Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, физико-химическая характеристика моноспецифических сывороток к иммуноглобулину с кур и их применение в промышленном птицеводстве

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение, физико-химическая характеристика моноспецифических сывороток к иммуноглобулину с кур и их применение в промышленном птицеводстве"

РСЗ 00

министерство сельского хозяйства российской федерации

санкт-петербургский ветеринарный институт

На правах рукописи

ГОРЕЦКЛЯ Тамара Ивановна

УДК 577.1:615.373.3.004.12:636.5

ПОЛУЧЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК К ИММУНОГЛОБУЛИНУ С КУР И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ПРОМЫШЛЕННОМ ПТИЦЕВОДСТВЕ

Специальность: 03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 1993

Работа выполнена в отделе общих методов исследования Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства.

Научный руководитель — доктор биологических наук, старший научный сотрудник Колабская Л. С. ,

Официальные оппоненты: .доктор биологических наук, профессор Хованских А. Е.; доктор ветеринарных наук, доцент Конопатов Ю. В.

Ведущее научное учреждение — Российский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский и технологический институт птицеводства.

Защита диссертации состоится в 13 часов на заседании Специализированного сойета К 120,20.01, в Санкт-Петербургском ветеринарном институте по адресу: 196084, г. С.-Петербург, Московский пр., 112.

. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке С.-Петербургского ветеринарного института.

Автореферат разослан

1993 Г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

доцент Эйсымонт Т. А,

ОБЩАЯ ЛАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В промышленном птицеводстве в условиях значительной концентрации поголовья птицы, интенсивных методов выращивания появляются заболевания, обусловленные снижением уровня неспецифической резистентности организма (Митшников В.М., 1985; Рудаков В.В. и др., 1982). В связи с этим актуальна является контроль уровня, резистентности птиц в процессе Еыраздованйя и' коррекция состояния защитных систем биологически активными веществами (Бессарабов Б.Ф., 1263; Валеева Р.В., 1986; Колабская Л.С. и др., 1990).

Актуальность темы. При каждой инфекции развитие иммунологических реакций имеет свои особенности, проявляющиеся в изменении концентрации иммуноглобулинов или состава антител (Боровик Р.В., 1978; ГолубничийВ.П. и др., 1985; СогЬеП Ь.В. ег а1.,1984). Однако роль гуморальных, клеточных'и секреторных факторов иммунитета при многих заболеваниях у птиц до настоящего времени изучена недостаточно ( зотасЬе в.п.,19Э0;Кауа л. е* а!.,1983). Зачастую при разработке способов ветеринарно-санитарных мероприятий и определении средств специфической профилактики иммунобиологическая реактивность организма птиц не принималась во внимание в связи с отсутствием доступных методов контроля (Колабская Л.С. и др., 1933; Пигаревский В.К. и др., 1980).

Одним из способов оценки состояния неспецифической резистентности является метод количественного определения иммуноглобулинов (Федоров Ю.Н., 1965; Колабская -<1.С. и др., 1907; Конопатов Ю.В., 1991). Основным компоненте!.! им.чун^химических реакций для количественного определения иммуноглобулинов в сыворотке крови птиц являются моноспецифические сыворотки к иммуноглобулинам. Особого внимания заслуживают моноспецифические сыворотки к 1оС-. как основному классу иммуноглобулинов кур. Отечественная биологическая промышленность в настоящее время не производит моноспецифические сыворотки к отдельным классам иммуноглобулинов птиц.

Отсутствие единой техники исследования и стандартных моноспецифических сывороток приводит' к получению Несопоставимых результатов при их использовании различи;-ми исследователями (Еилик В.В,, 19Ь7; Голубни'шй Б.Ц,, 19ЬЗ; ¡..к. <4 ш ., 1 ую).

Наличие моноспецифических сывороток и методов количественного определения классов иммуноглобулинов позволит изучить особенности

иммунологических реакций при различных инфекциях и осуществить контроль за.состоянием защитных систем организма птиц при проведении вакцинации, а также при отбора птиц для биологических исследований и воспроизводства.

Получение стандартных моноспецис£ических сывороток, обладающих высокой активностью и специфичностью, является условием для их применения в промышленном птицеводстве.

