Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА BOLA-DRB3 В СВЯЗИ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ И ВОСПРИИМЧИВОСТЬЮ К ЛЕЙКОЗУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ И СИММЕНТАЛЬСКОЙ ПОРОД В УСЛОВИЯХ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА BOLA-DRB3 В СВЯЗИ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ И ВОСПРИИМЧИВОСТЬЮ К ЛЕЙКОЗУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ И СИММЕНТАЛЬСКОЙ ПОРОД В УСЛОВИЯХ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН"



На правах рукописи

ШАРИФУЛЛ1ША МАПЛЯ МУСАГНТОВ11А

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ВОЕА-ОИВЗ В СВЯЗИ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ И ВОСПРИИМЧИВОСТЬЮ К ЛЕЙКОЗУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ И СИММЕНТАЛЬСКОЙ ПОРОД В УСЛОВИЯХ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН

06.02.01 — разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сонскаиие ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

УФА - 2005 - у

На правах рукописи

ШАРИФУЛЛШ1А МАИ ЛЯ МУСАГ11ТОВНА

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ВОЬА-РКВЗ В СВЯЗИ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ И ВОСПРИИМЧИВОСТЬЮ К ЛЕЙКОЗУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ И СИММЕНТАЛЬСКОЙ ПОРОД В УСЛОВИЯХ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН

06.02,01 - раэведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Работа выполнена на кафедре разведения сельскохозяйственных животных и в лаборатории молекулярной генетики при ФГОУ В ПО «Башкирский государственный аграрный университет»

Научный руководитель • Заслуженный деятель науки РБ,

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Ахатова Ираида Абубакировна

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук

Саитбаталов Tarup Файзрахманович кандидат сельскохозяйственных наук Гизатуллин Ринат Сахиевич

Ведущая организация - ГНУ «Башкирский научно-исследовательский

институт сельского хозяйства»

Зашита диссертации состоится «Ф> марта 2005 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.03 при ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» по адресу; 450001, г.Уфа, ул. 50 лет Октября, 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного аграрного университета

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационное совета

доктор сельскохозяйственных наук, профессо^^^ Гнниятудлин М.Г.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Многочисленные публикации и данные официальной ветеринарной статистики свидетельствуют о том, что среди инфекционных болезней крупного рогатого скота лейкоз по тяжести поражения органов, тканей, массовости проявления и экономическим последствиям занимает ведущее место. Заболевание наносит значительный экономический ущерб животноводству страны вследствие гибели и вынужденной выбраковки высокопродуктивных племенных животных, утилизации туш и органов с опухолевыми изменениями, расходов, связанных с ограничительными мероприятиями. Заболеваемость крупного рогатого скота лейкозом - одна из наиболее важных проблем не только ветеринаркой медицины, животноводства, но и биологин, экологии в целом, имеющая непосредственное отношение к безопасности здоровья человека, так как вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) имеет близкое морфологическое и эволюционное родство с вирусом Т-клеточного лейкоза человека. В связи с этим актуальным является проблема диагностики лейкоза на ранних стадиях заболевания. С помощью применяемых в настоящее время серологических методов диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота полностью искоренить заболевание "невозможно. Поэтому особую значимость для точной диагностики вируса представляют методы молекулярной биологии, в частности, лолимеразная цепная реакция (ПЦР), которая зарекомендовала себя как надежный, специфичный, достоверный и чувствительный тест для раннего выявления инфицированных ВЛКРС животных.

Для борьбы с лейкозом крупного рогатого скота разрабатываются селекционно-генетические методы с целью получения здорового, резистентного потомства. Работы многих ученых посвящены изучению механизмов генетической устойчивости животных к лейкозу (В.М. Нахмансон, 1973, 1986, 1997; Л.К.Эрнст и соавт., 1979; О.К.Гаврилов, В.П.Шишков, 1983; А.Г.Незавитин, 1992, 1995 и др.). Многие годы основу селекции сельскохозяйственных животных составляла, и продолжает оставаться актуальной, оценка генотипов животных по частоте заболеваемости особей, связанных родством и инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота. В последние годы, в связи с бурным развитием молекулярной генетики, особое значение приобретает ПЦР-метод для раннего отбора по устойчивости и восприимчивости к лейкозу и изучения главного комплекса гистосо вместимости, участвующего в регуляции иммунного ответа организма, в частности, в осуществлении клеточного взаимодействия при трансплантации органов и тканей, а также связанного с развитием многих заболеваний, в первую очередь аутоиммунных, онкологических, инфекционных (А.Р.Слепченко, 1994; И.Г.Удпна, 1994, 2001, 2003; Г.Е.Сулимова, 1995, 1996; С.П.Павленко и соавт., 1996; Л.К.Эрнст и соавт., 1997).

