Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение транскриптов гена тРНКPhe и их узнавание фенилаланил-тРНК-синтетазой Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение транскриптов гена тРНКPhe и их узнавание фенилаланил-тРНК-синтетазой Escherichia coli"

=т о

UJ

СО ^ На правах рукописи

О- C\J

ХОЛОД НАТАЛЬЯ СТЕПАНОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСКРИПТОВ ГЕНА тРНК"* И ИХ УЗНАВАНИЕ ФЕНИЛАЛАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗОЙ ESCHERICHIA COLI

Специальность 03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1998

Работа выполнена в лаборатории структурно — функционального анализа генетических систем микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина Российской Академии наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, В.Н. Ксензенко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор О.О. Фаворова доктор биологических наук, профессор Ю.В, Козлов

Ведущая организация:

Новосибирский Институт биоорганической химии СО РАН

1998 г.

Защита диссертации состоится /6 " ОкХ в час. 00 мин, на заседании Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан " СЛ-СсХрX 1998 г

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Узнавание тРНК соответствующей аминоадил—тРНК — синтетазой (АРСазой) — классический пример высо — коспецифичного белок — нуклеинового взаимодействия, часто встречающегося в живой клетке. Правильный выбор и аминоацилирование тРНК критически важны для воспроизведения генетически заданной первичной структуры белков. Известно, что АРСаза способна узнавать набор нуклеотидных остатков тРНК, так называемые "элементы специфичности". При определении этих элементов специфичности транскрипты различных генов тР1 !К и их мутанты сравнивали со зрелыми тРНК той же специфичности по кинетическим параметрам аминоацилирования. Для многих АРСаз, в том числе для всех АРСаз из Е. coli и большинства АРСаз из дрожжей, были определены элементы специфичности, но, тем не менее, вопрос о структурных элементах, обеспечивающих специфичность аминоацилирования, до сих пор нельзя считать решенным.

Транскрипция in vitro с использованием РНК—полимераз бактериофагов SP6, ТЗ и Т7 была предложена в начале 1980 —х годов как эффективный метод синтеза биологически активных РНК. Разработка транскрипционных систем in vitro, позволяющих синтезировать любые РНК, привела к бурному развитию новых направлений исследований, в частности применительно к тРНК. В настоящее время транскршггы генов тРНК широко используют для изучения структуры и функции тРНК в различных биофизических и биохимических исследованиях. Относительная легкость получения разнообразных вариантов мутантных форм тРНК способствовала существенному прогрессу в исследовании механизмов взаимодействия тРНК с многочисленными белками трансляционного аппарата клетки. Однако, в ходе многочисленных исследований неоднократно отмечали, что транскрипты по сравнению с ДНК — матрицей часто удлинены на 3' —конце на один —два нуклеотида. Безусловно, присутствие удлиненных молекул в препаратах может значительно искажать исследуемые физические и биологические свойства транскриптов изучаемых генов. Таким образом, способность РНК — полимераз включать дополнительные нуклеотидные остатки на 3' — конец транскриптов создает определенные проблемы при синтезе и очистке нужного РНК — транскрипта. Несмотря на многочисленные попытки решить эту проблему

разнообразными методами, универсальный, надежный и достаточно дешевый способ до сих пор еще не найден.

Известно, что бактериофаг Т5 кодирует тРНК, специфичные ко всем аминокислотам, участвующим в белковом синтезе. Нуклеотидная последовательность генов всех этих тРНК установлена, и показано, что большинство из них имеет существенные отклонения от канонической структуры "клеверного листа" и низкий уровень структурного сходства с соответствующими изоакцепторными тРНК Е. coli. Поскольку фагоспецифичные тРНК и тРНК Е. coli функционируют в единой системе трансляции (в частности, аминоацилируются одними и теми же АРСазами), их с полным основанием можно считать природными изоакцепторами. По этой причине тРНК фага Т5 представляют собой уникальную модель для исследования различных сторон функционирования этих макромолекул, в том числе их способности узнаваться и аминоацилироваться АРСазами из Е. coli.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы было изучение структурных особенностей тРНК, обеспечивающих специфичность аминоацилирования на модели тРНК^фенилаланил — тРНК—сшггетаза (PheRS). В качестве объекта исследования была выбрана синтезированная in vitro немодифицированная тРНКи"! фага Т5, В соответствии с данной целью конкретные задачи исследования состояли в следующем:

