Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полинуклеотидные индукторы интерферона. Ферментативный синтез и устойчивость к нуклеазам крови

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Полинуклеотидные индукторы интерферона. Ферментативный синтез и устойчивость к нуклеазам крови"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

„. г ,, . На правах рукописи

у ». ь - ^ 'V

Л Л ? Г Т ' ........

Г. о -------

СУРКИК Марина Аркадьевна

ПОЛИНУКЛЕОТИДКЫЕ ИНДУКТОРЫ ИНТЕРФЕРОНА: ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ И УСТОЙЧИВОСТЬ К НУКЛЕЛЗАМ КРОВИ

(специальность 03.00.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в лаборатории биополимеров Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. В.П. Константинова РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Тимковский А. Л.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

главный научный сотрудник, профессор Роэенгарт Е.В.,

кандидат биологических наук, доцент Скворцевич Е.Г.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургскиий химико-

фармацевтический институт из МП РФ.

Защита диссертации состоится "Не" НЧ<М^>Л\1995 г. в \(о час, на заседании диссертационного Совета К.063.57.09 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9, биолого-почвенный факультет, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке СПбГУ.

Автореферат разослан " Ученый секретарь

диссертационного Совета А.Г.Марков.

- 1 -ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. С открытием полинуклеотидфосфорилазы - фермента, катализирующего поликонденсацию рибонуклеозидди--фосфатов, появилась возможность получения высокомолекулярных полирибонуклеотидов различного состава. Синтетические поликукле от иды интересовали исследователей как модельные соединения, с помощью которых можно получить информацию о различиях структуры ДНК и РНК, они использовались в расшифровке генетического кода и в изучении биосинтеза белка.

Открытие в 1967 году интерфероногенных и противовирусных свойств у двунитевого полирибонуклеотидного комплекса по-ли(И)•поли(Ц) ознаменовало новый поворот в исследовании комплексов синтетических комплементарных полирибонуклеотидов. Стали разрабатываться новые методы синтеза полирибонуклеотидов, изучаться условия комплексообразования, структурные особенности, необходимые для проявления интерферон-индуцирующей активности. Целью всех этих исследований является создание наиболее активных и наименее токсичных индукторов интерферона.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в выделении и очистке интерферонов, а также в их получении с помощью методов генной инженерии, продолжает оставаться актуальным использование индуктороЕ интерферона, вызывающих образование в организме эндогенного (собственного) интерферона. Отчасти это связано с недостатками экзогенного интерферона. Введенный в орг яизм, он быстро гидролизуется. Поэтому высокую концентрацию интерферона в организме удержать неьолможно, а Сольшие дозы вводить опасно из-за его токсических эффектов.

Кроме того, интерферон является чисто терапевтическим средством применение которого необходимо в острой фазе заболевания, особенно в случае опасности для жизни больного. Индукторы же незаменимы для профилактической защиты организма от возможной инфекции, в том числе в тех случаях, когда тип вируса, представляющего потенциальную опасность, еще точно не определен. Такая профилактическая подготовка к встрече надвигающейся инфекции может осуществляться г. течение достаточно большого срока, охватывать большие людские контингент», и при этом она может быть выполнена при умеренных финансовых затратах.

Очень важно также, что, кроме интерферон-индуцирующей и противовирусной, двунитевые полирибонуклеотидные комплексы обладают также имунностимулирутощей, противоопухолевой и радиопротекторной активностями.

Наконец, исследование полирибонуклеотидных комплексов как индукторов интерферона остается актуальным и в теоретическом плане, т.к. изучение их структурных особенностей необходимо для расшифровки молекулярных механизмов их взаимодействия с чувствительными клетками и выработки этого защитного регуляторного белка.

Основные задачи работы

1. Изучение ферментативного синтеза полирибонуклеотидных сополимеров различного состава, предназначенных для исследования структуры комплексов и целенаправленного получения новых типов противовирусных препаратов.

2. Изучение синтеза комплекса поли(Г)*поли(Ц) при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы, его исследование и доказательство его максимальной структурной упорядоченности и возможности применения в качестве стандарта при анализе дефектов структуры полирибонуклеотидных индукторов интерферона.

3. Исследование чувствительности перспективных для клинического применения полирибонуклеотидных индукторов интерферона различного происхождения к рибонуклеазам человеческой крови и оптимизация способов их защиты.