Цель и задачи работы: Целью настоящих исследований являлось получение )лоноспеци$ических сывороток к 1^0- кур и их использование для контроля уровня иммуноглобулина С птиц при проведении профилактических мероприятий в промышленном птицеводстве.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить 1с£г из сыворотки крови кур и определить его физико-химические показатели.

2.- Получить моноспецифические сыворотки к 1с|р- кур.

3. Изучить физико-химические, иммунохимические, специфические свойства моноспецифических сывороток к кур.

4. Разработать экспресс-метод определения количественного содержания в сыворотке крови кур с использованием моноспецифических сывороток.

5. Изучить особенности изменений 1<^£> сыворотки крови интакт-ных кур и при экспериментальном заражении возбудителями вирусных, бактериальных и протозойнцх заболеваний.

6. Провести контроль уровня 1ср в сыворотке 'крови кур при проведении ветеринарно-санитарных мероприятий в условиях промышленного птицеводства.

7. Разработать нормативно-техническую документацию на получение моноспецифшеских сывороток к Хс^О- кур,

Осношшо положения, выносимне на защиту;

I. Получение монойпецифических сывороток к кур: выделение из сыворотки крови кур иммунохимически гомогенного иммунизация животных, позволяющая получить стандартные,, активные, . високоспецис^ичные сыворотки..'

. 2. Использование моноспеци^ических сывороток к кур для контроля уровня неспеци^ической.резистентности птиц в условиях промышленного птицеводства.

Научная новизна. Используя сочетание методов (осаждение нейтральными солями, ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию) получен 1оС кур, иммунохимически однородн..й, характеризующийся , коэффициентом седиментации 6,9-7,2 3 и молекулярной массой 160000-170000 Д.

Впервые в нашей стране разработаны и биофабрично выпущены наборы сывороток и наборы радкально-иммунодиф^уэионкых кассет, предназначенные для количественного определения кур.

Впервые проведено количественное определение уровня сыворотки крови кур в эксперименте при бактериальных (пуллороз, ' колибактериоз), протозойных (кокцидиоз), вирусных инфекциях (инфекционная бурсальная болезнь) и при проведении плановых, вакцинаций в птицехозяйствах.

Контроль уровня 1о& в сыворотке крови кур при проведении ветеринарно-санитарных мероприятий в условиях птицефабрик позволил провести научно обоснованное применение биологически активных препаратов для коррекции иммунной системы организма птиц.

Практическая ценность. На основании проведенных исследований разработана нормативно-технически документация "Набор сывороток для количественного определения 1ой кур, гусей, уток и индеек":

1. Технические условия (ТУ 10-07-262-91),

2. Инструкция по изготовлению и контролю,

3. Наставление по применению,

утвержденное ГУВ Госагропрома СССР 12 Л1.91, и нормативно-техническая документация "Набор радиольно-иимунодиффуэионных кассет для количественного определения IоС- кур, гусей, уток и индеек":

1. Технические условия (ТУ Ю-07-263-91),

2. Инструкция по изготовлению и контролю,

3. Наставление по применению,

утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 12,11.91. Главным Управлением ветеринарии издан приказ № 72 от 17.12.91. о внедрении наборов сывороток и радиально-иммунодиффузионных кассет в практику промышленного птицеводства.

Результаты исследований используются на курсах усовершенствования ветеринарных врачей во Всероссийском НИВ-! птицеводства при изучении влияния биологически активных препаратов на иммунный статус организма птиц.

Результаты исследований используются для контроля уровня неспецифической резистентности в процессе выращивания птицы в условиях птицефабрик.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Система мер по обеспечению эпизоотологического благополучия и рентабельности птицеводческих мероприятий" (Ленинград, 1965), на Всесоюзной конференции "Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеаодстве - резерв повышения эффективности производства" (Ленинград, 1989) на конференции молодых ученых и специалистов "Ветеринарные проблемы птицеводства" (Ленинград, 1990), на Методическом и Ученом Советах Всероссийского НИВИ птицеводства (1966-1990 г.г.).