Целью работы явилось изучение полиморфизма гена класса И главного комплекса гистосо вместим ости крупного рогатого скота (ВоЬА-ОЯВЗ) в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу крупного рогатого скота

черно-пестро(1 и симментальской пород в условиях Республики Башкортостан. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• сформировать банк ДНК! изучаемых популяций крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород;

• исследовать ДН К-палим орфизм гена ВоЬА-РЯВЗ у крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород с различным уровнем инфицированное™ вирусом лейкоза крупного рогатого скота;

• провести анализ распределения частот аллелей и генотипов в группах вирусоноснтелей и здоровых животных;

• оценить генетическую структуру изучаемых популяций по восприимчивости и устойчивости к лейкозу;

• разработать научно обоснованные рекомендации по ранней оценке уровня устойчивости и восприимчивости ремонтного молодняка крупного рогатого скота к лейкозу к повышению генетической детерминированности устойчивости племенных стад к заболеванию;

• определить экономическую эффективность анализа ДНК -полиморфизма при профилактике лейкоза кру пного рогатого скота.

Научная новизна. Впервые в условиях Республики Башкортостан с использованием современных молекулярно-генетических методов изучен ДНК-полиморфизма гена класса И главного комплекса гнстосовместимости (ВоЬА-й1ШЗ) у племенного крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород. Создан банк ДНК объемом 300 проб как база для дальнейших исследований в области понуляциокной генетики. , Проанализирована генетическая структура стад трех племенных хозяйств с установлением в них доли животных, несущих устойчивые и чувствительные к лейкозу генотипы. Подтверждена роль уровня гетерозиготпости как не специфического фактора устойчивости к лейкозу. Предложена и обоснована экономическая эффективность повышения уровня генетической детерминированности устойчивости стад к лейкозу на основе раннего отбора племенного молодняка при помощи ПЦР — тестирования на восприимчивость к заболеванию.

Теоретическая н практическая значимость работы. На основе изучения полиморфизма гена ВоЬА РЯВЗ крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород, генетической структуры популяций, частоты аллелей, ответственных за устойчивость и чувствительность к лейкозу, подтверждена генетическая детерминированность предрасположенности к заболеванию и предложен метод отбора молодняка на основе ПЦР -тестирования на первом месяце жизни. Ранний отбор и использование для ремонта стад устойчивого к заболеванию молодняка одновременно обеспечивает сокращение непроизводительных затрат по выращиванию на племенные цели особей с высоким риском развития лейкоза и повышение уровня резистентности за счет наследственного закрепления признака.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на двух международных научно-практических конференциях: «Пути повышения эффективности АПК в условиях вступления России в ВТО» (г. Уфа, 2003),

«Проблемы и пути интенсификации племенноП работы в отраслях животноводства» (г. Уфа, 2004); на республиканских научно-практических конференциях молодых ученых и аспирантов (г. Уфа, 2003, 2004); на ПО-""1 научно-практической конференции преподавателей, сотрудников и аспирантов университета «Достижения аграрной науки - производству» (г. Уфа, 2004).

Публикация результатов исследован»П. Основные результаты исследований опубликованы в 6 научных статьях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, предложений производству, библиографического списка. Ока изложена на 120 страницах компьютерного текста, включает 10 таблиц, 13 рисунков. Библиографический список включает 226 наименований, в том числе 90 -иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на зашиту:

1. Генетический полиморфизм гена ВоЬА - ОИВЗ у здоровых и инфицированных вирусом лейкоза племенных животных черно-пестрой и симментальской пород.

2. Ассоциативная связь выявленных ранее мол екулярио-генети чески х маркеров предрасположенности и устойчивости с заболеваемостью лейкозом крупного рогатого скота.

3. Породные особенности аллелофонда по уровню распространения аллелей, ответственных за устойчивость и чувствительность к лейкозу.

4. Гстерозиготность как иеспецнфический фактор устойчивости к лейкозу.

5. Раннее прогнозирование восприимчивости к лейкозу методом типирования аллелей и генотипов и его использование для повышения резистентности племенного поголовья к заболеванию.

Исследования проводились в рамках ГНТП РБ ло программе №11 «Научное обеспечение устойчивого развития агропромышленного комплекса РБ, утвержденной Постановлением Кабинета Министров РБ № 285 от 26 сентября 2002 г.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2Л Материал и методы исследований

Работа выполнялась в 2002-2004 г.г. на базе кафедры разведения сельскохозяйственных животных и лаборатории молекулярной генетики при ФГОУ В ПО «Башкирский государственный аграрный университет».

Общая схема исследований приведена на рисунке 1.

Объектами исследования явились 100 коров черно-пестрой породы и 100 симментальской породы, принадлежавшие ФГУП СПО «Стерлитамакский совхоз-техникум», 100 коров черно-пестрой породы из ККХ «Заря» Сгерлкта макс кого района Республики Башкортостан. На

основе серологического исследования (РИД в геле агара) популяции черно-пестрого и симментальского скота подразделили на две группы: здоровые и внрусоносители.

Кровь для исследований брал» по общепринятой методике. В качестве антикоагулянта применяли стерильный раствор «Глюгниир» в соотношении препарата и крови 1:4. ДНК выделяли из лейкоцитов крови по стандартной методике с использованием протеи пазы К, фенол-хлороформенной очистки с последующим осаждением этанолом (В.Н.Горбунова, 1999),

Реактивы для полимеразной цепной реакции и рестрикцноиного анализа были получены из фирмы «СибЭнзим», г. Новосибирск. Олнгонуклеотидные прайм еры HL030 и HL032 были синтезированы в ЗАО «Сннтол», г. Москва. Полимеразную ценную реакцию проводили в амшшф и кагоре ТП4-ПЦР-01-«Териик» (Россия) по методике Г.Е.СулимовоЯ (2002) в один этап в следующем режиме: денатурация - 0,8 мни лри 94°С, отжиг - 0,8 мин при 68°С, синтез - 0,3 мин при 72°С, всего 30 циклов.

