Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение бактериального суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы C(RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение бактериального суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы C(RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА и ЮА ОВЧИННИКОВА

На правахрукописи

ЖЕЛЯБОВСКАЯ Ольга Борисовна

Получение бактериального суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы С (КАСК1) с помощью генетической селекции сайта инициации

трансляции.

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2004

Работа выполнена в Институте Биоорганической Химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Ю.А. Берлин

кандидат биологических наук К.Р. Бирих

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

С.В.Машко

кандидат биологических наук Л.И. Патрушев

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгелыгардта РАН

Зашита состоится 9 июня 2004 г.

На заседании специализированного совета Д 002.3S.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

В. А. Несмеянов

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы.

Совершенствование методологии рекомбинантных ДНК поразительно, расширило возможности направленного биосинтеза белка. Среди различных систем экспрессии генетических, детерминант важное место занимают прокариотические системы. Бактериальные суперпродуценты позволяют получать значительные количества высокоочищенных рекомбинантных белков для использования в медико-биологических и сельскохозяйственных целях.

Для экспрессии в бактериальной системе безинронный ген (кДНК) клонируют в плазмидный вектор, содержащий структурные элементы, необходимые, для- его транскрипции и трансляции. При этом наименее предсказуемым этапом в синтезе рекомбинантного белка является трансляция, особенно ее инициация. Эффективность трансляции существенно зависит от структуры кодирующей части гена, которая в большой степени определяет вторичную структуру участка связывания рибосом, поэтому выход белка в одной и той же системе экспрессии может сильно варьировать от гена к гену. Так что разработка новых подходов к оптимизации трансляции чужеродных генов в Е.еоИ является важным направлением современных молекулярно-биологических исследований.

Цель работы.

Целью работы было создание системы искусственного отбора для оптимизации экспрессии чужеродных генов в Е. coli и получение на этой основе суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1).

Научная новизна и практическая ценность работы.

Несмотря на то, что о молекулярной природе детерминантов трансляции известно многое, эффективность сайта инициации трансляции в сочетании с тем или иным геном практически непредсказуема. Многочисленные попытки создания униресального вектора равнопригодного для любого гена не увенчались успехом, поэтому получение суперпродуцентов нехимерных чужеродных белков обычно полагается на метод проб и ошибок. В предлагаемом исследовании мы вывели этот метод на качественно новый уровень с чрезвычайно высокой пропускной способностью. В созданной нами генетической системе проверка эффективности сайтов инициации трансляции из пула

] РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ | I БИБЛИОТЕКА I

| СПстср'

3 * 03 JOB'

рандомизованных последовательностей для экспрессии целевого гена проводится самим микроорганизмом на уровне выживания на селективной среде.

Такая искусственная селекция достигается в результате того, что трансляция целевого гена сопряжена с трансляцией дополнительного селективного маркера, являющегося вторым цистроном. Таким образом, впервые разработана система генетической селекции позволяющая адаптировать сайт инициации трансляции к конкретному гену для его наиболее эффективной экспрессии в E.coli.

Эта система была успешно использована для получения суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1) человека

Отобранный сайт инициации трансляции длиной в 15 п.н. обеспечивал эффективную экспрессию RACK1 с выходом рекомбинантного белка более 30% клеточного белка.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы • были представлены на конференциях: «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001), а также на XV и XVI зимних международных молодежных научных школах «Перспективныенаправления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003,2004).

Публикации.

Материал, представленный в диссертации, опубликован в одной статье в международном реферируемом журнале.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 114 страницах, включая 37 рисунка, содержит три главы - обзор литературы, посвященный рекомбинантным белкам, как инструменту для изучения внутриклеточной сигнализации (на примере белка RACK1), обсуждение полученных результатов, описание материалов и методов, использованных в работе, а также список цитируемой литературы (163 ссылки).

Содержание работы.

1. Принцип и дизайн системы генетической селекции.

В данной работе мы ставили своей задачей создать такую генетическую систему, которая позволяла бы из пула плазмид с рандомизованным сайтом инициации трансляции отбирать клоны эффективно экспрессирующис целевой белок. Любой комбинаторный эксперимент состоит из двух этапов - рандомизация и отбор. Рандомизация представляет собой введение в оптимизируемый сайт (в нашем случае сайт инициации трансляции) множества разнообразных последовательностей (рандомизованного фрагмента) и создания таким образом пула для селекции. Отбор нужных последовательностей должен происходить по принципу - чем эффективнее экспрессия целевого белка, тем выше выживаемость бактерии.

Такую систему отбора несложно себе представить, если целевым белком является фактор устойчивости к антибиотику или другой необходимый клетке белок.

Однако чужеродный ген не только не является необходимым для бактерии, но скорее наоборот. И все же экспрессия чужеродного гена может являтся необходимой если она регулирует экспрессию другого, нужного гена. Такая регуляция может осуществляться в условиях сопряженной- трансляции. Этот механизм широко распространен у микроорганизмов и их паразитов для координированной экспрессии соседних генов.

Наиболее частовстречающейся разновидностью такой регуляции является сопряжение за счет вторичной структуры РНК. В этом случае сайт инициации трансляции дистального гена скрыт вторичной структурой транскрипта, которая разрушается рибосомой во время трансляции проксимального гена, обеспечивая инициацию трансляции второго гена. Однако, такой принцип малопригоден для нашей искусственной системы, так как вторичная структура РНК плохо предсказуема и, кроме того, для каждого нового целевого гена необходимо было бы создавать свой сайт сопряжения трансляции.

Альтернативная система сопряжения, обнаруженная, например, в случае сопряжения трансляции белков оболочки и лизиса бактериофага MS2 (Adhin & van Duin, 1990), использует принцип доставки рибосом, и гораздо лучше подходит для нашей системы. При этом дистальный ген (в нашей системе это будет ген устойчивости к антибиотику) снабжен слабым сайтом связывания рибосомой, который не способен самостоятельно инициировать трансляцию этого гена. Однако в процессе экспрессии проксимального гена (в нашей системе - целевой ген) терминирующие рибосомы

доставляются в сайт инициации трансляции второго цистрона, где реинициируют трансляцию обеспечивая невысокий уровень экспрессии дистального гена. В такой системе целевой ген будет сопряжен с геном устойчивости к антибиотику, причем экспрессия последнего будет зависеть от суперэкспрессии целевого гена (рис.1). Такая система имеет два преимущества: 1) эффективность реинициации трансляции второго цистрона не зависит от первичной последовательности первого цистрона, то есть такой подход может использоваться для любого чужеродного гена в качестве первого цистрона; 2) эффективность инициации трансляции второго цистрона значительно снижена по сравнению с первым цистроном, что должно обеспечивать ограниченную экспрессию селективного маркера при суперэкспрессии целевого гена.

Кроме маркера устойчивости к антибиотику, помещенного в сопряженную систему трансляции, в плазмиде, конечно, должен присутствовать еще один независимый маркер для клонирования конструкции (селективный маркер 1).

Исходно мы рассматривали две стратегии проведения генетической селекции. Первая стратегия подразумевала введение рандомизованного фрагмента в одноцистронную конструкцию, содержащую только ген устойчивости к тетрациклину и проведение первого раунда селекции,. который, как мы предполагали, приведет к промежуточному плазмидному пулу, способному обеспечивать инициацию трансляции. В этот пул мы предполагали клонировать целевой ген и далее отбирать наиболее эффективные продуценты либо с помощью второго раунда селекции на тетрациклине (уже в двуцистронной конструкции) либо анализом отдельных клонов электрофорезом белков. Иными словами, мы проводим отбор сайта инициации трансляции целевого гена не из полностью случайной последовательности, а из набора компетентных последовательностей. Эта стратегия привлекательна тем, что для каждого нового целевого гена не нужно снова проводить рандомизацию, а можно воспользоваться имеющимся промежуточным плазмидным пулом.

Вторая стратегия предполагала клонирование двуцистронной конструкции с целевым геном, а затем уже введение рандомизованного фрагмента и селекцию сайта инициации трансляции из полностью случайного пула. Преимуществом этого пути является то, что селекция с самого начала ведется под целевой ген, что увеличивает вероятность выбора наилучшего сайта.

— ^

С Рандомизация) Pff^ RBS ^

елевой ген

0оря*ени

-.»vi

Селективным маркер 2

(ТеГ8)

Селективный маркер 1 (Аргм)

Рис. 1. Селективная система для оптимизации трансляции.

2. Конструирование в клонирование синтетического фрагмента COTR в плазмидном

векторе pGEMl.