Научная новизна работы

Впервые изучены закономерности синтеза ряда сополимеров -нуклеотидных модификаций гомополимера поли(Ц) с помощью полипу клеотидфосфорилазы из термофильного микрорганизма Thermus thermophllus.

Впервые проведено подробное сравнительное изучение гомогенного и гетерогенного синтеза с определением нуклеотидного состава сополимера поли(Ц,У), синтезируемого как растворимыми, так и иммобилизованными полинуклеотидфосфорилагами из мезофиль-кых (Е. coli) и термофильных (Т. thorrr-ophllus) бактерий.

Впервые при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы был получен комплекс поли(Г)-поли(Ц), который превосходил по активности в культуре клеток комплекс поли(И)-поли(Ц), а также исследована

его структура, доказаны упорядоченность и-возможность использования его з качестве стандарта при структурных исследованиях.

Впервые было: а) проведено исследование стабильности природных индукторов интерферона двунитевых РНК - ларифана и ри-достина к действию нуклеаз крови человека; б) доказано, что КЩ с полилизином не препятствует у них проявлению интерферон-индуцирующей активности, а обеспечивает значительную защиту от нук-леаз крови; в) показано, что только полигуацил не нуждается в защите от нуклеаз крови человека; г) установлено, что наибольший защитный эффект обеспечивает полилиаин с молекулярным весом 12300.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в докладах на научных семинарах лаборатории биополимеров и Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 146 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Синтез полирибонуклеотидов проводили реакцией поличонденса-цией нуклеозид-Ь'-дифосфатов в присутствии ШФазы из Е. coll или Т. thermophllus при 37° С или 65° С, соответственно. Содержанке НДФ в реакционной смеси - 10 или 20 мкмоль/мл. Количество неорганического фосфата в пробах определяли по методу Фиске-СуО бароу.

Основную часть полирибонуклеотидов синтезировали из НДФ в режиме проточного твердофосф^тного синтеза с помощью иммобилизованной бактериальной полинуклеотидфосфорилазы.

Для определения нуклеотидного состава гетерополирибонуклео-тидов реакционную смесь пропускали через сефадекс G-50 для отделения полимера от НДФ, полимер гидролизовали в 0,25 М КОН, обрабатывали щелочной фосфатазой.Смесь образующихся после действия фермента нуклеозидов разделяли ионообменной хроматогрлфи-

ей на колонке со смолой "Ат1пех С}165" (Биорад, США) при температуре 45° С. Регистрации вели с помощью оптического блока "Милихрома" при длине волны 260 нм. Мольную долю кладого компонента в анализируемом продукте определяли по площади пика с учетом молярной экстинкции при данной длине волны и рН 9,8.

Концентрацию РНК-полимеразы, необходимую для эффективного матричного синтеза поли(Г) и кинетику синтеза определяли в реакционных смесях с добавлением 14С-ГТФ.

Препаративный синтез комплекса поли(Г)-поли(Ц) проводили в инкубационных смесях объемом 20 мл. После завершения синтеза реакционную смесь депротенизирозали и диализовали.

Подготовку образцов для электронной микроскопии проводили по модифицированной методике Кляйншмвдта-Дэвиса.

Для приготовления ЛГЦ - аффинного сорбента для связывания поли(Ц) использовали с некоторыми модификациями методику иммобилизации ДНК.

Определение чувствительности полирибонуклеотидных индукторов интерферона к цуклеазам крови человека определяли следующим образом: 1. Через определенные промежутки времени после начала инкубации препаратов сывороткой крови измеряли ОП кислото-растворимой фравдии. 2. В пробах, отобранных через 1 ч и 24 ч после начала инкубации препаратов с сывороткой, регистрировали профили гель-хроматографии на колонке с сефарозой СЬ-4В в стандартных условиях. 3. Через 4 и 24 часа инкубации препаратов при 37°С с равным объемом сыворотки крови определяли их интерферон-индуцирующую активность в организме белых мышей линии ВаЬВ/с.

Экранирование комплексов полирибонуклеотидов и природных 2-спиральных РНК препаратами полилизина в присутствии карбокси-метилцеллюловы проводили по методике Леви, модифицированной Тимковским и др.

РЕЗУЛ' ТАШ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Синтез соподимеров.

