Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм пероксидазы в культуре тканей самоопыленных линий сахарной свеклы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм пероксидазы в культуре тканей самоопыленных линий сахарной свеклы"

КАЗАХСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

КАЗАХСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗЕМЛЕДЕЛИЯ имени В. Р. ВИЛЬЯМСА

На правах рукописи

АЛ ИМ ГАЗ И НОВА Баян Шурумбаевна

ПОЛИМОРФИЗМ ПЕРОКСИДАЗЫ В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ САМООПЫЛЕННЫХ ЛИНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

Специальность — 03.00.23 — биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

п. Алмалыбак — 1991

Работа выполнена в лаборатории физиологии и биохимии растений и лаборатории селекции сахарной свеклы Казахского научно-исследовательского института земледелия им. В. Р. Вильямса в 1984—1990 гг.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор

Ю. В. Перуанский

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор

И. Р. Рахимбаев

— кандидат биологических наук, М. Б. Амерханова

Ведущая организация — Кыргызский НПО по земледелию

Защита диссертации состоится « Х4 *

1991 г. в

часов на заседании специализированного Совета К.020.39.01 по присуждению ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук при Казахском научно-исследовательском институте земледелия им. В. Р. Вильямса по адресу: 483133, Алма-Атинская область, Каскеленский район, поселок Алмалыбак, КазНИИЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан « Л^» и^'Ь^^ШС,__199[ г

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат сельскохозяйственных наук

С. Б. РАМАЗАНОВА

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА FAEOEJ

В последние десятилетия а целях интенсификации селекционного процесса сахарной свеклы эффективно применятся биотехтологические методы: культура тканей» клеточная селекция» генная инженерия и другие. Внедрение нетрадиционна* методов в селекцип сахарной свеклы позволит быстро размножать перспективные формы и получать новый исходный материал для реализации селекционных программ.

При развития бпотехнологических исследований возрастай г значимость использования биохимических методов для изучения биологии, культивируемых in vitro растительных тканей,выявления маркеров дифференциации каллуса, идентификации генотипов. Биохимическое обеспечение бпотехнологическпх работ на всех эта-' пах создания новых растительных форм включает: подбор и комплексную оценку.исходного материала, вводимого в культуру; использование маркеров органогенеза каллусов, развития суспензионных культур, биохимических критериев развития раганерангов; биохимический контроль в традиционной селекции поело передачи селекционерам новых форы. Болыяие преимущества для этих целей ншпг принципы и методы белковых маркеров, основанные на споци-5ячности и ш^ормативности спектра компонентов множественных, генетически полиморфных балков и ферментов, в часгиостк.перок-сидазы.

Успешное использование катодов культуры тканей и органов в селекцип сахарной свеклы делает актуальным вопрос о выявлении и применении биохимических маркеров для контроля биотехно-иогических работ.

¡$ДЬ-А-£?ДЯЗЙЛФРда&ШДЭ« Целью настоящей работы является установление возможности использования порокацадзи как биохкми-чэского критерия при культивировании тканей. сахарной свекла ¿п vitro .В соответствии о этил для исследования были постав-тони следувяае задачи:

- для характеристики неходкого материала, вгсдиюго в культуру, изучить гегерогешшегь по роке ¡козы в листьях растений, >ПР оделить специфичность электрофоретичсского спектра фермента ия сшлоопыленных линяй сахарной свеклы; изучить некогорцо ^изйко-хпмичоскиэ сдайства пероксидази листьев цитоктних расте-1ИЙ (субстратную специфичность, аминокислоты,' состав, отношено к детергентам);

- для прогнозирования шр^огенетических потенций каллус-ных тканей исследовать компонентный состав я активность перок-сидазы в культивируемых тканях;

- выявить закономерности ингибирования изопероксвдаз каллусов и рогенерантов танином я анионами солей.

ЁЖШРаботы состоит в том, что показана изменчивость активности множественных молекулярных форм пароксвдазы листьев сахарной свеклы в зависимости от использованного субстрата; впервые определен ашнокислотиый состав пероксидазы листьев сахарной свеклы; установлено, что пероксидаэа, ее качественный и количественный состав №гут быть использованы для характеристика тканей, культивируемых in vitro ; выявлена разнокачественность изопероксвдаз по устойчивости к иягибцруюце< му действию детергентов в денатуратов .(шшна, анионов солей и шчевины); показаф,'что изменения в влекгрофорегическом спектре тканевых и эксграцоллиллрпых изопероксвдаз среды могут служить маркерами ризогенеза.

Установлена перспективность использования электрофоре гиче ского спектра перокскаазы каллуса и хитагачьной среды для прогнозирования процессов двфференцазцш и морфогенеза камусов. Результаты исследования активности изо-пероксядаз в присутствии мочевины, детергентов, анионов солей служат основой для дальнейшего изучения взаимодействию фермента о ивакгивируюциш агентами и разработки путей регуляции активности пероксйдазы при страссовшс условиях. Ивоферыентный спектр пероксвдазы монот использоваться для сравнитачыюго изучения исходных растений я полученных регенерантол в биотежнэло-гии.

. Основные положения диссертационной ра-

боты дологшны на II научной конференции молодых ученых и аспирантов КазНИИ дзшвделия (IS85), на заседаниях методической комиссии Восточного селекцентра ВАСШЯ <1966-1987). на 12 научно-практической конференции молодых ученых и спецааластов,по-свящешгоа <0-лагию Велигой Октябрьской революции (ISQ7), на Рес' пубдиканской научно-теоретической конференции "Молодые учеше--сеяьскоку хозяйству Казахстана" (19Ю), а также излозени в тезисах доклада Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (IS9I).