Наша система искусственного отбора эффективных сайтов инициации трансляции разработана на основе плазмидного вектора экспрессии pGEMl [Promega], имеющего в своем составе Т7 промотор и ген устойчивости к ампициллину, который будет служить независимым селективным маркером. Для того чтобы сконструировать вектор для клонирования целевого гена и проведения селекции, мы клонировали в плазмиду pGEMl синтетический линкер, содержащий структурные предпосылки для сборки всей системы. Этот линкер включает сайт сопряжения трансляции целевого чужеродного гена с геном устойчивости к тетрациклину (между сайтами Крп\ -М/еТ), позаимствованный из системы регуляции экспрессии белков оболочки и лизиса бактериофага MS2, а также сайты рестрикции для клонирования целевого гена, гена устойчивости к тетрациклину и введения рандомизированного фрагмента в область инициации трансляции целевого гена. Мы также ввели в состав линкера энхансер трансляции (Lehmeier & Amann, 1992; O'Connor and Dahlberg, 2001; рис. 2).

Рис.2. Синтетический линкер СОТЯ.

Этот линкер был сконструирован из четырех частично перекрывающихся олигонуклеотидов (рис. 3).

Ъ' -аетТААСТТТЛССАТААСАОТЕ-Э' 5' -ТА<КТ»ССТТТААААСТ0СТААСС-3'

3> -ТТСТСАССТАТТОТАТАСАТССЛТО-5' 3' -ССАТТОСеГИЛСМССИССТСТС-Ь'

Рис. 3. Синтетические олигонуклеотиды для конструирования дуплекса СОТЯ.

Так как перекрывание олигонуклеотидов составляло всего 7 и.о., для сборки дуплекса СОТЯ использовали комбинацию достроек фрагментом Кленова и ПЦР (рис.4). Сначала отожгли олигонуклеотиды СОТШ с СОТК2, а СОТЯ3 с СОТЯ4 и достроили фрагментом Кленова с получением фрагментов СОТШ-2 и СОТЮ-4. Затем провели амплификацию полученных фрагментов с избытком олигонуклеотида СОТШ и с избытком олигонуклеотида СОТЯ4, соответственно. Таким образом были наработаны одноцепочечные фрагменты СОТШ-2 и СОТИ3-4. После этого реакционные смеси СОТШ-2 и СОТЮ-4 объединили, провели достройку фрагментом Кленова с получением полноразмерного сегмента СОТЯ и провели амплификацию с праймерами СОТШ (фосфорилированным) и СОТЯ4, концы подравняли фрагментом Кленова. Полученный

сегмент после обработки рестриктазой РзИ встроили в рОБМ1 по сайтам 8ша1 и РзИ (рис. 5).

Рис.4. Схема сборки дуплекса ССГО из олигонуклеотидов.

Рис. 5. Конструирование плазмиды рОЕМС-2.

Далее был проведен рестриктный анализ ДНК клонов при помощи эндонуклеазы рестрикции Ы(е1, сайт узнавания которой присутствовал в клонированной

последовательности. Первичную последовательность вставки клона, отобранного по результатам рестрикционного анализа, подтвердили сиквенированием на автоматическом сиквенаторе. Таким образом была получена плазмида рОЕМ-С2.

3. Клонирование кодирующей части гена резистентности к тетрациклину в плазмиду

pGEM-C2.

В полученный таким образом вектор рОЕМ-С2 клонировали кодирующую часть гена Те!1 по сайтам Ы/е1 ~ (рис. 6). Кодирующая часть гена Те!' была получена с помощью ПЦР с праймерами ТеШ8 и Те1Б8, имеющими в своем составе сайты узнавания рестриктазами, соответственно, М/еI и Л/1, и плазмидой рБЮ22 в качестве матрицы.

Рестриктный анализ ДНК клонов проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции которые в рекомбинантных клонах выщепляли вставку размером около 1,2 тыс.п.о. Нуклеотидную последовательность вставки в отобранном клоне подтвердили сиквенированием на автоматическом сиквенаторе. Полученной плазмиде было присвоено название рОСТ2.

Как мы и предполагали, эта плазмида не обладала устойчивостью к тетрациклину, так как слабый сайт связывания рибосом в составе сайта сопряжения трансляции не способен к независимой инициации трансляции гена устойчивости к тетрациклину. Таким образом, мы получили базовую конструкцию (рОСТ2), содержащую все необходимые элементы для проведения клонирования целевого гена и селекции его клона-суперпродуцента.

4. Схема введения рандомизованного фрагмента.

Для введения рандомизованного фрагмента в область инициации трансляции мы разработали методику схематично изображенную на рис. 8. Для этого был химически синтезирован олигонуклеотид "N20", содержащий 20-звенный рандомизованный участок (при синтезе каждого звена которого в реакцию вводились все 4 предшественника), а также фрагменты сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции Вя1Х и Ше1 во фланкирующих областях. Кроме того в 5'-фланкирующую область была введена последовательность ТТА, комплеменарная терминирующему кодону, чтобы закрыть рамку считывания, совпадающую с рамкой целевого гена, которая может быть открыта в результате рандомизации (рис.7). Иначе, появление дополнительного инициирующего кодона могло бы привести к удлинению целевого полипептида с Оконца. В то же время, открывание двух других рамок считывания не представляет опасности, так как они

неизбежно будут закрыты в кодирующей части гена и не приведут к сопряженной трансляции. Так что эта клоны будут нежизнеспособны.

Рис. б. Конструирование плазмиды рОСТ2. 12

Для встраивания этого олигонуклеотида в плазмидный вектор использовали сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BstX I в составе дуплекса COTR. Расщепление по этому сайту дает непалиндромные 3'-выступающие концы, которые не могут отжигаться сами на себя. Один из этих концов комплементарен концевому фрагменту олигонуклеотида N20 и может служить матрицей для его отжига и лигирования к вектору, а также праймером для достройки второй цепи рандомизованного фрагмента с последующим внутримолекулярным лигированием по «тупым концам» (рис.8).

ВзК I ф I

5'-ССАТААСАСЗТЕСАТААСАТАТО

3'-ввТАТТвТСАССТЛТТвТАТДС

■ССАТААСА

М 1) Гидролиз Вз0( I И N66 I 2) Лигирование рандомизованного оНдо

ТАТв-

АС .

6вТАТТ6ТСАСС1ППШПШПП1АТТвТ

V

3)Фрагмвнт Кленова

4)Лигированив Л

5'-ССАТААСАСТ<3©га1Ш5ШЫНОТ:йАСА ТАТв .

3'-ввТАТТеТСАССтПОПППППШАТТвТ АТАС.

V

Рис. 8. Схема введения рандомизированного фрагмента.

5. Проведение генетической селекции в одноцистронной системе.

Таким образом, для получения исходного пула с целью проведения селекции в одноцистронной- системе, плазмидный вектор рОСТ2 расщепляли эндонуклеазами рестрикции В8Ш и М(еи и вводили рандомизованный фрагмент "N20", как описано выше. Полученный пул был назван р0СТ-№0 (пул 0) (рис. 9).

Сначала всей полученной лигазной смесью трансформировали клетки К coli XL1-blue для того чтобы получить пул суперскрученной плазмидной ДНК. Затем вновь полученным пулом pGCT2-N20 (пул 0) трансформировали клетки BL21(DE3), содержащие ген Т7 РНК-полимеразы, для проведения селекции. После индукции IPTG (0,05 мМ) клетки растили в среде LB при разных концентрациях тетрациклина: 1 мкг/мл, 3 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл. Клетки, содержащие контрольную конструкцию pGCT2 (без рандомизованного фрагмента) не росли на среде LB, содержащей тетрациклин, в то время, как клетки, содержащие рандомизованный фрагмент (pGCT2-N20, пул 0), давали рост при концентрациях тетрациклина: 1 мкг/мл, 3 мкг/мл, 5мкг/мл.

ДНК субпула pGCT2-N20, выросшего на среде с 5 мкг/мл, (р(ЗСТ2/пул 1.1), сиквенировали по Сэнгеру не изолируя индивидуальные клоны. Сиквенирование выявило уникальную 14-звенную последовательность RBS-Tet (рис. 10), которая по-видимому представляла подавляющее большинство клонов. К нашему удивлению, полученный сайт инициации трансляции не содержал канонической последовательности Шайна-Дальгарно. Последовательность RBS-Tet в целом АТ-богатая, однако имеет цитидиновый кластер непосредственно прилегающий к инициирующему кодону.