Смесь для ПЦР содержала по I мкл препарата ДНК, по I мкл каждого лраймера (HL030 И HL032), 2,5 мкл 10х буфера для амплификации, 18,5 мкл дистиллированной воды, 1 мкл суммарного dNTP и 1 мкл Taq-полимеразы под слоем вазелинового масла.

Рестрнкиионный анализ амплифицированных ДНК проводили эндонуклеазами Rsa I,Hae Ш н Xho К. Дня рестрикции отбирали 8,5 мкл амплификата, добавляли 2,5 мкл смеси одной из эндонуклеаз с буфером. Реакционну ю смесь инкубировали при 37°С в течение J 6 часов.

В качестве маркера молекулярных масс использовали ДНК ллазмид pUC 19 или pBR322, обработанных рестриктазой Mspl.

Продукты рестрикции разделяли злектрофорети чески в 7,5% полиз к р илам илном геле и тестировали в ультрафиолетовом свете после прокрашивания бромистым этидием. Присутствие того или иного аллеля гена DRB 3 определяли по наличию или отсутствию сайтов рестрикции (Г.Е. Сулимова н соавт., 2002; M.J.T.Van Eijk et. al., 1992).

Изображения гелей фиксировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» и прилагаемого к ней программного обеспечения «Gel-lmager» и «Gel-Analysis» в версии J.O. Частоту аллелей и генотипов определяли по формуле Меркурьевой Е.К. (!977).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программного обеспечения MS Excel 2000 (Microsoft) и компьютерной программы RxC (Rows х Columns)(Roff, Bentzen, 1989).

При попарном сравнении частот генотипов н аллелей в группах вирусоносителей и здоровых животных использовали критерий х2(Р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Йетса на непрерывность.

Сила ассоциаций с риском развития лейкоза для конкретных аллелей и генотипов оценивали в значениях показателя соотношения шансов (odds ratio, OR) (Bland, 2000). При OR > 1 ассоциацию заболевания с аллелем или генотипом рассматривали как положительную («фактор риска») и OR < 1 -как отрицательную ассоциацию («фактор устойчивости»).

Рисунок 1 Схема проведения исследований

g

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАН«!"!

2.2.1 Распределение частот аллелей гена BoLA-DRB3 в исследуемых популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой породы

Результаты распределения частот аллелей геиа BoLA-DRB3 в полуляини черно-пестрого скота из ФГУП СПО «Стерлнтамакский совхоз-техникум» представлены в таблице 1.

В исследованной нами популяции крупного рогатого скота черно-пестрой породы, принадлежавшей ФГУП СПО «Стерлнтамакский совхоз-техникум», выявлено 17 аллельных вариантов. Выявленные аллельные варианты составили среди 100 обследованных животных 17 генотипов. Не были обнаружены аллели: DRB3.2«!, *2, *5,*9, *10. *12, «13, *14, *17, *19, *20, *21, "29, "30.

В под выборке внрусоносителей, в которой количество животных составило 50 голов, достаточно частыми являются аллели; *]б (0,1), * 18 (0,072), «22 (0,163), *24 (0,182), три из которых - "16, »22, *24 - определяют чувствительность к развитию лейкоза у крупного рогатого скота. Частота остальных 11 аллелей не превышает 0,06.

В под выборке из здоровых животных, количество которых составило 45 животных, выявлено 16 аллельных вариантов. Данная группа животных характеризуется относительно равномерным распределением частот аллелей. Наиболее часто встречаются: *11 с частотой 0,08, *22 - 0,111, *23 - 0,155, *24 - 0,133, «28-0,111.

В результате исследования популяции крупного рогатого скота черно-пестрой породы, принадлежавшего ККХ «Заря», выявлено 19 аллельных вариантов гена BoLA-DRB3. Данные аллельные типы составили 13 генотипов среди 100 обследованных животных. Характер распределения аллелей геиа DRB3.2 и их частот в данной популяции крупного рогатого скота представлен в таблице 2,

В подвыборке животных-в иру со носителей, количество которых составило 46 голов, наиболее часто представлены следующие аллели: *16 с частотой 0,130, *18 - 0,109, *22 - 0,174, *24 - 0,152, из которых »16, *22, *24. ответственны за чувствительность к лейкозу крупного рогатого скота.

Среди животных, оставшихся здоровыми, преобладают аллели: *16 (0,093), *18 (0,148), *22 (0,083), »23 (0,130), *24 (0,074), *28 (0,111). Частота остальных аллелей не превышает 0,046.

Данные по распределению частот аллелей *8, *16,*22,*24, *11, *23, *28 в изученных популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой породы в группах внрусоносителей и здоровых животных показаны на рисунках 2 и 3.