— оптимизировать условия синтеза транскрипта гена тРНКр|ш фага Т5;

— найти способ очистки транскрипта, позволяющий разделять продукты

нормальной длины и удлиненные на один — два нуклеотидных остатка;

— подобрать оптимальные условия аминоацилирования транскрипта гена

трнкрь= ф^ Т5 PheRS „а соц.

— определить кинетические параметры реакции аминоацилирования транскриптов гена фагоспецифичной TPHKph<> и его мутантов;

— сравнить кинетические параметры аминоацилирования транскриптов

генов тРНКРЬе фага Т5 с параметрами аналогичных транскриптов Е. coli;

— сделать выводы о расположении в тРНКрь'1 "элементов специфичности" для PheRS из Е. coli.

Научная новизна работы. В данной работе впервые проведено детальное изучение влияния удлиненных продуктов транскрипции in vitro

генов тРНК и димерных молекул тРНК на определение кинетических параметров аминоацилирования. Показано, что синтез удлиненных продуктов, а также способность к образованию димеров зависит от структуры тРНК. Разработаны методы очистки транскриптов генов тРНК, позволяющие получать гомогенные препараты данных транскриптов. Определены условия "активации" транскриптов генов тРНК, позволяющие избежать образования димерных молекул.

Впервые проведено изучение in vitro акцепторных свойств фагоспецифичной тРНКР1" в сравнении с изоакцепторной тРНКРЬс из Е. coli. Показано, что специфичность данного взаимодействия существенно зависит от ионных условий аминоацилирования (по концентрации Мд2+). Полученные данные позволяют предположить, что при физиологических ионных условиях (4 мМ Mg2*) PheRS узнает не только отдельные нуклеотидные остатки тРНК, но и конформацию отдельных участков молекулы тРНК. Результаты данной работы по определению элементов специфичности для PheRS Е. coli показывают необходимость пересмотреть некоторые выдвинутые ранее предположения о механизме взаимодействия тРНКгы с PheRS.

Научно-практическое значение работы. Предложенная в данной работе процедура очистки транскриптов генов тРНК позволяет получать практически гомогенные продукты транскрипции. Данный подход может быть успешно применен для получения, по крайней мере, всех бактериальных и фагоспецифичных немодифицированных тРНК. Кроме того, метод очистки электрофорезом в неденатурирующих условиях может быть использован при очистке достаточно коротких транскриптов любых других генов. Полученные результаты показали, что фагоспецифичные тРНК и транскрипты их генов могут служить удобной моделью для изучения разнообразных биохимических реакций с участием тРНК. Применение тРНК фага Т5 позволяет проводить сравнительный анализ физических и биологических свойств этих тРНК с соответствующими тРНК Е. coli, что особенно актуально для тех тРНК, которые не имеют изоакцепторов в бактериальной клетке.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 16 Международном Рабочем Совещании по тРНК (16ш International tRNA Workshop, USA 1995), на конкурсе научных работ ИБФМ РАН (Пущино,

1995), Городской научной конференции молодых ученых г.Пущино (1996), 17 Международном Рабочем Совещании по тРНК (17й1 International tRNA Workshop, Japan, 1997).

