:1 с тем, чтобы основным продуктом этой стадии ПЦР был одноцепочечный фрагмент ДНК так называемый мегапраймер, несущий замены в области аытиходона, На втором этапе в реакционную смесь, содержащую мегапраймер и ДНК-матрицу, добавляли праймер, комплементарный 3'-кокну гена тРНК, Основным конечным продуктом ПЦР таким образом является полноразмерный фрагмент ДНК, содержащий ген тРНК с необходимыми заменами в области антикодона. Амплифицированные гены клонировали в специализированном векторе pGFIBl. Первичную селекцию проводили в штамме £1 coli ХАС-1, содержащем эписому Р/исргоВ, в которой 17-ый кодон гена 1асЪ заменён на амбер-кодои. Супрессия нонсенс-мутатшн в гене laeZ приводит к синтезу активного белка, что позволяет вести первичный отбор на селективной среде, содержащей X-gaL Из клонов, имеющих синюю окраску, выделяли плазмндную ДНК и проверяли наличие мутаций методом секвениро вання.

Определение активности ямбер-супресеорных тРНК

Определение уровня суп рессорной активности проводили в штаммах Е, coli SN AI б и SNA30. В этих, штаммах гены ieel и focZ "слиты". Наличие амбер-кодоиа в гене loci приводит к терминации трансляция и отсутствию синтеза ß-галактозидазы. Введение амбер-сунрессорной тРНК в усу систему позволяет восстановить синтез белка за счйт супрессии ноасенс-кодова. Известно, что уровень супрессорной активности зависит от последовательности мРНК, непосредственно прилегающей к нонсенс-кодону, В указанных штаммах амбер-кодон UAG находится в следующем окружении: 5'-öACUAGAUC-3' (SNA 16) и 5'-UGUUAGACA-3' (SNA30), Предполагалось, что в сравнения с SNA30 в штамме SNA16 амбер-кодон находится в менее благоприятном окружении. Мы показали, что в штамме SNA16 наблюдается только незначительное снижение супрессорной активности (Табл. 2). Подобные результаты были получены и при анализе супрессоров Е. coli (KJeitia et al,, 1990).

Таблица 2. Эффективность амбер-супрессорных тРНК бактериофага TS в штаммах £ coli SNA16 и SNA3Ö.

Суврмсормая «ктиыфсть (%)

Амбер* eytipícío(i Штамм Е. coli Амбер* еупрессор Штамм £ ealt

SNA30 SNA 16 SNA30 SNA]«

AU (>8,3 64,6 Leu 16,6 7.8

Gin 42,5 45,0 Lys 34,0

CIу 100 72.7 Pro 10,4 2,4

His 83,1 50,9 Strl 100 64.6

Del 9J¡ 2 й StrJ S2.1 17,2

Ile2 2,5 Тут 50,2 45,0

В таблице не представлены амбер-супре ссоры, активность которых в обоих штаммах составляла менее 0,1 % (Arg, Asn, Asp, Cys, Met, РЬе, Ser2, Trp, Thr и Val).

Безусловно, одним из критических факторов для проявления супрессорной активности является способность АРСаа узнавать н аминоацшшровать амбер-супрессорные тРНК. Низкая эффективность ряда супрессоров фага Т5 может быть объяснена изменением некоторых из элементов специфичности в их структуре. Например, в случае тРНКр|е наблюдается замена пяти из десяти иуклеотидных остатков, определенных ранее как элементы специфичности для фенидаланиновой

АРСазы Е, coli (McClain and Foss, 1988a). Известно, что в большинстве случаев антекадон служит главным или одним из главных элементов узнавания соответствующей АРСазой (Patlank, 1995), Следовательно, изменение антикодсюа в случае супрессорных тРНК может в решающей степени сказываться на процессе аминоацилирования, что приводит к снижению супрессорной активности, как, например, в случае тРНК^сил, тРНК^сш, tPHK^cüa, тРНК1|е'о)л, tPHK^'cua, tPHKtipcua h TPtiKv%A. Интересно, что в случае tPHK^cu* и tPHK^cua, несмотря на изменение антнкодона, играющего важную роль в узнавании соответствующими АР Сазами, их активность оказалась высокой. Эти данные могут свидетельствовать о том, что помимо антнкодона, значительный вклад в процесс специфического узнавания тРНК могут вносить и другие участки молекулы. Неожиданным оказалось отсутствие супрессорной активности в tPHK^'cua, Для аминоашшироваиня которой антикодон считался несущественным. Другие нзоакцепторы этой тРНК (Sert и Ser3) были активны как суп рессоры.

Дополнительные мутации, повышающие суирессорпу» активность тРНК

Известно, что вклад структуры самой молекулы тРНК и особенно её антикодоновой шпильки в эффективность взаимодействия тРНК с рибосомой (гипотеза "удлиненного" антнкодона) весьма значителен (Yarus, 1982). Анализ полученных нами неактивных супрессоров (тРНК^сил, tPHK^cua, tPHK'^cua, тРНК^сил, tP1ÜC11ucua, tPHKv-cua) показал, что в этих случаях структура антикодоновой шпильки является неоптимальной с точки зрения гипотезы "удлиненного" антнкодона, что, по всей вероятности, элиминирует или снижает эффективность этих супрессоров. Для подтверждения этого предположения мы получили амбер-супрессор PheM, в который направленно ввели замены в соответствии с гипотезой "удлиненного" антнкодона (Рис. 2), В результате таких замен мы получили достоверное повышение уровня супрессорной активности. Эти эксперименты подтверждают ранее высказанное теоретическое предположение о вкладе структуры антикодоновой шпильки в функциональную активность тРНК.

Рис. 2. Структура амбер-супрессорной с—С

tPHK™* бактериофага TS а форме tJtr—S_AAf?cu и л

"клеверного листа". Стрелками LIA с ag.>cg ТIЦI Л

указаны замены, введенные в данную с •ТТ| <iJJiCGtll,с

тРНК в соответствии с гипотезой с* "удлиненного" антикодона. V^c

Кроме того, в ходе мутагенеза с использованием Taq-полимеразы, не обладающей корректирующей активностью и, в некоторых случаях, приводящей к возникновению спонтанных замен в структуре ам[инфицируемого фрагмента, были отобраны суп рессоры, содержащие дополнительные муташш вне антикодона. При получении амбер-супрессоров Arg, Asp, Cvs, Glu только такие мутанты давали синюю окраску на селективной среде. Полученные супрессоры были названы соответственно ArgM, AspM, CysMl, CysM2 и GluM (Рис. î).

Рис. 3. Структура аыбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5, спепифичных к аргинину, аспарагиновой кислоте,

глутаминовой кислоте и иистеину, в форме "клеверного листа". Стрелками указаны нуклсотидные замены, приводящие к повышению супрессорной активности.

1

* .Л. с г«св

б нслг ил

^ щ

iphkÄa

VA*, А"

Î О ^

1WII S-t C},r,u

Результаты секвенирования гена супрессора ArgM показали наличие замены С32 -Та внтикодоновой петле. Интересным является тот факт, что это положение в структуре тРНК £ coli является полуконсервативиым, В этой позиции всегда находится пиримидин. Возможно, замена С на U приводит к возникновению новой AU

пары в положении 32-38, удлиняющей аитикодоцовую шпильку и сокращающую размер антнкодоновой летлв с семи до пяти нуклеогидов. Более того, это позволяет образовать еще одну AU-napy (33-37), что уменьшает размер антнкодоновой петли до размера самого антнкодона. Естественно, что такое глубокое конформацнонное изменение леей антнкодоновой шпильке кардинально сказывается на биологической активности тРНК-Ч

Известно, что для образования биологически активной третичной структуры tPHKCys Е coli и для узнавания этой тРНК соответствующей АРСазой, необходимо присутствие G в 15-ом положении (D-петля) и G в положении 48, а также наличие конфигурации D3V4 (три пары оснований в D-шпильке и четыре нуклеотида в вариабельной петле) (Нои, 1994). В тРНК^ фага Т5 элементы GIS и G48 заменены соответственно на А и U, а также изменена конфигурация D3V4, Возможно, это является одной из причин отсутствия супрессорной активности фагоспецифичной тРНК*^5, При получении амбер-супрессора этой тРНК нами было отобрано два клона, проявляющих супрессорную активность. Ссквенированне их генов показало наличие замен в положении C20-U (CysMI), а также делении одного нуклеотида в вариабельной петле (CysM2). Вполне вероятно, что в случае мутанта CysM2 деления одного нуклеотида восстанавливает ОЗУ4-конфвгуршию, что и повышает активность этой молекулы тРНК. В случае же CysMI замена C20-U затрагивает область, которую раньше не считали необходимым элементом для взаимодействия с белками трансляционного аппарата Е. coli.