ДХЙЙШЙА» По материалам диссертации опубликовано 8 науч-

jx работ.

Диссертационная работа изъяна на /¿¿страницах машинописного текста! состоит из задания, пяти глав, выводов, рекомендаций для совместной работы ютехнологов и биохимиков, списка использованной литературы 1 -tffl наименований. Текст иллюстрирован 21 таблицами и 25 юунками.

ОБЪЕШ ИССВД5ВАНИЯ

Для исследования бшш взяты саюопцленныэ линии сахарной )эклы. различакциеся происходившем, интенсивностью ннбридин-I,' хозя2сгвешо-цоннш,я признаками; При изучения изопероксвдаз-iro спектра листьев использовались растения, выращеннко в 85 году в Каскеленском ОПХ КазНИИ земледелия на поливо по ¡щецринягой огротехтпм.

Субстратная'специфичность псроксгдазы, влияние детергентов мочевины па активность фермента исследовались на препаратах. Явленных из тепличных растений следующих линий: П-277, Я-5, 62, Я-40, 2698.

Для получения кэллусных тканей изолировали нзогйодотвэрен-;е сомядащш растений линий А-5. 5474, СОЛ!-5, вараценных в левых условиях (IS89-I990 гг.Н

3 рздэ опытов изучались стерильные проростка я растения, льтивируемие in vxtro ,янгактны9 растения линий Г0Э-20, АН-5, Ш-44.

методы исслздотния

Зксгракцко свободных перокстааз проводила из одтююзраог-х листьев, каллусов п пп га только2 среды трас-глициновым буром рН 8,3 (Кабхаиова, Перуанский, 1975) . Связанные перокси-зы извлекали детергентами: It тритоном х-100 и О.ОГ* m>s-Kn

Общи активность определяли спектрофотоштричоски (05-25 "SPEK0L-11 " ) по методике О'.ВЛебедевой с соавторами Э77). Удельнуа активность рассчитывали на мг белка по O.K. sn е. а. (1951) а вцраетли в ккят х га1*1 белка (Номеикла-ра ферментов, 1979).

Катодный (от V к "-") электрофорез пероксстзз прово-гш в трис-глициновэм буфере рН 8,3 о охлаждением в цилицаря-зтеих гелях размером 0,6x7 см в голиакриламиднем голо го UJ.Lnviu ( 1964).

В качества субстратов для проявления изопероксвдаз использовали 1,25хЮ"3м раствор солянокислого бензгоана в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,7, а также 0-дианизидин,0-фенилещшамйи. п -анизвдин и кофейнув кислоту различит концентраций (0,01-0,04?) с. 1.2x10"% пероксидом водорода'.

Ингибирование'изопероксиааз в ряде экспериментов проводилось инкубированием голей после электрофореза в течение 20 минут в растворах 0,005М ванадага аммония. О,5М цитрата и хло-рада натрия»

Для выяснения влияния различных концентраций шчевины в hií- j бацконнус смесь сносили сухую мочевину до концентрации 2, 4В 6 и 8 К, тритон X-IOO - до содержания 0,5; 1.0; 2„0; и а также ьм-На - до - 0,01; 0,03; 0.о5 и 0.1*.

Относи тельную активность изопероксвдаз рассчитывали по методу Е.н.ьхи (1273)..

Аминокислотный состав определяли на аминоанализагора ("1кз "» Швеция) модель 4101 па общепринятой методике; Коли-• чество свободного триптофана в каллусах и питательной срадо определяли согласно методу Ю.В.Перуанокого (IS88). Свободный пролин рассчитывали по методу ■z.&.Batea e.t, (I973)o

Квллусогенез ивдунировали на среде Гамборга В5 (1268) с различными концентрациями и соотношением гормонов цря температуре 25±2°С в термостате; Анализу-подвергались гакяа стерильные щобирочные растения, полученные методом активации пазушных меристем из 7-Ю-дневных цроростков (Кохахыагов.Шзгебаа; 1989). Проростки били получены в лабораторных условиях црораци' ваниом семян в растильнях на фильтровальной 6yi,are (Филатов и ДР..1985)«

. тематическая обработка результатов включала статистический анализ данных на МК-57» кластерный анализ на ЭШ EC-I02; в вычислительном центре ВАСХНИЛ и на компьютере IK.1/PG в лаборатории биометрии и Ш1форматики КазШИЗа (Дсран.Оделл.1977. Мартынов и др.,1983).

РЕЗУЛЬТАТУ !ЮСЭД0ВАН1Й И Щ ОБСУЖДЕНИЕ

Полиморфизм пероксидазы листьев интактных растений сахарной свеклы

JSSKSRSij» Выбор белковых маркеров для селекционных целей должен соответствовать определенным критериям четкой выраженности

i протяжении всего жизненного цикла развитиярастения, неза-юймо in vivo ила i" vitro Лчогкость и просто га элект-' |форвгяческого разделения белка» предпочтительно в сиром :стракте, взбегая длительных процедур очистки; наличие еотесг-imroro полиморфизма ( Van Geytí.a.ii934);

Методом электрофореза в ПААГ, используя экс гранты фер-iHra из различных сегментов листа; из листьев различной физио» иичаской зрелости, из 14-дневных проростков сахарной свеклы» i га но вили, что катодные пероксвдазы зрелых листьев наиболее ото отвечают требованиям бзлкового маркера.