Публикации. По материалам работы опубликовано 5 статей и один мини — обзор.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация включает 106 страниц машинописного текста, 18 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 145 источник.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для получения немодифицированной тРНК| ,1е фага Т5 сконструирована плазмида pT5F0. В результате расщепления плазмидной ДНК эндонуклеазой ßs/N 1 образуется набор фрагментов, причем выступающий 5'—концевой тимидин во фрагменте, содержащем ген тРНКГЬс фага Т5, комплементарен 3' —концевому аденозину тРНК. Транскрипция гидролизованной BsiNl плазмиды pT5F0 РНК—палимеразой фага Т7 приводит к образованию РНК длиной 75 оснований, идентичной по нуклеотидной последовательности немодифицированной тРНК'1"' фага Т5. Для повышения эффективности транскрипции в структуре гена тРНКРЬе основания A3—Т70 заменены на G3 —С70. Ранее показано (Tinkle — Peterson & Uhlenbeck, Biochemistry, 1992, 31, 10380— 10389), что аналогичные замены в гене тРНК№е (Я. coli) не влияют на кинетические параметры аминоацилирования PheRS. Для удобства транскрипты тРНКрь<!, содержащие G3 — С70, названы в данной работе "транскриптами дикого типа". Все мутантные транскрипты генов тРНКр|ш фага Т5 и Е. coli также содержат данные замены, что позволяет их сравнивать с "диким типом".

Для выяснения влияния нуклеотидной последовательности ДНК — матрицы на синтез 3'—удлиненных продуктов, проведена транскрипция in vitro различных генов тРНК бактериофага Т5 и Е. coli РНК—полимеразой фага Т7. Результаты показали, что при транскрипции всех исследованных нами генов тРНК синтезируется значительное количество продуктов, удлиненных на 1 — 2 нуклеотидных остатка (рис. 1). Количественный анализ

1 2 3 4 5 6

29 23 20 11 31 6 количество удлиненных продуктов, (%)

Рис. 1. Транскрипция генов тРНК фага Т5: тРНКс" (дорожка 1), тРНКТгр (дорожка 3), тРНКРЬе (дорожка 5), мутантная тРНКРЬе (T28G, T29G, Т41С, Т42С) (дорожка 6), и генов тРНК Е. coli; тРНКТгр (дорожка 2), тРНКРЬе (дорожка 4) РНК — полимеразой бактериофага Т7. Радиоавтограф 6% ПААГ, содержащего 8М мочевину. Электрофорез проводили при 55°С в буфере ТБЕ, толщина геля была 0.2 мм, напряжение электрического поля — 100 В/см. Количество синтезированных транскриптов (тотально меченных [а— ^PJATP в ходе транскрипции) определяли путем вырезания радиоактивных полос геля с последующим измерением уровня их радиоактивности по методу Черенкова.

синтезированных транскриптов после разделения электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) показал, что выход удлиненных продуктов различен для разных генов тРНК и в значительной степени зависит от первичной структуры ДНК —матрицы (рис. 1). Более того, замены нуклеотидных остатков в ДНК, используемой для транскрипции, могут изменять относительный выход 3'—удлиненных продуктов. Следовательно, препараты транскриптов различных мутантных генов тРНК (если они тщательно не очищены) могут содержать разное количество неактивных молекул (рис. 1). Можно предположить, что условия транскрипции in vitro в отсутствие терминатора неблагоприятны для отделения РНК — полимеразы от ДНК —матрицы и терминации

А

Рис. 2. Анализ транскриптов гена тРНКи'а фага Т5. Электрофорез в денатурирующем (А) и неденатурирующем (Б) 15% ПААГ образцов, предварительно очищенных электрофорезом в денатурирующем ПААГ (дорожка 1) и афинной хроматографией с использованием фактора элонгации Ти из Т. ОгегторШиБ (дорожка 2).

для отделения РНК — полимеразы от ДНК —матрицы и терминации транскрипции точно по концу матрицы.

Электрофорез в денатурирующем ПААГ наиболее часто используют для очистки транскриптов генов тРНК. Чтобы оценить чистоту транскриптов, полученных этим методом, проведено исследование препарата транскриптов гена тРНКРЬв фага Т5. Хотя препарат выглядел гомогенным при анализе электрофорезом в денатурирующем ПААГ (рис. 2А), анализ полного щелочного гидролизата этого же препарата двумерной тонкослойной хроматографией (ТСХ) выявил присутствие двух нуклеотидных остатков на 3' — конце транскриптов. Дополнительно к аденозину, вероятно соответствующему 3' — концу тРНК, транскрипты содержали также значительное количество цитозина. Электрофорез в неденатурирующем ПААГ позволил разделить этот препарат транскриптов на несколько дискретных полос (рис. 2Б).

