Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полипептиды, участвующие в транскрипции S-плазмид из митохондрии Zea Mays

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полипептиды, участвующие в транскрипции S-плазмид из митохондрии Zea Mays"

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени Государственный университет им. М.В. Ломоносова

На правах рукописи УДК 577.155.2

ЛЕВЧЕНКО Игорь Викторович

ПОЛИПЕПТИДЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ТРАНСКРИПЦИИ 5-ПЛАЗМИД ИЗ МИТОХОНДРИИ ZEA MAYS

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена ка кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени Ы.в.Ломоносова

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор-консультант Г.({.Зайцева

Официальные оппоненты - доктор биологически наук,

ведущий научный сотрудник М.Д.Кирнос

кандидат биологических наук, заведувдий сектором В.М.Андрианов

Ведущая организация - Институт физиологии растений

АН СССР.

Защита диссертации состоится ",„" ^ 1992 г.

_______

у <4° ■

в /О -час. на заседании Специализированного совета Д.053.50.70 при МГУ имени Ы.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ по адресу: 119899 Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

Автореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛЬОТЫ

1. Актуальность проблпш. ЬЬ.тохондриалышй геном высших стенкй обладает рядом свойств, отличаю;»« его от других гохондриалышх ДШС. К его наиболее своеобразный чертам mojkho iwctu чрезвычайно больше размеры, интенсивные процессы комбинации штохондрнзльней ДНК, происходящие в онтогенезе и логенезе, значительная пластичность генома, следствием которой лается высокая гетерогенность по размеру и набору следовательностей иитохондриалыгой ДЕК даже у родственшх видов, также удивительное многообразие плазнидоподобных ДНК. У которых растений присутствие плазшд коррелирует .. с топлазматической иузской стерильностью (UJiC) - наследуемым топлазнэтическим признаком, связзшшм с жп'охондриальной ДШС, и клотающпмся в неспособности растения производить нормальную льцу.

У линий кукурузы Z.mays, характеризующихся так называешь типом ip.iC обнаружены две линейные олззмадные ДНК, названные плэзшдаш. Эти ДНК имеют концевые шц.иртировамие повторы и сут ковалентно связанные с 5' концами ДЕК тершналыще белки -evtngs at. al., 1977). Гомологичная рекомбинация следовательностей S-шюзиид с штохондризльной ДНК приводит к неаризацип митохондряального генома S-HMC Z.mays (Schardl et. ., 1984). При цатоплззмятическсй реверсии к фертильности, в ¡них случаях происходит исчезновение свойоднш S-плпзмнд (Schardl al., 1905), в других наблюдается реорганизация 'следовательностей штохондриальной ДНК, прилегагацнх к участку, щологичному инвертированно;,<у повтору S-плазмид (Zabala et. al., 190). Вопрос о механизмах этих процессов и возиожной роли в них шових факторов, кодируемых S-нлазиидаия, остается совершенно ¡изученным.

Необычная организация и связь с крупномасштабными ¡мененияш, происходящими в штохондриальной ДНК кукурузы, делает -плазмиды интересным объектом исследования.

Наличие в штохондршльной ДНК кукурузы с S-типои ЦМС, юледователыгостей гомологичных проиоторнону району S-плазмид, и )тенциально способных влиять на экспрессию мптохондриальных ¡нов, ставит на вервий план изучение белковых факторов, шствуюсдех в транскрипции S-плазмид.

2. Цель и задами исследования." Целью настоящей ра<5< являлось изучение белков, участвующих в транскрипции ДНК линей! S-плазмад из митохондрий кукурузы Zea mays. Были посташи следующие экспериментальные задачи: 1. Провести компьютер; анализ известных кодирующих последовательностей 8-плазуид. Клонировать фрагменты ДНК, содержащие участки инициа) транскрипции S-плазшд. 3. Идентифицировать белковые факто] связывающиеся с участком инициации транскрипции S-плазмид vitro. 4. Исследовать роль этих полипептидов в транскрипции J S-плазшд in vitro.