явв-та. ТАТ АТА АТА СТС СС

Сайт сопряжения

В31Х1_АТСЬАбЕ 1ранспяции ^е!_

О МТСежСТСвССОСССТТЛХПТКСП мсчтел И-АТААТЛСГССсигдтжвОТАССТТТЛЛМСТввТМСССХХТТвЛЛ^-СТИКЛАТ«: ССХ'СОТС* 10 20 30 40 И 60 ТС » М 1И 110

Рис. 10. Фрагмент результата сиквенирования плазмидного субпула р(5СТ2-Н20 (пул 1.1), содержащий последовательность "ИВБ-Те!".

Надо отметить, что трансляция гена устойчивости к тетрациклину в одноцистронной конструкции осуществляется не непосредственно с отобранного сайта инициации трансляции, а через сайт сопряжения, так как сразу за инициирующим кодоном следует терминирующий триплет, так что трансляция гена ТеГ может начаться только в результате реинициации. Поэтому, как и в двуцистронной конструкции, в этом случае даже очень эффективный сайт инициации трансляции может обеспечить лишь невысокий уровень экспрессии гена Тег\ Неудивительно поэтому, что белковый электрофорез лизатов клеток не выявил появления мажорной полосы в области 38 кДа, соответствующей электрофоретической подвижности белка Тй* (данные приведены в диссертации).

6. Клонирование кДНК КАСК1 в плазмиду рОСТ2.

Целевым белком в нашем проекте является Рецептор Активированной Протеинкиназы С (ИАСК1) (рис. 11). Комплементарная ДНК гена ИАСК1 была получена с помощью ПЦР с праймерами ИАСК-^пёе и КАСК-Э8крп, имеющими в своем составе сайты узнавания рестриктазами Мёе1 и Крп\ соответственно (рис. 12). В качестве матрицы использовали библиотеку кДНК из мозга эмбриона человека [С1оп1ееЬ].

Рис. 11. Конструкция для селекции ЯБ8-сайта для ЯАСК1.

, Шв1

ЯАСК-1)5пс1е б'-ТСАССОАОсХтАТОАСССТТСОТ-З' (23н.о.) (прямой праймер) Крп\ .

ЯАСК-ОБкрп 5'-ССОСТАССТТАОСОТСТАССААТАОТСАСС-3' (30 и.о.) (обратный праймер)

Рис. 12. Праймеры для амплификации гена гаск\.

После обработки продукта ПЦР обеими рестриктазами его встраивали в плазмиду рОСТ2 по сайтам Ше1 - Крп1 (рис. 13). Далее проводили рестриктный анализ ДНК клонов при помощи рестриктаз Мёе1 и Крп1, дающих два ожидаемых двуцепочечных фрагмента длиной 4097 п.о. и 954 п.о. Нуклеотидную последовательность вставки подтвердили также сиквенированием на автоматическом сиквенаторе. Полученной плазмиде было присвоено название рОСТ-ЯАСК!.

Рис. 13. Конструирование плазмиды рОСТ-ЯЛСК!.

7. Тестирование полученного сайта инициации трансляции для одноцнстронной системы (RBS-Tet) в двуцистрояной конструкции, содержащей гаск1.

Для проверки эффективности отобранного сайта нужно было бы клонировать в полученную конструкцию целевой ген. Однако, в процессе генетической селекции в одноцистронной конструкции рестрикционный сайт Ыёе1 был утрачен в результате

делении так, что клонирование целевго гена в полученную плазмиду стало невозможным. Поэтому мы решили синтезировать отобранную последовательность химически в виде дуплекса с выступающими «липкими концами», содержащими сайты узнавания рестриктазами I и Ndel, чтобы в дальнейшем клонировать ее в двуцистронную

конструкцию с целевым геном (рис. 14).

Рис. 14. Синтетический дуплекс ЯБ8-Те1

В двуцистронную конструкцию рОСТ-КЛСК1 (см. главу 2.6, рис. 11), в область инициации трансляции гена rackl клонировали последовательность ЯБ8-Те1 по сайтам I - ШЛ (рис. 15).

Лигазной смесью трансформировали клетки Ecoli ХЬ 1-Ь1ие. Нуклеотидную последовательность вставки в отобранном клоне анализировали с помощью рестрикгного анализа. Плазмидную ДНК рОСТ-ИАСК1 -ЯБ8-Те1 обрабатывали рестриктазами Шс>1 и BstXI, давших два ожидаемых двуцепочечных фрагмента длиной —110 п.о. и -4943 п.о.

Затем вновь полученной, суперскрученной, ДНК трансформировали клетки БЬ21(БЕ3). Индукцию проводили при небольших концентрациях 1РТО (0,05 мМ). После индукции клетки растили в среде ЬБ при разных концентрациях тетрациклина: 1 мкг/мл, 3

мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл. Клетки, содержащие контрольную конструкцию рОСТ-КАСК1 (без вставки) не росли на среде ЬБ, содержащей тетрациклин, также как и клетки, содержащие фрагмент "КБ8-Те1", рОСТ- КАСК1-КБ8-Те1. Лизаты клеток анализировали при помощи денатурирующего ПААГ-8Э8 (рис.16).

Рис. 16. Электрофоретический анализ (ПААГ-8Э8) лизатов клеток E.coh БЬ21фЕ3): 1 - рОСТ -ЯАСК1,2 - рОСТ- ЯАСК1-ЯБ8-Те1, 3 - маркер молекулярных масс.

Белковый электрофорез лизатов клеток не выявил появления мажорной полосы в области 30 кДа, соответствующей электрофоретической подвижности белка ЯАСК1. Все это указывает на то, что вставка "ЯБ8-Те1" не обеспечивает экспрессию гена ЯАСК1, в то время как для гена Те^ она дает возможность роста клеток на среде с тетрациклином. Это еще раз продемонстрировало, что не любой стандартный сайт связывания рибосомой подходит к данному гену.

Итак, наша попыка создать промежуточный пул экспрессирующих векторов до клонирования целевого гена не увенчалась успехом. Пул быстро сошелся к единственной последовательности. К тому же эта последовательность, будучи помещенной в другой контекст, оказалась неэффективной. Поэтому мы приступили к осуществлению второй стратегии отбора - рандомизации непосредственно перед целевым геном.

8. Контрольная конструкция для экспрессии ЯАСК1 в двуцистронной системе.

Разрабатывая положительный контроль для нашей системы, мы клонировали на место рандомизированного фрагмента (по сайтам ШХ - МёеТ) в плазмиду рОСТ-ЯАСК1 синтетический 20-нуклеотидный дуплекс "8Э", содержащий 4-нуклеотидную

последовательность Шайн-Дальгарно. Полученную плазмиду назвали рОСТ-КЛСК1-8Э (рис.17,18).

Перед встраиванием 8Э-дуилекса в плазмиду рОСТ-ЯЛСК1 по сайтам BstXl -N¿¿1, провели фосфорилирование олигонуклеотидов по отдельности, так как в дуплексе один из 5'-концов не является выступающим, что препятствует действию полинуклеотидкиназы фага Т4. Для проверки встраивания дуплекса проводили

рестрикционный анализ ДНК клонов при помощи рестриктазы ВатШ, сайт узнавания которой присутствует в дуплексе. При гидролизе плазмиды со вставкой образовывались три ожидаемых фрагмента размером 627 п.о, 659 и.о. и 3769 п.о. Также подтверждали нуклеотидную последовательность вставки сиквенированием на автоматическом сиквенаторе.

Полученная плазмида рОСТ-КЛСК1-8Э была протестирована на экспрессию белка ИЛСК1 в соответствующем бактериальном штамме. Эта конструкция делала клетки устойчивыми к тетрациклину в концентрации 1 мкг/мл, но не 5 мкг/мл и давала умеренную экспрессию белка ИЛСК1 (рис. 19), подтверждая потенциальную возможность использования нашей системы.

Рис. 19. Электрофоретический анализ (ПААГ-SDS) лизатов клеток Еcoh BL21(DE3): I -маркер молекулярных масс, 2 - pGCT-RACKl, 3 - pGCT- RACK1-SD.

9. Введение рандомизоваввого фрагмента в двуцистронную конструкцию pGCT-RACKl.