Мономеры

5Б РНК Димеры

12 3 4

Рис. 3. Образование димеров транскршггов гена тРНК"* фага Т5 в зависимости от условий активации транскриптов. Транскрипты нагревали в воде (дорожка 1), в буфере А, содержащем 30 мМ НЕРЕБ— КОН, рН 7.45 и 50 мМ КС1 (дорожка 2), в буфере А с 0.3 М МдС12 (дорожка 3) и в растворе 0.1 М ЫаС1 (дорожка 4). После прогревания препаратов в течение 30 сек при 95°С, транскрипты охлаждали до 37°С со скоростью 1°С/мин. Мономеры и димеры разделяли электрофорезом в неденатурирующем 15% ПААГ. Электрофорез проводили при комнатной температуре в буфере ТБЕ без ЭДТА. Толщина геля была 0.75 мм, напряжение электрического поля —

10 В/см.

Транскрипты, соответствующие зонам геля, пронумерованным как I, II и III, были выделены и проанализированы частичным гидролизом РНКазой Т,. При электрофорезе этих гадролизатов установлено, что полоса I содержит транскрипт ожидаемой длины (75 нуклеотидных остатков), тогда как полосы

11 и III содержат преимущественно транскрипты, удлиненные на 1 и 2 нуклеотидных остатка, соответственно.

Для устранения гетерогенности препарата транскриптов проводили аффинную хроматографию с использованием фактора элонгации Ти из Т. МегторШиэ. Электрофорез в неденатурирующем ПААГ препаратов транскриптов, очищенных этим способом, выявил только одну полосу (рис.

2Б). Двумерная ТСХ полного щелочного гидролизата показала наличие только аденозина на 3' —конце транскриптов. Следовательно, гомогенные по 3' — концу препараты транскриптов генов тРНК могут быть получены либо очисткой хроматографией с использованием EF—Tu, либо электрофорезом в неденатурирующем ПААГ.

Для проведения реакции аминоацилирования транскрипты генов тРНК, полученные in vitro, нуждаются в так называемой "активации". Наиболее часто используют процедуру активации, включающую денатурацию и последующую ренатурацию транскриптов. Однако, в большинстве исследований активированные транскршпы не проверяют на олигомеризацию. При анализе электрофорезом в неденатурирующем 15% ПААГ транскриптов гена тРНКРЬе фага Т5, активированных в буфере А (30 мМ HEPES —КОН, рН 7.45, 50мМ КС1), обнаружено образование электрофоретически менее подвижных форм РНК, по — видимому, димеров тРНК (рис. 3). При использовании различных условий активации установлено, что только "активация" в воде не вызывает агрегации молекул РНК. Способность транскриптов генов тРНК образовывать димеры изучали на примере мутантных форм тРНКРЬв фага Т5 (рис. 5). Оказалось, что димеризация зависит даже от единичных нуклеотидных замен в транскриптах гена тРНК (рис. 4). В одинаковых условиях транскрипт гена тРНК"' дикого типа образовывал только 50% молекул димеров, тогда как замена A20U приводит к образованию более 90% димеров. Восстановление спаренности оснований в антикодоновом стебле тРНК (замены U28-U42 и U29-U41 пар оснований на G28»C42 и G29«C41, соответственно) приводит к полной потере способности образовывать димеры. Следовательно, разные препараты транскриптов, активированных в условиях, способствующих димеризации могут содержать разное количество соответствующих димеров. Известно, что ССА—3' конец в молекуле тРНК необходим для аминоацилирования. В данной работе было проведено аминоацилирование препаратов транскриптов гена тРНКРЬе фага Т5, содержащих удлиненные молекулы и/или димеры. Как следует из опытов (рис. 5), димеры сохраняю стабильность в присутствии PheRS, но не аминоацилируются. Присутствие молекул, которые не аминоацилируются (как 3' —удлиненных транскриптов, так и димеров), значительно влияет на кинетику реакции аминоацилирования. Это влияние прежде всего заключается