Критическую роль при образовании комплекса аминоацил-тРНК с фактором элонгации трансляции EF-Tu*GTP играют структурные особенности сахарофосфатвого остова акцепторного в Т-стеблей (Rudmger et al., 1994), Безусловно, образование этого комплекса может влиять на супрессорную активность тРНК. При получении супрессорной тРНК®" мы отобрали единственный клон (GhiM) с высокой супрессорной активностью. Ген этой тРНК содержит замену C50U в Т-стебле, что приводит к образованию канонической пары U50-A64 (Рис. 3). Возможно, данная замена способствует восстановлению третичной структуры тРНК в области акцепторного и Т-стеблеЙ, что является необходимым для связывания с EF-Tu*GTP.

При получении амбер-супрессорной тРНК, специфичной к аспарагиновой кислоте, нам удалось обнаружить клон, содержащий активный супрессор (AspM). Анализ нуклеотвдной последовательности этого мутанта показал наличие дополнительной замены вне анткодова U25-C, которая приводит к восстановлению

спаренности в D-стебле. Такие изменения конформации D-шпильки могут приводить к стабилизации обшей структуры молекулы тРПК. Все отобранные таким образом супре ссоры тестировали в штаммах £ coli SNA 16 и SNA30, Результаты определения их супрессорной активности приведены в таблице 3,

Таблиц» 3, Эффективность супрессии амбер-супрессоров, несущих дополнительные

мутации вне антикедона, в штаммах £ coll SNA 16 н SNA30.

Амб£р- супреосор Дополнительные мутамнн в тРНК Супрессорная активность (ii)

SNA30 SNA 16

ArjM C32U »,2 2,0

A.ipM U2JC u

CysMl C30U 3,0 0,i

CysM2 диад 8,7 1,0

GluM C50U 100 29Л

PbeM U2£G, U29G, С31А G37A, G3W, U41C, U42C 4,0 2,3

Определение аминокислотной специфичности

Для предварительного определения аминокислотной специфичности амбер-супрессорных тРНК был предложен непрямой метод, основанный на уникальных особенностях процессннга щелочной фосфатазы Е. coli. Известно, что после транслокации через мембрану щелочная фосфатаза подвергается поспранслокационной модификации, включающей частичное (при сулерпродукпии белка) концевого аргинина и димеризавдю субъедениц, в результате чего образуются три различающиеся изоформы фермента, которые можно разделить с помощью электрофореза в натквных условиях (Nakata et al., 1987). Замена Arg +1 на другую аминокислоту имеет строго предсказуемые последствия для спектра изоформ, которые в ряде случаев могут быть однозначно интерпретированы.

На базе штамма £. coli El 5 с делецией гена phoA была сконструирована система экспрессии этого гена, содержащего амбер-мутацию в положении +1, ь составе плазмяды pPHOA7j(am+i )• Данная плазмида была создана на основе вектора pl5KS(+). Новый пггамм трансформировали адаз мидами несущими гены амбер-супрессорных тРНК с последующим лизисом клеток и выявлением изоформ щелочной фосфатазы в

лераплазматической фракции с помощью электрофореза и иммунологического окрашивания активных форм фосфатазы непосредственно в геле. (Рис. 4).

1 1 3 4 S 6 7 S 9 10 11 11 13 14 IS 16 17 IS 1? 20 21

Г и с. 4. Спектры изо форм щелочных фосфатаз, содержащих различные аминокислотные замены в+1 положении. 1. щелочная фосфатаза дикого тика; 2. GluM Т5; 3. Glu К coli; 4. Lys Т5; 5. His Т5; 6. His £ coli; 7. PheM Т5; 8. Ile Т5; 9. Ala£ colt; 10. Ala T5; 11. Gly Т5; 12. Serl Т5; 13. Ser3 Т5; 14, Gin Т5; 15, Туг Tí; 16. Leu Т5; 17, Pro Т5; 18. Pro Е. col!; 19. Cys Ml T5; 20. Cys M2; 21. Cys E. cotí. Римскими цифрами обозначены изоформы щелочной фосфатазы,

Известно, что введение пролива в положение +1 щелочной фосфатазы полностью предотвращает процессниг этого белка (Карамьппев и др. 1994). Как видно из рисунка б (дорожка 17) после прочтения стоп-кодона амбер-супрес сором Pro фага Т5» наблюдается значительное изменение в электрофоретической подвижности белка. Подобная электрофореграмма является характерной для мутантяого бедка, несущего лролин в позиции +1. Таким образом, в случае амбер-супрессорной тРНК'*" фага Т5 мы можем сделать заключение о том, что эта тРНК узнается родственной АРСаэой £ coli.

Экспрессия щелочной фосфатазы в присутствии амбер-супрессоров CysMl и CysM2 приводит к образованию дополнительной формы белка с меньшей электрофоретической подвижностью (дорожки 19, 20). Появление этой изоформы обусловлено образованием дисульфидных мостиков между молекулами фосфатазы (Карамышев и др. 1994). На основании данных приведены* иа рисунке б можно сказать, что эти суп рессорные тРНК аминоацилируются дистеином. В случае мутанта CysM этот факт является весьма неожиданным. Как уже отмечалось выше, для узнавания этой тРНК родственной АРСазой, необходимо образование D3V4 конфигурации молекулы. В данном супрессоре эта конфигурация нарушена, я, следовательно, мы должны были наблюдать изменение специфичности её аминоацилирования.

В случае введения лнзнна в положение +1 будет происходить образование только изоформы I, соответствующей димеру с неотщеплйнной положительно наряженной N-кондеаой аминокислотой. Именно такая электрофоре грамма наблюдается в случае супрессора Lys Т5 (дорожка 4). Это свидетельствует о сохранении специфичности данной супрессороной тРИК,

В случае амбер-супрессора GluM (дорожка 2) мы наблюдали образование двух нзоформ, одна из которых имеет более высокую электрофорешческую подвижность н свидетельствует о наличие неотщепленной отрицательно заряженной аминокислоты на N-KOHue димера. Вторая форма мутантного белка имеет подвижность, характерную дня щелочной фосфатазы с незаряженной аминокислотой в +1 положении. Таким образом мы можем заключить, что супрессор GluM помимо отрицательно заряженной (глутами новой кислоты) может аминоацилироваться другой незаряженной аминокислотой в соотношении приблизительно 50:50. В работе Норманли и совт. было также показано изменение специфичности супрессора Glu Е. coli. В работе отмечалось, что данный супрессор ошибочно аминоацидировался глутамнном с эффективностью 17% (Normaaly et al., 1990). Вполне вероятно, что в случае соответствующего супрессора фага Т5 мы наблюдаем аналогичную ситуацию, однако следует отметить увеличение эффективности узнавания неродственной АРСаэой.

Эксперименты по прямому определению аминокислотной специфичности амбер-супрессорных тРНК проводили также на щелочной фосфатазе. Для этого была получена рекомбинантная плазмида рШОА(ат+2), содержащая ген фосфатазы с Ala в положении +1 и омбер-кодоном в позиции +2. После супрессия нонсенс-колона щелочную фосфатаэу очищали н проводили определение первых четырех амиаокаслот. Эта часть работы проведена Ц.А. Егоровым, Институт биоорганической химни им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, В случаях "слабых" суврессоров нам не удалось выделить достаточное количество белка для такого анализа. Определение аминокислотной специфичности оказалось возможным только для амбер-супрессоров, активность которых превышала 50% (Табл. 4),

Как видно из таблицы 4, амбер-супрессоры специфичные к аланину, глицину, гистидину, лизину, серину и тирозину узнаются соответствующими АРСаэами. В случае супрессоров Ala, His и Ser этот факт не удивителен, так как в этих тРНК присутствуют практически все элементы специфичности, определенные ранее дтя соответствующих АРСаз Е. coli (Hou and Schimmel, 1988), Кроме того, известно, что

антикодон этих тРНК не участвует в процессе их узнавания аминоатщл-тРНК-синтетаэой.

Таблица 4. Аминокислотная специфичность амбер-супрессорных тРНК фага Т5.