Причем, по числу, относительной и удельной активности изо-1рЬксидаз дажно характеризовать функциональное состояние лис-.ево Удельная активность фермента го мере старения листа да вы- . |лась (тебл.1). что согласуется с мнением Титова (1975)«Гусева сотр. (1982)а Иевянына (IS88)» отводящих определенную роль >роксвдазе в процессах старения. "

Таблица I

Удельная активность пероксвдазы листовых пластинок растений сахарной свеклы

(нкат х мг"* белка)

шоопцленнна гРастущий листг Зрелый лист : Старасдай лист

^ даид

3 6467 6651 Ю835

4 6915 9727 .19619 73 3383 6683 11058 80 6518 7396 13617

Отмечаются значительные трансформации в электрофоратичас-)м спектре пероксвдазы в процессе развития растений. Наиболь-эе число изопероксидаз характерно для листовых пласт тюк з роде листьев (табл.2);

Общимя для всех типов листьев являются компоненты с ОЭП и 100, причем последний последовательно повышает свою ахтив-зегь по мере старения листьев. Катодный спв«тр перокекдазы раз-элпла на три груши: А - с относительными электрофоре тачоски-> подвижноетямя (ОЭП) 0-29; В-30-70; 0-71:100; и болеем

Таблица 2

Изменение количества- катодных изопероксидаз в процессе развития листьев сахарной свеклы

■ ✓ ^ ^ ^ ^ Ди^н^ ^ ** *> ^ ** ^ ^ **

Сазы : I : П :Ш : I : П :. Ш : I :П ; Ы : .1 : П : II ¿азв^г^ „ „ ^ „ ^ ^ „ „ „ ,, х ~

Число кзопе-

роксвдаз 9 II • 9 ? 13 12 Э 13 14 8 II I - растущий* Л - зрелый» Ш - сгароюций лисг

Используя тэдинаковцз концентрации субсграгов в среде инкубщювакия гзлей после элекгро<$орегичаского разделения, мы обнарухили суцесгшнные различия в цроявяошш изопероксидаз (табл;з). '

Таблица 3

Субстратная специфичность пероксидазы листьев • сахарной свислы

Субсгра? ; Цвет зон:К)кцентра- :Количасгю компонентов 1 1Ц«я субстра-' —

^ У-Л У-Л ' ТТ

.VI

Бензшш голубой, 0,02 соляно- ШПОХОДЯ-кислый дий б коричневый '

0-диашш-

дйн орашгевш"! 0,02

* и -анизи-

дкн калиновый 0,02-0,04

ярко-зол- ■

Д!а.шъ ¿г. 0,02-0,04.

9 9

1 4

8

8 4

О 3

8

8

4

2 О

7

6

6

Кофейная зеланоза-1:;:ело та Ю-ксрп'шо- 0,02-0„04

Б!Й •

Примечание: 1-7 - линии сахарной своклц: П-277, Л-5, Я-62, Я-40, 2598

О б

3 5 '

Содержанке в ацетатном буфере рН 4,7 бензидина • я 0-дяа-аизйдина в количестве 0,02^ было достаточно, для выявления и расчета относительной активности изопероксидаз'. Дри этой ±е сонцентрацга п -анизияина, 0-ч$енилекдиамина и кофейной кислоты число проявившихся компонентов было иным, т'.в.- часть изози-иов не обнаруживалась. Наибольшее сродство изученные линии проявили к бензидину соляно1шслому и 0-дианкзидину, причем расчет относительной активности изопероксидаз при окислении этими до-торами водорода показал практически одшаювое сродство, ■ что зогласуется с данными 0 Лебеде вой и сотр. (1977), Танибаевой ¡1969). ,

Методом кластерного анализа были получены высокие полозки-гальные кооф|,ицпенгы корреляции (0,91-1,00) медцу бензидином ¡олянокислым и 0-дианазидином, что свидетельствует о близких . шэчонкях активности изоперокевдаз во всех линиях цри использо-эаншг этих синтетических аминов. Следует отметить, что изопе-эоксидазы с ОЭЛ 80, 100 и 108 чацз оказывались в одном кластеро, ло указывает на их сходную субстратную специфичность.

Как показали наши исследования, наиболее подходящими суб-¡тратами для сравнения линий сахарной свеклы являются бензякш • ¡олянокислый и 0-дианизидни. Аналогичные данные сообщаются в >аботах Сарсенбаева, Полимбетовой (1986), Комаровой и сотр. 1989, 1991).

ШтШттжтттжлтЯлзштлжш^л^

изучалась возшжность ис-[ользования изопероксидаз листьев для идентификации самоо падении линий';' С этой цолыо были проанализированы одновозрастные >астения 44 ляшй сахарной свеклы, огличаювдеся происхоздензем, (нтзнсавностьв инбридинга, морфологическими и хозяйственно-цен-гыш признаками.

Несмотря на разнокачоственность линий, методом электро$о-юза в ПЛАТ удалось . выявить всего лишь 17 тигов спектра изо-■яюв (тсбл.4).

По частота встречаемости типы спектров, могут быть разделены а три группы: I - единичные, встречающиеся лишь один раз 9-17 типы); 2 - редкие типы, встретившиеся 2 раза; 3 - часто ютречающпося типы (1-4). Число изозимов варьирует от 7 до. 10, сего идентифицировано 14 изопероксидаз;

Варианты спектров порокешмзы листьев можно рассматривать

Таблица 4

Изменчивость катодных изопероксддаз лиогьев различных . линий сахарной свеклы

Тиш: Изо$орментный состав (ОЭП компонентов) :Коли-

спек- ^■'"^''^''о'''''*'''"*"'*''''''''^^''^''''^ чество тров: А(0-2Э) В-(30-70) :С(71-100 и более .-линий

I 7 14 22 38 80 100 108 10.