Синдром приобретенного иммуноь-фндита (СГЩ) является инфекционным заболеванием, которое вызывается вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и пораялст систему шуточного иммунитета. В последнее ¡?ремя выяснено, что комплексы синтетических полирибонуклеотидов - поли (А) -поли (У), поли (И) • ноли СЦ). а так»-- Амплиген -

модифицированный поли(И)-поли(Ц), в котором нить поли(Ц) содержи1? вставки" некомплементарных инозину нуклеозидов, не только являются активными индукторами интерферона, но и ингибируют размножение ВИЧ в Т-лимфоцитах и в клетках крови пациентов со СПИД.

Синтез Амплигена или его аналогов требует точного задания соотношения нуклеотидов в сополимерах. Известно,что при синтезе с помощью ГШ некоторых типов сополимеров соотношение мономеров в них может отличаться от соотношения соответствующих нуклеозид дифосфатов (НДФ) в исходной реакционной смеси, подчиняясь определенным закономерностям. Одной из главных наших задач и было определение таких закономерностей при синтезе некоторых сополимеров при помощи полинуклеотидфосфорилазы,выделенной из thermus thenrophilus.

В таблице 1 приведены результаты измерений зависимости нук-леотидного состава синтезированных сополимеров - f от состава начальной смеси для трех пар НДФ - F. Все данные относятся к сополимерам на основе поли(Ц), т.к. они представляют для нас практический интерес. Параметр К - f/F показывает степень отклонения мономерного состава синтезируемого сополимера от соотношения нуклеозиддифосфатов в исходной реакционной смеси. Для сополиуеров поли(Ц,А) и поли(Ц.Г) К < 1 независимо от того, какой из НДФ задавался в исходную реакционную смесь в избытке, т.о.

ЦДФ включается в продукт синтеза в меньших количествах, чем задается в исходную реакционную смесь. Для сополимера поли(Ц.У) в области, где е исходную реакционную смесь в избытке задается ЦДФ, мы наблюдаем такую же зависимость, но когда переходим в область избыточного содержания в исходной реакционной смеси УДФ, то наблюдаем отклонение от вышеуказанных зависимостей.

Поскольку полученные зависимости для сополимеров поли(Ц,Г) и поли(Ц,А) мало отличались от данных других авторов, а также поскольку нам нужно было сополимер поли(Ц.У) синтезировать в препаративных количествах, мы провели более подробное сравнительное изучение синтеза сополимера поли(Ц,У) иммобилизованной и свободной поликуклеотидфосфорилазой термофильного и мезофильно-го происхождения, т.е. выделенных из микроорганизмов Thermus thermophilus и Е. coll.

Таблица 1

Зависимость нуклеотидного состава сополимеров от состава начальной субстратной смеси

Тип Начальное Соотношение

сополимера соотношение компонентов К-Г/?

компонентов в полимере

(Р) (Г)

99:1 50,0:1 0,50

49:1 22,5:1 0,46

24:1 16,0:1 0,67

22:1 14,0:1 0,64

Ц:Г 10:1 7,7:1 0,77

9:1 4,0:1 0,45

4:1 2,5:1 0,62

1:1 1:1,5 0,67

1:4 1:6,3 0,63

19:1 13,5:1 0,71

14:1 9,1:1 0,65

Д:У 10,8:1 7,8:1 0,72

4:1 3,3:1 0,82

1:1 1:1,4 0,72

1:8 1:6,4 1,20

10:1 7,8:1 0,78

Ц:А 4:1 2,1:1 0,52

1:1 1:1,5 0,65

1:8 1:10,6 0,76

На рис. 1 и 2 представлены зависимости К от Р. Эти зависимости имеют очень сложный характер и отличаются для мезофильного и термофильного фермента. Структурные изменения, которые фермент претерпевает в ходе иммобилизации, также сказались и на соответствующих зависимостях. Они отличаются для свободного и иммобилизованного фермента.

Тем не менее, полученные зависимости позволяют осуществлять программируемый синтез сополимеров различного состава при варьировании соотношений между компонентами в .широком диапазоне.

РИС. 1.

Зависимость параметра К - Г/Г от Г для полинуклеотидфосфорилазы из Е. соП.

Г - мольное соотношение ЦЦФ/УДФ в начальной субстратной смеси, Г - соотношение Ц/У в полимерном продукте. 1 - растворимый фермент, 2 - иммобилизованный фермент.