Рисунок 2 Частоты аллелей, ответственных за чувствительность (*8, * 1 б, *22, *24) и устойчивость (*П,*23, *28) к лейкозу в популяции черно-пестрого скота (ФГУП СПО «СтерлнтамакскиП совхоз-техникум»)

к ррфусиносители Р эпороььк]

Рисунок 3 Частоты аллелей, ответственных за чувствительность (*8, *16, *22, *24) и устойчивость (*1 1.*23, *28) к лейкозу в популяции черно-пестрого скота (ККХ «Зарям)

Таблица 1 Частоты аллелей гена ВоЬА-ОКВЗ в популяции 1 крупного рогатого скота черно-пестрой породы

Группа животных

Аллели гена BoLA-DRB3 здоровые(n=45) вирусоносители (п=55) общая популяция (п=100) !

n частота п частота п частота 1 1

Аллели, определяющие чувствительность к лейко!у; DRB3.2*» DRB3.2*] 6 DRB3,2*22 DRB3,2*24 6 10 12 0,066 0,Ш 0,133 7 11 18 20 0,06 0,1 0,163 0,182 7 17 28 32 0,035 0,085 0,14 0,16

Алл ели.опре делающие устойчивость к ! лейкозу: DRB3.2M1 DRB3.2*23 DRB3.2*28 7 14 10 0,08 0,155 0,111 8 4 0,072 0.036 7 22 )4 1 0,035 0,11 0,07

Нейтральные аллели: DRB3.2*3 DRB3.2M DRB3,2*6 DRB3.2*7 DRB3.2*15 DRB3.2M8 DRB3.2*20 DRB3.2*25 DRB3.2*26 DRB3.2*27 2 2 3 7 2 6 2 3 2 2 0,022 0,022 0,033 0,0S 0.022 0,066 0,022 0,033 0.022 0,022 3 4 4 5 3 8 6 5 4 0,027 0,036 0,036 0,045 0,027 0,072 0,054 0,045 0,036 5 6 7 12 5 14 2 9 7 6 0,025 0,03 0,035 0,06 0,025 0,07 0,01 0,045 0,035 0,03

Сумма 90 1,000 ПО 1,000 200 1,000

Примечания: Номенклатура аллелей дана в соответствии с данными MJ.T. Van Eijk (1992). Статус аллелей по отношению к лейкозу определяли по данным Г.Е.Сулимоеой (1995).

Таблица 2 Частоты аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ в популяции 2 крупного рогатого скота черно-пестрой породы

1 Группа животных

' Аллели гена ВоЬА-! ЭКВЗ здоровые(л=54) вирусоносители (п=4б) общая популяция <п=100)

ч 1 п частота п частота п частота

: Аллели.определяющие

! чувствительность к ' лейкозу:

: рквз,2*« ! ОИВ3.2*1б РКВ3.2*22 ; ШгВ3.2*24 2 10 9 8 0,019 0,093 0,083 0,074 8 12 16 14 0,087 0,130 0,174 0,152 10 22 25 22 0,05 0,11 0,125 0,11

А л л ели, опр е депяющи е устойчивость к лейкозу; ОИВЗ,2*1 1 5 0,046 5 0,025

ОГШ3.2*23 14 0,130 4 0,057 18 0,09

ОКВ3.2*28 13 0,120 6 0,028 19 0.095

Нейтральные аллели:

оавз.2*2 Э1ш3,2*3 оивз,2*4 ОКВ3.2*б ОКВ3.2*7 ОЯВЭ.2*12 ОЯВ3.2*15 ОКВ3.2*18 □КВ3.2*20 ОКВ3.2*21 ОКВ3.2*25 2 4 2 3 5 2 3 16 5 2 3 0,019 0,037 0,019 0,027 0,046 0,019 0,027 0,148 0.046 0,019 0,027 3 2 4 3 1 2 10 2 1 4 0,033 0,022 0,043 0,033 0,011 0,022 0,109 0,022 0,011 0,043 2 7 4 7 8 3 5 26 7 3 7 0,01 0,035 0,02 0,035 0,04 0,015 0,025 0,13 0,035 0,015 0,035

Сумма 108 1,000 92 1,000 200 1,000

2.2.2 Распределение частот аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ в популяции крупного рогатого скота симментальской породы

В изученной популяции крупного рогатого скота симментальской породы выявлено 18 аллелей гена ВоЬАЧЖВЗ, которые составили 23 вида генотипа в выборке из 100 животных. Частоты аллелей в группах вирус о носителей и здоровых животных представлены в таблице 3.

В целом по популяции можно отметить, что спектр аллелей гена ВоЬА-ОЕШЗ, изученный на черно-пестрой породе, подтвердился и для симментальской породы крупного рогатого скота.

Среди 50 в и русо носит елей наиболее часто встречались аллели: *8, *! 6, *24, *25 с частотами 0,09, 0,1, 0,08, 0,1 соответственно, из которых первые три обуславливают чувствительность к развитию лейкоза.

Аллели, ответственные за устойчивость (*11, *23, *28), встречаются в подвыборке с частотами от 0,04 до 0,08,

В группе здоровых животных (50 годов) наибольшую частоту отмечали у аллелей *П (0,32), *23 (0,14), *28 (0,1), которые ответственны за устойчивость крупного рогатого скота к лейкозу. Частоты аллелей, определяющих чувствительность к лейкозу, составили от 0,02 до 0,06.