Цублнкации. Основные положения диссертации опубликованы в 6 научных работах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 161 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 13 таблицами. Список литературы включает 214 источников литературы, в том числе 102-иностранных авторов,

I. МАТЬБШШ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования. В работе было использовано ИЗО линейных цыплят кросса "Бройлер-6" и "Заря-17" различного возраста^ 20 кроликов породы "Шиншилла" массой 2,0-2,5 кг,.5 баранов, содержащихся в условиях вивария ВШВИП и цыплята кросса "Заря-17" содержащиеся в условиях птицефабрик Ленинградской и Московской областей. • . .

Сыворотку крови для фракционирования 1ср получали от цыплят разного возраста, доставленных из птицехозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям.

Иммунизацию кроликов и баранов проводили очищенным Дс^, К-глобулином и сывороткой крови кур.

Определение количественного содержания 1аО- в сыворотке крОви цыплят мясного и яичного направления проводили на модели экспериментального колибактериоза, пуллороза и кокцидиоза, вакцинации против ньюкасдской болезни, болезни Марека, при заражении вирусом инфдкционной бурсалЬной болезни.

Заражение Escherichia coli штамм "Bg" (эпизоотический) проводили в суточном возрасте подкожно в дозе la^q ¡Salmonella gallina run pullorun - в 3-суточном возрасте внутримышечно в дозе ьДзд, Eimeria tenella - в Ю-суточном возрасте перорально в дозе ьДзд. Наблюдения продолжали 50 суток, пробы крови исслбдовали на 1,3, 5, 10, 30, 50 сутки.

Экспериментальное заражение 35-дневных цыплят проводили вирусом инфекционной бурсальной болезни (ИББ) штамм "52/70" интрана-зально в дозе 100 Щ^^/т в объеме 0,2 мл. Наблюдение продолжали '30 суток. Пробы крови исследовали на I, 2, 3, 5, 30 сутки после заражения.

Против болезни Марека вакцинировали цыплят в суточном возрасте жидкой вакциной герпес-вируса индеек (ГБИ) штамма "ФС-126" внутримышечно в дозе 2000 ФОЕ на цыпленка. Наблюдение продолжали 120 суток, пробы крови исследовали на I, 8, 20, 120 сутки.

. Аэрозольную вакцинацию цыплят против ньюкаслской болезни проводили вакциной из штамма "Ла-Сота" в Дозе ВД50 в суточном и 20-су-точном возрасте. Наблюдения продолжали 41 сутки, сыворотки крови исследовали на I, 7,. 20, 41 сутки.

Метода. Для фракционирования иммуноглобулинов использовали различные методы: осаждение сернокислым натрием, осаждение сернокислым аммонием, риваноловый метод (Губенко Т.Л. и др., 196! з; ukva-rll et al., 1965 ) ионообменную хроматографию на Д!АЕ-целлюлозе, гель-фильтрацию на сефадексе G-200 (Детерман Г., 1970; Киселев И.А. и др., 1983).

Степень очистки Ic^G контролировали с помощью аналитического диск-электрофореза (Davis В., 1964 ) и иммуноэлектрофореза (AXelsen ,1977) .

Коэффициент седиментации иммуноглобулина класса G определяли аналитическим ультрацентрифугированием на ультрацентрифуге spinco-E, молекулярную массу - электрофорезом в полиакриламиднсм геле (ьаешп-li ü.,1970). •

Концентрацию белка определяли по метода'' Лоури (1951) и мик-'робиуретовым методом по Дк.Бейли (1967),. кроме того,оценивали по оптической плотности при длине волны 280 нм.

С целью получения антиспвороток иммунизацию кроликов и бараков (овец) проводили по двум схемам: подкожная иммунизлция в

область живота (Колабская Л.С., Шорникова Л.Л., 1978, 1984) и в подколенный лимфоузел.

Количественное содержание IcjG- в сыворотках крови кур определяли по методу Манчини и др. (1965) в модификации Колабской Л.С. и др. (1984).

Количественную оценку внутриклеточного содержания лиэосо-мально-катионных белков проводили по методу Пигаревского В.Е, (1980) и по формуле Aataldy и Verga (1957).

Уровень неспецифической резистентности определяли согласно Методическим рекомендациям Колабской Л.С. и др. (1987)..