Введение рандомизованного фрагмента в область инициации трансляции гена rackl в составе плазмиды pGCT-RACKl проводили по выше упомятой методике (см. главу 4), (рис.20). Сначала получили плазмидный пул pGCT-RACKl-N20 (pool 0) выделенный из штамма Ecoli XL I-blue после трансформации лигазной смесью, полученной при введении рандомизованного фрагмента. Для этого все полученные клоны в количестве ~ 160 000 штук смывали с селективных чашек, используя среду LB, и из всей биомассы выделяли суперскрученную плазмидную ДНК при помощи Qiagen tip-500.

Рестриктный анализ индивидуальных клонов при помощи рсстриктаз ЕсоЫ и а также сиквенирование общей плазмидной ДНК этого пула показали, что 70% плазмид имеют вставку, содержащую ~20 нуклеотидов (рис.21). ГОСТ-ПАСК1

Рис. 21. Сиквенс плазмидного пула pGCT-RACKl-N20 (pool 0) указывает на эффективное введение фрагмента N20.

Понятно, что полученный пул не охватывает все возможные последовательности, а это 4 20 вариантов. Однако, этот пул содержит несколько сотен последовательностей удовлетворяющих минимальному требованию к сайту инициации трансляции - наличие последовательности Шайн-Дальгарно, длиной в 4-5 нт, расположенной на расстоянии в 6 - 9 нуклеотидов от стартового кодона. Поэтому мы предположили, что такого пула может оказаться достаточно для селекции эффективного суперпродуцента.

10. Искусственный отбор и анализ отдельных клонов.

Плазмидной ДНК исходного пула pGCT-RACKl-N20 (pool 0) трансформировали

клетки штамма BL21(DE3), содержащие ген Т7 РНК-полимеразы. Выросшие в количестве

-12 000 штук трансформанты смывали с селективных чашек, используя среду LB.

Сначала аликвоты (см. диссертацию) из этой биомассы растили на среде LB (Ар 50 мг/мл)

без индукции Т7 РНК-полимеразы, затем добавляли IPTG (индуктор транскршщии гена

Т7-полимеразы), чтобы начать экспрессию целевого белка и белка резистентности к

тетрациклину. Для индукции мы использовали низкую концентрацию IPTG (0,05 мМ)

чтобы избежать замедления роста клонов сильно продуцирующих целевой белок. Далее,

через 3 часа, в культуральную среду добавляли Tet (5 мг/мл) чтобы начать генетическую

селекцию. Плазмидный пул, устойчивый к тетрациклину, был выделен из ночной

культуры и проанализирован на агарозном геле (рис.22, А). Большинство плазмид из данного пула, судя по длине, утратили целевой ген и экспрессировали ген устойчивости к тетрациклину непосредственно с селектированного сайта инициации трансляции. Однако, небольшая фракция пула имела нужную подвижность в агарозном геле и, по-видимому, содержала оба гена. Мы провели элюцию из геля соответствующей полосы (рис. 22, А, Б). Затем отдельные клоны из этой фракции после трансформации клеток БЬ21(ОЕ3) были взяты для дальнейшего анализа. Сначало было отобрано 10 полноразмерных клонов (так как пул был существенно загрязнен короткими плазмидами, как видно из рисунка 22 (Б).

А. Б.

1 2 3 4 5 1 2 3 4

Рис. 22. А. Пулы после селекции: 1 - pool 1.1 (Tet 1мкг/мл), 2 - pool 1.3 (Tet 3 мкг/мл), 3 - pool 1.5 (Tet 5 мкг/мл), 4 - Pool 0 (pGCT-RACKl-N20), 5 - pGCT-RACKl. Б. Пулы после выделения из геля: 1 - Маркер П (23 150,9 416, б 557,2 322,2 027,500 п н), 2 - pool 2.1 (Tet 1мкг/мл), 3 • pool 2.5 (Tet 5 мкг/мл), 4 - pGCT-RACKl. Стрелками указаны фракции, соответствующие полноразмерной конструкции pGCT-RACKl-N20.

Эти клоны были проанализированы на резистентность к тетрациклину. Для этого клоны инкубировали в жидкой среде с IPTG и АР в течение 3 часов, затем добавляли тетрациклин (1 мг/мл и 5 мг/мл). Все десять клонов, взятых для анализа, кроме негативной контрольной конструкции pGCT-RACKl, были способны расти на среде содержащей 1 мг/мл Tet, однако только три клона были способны расти на среде содержащей 5 мг/мл Tet.

Когда эти клоны были проанализированы на наличие экспрессии белка RACK1 (используя стандартную концентрацию IPTG 0,3 мМ), обнаружилось, что устойчивые к тетрациклину (5 мкг/мл) клоны дают суперэкспрессию рекомбинантного белка RACK1 с выходом свыше 30% от общего количества клеточного белка (рис. 30 (Б) дорожка 2). Иммуноблотинг гомогената из суперэкспрессирующего клона "7.5" (Tet 5 мкг/мл), подтвердил присутствие белка в районе 30 кДа, что соответствует электрофоретической подвижности нашего белка RACK1 (31,5 кДа) (рис.23) (Birikh et al, 2003).

Рис. 23. Электрофоретический анализ (ПААГ-SDS) лизатов клеток E.coli BL21(DE3), принадлежащих отдельным клонам из pool 1.1 и pool 1.S: А. Вестерн-блот гомогената клона 7.5 (5 мкг/мл Tet) с антителами к RACK1. Б. Грубые гомогенаты клонов устойчивых к тетрациклину: 1 - клон 2.1 (1 мкг/мл Tet), 2 - клон 7.5 (5 мкг/мл Tet), 3 - маркер молекулярных масс, 4 - pGCT-RACK1.

Сиквенирование клонов устойчивых к 5 мкг/мл Тет выявило одну и ту же структуру сайта инициации трансляции во всех трех клонах, обогащенную адениновыми остатками, содержщую каноническую четырехнуклеотидную последовательность Шайн-Дальгарно и небольшой цитидиновый кластер предшествующий инициирующему кодону (рис. 24).

РИС. 24. Сиквенс области связывания рибосом клона-суперпродуцента "7.5" (Tet 5 мкг/мл).

11. Тестирование области инициации трансляции из клона-суперпродуцента в исходном векторе pGCT2.

Разработанная нами система отбора сайта инициации трансляции подвержена риску случайной вставки какого-либо нового сайта в ходе отбора, которая могла бы повлиять на эффективность репликации и трансляции. Чтобы исключить эту возможность мы переклонировали фрагмент BstXl - Крп\ (включающий и сайт инициации трансляции

и ген ЯЛСК1) из суперпрдуцирующего клона "7.5" в плазмиду рОСТ2, не подвергавшуюся селекции (рис. 11). Для этого плазмидные ДНК рОСТ2 и "клон 7.5" обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BstX\ и Крп\ в буферах, рекомендованными фирмами-производителями. Полученные фрагменты разделяли в агарозном геле, элюировали полосы соответствующие по длине фрагменту В81Х\-Крп1 (~955 п.о.) из клона-суперпродуцента "7.5" и Kpn\-BstX\ (~3142 п.о) из конструкции рОСТ2. Лигазной смесью трансформировали, клетки ЕеоН ХЬ 1-Ь1ие, выделяли суперскрученную плазмидную ДНК. Анализ полученной конструкции рОСТ2/ююН 7.5 на резистентность к тетрациклину, а также на экспрессию белка ИЛСК1 дал такие же результаты, как и для клона-суперпродуцента "7.5" (рис. 25).

1 2 3

™ \

Рис. 25. Электрофоретический анализ (ПААГ-8Э8) лизатов клеток Е.еоН БЬ21(ЭЕ3), содержащих разные плазмидные конструкции: 1 - контрольную конструкцию рОСТ-ЯЛСК1,2 - клон-суперпродуцент "7.5", 3 - новый вектор рОСТ2/клон7.5, содержащий область инициации трансляции из клона-суперпродуцента 7.5 и ген ЯЛСК1.

Эта работа демонстрирует, что описанная система позволяет создавать продуценты рекомбинантных белков в таком мелкомасштабном селекционном эксперименте.

Выводы:

1. Создана генетическая система, в которой с помощью направленной эволюции можно оптимизировать сайт инициации трансляции чужеродного гена для экспрессии в бактериальной системе.

2. Разработан новый метод введения короткого рандомизованного фрагмента в плазмидный вектор.

3. С использованием разработанной системы получен суперпродуцент рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1) человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Бирих К.Р., Желябовская O.E.J Берлин Ю.А|. Генетическая система для направленной эволюции прокариотического сайта инициации трансляции. Конференция «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». Пущино, 2001,42.

Желябовская О.Б.,|Берлин Ю.А1, Бирих К.Р. Структурно-функциональное изучение области инициации трансляции у E.coli методом икусственной эволюции. ХУзимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2003. Тезисы докладов, 16.