2 7 12 16 22 38 80 100 103 8

3 7.12 16 22 30 33 80 100 108 5

•4 7 14 22 38 54 80 •100 108 4

5 7 14 22 33 54 80 100 103 2

6 7 14 22 30 38 80 100 103 2

7 7 14 22 30 38 54 80 85 94 100 108 2

3 7 12 16 22. 38 54 80 94 100 1С8 2

9 • 7 14 22 / 33 54 75 80 94 100 108 I

ю 7 14 '22 30 за 54 80 94 100 108 I

II 7 14 22 38 54 80 94 100 108. I

12 7 12 16 22 38 ■54 80 05 94 100 ЮЗ I

13 7 12 16 22 30 £8 54 80 100 108 I

14 7 12 22 33 75 80 100 108 I

15 7 . 14 16 22 30 33 ' 75 80 94 100 108 •I

16 7 12 16 22 38 80 94 100 108 I

17 7 14 22 38 80 94 100 108 I

го двум категориям: : I) отсутствие али наличие К0Ь' июней гов со 8

позициям (ОЭП), исключая осговнво, стабильные изоформэигы; 2) по относительной активности «зопероксвдаз. Относительная активность отдельных изозашв изменяется в широких пределах;обвей закономерность» является для всех линий низкая активность компонентов группы С,

Исследования показали,что специфичность спектра перокскда-зы листьев сахарной свеклы невысока; Диффоронциацаа'кезяду линиями слабая: линии удалось разйигь лизь на группы ,ш с снопа изофермеи.ишх спектров, '

Из вас гю, что среди изучекагх шлятрфпк ферментных сис- • тем наиболее высокие показатели пол«гд>р$косга и гогорогепносгс свойственны эсхеразаы* пероксцдозш ь др.' (Еопарев, 1083; Созшов, ,1985). Однако для даффарешгащш ющухт-лгаай сахар-

ной свеклы специфичность спектра изопероксцдаз листьев недостаточна-.

Возможность идентификаций ооргов сахарной свеклы изучалась на.основании изозямных спектров ряда ферментов (Ve» Geyt, smed, 1984; xtcnov е.а. ,1985; Левигес.1986): пероксэдаз, Х-амилаз, щелочных и кислых фосфэтаз, эстероз а др. Вгоимо, для самоопы-леиных линий сахарной свеклы кроме пероксидази необходимо привлекать я другие ферменгные системы, что позволило бы далучять дополнительную информацию для характеристики селекционшго материала;

• шт^ттк^т^л^тж^лштшйт^^тй сзоде-

шй od аминокислотном составе перокскдазы у сахарной своклы в литературе нами не обнаружено^ В связи с этим проведено сраиш-гольноэ изучение аминокислотного состава различию; групп перок-« -сцдагы листьев, представляющих фракции А,В,С трех типов спекгрз (PBCil)i

ОЭП

+ А. . — = 12 14 16 14 22 ■ 38

И 80.

С = — 94 ' ' 100 108

I II Ш

Pnc.I.ai Схемы электрофором ческпх спектров «елочных

дзоформ перокс;яазы лисгип сахарной свеклы; ' • 1-Ш-ГЛП11 спектров

Цри анализе аминокислотного состава изопероксвдаз наш ошочоны отличия кеду соответствуют« группами трех типов спектров; Изоформы Bgg значительно различались по содержании аспарагшгавой, глугампновой кисло г, серину, пролину, глицину, гисщдяку. органику; азоэамы А-1руппц-глутамяновоП кислоты, пролину, изолейшшу, лейцину, лизину » С-группы-дролину.глицину. долину, фенйлалашгау, гпсп-дшо". яспагагядавой и глуга-

Ж 1-Е) 80

6U .

4U

2U

2 8 I

3 I

4 7 9 b 6 П ÍÜ

PBc'il.6? Девдрограмма настроенная на основании

аминокислотного состава катодных язопероксидаз листьэв сахарной свокяы:4группы 1,4,7-А; 2,5,8-В; 3,6.9-Cî типы спектров: I-3-первый; 4-6-вхорой; 7-9-третий; I-Щ кластеры

миновой кислот; Наиболее гидрофобной била А-группа изффермен-гов m обоим гоказателям гщфофобнйсти ( c.c.aigeiow ,1967 И E.Q.Lmvaon e.f.,1994),

¡^пользование одного из методов многомерней статиртшш--кугасгергаго анализа, позволило обнаружить сходство со аминокислотному составу Бзд изозима I п Ш типа спектров. А»группы П и Ш типа и Б- и С-грушш II типа спектра (рис;1,б); На уровне Д(1- R )=30 обнаружено три. кюстора^ Кластеризация осудесгалялась согласно гидрофобноета групп изо-ферменгов*, '

В задачу данной серии отдав входило установление опм1маль]Ш'концентраций детергенхов'для извлечения мембрако-связанных пероксцдазс максимальным сохра-. нанием ферментатякюй активноетп, а такяе выявление р.езпетенг-ï.îxx нзефера фермента к моче вино при электрофореза в ПЛАТ?