1 23456789 1011

Димеры

З'-удлиненные продукты

Мономеры -»

48 91 57 41 72 70 51 0 12 0 70 количество димеров, (%)

Рис. 4. Влияние нуклеотидных замен в транскриптах гена тРНКрь" фага Т5 на образование димеров. Транскрипт "дикого типа" (дорожка 1), мутанты: A20U (дорожка 2), A36G (дорожка 3), A35U (дорожка 4), G34A (дорожка 5), A20U + A36C (дорожка 6), вставка U45 (дорожка 7), G26A+A44G (дорожка 8), U60C (дорожка 9), U28G + U29G + U41C + U42C (дорожка 10), A73U (дорожка 11). Все препараты транскриптов нагревали до 95°С в буфере А с 0.3 мМ МдС12, охлаждали до 37°С и разделяли электрофорезом в 15% неденатурирующем ПААГ. Количество димеров определяли сканированием фотопленок полиакриламидных гелей (программа Kodak ID).

А

Б

Димеры

Мономеры'

Рис. 5. Аминоацилирование транскриптов гена тРНКГк,е фага Т5 в условиях, благоприятствующих димеризации. (А) Транскрипты активировали нагреванием в буфере А с 0.3 мМ МдС12, аминоацилировали [14С]фенилаланином и разделяли в 15% ПААГ, рН 5.3 (дорожка 2). В качестве контроля на гель наносили неаминоацилированные транскрипты (дорожка 1). (Б) Радиоавтограф этого же геля.

в понижении плато аминоацилирования, а также в изменении каталитических констант (табл. 1). Поскольку количество 3'—удлиненных молекул и димеров зависит от нуклеотидных замен в структуре тРНК, ошибки в определении каталитической эффективности аминоацилирования транскриптов дикого типа и мутантов могут быть различными и достаточно значительными. В принципе, для популяции гомогенных и активных молекул при оптимальной концентрации всех компонентов, почти все молекулы тРНК в реакционной смеси могут быть аминоацилированы. Фактически, 100% плато аминоацилирования было достигнуто при аминоацилировании транскриптов гена тРНКРЬе фага Т5, очищенных с использованием фактора элонгации Ти (табл. 1). Этот результат существенно важен, поскольку означает, что только применение соответствующей методологии позволяет получать гомогенные и полностью активные транскрипты для физических и биохимических исследований. Более того, после очистки хроматографией на ЕР —Ти транскрипты не нуждаются в дальнейшей активации денатурацией/ренатурацией, которая

Таблица 1. Кинетические параметры аминоацилирования транскриптов гена тРНКрь" фага Т5 фенилаланил—тРНК —синтетазой

из Е. coli.

Подготовка препарата транскриптов Плато аминоаци — лирования, (%) Кинетические параметры аминоацилирования

км (мкМ) ^cot (мин"') относит.

Хроматография с ЕР—Ти

активация нагреванием

в Н20 100 0.950 550 (1.00)

в 0.3 мМ МдС12 70 * * НО

Электрофорез в

денатурирующем ПААГ

активация нагреванием

в Н20 70 1.000 480 0.82

в 0.3 мМ МдС12 50 2.545 400 0.27

*, трудно измерить. НО, не определяли.

способствует димеризации. Следовательно, очистка транскриптов с помощью EF —Tu также позволяет избежать образования димеров.

Суммируя наш опыт получения гомогенных и полностью активных . транскриптов генов тРНК, можно рекомендовать (1) очистку продуктов транскрипции электрофорезом в денатурирующем ПААГ, дальнейшую очистку полученных транскриптов электрофорезом в неденатурирующем ПААГ; (2) препаративное амипоацилирование транскриптов соответствующей АРСазой, затем аффинную хроматографию этих транскриптов на иммобилизованном EF — Tu и деацилирование полученных транскриптов. Усовершенствованный протокол очистки и предотвращение образования димеров позволяют избежать главных недостатков транскрипции in vitro: присутствия биологически неактивных димеров, 3' — удлиненных транскриптов и неправильно свернутых РНК—продуктов. Хотя описанный выше протокол разработан главным образом для транскриптов гена тРНКР1"' фага Т5, мы успешно применили его для получения гомогенных и полностью активных транскриптов других генов тРНК Е. coli

MgCl2 (мМ)

Рис. 6. Зависимость начальной скорости ашшоацилирования транскриптов генов тРНКРЬв фага Т5 и Е. coli от концентрации ионов Мд2+ в реакционной смеси.