Желябовская О.Б.,|Берлин Ю.А[, Бирих К.Р. Получение бактериального суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции. XVIзимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2004,82.

Olga В. ZhelvabovskavaiYuri A. Berhq, and Klara R. Birikh. Artificial genetic selection for an efficient translation initiation site for expression of human RACK1 gene in Escherichia coli. Nucleic Acids Res., 2004,32, No. 5, e52, crpl-5.

Р1 0 4 8 2

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДЫ 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 26.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,75 Тираж 50 экз. Заказ 191. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Желябовская, Ольга Борисовна

Список сокращений

Введение.

Глава I. Рекомбинантные белки как инструмент для изучения внутриклеточной сигнализации (на примере белка RACK1).Обзор литературы.

1.1. Введение.

1.2. Белок RACK1 - участник фосфоинозитидного пути передачи сигнала. 10 Фосфоинозитидный путь передачи сигнала. 10 Протеинкиназа С и ее внутриклеточные рецепторы. 11 RACK1 - рецептор активированной протеинкиназы С.

1.3. Экспрессия чужеродных белков в Е.coli.

1.3.1. Генетические элементы экспрессирующего вектора. 17 Промоторы. 17 Решающая роль инициации в эффективности процесса трансляции. 20 Закономерности первичной структуры области инициации трансляции. 22 Влияние вторичной структуры RBS на эффективность инициации трансляции. 26 Применение сильных природных RBS в генноинженерных конструкциях. 28 Усилители трансляции. 29 Терминаторы трансляции. 32 Стабилизаторы мРНК. 33 Использование кодонов.

1.3.2. Компартментализация продуцируемого белка.

1.3.3. Экспрессия правильно сворачивающихся белков в Е. coli.

1.3.4. Химерные белки.

1.4. Рандомизация и генетическая селекция как инструмент молекулярной биологии.

Глава II. Получение бактериального суперпродуцента - рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции.Результаты и обсуждение.

2.1. Принцип и дизайн системы генетической селекции.

2.2. Конструирование и клонирование синтетического фрагмента COTR в плазмидном векторе pGEM 1.

2.3. Клонирование кодирующей части гена резистентности к тетрациклину Tetr в плазмиду pGEM-C2.

2.4. Схема введения рандомизованного фрагмента.

2.5. Проведение генетической селекции в одноцистронной системе.

2.6. Клонирование кДНК RACK1 в плазмиду pGCT2.

2.7. Тестирование полученного сайта инициации трансляции для одноцистронной системы (RBS-Tet) в двуцистронной конструкции, содержащей гаск\.

2.8. Контрольная конструкция для экспрессии RACK1 в двуцистронной системе.

2.9. Введение рандомизованного фрагмента в двуцистронную конструкцию pGCT-RACK1.

2.10. Искусственный отбор и анализ отдельных клонов.

2.11. Тестирование области инициации трансляции из клона-суперпродуцента в исходном векторе pGCT2.

Глава III. Материалы и методы.

3.1. Реактивы.

3.2. Ферменты. 78 3.3 Материалы.

3.4. Препараты.

3.5. Олигонуклеотиды.

3.6. Штаммы и векторы.

3.7. Лабораторное оборудование. 81.

3.8. Буферы и растворы.

3.9. Методы.

Электрофорез нуклеиновых кислот в неденатурирующем ПААГ.

Трансформация бактериальных клеток и отбор рекомбинантов. 84 Препаративное выделение и плазмидной ДНК методом щелочного лизиса и очистка на ионообменных колонках "Qiagen-tip 500".

Приготовление лизатов клеток для белкового электрофореза.

Белковый электрофорез.

Амплификация ДНК in vitro.

Очистка продуктов амплификации.

Извлечение ДНК из агарозного геля.

Иммуноблотинг.

Клонирование синтетического дуплекса COTR в составе плазмиды pGEMl. 90 Клонирование кодирующей последовательности гена устойчивости к тетрациклину в плазмиду pGEMC2. 91 Клонирование кодирующей последовательности гена рецептора активированной протеинкиназы С - RACK1 в составе плазмиды pGCT2. 92 Введение рандомизованного олигонуклеотида в конструкцию pGCT2/pGCT

RACK1.

Введение синтетического дуплекса RBS-Tet в вектор pGCT-RACKl.

Введение синтетического дуплекса SD в конструкцию pGCT-RACKl.

Искусственный отбор.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение бактериального суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы C(RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции"

Совершенствование методологии рекомбинантных ДНК поразительно расширило возможности направленного биосинтеза белка. Среди различных систем экспрессии генетических детерминант важное место занимают прокариотические системы. Бактериальные суперпродуценты позволяют получать значительные количества высокоочищенных рекомбинантных белков для использования в медико-биологических и сельскохозяйственных целях.

Для экспрессии в бактериальной системе безинронный ген (кДНК) клонируют в плазмидный вектор, содержащий структурные элементы, необходимые для его транскрипции и трансляции. Наиболее эффективная и широко используемая система транскрипции (система Студиера) включает промотор из фага Т7 в сочетании с бактериальными штаммами, несущими индуцибельный ген Т7-РНК-полимеразы в своем геноме (Studier & Moffat, 1986). Эта система обеспечивает массивную транскрипцию, эффективность которой практически не зависит от структуры целевого гена. Однако, выход белка в одной и той же системе экспрессии может сильно варьировать от гена к гену. Этот факт объясняется тем, что лимитирующей в этих условиях является следующая стадии биосинтеза белка - трансляция, в особенности ее инициация. Эта стадия является наименее предсказуемой, так как ее эффективность сильно зависит от структуры целевого гена, которая в большой степени определяет вторичную структуру участка связывания рибосом.

В идеале сайт связывания рибосом нужно было бы подбирать специально для каждого целевого гена, однако рациональной основы для такого подбора не существует, так что обычно это делается методом проб и ошибок. В нашей работе, вместо рутинного перебора вариантов различных последовательностей, мы разработали комбинаторный подход при котором нужные последовательности выбираются автоматически в результате генетической селекции в специальной системе.

Этот подход позволяет подобрать эффективный сайт инициации трансляции для любого чужеродного гена в одном эксперименте. Эта система была нами использована для создания суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы С - RACK1.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Желябовская, Ольга Борисовна

Выводы:

1. Создана генетическая система, в которой с помощью направленной эволюции можно оптимизировать сайт инициации трансляции чужеродного гена для экспрессии в бактериальной системе.

2. Разработан новый метод введения короткого рандомизованного фрагмента в плазмидный вектор.

3. С использованием разработанной системы получен суперпродуцент рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1) человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Желябовская, Ольга Борисовна, Москва

1. Adhin M.R., van Duin J. (1990) Scanning model for translational reinitiatin in Eubacteria. J.1. Mol. Biol., 213, 811-818.

2. Altuvia S., Oppenheim A.B. (1986) Translational regulatory signals within the coding of the bacteriophage 1 clll gene. J. Bacterial., 167,415-419.

3. Andre A., Puca A., Sansone F., Brandi A., Antico G., Calogero R.A.(2000) Reinitiation ofprotein synthesis in Escherichia coli can be induced by mRNA cis-elements unrelated to canonical translation initiation signals. FEBS Lett., 468, 73-8.

4. Andrews В., Adari H., Hannig G., Lahue E., Gosselin M., Martin S., Ahmed A., Ford P.J.,

5. Hayman E.G., Makrides S.C. (1996) A tightly regulated high level expression vector that utilizes a thermosensitive lac repressor: production of the human T cell receptor V beta 5.3 in Escherichia coli. Gene, 182,101-109.

6. Arora R., Priano C., Jacobson A.B., Mills D.R. (1996) cis-acting elements within an RNAcoliphage genome: fold as you please, but fold you must!! J. Mol. Biol., 258,433-446.

7. Baneyx F. (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol., 10,411-421.

8. Berkhout В., Kastelei R. A., van Duin J. (1985) Translational interference at overlapping reading frames in prokaiyotic messenger RNA Gene, 37,171-179.

9. Berridge M.J. (1984) Inositol triphosphate and diacylglycerol as second messengers. Biochem. J., 220, 345-360.

10. Berridge M.J. (1987) Inositol triphosphate and diacylglycerol: two interacting second messengers. Annu. Rev. Biochem., 56,159-193.