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием методов вариационной статистики, корреляционного анализа и критерия согласия X** (Рокицкий П.С., 1967).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Получение из сыворотки крови кур в экспериментальных условиях и его физико-химическая характеристика

Получение иммуноглобулинов осуществляли из сыворотки крови клинически здоровых кур в несколько этапов. Вначале выделяли ¿f-глобулиновую фракцию путем осаждения сульфатом натрия, сульфатом аммония или риванолом. Наиболее перспективным является применение .сернокислого натрия, так как этот метод прост и дает наименьшие потери антител. Кроме того, при охлаждении растворов, содержащих сернокислый натрий, большая его часть кристаллизуется и выпадает в осадок, что облегчает дальнейший диализ.

Далее ¿ -глобулиновую фракцию подвергали ионообменной хроматографии на ДЕЛЕ-целлюлозе. Белки элюировали последовательно 0,02-0,04М фосфатными буферными растворами рН 8,0. Локализацию белковых пиков определяли по оптической плотности элюата при длине волны X =280 нм. Гомогенный IcjG- выходил во втором пике. Смесь 1с|С и IcjA, полученную в третьем пике подвергали гель-хроматографии на софадексе G-200. Дня элюции использовали трис-НС£ буферный раствор рН 8,0.

Критерием чистоты IcjG служили результаты иммуноэлектрофореза и электрофореза в полкакриламидном геле. Коэффициент седиментации элентрофоретически .-гомогенного IqG-при определении аналитическим ультрацентрифугированиеы составил 6,9-7,2 ед.Í, молекулярная масса' - I60000-I70000 Д.

2.2. Получение антисывороток

Моноспецифические сыворотки к IqC- кур и антисыворотки к белкам сыворотки крови кур (А1(С) получали путем иммунизации кроликов и баранов подкожно в область живота и в подколенный лимфоузел. В качестве стимулятора иммуногенеза использовали полный адъювант Фрейнда (ПАФ), который при подкожной иммунизации вводили однократ-йо перед введением антигена, а при иммунизации в подколенный лимфоузел - в смеси с антигеном.

Активность полученных антисывороток определяли в реакции диффузионной преципитации в агаровом геле. AKÖ удовлетворяла требованиям активности, если ее титр был не ниже 1:256.

Идентификацию полученных антисывороток проводили методом иммуноэлектрофореза. АКС образовывала с контрольной сывороткой крови кур более 6 линий преципитации, характерных для белков сыворотки крови кур.

Опытным путем установлено, что пригодными для иммунохимиче-ских исследований являлись' те моноспецифические сыворотки, которые имели в реакции преципитации титр не ниже 1:16 и были моноспецифичны, то есть в иммуноэлектрофорезе с контрольной сывороткой крови кур образовывали одну линию преципитации, соответствующую iqg- кур.

г

2.3. Влияние длительного хранения на активность антисывороток и способы их стабилизации

Одним из способов консервирования антисывороток являлось замораживание. Хранение АКС с титром антител 1:512-1:2048 при температуре - 14-20° позволяло их использовать в течение 10 лет, моноспецифических сывороток с титром 1:32-1:64 - в течение 5 лет. Однако титр преципитируящих антител снижался на 2-3 1о^>.

Добавление в антисыворотки азида натрия в конечной концентрации 1:10000 не снижало их преципитирущую активность в течение года и не изменяло иммунохимическую специфичность. *

Использование нового консервирующего вещества - метацида 5 конечной концентрации 0,005 f. обеспечивало стерильность антисывороток в течение 12 месяцев и способствовало стабильности титрл лрецинитирующих антител.

Наиболее удобным способом сохранения активности и специфичности антисывороток являлось лиобильное высушивание. Этот способ был предложен нами при промышленном изготовлении наборов ыоноспе-Ф1<£ических сывороток к 1с£>- кур.