и фага Т5. Следовательно, разработанный подход может быть применен, по крайней мере, для получения транскриптов генов всех бактериальных и всех фагоспецифичных тРНК.

Известно, что концентрация ионов Мд2+ в реакционной смеси значительно влияет на скорость аминоацилирования. Для определения оптимальных условий иротекания реакции изучили аминоацилирование транскриптов генов тРНКР1"' фага Т5 и Е. coli фенилаланил—тРНК— синтетазой из Е. coli при различных концентрациях Мд2+. Максимальную скорость ашшоацилирования транскриптов фага Т5 и Е. coli наблюдали при 4 мМ и 15 мМ Мд2+, при 4 мМ и 15 мМ Мд2+, соответственно (рис. 6). В ионных условиях, оптимальных для каждого транскрипта, каталитическая эффективность аминоацилирования (К*/Км) была одинакова (табл. 2). Приведенные данные показывают, что изоакцепторы могут обладать неидентичным набором элементов специфичности. Более того, набор элементов специфичности транскриптов Е. coli и фага Т5 неожиданно оказался зависящим от ионных условий в реакционной смеси.

Нуклеотидные остатки антикодона G34, А35 и А36, а также основание А20 определены как главные элементы специфичности для PheRS из Е. coli

А А

с с

А

G-C С - G A- U С - G С - G U -G

,V-acaagcuV А<3А А ,.111 А

U GUCG GUUCG...C

Q UAGC Ga

GAU gc-G^

1 и и

и и

G - С С - G С А U G GA А

U

ш

иии ссс

A G

И А

С С А

G - С С - G С - G С - G G -С G - С

А - U UU

„ U GAGCC А

USA А il-ii G С CUCG CUUGG, „ ,С

1111 с. i

G_ aGAGC. Uq

I G-C

+ G-C

A G-C

A- U U A U A G A A

I I

А С

UU

Рис. 7. Первичная структура ^модифицированных тРНКГЬе фага Т5 (А) и Е. соИ (Б) в форме "клеверного листа". Стрелками показаны нуклеотидные замены, проведенные в данной работе.

(Tinkle-Peterson & Uhlenbeck, Biochemistry, 1992, 31, 10380-10389). Для исследования влияния этих нуклеотидных остатков в тРНКРЬс фага Т5, мы изучили аминоацилирование транскриптов мутантных генов тРНК с заменами каждого основания антикодона (рис. 7). Поскольку транскрипты дикого типа фага Т5 и Е. coli имеют различный оптимум аминоацилирования (рис. 6), мы сравнивали каталитическую эффективность аминоацилирования мутантов при двух концентрациях Мд2"1", соответствующих оптимумам каждого из изоакцепторов (рис. 8).

Неожиданно оказалось, что замена оснований А35 и А36 в транскрипте фага Т5 приводит к увеличению эффективности аминоацилирования при 15 мМ Мд2+ по сравнению с транскриптом дикого типа (рис. 8Б и табл. 2). Мутация G34A в транскрипте гена тРНКГЬе (Е. coli) только незначительно уменьшает отношение ксм/Км при 15 мМ Мд2+. Следовательно, если тестирование гашетики аминоацилирования проводить при 15 мМ Мд2*, то можно сделать вывод, что основания антикодона не являются элементами специфичности для данной АРСазы. Однако,

1600 1200 800 400 0

6 8 мин

6 8 мин

Б A36G

и _ 1 nft?""