Амбер-супрессор Супрессорвая ятшность (%) Аминокислота« специфичность

АН апаннн (80%)

Оу 100 глицин (100%)

НЬ Ш гистидин(100%)

87,9 лизин (100%)

Бег) 100 серии (100%)

ЭегЗ 82,1 серил (100%)

Туг 50,2 тирозин (100%)

СТиМ 100 глугамкн (*6,7%), глутаминовая кислота (53,3%)

Известно, что антикодон, а именно цитозик в положении 35 тРНК°\(сс соИ является одним из важных элементов узнавания для соответствующей АРСазы (МсС1аш е1 а!., 1991; Катей 1997), Изучение амбер-супрессора, полученного на основе этой тРНК, показало, что изменение последовательности антикодона ЦСС на С11А приводит к изменению его аминокислотной специфичности. Такой суп рессор эффективно узнавался глутаминовой АРСазой (ЫогтаЫу а а1., 1990). Нами показано, что тРНК°%А фага Т5, несмотря на изменение антикодона, полностью сохраняет способность аминоашиироваться глициновой АРСазой. Анализ первичной структуры этой тРНК показал ряд структурный особенностей этой молекулы. Так, например, мы наблюдали нарушение комплементарности в позициях С10-С25, С27-С43 и Ш9-С65, а также образование дополнительной пары оснований С14-021 в О-шпильке, приводящей к уменьшению размера Б-петли до 5 нуклеотидов. Кроме того, в структуре этой тРНК отсутствуют консервативные элементы ив и А14, участвующие в образовании Ь-образноЙ третичной структуры (Рис. 5). Тем не менее, такие кардинальные изменения вторичной и третичной структуры не отразились на суп рессорной активности данной тРНК, и, более того, не сказались на специфичности ее взаимодействия с глициновой АРСазой К соЛ

Рас. 5. Вторичная структура тРЫК^^исс бактериофага Т5 а форме клеверного листа. Нуклеогиды, отличные от нуклеотидов в структуре

соответствующего изоакпептора Е. соИ выделены курсивом и подчеркнуты. Кружками выделены элементы узнавания для родственной АРСазы К соП <МсС1ат е( а1.1991)

Таким образом, на основании наших данных можно сделать вывод о том, что антикодон в случае фагоспецифичной тРНК^исс не является элементом специфичности для соответствующей АРСазы Е со!I. Вероятнее всего, другие структурные элементы молекулы принимают участие во взаимодействии этой тРНК с соответствующей аминоацшьгРНК-сннтетазо й.

Подводя итог всему выше изложенному, следует отметить, что данная работа выявила уникальные структурные и функциональные особенности тРНК фага Т5, В ходе экспериментов по изучению дополнительных замен в амбер-супрессорных тРНК, повышающих их активность, продемонстрировано, что изменение в структуре их антнкодоновой шпильки играющей важную роль в процессе специфического взаимодействия с трансляционным аппаратом может компенсироваться изменением других участков, в результате которых возникает функционально - активная молекула. Данная работа создала предпосылки для дальнейшего изучения фагоспецнфичньи тРНК с использованием других современных приемов, как. например, кристаллографический анализ комплексов этих тРНК с соответствующими АРСазами и другими белками трансляционного аппарата Е, ссИ.

1. Завершено определение нуклеотидной последовательности области генов тРНК фага Т5, общая длина которой составила 14530 п.н. Анализ згой пооледовательнеости позволил локализовать 25 генов тРНК, 9 генов стабильных РНК с неизвестной функцией, 26 ОРС, 10 промоторов и два (Независимых

ВЫВОДЫ

терминатора транскрипции. Обнаружено, что исследуемая область имеет мозаичную организацию, где гены тРНК распределены между генами других стабильных РНК И ОРС.

2. Фрагменты ДНК, содержащие последовательности промоторов и терминаторов, были клонированы в специализированных плазмидных векторах и их активность была продемонстрирована и охарактеризована в экспериментах in vivo.

3. С помощью ПЦР-опосредоваиного сайт-направленного мутагенеза был сконструировал полный набор генов амбер-супрессорных тРНК фага Т5. Эти гены были клонированы в длазмшшом векторе pGFIBl и их активность изучена в специализированных огтаммах £ coli в зависимости от окружения амбер-кодона в релортерном гене. Показано, что амбер-супрессоры, сконструированные на основе тРНК, специфичных к аланкну , глутамину, глицину, гистидину, лизину, серину (tPHK^i h тРНК^з) h тирозину, обладают высокой активностью in vivo. Выявлены дополнительные замены (вне последовательности антикодона) в амбер-супрессорных tPHK^cua, tPHK^cua, tPHK^cua, тРНКс1исил и тРНКРЬесил. приводящие к существенному повышению супрессорной активности. Проведен анализ данных по эффективности супрессии в зависимости от структурных особенностей тРНК.

4. Определена специфичность наиболее сильных фагоспецн фичных амбер-супрессоров. Показано, что амбер-супрессорные tPHK^cua, тРНК^ом, tPHK1,í'cua, tPHK^cua, tPHK^Yua, tPHK^W h тРНК^сцд сохраняют аминокислотную специфичность исходных тРНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Палькова H B.. Карам ышев АЛ., Шляпников М.Г., Пресич А.Н., Ксеязенко В.Н. (1998) Амбер-супрессорные тРНК бактериофага т5: конструирование генов и определение эффективности супрессии in vivo. Молекуляр. бнод, Т. 32, с. 10041012.

2. Kholod N.. Рад'ko va N. Ksenzenko V„ Kisselev L. (1998) Aminoacylation oflRNA gene transcripts is strongly affected by 3*-extended and dimeric substrate RNAs. FEBS Lett. Vol. 426, p. 135-139.

3. Kholod N.S., Pan'tova K.V.. Мауотоу S.G., Kxutilina А.1., Shlyapnikov M.G., Kisselev Ksenzenko V.N, (1997) Transfer RNA1*® i »acceptors posess non-

identical set of identity elements at high and low Mg2' concentration, FEBS Let Vol. 411, p. 123-127.

4, Холод, H.C., Панькова H.B.. Майоров С.Г, Крутилина А.И., Шляпников М.Г., Ксензенко В.Н, и Киселев ЛЛ. (1996) Влияние ионов MgJ+ и Ca2* на аминоацилироваяне транскриптов генов тРИК^1" бактериофага Т5 н Escherichia coli. Молекуляр, бнол, Т. 30, с. 1066-1075.

5, Kholod N., ppn'kova N.. Mayorov S, Krutitina Л., Shlyapnikov M., Kisselev L., Ksemenko V. (1997) Phage T5 tRNA"* recognition by £ coli phcnylalanyl-lRNA synthetase- Abstracts 17й1 International tRNA Workshop. Kazusa Akademia Center, Japan, p. 14-16.

6. Pan'kova N.. Vinokurov L,, Karamyshev Л., Shlyapnikov M,, Ksenzenko V. (1997) Construction and characterization of the complete collection of phage T5 amber suppressors. Abstracts 17й International tRNA Workshop. Kazusa Akodemia Center, Japan, p. 4-5.

7. Панькова HB.. Карамышев A,J]., Майоров С.Г., Ксензенко, В.Н, (1996) Конструирование и характеристика амбер-суирсссоров бактериофага TS. Сборник трудов городской научной конференции молодых ученых, Пущино, с, 55-58,

8- Холод, Н.С., Панькова Н.В.. Майоров С.Г,, Ксензенко В.Н. (1996) Влияние нуклеотидных замен в шггнкодоке тРНКРЬе бактериофага TS на амнноацшшрование ее транскриптов. Сборник трудов городской научной конференции молодых ученых, Пушино, с, 63-66,

9, Холод, Н.С., Панькова Н.В.. Майоров С.Г., Ксензенко В.Н. (1996) Особенности амияоацилнрования транскриптов гена тРНК""1 бактериофага Т5. Сборник трудов городской научной конференции молодых ученых, Пушино, с. 96.

Принято к исполнению 16/11/2004 Исполнено 16/11/2004

Заказ № 45В Тираж: 75 экз..

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трахтман, Наталия Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общее строение молекул тРНК.

1.2. Взаимодействие тРНК с аминоацил-тРНК-синтетазами.

1.2.1. Нуклеотиды антикодона как элементы специфичности.

1.2.2. Роль мдискриминаторного" основания во взаимодействии тРНК с соответствующей АРСазой.

1.2.3. Другие элементы узнавания в молекуле тРНК.

1.3. Супрессорные гены и супрессорные тРНК Е. coli.

1.4. Известные фагоспецифичные тРНК и их супрессоры.

1.5. Факторы, влияющие на эффективность супрессии.

1.5.1. Влияние последовательности мРНК, прилегающей к нонсенс-кодону.

1.5.2. Влияние структуры антикодоновой шпильки.

1.5.3. Влияние модифицированных оснований в структуре тРНК.