Рис. 2.

Зависимость К от Р для полинуклеотидфосфорилазы из Т. (.ЬегторЬПиэ. Обозначения идентичны рис. 3.

Одним из итогов данного раздела работы было осуществление препаративной наработки сополимера поли(Ц.У) с определенным соотношением мономеров и приготовление комплекса - аналога амплиге-на, который был передан для испытаний в культурах лимфоцитов в НИИ эпидемиологии и.микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. Испытания показали, что этот комплекс сильнее подавлял размножение вируса иммунодефицита человегл в культуре клеток, чем контрольный препарат амллигена, синтез которого также был осуществлен в строго идентичных условиях. Приготовленный комплекс является предметом патентной заявки, которая находится в стадии офрмления.

2. Матричный синтез комплекса поли(Г)-поли(Ц)

Обычный метод получения полирибонуклеотидных комплексов смешением комплементарных гомополимеров из-за неизбежной полидисперсности синтетических полинуклеотидов (длина цепи при ферментативной поликонденсации не стандартизуется) и отсутствия строгой фиксации их взаимного расположения обязательно приводит к образованию в макромолекулах комплексов тех или иных нарушений регулярности и;х структуры (петель, разветвлений, однонитевых участков и т.п.) . Поэтому, хотя комплекс поли(Г)-поли(Ц) теперь легко получить традиционными методами , его матричный синтез представлял для нас особый интерес как способ получения идеально регулярного комплекса, который можно использовать в качестве стандарта при исследовании структуры и биологической активности полирибонуклеотидных индукторов интерферона.

Пг^жде всего по уровню и кинетике включения радиоактивной метки 14С из ГТФ в кислотонерзстворимую полимерную фракцию были определены условия осуществления наиболее полного синтеза нити поли(Г) из ГТФ на матрице поли(Ц). Из рис. 3 видно, что реакция проходит эффективно при концентрации поли(Ц) 0,15 мМ и 10-кратном молярном избытке ГТФ. Повышение концентрации поли(Ц) вплоть до уравнивания ее с концентрацией ГТФ (1,5 мМ) резко сникает эффективность реакции. Подсчет на основании измерений включения метки количества вошедшего в состав полимера гуано-зин-монофосй та показывает, что оно практически равно количеству введенной матрицы поли(Ц), т.е. имеет место полное прочиты-вание матрицы.

Подробный анализ распределения веществ в инкубационной смеси

нерастворимую фракцию.

1 - концентрация ГТФ - 1,5 мМ, поли(Ц) - 0,15 мМ.

2 - концентрация ГТФ - 1,5 мМ, поли(Ц) - 1,5 мЧ.

в ходе реакции был проведен с помощью гель-хроматографии на се-фарозе 2В. На этом геле без удержания элюируется лишь комм-плекс, а остальные компоненты, в том числе и поли(Ц), фракционируются. Продукт синтеза был выделен после завершзния препаративного синтеза, депротеинизации и диализа.

Спектр поглощения очищенного продукта реакции в УФ области полностью идентичен спектру комплекса поли(Г)-псли(Ц).

При электронномикроскопическом исследовании в белковом .монослое продукт реакции выглядит аналогично двунитевой РНК или Д}:к (рис. 4а). Видно, что степень разветвленности и агрегация в этом препарате минимальны в сравнении с комплексгл< поли(Г)-по-ли(Ц), полученным традиционным методом смешения комплементарных полинуклеотидов (см. рис. 46). Таким образом, есть все основания считать высокомолекулярный продукт матричного РНК-полиж -разного синтеза двунитеЕЫМ комплексом поли(Г)-полиСЦ).

В ходе дальнейшей работы мы столкнулись с тем фактом, что степень завершенности синтеза зависит от коммерческой партии ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Для того, чтобы выяснить присутствуют ли при неполном матричном синтезе в реак.'з:еннс;': сыс-ги г а< и не вступившие в реакцию молекулы матрицы поли; 13) или ж-.? км? ются неполностью прочитанные молекулы матрицы, т.е. чзсти*»г5>--комплексы, мы использовали аффинный сорбент пели (Г) -ц-гдлол-^у. Используя спектрофотометрические методы (по убыли СП), а также тот факт, что радиоактивная метка из 3Н-ГТФ Екедряетсл

Рис.4а. Электронномикроскопическая фотография препарата очищенного продукта РНК-полимеразной реакции.