В целом в популяции доля аллелей, обуславливающих устойчивость к лейкозу, составила 28,5%, аллелей, обуславливающих восприимчивость -25,5%."

Распределение частот аллелей *16,*22,*24, *] 1, *23, *28 я изученной популяции крупного рогатого скота симментальской породы в группах здоровых животных н в и русо носите лей показано на рисунке 4.

0.14 г-Г РТ "

!

I »

I

С *

\ 9

** *14 *гг *и

|Я »пр>со»ооие.м □ иорфрые [

Рисунок 4 Частоты аллелей* ответственных за чувствительность *16, %22, *24) и устойчивость (*М,*23, *28) к лейкозу в полуляции крупного рогатого скота симментальской породы

Таблица 3 Частоты аллелей гена ВоЬА-ОКВЗ в популяции крупного рогатого скота симментальской породы

Группа животных

Аллели гена ВоЬА-БЯВЗ здоровые(п=50) вирусоносители <п=50) общая популяция (п=100)

п частота п частота п частота

А лл ел н ,о п р еделя ю ш не ,

чувствительность к лейкозу:

РЯВ3.2*8 2 0,02 9 0,09 и 0,055

ОЯВ3.2*16 5 0,05 10 0,1 15 0,075

ОЯВ3.2*22 6 0,06 7 0,07 13 0,065

Ш1В3.2*24 4 0.04 8 0,08 12 0,06

А л лели,оп ределя юш и е устойчивость к лейкозу: ОКВ3.2*П 12 0,12 4 0,04 16 0,08

ОИВ3.2*23 14 0,14 8 0,08 22 0,11

1ЖВ3.2*28 10 0,1 9 0,09 19 0,095

Нейтральные аллели: —

РКВ3.2*2 5 0,05 2 0,02 7 0,035

ОЯВ3.2*3 5 0,05 4 0,04 9 0,045

ривз.гм 4 0,04 2 0,02 6 0,03

ОКВ3.2*6 2 0,02 2 0,02 4 0,04

□ЯВ3.2*14 1 0,01 2 0,02 3 0,015

ОЯВ3.2* 15 2 0,02 4 0,04 6 0,03

ВР.В3.2*18 5 0,05 6 0,06 и 0,055

□ЯВ3.2*20 4 0,04 6 0,06 10 0,05

Р1Ш3.2*21 4 0,04 3 0,03 7 0,035

ОКВ3.2*25 10 0,1 10 0,1 20 0,1

ОКВ3.2*27 5 0,05 4 0,04 9 0,045

Сумма 100 1,000 100 1,000 200 1,000

2.2.3 Изучение ассоциаций аллелей гена BoLA-DRB3 с риском развития лейкоза у крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород

Известно, что риск развития того или иного заболевания зависит от многих факторов, в том числе и от наличия в генотипе организма аллелей предрасположенности или резистентности. В случае для лейкоза крупного рогатого скота в системе BoLA аллелями, ассоциированными с предрасположенностью, являются: *8, *16, *22, *24 и ассоциированными с резистентностью к развитию лейкоза - *11, *23, *28. Для более достоверного определения силы ассоциаций аллелей гена с риском развития заболевания определяли показатель соотношения шансов (odds ratio, OR). При значениях OR > 1 ассоциацию аллеля с заболеваемостью считали положительной, при OR < 1 — отрицательной.

Наибольшие значения OR. во всех изученных популяциях крупного рогатого скота отмечались для аллеля *8, ассоциированного с предрасположенностью к заболеванию лейкозом. Так, в популяциях черно-пестрого скота значения OR составили соответственно: 6,41 (С 1=0,7-46,7; Р<0,01) и 5,47 (С1=0,98-39>6; Р<0,05), в популяции симментальского скота -5,26 (С1=0,97-37,6; Р<0,05), то есть при наличии данного атлеля в генотипе животного риск заболеваемости достоверно возрастает. Значения OR > 1 отмечались для всех аллелей, ответственных за восприимчивость к лейкозу в изученных популяциях: *16 - 1,62; 1,55; 2,25; »22 - 1,7; 2,66; 1,19; *24 -1,57; 2,51; 2.19. Полученные значения показателя соотношения шансов подтверждают ассоциацию этих аллелей с лейкозом в изучаемых породах.

Наименьшие значения соотношения шансов - OR выявлены для аллеля ♦11, являющегося аллелем устойчивости: 0,005, 0,005 и 0,27, Также значения OR < 1 отмечались для остальных аллелей, ответственных за устойчивость к заболеванию лейкозом - *23 (0,37, 0,27 и 0,49), *28 (0,27 0,47 и 0,87).

2.2.4 Распределение уровня гетерозиготности в изученных популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород

Показатели фактической гетерозиготности гена ОЙВЗ в популяциях оказались достаточно высокими и составили: в популяции черно-пестрого скота из ФГУП СПО «Стерлитамакский совхоз-техникум» - 95%, в популяции черно-пестрого скота из ККХ «Заря» - 96%, в популяции симментальского скота - 96%, В таблице 4 приведены данные по определению фактического и теоретического уровней гетерозиготности в изученных популяциях крупного рогатого скота в группах вирусоносителей и здоровых животных.