1.6. Использование супрессорных тРНК для определения элементов узнавания тРНК соответствующими АРСазами.

1.7. биологическая роль фагоспецифичных тРНК.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы и плазмидные ДНК.

2.1.2. Среды для выращивания Е. coli.

2.1.3. Буферы.

2.1.4. Реактивы.

2.1.5. Препараты ферментов.------------.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.3. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.2.5. Введение нуклеотидных замен в гены тРНК с помощью двустадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.6. Очистка фрагментов ПЦР с помощью электрофореза в ПААГ.

2.2.7. Мечение 5'-конца олигонуклеотида с помощью полину клеотидкиназы фага Т4.

2.2.8. Метод отбора измененных генов тРНК.

2.2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.10. Определение супрессорной активности.

2.2.11. Определение изоформ щелочной фосфатазы.

2.2.12. Выделение и очистка щелочной фосфатазы из клеток Е. coli.

2.2.13. Определение концентрации белка по Брэдфорду.

2.2.14. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

2.2.15. Определение промоторной активности.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Определение нуклеотидной последовательности области локализации генов тРНК бактериофага Т5.

3.1.1 Анализ частоты использования кодонов в геноме бактериофага Т5.64 3.1.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей области генов тРНК бактериофагов Т5 и BF23 и фага 5.

3.2. Конструирование генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5.

3.3. Определение уровня супрессорной активности.

3.3.1. Активность амбер-супрессоров в штамме Е. coli ХАС-1.

3.3.2. Определение влияния 5' - прилегающего к амбер-кодону триплета на супрессорную активность.

3.3.3. Отбор дополнительных мутаций, повышающих активность супрессорных тРНК.

3.4. Определение аминокислотной специфичности амбер-супресорных тРНК 90 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5"

Установление взаимосвязи между структурой и функцией биомакромолекул представляет собой одну из ключевых задач молекулярной биологии, в рамках которой особо важное место занимает проблема специфического белок-нуклеинового взаимодействия. Значимость структурно-функциональных исследований на модели тРНК обусловлена тем, что: 1) в процессе функционирования молекула тРНК специфически взаимодействует не менее чем с 20-ю различными белками; 2) в её струюуре удивительным образом сочетаются консервативность элементов, определяющих функциональное единство всех тРНК в биосинтезе белка, и уникальность каждой нуклеотидной последовательности, что обеспечивает строгую специфичность биохимических реакций, протекающих с их участием. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый к настоящему времени в изучении первичной структуры тРНК и установлении их функционального разнообразия, молекулярные механизмы взаимодействия тРНК с компонентами

I* белоксинтезирующего аппарата клетки и многочисленными ферментами процессинга остаются ещё во многом невыясненными.

Особый интерес представляет изучение элементов структуры тРНК, которые определяют строгую селективность процесса аминоацилирования соответствующими аминоацил-тРНК-синтетазами (АРСаза), с использованием в качестве модельных систем молекул тРНК и АРСаз Е. coli. Исходным этапом f такого рода исследований является поиск консервативных элементов в изоакцепторных тРНК, которые, по всей видимости, и определяют специфичность этих взаимодействий. В случае Е. coli структурная база подобного рода исследований может быть значительно расширена за счет привлечения информации о структурных особенностях тРНК, кодируемых бактериофагами, но использующих тот же трансляционный аппарат. В этом отношении интересной " моделью является бактериофаг Т5, в геноме которого кодируются тРНК, специфичные ко всем 20-ти аминокислотам, участвующим в белковом синтезе, а также ряд изоакцепторов. Привлекательность данной модели обусловлена уникальными структурными особенностями этих тРНК. Анализ нуклеотидной последовательности генов нескольких из этих тРНК показал, что они имеют существенные отклонения от обобщенной модели "клеверного листа", которые заключаются не только в наличии неспаренности в шпильках, но также и в замене консервативных и полуконсервативных оснований, участвующих в образовании третичной L-образной структуры молекулы (Шляпников и др. 1994). Кроме того, тРНК бактериофага Т5 обнаруживают низкий уровень струюурного сходства с соответствующими изоакцепторными тРНК Е. coli (Hirsh D. 1971). Поскольку фагоспецифичные тРНК и тРНК Е. coli функционируют в единой системе трансляции (в частности, аминоацилируются одними и теми же АРСазами), их с полным основанием можно считать природными изоакцепторами. Таким образом данные о структуре и функции Т5 специфичных тРНК могли бы оказаться полезными при изучении различных сторон функционирования макромолекул этого класса.

Исследования, связанные с функционированием тРНК обычно проводят с использованием двух взаимодополняющих подходов. Первый из них основан на получении немодифицированных транскриптов генов тРНК и определении кинетических параметров реакции аминоацилирования соответствующими АРСазами in vitro. Второй подход сводится к конструированию нонсенс-супрессорных тРНК и определению их супрессороной активности и специфичности in vivo. В этих исследованиях обычно используют амбер-супрессорные тРНК, поскольку амбер-кодон редко встречается с клетках Е. coli и других бактерий в качестве стоп-кодонов при терминации трансляции. Благодаря этому условию, введение супрессорных тРНК в клетки не оказывает существенного влияния на их жизнеспособность.

Использование обычных генетических подходов позволяло получить только ограниченный набор супрессоров. Развитие современных методов молекулярной генетики и генной инженерии, в частности олигонуклеотиднаправленный мутагенез, делает возможным получение супрессорных генов практически любых тРНК.

Цель и задачи исследованиия

Настоящая работа являлась частью проводимого в течение многих лет в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН комплексного исследования транспортных РНК, кодируемых бактериофагом Т5. Её основная цель заключалась в изучении структурно-функциональных свойств тРНК бактериофага Т5. В соответствии с целью работы были определены следующие задачи:

• Завершить определение нуклеотидной последовательности области генов тРНК бактериофага Т5 и провести её анализ.

• Охарактеризовать регуляторные элементы транскрипции, обнаруженные в указанной области генома фага Т5.

• Апробировать метод ПЦР-опосредованного мутагенеза для направленного введения нуклеотидных замен в гены тРНК и получить с его помощью полный набор клонированных генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5.

• Определить эффективность супрессии и аминокислотную специфичность полученных амбер-супрессоров.

Научная новизна работы

Полученные в данной работе результаты имеют неоспоримую теоретическую ценность. В ходе работы завершено определение нуклеотидной последовательности участка генома фага Т5, в котором локализованы гены тРНК (14530 п.н.). Показано, что эта область имеет мозаичную структуру, в которой гены 25 тРНК распределены между генами, кодирующими 9 РНК с неизвестными функциями и 26 ОРС. В ходе анализа секвенированного участка ДНК, обнаружены нуклеотидные последовательности, характерные для промоторов и терминаторов транскрипции прокариот. Эти элементы были клонированы в специализированных векторах и определена их эффективность в клетках Е. coli. Показано, что промоторы фага Т5 обладают очень высоким уровнем эффективности.

Создана и охарактеризована коллекция генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5, значительно расширяющая возможности изучения фагоспецифичных тРНК в системе in vivo. Определена специфичность аминоацилирования и оценен вклад антикодона в узнавание тРНК соответствующими аминоацил-тРНК-синтетазами. Безусловно, полученные в ходе данных исследований результаты, значительно обогащают базу данных о структурных основах взаимодействия тРНК с трансляционным аппаратом Е. coli. Научно-практическое значение работы

Несмотря на то, что настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований, данные, полученные в ходе этой работы, могут найти практическое применение. Прежде всего, полученная коллекция фагоспецифичных амбер-супрессоров может быть использована в экспериментах по белковой инженерии для быстрой проверки влияния тех или иных аминокислотных замен на активность белков. Кроме того, рекомбинантные плазмиды, содержащие гены фаговых тРНК, узнающих редкие для Е. coli кодоны, могут использоваться для оптимизации экспрессии генов, ОРС которых обогащены этими кодонами.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Трахтман, Наталия Викторовна

выводы

1. Завершено определение нуклеотидной последовательности области генов тРНК фага Т5, общая длина которой составила 14530 п.н. Анализ этой последовательнеости позволил локализовать 25 генов тРНК, 9 генов стабильных РНК с неизвестной функцией, 26 ОРС, 10 промоторов и два р-независимых терминатора транскрипции. Обнаружено, что исследуемая область имеет мозаичную организацию, где гены тРНК распределены между генами других стабильных РНК и ОРС.

2. Фрагменты ДНК, содержащие последовательности промоторов и терминаторов, были клонированы в специализированных плазмидных векторах и их активность была продемонстрирована и охарактеризована в экспериментах in vivo.