Установлено,что тритон Х-100 в концентрации 0,5 п IÏ практически не влиял на активность шроксидаз- обеих линий Я-62 и П-173; При повышении концентрации до 2-3*2! фермент теряет до I6-30Ï исходной удельной 'активности^ Анионный детергент DDS-ra

i концентрации Ол(Ш юдавлял активность на 85-90<, а О.ГЙ -¡онцентрация, широко используемая для электрофорэтического «зделения белков, да чтя полноетьв лишал активности препараты ¡ертлента"; Мочевина ингибировала наиболее сильно до концентрации IJÍ в это трактах как цитопдазштйческие, так я мекбрадасвязан-1ке пероксидаэы, выделенные с помощью К-иого раствора тритона >100'. Дальнейяее повышение концентрации денатуранта в меньше степени подавляло актиншеть сю ¿одних и по чтя не влияло ¡а связанные перокевдазы. Несомненный интерес представляло вы-юление резистонтных изоформ данного фермента к мочевине'; При юдоряанйи 4М денатурирующего агента в гелях полностью отсутст-¡овала активность в зоне с ОЭП 12, 30, 38. Сходную устойчивость :атодные перокевдазн линий П-277, Я-5, Я-40, 2698f Я-62, П-173 [роявили к 8'Д мочевины в геле: резистентедан оказались изозиш ¡ ОЭП 7, 80, 100 и 108.

ПОЛИМОРФИЗМ ШРОКСЗДШЫ ШЛУСПКХ ТКАНЕЙ САХАРЮЙ свшы

При культивировании неоплодогвореишх семяпочек сахар-гой свеклы линии А-5 на питательных сродах МС и Га»Copra В5-ííwh ьолучаны различные типы каллусов, отличающиеся морфологи-госкими признаками и морфогенегическими потенциями. Исследования ¡оказали специфичность изопэроксцдазного спектра для каздого ■ипа каллуса (рис.2);

•Изозивдый состав пероксидаз каллусов включал до 7-13 сомгоненгов. В'шиателькый субстрат экстрагировалось 4-8 изо-герокевдаз.- Общая активность перокевдазы в среде (жда в 8-II ээз ниже, чем в качлусной ткани. Две изсх?ормы 22 и 100 cíeли характерны для всех каллусов и питательных сред. Наиболее актшз-юй била пзопероксидаза с ОЭП 22, на долю ее приходилось :/4-1/3 всей активности пероксидазы. Наличие компонентов с >ЭП 14 и 94 специфично для зеленого каллуса. причем изозим с )ЭП 14 не переходил в среду. Псбегоностй сеегло-серий участок-:аллуса отличался от бурого,конгактирущаго со оредой,цяо<|ор-ой С 109 . Следует отметить, что мезду каллуса га (средами) с.-1ествувг не только качественные (по числу изопероксидаз), до j голпчесгвеннке различия (активность л mea г).

Цря продадзч геяьноы культивировании каллусов ожочэлось юявлсшга лидентичных условиях народу с белам крупнозернистым • сг,з?ло-суроро каллуса. Ввдгшо. зторой мп каллуса является

_5

ОЭП

10

:Н '22 .38

12 16

б а баб

■54 -60

.75

.30

,09

]Э4

■100

.4100

Рис';2'. Схемы электрофоретичоских спектров порокецдазы

• различных типов каллуса сахарной шюш и питательных сред: I- белый плотный, 2 - серый рыхлый, 3 - зеленый, 4 - светло-серый с побагом, 5 - бурый баз побега каллус; а - каллус, б - ервда

стадией старения белого; Изоперокскдазный набор усложняется пс явлением минорного компонента с ОЭП 75". Слодует отмотить резкое изменение активности изо^орм с высокой 0ЭП-100 и 103' при деградации клеток.

Цри культивировании незрелых семяпочек на нескольких вариантах питательной среды' Гамборга В5 наблюдалось появление боло-желтого каллуса, мелкозернистого, легко рассыпзюдогося.Каллусн отличались, по изопероксадазноку спектру. Независимо от наличия фигогормомв для всех каллус юв образований идентифицируются изозш.ш с ОЭП 10, 14, 22, 38* 94, 100 и 108.

Содержание кинегпна (0,2 от/л) в двух адраангах пагагвль-■ той среды ивдуцдруег в каллусах компонент Лд. Зпэсешзе ИУК в концентрации 2 ш7л сгимулирсвало появление дополнительных полос с порокевдазиой активность» в зош Б и С с ОЗП 54, 60» 80, 88. Увеличение количества кипе тала до 2мг/л способствовало обнаружению йзозима С 116. Наиболее высокая обдая акяшюсп.

фермента в каллусе наблвдаласъ при содержании ЕЛП I мг/л в среда. В литературе есть йакты, указывающие на стимулирование пероксидазиой активности бвтилашшпурадам. прячем нэвдаскила ковдеятроциями { L'lodubzeivEka е.г.,,1967)". На влияние регуляторов роста кагодина перокещазы отвечают по-разному количествен- ■ но: депрессию или, напротив, активацию отдельных изопероксцааз каллусов габлэдаля на различных вариантах питательной среды.