Таблица 4 Показатели уровня гетерозиготности в популяциях черно-пестрой н симментальской пород

Гмерознготность Популяция 1 1 [о пуля цня 2 Популяция 3

Здоровые вирусоно- СИТСЛ1Г здоровые вирусоно-orre.ni здоровые вирусшо-сители

Фактическая 0,98*0,02 0,93 ±0,03 0,98*0,01 0,95±0,03 1,00 0,98±0,01

Теоретическая 0,92±0,01 0,91 ±0,01 0,92*0.01 0,9) ±0,01 0,92*0,01 0,96±0.01

Примечание; популяция 1 - черно-пестрый скот из ФГУП СПО «Стерлитамакский совхоз-техникум»; популяция 2 - черно-пестрый скот из ККХ «Заря»; популяция 3 - крупный рогатый скот симментальской породы.

Во всех трех популяциях, в группах инфицированных животных уровни гетерозиготности оказались ниже по сравнению со здоровыми животными. В симментальской породе отмечен самый высокий уровень фактической гетерозиготности в группе здоровых особей (100%), что, по сравнению с черно-пестрой, указывает на пониженный риск заболеваемости лейкозом. Во всех группах черно-пестрого скота фактический уровень гетерозиготности был несколько выше, чем теоретический, в симментальской породе аналогичные особенности наблюдали в группе вирусоносителей.

2.2.5 Результаты анализа ассоциаций г енота лов с риском развития лейкоза в изученных популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород

В группе здоровьк животных черно-пестрой породы из ФГУП СПО «Стерлитамакский совхоз-техникум», число которых составило 45, наблюдали следующее распределение частот генотипов. С высокой частотой встречаемости отметили генотип 28/7 — 0,155, у которого аллель *23 определяет устойчивость к лейкозу, аллель *7 — нейтральность, отношение шансов (<Ж) составляет 0,0005, 6,95, уровень значимости Р<0,001, доверительный интервал (С1) = 0,45-0,58. С такой же частотой встречался генотип 22/23, у которого аллель *22 - определяет чувствительность, *23 - устойчивость, отношение шансов для этого генотипа составило: ОЯ = 0,54 (х3 = 2,46, Р<0,05, С1=0,13-2,11).

В группе вирусоноснтелей, число которых составило 55 животных, с наибольшей частотой встречался генотип 22/24 - 0,16 ((Ж = 8.61, х' ~ 4,04, Р<0,01, С1 = 1,03-191,7). Оба алледя ассоциированы с чувствительностью к лейкозу, а высокое значение отношения шансов (01?) подтверждает повышенный риск заболевания лейкозом животных с данным генотипом.

Частота другого генотипа, ассоциированного с чувствительностью к лейкозу, 8/16 составила 0,13, значение (Ж также оказалось достаточно высоким - 6,42 (Х: = 5,42, Р<0,01, С1 = 0,74-146,7). Генотип 16/22 ассоциирован с чувствительностью к лейкозу, частота составила — 0,07, ОЯ = 3,45 (х2 = 1,4, Р<0,04, С1 = 0.34-82.7). Генотип 22/23 отмечали с частотой 0,09, значение ОЯ = 0,54(Х2=Ь'»6, Р<0,05, С1 = 0,13-2,11).

При анализе распространения генотипов в группе здоровых животных из ККХ «Заря» отметили наиболее представительный генотип - 1623 с частотой 0,13, один алиель которого (*1б) ассоциирован с чувствительностью к лейкозу, *23 - с устойчивостью. Значение ОЯ составило 0,15, (х! = 4,6, Р<0,01, С1 = 0,007-1,29). Генотип 22/23 с частотой 0,11 также имеет в своем составе аллель, ответственный за устойчивость (*23) и аллель, ответственный за чувств>ггельность к лейкозу <*22), значение ОЯ составило 0,76 (х2 =2,3, Р<0,04, С1 = 0,16-3,34).

В группе инфицированных наиболее часто отмечали животных с генотипом 8/16 — 0,17, аллели которого ассоциированы с чувствительностью к лейкозу. Значение ОЯ для данного генотипа составило 11,1 (х2 = 5,54, Р<0,01, С1 = 1,31-251,7). Для генотипа 28/18 (частота 0,13) значение ОК. составило 1,87 (X2 - 2,36, Р<0,05, С1 = 0,43-8,61). Генотипы с чувствительными аллелями 16/22 и 22/24 отмечали с одинаковой частотой 0,08, значение ОЯ составило соответственно - 5,05 и 2,4. Генотип 22/23 с частотой 0,08, один аллель которого ассоциирован с чувствительностью (*22), другой — с устойчивостью (*23), значение О Я = 0,76 {уС~ 5,5, Р<0,01,С1 = 0,16-3,34). Частоты остальных генотипов составили 0,02-0,06.

В группе здоровых животных симментальской породы наиболее высокую частоту встречаемости отметили у генотипа 11/22-0,12, у которого *11 аллель ассоциирован с устойчивостью, *22 - ассоциирован с чувствительностью к лейкозу, значение ОЯ = 0,47 (х2= 4,8, Р<0,01, С1 = 0,08 - 2,29). Генотипы 23/3 и 23/4 выявлены с одинаковой частотой 0,1 и значение отношения шансов развития заболевания составило 0,18. Частота генотипа 16/11, у которого аллель *1б обуславливает предрасположенность, а аллель * 11 - устойчивость к лейкозу составила 0,06, а значение ОЯ = 0,32 (х~ =2,6, Р<0,05, С1 = 0,01-3,65). Частоты остальных генотипов составили 0,02-0,06.