2.4. Разработка промышленной технологии изготовления .моноспецифических сывороток- к кур, нормативно-технические требования к препарату и.метод количественного определения

К моноспсцифической сыворотке предъявляются два основных требовшия: она должна содержать достаточную концентрацию специфических антител (титр на ниже 1:16) и не должна содержать гетерогенных антител, способных обусловить неспецифическую реакцию»

Для промышленного получения антисывороток использовали в качества продуцентов баранов (овец) и схему подкожной иммунизации в область кивота. От I барана за период от 7 до 21дня получали 2 литра сыворотки, используя при этом плазмозамещаощие растворы. Полученная при этом антисыворотка отвечала всем нормативно-техническим требованиям.

Разработанный способ получения моноспецифических сывороток к 1рр кур освоен на Покровском заводе биопрепаратов. Опитно-про-мышленная партия представляет собой набор сывороток для количественного определения 1о& в сыворотке крови кур. Набор состоит из 6 ампул моноспецифической сыворотки к 1с(С кур и 2 ампул контрольной сыворотки крови кур. Сыворотка находится В ампулах в ' виде лиофильно высушенной, светло-коричневой массы. Моноспецифическая сыворотка к кур не имеет посторонней примеси, растворяется в 2 мл дистиллированной воды в течение 2-5 мин, имеет титр специфических антител не ниже 1:16 и образует одну линию преципитации, соответствующую в контрольной сыворотке крови кур.

Количество 1с]С- в сыворотке крови кур определяли в реакции иммунодиффузионной преципитации с.ионоспецифическими сыворотками к 1ср кур на стеклянных, пластинах с использованием 2 $-иого агара

Для упрощения количественного, определения. 1<}С-сыворотки крови кур нами был разработан окспресс-метод с использованием раднально-иммунодиффузиониых кассет (РНК). В<К представляют собой круглые контейнеры из полистирола, закрытые крышкой. В кассеты внесена смесь агара с моноспецифической сывороткой. Каждая кассета имеет. 12_ пронумерованных лунок. Для постанови реакция радиальной нммунбдкффуэии достаточно гнести в лунки исследуемую сыворотку,

закрыть крышкой и оставить на 24 часа при комнатной температуре для образования колец преципитации. Затем измерить диаметр колец преципитации и по калибровочной кривой, прилагаемой в "Наставлении по применению", определить концентрацию 1с|& в исследуемых сыворотках. Наборы РИК были изготовлены на Покровском заводе биопрепаратов.

2.5, Определение количественного содержания 1оС ь сыворотке крови клинически здоровых кур, при экспериментальном заражении и при вакцинации

Средние данные о содержании. в сыворотка крови клинически здоровых птиц кросса "Заря-17* представлены' в табл,1.

Таблица I

Показатели уровня 1ср- в сыворотке крови клинически . здоровых цыплят и кур кросса "Заря-17" в возрастном . аспекте л.*=35)

Возраст Содержание 1а6, Возраст Содержание

птиць^дн мг/мя птицы ;дн ,'лг/мл

I 5,10 ± 0,40 90 6,20 ± 0,20

5 4,50 ± 0,30 150 7,30 ± 0,10

10 2,70 ± 0,10 200 8,60 ± 0,40

20 2,'60 ± 0,10 250 6,30 ± 0,10

30 . 3,70 ± 0,20 300 4,90 - 0,60

60 5,50 ± 0,30 400 4,60 ± 0,10

Уровень 1ср в сыворотке крови цыплят Ю-30-днёвного возраста значительно ниже, чем у Цыплят суточного и 60-150-дасвного возраста. Максимальный уровень регистрировался у кур к началу яйцекладки (150 да), сохранялся З-б месяцев, а затем снижался.

Анализ Показателей.количественного, содержания в сыворотке крози цыплят при зксперйнонтальйом заражении возбудителями бактериальных и протозойных инфекций показал, что уровень как правило, резко снижен в острый период заболевания (на 27,6-45,3 %) по сравнению с таковым у клинически здоровых цыплят тех же возрастных групп (табл.2). Затем уровень ¡^(»увеличивался и в |5 дней был вше, чем у контрольных цыплят на 39,8 %. У выз-

доровевших цыплят уровень в 2-3 раза превышал таковой в сыворотке крови неинфициро ванных цыплят того же возраста, а в отдаленный период (30 суток) не отличался от уровня у контрольных птиц.