Итак, полученные даннш позволили выяснить, что присутствие п пропорция фитогормоиов в значительной мере влияют на регуляции активности пзроксидазы культивируемых in vitro тканей сахарной свеклы",

£9Д> Внесение триптофана в питательную сред:/- МС в концентрации .50-100 мг/л стимулировало калдусообразо ванне. Цри дальнейшем повышении содержания аминокислоты в среде рост каллуенцх линий ингибировался. Подобное явление наблвдалось при исследовании влияния -Tpnnioiaia на рост суспензии меток руты душистой: концентрация 0.5-1 Ш (100-200 мг/л) тормозила рост клеток (Кузоеяинз и др..1937); Обдая активность лороксидазы в каллусе и питательной среде возрастала по мере увеличения содержания триптофана в среда. Еоомокдо. это связано с активацией одной из многочисленных функций пороке им зы КУК-слнготазтой, что вызвано наличием я повышением содержания триптофана в среде .Незна-чятельноо содеретниз триптофана в питательной среде по сравнению с тканью, свидетельствует о своевременной утилизации аминокислоты для нуга развития каллуса. Какоторое накопление свободных аминокислот (триптофана и пролита) при 500 ur/л триптофана в средо ингпбгтрует рост каллуса полностью. Каллус приобретает темно-коричневую окраску, плотную консистенции, наступает дол-пай некроз тканей. При этом следует отметить,что каллусная ткань обладает высокой пзроксидаздой активностью. Электро$оретзчвс-кий анализ псроксиаз -каллуса и среды показал изменения качвет-ветэго и количественного характера цри повышении концентрации аминокислоты э среде.

Результаты опытов показали, что воздействие высоких коь-цоятршиа триптофана вкзнваег значительные пзшюаия в функцло-

состоя:::;- каллуса, что отражается прежде всего на по-рохоадазпой сястопо. Ка наш взглад, коицвнграшв триптофана 50-100 кг/л следует использовать при культивировании галлуешж

тканей сахарной свеклы для интенсивного накопления биомассы.

ПОЛИМОРФИЗМ ПЕРОКСШЗЫ ПРИ КЯОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ

размножения и сохранения ценного, генетически идентичного материала эффективно используют микро-клопалькое размножение. Одним из важных этапов этой технологии является укорзнение размноженных побегов. В литературе есть сведения, связанные с изучением роли пероксвдазы в регуляции процессов корнеобразозания (Гуськов и др.,1586; Иа вин ыд, 1988);

Наш изучались закономерности изменения активности перок-сидазной системы в период образования и роста корней сахарной свеклы in vitro .Дг-я анализа использовались растения линии СОАН-5, отличающейся хорошими ризогешшми способностями в условиях м vitro '.Были проанализированы листовые пластинки, часть стебля у корня, корни и питательная среда. Фермент извлекался из растений, различающихся степенью развития корней: без корней,-с корешками длиной 2-4 мм, с хорода развитой ;х>рневой системой - 10-20 мм.

В анализируемых частях растений наблюдался различный характер изменения активности пероксвдазы (табл.5)'.

Таблица 5

■ Общая активность пероксвдазы растений сахарной свеклы при корнеобразовании (нкат)

Растения :листовой : стебля : корной :пигательной ----- - .. ^„среды^ ^ ,

Растения без

корней 6085*128 Ю502±158 - 154+5.

Растения с 4218±103 ?Ю2±249 5000±150 245+4 • корешками 2-4мм

Растения с 12486+432 ■ 5902±177 9000+135 483±17 развиты?.«! корнями

Усиленный рост корней стимулирует ввделеиие пероксвдазы в питательную сроду. При этом активность фермента л .среде значительно ниже, чем в различных органах растоний. Иэоферментный

lafiop лис то вше пластинок упрощается по мере появления и развития'корней. Стебель сохраняет пероксидазиый комплекс из б ком-юненгов, причем язозш.1 Cqq обладает органоспециЗичностью'.Иво-тороксодаза Вер появляется в развитых корневых волосках. Отме-заюгея различия го спектру язоперокеццаз.ввделяемых в питагель-?ый субстрат: при индукции горней найвдается изозям CjI2i !30cí;op;.:2Hгы Ajg и Bog обнаружены в среде растений с развитыми юршалв.

При анализе количественные изменений активности изоперокси-иэ можно выделить следующио тенденция: относительная актив-га стъ изозвмов С ОЗП 7 я 22 в листьях» стебле, с ОЭП-7 - в :реде нацрашенко повышается по мера роста корней; стабильные гаоформн. характерные для листьев, стебля, средн. с ОЗП ТОО и :08 последовательно теряют фермента тявнуо активность. Для корней габлвдается обратная картина: повышение активности Cjqq и Cj03 !зоз1Шв и снижение количественных значений А™ и А22>

Можно полагать, что фермент принимает участие в регуляции юсга корней; Сонокон изменчивости количественных показателей ¡екоторых язоперокевдаз значительно расширяет воаможкоегк яс-юлзования этого показателя для раннего тестирования ризогенного ' , гатенциэла каллусов; Различная интенсивность ввделеняя перокси-;азн в питательный субстрат определяется физиологическим состоящем растения. При поиске биохимических кернеров для прогнозирования ризогенеза есть необходимость наряду с изучением ак- . ■явности изози много состава пероксиазы растений, исследовать [акономерностя изменения фермента в среде.

• ускоренного

©змнокения ценных генотипов сахарной свеклы используется цра-ш клонального микроразмноженкя in vitro t д частпооги.ме-од активации пазушных меристем. Кзрпстематичаскоо цроисхолдениа ¡азушвих побегов обеспечивает гекзтячэскур »дентичиость потои-:тва исходной материнской форме".

Цропадецо сравнительное изучение изотермойпоа перокекдазы :истьев линий Рч)9-20 в ряду: старильнно проростки - пассирув-аю растения - глоркялони - ипгактнио растения. Для г>сох изучении адеттк^кцфумуся 13 компонентов,

Ыссгь основных» стабильно иэопорокеддаз с ОЗП 7,22,38.. ■0,100,103, шиоленчих раноо для всех лтшЛ при .¡донщ'Ёигаадк

инцухт - линий сахарной свеклы, били обоими для всех форм в исследуемом раду. Стерильные апикальные меристемы проростков» вводимых в культуру, имели пероксвдазный коышексасосгоадий из 9 изозимов.