11. Berridge M.J. (1993) Inositol triphosphate and calcium signaling. Nature, 361, 315-325.

12. Birikh K.R., Lebedenko E.N., Boni I.V, Berlin Y.A. (1995) A high-level prokaryotic expression system: synthesis of human interleukin 1 alpha and its receptor antagonist. Gene, 164, 341-345.

13. Birikh K.R., Berlin Y.A., Soreq H., Eckstein F. (1997) Probing accessible sites for ribozymes on human acetylcholinesterase RNA. RNA, 4,429-437.

14. Birikh K.R., Sklan E.H., Shoham S., Soreq H. (2003) Interaction of "readthrough"acetylcholinesterase with RACK1 and PKCbeta II correlates with intensified fear-induced conflict behavior. Proc Natl Acad Sci USA, 100,283-288.

15. Birnboim I.V., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 7,1513-1516.

16. Blum P., Ory J., Bauernfeind J., Krska J. (1992) Physiological consequences of DnaK and DnaJ overproduction in Escherichia coli. J. Bachteriol., 174, 7436-7444.

17. Boni I.V., Isaeva D.M., Musychenko M.L., Tzareva N.V. (1991) Ribosome-messengerrecognition: mRNA target sites for ribosomal protein SI. Nucleic Acids Res., 19,155-162.

18. Botterman J., Hoefte H., Zabeau M. (1987) High-level ezpression of genes under control of cro translation initiation signals in Escharichia coli. J. Biotechnology, 6,71-81.

19. Brinkman U., Mattes R.E. and Buckel P. (1989) High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the drtaY gene product. Gene, 85, 109-114.

20. Buell G., Schulz M.-F., Selzer G., Chollet A., Mowa N.R., Semon D., Escanez S., Kawashima E.1985) Optimizing the expression in E. coli of a synthetic gene encoding Somatomedin-C (EFG-I). Nucleic Acids Res., 13,1923-1938.

21. Buensuceso C.S., Woodside D., Huff JL., Plopper G.E., O'Toole Т.Е. (2001) The WD protein

22. Rackl mediates protein kinase С and integrin-dependent cell migration. J. Cell Sci., 114, 1691-1698.

23. Casadaban M.J., Chou J., Cohen S.N. (1982) Oveiproduction of the Tu3 transposition protein and its role in DNA transposition. Cell, 28,345-354.

24. Chang B.Y., Chiang M., Cartwright C.A. (2001). The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase С and tyrosine phosphorylation of RACK1. J. Biol. Chem., 276,20346-20356.

25. Chen C.S., Nakamoto T. (1978) Translational specificity of Bacillus stearothermophilus ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,167-171.

26. Choi J.H, Lee S.Y. (2004) Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol., 14, Epub ahead of print.

27. Chopra A.K., Brasier A.R., Das M., Xu X.J., Peterson J.W. (1994) Improved synthesis of Salmonella typhimurium enterotoxin using gene fusion expression systems. Gene, 144, 81-85.

28. Cloney L.P., Bekkaoui D.R., Hemmingsen S.M. (1993) Co-expression of plastid chaperonin genes and a synthetic plant Rubisco operon in Escherichia coli. Plant. Mol. Biol., 23, 1285-1290.

29. Cole P.A. (1996) Chaperone-assisted protein expression. Structure, 4, 239-242.

30. Cone K.C., Steege D.A. (1985) Overexpression of HIV-1 proteins in Escherichia coli by a modified expression vectors and their one-step purification. Protein Expr. Perif., 4,367-372.

31. Cornelis P. (2000) Expressing genes in different Escherichia coli compartments. Curr Opin Biotechnol., 11,450-454.

32. Curry K.A., Tomich C.-S.C. (1988) Effect of ribosome binding site on gene expression in Escherichia coli. DNA,7,173-179.

33. Dalboge H., Carlsen S., Jensen E.B., Christensen Т., Dahl H.-H.M. (1988) Expression of recombinant growth hormone in Escherichia coli: Effect of the region between the shine-Dalgarno sequence and the ATG codon. DNA, 7,399-405.

34. Davis R.W. (1980) DNA sequence of the int-xis-pi region of the bacteriophage lambda: Overlap of the int and xis genes. Nucleic Acids Res., 8,1765-1782.

35. Dieter P., Fitzke E. (1993) Formation of diacylglycerol, inositol phosphates, arachidonic acid and its metabolites in macrophages. Eur. J. Biochem., 218, 753-758.Щ

36. Di Guan C., Li P., Riggs P.D., Inouye H. (1988) Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides in Escherichia coli by fusion to maltose-binding protein. Gene, 67,21-30.

37. Dunn J., Studier F. (1981) Nucleotide sequence from the genetic left end of bacteriophage T7 DNA to the beginning of gene 4. J. Mol. Biol, 148, 303-330.

38. Erlich H.A. (1979) Levinson J.R., Cohen S.N., McDevitt H.O. (1979) Filter affinity transfer. A new Techniqe for the in situ identification of proteins in gels. J. Biol. Chem., 254,1224012247.

39. Protein Sci. 3,1953-1960. Georgiou G. and Valax P. (1996) Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli.

40. Goloubinoff P., Gatenby A.A., Lorimer G.H. (1989) GroE heat-shock proteins promoteassembly of foreign prokaryotic ribulose bisphosphate carboxylase oligomers in Escherichia coli. Nature, 337,44-47.

41. Golshani A., Kolev V., Mironova R., AbouHaidar M.G., Ivanov I.G. (2000) Enhancing activity of epsilon in Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2,508-512.

42. Gren EJ. (1984) Recognition of messenger RNA during translation initiation in Escherichia coli. Biochimie, 66,1-29.

43. Grundstroem Т., von Gabain A., Nilsson G., Anderson M., Lundstroem M., Lund В., Lundgren E.1987) Expression of an interferon-a gene variant in Ecoli using tandemly repeated synthetic ribosomal binding sites. DNA, 6,41-46.

44. Guzman L-M., Belin D., Garson M.J., Beckwith J. (1995) Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol., 177,4121-4130.

45. Hall M.N., Gabay J., Debarbouille M., Schwartz M. (1982) A role for mRNA secondary structure in the control of translation initiatin. Nature, 295,616-618.

46. Hanning G., Makrides S.C. (1998) Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. Trends Biotechnol., 16, 54-60.

47. Hartl F.U., Hlodan R., Langer T. (1994) Molecular chaperones in protein folding: the art of avoiding sticky situations. Trends. Biochem. Sci., 19,20-25.

48. Hasan N., Szybalski W. (1995) Construction of /aclts and /aclqts expression plasmids and evaluation of the thermosensitive lac repressor. Gene, 163, 35-40.

49. He D.Y., Vagts A.J., Yaka R., Ron D. (2002) Ethanol induces gene expression via nuclear compartmentalization of receptor for activated С kinase 1. Mol. Pharmacol., 62, 272-280.

50. Hockney R.C. (1994) Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli. Trends Biotechnol., 12,456-463.

51. Humphreys D.P., Weir N. Mountain A. and Lund. P.A.- (1995) Human protein disulfide isomerase functionally complements a dsbA mutation and enhances the yield of pectate lyase С in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 270,28210-28215.

52. Jay E., Seth A.K., Rommens J., Sood A., Jay G. (1982) Gene expression: Chemical synthesis of E.coli ribosome binding sites and their use in directing the expression of mammalian proteins in bacteria. Nucleic Acids Res., 10, 6319-6329.

53. Jones I.M., Brownlee G.G. (1985) Differential expression of influenza N protein and neuraminidase antigenic determinants in Escharichia coli. Gene, 35, 333-342.

54. Johnson J.E., Giorgione J., Newton A.C. (2000) The CI and C2 domains of protein kinase С are independent membrane targeting modules, with specificity for phosphatidylserine conferred by the CI domain. Biochemistry, 39, 11360-11369.

55. Joyce G.F. (1996) Building the RNA world. Ribozymes. Curr. Biol., 6, 965-967.

56. Kidwell J., Valentin H.E., Dennis D. (1995) Regulated expression of the Alcaligenes eutrophus pha biosynthesis genes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 61, 1391-1398

57. Kiely P.A., Sant A., O'Connor R. (2002) RACK1 is an insulin-like growth factor 1 (IGF-1) receptor-interacting protein that can regulate IGF-1-mediated Akt activation and protection from cell death. J. Biol. Chem., 277,22581-22589.

58. Kimura S., Iyanagi T. (2003) High-level expression of porcine liver cytochrome P-450 reductase catalytic domain in Escherichia coli by modulating the predicted local secondary structure of mRNA. J. Biochem., 134,403-413.