Среди изученной выборки инфицированных животных симментальской породы наиболее представительным генотипом является 8/16 с частотой 0,18, оба аллеля ассоциированы с предрасположенностью к лейкозу - ОЯ = 5,27 (х2"= 3,67, Р<0,05, С1 = 0,97-37,6). Также отметили генотип 22/23 с частотой 0,08, ОЯ = 4,26 = 2,8,. Р<0.05, С1 = 0,42-102,1). Частоты остальных генотипов составили 0,04-0,08.

2.2.6 Экономическая эффективность результатов исследований

При определении экономической эффективности исследований нами за основу взят уровень предотвращен кого ушерба при раннем прогнозировании

предрасположенности к лейкозу, которое достигается при проведении ПЦР -анализа на 1 месяце жизни племенного молодняка. Расчеты проводили в соответствии с формулой, приведенной в Ветеринарном законодательстве (2000):

П,= Мо* К„х КП*Ц, где

П предотвращенный экономический ущерб;

М,- поголовье животных;

К,,- коэффициент возможной заболеваемости животных;

К„ - удельная величина потерь основной продукции в расчете на одно заболевшее животное, кг;

Ц-цена реализации единицы продукции, руб Пу= 300*0,011x36,7x30000 = 3633300

Экономический эффект, полученный в результате осуществления профилактических мероприятий, определяли по формуле:

Э.=П,-Зв,где

3 „ - затраты на мероприятия.

Э „=3633300-60000 = 3573300 рублей.

В расчете на 1 голову экономический эффект составил 11911 рублей.

ВЫВОДЫ ^

1. Создан банк ДНК крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород племенного назначения объемом 300 проб кзк база для дальнейших исследований в области популяционной генетики.

2. Изучением генетического полиморфизма гена Во!-А - ЭКВЗ в группах здоровых и инфицированных животных трех племенных стад: черно-пестрой и симментальской пород из Стерлитамакского совхоз-техникума и черно-пестрой породы — из ККХ «Заря» установлена наибольшая частота встречаемости'для аллелей в популяциях:

- а) черно-пестрой породы Стерлитамакского совхоз-техникума ОКВ3.2*7,*16, *18, *22, *23, *24, *25 с частотами 0,06, 0,085, 0,07, 0,14, 0,11, 0,16, 0,045 соответственно;

- б) черно-пестрой породы из ККХ «Заря» - ОНВ3.2*8, *)6, *18, *22, ♦23, *24, *28 с частотами 0,05, 0,П, 0,13. 0,125, 0,09, 0,11, 0,095 соответственно;

-в) симментальского скота - □аВ3.2*8, *11, *16, *18, *22, *23, *24, "28 с частотами 0,055,0,08,0,075, 0,055,0.065, 0,11, 0,06,0.095 соответственно. ___

3. Установлено существование межпородных различий по уровню распространения аллелей, ответственных за устойчивость и предрасположенность к лейкозу. В черно-пестрой породе более представленным является аллель, ответственный за предрасположенность к

лейкозу: РЯВ3.2*22: 14% и 12,5%, в популяции симментальского скота -6,5%. Аллели, ответственные за устойчивость к лейкозу, в обеих породах представлены примерно с одинаковой частотой, кроме аллеля ОКВ3.2*11, который в симментальской породе встречался с частотой 8%, в черно-пестрой породе - 3,5% и 2,5%,

4. Проанализирована генетическая структура изучаемых популяций на основе степени чувствительности к лейкозу:

- а) доля животных, несущих устойчивые генотипы в популяции черно-пестрого скота из Стерпитамакского совхоз-техникума составляет 43%, восприимчивые генотипы —57%;

- б> доля животных с чувствительными генотипами в популяции черно-пестрого скота из ККХ «Заря» составляет 39%, с устойчивыми генотипами 44%;

- в) в популяции симментальского скота доля животных с чувствительными генотипами составляет 19%, с резистентными — 56%,

5. В изученных популяциях показатели соотношения шансов по аллелям ОКВ3.2*8, *1б, *22, *24 составили <Ж>1. Следовательно, 42% изученного поголовья черно-пестрой породы Стерлитамакского совхоз-техникума н 39,5% - ККХ «Заря» имеют повышенный риск развития лейкоза крупного рогатого скота. Для популяции симментальского скота риск значительно ниже и составляет 25,5%.