Растения второго пассам показали несколько усложненный спектр: дополнительно идентифицировались Aj2 0 В50 - изозимы, а Вг,0 - компонент не был обнарунек. Нормально сформированные растения, развившиеся из пазушных меристем проростков и высаженные на новую питательную среду, синтезируют изоформу Сд^, которая характерна также для листьев взрослых интактных растений, даращенных, в полевых условиях. Для интактных трехмесячных растений специфична изопероксщаза BgQ, нерегистряруемая в электрофоретическкх спектрах других форм^

Самая высокая относительная активность приходилась на долю компонентов с ОЭП 22,94,100,106 (9-ЗШ;. Изозиш BgQ и В-де - минорные проявлялись не во всех вариантах.- В целях сравнения был исследован электрофоре! и ческий спектр перокскдазы растений линии 1136, также размноженных активацией пазушных почек; Для него специфично наличие энзиматяческих полос с ОЭП 4« 14,54 и 85.

Полученные результаты позволяет заключить.что изоферменты перокскдазы исходной материнской формы с ОЭП 7,16,22,38,80, 100,108 наследуются в кленовом потомстве; Некоторые изоперокси-дазы (Aj2. Вг,0» С94) miyr появляться в результате более интенсивного роста культивируемых тканей, вследствие экзогенного снабжения их ауксинами и цитокиниками.

Изменения в изопарокепдаздом спектре можно классифицировать как ответ генома на шок, вызванный условиями культивирования. Изопероксцдазиай спектр листьев растений сахарной свеклы можно исгользоеэгь для характеристики и идентификации при клональном мшфоразмнозеиии как свидетельство их относительной генетической стабильности и установления особенностей функционирования пероксюшной системы в условиях i/1 i/ifw

Шл&тЖтш^хжштт&^л^^^-ш солюбили-заци ■ пероксидаз из растительных источников на экстрагируете гь фермента и его активность оказывает влияние гт'ггоугсгвяв соединений пелифеюльной природы-танинов, а также мгурантов белков-анионов оолой. В связи с этим представлял интерес выяснение степени ингибирования изсперокскдаз танином и анионами

Î8

солвй-ваиадатом, хлоридом,, цитратом. Фершкт извлекался из каллусных тканей и питательной среды. Каллусные ткани балл получены для двух геногигов-5474 и 0DAK-5 на различных питательных средах.

Найявдалась специфичное га изоперокекдазкого спектра каллусов и питательной среды. Ойцими -для тканей явдяптоя юмгокек-гы с ОЗП 7 и 22. Изсзнм А22 на долю которого приходится 36-49« всей фермектагинюй активности, переходит в среду.

При действий танина ною горца изоперокевдазы сохраняют or II до 69Я псрсоначальной активности. Активность изозимов с ОЭП 7 и 12 генотипа 5474 полностью подавляется ганином.Наиболеа устойчивыми оказались цзозямы каллуса и среды линии С0АН-5;

Анионы солей действуют более мягко на перокекдазы как кал- . лусов.так и питательной среды. Ванадат аммония, в концентрации в 1000 раз даньша, чем хлорид и цитрат натрия, ингябкрует больше* при этом изоперокевдазы каллуса сохраняют П-50Я активности.

Кластеризация позволила четко разделить изопороксидазы по сгапеня устойчивости к деиатурантач (рис.З). На уровне Д (1-п ) < 20 можно вычленить два кластера, причем второй об!адинязт кзофорш обоих генотипов, наиболао резистентные ко всем реагентам.

Ингибиругздй эффект танина и ванадата продемонстрtгрован также для пороксидазы ластьев .стерильных цробдрочных растений линий ЕП-44, СОАН-5 и Р-09-20, голученпых активацией пазушных почек и культивируемых на среде с содержанием БАП 0,2 от/л. Изопероксидазныа спектры трех ганогидов отличались по числу компонентов и их относительной актишости. Танин в листьях подавляет, в основном, медленноподветша изоперокевдазы с ОЭП 7, 12,10; Следует отметить более высо:<ув устойчивость изозиша листьев генотипа 00АН-5 к воздействию денатуранта. П°давляодее действие ванадата является более мягким по сравнению с танином.

Растения линии Р-02г2о.культйвируемы9 на питательных средах, различающихся содержанием и соотношением регуляторов рос-' та, шел и 4-7 компонентов в изоперокещазюм спектра; Изофемен-гы листьев проявили более высокую устойчивость к действию танина и ванадата. Могод кяазтерного анализа позюлил чегко дифференцировать кзепарокевдазы анализируемых тканей по с то пен и ингибдоовання их танином а анионами солей.

■• Устойчивость отдельных кзопороксидаэ к дзиатур'фугаему

да-R)

50

40 30

20

15

10 8

б

Т.