3. С помощью ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза был сконструирован полный набор генов амбер-супрессорных тРНК фага Т5. Эти гены были клонированы в плазмидном векторе pGFIBl и их активность изучена в специализированных штаммах Е. coli в зависимости от окружения амбер-кодона в репортерном гене. Показано, что амбер-супрессоры, сконструированные на основе тРНК, специфичных к аланину , глутамину, глицину, гистидину, лизину, серину (тРНК^! и тРНК^з) и тирозину, обладают высокой активностью in vivo. Выявлены дополнительные замены (вне последовательности антикодона) в амбер-супрессорных tPHKAspcua, tPHK^cua» тРНКСу8сил, tPHKg1uoja и TPHKpheCUA, приводящие к существенному повышению супрессорной активности. Проведен анализ данных по эффективности супрессии в зависимости от структурных особенностей тРНК.

4. Определена специфичность наиболее сильных фагоспецифичных амбер-супрессоров. Показано, что амбер-супрессорные тРНКА|асиА, TPHKGlyCUA, тРНКн%д, TPHKLyscuA, тРНК8ет1 сил? тРНК8" cua и tPHKT)tcua сохраняют аминокислотную специфичность исходных тРНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог всему выше изложенному, следует отметить, что данная работа выявила уникальные структурные и функциональные особенности тРНК фага Т5. В ходе экспериментов по изучению дополнительных замен в амбер-супрессорных тРНК, повышающих их активность, продемонстрировано, что изменение в структуре их антикодоновой шпильки играющей важную роль в процессе специфического взаимодействия с трансляционным аппаратом может компенсироваться изменением других участков, в результате которых возникает функционально - активная молекула. Данная работа создала предпосылки для дальнейшего изучения фагоспецифичных тРНК с использованием других современных приемов, как, например, кристаллографический анализ комплексов этих тРНК с соответствующими АРСазами и другими белками трансляционного аппарата Е. coli.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трахтман, Наталия Викторовна, Пущино

1. Agris, P.F. (1996) The importance of being modified: roles of modified nucleosides and Mg in RNA structure and function. Prog Nucleic Acid Res. 53, 79-129.

2. Anderson, J.S., Matsuhashi, M., Haskin, M.A. and Strominger, J.L. (1967) Biosythesis of the peptidoglycan of bacterial cell walls. II. Phospholipid carriers in the reaction sequence. J. Biol Chem. 242,3180-3190.

3. Arnez, J.G., and Steitz, T.A. (1994) Crystal structure of unmodified tRNA(Gln) complexed with glutaminyl-tRNA synthetase and ATP suggests a possible role for pseudo-uridines in stabilization of RNA structure. Biochemistry 33,7560-7567.

4. Asahara, H., Himeno, H., Tamura, K., Hasegawa, Т., Watanabe, K., and Shimizu, M. (1993) Recognition nucleotides of Escherichia coli tRNA(Leu) and its elements facilitating discrimination from tRNASer and tRNA(Tyr). J Mol Biol. 231,219-229

5. Asahara, H., Himeno, H., Tamura, K., Nameki, N., Hasegawa, Т., and Shimizu, M. (1994) Escherichia coli seryl-tRNA synthetase recognizes tRNA(Ser) by its characteristic tertiary structure. J Mol Biol. 236,738-48

6. Ashraf, S.S., Sochacka, E., Cain, R., Guenther, R., Malkiewicz, A., and Agris, P.F. (1999) Single atom modification (0->S) of tRNA confers ribosome binding. RNA 5,188-94.

7. Bachmann, BJ. (1987) Derivations and gehotypes of some mutant derivatives of E. coli K12. In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and molecular biology, Washington. 1190-1219

8. Bare, L.A., and Uhlenbeck, O.C. (1985) Aminoacylation of anticodon loop substituted yeast tyrosine transfer RNA. Biochemistry 24,2354-2360.

9. Bjork, G.R. (1995) In tRNA: Structure, biosynthesis and function. Soil D.; RajBhandaiy, U., Eds; ASM Press: Washington D.C., 165-205.

10. Bjornsson, A., Mottagui-Tabar, S., and Isaksson L.A. (1996) Structure of the C-terminal end of the nascent peptide influences translation termination. EMBO J. 15,1696-1704.

11. Brevet, A., Chen, J., Commans, S., Lazennec, C., Blanquet, S., and Plateau P. (2003) Anticodon recognition in evolution. Switching tRNA specificity of an aminoacyl-tRNA synthetase by site-directed peptide transplantation. J. Biol Chem. 278,30927-30935.

12. Brown, C.M., Stockwell, P.A., Trotman, C.N., and Tate, W.P. (1990) The signal for the termination of protein synthesis in procaryotes. Nucleic Acids Res. 18, 2079-2086.

13. Brunei, F., Thi, V.H., Pilaete, M.F., and Davison, J. (1983) Transcription regulatory elements in the late region of bacteriophage T5 DNA. Nucleic Acids Res. 11,7649-7658.

14. Brunei, F., and Pilaete, M.F. (1985) Localisation and characterization of a new rho-dependent transcription terminator from bacteriophage T5. Nucleic Acids Res. 13,7687-7701.

15. Buckingham, R.H., Grentzmann, G., and Kisselev, L. (1997) Polypeptide chain release factors. Mol.Microbiol. 24,449-56.

16. Buckingham, R.H. (1990) Codon context. Experientia 46, 1126-1133.

17. Cabello-Villegas, J., Tworowska, I., and Nikonovich, E.P. (2004) Metal ion stabilization of the U-turn of the A37 N^dimethylallyl modified anticodon stem-loop of Escherichia coli tRNAPhe. Biochemistry 43, 55-66.

18. Chamberlin, M., and Ryan, T. (1982) In: The Enzymes. (Boyer P.D., eds.), Academic Press., New York 15, 85.

19. Chang, K.-Y., Varani, G., Bhattacharya, S., Choi, H., and McClain, W.H. (1999). Correlation of deformability at tRNA recognition site and aminoacylation specificity. Proc Natl Acad Sci USA 96,11764-11769.

20. Cermakian, N., McClain, W.H., and Cedergren, R. (1998) tRNA nucleotide 47: an evolutionary enigma. RNA 4,928-936.

21. Chen, M.-J., Locker, J., and Weiss, S.B. (1976) The physical mapping of bacteriophage T5 transfer RNAs. J. Biol. Chem. 251, 536-547.

22. Chu, W.-C., and Horowitz, J. (1991) Recognition of Escherichia coli valine transfer RNA by its cognate synthetase: a fluorine-19 NMR study. Biochemistry 30,1655-1663.

23. Chu, W.-C., and Horowitz, J. (1989) 19F NMR of 5-fluorouracil-substituted transfer RNA transcribed in vitro: resonance assignment of fluorouracil-guanine base pairs. Nucl. Acids Res. 17,7241-7252.

24. Daniel, V., Sarid, S., and Littauer, U.V. (1970) Bacteriophage induced transfer RNA in is. coli. Science 167, 1682-1688.

25. Davis, D.R., Veltri, C.A., and Nielsen, L. (1998) An RNA model system for investigation of pseudouridine stabilization of the codon-anticodon interaction in tRNALys, tRNAHis and tRNATyr. J Biomol Struct Dyn. 15,1121-32.

26. Davis, L.G., Diner, M.D., and Battey, J.F. (1986) Basic methods in molecular biology .-Elsevier Science Publishers, New York, 388.

27. Desai, S.M., and Weiss, S.B. (1977) Study of the transfer RNAs coded by T2, T4, and T6 bacteriophages. J. Biol. Chem. 252,4935-4941.

28. Diaz, I., and Ehrenerg, M. (1991) ms2i6A deficiency enhances proofreading in translation. J.Mol.Biol. 222,1161-1171.

29. Dirheimer, G., Keith, G., Dumas, P., and Westhof, E. (1995) In: tRNA: Structure, biosynthesis and function. (Soil, D. and RajBhandary, U.L., eds.) Washington. DC: American Society of Microbiology, 93-126.

30. Eggertsson, G., and Soil, D. (1988) Transfer ribonucleic acid-mediated supression of termination codons in Escherichia coli. Microiol. Rev. 52,354-374.

31. Eiler, S., Dock-Bregeon, A., Moulinier, L., Thierry, J.C., and Moras, D. (1999) Synthesis of aspartyl-tRNA(Asp) in Escherichia coli-а snapshot of the second step. EMBOJ. 18,6532-6541.