Таблица 2

Показатели в сыворотке крови цыплят при экспериментальном'заражении возбудителями некоторых бактериальных и протоэойных инфекций в острый период

п=10

Заболевание -Возбудитель Содерт.аше_ЦО,_мг/^л

ОПЫТ контроль

Колибактериоз ЕасЬег1оЬ1а М 1,86х 3,40

сои ±т 0,27 0,41

Пуллороз ЗаХшопеИа еа1- М 1,20х 1,70

Ипагит ри11огига +т 0,10 0,20

Кокцидиоз Б1тег1о М 2,10х 2,90

1;ошз11а ±ш 0,11 0,01

Примечание: Р* - степень достоверности указана относительно контроля (Р ¿0,05).

При экспериментальном заражении цыплят 35-дневного возраста вирусом инфекционной бурсальной болезни (ИББ) было выявлено увеличение содержания 1о& через 2 часа после заражения. Уровень 1с|Сг в сыворотке крови зараженных цыплят повышался на 23,4 % и составлял 3,58*0,14 мг/мл по сравнению с сывороткой крови цыплят контрольной группы (2,90±0,10 мг/мл), и через 30 суток был выше на 37,27 % (6,04±0,20 мг/мл).

Известно, что вирусные заболевания отличаются тяжелым течением, высокой летальностью поголовья и наносят большой экономический ущерб. Наиболее надежным на сегодняшний день способом профилактики этих заболеваний является вакцинация. В связи с чем необходимо было изучить динамику изменения уровня 1р&- в сыворотке крови кур при применении вакцин.

Количественные изменения как при вакцинации цыплят против ньюкаслсксй болезни, так и при болезни Марека характеризовались снижением уровня на 7-6 день после вседения антигена и повыше-, нием его на 19-20 день. Однако у цыплят опытных групп количество

1(^3 било соответственно на 8,1-44,4 % (1,98*0,30-2,60*0,10 мг/мл) выше, чем у цыплят контрольных групп (1,82-0,30 мг/мл), и оставалось вше на протяжении всего срока наблюдения.

2.6. Испытание объективности моноспецифических сывороток к кур и радиально-йммунодиффузионних кассет в промышленном птицеводстве

Исследования показали прямую зависимость между снижением уровня резистентности и увеличением летальности птицы от заболеваний и поствакцинальных осложнений. Особенно восприимчивы для различного рода инфекций были цыплята в возрасте до 10 дней. Из общего количества павших цыплят отого возраста около 60 % имели сравнительно низкий уровень - 0,60*0,03¿мг/мл и лизосомально-катионных белков (ЛКБ) - 0,90*0,5 ед. Исследования цыплят одного возраста, но содержащихся в разных птичниках, за 2 дня до вакцинации против инфекционного ларинготрахеита показали различный уровень неспецифической резистентности (табл.3). Летальность цыплят за 10 дней до вакцинации во всех группах колебалась от 134 до 226 голов. После проведения аэрозольной вакцинации летальность птиц отмечалась, как правило, на 8-14 день и продолжалась ' в течение 8-10 дней. Количество павшей птицы в этот период времени коррелировало с показателями неспецифической резистентности.

При обследовании птицефабрик было установлено, что летальность цыплят от болезни Марека в возрасте 100-120 дней составляла 4 % от общего количества павшей птицы. Причем, в разных птичниках летальность била различной и коррелировала с уровнем резистентности цыплят в возрасте до 30 дней. В тех птичниках, где у цыплят уровень неспецифнческой резистентности был близок к таковому интакт-НОЙ птицы (1^ 2,40*0,02-3,90*0,02 мг/мл; ЛКБ 1,35*0,01-1,71*0,0,1 ед), отход от болезни Марйна бил Минимальным - 1,53-3,4 %. У цып.-лят с повышенннм содержанием 1о& на 65,38-88,46 % (4,30*0,05 - ; 4,90*0,01 мг/мл) и ЛКБ - на 17-40 % (1,52*0,03-1,82*0,05 ед) отход от болезни Марека составлял 14,2-21,69 %.

Применение аминокислотных препаратов цыплятам с пониженной резистентностью способствовало нормализации показателей неспецифической резистентности И увеличению сохранности птицепоголовья (табл.4).