-— А35С

^--"Хикий ТИП

A35CA20U

^---- G34C

------------

1600 1200 800 400 0

Г дикий тип

g34a

---- u20a

_ 4 W

8 10 12 14

6 8 10 12 14

Рис. 8. Аминоацилирование транскриптов генов тРНК™" фага Т5 дикого типа и его мутантных форм при 4 мМ Мд2+ (А) и 15 мМ Мд2+ (Б), транскриптов генов тРНКРЬе (Я. coli) при 4 мМ Мд2+ (В) и 15 мМ Mg2t (Г). Концентрации тРНК и PheRS — 0.44 мкМ и 0.6 нмоль, соответственно.

известно, что все три нуклеотидных остатка антикодона относятся к элементам узнавания в тРНКрь'' для соответствующей АРСазы в других организмах. Действительно, измерения каталитических констант аминоацилирования при 4 мМ Mg" транскриптов Е. coli и фага Т5, содержащих замены оснований в позициях 34, 35 и 36, подтверждает важность нуклеотидных остатков антикодона для специфического узнавания PheRS (рис. 8). Известно, что концентрация свободного Мд3+ в клетках Е. coli составляет 0.3 — 2.0 мМ. Следовательно, можно предположить, что при нефизиологических ионных условиях (15 мМ Мд2+) узнавание тРНКР1"' PheRS значительно изменено, и конформация тРНК, по — видимому, становится важнее набора отдельных нуклеотидных остатков. Если мутации в антикодоне транскриптов фага Т5 и Е. coli при 4 мМ Mg2"1" одинаковым образом влияют на скорость аминоацилирования, то замена

Табл. 2. Кинетические параметры аминоацилирования транскриптов генов тРНКГЬг фага Т5 и Е. coli и их мутантных форм фенилаланил — тРНК— синтетазой из Е. coli при 4 мМ и 15 мМ Мд2+

тРНКРЬв МдС12, Км. 1 Км/ Км

(транскрипт) (мМ) (мкМ) (mihi-1) относит.

Е. coU

Дикий тип 4 15 0.856 ± 0.050 0.814 ± 0.008 140 ± 12 485 ± 42 0.27 (1.00)

G34A* 15 0.851 ± 0.043 342 ± 2 0.67

U20A* 15 1.023 + 0.080 209 ± 9 0.33

Бактериофаг Т5

Дикий тип 4 0.947 ± 0.014 549 ± 33 0.97

15 1.940 ± 0.090 207 + 16 0.18

A20U 4 15 0.940 ± 0.060 0.794 ± 0.050 369 ± 14 226 ± 28 0.65 0.47

A36U* 15 0.606 + 0.040 213 ± 30 0.60

A36G' 15 0.687 ± 0.080 210 ± 11 0.52

А36С* 15 1.212 ± 0.055 233 ± 24 0.32

A35U* 15 0.688 ± 0.078 139 ± 8 0.33

А35С* 15 0.703 ± 0.070 188 ± 13 0.45

'Значения при 4 мМ МдС12 не представлены вследствие низкого уровня аминоацилирования (к^/К^ < 0.001).

основания в положении 20 приводит к значительным различиям в для двух типов субстратов. Мутация U20A в транскрипте гена тРНКрь<> (Е. coli) привела к резкому падению скорости аминоацилирования (рис. 8В), тогда как транскрипт гена тРНКр"в фага Т5 дикого типа, содержащий А20, эффективно аминоацилировался PheRS из Е. coli (рис. 8А и табл. 2). "Обратная" замена A20U в транскрипте фага Т5 лишь незначительно повлияла на аминоацилирование этого транскрипта (рис. 8А и табл. 2). Известно, что основание 20 не взаимодействует с другими нуклеотидными остатками в третичной структуре тРНК, и, следовательно, его замена не

должна изменять третичную структуру тРНК. Однако, ранее показано, что замена U20A в транскрипте гена тРНКГЬс (JE. coli) приводит к уменьшению скорости расщепления тРНК, индуцируемой ионами РЬ2+, что свидетельствует об изменении конформации мутантной тРНК. Поскольку А20 присутствует в транскрипте гена тРНКр'"! фага Т5 дикого типа, можно предположить, что транскрипты фага Т5 и Е. coli имеют разную конформацию. Приведенные данные по аминоацилированию транскриптов мутантных генов тРНКРЬе позволяют заключить, что не только отдельные нуклеотидные остатки, но и локальная конформация тРНК важны для специфичного узнавания тРНКгь<! PheRS из Е. coli. Прежняя концепция о "наборе элементов узнавания" должна быть дополнена представлениями о конформации локальных участков молекулы тРНК, вносящих существенный вклад в специфичность белок—нуклеиновых взаимодействий.