32. Giege, R., Florentz, C., Kern, D., Gangloff, J., Eriani, G., and Moras, D. (1996) Aspartate identity of transfer RNAs. Biochimie. 78,605-623.

33. Gorini, L. (1970) Informational suppression. Annu. Rev. Genet. 4, 107-134;

34. Grosjean, H., Soil, D., and Crothers, D.M. (1976) Studies on the complex between transfer RNAs with complementary anticodons. I. Origins of enchanced affinity between complementary triplets. J. Mol. Biol. 103,499-519.

35. Grundy, F.J., Winkler, W.C., and Henkin, T.M. (2002) tRNA-mediated transcription antitermination in vitro: codon-anticodon pairing independent of the ribosome. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11121-11126.

36. Grundy, F.J., Hodil, S.E., Rollins, S.M., and Henkin, T.M (1997) Specificity of tRNA-mRNA interaction of Bacillus subtilis tyrS antitermination. J.Bacteriol. 179, 2587-2594.

37. Guillon, J.M., Meinnel, Т., Mechulam, Y., Lazennec, C., Blanquet, S., and Fayat, G. (1992) Nucleotides of tRNA governing the specificity of Escherichia coli methionyl-tRNA(fMet) formyltransferase. J Mol Biol. 224,359-367.

38. Guthrie, C., and McClain, W.H. (1973) Conditionally lethal mutants of bacteriophage T4 defective in production of a transfer RNA. J Mol Biol. 81, 137155.

39. Hall, K.B., Sampson, J.R., Uhlenbeck, O.C., and Redfield, A.G. (1989) Structure of an unmodified tRNA molecule. Biochemistry 28, 5794-5801.

40. Hasegawa, Т., Himeno, H., Ishikura, H., and Shimizu, M. (1989) Discriminator base of tRNAAsp is involved in amino acid acceptor activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1534-1538.

41. Henkin, T.M. (1994) tRNA-directed transcription antitermination. Mol. Microbiol. 13,381-387.

42. Himeno, H., Hasegawa, Т., Asahara, H., Tamura, K., and Shimizu, M. (1991) Identity determinants of E. coli tryptophan tRNA. Nucleic Acids Res. 19, 63796382.

43. Himeno, H., Hasegawa, Т., Ueda, Т., Watanabe, К., and Shimizu, M. (1990) Conversion of aminoacylation specificity from tRNATyr to tRNASer in vitro. Nucleic Acids Res. 18,6815-6819.

44. Himeno, H., Hasegawa, Т., Ueda, Т., Watanabe, K., Miura, К and Shimizu, M. (1989) Role of the extra G-C pair at the end of the acceptor stem of tRNA1®8 in aminoacylation. Nucleic Acids Res. 17,7855-7863.

45. Hirsh, D. (1971 a) Tiyptophan of the UGA suppressor. J. Mol. Biol. 58,439-458.

46. Hirsh, D., and Gold, L. (1971b) Translation of the UGA triplet in vitro by tryptophan transfer RNA. J. Mol Biol. 58,459-468.

47. Hollei, R.W., Apgar, J., Everett, G.A., Madison, J.T., Marquisee, M., Merrill, S.H., Penswick, J.R. and Zamir, A. (1965) Structure of ribonucleic acid. Science 147, 1462-1465.

48. Hou, Y.M., and Schimmel, P. (1988) A simple structural feature is a major determinant of the identity of a transfer RNA. Nature 333,140-145.

49. Hou, Y.M. (1997) Discriminating among the discriminator bases of tRNAs. Chem Biol 4,93-96.

50. Hunt, C., Desai, S.M., Vaughan, J., and Weiss, S.B. (1980) Bacteriophage T5 transfer RNA. Isolation and characterization of tRNA species and refinement of the tRNA gene map. J. Biol Chem. 255,3164-3173.

51. Ikemura, Т., and Ozeki, H. (1975) Two-dimesional polyaciylamide-gel electrophoresis for purification of small RNAs specified by virulent coliphages T4, T5, T7 and BF23. Eur. J. Biochem. 51,117-127.

52. Jahn, M., Rogers, M.J., and Soil, D. (1991) Anticodon and acceptor stem nucleotides in tRNAGln are major recognition elements for E. coli glutaminyl-tRNA synthetase. Nature 352,258-260.

53. Joseph, S., and Noller, H.F. (1998) EF-G- catalyzed translocation of anticodon stem-loop analogs of transfer RNA in the ribosome. EMBOJ. 17, 3478-3483.

54. Keith, G., Pixa, J., Fix, C. and Dirheimer, G. (1983) Primary structure of three tRNAs from brewer's yeast tRNAPro/2, tRNAHis/l and tRNAHis/2. Biochimie 65, 661-672.

55. Kim, S.H., Suddath, F.L., Quigley, G.J., McPherson, A., Sussman, J.L., Wang, A.H., Seeman, N.C., and Rich, A. (1974) Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA. Science 185,435-440.

56. Kleina, L.G., Masson, J.-M., Normanly, J., Abelson, J., and Miller, J.H. (1990) Construction of Escherichia coli amber suppressor tRNA genes. Synthesis of additional tRNA genes and improvement of suppressor efficiency. J.Mol. Biol. 213,705-717.

57. Komatsoulis, G., and Abelson, J. (1993) Recognition of transfer RNACys by Escherichia coli cysteinyl-transfer RNA synthetase. Biochemistry 32,7435-7444.

58. Ksenzenko, V.N., Shlyapnikov, M.G., Azbarov, V.G., Garcia, O., Kiyukov, V.M., and Bayev, A.A. (1987a) Sequence organization in the bacteriophage T5 tRNA region. Mol. Gen. (Life Sci. Adv.) 6,193-198

59. Ksenzenko, V.N., Shlyapnikov, M.G., Azbarov, V.G., Garcia, O., Kryukov, V.M., and Bayev, A.A. (1987b) Nucleotide sequence of the bacteriophage T5 DNA fragment containing a distal part of tRNA gene region. Nucleic Acids Res. 15, 5480-5481.

60. Ksenzenko, V.N., Wilkens, K., Rueger, W., and Shlyapnikov, M.G. (1992) Nucleotide sequence of the phage T5 DNA segment containing six tRNA genes. Nucleic Acids Res. 20,6104.

61. Kunisawa, T. (2002) Fuctional role of bacteriophage transfer RNAs: codon usage analysis of genomic sequences stored in the genbank/EMBL/DDBJ databases. Data Science Journal 1,216-228.

62. Ladner, J.E, Jack, A., Robertus, J.D., Brown, R.S., Rhodes, D., Clark, B.F., and Klug, A. (1975) Structure of yeast phenylalanin transfer RNA at 2.5A0 resolution. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 72,4414-4418.

63. Li, S., Pelka, H., and Schulman, L.H. (1993) The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA^. J. Biol. Chem. 268, 18335-18339.

64. Lim, V.I. (1994) Analysis of action of wobble nucleoside modifications on codon-anticodon pairing within the ribosome. J Mol Biol. 240, 8-19.

65. Louise, L., Major-Poole, E.S., Dalphin, M.E, Mannering, S.A., and Tate, W.P. (1996) Is the in-frame termination signal of the Escherichia coli release factor-2 frameshift site weakened by a particularly poor context? Nucl. Acids Res. 24, 2673-2678.

66. Masson, J.-M., and Miller, J.H. (1986) Expression of sinthetic suppressor tRNA genes under the control of a synthetic promoter. Gene 47, 179-183.

67. McClain, W.H., and Foss K.(1984) Hybrid transfer RNA genes in phage T4. Cell 38,225-231.

68. McClain, W.H. (1995) tRNA: Structure, biosynthesis and function./Soll D., RajBhrandaiy U.L., Eds. Washington, D.C.:ASM Press. 335-347.

69. McClain, W.H., and Foss, K. (1988c) Changing the identity of a tRNA by introducing a G-U wobble pair near the 3' acceptor end. Science 240,793-796.

70. McClain, W.H. (1993) Identity of Escherichia coli tRNACys determined by nucleotides in three regions of tRNA tertiary structure. J Biol. Chem. 268, 1939819402.

71. McClain, W.H., and Foss, K. (1988a) Nucleotides that contribute to the identity of Escherichia coli tRNA"*. J. Mol. Biol. 202,697-709.

72. McClain, W.H., and Foss, K. (1988b) Changing the acceptor identity of a transfer RNA by altering nucleotides in a "variable pocket". Science 241, 1804-1807.

73. McClain, W.H., Foss, K., Jenkins, R.A., and Scheider, J. (1990) Nucleotides that determine Escherichia coli tRNA^ and tRNALys identities revealed by analyses of mutant opal and amber suppressor tRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 92609264.