59. Kleerebezem M., Heutink M., Tommassen J. (1995) Characterization of an Escherichia coli rot A mutant, affected in periplasmic peptidyl-prolyl cis/trans isomerase. Mol. Microbiol., 18, 313-320.

60. Klovins J., van Duin J., Olsthoorn R.C. (1997) Rescue of the RNA phage genome from RNase III cleavage. Nucleic Acids Res., 25, 4201-4208.

61. Klovins J., TsarevaN.A., de Smit M.H., Berzins V., van Duin J. (1997) Rapid evolution of translational control mechanisms in RNA genomes. J. Mol. Biol., 265,372-384.

62. Kolkova K., Novitskaya V., Pedersen N., Berezin V., Bock E. (2000). Neural cell adhesionmolecule-stimulated neurite outgrowth depends on activation of protein kinase С and the Ras-mitogen-activated protein kinase pathway. J. Neurosci., 20,2238-2246.

63. Vallie E.R., DiBlasio E.A., Kovacic S., Grant K.L., Schendel P.F., McCoy J.M. (1993) A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology N-Y, 11,187-193.

64. MacBeath G., Kast P., Hilvert D. (1998) Probing enzyme quaternary structure by combinatorial mutagenesis and selection. Protein Sci., 7,1757-1767.

65. Makrides S.C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev., 60, 512 538.

66. Marquis D.M., Smolec J.M., Katz D.H. (1986) Use of portable ribosome binding site for maximizing expression of a eukaiyotic gene in Escherichia coli. Gene, 42, 175-183.

67. Marrtin J. and Hartl F.U. (1997) Chaperone-assisted protein folding. Curr.Opin. Struct. Biol., 7, 41-52.

68. Matteucci M.D., Heynecker H.L. (1983) Targeted random mutagenesis: the use of ambiguouslysynthesized oligonucleotides to mutagenise sequences immediately 5' of an ATG initiation codoa Nucleic Acids Res., 11,3113-3121.

69. Mayer M, Buchner J. (2004) Refolding of inclusion body proteins. Methods Mol Med., 94,239254.

70. McCarthy J.E.G., Schairer H.U., Sebald W. (1985) Translational initiation frequency of atp operon from Escherichia coli: identification of an intercistronic sequence that enhances translation. EMBO J., 4,519-526.

71. McCarthy J.E.G., Sebald W., Gross G., Lammers R. (1986) Enhancment of translational efficiency by the Escherichia coli atpE translational initiation region: its fusion with two human genes. Gene, 41,201-216.

72. McCarthy J.E.G. (1988) Expression of the unc genes in Escharichia coli. J. Bioen. Biomemb., 20,19-39.

73. McCarthy J.E.G., Bokelman C. (1988) Determinants of translational initiation efficiency in the atp operon of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 2,455-465.

74. McCarthy J.E.G., Schauder В., Ziemke P. (1988) Post-translational control in Escharichia coli: translation and degradation of tha atp operon mRNA. Gene, 72,131-139.

75. McLeod M., Shor В., Caporaso A., Wang W., Chen H., Hu L. (2000) Cpc2, a fission yeast homologue of mammalian RACK1 protein, interacts with Rani (Patl) kinase To regulate cell cycle progression and meiotic development. Mol. Cell Biol., 20,4016-4027.

76. Mertens N., Remaut E. Fiers W. (1995a) Tight transcriptional control mechanism ensures stable high-level expression from T7 promoter-based expression plasmids. Biotechnology (N Y), 13,175-179.

77. Mertens N., Remaut E., Fiers W. (19956) Versatile, multi-featured plasmids for high-level expression of heterologous genes in Escherichia coli: overproduction of human and murine cytokines. Gene, 164,9-15.

78. Missiakas D., Georgopoulos C., Raina S. (1994) The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation. EMBO J., 13,2013-2020.

79. Mochly-Rosen D., Khaner H., Lopez J. (1991) Identification of intracellular rcepror proteins for activated protein kinase C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 3997-4000.

80. Mochly-Rosen D. (1995) Compartmentalization of protein kinase С by anchoring proteins: a theme in signal transduction. Science, 268,247-251.

81. Mochly-Rosen D., Gordon A.S. (1998) Anchoring proteins for protein kinase C: a means for isozyme selectivity. FASEBJ., 12, 35-42.

82. Moore J.T., Uppal A., Maley F., Maley G.F. (1993) Overcoming inclusion body formation in a high-level expression system. Protein Expr. Purif, 4,160-163.

83. Mowa N.R., Nakamura K., Inouye M. (1980) Gene structure of the OmpA protein, a major surface protein of Escherichia coli required for cell-cell interaction. J. Mol. Biol., 177,663-683.

84. Nilsson В., Abrahmsen L. (1990) Fusions to staphylococcal protein A. Methods Enzymol., 185, 144-161.

85. Nishizuka Y. (1984) The role of protein kinase С in cell surface signal transduction and tumor promotion. Nature, 308, 693-698.

86. Nishizuka Y. (1986) Studies and perspectives of protein kinase C. Science, 233,305.

87. Nishizuka Y. (1988) The molecular heterogeneity of protein kinase С and its implications for cellular regulation. Nature, 334, 661-665.

88. Nishizuka Y. (1992) Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Sciense, 258, 607-614.

89. Nishizuka Y. (1995) Protein kinase С and lipid signaling for sustained cellular responses. FASEB J., 9,484-496.

90. O'Connor, M. and Dahlberg, A.E. (2001) Enhancement of translation by the epsilon element is independent of the sequence of the 460 region of 16S rRNA. Nucleic Acids Res., 29, 1420-1425.

91. Ohno S., Nishizuka Y. (2002). Protein kinase С isotypes and their specific functions: prologue. J Biochem. (Tokyo), 132, 509-11.

92. Olins P.O., Devine C.S., Rangwala S.H., Kavka K.S. (1988) The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhances the expression of forein genes in Escherichia coli. Gene, 73, 227-235.

93. Olsen M.K., Rockenbach S.K., Curry K.A., Tomich C.-S.C. (1989) Enhancement ofheterologous polypeptide expresson by alterations in the ribosome binding-site sequence. J. Biotechnol., 9,179-190.

94. Olsthoorn R.C., Licis N., van Duin J. (1994) Leeway and constraints in the forced evolution of a regulatory RNA helix. EMBOJ., 13, 2660-2668.

95. Olsthoorn R.C., Zoog S., van Duin J. (1995) Coevolution of RNA helix stability and Shine-Dalgarno complementarity in a translational start region. Mo I. Microbiol., 15, 333-339.

96. Olsthoorn R.C., van Duin J. (1996) Random removal of inserts from an RNA genome: selection against single-stranded RNA. J. Virol., 70, 729-36.

97. Ostermeier M and Georgiou G. (1994) The folding of bovine pancreatic trypsin inhibitor in the Escherichia coli periplasm. J. Biol. Chem., 269,21072-21077.

98. Ostermeier M., De Sutter K., Georgiou G. (1996) Eukaryotic protein disulfide isomerase complements Escherichia coli dsbk mutants and increases the yield of a heterologous secreted protein with disulfide bonds. J. Biol. Chem., 271,10616-10622.

99. Pedersen-Lane J., Maley G.F., Chu E., Maley F. ( 1997) High-level expression of human thymidylate synthase. Protein Expres. Purif., 10,256-262.

100. Perez-Perez J., Gutierrez J. (1995) An arabinose-inducible expression vector, pAR3, compatible with ColE 1-derived plasmids. Gene, 185,141-142.

101. Poole E.S., Brown C.M. and Tate W.P. (1995) The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli. EMBO J., 14,151-158.

102. Pugsley A.P., Francetic О., Possot O.M., Sauvonnet N., Hardie K.R. (1997) Recent progress and future directions in studies of the main terminal branch of the general secretory pathway in Gram-negative bacteria--a review. Gene, 52, 13-19.

103. Pugsley A.P., Francetic O., Driessen A.J., de Lorenzo V. (2004) Getting out: protein traffic in prokaryotes. Mol Microbiol., 1,3-11.

104. Puri N., Appa Rao K.B., Menon S., Panda A.K., Tiwari G., Garg L.C., Totey S.M. (1999) Effect of the codon following the ATG start site on the expression of ovine growth hormone in Escherichia coli. Protein Expr Purif., 17,215-23.

105. Ringquist S., Shinedling S., Barrick D., Green L., Binkley J., Stormo G.D. Gold L. (1992) Translation initiatin in Escherichia coli: sequences within the ribosome-binding site. Mol. Microbiol., 6, 1219-1229.

106. Ron D., Chen C.-H., Caldwell J., Jamieson L.,Orr E., Mochly-Rosen D. (1994) Cloning of an intracellular receptor for protein kinase C; a homo log of the P subunit of G proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 839-843.

107. Ron D., Jiang Z., Yao L., Vagts A., Diamond I., Gordon A. (1999) Coordinated movement of RACK1 with activated betallPKC. J. Biol. Chem., 274,27039-27046.V

108. Russ W.P., Engelman D.M. (1999) TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 96, 863-868.

109. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, p.A12.

110. Sambrook J., Russel D.W. (2001) Molecular Cloning. A laboratory manual. Gold Spring Harbor, New York.

111. Sandkvist M. and Bagdasarian M. (1996) Secretion of recombinant proteins by Gram-negativebacteria. Curr. Opin. Biotechnol., 7, 505-511.

112. Schechtman D., Mochly-Rosen D. (2001) Adaptor proteins in protein kinase C-mediated signal transduction. Oncogene, 20,6339-6347.

113. Scherer G., Walkinshaw M., Amott S., Moore D. (1980) The ribosome binding sites recognized by Escherichia coli ribosomes have regions with signal character in both the leader protein coding segments. Nucleic Acids Res., 8,3895-3907.

114. Schine J., Dalgarno L. (1974) The 3' terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: Complementarity to nonsence triplets and ribosome binding sites. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 71,1342-1346.

115. Schoner B.E., Hsiung H.M., Belagaje R.M., Mayne M.G., Schoner R.G. (1984) Removal of aterminator structure by RNA processing regulates int gene expression. J. Mol. Biol., \16,39-53.

116. Schottel J.L., Shinsky J. J., Cohen S.N. (1984) Effects of alterations in the translation control region on bacterial gene expression: Use of cat gene constructs transcribed from the lac promoter as a model system. Gene, 28,177-193.

117. Shepard H.M., Yelverton E., Goeddel D. (1982) Increased synthesis in E.coli of fobroblast and leukocyte interferons through alterations in ribosome binding sites. DNA, 1,125-131.

118. Shigesada K., Itamura S., Kato M., Hatanaka M, Imai M., Tanaka M., Masuda N., Nagai J., Nakashima K. (1987) Construction of a new plasmid vector that can express cloned cDNA in all translational reading frames. Gene, 53, 163-172.

119. Singer B.S., Gold L., Shinedling S.T., Colkitt M., Hunter L.R., Prinow D., Nelson M.A. (1981) Analysis in vivo of translational mutants or the rllB cistron in bacreriophage T4. J. Mol. Biol, 149,405-432.

120. Smith D.B. and Johnson K.S. (1988) Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene, 67,31-40.

121. Sosnick T.R., Mayne L., Hiller R., Englander S.W. (1994) The barriers in protein folding. Struct. Biol., 1, 149-156.

122. Sprengart M.L., Fatsher H.P., Fuchs E. (1990) The initiation of translation in E.coli: apparent base pairing between the 16S rRNA and downstream sequences of the mRNA. Nucleic Acids Res., 18, 1719-1723.

123. Stader J.A. and Silhavi T.J. (1990) Engineering Escherichia coli to secrete heterologous gene products. Methods Enzymol., 185,166-187.

124. Steitz J. A. (1969) Polypeptide chain initiation: nucleotide sequences of the three ribosomal binding sites in bacteriophage R17 RNA. Nature, 224,957-964.

125. Stenstrom C.M., Isaksson L.A., (2002) Influences on translation initiation and early elongation by the messenger RNA region flanking the initiation codon at the 3' side. Gene, 288,1-8.

126. Stormo G., Schneider Т., Gold L. (1982a) Characterization of translation initiation sites in Escherichia coli. Nucleic Asids Res., 10,2971-2996.

127. Stormo G., Schneider Т., Gold L., Ehrenfeucht A. (19826) Characterization of translation initiation sites in Escherichia coli. Nucleic Asids Res., 10,2997-3011.

128. Stormo G.D. (1986) Translation initiation. Maximizing gene expression / Eds Reznikoff W., Gold L. Boston: Butterworths, pp 196-212.

129. Studier F.W., Moffat B.A. (1986) Use of bacteriophage T7 polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., 189,113-130.

130. Suissa M., Altuvia S., Koby S., Giladi H., Oppenheim. (1988) Translational signals of a major head protein gene og bacterophage lambda. Mol. Gen. Genet., 214, 570-573.

131. Tessier L.-H., Sondermeyer P., Faure Т., Dreyer D., Benavente A., Villaval D., Courtney m., Lecocq j.-p. (1984) Yhe influence og mRNA primary and secondary structure on human gamma interferon gene expression in E.coli. Nucleic Acids Res., 12,1663-1615.

132. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. (1997) Molecular chaperones, folding catalysts, and therecovery of active recombinant proteins from E. coli. To fold or to refold. Appl. Biochem. Biotechnol., 66,197-238.

133. Tomich C.-S.C., Olson E.R., Olsen M.K., Kaytes P.S., Rockenbach S.K., Hatzenbuhier N.T. (1989) Effect of nucleotide sequences directly downstream from the AUG on the expression of bovine somatotropin in E.coli. Nucleic Acids Res., 17, 3179-3197.

134. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. (1979) Electrophoresis transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedures and some applications. Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 76,4350-4354.

135. Vize P.D., Wells J.R.E. (1987) Spacer alterations wich increase the expression of porcine growth hormone in E.coli. FEBSLett., 213,155-158.

136. Wall J.G. and Pluckthun A. (1995) Effects of overexpressing folding modulators on the in vivo folding of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol., 6, 507-516.

137. Warburton N., Boseley P.G., Porter A.G., (1983) Increased expression of a cloned gene by local mutagenesis of its promoter and ribosome binding site. Nucleic Acids Res., 11,5837-5854.

138. Weikert M.J., Doherty D.H., Best E.A., Olins P.O. (1996) Optimization of heterologous protein production in Escherichia coli. Current. Opinion in Biotechnology, !, 494—499.

139. Wetzel R. (1994) Mutations and off-pathway aggregation of proteins. Trends Biotechnol, 12, 193-198.

140. WhiteholnN., Livak K.J., Pettewey S.R. (1985) The effects of hybrid ribosome binding site variants on the expression of human interferon-B in E.coli. Gene, 36,375-379.

141. Wilkinson D.L. and Harrison R.G. (1991) Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnology N-Y., 9,443-448.

142. Wood D.W., Wu W., Belfort G., Derbyshire V, Belfort M. (1999) A genetic system yields self-cleaving inteins for bioseparations. Nat. Biotechnol, 17, 889-892

143. Wulfing С: and Pluckthun A. (1994) Correctly folded T-cell receptor fragments in the periplasm of Escherichia coli. Influence of folding catalysts. J. Mol. Biol., 242,655-669.

144. Yabuta M., Miura-Onai S., Ohsuye K. (1995) Thermo-inducible expression of a recombinant fusion protein by Escherichia coli lac repressor mutants. J. Biotechnol., 39, 67-73.

145. Yaka R., Thornton C., Vagts A J., Phamluong K., Bonci A., Ron D. (2002) NMDA receptorfunction is regulated by the inhibitory scaffolding protein, RACK1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,5710-5715.

146. Yasukawa Т., Kanei-Ishii C., Maekawa Т., Fujimoto J., Yamamoto Т., Ishii S. (1995) Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J. Biol. Chem270,25328-25331.

147. Yoon S. K., Kang W.K., Park Т.Н. (1996) Regulation of trp promoter for production of bovine somatotropin in recombinant Escherichia coli fed-batch fermentation. J. Ferment. Bioeng., 81, 153-157.

148. Zabeau M., Stanley K.K. (1982) Enhanced expression of cro-P-galactosidase fusion proteins under the control of the Pr promoter of bacteriophage lambda. EMBO J., 1,1217-1224.

149. Гуревич А.И., Есипов P.C., Качалина Т.А., Каюшин A.JI. (1995) Зависимость уровня экспрессии гена в E.coli от структуры участка инициации трансляции (TIR). I. Первичная структура TIR. Биоорган, химия, 20,117-123.

150. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. (1992а) Метаболизм фосфоинозитидов и формирование кальциевого сигнала в клетках. Цитология, 34,26-44.

151. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984) Молекулярное клонирование. М. «Мир».

152. Остерман Л.А. (1985) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультраценрифугирование. М., Наука.