Таблица 3

Показатели неслецифической резистентности и летальности .цыплят от поства'кцинальнмх осложнений после аэрозольной вакцинации против инфекционного ларинготрахеита Ш±и ; п=20)

№ группы показатели резистентности Летальность

мг/мл ЖБ, ед, кол-во голов %

1 2,10*0,10* . 1,07±0,22 3275 . » 10

2 2,10*0,10х 1,75*0,20 , 1551 5

3 2,5040,0.1 . 2,20*0,20х 686 2,1

4 2»50*0,01 2,60*0,10* 288 0,8

5 2,50*0,10 . 1,60*0,21 -

Примечание:'группа 6 5 - контрольная группа

Рх

степень достоверности указана относительно контрольной группы (Р 0,05).

Таблица 4

Влияние аминокислотного препарата на резистентность 90-дневны:с цыплят крооса "Заря-17" и их сохранность в ГППЭ "Нагорный" 1М*т ; п-20)

Содержание Название группы Поголовье Показатели резистентности !(}&, мг/мл ЖБ, ед. Сохранность,/»

Напольное Опыт 40020 0,80*0,04 2,12*0,05 93,57

Контроль' 24300 . '7,30*0,09 1,97*0,04 95,60

Клеточное Опит 48030 9,90*0,03 2,04*0,09 97,10

Контроль ССООС. ¡3,90*0,09 1,75*0,03 96,35

ВЫВОДЫ;

1. Получен иммунохимически гомогенный из сыворотки

крови-кур путем осаждения сернокислым натрием с последующей ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе и гель-фильтрации на сефадексе С-200.

2. Получены моноспецифические сыворотки к Гс^С- кур для применения в реакции радиальной йммунодиффуэии с титром преципити-рующих антител 1:16-1:64, высокой специфичностью и стандартностью.

3. Стандартность моноспецифических сывороток к 1ср кур при хранении в течение I года обеспечивалась применением консерванта азида натрия в конечной концентрации 1:10000' и метацида в концентрации 0,00о /', при лиофильном высушивании - 2 года, при замораживании (-14-20 °С) - в течение 5 лет.

4. Для упрощения постановки реакции радиальной иммунодиффузии и создания экспресс-метода разработаны.радиально-иммунодиффузионные кассеты, позволяющие, обеспечить стандартизацию исследований и

не требующие дополнительного оборудования.

5. Изучена динамика изменения содержания кур при некоторых экспериментальных бактериальных, протоэойных и вирусных инфекциях (колибактериоз, пуллороз, кокцидиоз, инфекционная бур-сальная болезнь). Установлено, что уровень 1^3- резко снижен (на 27,6-45,3 %) в острый период бактериальных и протозойных заболеваний по сравнению с клинически здоровыми цыплятами тех же возрастных групп. В сыворотке крови цыплят в период выздоровления уровень

в 2-3 раза выше, чем в сыворотке неинфицированных цыплят, У экспериментально зараженных вирусом инфекционной бурсальной болезни 35-дневных цыплят уровень на 23,4 % был выше через 2 часа после заражения и даже через 30 суток оставался на 37",27 % выше, чем у цыплят контрольной груяпь).

6. При вакцинации цыплят против болезни Марека и ньюкаслокой болезни установлено снижение уровня Iс^С- на 7-8 сутки. Повышение уровня наблюдалось на 19-20 сутки. На всем протяжении наблюдения (41-120 дней) уровень 1с|б- вакцинированных цыплят был выше.

7. Выявлена корреляция между снижением показателей неспецифической резистентности и поствакцимальными осложнениями у цмплят при вкручивании в условиях промышленного птицеводства. При снижении

у 30-дневных цыплят уровня Iс^р- на 16 $ и лизосомально-катионных белков на 33,13 % летальность цыплят от поствакцинальных осложнений после аэрозольной вакцинации против инфекционного ларинготрахеита увеличилась с 0,8 до 10 %.

8. Использование моноспецифических сывороток к кур для контроля уровня неспецифической резистентности организма птиц ' экономически оправдано.