3. Научная новизна работы. Полученные в работе дам расширяют наши знания о линейных митохондриальных плазиид: Обнаружена гомология одного из плазмидных генов с ген; ДНК-зависимых РНК полимераз. Впервые показано, что промотор] район ДНК S-плазшд является участком связывания д; полипептидов, присутствующих только у растений, содержа! S-плазмиды. Проведено биохимическое фракционирование обнаружен] белков и определены их молекулярные массы. Показано, что один полипептидов необходим для специфической транскрипции J S-плазиид in vitro.

4. Научно-практическая ценность работы. Полученные результ; являются новым вкладом в изучение организации и эксорео линейных плазиид кукурузы. Клонированные последовательно S-плазшд могут быть использованы в работах по изуче; митохондриальных геномов различных растительных линий Z.raa; Данные, полученные в настоящей работе, касавдиеся структур: организации S-плазмид, могут быть использованы для созда: векторных систем для высших растений.

5. Апробация работы. Материалы диссертации были представл на конференции "Организация и транскрипция митохоидриальн генома высших растений" (институт генобиологических исследован Западный Берлин, 1990 г.). Работа неоднократно обсуждалась заседаниях кафедры молекулярной биологии Биологического факульт МГУ. 6. По материалам исследований опубликованы 2 печатные рабо

7. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит введения, обзора литературы, описания материалов а метод изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируе литературы, включающего 238 наименований. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 23 рисунка и 5 таблиц

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования - представитель высших растений семейства псов Zea mays.

Выделение митохондрий проводили по методу (Kemble et. &1., to). Митохондриальную ДНК выделяли по методу (Pring & LeVings, Г8), ДКК S-плазмид - по методу (КегоЫе & Thompson, 1982). чышнство гениоиияенерных манипуляций проводили как описано в Зораторных пособиях (Маниатис и др., 1984, Гловер, 1988). ределенив нуклеотидной последовательности проводили по методу чгерэ (Sanger et. al., 1977). Локализацию ДНК-белковых иплексов проводили с помощью метода торможения в шакрилаипднои геле (Schinkel et. al., 1988). Для детекции tt-связываших полипептидов использовали Southwestern 5ридизацию (Slngh et al., 1988, Hübscher, 1987) и метод -индуцируемых ДНК-белковых сшивок (Schnapp et. al., 1990). новой для опытов по транскрипции In vitro послужили работы dwards et. al., 1982, Kenneil et. al., 1989, Fisher et. al., 85).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ аминокислотных последовательностей полипептидов,_ даруемых S-плззиидными ДНК Zea mays.

К моменту качала работы были определены нутслеотидные следовательности плазмид S1 и S2, и были обнаружены участки, тенциально кодирующие полипептиды (Levlngs & SederofI, 1983, illard et. al., 1985). Выло показано также, что продукты 0РС1 ОРСЗ аписом - полипептиды с молекулярными массами 130 кД и 103 (, действительно присутствуют в митохондриях Z.mays с S-типом 1Топлазмы (Manson et. al., 1986, Zabala & Walhot, 1988). Была ¡наружена гомология аминокислотной последовательности ОРСЗ S1 с (дои вирусных ДНК полииераз (КигтШ & Levchenko, 1987).

Используя компьтерную программу GENEPEO, BiverBlde Sclentlllc I анализировали особенности аииногаслотних последовательностей .'лков, кодируемых 0РС1,2,4. Гидрофильный характер 130 кД -шшептида и его обогащениость остатками основных аминокислот сазывали на возможное взаимодействие белка с нуклеиновыми {слотами и участие в репликации или транскрипции плазмидных шов. В аминокислотной последовательности 0РС1 мы обнаружили 10 люков гомологии с консервативными последовательностями РНК

3

А. 180 f------► 3692 500 П.н.

0РС1(Л513П.Н.) ' I—I

S2 Г ^-V.vx^-^.x.v;

»»•' • ■ ■w.svrtaivj <i«8

(5453n.ll.) , 4258 5274

♦------i

ОТО (2787П.н.) 0PC2 (1017П.н.}

180 |------------- . 2906

Ь202 6218 4183 . .

'"—I "--\

0PC4 (76ün.H.)0PC2

RP041 Afro№/IW.KPTKNDi) (-95 - )Г>Ш£13КК -STílWraNR (-45- JGKAIEMEFR

I * * * • * ** и и * * + » 1.1 * «** XII »+** E

0PC1S2 AKD-YIJI)ramPDD(-90->SE-I^mW^ISK-Qam(-23-)RKlIEVKKP №041 (-130-) VEI'I'J/IVVÍÍW! ti 1С с; У (-137 -) LE IARA FLC EK-LYÍTHIÍLÍ FRGRAYPLSl IV + * * *** V **.'* * * +*** к*»*** * * 0PC1S2 (-62- )LTI>LSSY- -R COY (-123 JllKIAEAYlDYK-IYFI'IFLDFRCRNYRHGi RP041 -¡ÍFíílCTXlNDLiSRGl.LIÍ1' (- 55- JWimADKPVíQALATCFE(-22->DGTCNGMl{YA

»» * * * ч** VI ++ * ' * ** VII * + * 0PC1S2 FHF-H-ERDLVRSFIIF (-43- )ITtíKIED-!.!QSKFÍFFE(-42-)DASASAYQItóS

RP041 ALGGDVKA'i'QmV-PSDK----VQDVY (-28-) TRKVVKQTVMTNVYG (-85- )V

*++ *+ **4 + + *+* VIII * *»* * ** IX * 0PC1S2 YFLLDIDYGIHTMblKKTNrDGRYIHDlY(-38-)DRfJVVKKMFMPMMYG(-61 - )V RP041 IWTP1GLPIVQP YE (-27 - )ARRQKAGLPPNFIJISLDA-SH(-182-)C00[I

+ +** »+ X **** •* +

0PC1S2 VYSTPYWVT-LQTYK(-36-) IRK5STSTFANFIHQKBAFTA (-205-) COOH

nil,-g—-fl-f-в-щд—ц-ц—g—i-cooh

I II/ ////// - ^ Hifg——a-SHh-fl-g-fl В В-8-Я-COOH

Г II IV V VI VII IX X 0RF1S2

III VIII

Рнс. 1 А. Организация S1 и S2 плазмид из митохондрий Z.mays. Q - инвергировашше повторы, - гомология ДШС SI и S2. Б. Гомология 0РС1 S2 с каталитической субъединицсй мнтоюндриальноЯ РЯК полимиразы S.cerevlslae (RP041).

si с

(6397п.Н.)

SI

KP

h4

0.5 т.п.н.

P В 3 P

s2

SW1 U.

pSW1

(2.156 n.It.)

pSW6

(t.465 п.н.) pSW2 t-

J pSWIOl (6.135 п.н,)

KP

u pSW5

(0.105 П.И. >

(1.600 n.ll.)

L

К ■ P

•-1 pSVSI5

|—| 50 п.н.

ic.2. Рестрикциошшя карта Д1ЙС митохондриа-лишл линейных плазмид

I и S2 Z.mays (Kim et. al., 1982). Увеличен участок правого

ивертировакного повтора. Обозначения - Р (Petl), В (BaraHI), К Spnl).

полимеразы бактериофага ТЗ E.coli и нитохондриального фермента cerevlslae (кодируемого геном RP041) (Masters et. al., 1987). Рис. 1 показаны: (А) структура S-плазмид; (Б) участки гомоло аминокислотных последовательностей RPQ41 S.cerevisiae и ОРС1 Z.roays. ^оказано также расположение гомологичных блоков молекулах двух белков.

Обнаруженная гомология оказалась первым свидетельством то: что линейные плазмидные ДНК, характеризующиеся наличием конце] инвертированных повторов и терминальных белков, потенциально мо: кодировать ДНК-зависимую РНК полимеразу. Последовательное-гомологичные 0РС1 S2 в ВР041 были обнаружены в последнее вреш многих линейных матохондриальных плазмид (Оевег & Tudzynski, 19< Chan et al., 1991, Hoblnson et al., 1991).

Нам не удалось обнаружить гомологии аминокислот! последовательностей 0РС2 и 0РС4 с известными полипептидами.

Для исследования свойств белков, участвующих в транскригп плазмид, необходимо было клонировать последовательное инвертированных повторов - участков, содержащих промотор} последовательности транскрипции аписом.

2. Клонирование ДНК S-плазмид. ■

Препарат митоховдриальной ДНК кукурузы сорта "Днепровм 243МВ", обогащенный ДНК S-плазмид с помощью центрифугирования СвС1, использовали для клонирования. На Рис. 2 представле рестрикционная карта S-плазмид и указано расположение ветре полученных нами плазмид серии pSW. Используя ДНК интакп S-плазмид, мы клонировали полные последовательности линей} геномов, за исключением 130 п.н. концевых участков инвертирован! повторов. Недостающие последовательности, содержащие промотс транскрипции, клонировали из библиотеки митохондриальной I г.тпаув сорта "Одесская 10", содержащей интегрирован» последовательности линейных плазмид R1 и К2 (последняя практичес идентична S2) (Houchlns et. al., 1986). Известна частич? куклеотидная последовательность ot-R1 и Р-В2 участа

митохондриальной ДНК (Houchlns et. al., 1985).

Продукты рестрикции митохондриальной ДНК BamHI клонировали вектор pUC18. Из 20 случайно отобранных рекомбинантных клоне обладающих ()gal~ фенотипом, 16 содержали встройки. Скринк полученных рекомбинантов осуществляли с помощью гибридизации J0 клонов с меченным KpnI-PstI фрагментом плазмида pSW5, содержав

6

в.

X

-Ч-

367

809

N БР

—I—н-

1411 1621

2250

(—| 200 п.н.

Рис. 3 (4). Электрофореграима продуктов расщепления плазмидной

клона «7 рестриктазами (б) ХЪа1 + Вапй1, (в) БрЫ + Валй!, (а)

верные фрагменты ДНК рестрицированной PвtI.

(Б). Гибридизация по Саузерну рестриктов ДНК «7 с КрпГ-РвК гментом плазмиды рБ?»5.

(В). Рестрикционная карта ВашН1 - фрагмента 2.25 т.п.н. ? локуса митохондриальной ДНК кукурузы с нормальным типом . эплазмы ( НоисМпв е1. а1., 1986 ). В - ВашН1, Н - Исо1, X 1Ьа1, Б - БрЫ, Р - Рв«.

А.

В X

К.....н

X

-к

N 5Р

-Н---Н

н 200 п.н.

Б. ССАТСССС АТТГСАСАТС СТГТСССЛСГ ТТГОТСЛСАО ТСАСТССССА * *

АТАСААААСТ АТАСААССАС АТГКСАА'1'С ГАСА'Ш.АОА 'ГАССЛЛСС.ЛС

- са —........— --------

СТАТСГАСТТ САААСАСАСС СССТССССиА ТССТЧП'АСТА ТТААСАСАСА

I

САТААСААТС СТССССАСАС АСАТССАСАС ААОТССАС

Рис. 4. (А). Рестрикционная карта ДНК #7 и стратеги, секвенирования последовательности инвертированного повтора. (Б). Нуклеотидная последовательность БрИ - РвП фрагмента »7. Участо; инвертированного повтора фланкирован вертикальными стрелками; точк. старта транскрипции (Тгаупог & Ьеч1гщ5. 1986) отмечена звездочкой участок гомологии инвертированных повторов Б- и п-плазмид выделе пунктиром, отмечены куклеотидные вариации.

а

30 п.н. инвертированного повтора. Было проанализировано 250 клонов, из них 1Ш обнаружили один, гибридизовавшийся с зондом. Этот клон - #7, содержал встройку размером 2.2 т.п.н. Результаты рестрикционного картирования и гибридизации рестриктов #7 с клонированным участком инвертированного повтора представлены на Рис. 3 (А,Б). С меченным зондом гибридизовались следующие фрагменты ДНК клона «7: ХЪаГ-ВатН1, 1560 п.н. и Sphl-BamHI, 752 п.н. Результаты свидетельствовали о том, что мы клонировали участок локуса ß-K2, содержащий полную копию инвертированного повтора (Houchina et. al., 1986). Рестрикционная карта BamHI -фрагмента (3-R2 приведена на Рис. 3 (В). Известно, что препараты митохондриальной ДНК, выделенные из различных линий кукурузы, . обнаруживают минорные различия в нуклеотидных последовательностях. Для того, чтобы убедиться в интактности клонированного наш инвертированного повтора мы субклонировали Spht-Pstl фрагмент ДНК (170 п.н.) клона #7 и определили его нуклеотидную последовательность. Результаты секвенировашя, представленные на Рис. 4, показали, что клонированный нами участок митохондриальной -ДНК кукурузы действительно содержит интегрированную, копию инвертированного повтора В2 плазмида, отличающегося от S-плазмидного 1—»G транзицией в положении 19 нуклеотпда. Известно, что эта замена не влияет на транскрипционную активность плазмидных генов (Тгаупог & Levings, 1986).

2.1. Анализ нуклеотидных последовательностей инвертированных повторов линейных плазшад кукурузы.

Известно, что точка старта транскрипции S-плазмидных ДНК локализована в положении 32 нуклеотида инвертированных концевых повторов (Тгаупог & Lev Inge, 1986). При анализе нуклеотидных последовательностей штохондриальных плазмид. мы обнаружили, что последовательность: 5*-СААТСГАСА!ГАААСАТАССААСС-3' инвертированного повтора S-плазмид, расположенная в координатах 22-44 нуклеотида, присутствует в инвертированных повторах п-линейной плазмида (Leon et. al., 1989) из митохондрий кукурузы (46-68 нуклеотад). За исключением этой последовательности (названной нами CS-Conserved Sequence) в участка первых 9 нуклеотидов (Leon et. al., 1989) инвертированные повторы S- и n-плазмид не обнаруживают гомологии.

Характерное расположение CS-мотива по отношению к точке старта транскрипции указывает на возможную роль этой последовательности в связывании белков, участвующих в транскрипции

9

плазмид. Вариация 3 и 4 нуклеотидов СБ-мотива, существующая у пи Б-плазмид (си. Рве. 4), может отражать различия в эффективности связывания факторов.

3. Связывание митохондриальшх белков с СБ-последовательностью инвертированного повтора.

Для исследования ДНК-связываюцей активности митохондриальных белков использовали метод торможения ДНК-белковых комплексов в полиакриламидном геле., В работе использовали "грубые" экстракты митохондриальных белков кукурузы сортов "Днепровский 505МВ"(Б-тип цитоплазмы) и "Днепровский 505ТВ"(Т-тип цитоплазмы), последний не содержал Б-плазмид. В качестве Р*^ -зондов использовали фрагменты инвертированного повтора, а также синтетический 22-членный двуцепочечный олигонуклеотид - 22-СБ, содержащий только СБ-последовательность Б-плазмид.

Электрофореграмма белков митохондриальных экстрактов представлена на Рис. 5(А). Видно, что Б-плазмидные белки 130 кД и 103 кД (Иапвоп ег. а!., 1986, гаЬа!а ег. а!., 1987, гаЬа1а & Ка1Ъог, 1988), присутствуют только в препаратах, полученных из растений с Б-типом цитоплазмы.

В опытах по ретардации были обнаружены два, различающихся по подвижности, ДНК-белковых комплекса, присутствующих только в лизатах Б-митохондрий (си. Рис. 5(5)). Комплексы I ("быстрый") и II ("медленный") являлись результатом сайт-специфического связывания полипептидов с СБ-последовательностью, поскольку: 1. Реакция образования комплексов проводилась в условиях значительного избытка гетерологичной ДНК. 2. Один из зондов -22-СБ содержал только СБ-последовательность. 3. Присутствие в реакционных пробах специфического конкурента - немеченного 22-СБ, препятствовало образованию Р^-ДНК-белковых комплексов.

Так как СБ-белковые комплексы I и II обнаруживались только в Б-митохондриях, и таким образом, коррелировали с присутствием свободных Б-плазмад, ш предположили, .что полипептиды, кодируемые зшасомами, участвуют в образовании комплексов.

4. Очистка белков, связывающихся с СБ-последовательностью инвертированного повтора.

Для очистки полипептидов, связывающихся с СБ-мотивом, использовали экстракт белков из митохондрий кукурузы "Днепровский 505МВ", полученный с помощью процедуры, указанной в подписи к

10

д.

Б.

а О в

130 КД -103 кД *

комплекс II комплекс I

свободный зонд

/Ч

Рис. 5. (А). схематическое изображение электрофореграммы митохондриалькых белков, солюбшшзировашшх при

"замораживании-оттаивании" магопластов кукурузы в условиях осмотического шока, преципитированных сульфатом аммония, добавленным до 75% от насыщения, и диализованиых против буфера, содержащего 50 М KCl. S - митохондрии растений сорта "Днепровский 505МВ", Т - "Днепровский 505ТВ".

(Б). Факторы, взаимодействувдне с CS - последовательность!), (а) Т-митохондрии; (б) S-митохондрии; (в) контроль. В качестве зонда использовали 22-CS - олигонуклеотид, взятый в количестве 0.5 нг в реакцию.

Митохондриальный экстракт

| 0.1 И КС1

| С1Ьасгоп В1ие + Агароза

I I

I 0.3 Н I 0.6 11

* КС1 I КС1

4.

СБ-связиванцяе белка 1,11; КЖ полиыераза

| 0 М

| КС1

| П£&£ Сефароза С16В

I

| 1.0

4. КС1

* 0.04 Ы I ИС1

4-

сг-связывгпцвй белок I

I

' 0.25 1 ' КС1

СБ-связывавдий белок II, РНК полиыераза

Рис. 6. Схеыа очистки полипептидов, связывапдшся с СБ-последовательностью инвертированного повтора Б-плазиид.

Me. 5. Схема очистки представлена на Рис. 6. На всех стадиях чистки регистрацию Селков проводили по методу торможения в геле, араллельно, в пробах измеряли FHK-полииеразную активность на кзогешюй денатурированной ДНК. Для ингибиторного анализа юрментативной активности использовали d-аиаштин и рнфампищк -звсстные ингибиторы про- и эукариотических ПК полинераз.

При хроматографии митохондриальшх белков на Cibacron Blue гарозе, белки, формирующие комплексы I и II, коэлшруются с i-аыянитин-, рчфлмпицин-устойчивой РЩ-полииеразноЯ активностью, [а Рис.. 7 (А) представлены результаты хроматографии Ш-связывающих белков, снятых с Cibacron Blue агарозы, на ДЕЛЕ :ефлрозе (pH буфера 7.9). В результате хроматографии происходит 1азделение факторов, свлзывэюплхся с CS-последопатрльностью (Рис. '). Белок, образующий "быстрый" комплекс, злюируется при более нзкой ионной силе (40-60 мМ KCl), чем белок "медленного" комплекса (250 мМ KCl). Результаты анализа ДНК-связываюцей 1Ктивноста свидетельствовали о том, что оба белка способны :вязываться с CS-последовательностью независимо друг от друга. :тепень очистки полппептидов по ДНК-связываюцему тесту составила фимерно 100 раз.

5. Определение молекулярных масс полипеитвдов, связывающихся : CS-последовательностью инвертированного повтора.

Наличие частично очищенных CS-связывапцих полипептидов юэволило нам определить их молекулярные массы. В работе применяли 1етод УФ индуцируемых ДНК-белковых сшивок и Southwestern 'ибридизацию. Первый метод включает в себя следующие этапы: 1. )бразование комплексов белка с Р32-зондом, содержащим в одной из (епеЯ ДНК 5-бром-дезоксиуридан вместо тимидина. 2. Образование совалентных сшвок между контактируициии участками ДНК и белка при облучении реакционных проб УФ. 3. Обработку полученных комплексов гуклеазами. 4. Определение молекулярной массы белка, меченного за ;чет связанных Р^-олигонуклеотидов, с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. На Рис. 8 представлены результаты такого эксперимента с белком, образующим комплекс I. Основным продуктом ;шавки являлся полипептид с молекулярной массой около 40 кД. Триеутствае в реакции образования комплексов избытка немеченного зпецифичеекго конкурента, а также обработка пробы перед электрофорезом протеинззой К приводили к исчезновению зоны печенного продукта, что свидетельствовало о его белковой природе и

13

КС1 (И)

г 0.5

--- 0.25

- 0.04

Г2

н

л

-1

30 ил

а б в г д

комплекс II комплекс I

свободные зонд

и

Рис. 7. (А). Хроматография СБ-связывапцих белков на анионообменной колонке с ВЕАЕ-Сефарозой СЬ6В. Колонка 1x3 си. Сплошной линией □оказано поглощение при 280 ни., пунктирои - концентрация КС1 в элшрупцем буфере, сплошной линией с точками - РНК-полимеразная активность; (Б). ДНК-связывапцая активность белков, полученных фракций, (а) фракция белков, не связавшихся с колонкой (б,в) фракция, злшруемая 0.04 И КС1 (г) фракция, злшруеиая 0.25 К КС1 (д) контроль.

Б

CAATCTACATAAAGATACCAACC 3' 5-бром-дГГФ, йР^дАТФ,

TCTATGCTTGC 4 дГТФ. Фермент Кленова.

а б в

В.

а б в г

150 70

150 70

40 —► г"» 40 —

в»

Рис. 8. Определение молекулярной массы CS-связывапцего полипептида , образующего комплекс I, с помощью УФ-индуцируемых ковалентных сшивок. (А). Схема получения меченного зонда, содержащего бром-дезоксиуридин. (Б). Электрофореграмиа меченных полипептидов: (а) 15 мин УФ-ивдукции, (б) 10 мин, (в) 5 мин. (В). Электрофореграмиа меченных полипептидов, длительность УФ-индукции 15 шга (а) контроль без белков; (б,в,г) фракция, содержащая белок комплекса I; (б) проба, обработанная протеиназой К; (г) проба, содержащая 10-кратный молярный избыток немеченного 22-CS. Стрелками показаны маркеры молекулярных весов в кД.

о специфическом характере связывания с CS-последователькостьх Используя метод УФ-индуцируемых с сивок нам не удалось обнарукит полипептид, образующий "медленный" комплекс. При увеличен времени УФ-индукции обнаруживались лишь минорные количества 40 л полипептида. Мы предположили, что использованный нами зо! является неэффективным в реакции образования сшвок с полипептидс II, возможно из-за отсутствия молекул бром-дезоксиуридика в точкг контакта белка II с CS-последовательностью. Полученный результг косвенно свидетельствовал о том, что два белка узнают различш, участки CS-мотива.

На Рис. 9 представлены результаты Southwestern гибридизащ белков с. P^-CS-22. В пробах, содержащих белки комплексов I и II обнаруживались полипептиды с молекулярными массами 40 кД и 130 kJ соответственно.

Суммируя полученные результаты, мы предположили, ч' полипептиды с молекулярными массами 130 кД п 40 кД мог; потенциально кодироваться 0РС1 и 0РС2 S-плазыид.

6. Транскрипция ДНК S-плазмид In vitro.

Многократная очистка CS-связыващих полипептидов позволи. нам исследовать их функциональную роль в процессе транскрипции Д1 S-плазмид. Мы пытались реконструировать процесс специфическ runoff транскрипции In vitro. В качестве матрицы использова рестриквдонный фрагмент Hlndlll-EcoRI, содержащий полную коп инвертированного повтора. . Специфическая транскрипция это фрагмента ДНК должна приводить к образованию runoff-транскрип размером 220 н. Добавление в реакцию фракции, содержащей 130 полипептид, приводило к образованию 220 и. транскрипта, котор детектировался на фоне пула не специфически инициированных РНК (с Рис. 10 Б(в)); присутствие в такой системе 40 кД полипепти способствовало корректной инициации транскрипции и образованию Р ожидаемого размера (см. Рис. 10 Б(г)). Участие в реакции одно CS-связыващего полипептида I не обеспечивало транскрипции из-отсутствия каталитической РНК-полимеразной активности (Рис. Б(б)). Таким образом, полипептид с молекулярной массой 40 к является фактором, определяющим специфичность транскрипи S-плазмид In vitro, а CS-последовательность (или часть е промотором. Так как нам не удалось отделить CS-связываиций бел II от каталитической активности "основной" митохондриалы РНК-полимеразы и показать его ферментативную активность, мы

16

а б

116

40

Рис. 9. Southweßtern гибридизация CS-связивапцзх полипептидов с Р32- мечешши 22-CS олигонуклеотидои (схема). (а) белки, злшруеше 0.04 M KCl с DEAE-Сефарозы, (б) белки, злгаруемие 0.25 M KCl. Стрелками указаны маркеры молекулярных масс в кД.

HS

А.

а б в

— pSW5

piR

404

#7

309 —

242 —

217 —

201 —

190 —

180 —

160 —

Е

Р

Рис.10. Транскрипция ДНК S-плазиид In vitro. (А). Физическая карта встройки плазмиды pAR, полученной путем дотирования фрагментов инвертированного повтора PstI-КрпГ pSW5 и Sphl-PstI «7.(Б). Злектрофореграмма runofi-транскриптов Hlndlll-EcoEI фрагмента pAR (схема), (а) маркеры (б) транскрипция в присутствии 40 кД полипептида (в) транскрипция в присутствии 130 кД белка (г) транскрипция в присутствии белков 40 кД и 130 кД.

17

можем исключить возможность участия этого полипептида в транскрипции S-плазшд в качестве транскрипционного фактора.

ВЫВОДИ

1. Полипептид с молекулярной массой 130 кД, кодируемый митохондриальной плазмидой S2 Zea nays, содержит 10 участков гомологии с консервативными последовательностями ряда ДНК-зависимых РЖ полимераз.

2. В митохондриях растений кукурузы с S-типом цитоплазмы присутствуют два полипептида, связывающиеся сайт-специфично с 22-нуклеотидной последовательностью, фланкирующей точку старта транскрипции S-плазмид.

3. Обнаруженные полипептиды различаются по своим хроматографяческим свойствам и имеют молекулярные массы 40 кД и 130 кД. Оба полшептида взаимодействуют с мишенью независимо друг от друга, и вероятно имеют различные участки связывания.

4. . Велок с молекулярной массой 40 кД является фактором, определяющим специфичность транскрипции S-плазмид In -vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. 1.7. Kuznln, 1.7. Levchertfco. G.N. Zaltseva. S2 plasmld Iron cras-S-roalze mitochondria potentially encodes а вресШс BMA polymerase // Nucl. Acids Res. - 1988. - Vol. 16. - P. 4177.

2. 1.7. bevchenko, E.V. Kuzmin, H.F. Sheinyakin, C.N. Zalteeva. Two distinct proteins bind to the inverted repeat ol linear S-plasraida from cms-S-malze mitochondria // Nucl. Acids Ees. -1992, в печати.