74. McClain, W.H., Foss, K., Jenkins, R.A., and Scheider, J. (1991) Rapid determination of nucleotides that define tRNAGly acceptor identity. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 88, 6147-6151.

75. McClain, W.H., Guthrie, C., and Barrel, B.G. (1972) Eight transfer RNAs induced bei infection of Escherichia coli with bacteriophage T4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,3703-3707.

76. McCourguordale, D.J. (1975) The T-odd bacteriophages. CRC Critical Reviews in Microbiology 4, 101 -159.

77. Meinnel, Т., Mechulam, Y., Lazennec, C., Blanquet, S., and Fayat, G. (1993) Critical role of the acceptor stem of tRNAs (Met) in their aminoacylation by Escherichia coli methionyl-tRNA synthetase. J Mo I Biol. 229,26-36.

78. Messing, J., Gronneborn, В., Miiller-Hill, В., Hofschneider, P. H. (1977) Filamentous coliphage M13 as a cloning vehicle in the M13 replicative form in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,3642-364.

79. Miller, J.H. and Albertini, A.M. (1983) Effect of surrounding sequence on the suppression of nonsense codons. J. Mol. Biol. 164, 59-71.

80. Moen, T.L., Seidman, J.G., and McClain, W.H. (1978) A catalogue of transfer RNA-like molecules synthesized following infection of E. coli by T-even bacteriophages. J. Biol. Chem. 253, 7910-7917.

81. Muramatsu, Т., Nishikawa, K., Nemoto, F., Kuchino, Y., Nishimura, S., Miyazawa, Т., and Yokoyama, S. (1988) Codon and amino-acid specificities of a transfer RNA are both converted by a single post-transcriptional modification. Nature 336,179-181.

82. Nagan, M.C., Beuning, P., Musier-Forsyth, K., and Cramer, C.J. (2000) Importance of discriminator base stacking interaction: molecular dynamics analysis of A73 microhelixAk variants. Nucleic Acid Res. 28,2527-2534.

83. Nameki, N., Asahara, H., and Hasegawa, T. (1996) Identity elements of Thermus thermophilic tRNAThr. FEBS Letters 396,201-207.

84. Nameki, N., Tamura, K., Asahara, H., Hasegawa, T. (1997) Recognition of tRNAGly by three widely diverged glycyl-tRNA synthetase. J. Mol Biol. 268, 640647.

85. Normanly, J., Ollick, Т., and Abelson, J. (1992) Eight base changes are sufficient to convert a leucine-inserting tRNA into a serine-inserting tRNA. Proc Natl Acad Sci USA 89, 5680-5684.

86. Normanly, J., and Abelson, J. tRNA identity. (1989) Annu. Rev. Biochem. 58, 719726.

87. Normanly, J., Kleina, L.G., Masson, J.-M., Abelson, J., and Miller, J.H. (1990) Construction of Escherichia coli amber suppressor tRNA genes. Determination of tRNA specificity. J Mol Biol. 213, 719-726.

88. Normanly, J., Ogden, R.C., Horvath, S.J., and Abelson, J. (1986) Changing the identity of a transfer RNA. Nature 321,213-219.

89. Nureki, O., Niimi, Т., Muramatsu, Т., Kanno, H., Kohno, Т., Florentz, C., Giege, R., and Yokoyama, S. (1994) Molecular recognition of the identity-determinant set of isoleucine transfer RNA from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 236, 710-724.

90. Osawa, S. (1995) Evolution of the genetic code. London: Oxford University Press/.

91. Рак, M., Pallanck, L., and Schulman, L.H. (1992) Conversion of methoionine initiator tRNA into a tryptophan-inserting elongator tRNA in vivo. Biochemistry 31,3303-3309.

92. Pallanck, L., and Schulman, L.H. (1991) Anticodon-dependent aminoacylation of a noncognate tRNA with isoleucine, valine, and phenylalanine in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 88,3872-3876.

93. Pallanck, L., Li, S., and Schulman, L.H. (1992) The anticodon and discriminator base are major determinants of cysteine tRNA identity in vivo. J. Biol. Chem. 267, 7221-7223.

94. Pallanck, L., Рак, M., and Schulman, L.H. (1995) tRNA discrimination in aminoacylation. In: tRNA: Structure, biosynthesis and function. (Soil, D., and RajBhandary, U.L., eds.) Washington. DC: American Society of Microbiology, 371-394.

95. Park, S.J., and Schimmel, P. (1988) Evidence for interaction of an aminoacyl transfer RNA synthetase with a region important for the identity of its cognate transfer RNA. J. Biol. Chem. 263, 16527-16530.

96. Pelka, H., and Schulman, L.H. (1986) Study of the interaction of Escherichia coli methionyl-tRNA synthetase with tRNA**1®1 using chemical and enzymatic probes. Biochemistry 25,4450-4456.

97. Persson, B.C., Gustafsson, D.E., Berg, D.E., and Bjork, G.R. (1992) The gene for a tRNA modifying enzyme, m5U54-methyltransferase, is essential for viability in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89, 3995-3998.

98. Persson, B.C., Jager, G., and Gustafsson, D.E. (1997) The spoU gene of Escherischia coli, the fourth gene of the spoT operon, is essential for tRNA (Gml8) 2'-0-methyltransferase activity. Nucleic Acids Res. 25,4093-4097.

99. Petrullo, L.A., Gallengnher, P.J., and Elseviers, D. (1983) The role of 2-metilo-N6-isopepentyladenosine in readthrough and suppression of nonsense codons in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 190,289-294.

100. Phelps, S.S., Jerinic, O., and Joseph, S. (2002) Universally conserved interactions between ribosome and the anticodon stem-loop of A site tRNA important for translocation. Molecular Cell 10, 799-807.

101. Puglisi, E.V., Puglisi, J.D., Williamson, J.R., and RajBhandary U.L. (1994) NMR analysis of tRNA acceptor stem microhelices: discriminator base change affects tRNA conformation at the 3' end. Proc Natl Acad Sci USA 91, 11467-11471.

102. Rak, В., and von Reutern, M. (1984) Insertion element IS5 contains a third gene. EMBOJ. 3, 807-811.

103. Raftery, L.A., and Yarus, M. (1985) Site-specific mutagenesis of Escherichia coli glfY yields a weak, glutamic acid-inserting ochre-suppressor. J. Mol. Biol. 184, 343-345.

104. Raftery, L.A., and Yarus, M. (1987) Systematic alteration in the anticodon arm make tRNAGlu- Su*. a more efficient suppresso. EMBOJ. 6, 1499-1506.

105. Robertus, J.D., Ladner, J.E., Finch, J.T., Rhodes, D., Brown, R.S., Clark, B.F., and Klug, A. (1974) Structure of yeast phenilalanine tRNA at 3A° resolution. Nature 250,546-551.

106. Rosenberg, M., and Court, D. (1979) Regulatory sequences involved in the promotion and termination of RNA transcription. Annu Rev Genet. 13,319-353

107. Rould, M.A., Perona, J.J., Soil, D., and Steitz, T.A. (1989) Structure of E. coli glutaminyl-tRNA synthetase complexed with tRNAGhl and ATP at 2.8 E resolution. Science 246, 1135-1142.

108. Rozenski, J., Crain, P.F., and McCloskey, J.A (1999) The RNA Modification database: 1999 update. Nucleic Acids Res. 27,1996-1997.

109. Rudinger, J., Blechschmidt, В., Ribeiro, S., and Sprinzl, M. (1994) Minimalist aminoacylated RNAs as efficient substrates for elongation factor Tu. Biochemistry 33, 5682-5688.

110. Saks, M.E., and Sampson, J.R. (1996) Variant minihelix RNAs reveal sequence-specific recognition of the helical tRNA(Ser) acceptor stem by E. coli seryl-tRNA synthetase EMBOJ. 15,2843-2849.

111. Sampson, J.R., and Uhlenbeck, O.C. (1988) Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 85, 1033-1037.

112. Sampson, J.R., DiRenzo, A.B., Behlen, L.S., and Uhlenbeck, O.C. (1989) Nucleotides in yeast tRNA111® required for the specific recognotoin by its cognate synthetase. Science 243, 1363-1366.

113. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-termination inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463-5467.

114. Scherberg, N.H., and Weis, S.B. (1972) T4 transfer RNAs: codon recognition and translational properties. Proc Natl Acad Sci USA 69, 1114-1118.