Рис.46. Электронномикроскопическая фотография препарата комплекса поли(Г)•поли(Ц), полученного традиционным методом.

- 11 -Таблица 2.

Радиоактивность кислото-нерастворимой фракции (имп/мин) продукта матричного синтеза до и после взаимодействия с ПГЦ

Продукт неполного (502) синтеза Продукт полного синтеза 1

До взаимодействия с ПГЦ После взаимодействия с ПГЦ До взаимодействия с ПГЦ После взаимодействия с ПГЦ

2184 ± 18 1034 ± 12 1705 ± 16 1715 ± 16 [

в нить поли(Г), можно однозначно различить поведение полиШ) -полностью свободной и в составе комплекса. На рис. 5 представлен профиль гель-хроматографии продукта неполного (507.) матричного синтеза до обработки поли (Г)-целлюлозой и после н>,е. Длн ные таблицы 2 показывают, что после обработки неполного продукта матричного синтеза количество радиоактивной метки в кислото-нерастворимой фракции уменьшилось в два раза, тогда как обработка продукта 1002-го матричного синтеза не приьела к иг нию количества метки. Из этого следуем, что при лйзаЕию--н:!о!/ матричном синтезе б реакционной смеси имеется гчаччт<лшк.<е ко личеетво дефектным комплексов с неполным прочтенном митг иш, т.е. со значительными участками незаполненной поли(Ц). Именно

такие незавершенные комплексы, наряду со свободной поли(Ц), связываются с аффинным сорбентом.

Далее мы сравнили противовирусную активность в культуре ткани эмбрионов кур: а) продукта матричного синтеза, б) комплекса поли(Г)-поли(Ц), полученного традиционным способом смешения комплементарных "омополирибонуклеотидов и в) коммерческого препарата поли(И)•поли(Ц). Результаты испытаний показали, что, в отличие от данных других авторов, комплекс поли(Г)•пояи(Ц) -продукт матричного биосинтеза по противовирусной активности в культуре ткани не только не уступает комплексу поли(И)-полиЩ), но даже превосходит его. В то же время традиционные препараты поли(Г)-поли(Ц) были намного менее активны.

Сопоставление этих данных с полученными в работе экспериментальными результатами позволяет с большей уверенностью говорить об определяющем значении упорядоченности структуры полинуклео-тидных комплексов для проявления их противовирусной активности в культурах клеток. Это дает веские основания утверждать, что полученный продукт ферментативной полимеризации ГТФ на матрице поли(Ц) представляет собой двунитевой комплекс поли(Г)-поли(Ц) с максимальной степенью структурной упорядоченности.

3. Устойчнвсть полирибонуклеотидных индукторов интерферона к

нуклеазам крови человека Известно, что двунитевые РНК - как природные, так и синтетические - индуцируют высокие титры интерферона (ИФН) в организме мышей и кроликов. Гораздо хуже индуцируется ИФН в организме обезьян и человсгл, однако ИФН-индуцирующую активность, по крайней ь.ере поли (И)-поли (Ц), удавалось существенно повысить, вадицая препарат ("экранируя") полилизином. Экранирование других полирибонуклеотидных комплексов и природных двунитевых РНК не было описано в литературе, и физико-химическое исследование процессов их разрушения нуклеазами крови ранее не проводилось. Мы сравнили чувствительность к действию сыворотки крови человека полипуклеотидных индукторов ИФН: природных двунитевых РНК, введенных в обиход в нашей стране и находящихся на стадии клинического изучения (ларифан и ридостин), и комплексов синтетических лолирибснуклеотидов - поли(И)-поли(Ц) и поли(Г)-поли(Ц). Для более чувствительных препаратов мы применили защиту полили-

зИном в присутствии КМЦ и выяснили зависимость между уровнем устойчивости экранированных индукторов и молекулярным весом п) лилиэина.

На рис. 6 представлена кинетика увеличения оптической плот ности кислоторастворимой фракции ридостина, поли(И)-поли(Ц), ларифана и поли(Г)-поли(Ц) после смешивания с сывороткой в от ношении 1:1 по объему. Видно, что ОП кислоторастворимой фракциг. ридостина достигает плато через 1 ч (кривая 1),. гидролиз по-ли(И)-поли(Ц) и ларифана идет гораздо медленнее (кривы« '/>. и :«'». а поли(Г)-поли(Ц) был стабилен в течение всего срока наблюдения (3 дня), вне зависимости от того, был это традиционный препарат (Кривая 4) или матричный (кривая Б).

Затем чувствительные к действию сыворотки препараты - ридос-тйн, поли(И)-поли(Ц) и ларифан были стабилизированы полилизина-мй различного молекулярного веса: N 1 - 2200 ± 100; N 2 - 4100 ± 1000; N 3 - 9700 ± 1000 и N 4 - 12300 ± 1000. Результат стабилизации был оценен после контакта с сывороткой опять по скорости появления кислоторастворимой фракции, а также по остаточной ИФН-индуцирующей активности.

Сравнивая результаты исследования экранированных индукторов интерферона (рис. 7,8,9 и табл. 3), видим явную корреляцию меж ду итогами физико-химического тестирования гидролиза и измерь ния остаточной биологической активности индукторов ИФН в симости от молекулярного веса экранирующегб полилизина, lio всех без исключения случаях мы видим, что наиболее устойчигмч -ак в отношении гидролиза, так и по остаточной биологической активности являются препараты, экранированные полилизином с мак:иы;ш ным молекулярным весом 12000. Полилиаин с молекулярным 1""т.м 2000 никакого защитного эффекта не дал. Различия между рассмотренными индукторами в степени корреляции между деструкцией и исчезновением биологической активности, скорее всего, являются результатом их различного происхождинш и огр^ния: поли(И* •!!••> ЛИ(Д) - -ЭТО комплекс ОИНТС'ТИЧС-СКИХ К1.!Ч11Л>,-М'.-!!Ш>Ш M'-'ii'.Víí'M" ров, а лаоифан и ридогтин - ирироднЫ" дч/нит'-ш.,- ЯК, но < ;.а: ным механизмом ои</;ант«г; а. Уч.»:тки дси--тьия иукп», и у -тих и,* паратоь могут иметь разную структуру и локализацию, а уц'-лозиио фрагменты также могут различаться по стру)',туре и размг-р;^.

Рис.6. Кинетика накопления кислоторастворимой фракции при контакте свободных полириОонуклеотидных препаратов с сывороткой крови человека. По оси абцисс -длительность инкубации,час: по оси ординат - отношение ОП кислоторастворимой фракции при 269 нм к начальной ОП. 1 - ридоетин; 2 - поли(И)'полиса); 3 -ларифан; 4 - паси(Г) -поли(Ц); 5 - поли(Г)-полиЩ) -матричный.

Таблица 3.

Титры интерферона в крови белых мышей через 4 ч после внутривенного введения препаратов, инкубированных с сывороткой крови человека

Препарат: Ридоетин ПОЛИ(И)-ПОЛИ(Ц) Ларифан

Длительность контакта с сывороткой: 0 4 ч 24 ч 0 4 ч 24 ч 0 4ч 24ч

Полилизин 0 1 2 3 4 256 <8 <8 <8 <8 64 16 32 16 128 128 128 640 <8 <8 <8 <8 - 64-128 64-128 >256 64-128 640 640 160-320 128 <8 <8 <8 <8 <8 <8 <8 <8 128 64 64

-о- с

-л- л *

г

-о- Н

Рис.7. Кинетика накопления кислоторастворкмой фракции при контакте ридосаича с сывороткой кропи человека. По оси абцисс - длительность инкубации, час; по оси ординат- отношение ОП кислоторастворимой фракции при 269 нм к начальной ОП. С- свободный ридостин; 1,

2, 3, 4 - ридостин, экранированный КВД и полилизином, соответственно, N 1., N 2, N

3, N 4.

—I—|—г—»—I

г \ (>

^f-ctriH*.-

■((-rftth-.

-or -X--V-

Рис. 8. Кинетика накопления кислоторастворимой фракции при контакте поли(И)-поли (Ц) с сывороткой кро ви человека. Обозначения по осям идентичны рис. 7. С - свободный с поли (И) • полиЩ); 1.2.3, «( 4-комплекс поли(И)'по-2 ли(Ц), экранированный ■г полилизином, соответ-и ственно, N 1. N 2, N 3. N 4.

З.о

1.0

I

, , , , , -г/ь-//-ГГГ~т-i Ч С 24 Т2.

-О-С -&-1 2

-о- ^

Мое

Рте. 9. Кинетика накопления кисло'; ораст-воримой фракции при контакте ларифапа с сывороткой крови человека. Обозначения по осям идентичны рис.'': С - свободный ЛПрифиН; 1, 2, 3, 4 - лчриЬ'ЛЧ. экранированный п^лили-зином, соответственно, N 1. N 2, И 3, И 4.

- 16 -выводы

1. Установлены закономерности для соотношения между составом субстратной смеси и составом получаемого полирибонуклеотида для ряда пар нуклеогид-5'~дифосфатов в реакции, катализируемой по-линуклеоткдфосфорилазами. Полученные зависимости позволяют осуществлять программируемый синтез сополимеров различного состава при варьировании соотношений между компонентами в широком диапазоне и получать более активные и менее токсичные комплексы -индукторы интерферона, в том числе эффективные против вируса иммунодефицита человека.

2. Изучены закономерности синтеза поли(Г) на матрице попи(Ц) и получен комплекс поли(Г)-поли(Ц) - продукт РНК-полимеразного синтеза с максимальной степенью упорядоченности, который по противовирусной активности в культуре ткани не только не уступает комплексу поли(И)-поли(Ц), но даже несколько превосходит его.

О. Предложен метод аффинной сорбции, который позволяет анализировать структуру комплексов и выделять из них наиболее регулярную часть.

4. Изучено поведение всех клинически перспективных полинук-леотидных индукторов интерферона - полигуацила, ридостина, ла-рифана и комплекса поли(И)-поли(Ц) при контакте с сывороткой крови человека. Наивысшая устойчивость к РНКазам человеческой крови отмечена у полигуацила. Остальные исследованные нами индукторы нуждаются в защите.

5. Исследована зависимость степени защиты от молекулярного-веса полилизина. Наибольший защитный эффект для всех индукторов отмечен у полилизина с молекулярным весом 12300 ± 1000 Да.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Суржик М.А., Вильнер Л.М., Качурин А.Л., Тимковский А.Л. Матричный синтез комплекса поли(Г)-поли(Ц) с помощью ДНК-лавиеимой РНК-полимеразы Escherihla coll. Исследование физико-химических свойств и биологической активности продукта ре.ищии. Препринт ЛИЯ». 1980. N 1555. С. 1-18. ?.. Суржик M. А., Дятлова Н.Г.. Глазунов Е. А., Тимковский А.Л., Власов'Г.П., Кожевникова Н.Ю. Устойчивость природных и син-

тетических полирибонуклеотидных индукторов интерферона к ри-бонуклеазам человеческой крови. Антибиотики и химиотерапия. 1902, Т. 37. N 1. С. 21-23.

3. Глазунов Е.А., Суржик.М.А., Мирлина Е.Д. Синтез сополимеров с помощью полинуклеотидфосфорилаэы из Thermus thermophllu;-,. Прикл. Биохим. Микробиол. 1995. Т. 31, N 2. С. 190-193.

4. Суржик М.А., Дукс А.Э., Дятлова Н.Г., Глазунов Е. А. , Фельдмане Г.Я., Тимковский А.Л. Взаимосвязь между длиной цепи экранирующего поли-1,-лиэина и степенью защиты полирибонуклеотидных индукторов интерферона от нуклеаз крови челов^кз. Антибиотики и химиотерапия. 1993. Т. 38, N 7. С. 21-26.

G. Суржик М.А., Тимковский А.Л. Анализ структуры комплекса поли (Г)-поли (Ц), полученного матричным синтезом, с помощью аффинной сорбции. Биополимеры и клетка. 1993. Т. 9, N 3. С. 23-27.

6. Глазунов Е.А., Суржик М.А., Дятлова Н.Г. Особенности синтеза поли(Ц.У) мезофильной и термофильной полинуклеотидфосфорила-зами. Препринт ГОШ. 1995. N 2037. С. 1-11............. _......

• Отпечатало на ротапринте ПШФ 3ак.305, тир, 100, уч.-изд.лЛ; 1ЭДП-19Э5г. ■ -.................Бесплатно..........~ ~