6. Генетические маркеры устойчивости к лейкозу - ВоЬА - РКВЗЧ I, *23, *28 имеют низкие значения показателя соотношения шансов - (Ж<1. В популяции черно-пестрого скота устойчивость к заболеванию имеют 21,5% (Стерлитамакский совхоз-техникум) и 21% животных (ККХ «Заря»); симментальского - 28,5%,

7. Предрасположенность к заболеванию лейкозом имеет четко выраженную генетическую детерминированность: генотипы, устойчивые к лейкозу, в группах здоровых животных черно-пестрой породы составили 68% (Стерлитамакский совхоз-техникум) и 63% (ККХ «Заря»), симментальской -72%, в группах в и русо носителей - соответственно 21,8; 21,7 и 40%. Генотипы, ответственные за чувствительность к лейкозу, по черно-пестрой породе в группе внрусоноскгелей составили 51% (Стерлитамакский совхоз-техникум) и 56% (ККХ «Заря»), симментальской - 30%; а в группе здоровых -соответственно 20,0; 24,1 и 8%,

8. Обоснована роль уровня гетерознготности как не специфического фактора устойчивости к развитию лейкоза крупного рогатого скота: в группах инфицированных животных изученных популяций уровень гетерознготности колебался в пределах 0,93 - 0,98, в группах здоровых животных - 0,98 - 1,0.

9. Определена экономическая эффективность раннего выявления и вьгранжирования ремонтного молодняка с аллелями, ответственными за предрасположенность к лейкозу (ОЯВ3.2*8, *16, *22, *24) за счет сокращения непроизводительных затрат на выращивание потенциально больных животных предотвращенный ущерб в расчете на 1 голову составит 11911 рублей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основе проведенных исследований считаем целесообразным внедрение в систему борьбы с лейкозом следующих мероприятий.

1. Учитывая высокую информативность, точность, быстроту и возможность использования в раннем возрасте животных, в ветеринарную практику внедрить метод ПЦР - анализа, особенно при необходимости выявления предрасположенности к заболеванию у молодняка до шестимесячного возраста и необходимости оценки оздоровления стад после проведенных противолейкозных мероприятий.

2. Молодняк от высокоценных племенных животных в неблагополучных по лейкозу хозяйствах необходимо на первом месяце жизни протестировать методом ПЦР - анализа. Всех особей, несущих аллели, связанных с предрасположенностью к лейкозу (РЕШ3.2*8, ф 16, *22, *24> для сокращения непроизводственных затрат необходимо исключить из группы ремонтного молодняка и выращивать как неплеменных животных.

3. Для оптимизации уровня генетической устойчивости поголовья племенных хозяйств к лейкозу, для широкого использования при искусственном осеменении, быков-производителей следует допускать только после генетического тестирования на носительство аллелей, ответственных за чувствительность к заболеванию.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Шарифуллина Н.М. Динамика инфицирован пост крупного рогатого скота вирусом лейкоза в Республике Башкортостан / Н.М.Шарифуллина, И.А.Ахатова // Пути повышения эффективности АПК в условиях вступления России в ВТО: Материалы международной научно-практической конференции (19-20 февраля 2003 г.). - Уфа, 2003. - С.394-396.

2. Шарифуллина Н.М. К вопросу о генетико-селекционной оценке устойчивости к лейкозу крупного рогатого скота ) Н.М,Шарифуллина, И.А.Ахатова // Аграрная наука в XXI веке: Материалы республиканской научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов (21-22 мая 2003 г.). - Уфа, 2003. - СЛ41-142.

3. Шарифуллина Н.М. Изучение ДНК-полиморфнзма гена ВоЬА-ОКВЗ в популяции черно-пестрого скота при ломоши пол и мера зной цепной реакции / Н.М.Шарифуллина, И.А.Ахатова // Современные проблемы иммуногенеза, теории и практики борьбы с паразитарными и инфекционными болезнями сельскохо^йственных животных: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ и РБ, доктора ветеринарных наук, профессора Х.В.Аюпова и 55-летию кафедры паразитологии, микробиологии и вирусологии 6ГАУ (26-28 января 2004 г.). - Москва-Уфа, 2004. - С.321-323.

4. Шарнфуллина Н.М. Распространение аллелей гена Во1.А-01ШЗ, ответственных за устойчивость и восприимчивость к лейкозу в популяции черно-пестрого скота / Н.М.Шарифуллина // Материалы ] 10 научно-практической конференнии преподавателей, сотрудников н аспирантов университета «Достижения аграрной науки - производству». (19 янвзря-З февраля 2004 г.), - Уфа, 2004 г. - С.157-161.

5. Ахатова И.А. Селекция крупного рогатого скота на устойчивость к лейкозу / И.Л.Ахатова, Н.М.Шарифуллина !! Проблемы и пути интенсификации племенной работы в отраслях животноводства: Материалы международной научно-практической конференции (26-28 апреля 2004 г.), -Уфа, 2004, - С.87-90.

6. Шарифуллина Н.М, Новое в селекции крупного рогатого скота на устойчивость к лейкозу / Н.М.Шарифуллина // Материалы научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов (12 мая 2004 г.) — Уфа, 2004. — С.149-151.

Лицензия РБ на издательскую деятельность Яа 0261 от 10 апреля 1998 года. Подписано в печать 0 2005 г. Формат 60x84. Бумага типографская.

Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. /6 . Уел, изд. л. /, 05 Тираж 100 экз. Заказ Кг .

Издательство Башкирского государственного аграрного университета. Типография Башкирского государственного аграрного университета. Адрес издательства и типографии: 450001, г. Уфа, ул, 50 лет Октября, 34.

-V?

"J C> * i i

i f

гЪ.с.гс

JC/'C

->c? - 5 ; - ' -

fjs рог, £>¿zt?j

■ V > '; ; • -

; (

р - 2 О 4 б