На основании проведенных исследований била разработана норма-. тивно-техническая документация (ТУ 10-07-262-91 и ТУ 10-07-263-91) на наборы сывороток и радиально-иммунодиффузионных кассет для количественного определения 1с|& кур и издан приказ о внедрении данных наборов в"практику промышленного птицеводства. ■

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

I. Предложен метод выделения иммуноглобулина б кур. Гомогенный препарат 1^0-может быть использован для:

а) получения моноспецифических сывороток;

б) построения калибровочной кривой с целью количественного определения содержания в сыворотке крови кур.

■ 2. Предложен технологичный метод получения мсноспецифических сывороток к кур и их стандартизация. Изготовление антисывороток может быть осуществлено в условиях биофабрик и производственных лабораторий для получения диагностических наборов сывороток и радиально-иммунсдиффузионных кассет (ШК). Эти диагностические наборы'рекомендуется использовать для:

а) количественного определения в сыворотке крови кур методом радиальной иммунодиффузии;

б) проведения количественного к качественного иммуноолектро-фореза и реакции преципитации для идентификации белковых фракций.

3, Рекомендуется проводить на птицефабриках определение уровня как одного из показателей неспецифической резистентности для •

правильного планирования проводимых вакцинаций и ветеринарно-сани-тарных мероприятий, а так же во избежании увеличения падежа птицы от поствакцинальных осложнений.

4. На основании проведенных исследований разработана нормативно-техническая документация на:

а) "Набор сывороток для количественного определения 1(^(5- кур, гусей, уток и индеек": Технические условия (ТУ 10-07-262-91),

Инструкция по тгстоБлешы и ¡;.лггрол,и, Наставление по применении, утвержденные ГУБ Госагропрома (-0С-Р 12.II.91.;

б) "Набор радиально-ишунодиффу.эионних кассет дня количественного (.лределения кур, гусей, уток и индеек": Технические услошм (ТУ Ю-07-2оЗ-91), Инструкция по изготовление и контроле, Наставление по применении, утворздениое ГУВ Госагропрска ССОР 12.11.92.

ОЫССК РАБОТ, ЛО ¡ШШАШ

^ 1РТу и^'а'1

1. Горецкая Т.Н., Амдий й.Л. Получение кк^цоглобулкиов для изготовления «рнтроцитарних препара?ов//Систе.ка ьврсприятиЯ по обеспечению эпизоотического благополучия и рентабельности птицеводческих предприятий: Тез.докл.н.-произв.кон^., ВНИБШ, -Ломоносов, 1983. - С.69-70.

2. Колабская Л,С., Горецкая Т.И., 11орнш:ова Л.Л. Получение

и применение моноспецифических1сивороток//Лередоьой научно-производственный оных в птицеводстве, ЕНИиТЛЛ -.Загорск, 19Ь7. -С.25-2о.

3. Горецкая Т.П., Колабекая Л.П., иоршкиьа Л.л. Резистентность птиц при вакцинации в прсьн пленной птицев?дстве//Хокплекс-ная система пстпр.шарних мероприятий в лтицеводстге - резерв иов .зешш о.^ектиеиссти пролзродства: Тез.докл.Есес.н.-произв. :-;он^., ЬпЖгЦ - Л., 1989. - С. 93-95.

4. Кслабская Л.С., Горецкая Т.Н., Иванова Н.В. ¡¡изкоыоле-куляршдс пептида в устойчивости организма к заболев'Шия.м//Сев~ ремеккье иройлеш ишунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерш; г> еетеринарноП медицине: Тез.докл.Всес.н.-технич.кенф.-М., 1990. - С.96-97.

о. Горецкая Т.Н., Колабс.кая Л.С., Иванова Н.В. Поколение резистентности кур с помощью и^1унсс1Ч1мучятора//Ее1ер;:иарш.е проблемы птицеводства: Тез.д конф.молодых ученых и специалистов -Л., 1990 - С.Ь0-Ь2.

6. Колабскал Л.С., Горецкая Т.Н., Кузина Т.Б. Иммунный статус организма птиц в промышленном птицеводстве.//Сб.на.,4. тр.ВпИБ1Ц/ оффективние средства, метода диагностики и профилактики болезнен птиц в пропиленном птицеводстве. - Л., 1991 - С. 112-123.