115. Schmidt, F.S., and Apirion, D. (1983) T4 Transfer tRNAs: paradigmic system for the stady of RNA processing/ Bacteriophage Т4/ Eds. Matthews C. Kutter E.M., Mosig G., Berger P.B. Amer. Soc. Microbiol. 208-217.

116. Schulman, L.H., and Pelka, H. (1988) Anticodon switching changes the identity of methionine and valine transfer RNAs. Science 242, 765-768.

117. Schulman, L.H., and Pelka, H. (1989) The anticodon contains a major element of identity of arginine transfer RNAs. Science 246, 1595-1597.

118. Schulman, L.H., and Pelka, H. (1990) An anticodon change switches the identity of E. coli tRNAnjMet from methionine to threonine. Nucleic Acids Res. 18,285-289.

119. Senger, В., Despons, L., Walter, P., and Fasiolo, F. (1992) The anticodon triplet is not sufficient to confer methionine acceptance to a transfer RNA. Proc Natl Acad Sci USA 89,10768-10771.

120. Shi, J.-P., and Schimmel, P. (1991) Aminoacylation of alanine minihelices. J. Biol. Chem. 266,2705-2708.

121. Shi, J.-P., Francklyn, C., Hill, K., and Schimmel, P. (1990) A nucleotide that enhances the charging of RNA minihelix sequence variants with alanine. Biochemistry 29, 3621-3626.

122. Shimada, A., Nureki, O., Goto, M., Takahashi, S., and Yokoyama, S. (2001) Structural and mutational studies of a recognition of the arginine tRNA-specific major identity element, A20, by arginyl-tRNA-synthetase. Proc Natl Acad Sci USA 98,13537-13542.

123. Shimizu, M., Asahara, H., Tamura, K., Hasagawa, Т., and Himeno, H. (1992) The role of anticodon bases and discriminator nucleotide in the recognition of some E. coli tRNAs by their aminoacyl-tRNA synthtases. J. Mol. Evol. 35,436-443.

124. Shlyapnikov, M.G., Kaliman, A.V., Kazantsev, S.I., Kryukov, V.M., and Bayev, A.A. (1984) The nucleotide sequence of bacteriophage T5 glutamine transfer RNA. Biochim. Biophys. Acta 782, 313-319.

125. Shlyapnikov, M.G., Kazantsev, S.I., Kryukov, V.M., and Bayev, A.A. (1985) The nucleotide sequence of bacteriophage T5 leucine tRNA. FEBSLett. 192,299-302.

126. Shlyapnikov, M.G., Ksenzenko, V.N., Kiyukov, V.M., and Bayev, A.A. (1986) Nucleotide sequence of the bacteriophage T5 DNA fragment which contains the gene for tRNAAsp. Eur. J. Biochem. 156,285-289.

127. Sikine, S., Nureki, O., Sakamoto, K.,Niimi, Т., Tateno, M., Go, M., Kohno, Т., Brisson. A., Lapointe, J., and Yokoyama, S. (1996) Major identity determinants in the "augmented D helix" of tRNAG,u from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 256, 685700.

128. Smith, J.D. (1979) Suppressor tRNAs in prokaryots. Nonsense mutation and tRNA suppressors. Eds. J.E.Celis. J.D.Smith. Acad. Press 109-125.

129. Sprinzl, М., Horn, С., Brown, M., Ioudovich, A., and Steinberg, S. (1998) Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes. Nucleic Acid Res. 26,148-153.

130. Sylvers, L.A., Rogers, K.C., Shimizu, M., Ohtsuka, E., and Soil, D. (1993) A 2-thiouridine derivative in tRNAGlu is a positive determinant for aminoacylation by Escherichia coli glutamyl-tRNA synthetase. Biochemistry 32, 3836-3841.

131. Tamura, F., Nishimura, S., and Ohki, M. (1984) The E. coli divE mutation, which differentially inhibits synthesis of certain proteins, is in tRNASerl. EMBO J. 3, 1103-1107.

132. Tamura, K., Himeno, H., Asahara. H., Hasegawa, Т., and Shimizu, M. (1991) Identity determinants of E. coli tRNA(Val). Biochem Biophys Res Commun. Ill, 619-623.

133. Tamura, K., Himeno, H., Asahara, H., Hasegawa, Т., and Shimizu, M.(1992) In vitro study of E. coli tRNA(Arg) and tRNA(Lys) identity elements. Nucleic Acids Res. 20, 2335-2339.

134. Theobald, A., Springer, M., Grunberg-Manago, M., Ebel, J.-P., and Giege, R. (1974) Tetriaiy structure of Escherichia coli tRNA3Thr in solution and interaction of this tRNA with the cognate threonyl-tRNA synthetase. Eur. J. Biochem. 175, 511-524.

135. Tinkle-Peterson, E., and Uhlenbeck, O.C. (1992) Determination of recognition nucleotides for Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase. Biochemistry 31, 10380-10389.

136. Urbonavicius, J., Durand, J.M. and Bjork, G.R. (2002) Three modification in the D and T arms of tRNA influence translation in Escherichia coli and expression of virulence genes in Shigella flexneri. J. of Bacteriology. 184, 5348-5357.

137. Vieira, J., and Messing, J. (1982) The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19,259-268.

138. Wang, S., and Kool, E.T. (1995) Origins of the large differences in stability of DNA and RNA helices: C5methyl and 2'-hydroxyl effects. Biochemistry 34, 41254132.

139. Whitfield, J. (1972) Suppression of nonsense, frameshift and missense mutation. The mechanism of protein synthesis and its regulation/ Ed. L.Bosch Elsevier. 243283.

140. Wilkens, K., and Ruger, W. (1994) Characterization of bacteriophage T4 early promoters in vivo with a new promoter probe vector. Plasmid 35, 108-20.

141. Wilson, J.H. (1973) Function of the bacteriophage T4 transfer RNAs. J. Mol. Biol. 74, 753-757.

142. Wilson, D.B., and Hogness D. (1966) in Methods in Enzymology. Grossman, L., ad Moldave, K., Eds; Acadenic press, New York. 8,229-240.

143. Yanisch-Perron, C., Vieira, J., and Messing, J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119.

144. Yarns, M. (1982) Translational efficiency of transfer RNAs uses of an extended anticodon. Science 218,646-652.

145. Yokoyama, S., and Nishimura, S. (1995) In tRNA: Structure, biosynthesis and function. Soil D.; RajBhandary, U., Eds; ASM Press: Washington D.C., 207-223.

146. Yue, D., Kintanar, A., and Horowitz, J. (1994) Nucleoside modifications stabilize Mg2+ binding in Escherichia coli tRNAVal : fii imino proton NMR investigation. Biochemistry 33, 8905-8911.

147. Zhang, S., Ryden-Aulin, M., and Isaksson, L.A. (1996) Functional interaction between release factor one and P-site peptidyl-tRNA on the ribosome. Mol. Biol. 261, 98-107.

148. Акуленко, Н.В., Ивашина, Т.В., Шалойко, JI.A., Шляпников, М.Г., Ксензенко, В.Н. (2004) Новые сайт-специфические эндонуклеазы F-7/Л, F-7/7II и F-7/7IV, кодируемые бактериофагом Т5. Молекуляр. биология 38, 632-641.

149. Зайцев, Е.Н., Зайцева, Е.М., Бакланова, И.В., Горелов, В.И., Кузьмин, Н.П., Крюков, В.М., и Ланцов, В.А. (1986) Клонирование и характеристика гена гесА из Pseudomonas aeruginosa. Генетика 22, 2721-2727.

150. Казанцев, С.И., Чернов, А.П., Шляпников, М.Г., Крюков, В.М., и Баев, А.А. (1979) Харакгеризация и картирование стабильных РНК, кодируемых делетабельной областью ДНК бактериофага Т5. Доклады АН СССР 247, 744748.

151. Миллер, Д. Эксперименты в молекулярной генетике. (1976) М. Мир. 391-395.

152. Спирин, А.С. (1986) Молекулярная биология: Структура рибосомы и биосинтез белка. / М. Высш. Шк.

153. Шляпников, М.Г., Калиман, А.В., Крюков, В.М., и Баев, А.А. (1987) Первичная структура пролиновой тРНК бауктериофага Т5. Биоорг. химия 13, 559-561

154. Шляпников, М.Г., и Ксензенко, В.Н. (1994) Особенности структуры транспортных РНК, кодируемых бактериофагом Т5. Молекуляр. биология 28, 1321-1329.

Информация о работе
  • Трахтман, Наталия Викторовна
  • кандидата биологических наук
  • Пущино, 2004
  • ВАК 03.00.03
Диссертация
Получение генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Получение генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5 - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы