Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация и эксперессия генов плазмид COLD и COLIb, связанных с синтезом колицина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Организация и эксперессия генов плазмид COLD и COLIb, связанных с синтезом колицина"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи ПШЕННИКОВА Елена Станиславовна

УДК 577.214.62

ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ПЛАЗЭД COLD и СОЫЪ , СВЯЗАННЫХ С СИНТЕЗОМ К0ЛИЩ1НА.

(специальность 03.00,03 - молекулярная биология)

Автореферат дисоертации на соискание 'ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в группе внехромосомной наследственности . Института молекулярной генетики АН СССР.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук И.А.ХМЕЛЬ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Р.С.ШАКУ10В, доктор биологических наук Л.С.ЧЗРНИН

Ведущее учреждение: Мекфакультетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н.Белозерского МГУ

Защита состоится " ¿¿/-С-К 1988 г. в '/^часов на заседании Специализированного совета Д.025.01.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, Дородный проезд, I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИгенетика Автореферат разослан " ¿Г " 1938.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук , В.И.йВЗЕБАКОВА

г^Ш

.....! Актуальность проблемы. В настоящее время изучение вне; - и [хромосомных генетических элементов бактерий представляет большой теоретический и практический интерес. Обнаружение в клетках бактерий плазмид, сообщающих'им ряд новых свойств и-дополняющих стабильную систему хромосомного наследования, дало начало новому этапу в развитии молекулярной биологии и генетики бактерий. Благодаря плаамидам бактериальные клетки приобрета-вт такие важные свойства, как устойчивость ко многим лекарственным препаратам, возмояность обмена генетическим материалом мезду клетками, синтез специфических антибактериальных веществ - бактериоцинов ( в случае E.coli - колицинов). В настоящее время известно более 25 колицинов - это крупные белки с узким спектром действия. Показано, что некоторые колицины обладают ферментативной активностью, взаимодействуя с ДНК и РНК; другие взаимодействуют с цитоплазмагической мембраной, меняя ее проницаемость. Гены колицинов характерны только' для внехроиосомных элементов и не обнаруживаются в хромосоме бактерий.

Способность определять синтез колицинов в клетке сочета-етсяс обеспечением плазмидой устойчивости этой клетки к действию соответствующего колицина. За это ответственен ген белка иммунитета плазмиды. В последние года у нескольких колициноген-ных плазмид был обнаружен еще один ген, связанный с синтезом и 'действием колицина - ген лизиса, продукт которого вызывает гибель и лизис клетки-хозяина в условиях индукции синтеза колицина' и в результате - выход активного колицина из клетки. Эти три гена - колицина, иммунитета и лизиса - расположены на одном участке плазмиды а составляют единую функциональную группу.

При нормальных условиях -роста культуры синтез колицина в большинстве-клеток популяции репрессирован, лишь очень небольшая часть клеток (.до 0,1%) синтезирует колишш в результате спонтанной индукции. Индукция синтеза колицина может быть вызвала действием многих агентов, повреждающих ДНК или блоки-рувдих синтез белка в клетке, например, митомицина С, хлорам-феникола и многих других /FugBloy, 1984 /. 3 результате индукции клетка гибнет, высвобождая в срезу полиция. Лолгое время считали* что причиной гябзта клетки был колттия, с »it-mo

доказано, что причиной гибели является индукция синтеза не ко-лицина, а белка лизиса.

Колициногенные плазмиды служат удобными объектами изучения механизмов многих биохимических и генетических процессов, структуры и регуляции функционирования отдельных генов и сложных оперонов. Сравнительное изучение этих плазмид позволяет лучше познать процессы эволюции внехромосомных генетических элементов и бактерий.

Быстро развивающаяся область молекулярной биологии -генная инженерия - нуждается в новых удобных векторах. Колициногенные плазлиды могут быть использованы как основа для конструирования таких векторов, например, векторов с положительной селекцией клонов, несущих рекомбинантные плазмиды.

Состояние вопроса, цели и задачи исследования. Явление колициногении было открыто еще в 20-х годах, но изучение организации и функционирования конкретных генов, связанных с синтезом колицина, было начато лишь в последнее время, К началу нашей работы организация и экспрессия этих генов были изучены только у малых колициногенных плазмид ColEl и CI0DP13.

Целью настоящей работы было изучение структурной организации и функционирования генов колициногенных плазмид ColD и Collb , связанных с синтезом колицина.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1) картирование генов, связанных с синтезом колицинов,

2) идентификация белков, кодируемых этими генами,

■ 3) выяснение особенностей организации указанных генов,

4) определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов иммунитета и лизиса и аминокислотных последовательностей соответствующих белков плазмиды ColD и некоторых других колициногенных плазмид.

Научная новизна работы состоит в следующем:

- локализованы гены колицинов Пив ; определено направление их транскрипции,

- показано, что у плазмиды ColD гены колицина, иммунитета и лизиса располагаются на одной цепи ДНК и при индукции синтеза колицина митошщином С транскрибируются как один оперон

с sos -зависимого промотора гена колицина. Ген иммунитета имеет собственный sos -независимый промотор,

- определена нуклеотидная последовательность гена белка иммунитета к колицину D,

- обнаружена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей белков лизиса плазыиды ColD и других коли-циногенных плазыид. Установлена роль белка лизиса плазмида ColD в процессе экскреции колицина.

В целом работа расширяет представления о структуре и принципах функционирования плазмидных генов. Полученные результаты существенны для понимания происхождения и эволюции плазыид.

Практическая значимость полученных в работе данных определяется возможностью использования изученных генов при конструировании векторов на основе колициногенных плазыид, в частности, на основе плазмида ColD . Знание особенностей организации и экспрессии генов, связанных с синтезом колицина, ваяно для конструирования векторов, обеспечивающих прямую селекцию клонов, несущих рекоыбикантные плазмида. Система этих генов может быть использована также для стабилизации плазшд, применяемых в микробиологической промышленности. Данные о функционировании белка лизиса плазмид можно использовать при создании штаммов продуцентов E.coli с обеспечением выхода синтезированного продукта в среду.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IX и X Всесоюзных совещаниях по программе "Плазмида" Шущи-но-на-Оке, 1984,1985), отчетной научной конференции Института молекулярной генетики АН СССР (Москва, 1986), У1 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), Международном симпозиуме "Физико-хиыия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси,1987), У Съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 8-ми опубликованных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа содержат следующие разделы: введение, обзор литературы, экспериментальная часть, Еключащал иетариалы и методы, результат исследований и обсуждение; заключение, выводы, список цитируемой литературы. Объем работы'составляет 122 страницы ыаианст;:;-ного текста, работа проиллюстрирована 15 р.гсуккакп и 10 тао.;л~

цами. Список цитируемой литературы включает 179 наименований.

ЭКСШЕРШВНТМЬНАЯ ЧАСТЬ .МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы. плазмиды. среды. В работе использованы штаммы E.coli СбОО, KI2 Su°,j£925, JM83 И плазмиды ColIb-P9, ColD-СА23, ColEI, PUCI9, PBR325 из коллекции музея ШГ АН СССР, а также коллекция штаммов с колициногенными плазмидами Пагсли / Pugsley, 1985/. .

Бактерии растили в бульоне (или на агаре) Хоттингера, средах ЕВ и М-9 с необходимыми добавками.

Выделение плазмидной ДНК вели щелочным методом с последующей очисткой хлористым литием. Обработка рестриктазами и ли-гирование ДНК проводились обычными способами, как описано в учебнике Ыаниатиса и соавт./ Maniatis et al., 1982/.

Транспозицию проводили с помощью бактериофага^ Ъ221-Оат29Рат80гех:: Тп5 ПО имеющейся методике/ Shanabruch, Walker, 1980/.

Трансформацию клеток E.coli. плазмидной ДНК проводили по методу Ыандела и Хиги / Handel, Higa, 1970/.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили методом Максама и Гилберта в твердофазной модификации Чувпило и Кравченко /1983/.

Разделение фрагментов ДНК осуществляли методом электрофореза в агарозном геле в 0,089 U Трис-<Зоратном буфере.

Получение и мечение миниклеток штамма j)£ 925 проводили по имеющейся методике с небольшими модификациями /stoker et al., 1974/.

Анализ полипептидов, синтез которых индуцируется в присутствии ыитомицина С (MC), вели по методике, предложенной Кавардом и coaBT./cavard et al., 1985/.

Разделение меченых 35s полипептидов в ПААГ вели в присутствии sos согласно методике Леылгли/ьаеяшИ,'1970/.

Индукции синтеза колицина вызывали обработкой культуры нитомицином С (0,5 мкг/ыл) или хлорамфениколом (100 мкг/мл) /Воробьева и др.,1973/. Титр колицина определяли как наибольшее разведение препарата колицина, при котором еще обнаруживается зона подавления роста индикаторного штамма /Воробьева и др., 1982/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Локализация генов, связанных с синтезом колицина.

плазмид Collb и ColD

I. Плазмида Со1ГЬ .

Проводить изучение организации и функционирования отдельных генов на большой плазмиде Collb (мол.масса 61,5 1ЛДа) очень трудно и поэтому ранее в нашей лаборатории с этой целью был клонирован EcoRi-фрагмент (2,7 т.й.н.) плазмиды, определяющий синтез колицина хъ , на векторе рВЮ25 /Воробьева и др., 1982/. Таким образом была получена рекомбинантная плазмида piV4l . Для локализации генов, связанных с синтезом колицина, били получены с помощью транспозона Тп5 мутантные плазмида со встройкой транспозона в исследуемом фрагменте Collb (рис.1). Плазмида pIV4I и некоторые мутантные плазмиды plV4l :: Тп5 были преданы с помощью трансформации в клетки штамма j. 925, способного образовывать миниклетки, и методом электрофореза в ПААГ проанализированы полипептиды, синтезируемые в миниклетках (рис.2). Таким образом мы определили размер интакт-ной молекулы колицина lb - 69 КДа (плазмида piV4I и й41). В случае нутантных плазмид с нарушенным геном колицина ОгЗб, 51 и 24) зона в области 69 КДа исчезает и появляются новые зоны в областях 58, 45 и 23 ¡{Да - это незавершенные молекулы колицина. На основании данных о локализации встройки Тп5 в каждом отдельном случае и размере получаемых при этом неполных молекул колицина были определены границы и направление транскрипции гена колицина 1Ъ (рис.1,2).

При анализе фенотипа, который сообщают клеткам мутантные плазмиды, оказалось, что клетки либо синтезировали колицпн и были устойчивы к его действию, либо не синтезировали коляцин и были чувствительны к нему. При передаче плазмида piV4l о помощью трансформации в-различные штаммы E.coli траясформан-ты также были устойчивы к колицину 1Ъ . На основании этих данных мы считали, что клонированный фрагмент Collb определяет иммунитет к действию колицина lb . Это соответствовало литературным данным о сцепленности генов, определяющих синтез ; колицинов и иммунитет к ним, а также данным о необходимости присутствия в плазмиде гена иммунитета для нормального существования клеток, несущих колицяногенную плаз г.-аду. Однако, с,

!Т

V V V

V ууу

УУУ УУ УУУУУ V уу V УУУУУУV УУУУУ V УУ V V V

ЕсоМ Н1ш1111 Зта1 КрпХ ЕсоКУ ЕсоН1

I-1-1-1-1-I .1-1, I_'''1111

О 0,2 0,6 1,0 1,4 1,8 2,2 2,6 2,8

Т.П.Н.

Рис.1. Локализация встроек Тп5 в клонированном ЕсоНХ-фрагменте плазшщы СоНЪ.

Р - промотор гена колицина 1Ъ . у - сайты встройки тП5.

С?ТГ<

сааз»

) ■

1

<

•а» -- О

4- * » —

{ *

24Й-

51

36

41 _

га(1)

Ы(2)

М I

О 0,8 1,6 2,4 Т.П.Н.

Рис.2.35з -меченые полипептиды, синтезируемые в миниклет-ках, несущих р1У41 (I) и плазмиды рПЧ1::Тп5 : 41 (2), 36 (3), 51 (4) И 24 (5). М - маркерные белки (КДа): 92; 66,2; 45; 24,3; 12,5. Стрелками обозначены зоны, соответствующие колицину 1ъ(верхняя) и неполным продуктам гена колицина. См. также схему.

опубликованы результаты, полученные Варлеем и Булнуа /varley, Bouinois, 1984 /, согласно которым,клонированный авторши EcoRi -фрагмент (2,9 т.п.н.) плазмиды Со11Ъ-Р9 , несущий ген колицина, не определял иммунитет к колицину Ib . Этот вывод был сделан на основании анализа нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента и факта одновременной устойчивости клеток E.coü , содержащих плазмиду с клонированным фрагментом, к действию колицинов хь и 1в . Последнее характерно для хромосомных мутаций, приводящих к нарушении синтеза рецептора колицинов 1а и ХЬ , но не для иммунитета, связанного с коли-циногенной плазмидой. Мы подтвердили эти результаты.

Ген иммунитета к колицину ТЬ был обнаружен в Sali _ фрагменте плазмиды СоЦЪ размером около 22 т.п.н., клонированном ранее в нашей лаборатории на векторе pBR325 /Kopylov et al. , 1984 /. 3 этот фрагмент входит и EcoRI -фрагмент, содержащий ген колицина.

Было показано, что ген иммунитета плазмиды СоИЪ функционирует независимо от гена колицина. Этот вывод сделан в результате анализа полученных нами Со11Ъ::Тп5 мутантннх плазмид, среди которых было большое количество плазмид col~ imm+. Чтобы уточнить локализации гена иммунитета была начата работа по субклонкрованию Sali -фрагмента плазмиды. Но в это время появилась статья, в которой приводилась полная нуклеотидная последовательность генов колицина и иммунитета плазмиды Coirb / Manckovlch et al., 1986 /. Авторы показали, что эти гены располагаются рядом, но на разных цепях ДНК.

2. Плазмида ColD.

Эта плазмида относится к малым колициногенным плазмидам, ее размер 5,3 т.п.н. (рис.3). Для картирования генов, связанных с синтезом колицина D , был использован метод получения и анализа мутантных плазмид ColD:sTn5 , как и в случае плазмида pIV4I , Плазмида ColD и некоторые плазмиды ColDs:Тп5 были переданы в штата J. 925. На рис.4 представлены белки, синтезируемые в миниклетках, несущих эти плазмиды. На основании этих данных мы определили размер интактной молекулы колицина D (80 КДа), границы и направление транскрипции его гена.

Рис.3. Генетическая карта

плазмиды ColD. col - ген колицина, imm - ген иммунитета, lys - ген лизиса, orl - область, ответственная за инициацию репликации, v - сайт встройки Тп5, I, II и III - группы мутантов ColD:iTn5»

M I 23456 78

~ _ ш fcl г--_

— Ы & У эт - ss щ

'л H ■ J ) р ■

35с

и ее производные.

Рис.4."'"'Э-меченых полипептидов, синтезируемых в миниклет-ках, несущих плазмиды СоЮ I - СЫВ-, 2 - рРК1; 3 - рРК2; 4 - рВЙ325? и Со1С::Тп5 -плазмиды: 5 - I, 6 - 8, 7 - 19 и 8 - 42. М - маркерные белки ( КДа) : 116,2; 92; 66,2; 60; 45; 40; 25; 17,8 и 12,5. Стрелками указано полояение зоны колицина о и его незавершенных молекул.

При исследовании фенотипа, сообщаемого клеткам ColD::Тп5 мутантными плазмидами, оказалось, что все они, независимо от . способности синтезировать колицин и локализации встройки Тп5, ' . сообщали клеткам тиуштет к колицину d .

Для локализации гена иммунитета мы клонировали отдельно два фрагмента EcoRV плазмида ColD (рис.3) на векторе рВЯ325. Оказалось, что рекомбинантная плазмида, несущая EcoHV-фрагмент ColD размером 1,1 т.п.н. (рРК2), сообщала клеткам иммунитет к колицину D . Обе рекомбинантные плазмида - pPKI, несущая EooRV-фрагмент 4,2 т.п.н., и рРК2 - были переданы в шташ JC 925, полипептиды, синтезируемые в миниклетках, были проанализированы методом электрофореза в ПАДГ (рис.4). На рисунке видно, что плазмида рРК2, как и ColD и все плазмида с о ID: .-Тп5 (т.е. все imm+плазмида) определяют синтез белка с мол.массой около 10 ВДа, этого белка нет в клетках, несущих плазмида pPKI и pBR325 - не определяющие иммунитет. Эти данные показывают, что белок с мол.массой около 10 КДа является белком иммунитета. Описанные в литературе белки иммунитета других колициноген-ных плазгшд близки по размеру к этому белку.

Встройки Тп5 в ген колицина не влияют на выражение гена иммунитета, следовательно, ген иммунитета транскрибируется с собственного промотора независимо от гена колицина. Подтверждением этого служат данные по клонированию фрагмента, содержащего ген иммунитета.

При изучении поведения клеток, несущих плазмида ColD и ColD::?п5 в условиях индукции синтеза колицина, вызванной действием штомидана С, мы показали, что клетки с ColD гибли и лизировали в большей степени, чем бесплазмвдные или несущие

Та5 -плазмида (табл.1). Это-свидетельствует о том, что I) плазмида ColD ^ очевидно, содержит ген лизиса и 2) у всех полученных мутантов ColDг:Тп5 выражение этого гена нарушено.

Мы изучали таете выражение функции лизиса клеток , содержащих плазмида ColD и ColEl при действии еще одного индуктора синтеза колицина - хлорачфеникола. Это индуктор с иным .механизмом действия, чем митоиицин С - индукция синтеза колицина обусловлена подавлением (временным) синтеза белка (табл.2).

Было показано, что встрсгйки Тв5 в различные участки гена колицина приводят к вшшяению функции лизхса, т.е. наблядаетод

Таблица. I

Определение функции лизиса клеток E.coli, несущик плазмиду ColD и ее Тп5-проиэводные, при действии митомицина С (МС, I мкг/мл)

тч.от« ' ват™, ! Мутность ! Выживаемо

Шташ , Вариант , 4дЬтуры г (кл/ил)

СбОО +Ы0 3,50 I,4xI0V

СбОО(СоЮ) +MC 1,20 2,0xl03

C600(ColDi sTn5 I) +MC 3,15 0,5xI07

C600(CO1DJsTn5 8) ж 3,41 0,5xI07

C600 -uc 5,00 I.OxIO9

Таблица 2

Влияние хлораыфеникола (Х1Л, 100 мкг/мл) на лизис клеток E.coli , содержащих плазмиды ColD, ColEI.

Штамм

| Вариант j

Мутность культуры

тг

Выживаемость (кл/мл)

6,0x10'' 2,0хЮ7 6,0x10® 4,0x10®

C600(ColEI)

C600(ColD)

СбОО

СбОО(Со1Е1)

C600(ColD)

СбОО

+ХМ +ХМ +ХМ

-хм -хм

-»I

0,48 0,28 2,10 8,10 6,00 5,00

- клетки обрабатывали ХМ в течение 3 часов, затем отмывали от антибиотика, ресуспендировали в свежей питательной среде и доращивали в течение 3-4 часов.

полярный аффект мутаций в гене колицина на выражение гена лизиса плазмиды СоЮ . Встройки транспозона, не затрагивающие ген колицина, но нарушающие ген лизиса, располагаются за пределами меньшего ЕсоКУ -фрагмента плазмиды - во фрагменте ЕсоНУ(2)-РтгиИ (рис.3). Таким образом, можно полагать, что ген лизиса плазмиды СоЮ лишен собственного промотора, он функционирует в составе колицинового оперона и транскрибируется с промотора гена колицина, располагаясь за геном колицина.

Определив титр колицина Р в клетках, несущих плазмиду Сои) и некоторые ее производные, и в культуральной жидкости, мы показали, что клетки, содеряащие плазмиды с нарушенной функцией лизиса, накапливают большое количество колицина, высвобождение его из клеток затруднено (табл.3).

Таблица 3

Накопление колицина I) (титр) при обработке культуры митомицином С (Ш) в клетках (А) и в культуральной жидкости (Б).

Штамм { -тс 4 ч | +Ш 1.5 +МС 4 Ч

1 А ! Б : 1 А | Б | А ! Б

СбОО(СоЮ) 128 2 256 32 10000 128000

СбОО(Со1В::Тп5 I) 100 I 512 8 32000 2048

СбОО(СоХВ::Тп5 2) - - 512 8 32000 2048

Таким образом, можно полагать, что белок лизиса плазмиды СоИ) необходим для выхода колицина в среду.

В результате проведенных экспериментов был локализован ген колицина и показано, что гены, связанные с синтезом колицина располагаются в следующем порядке: ген колицина - ген иммунитета - ген лизиса. Показано также, что ген иммунитета локализован в Крп1-ЕсоКУ(2) -фрагменте•плазмиды и транскрибируется независимо от генов колицина и лизиса. Неясным оставалось направление транскрипции этого гена, т.е. на какой цепи ДНК относительно гена колицина он расположен.

Анализ последовательности нуклеогидов Крп1-ЕсоНУ(2)-

фрагмента плазмиды Со1Р.

Была определена последовательность 822 нуклеотидоз крпх-ЕсоН7(2 фрагмента плазмиды. Йо данным электрофореза беле:-: нитета к колицину в шлеет массу около 10 КДа. На обеих цепях

ДНК мы нашли несколько открытых рамок считывания, но гену белка шшуннтета могла соответствовать только одна, длиной 252 п.н. Перед геном иммунитета обнаружены характерные промоторные последовательности: -10, -35 и SD. Последовательности S03 -бокса мы не обнаружили. В конце гена иммунитета располагается инвертированный повтор и последовательность CACICA, которые могут служить

р -зависимым терминатором транскрипции. Ген иммунитета ColD располагается на той же цепи ДНК, что и ген колицина (рис.4,5). .

При сравнении аминокислотных последовательностей белков иммунитета плазмиды ColD и плазмид ColA, colEi, ColE2, ColE3 и cioDFl3 мы не смогли выявить сколь-нибудь заметной гомологии. Г.1ы провели сравнение нуклеотидных последовательностей генов белка иммунитета ColD и ColEI, ColE2, ColE3, CloDPI3 . Для некоторых участков этих генов была обнаружена определенная гомология (30 гомологичных нуклеотидов из 63 и 15 из 31).

Кроме гена иммунитета, мы обнаружили в исследуемой последовательности открытую рамку считывания для белка состоящего И8 55 аминокислот. Перед этим гипотетическим геном располагаются последовательности, которые могли бы служить последовательностями SD , -10 и -35. "Ген" располагается на той же цепи ДНК, что и гены колицина и иммунитета, между ними. Функция этого "гена" была неясна. Могло было предположить, что обнаруженный наш ген обеспечивает иммунитет к какому-нибудь колицину, по аналогии с плазыидой Со1ЕЗ , которая кроме гена иммунитета к колицину ЕЗ, несет еще и ген иммунитета к колицину Е8. ¡Лы исследовали устойчивость клеток с ColD и рекомбинантной плазмидой, содержащей изучаемый Kpnl-EcoRV(2) -фрагмент, к колицинам, синтезируемым штаммами из коллекции Пагсли /Pugaley, 1985 / и некоторыми другими. Оказалось, что этот фрагмент, как и целая плазмида ColD , обеспечивал клеткам устойчивость не только к колицину D, но и колицину Н. Возможно, что именно обнаруженный в исследуемом фрагменте "ген" отвечает за устойчивость к колицину Н.

Анализ нуклеотидной последовательности гена белка

лизиса плазмиды сот.

Как было показано, встройки Тп5 , нарушающие выражение гена белка лизиса, локализованы за пределами меньшего EcoRV-фрагмента плазмиды в соседнем фрагменте EcoRV(2)-PvuII. í¡ этом фрагменте располагается область, ответственная за иници-

- 1Э -

-35 -Ю SD

51,..IAAIGGCIGAATTTAITIAOAGACAGGTGAACIATGAAIAAGATGGCA

met lie asp leu ala lys leu pile leu ala ser lys lie thr val ATO АТС GAT Ий GCG AAA TTA TIT TTA GOT ICG AAA ATI АСА GIG

lie glu phe eer glu arg ile cys val glu arg arg arg leu tyr All GAG TTT TCA GAG CGA ATI TGT GIT GAA CGG AGA AGA ITG TAT

gly val lys aap leu ser pro aan ile leu asn cys gly glu glu GGI GTT AAG GAT TTG TCI CCG AAT ATA TTA AAT IGT GGG GAA GAG

leu ser net ala ala glu arg phe glu pro авр ala asp arg ala TTG TCI ATG GCT GCT GAG CGA TIT GAG CCT GAT GCA GAT AGG GCI

aan tyi* glu lie asp asp aan gly leu lys val glu val arg aer AAT TAT GAA ATT GAT GAT AAT GGA CTT AAG GIC GAG GIC CGA TCT

ile leu glu lye leu lys ser *

АТС TTG GAA AAA CTT AAA TCA TAAICATGAGTGAIIITAATATCTGGCATITA AGTAIAAATGTCAGAIATTCACTCAIGC,..3»

Рис. 5 . Нуклеогиднал последовательность участка ДНК

плазмиды ColD, содержащего ген белка иммунитета. Сверху над строкой - последовательность аминокислот белка иммунитета. Стрелками и рамкой обозначен возможный р -зависимый терминатор транскрипции.

Рисунок G.

Сравнение нуклеотидных последовательностей генов белков лизиса и аминокислотных . - последовательностей соответствующих белков плазмидн ColÜ и других плазмид.

£ 10 ' ColA Met Lys Lys Ile Ile Ile Cys Val Ile Leu Leu Al

ColEI■ Met Arg Lyc Lys Phe Phe Val Gly Ile Phe Al ColE2 Met Lys Lys IJ.e Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala

CI0DFI3 ColD

ColA

ColEI

ColE2

C10DFI3

ColD

Lys IJ.e Ile Ile Thr Gly

Met LysLya. l£u Phe Ile Leu Ile Val

Ala Lys Ala Ile HTe *********

-20-

Ala Cys Gin Val Asn Asn Val Arg Asp Gly Cys Gin Ala Asn Туг Ile Arg Asp Ala Cys Gin Ala Asn Туг Ile Arg Asp Ala Cys Gin Ala Asn Туг Ile Arg Asp Ala Cys Gin Ala Asn Туг Met ¿SS-

Val Val

Tbr Gly Val Gin Val Gin Val' Gin

Ser

Ale

lie

Val

Phe Arg Elu Glu Gin

-30

Gly Gly

Gly Gly

Gly Gly

Gly Gly

Gly Gly

40

CoU Ser Ser lie Val Tbr Gly Val Ser Met Gly Ser Asp

ColEI Ser Ser Ser Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ala Val Val

Со1Е2 Ser Ser Tbr Ala Glu Val Ihr Gly Leu Ala Val Gln

CI0DFI3 Ser Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gly Ile Ala Val Gln

ColD Ser Ser Ser Ser Lys Leu lie Gly Met Ala lie Gln

Met Leu Leu Ala

Asn Leu Leu •Val

Ile lie Leu Ser

Phe Leu Leu Val

Leu Cys Leu Thr

Ser Val Ser Ero

Thr lie Ala Pro

Thr Val Ser Pro

Thr Val Ala Pro

Ser Leu Pro Pro

50

Стрелкой отмечено действие сигнальной пептидазн.

ген

лизиса ile gln *

TfA/ C+GÍ Ti A-T G-C 0-0 A-T A-T

-10

РНК .II

ATT CAG TAG ААААТАШТ A_T tTTCClGCGCGTAATCTGCTGGCCTG^AACAAA

Рио.7. Перекрываше последовательностей ^»-независимого

терминатора транскрипции гена лизиса и -35 промотор-ной области праймерной РНК плазмида, ColD.

ацию репликации плазшщы, его нуклеотидная последовательность была определена ранее в нашей лаборатории В.В.Зверевым. Мы проанализировали эту последовательность с целью найти в ней ген лизиса плаамиды. Все известные плазмидные белки лизиоа проявляют высокую степень гомологии - в них существуют блоки гомологичных аминокислот. 120 нуклеотидов этой области кодируют последовательность аминокислот, гомологичную белкам лизиса. Мы полагаем, что это С-концевая область гена белка лизиса плазмиды (рис.6), в конце гена лизиса плазыида ColD (рис.7) располагается инвертированный повтор и блок из шести Т. Эта структура полностью идентична р -независимому терминатору транскрипции гена лизиса плазмиды ColEl . ¿Интересно, что этот повтор перекрывается с -35 иромоторкой областью праймерной РНК (РНК П), участвующей в инициации репликации плаамиды. Такое перекрывание не уникально - оно описано и для плаадд ColEI и C!oDFI3.

Если белки лизиса различных длазмид обнаруживают высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей, то для белков иммунитета подобной гомологии обнаружено не было. Это вероятно, свидетельствует об универсапьнооти способа высвобождения колицинов из клеток и высокой специфичности системы иммунитета к колицинам.

Анализ полипепгидов, синтезируемых в клетках Е.coll,

содержащих плазмиды ио-ш и ¿Ь-Ш:

при индукции синтеза колицина митомицином С.

Было показано, что ген белка иммунитета плазмиды ColD расположен на той же цепи ДНК, что и гены колицина и линией, между ними. Г.1ы нашли также, что при действии митомицина С на клетки с плазмидой ColD в них происходит индукция синтеза колицина и белка лизиса. Ген белка иммунитета имеет собственный промотор, но "территориально" входит в состав колицинового оперона. Чтобы узнать, индуцируется ли синтез белка иммунитета при индукции синтеза колицина и будет ли его ген транскрибироваться в составе колицинового оперона, мы проанализировали белки, синтез которых индуцируетоя при обработке клеток митомицином С. С этой целью использована методика, позволяющая обнаружить только те белки, синтез которых индуцирован. На рио.8 представлено схематичное изображение разделения белков, синтезируемых в бесплазмадных клетках и клетках, содержащих плазмиды

I*

i

Б 1,5 ч 1ч 1,5 ч

——г-.»».—-'« yyt-q А 1,5 ч

I' ■I**.'.*'

« t?*

vas» I-ï w *** * еокда g»

«йв»

» _ r Î i-z vJ ; - -- ¿J*

♦ - ? __ " ". " Г1 _ ¿-"5 ' — -г ГГ V•

гг sg ^ ^ У--~ ^ Щ

—: - 'tr

Й - - « <1

- — 1

10 КДа

I 2

2

5

Рис.8. Радиоавтограф полипентвдов, синтез которых" индуцируется в клетке

действием митомицина С. ' А. Полипептиды,- обнаруживаемые в клетку через Щш| вв«улетки,

Б. Полипептады, обнаруживаемые в Ж *

введения метки. I - клетки без и^э^щ, 2 - с ^ашдои + + L }

Клетки с плаз;.эда-.ш CotD::Tn5 : 3. - Ucct wm c^s ь

5 - 8( cot" imm' tyS" ) и 6 - 42( Cot .mm+ tyS ).

?sos(I) Vr) V2)

V/k co1 . ? YA

■KI)_P(2)

r(i) T(2)

I coi 11 группа

PCI) T(I) T(2)

j col CIODFI3.

P(I) ,___P? T(I) T (2)

I col J7ñS> pys^. C0LS2

P(I) P(2) T(I)p T T(2)

col C0LE3

H ►d <<!

Я

Я p

Рис.9 . Схематическое изображение структуры колициновых оперонов. col - ген колицина, 1ша ген иммунитета, lya - ген лизиса. Р - промотор,

Т - терминатор транскрипции.

ColD, ColDs : Tn5 I, 2 <col+imra+lys") ; 8, 42 (col*"imm+lys~). Видно, что в клетках, синтезирующих колицин ( с плазмидами ColD I и 2), индуцируется синтез бежов - с мол.массой 80 КДа (колицин) и около 10 КДа. Этих белков нет в клетках несинтезирующих колицин (без плазмид и с плазмидами 8 и 42). В культуральную -жидкость эти белки выходят только в случае плазмида ColD ; из клеток с плазмидой I происходит лишь небольшая утечка колицина, а бежа 10 КДа з культуральной нздкости не обнаруживается. Следовательно, при действии митомицина С в-клетках с плазмздой ColD происходит индукция синтеза колицина и белка, ген которого находится в одном опероне с геном колицина, т.к. повреждения гена колицина запрещают индукции синтеза этого белка. Поскольку по мол.массе этот белок соответствует белку иммунитета ColD и он обнаруживается в клетках, несущих плааглда iат+ lys", то этот белок может быть лишь белком иммунитета.

Следует отметить, что отдельной зоны для белка лизиса плаз-миды ColD нам так и не удалось обнаружить электрофоретячесяи ни в миниклетках, ни среда белков, синтез которых индуцируется при действии митомицина С. ¡Ложно предположить поэтому, что балок лизиса ColD по размеру близок к белку иммунитета.

smmssïs

• Итак, мы показали, что у плазмида ColD гены колицина, иммунитета и лизиса располагаются на одной цепи ДНК, образуют один оперон и при индукции синтеза колицина транскрибируется с колицинового sos-зависимого промотора. В норме синтез колицина и белка лизиса репрессирован, а ген иммунитета транскрибируется конститутивно с собственного sos-независимого промотора (рис.S). Полученные нами данные о локализации генов колицина, иммунитета и лизиса плазмида ColD были подтверндены в работе Фрея и соавт./Ргеу et al., 1986/.

У плазмида СоНЬ.гены колицина и иммунитета расположены на разных цепях ДНК; в условиях индукции синтеза колицина выра-яение гена иммунитета не зависит от выражения гена колицина.

Все изученные в настоящее время колициногенные плазмида по принципу организации генов, связанных с синтезом колицина, М0.7Л0 разделить на два класса. Первый класс образуют плазмида CI0DF13, coiE2, Со1ЕЗ , сюда же относится и плазмида ColD, т.е. такие плазмида, у которых эти гены организованы в один

оперон, и при индукции синтеза колицина индуцируется синтез всех.трех белков. Ко .второму классу относятся плазмида ColEi, ColA, Colla и Coirb . Ген иммунитета у них расположен на противоположной цепи ДНК относительно гена колицина, и при индукции синтеза колицина синтез белка иммунитета не индуцируется. Выражение гена иммунитета таких плазмад не зависит от выражения гена колицина.

Обращает на себя внимание, что колицины, определяемые пла-змидами второго класса, действуют снаружи - на цитоплазматичес-кую мембрану, т.е. внешнюю мишень, тогда как колицины, определяемые плазмидами первого класса, действуют на внутреннюю мишень (ДНК, РНК), расположенную внутри клетки. При этом белок иммунитет0, по-видимому, может защитить мишень от внутриклеточного колицина. Механизм иммунитета к колицинам плазмид I класса сводится к нейтрализации колицина белком иммунитета, в результате образуется неактивный комплекс, в котором молекулы колицина и белка ишунитета находятся в соотношении 1:1. Поэтому для защиты колициногенной клетки от собственного колицина синтезы колицина и белка ишунитета долкны быть скоординированы.

Однако, в условиях интенсивного синтеза колицина, при его индукции, колициногенные клетки погибают, и поэтому вызывает сомнение целесообразность существования таких защитных механизмов. По нашему мнению, защита клетки от внутриклеточного колицина мокет быть необходимой в двух ситуациях. Во-первых, если в клетке, как мы предположили, происходит фоновый синтез колицина, то этот колицин должен быть нейтрализован внутри клзтки. Во-вторых, синтез колицина - свойство, полезное для популяции. ■Поэтому в "интересах" популяции бактерий (а, следовательно, и популяции плазывд), чтобы клетка перед тем, как погибнуть, успела синтезировать достаточное количество колицина. Скоординированный синтез колицина и белка ишунитета в этих условиях необходим для того, чтобы защитить ДНК и белок-синтезирующий аппарат клетки.

Колицины, мишенью действия которых является мембрана, по-видимому, не поражают колициногенную клетку изнутри - они действуют на клетки снаружи. Механизм иммунитета к таким колицинам до конца не ясен. Показано, что колицин, синтезирований при индукции, не образует комплеко о белком иммунитета, а мо-

лекулы белка иммунитета обнаруживаются в мембране. Показано также, что необходимо непосредственное взаимодействие колицина с белком иммунитета. Так или иначе, скоординированный синтез этих двух белков в случае шгазмпд II класса необязателен.

Такт/ образом, на основании этих данных можно предположить, что именно расположение мишени действия колицина является определяющим при "выборе" плазмидой принципа организации генов, связанных с сшзтезом колицина. Если это предположение действительно верно, го возможно прогнозирование структуры колицинового оперона неизученной плазмиды на основании данных о механизме действия определяемого- ею колицина и наоборот.

ШВОДЫ

1. Определены локализация и направление транскрипции гена колицина ib.

Показано, что полиция хь имеет мол.ыасау 69 КДа.

2. Показано, что клетки, содержащие рекомбинантную мультикопий-ную плазмзду с клонированным геном колицина хь , но без гена иммунитета, могут существовать, однако, в культуре быстро селектируются мутанты, устойчивые к колицину ib.

3. Установлено, что плазмида ColD определяет синтез белка лизиса, обуславливающего гибель и лизис клеток при индукции синтеза колицина. Этот белок ответственен за выход колицина из клетки.

4. Локализованы гены плазмида ColD , функционально связанные с синтезом колицина, - гены колицина, иммунитета и лизиса. Идентифицированы колицин D (80 КДа) и белок иммунитета к этому колицину (около 10 КДа).

5. Определена последовательность нуклеотидов области плазмиды ColD , содержащей ген иммунитета. Показано, что ген иммунитета к колицину D имеет собственный зоэ-независимнй промотор и располагается на той же цепи ДНК, что и гены колицина и лизиса, между ними.

6. Наблюдается высокая степень гомологии белков лизиса плазмиды ColD и других колициногенных плазмид; для белков иммунитета подобной гомологии обнаружено не было.

?. При индукции синтеза колицина о в клетке индуцируется синтез колицина, белка иммунитета и белка лизиса; гены, определяющие синтез этих белков, функционируют в составе коли-

цинового оперона, траяскрибируясь о sos -зависимого промотора гена колицина. Определена тонкая структура колидиново-го оперона плазмида ColD,

8. Высказана гипотеза о зависимости типа организации генов, связанных с синтезом колицина, от расположения мишени действия колицина.

Публикации, в которых отражены основные научные результаты диссертации.

1. Пшенникова Е.С., Колот ¡Л.Н., Воробьева И.П., Липасова В.А., Хмель И.А, Изучение организации генов, ответственных за

• синтез колицина 1Ъ и иммунитет к нему, в плазшде Colib-pg //Генетика.-1985.-Т.21.-С.541-547.

2. Пшенникова Е.С., Липасова В.А., Колот М.Н., Хмель И.А. Организация и экспрессия генов плазмида C0ID-CA23 , связанных с синтезом колицина/Денетика.-1986.-Т.22.-С.733-740.

3. Пшенникова Е.С., Колот L1.H., Хмель И.А. Структурная и функциональная организация колицинового оперона плазмида ColD- . СА23 /Д1ол. биология.-1987.-Т. 21, Jí6.-С. 1560-1566.

4. Пшенникова Е.С., Колот М.Н., Воробьева И.П., Липасова В.А. Организация генов плазмида Со11Ь-Р9 , определяющих синтез колицина и иммунитет к нему//Тезисы IX Всесоюзного совещания по программе "Плазмида".-Пущино-ка-0ке,1984.-С.58,

5. Пшенникова Е.С., Колот М.Н., Хмель И.А. Изучение генетической организации плазмида ColD-CA23 //Те висы X Всесоюзного совещания по программе "Плазмида".-Пущино-на-^Оке,1985 .-С.144.

6. Пшенникова Е.С., Хмель И.А. Организация генов плазмид ColD-СА23 и СоИЪ-Р9 , связанных с синтезом колицинов// Тезисы 1У Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов".-Москва,I987.-C.178-179.

7. Хмель И.Д., Пшенникова Е.С., Колот М.Н. Организация и экспрессия генов колициногенной плазмида ColD-CA23 , связанных с синтезом кодкцйка//Тезисы Международного симпозиума "Физико—химия ДШ и молекулярные механизмы функционирования генома" .-Килиси, 1987.-С. I3I-I32.

8. Хмель И.А..Зверев В.В..Пшенникова Е.С..Липасова В.А..Копылов В.М..Воробьева И.П. Молекудярно-генетический и функциональный анализ колицаногешшх плавшд//Тезасы У Съезда ВОГИС. -}&>сква,1987.-Т.5.-С.94-95.