ВЫВОДЫ

1. В ходе транскрипции in vitio генов тРНК часть транскриптов удлиняются на 1 —2 нуклеотидных остатка на 3'—конце. Относительный выход удлиненных молекул зависит от первичной структуры гена тРНК, используемой в качестве матрицы для транскрипции. Предложена процедура препаративного получения гомогенных биологически активных транскриптов генов тРНК, включающая использование электрофореза в неденатурирующих полиакриламидных гелях и/или афинной хроматографии на иммобилизованном факторе элонгации Tu из Т. theimophilus.

2. Транскрипты гена тРНК"1* бактериофага Т5 могут образовывать неактивные димеры, доля которых зависит от единичных замен в структуре тРНК и от условий их получения. Подобраны условия активации транскриптов, предотвращающие образование димеров.

3. Присутствие неактивных 3'—удлиненных молекул и димеров в препаратах транскриптов значительно искажает результаты измерений кинетических параметров реакции аминоацилирования (¿^ и Км). Усовершенствованный протокол очистки и контроль за образованием димеров тРНК позволяют получать истинные значения параметров аминоацилирования транскриптов генов тРНК.

4. Транскрипт гена тРНКР,'е фага Т5 в отличие от аналогичного транскрипта Е. coli эффективно аминоацилируется фенилаланил —тРНК—синтетазой из Е. coli при физиолопгческих концентрациях Мд2* (4 мМ) в реакционной смеси.

5. Все три основания антикодона тРНКрь" являются основными элементами узнавания для фенилаланил—тРНК—синтетазы из Е. coli при физиологических концентрациях Мд2+ (4 мМ) в реакционной смеси. Нуклеотидный остаток в положении 20 TPHKphe не является элементом узнавания. Взаимодействие тРНКРЬе с фенилаланил —тРНК —синтетазой Е. coli существенно зависит от ионных условий: фермент узнает не только химическую природу элементов специфичности, по и конформацию отдельных участков молекулы тРНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Холод, Н.С., Панькова Н.В., Майоров С.Г., Крутилина А.И., Шляпников М.Г., Ксензенко В.Н. и Киселев Л.Л. (1996) Влияние ионов Мд2+ и Са2+ на аминоацилирование транскриптов генов тРНК1"1* бактериофага Т5 и Escherichia coli. Молекулярная биология, 30, 1066—1075.

2. Холод, Н.С., Панькова Н.В., Майоров С.Г., Ксензенко В.Н. (1996) Влияние нуклеотидных замен в антикодоне тРНКрь" бактериофага Т5 на аминоацилирование ее транскриптов. Сборник трудов городской научной конференщш молодых ученых г.Пущино, ПНЦ, стр. 63—66.

3. Kholod, N.S., Pan'kova, N.V., Mayorov, S.G., Krutilina, A.I., Shlyapnikov, M.G., Kisselev, L.L., Ksenzenko, V.N. (1997) Transfer tRNAPhe isoacceptors possess non—identical set of identity elements at high and low Mg2* concentration. FEBS Letters, 411, 123- 127.

4. Kholod, N., Vassilenko, K., Shlyapnikov, M., Ksenzenko, V., Kisselev, L. (1998) Preparation of active tRNA gene transcripts devoid of 3'—extended products and dimers. Nucl. Acids Res., 26, 2500-2501.

5. Kholod, N., Pan'kova, N., Ksenzenko, V., Kisselev, L. (1998) Aminoacylation of tRNA gene transcripts is strongly affected by 3' — extended and dimeric substrate RNAs. FEBS Letters, 426, 135-139.

6. Холод H.C. (1998) Димеры тРНК (Minni —обзор). Биохимия, принято в печать.