£1

4 8 13 Ъ 9 Н И to 5 12 1 2 7 3 6

изопороксвдаэн

Рпс'.З'. Кластеризация лзопороксидаз каллуса и среди линий

5474 И СОАН-5 по стопени устойчивости к танину и анионам солей: 1,2,3~0ЭП 7,2г,100-лйШ1И 5474 иа среде (НУК+БАП); 4,5»б-0ЭП 7.12,22-линия 5474 на средо без горшков; 7,В,ЭДо,П-ОЭП 7,16,22.88,100-лпнии OOAIi-5 на среде с II/К; 12-15-СШ 7,12,22Л00~лшшя 5474 па среде с 1ЕГК

влиянии ганияа и анионов солой вносит определенный вклад в готшаииа механизмов рогуляцяи Вермонта;- Эти изо$ормеигн,ог-личаадиося по физико-химическим свойствам, позволяет нормально функционировать тканям, не нарушая могаболизма клетки.Еи-' ражошгае ипгибирущое дейсгвио ваиэдзта ашония путем связывания некоторой доли катали-;;ческой активности в нзаих кссло-допшмк согласуется с результатами экспериментов па порокси-дазо из хрена и гшеш ( berrrj ,1930).

Полученные донные об остаточной гароксэдазюй активности

Отдельных tnO^opMOHTOD ТКаНЗЙ, КУЛЬТИБИруСМиХ j.n vitro юлио попользовать для изучения функционального состояния растительных форм, как один из методов исследования устойчивости растений в биотехнологических исследованиях';-

I

П

4

СП

ВЫВОДЫ

I. Установлено,что пероксвдаза тканей сахарной свеклы отличается высокой гетерогенностью, разнокачествендастыо катодных изопероксидаэ и может быть исдальзована в качестве биохимического маркера на все« этапах биотехнологичэcraix работ:

- для характеристики и изучения физно логичесдого состояния

исходного материала сахарной свеклы, вводимого в культуру to vitro;

- в качестве возможного белкового маркера дифференциации и органогенеза каллусных тканей, для идентификации гигов каллуса; для прогнозирования органогенетических потенций растений, культивируемых in vitro;

- для сравнения полученных растений - регенерангов с исходными родительскими формами, для выявления сомаклональной из--менчивости.

2". Показано регулягорное действие ф иго гормонов я триптофана в среде на пероксвдазную систем каллусных культур. Введение триптофана в концентрации 50-100 мг/л стимулирует кал--иусообразование; .

3*. Установлено,что для характеристики функционального »стояния растительных тканей in vitro следует привлекать шчзствэннце и количественные показатели активности пероксн-хазы в питательной среде.

Выявлено ингибируодее действие танина, сана да та оммо-:шя, цитрата и хлорида натрия на изопероксвдазы тканей сахарной свеклы in vitro .Показана дифференциация катодных изо-мроксйдаз по степени резистентности к денатурирувдему эффекту танина и ашоюв солей.

5. Продемонстрирована неоднородность кагрдных перокспдаз адстьов интактных растений сахарной свеклы по аминокислотному зосгаяу, по субстрагной-специфичности и устойчивости к воэ-хействип детергентов и шчевины.

6. Применение одного из современных методов многомерной яатистикя - кластерного анализа позволило определить степень зходства-различяй между катодными изо'зимами по субстратной :пецв$ичности, ло устойчивости к денатурантам, по аминокислог-юму составу.

РЕКОМЕНДАЦИИ да СОВМЕСТНОЙ РАБОТЫ БЮТЕХНОЛОГОВ И БИОХИМИКОВ

1, Для биохимической оценки функционального состояния . тканей сахарной свеклы, культивируемых в условиях in vxtro, для прогнозирования дифференциации и органогегеза каллусов следует использовать изозимный состав и относительную активность изопероксидаз тканей rt в питательной среде'.

2. Для интенсивного роста каллусных тканей сахарной свеклы рекомендуется применение в питательной среде триптофана в концентрации 50-100 мг/л.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

I'. Перуанский Ю.В.\Алимгазинова Б.Ш,- Изопероксвдазы самоопиленных линий сахарной свеклы // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана'.- 1985, № II.- С.30-32.

2. Алимгазипова Б.Ш. Использование изопороксадаз для идентификации сашопшепных линий сахарной свеклы в селекционной работе •// В сб.тр.:"Биохимические показатели в селекции верно-вых культур" - Алма-Ата, I986.-C.32-39.

3. Савич И.М.,Тажибаева T.JI.,Алимгазинова Б.Ш.Дойствие детгогентов и шчевшш на порркспдазы пшеницы, кукурузы и сахарной споклы // Физгология растений.- 1988.- Т'.35.Вып.2.-

С.361-368".

4. Алимгазинова Б.Ш., Савич И.М. Аминокислотный состав щелочных пероксидаз листьев сахарной свеклы // Известия АН КаэССР-.- 1990.- & 5.- С.76-79.'

5.- Перуансютй Ю'.В".!,Алимгазипова Б;1!1.-,Конахметов M.K., Абугализв И.А. Изопероксидазы каллусных культур сахарной свек-лы//Докяады ЕЛСХНШГ.-1991.- 1Ь 1;-С.7-Ю.

6. Алимгазинова Б.Ш. Перокоддазы при корнеобразованпи растений сахарной свеклы in vitro // Тез.Всесоюзн;коиф. го сельскохозяйственной биотохшлогии,- Целиноград,I99I.-C.II8-II9

7; Абугэлиев И.А.,Кокахметов М.К;,Алимгазинова Б.Ш.-, Айтшбетова К. Шрфологическая и биохимическая характеристика М0р!г'1онов сахарной своклы // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана.- 1991.- К 8.- С.20-22.

Э.Алимгпзииова Б.Ш;,Кожахметов М.К;Пероксвдазы тканей сахарной свеклы vitro// Новости науки Казахстанаi-КазНИИТИ;-Алвд-Ага,-1991.-С. ^ ^