Показатели свободно-радикального окисления и уровень кортикостероидов у больных с депрессией и деперсонализацией

Морозова, Марина Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Показатели свободно-радикального окисления и уровень кортикостероидов у больных с депрессией и деперсонализацией
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Показатели свободно-радикального окисления и уровень кортикостероидов у больных с депрессией и деперсонализацией"

На правахрукописи

П'в 01

2 5 ДЕК 7003

МОРОЗОВА Марина Геннадьевна

ПОКАЗАТЕЛИ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ И УРОВЕНЬ КОРТИКОСТЕРОИДОВ У БОЛЬНЫХ С ДЕПРЕССИЕЙ И ДЕПЕРСОНАЛИЗАЦИЕЙ

Специальность: 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском психоневрологическом институте имени В.М. Бехтерева.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Е.Е. Дубинина

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Ю.Л. Нуллер

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Б. Долго-Сабуров; кандидат биологических наук H.H. Зыбина

Ведущая организация:

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова

Защита диссертации состоится «ДЗ"» ср&паЛУъ^. 2000 года в -У-/ часов на заседании Диссертационного совета к 084.63.01 при Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии ,(197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 4/6).

Автореферат разослан 2000 года.

К?

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.В. Кириллов^

f ¿U-bz^O

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Со времени введения Г. Селье в научный лексикон термина «стресс» рамки этого понятия значительно расширились. Однако основная суть его осталась неизменной: стресс - это системная реакция организма, имеющая приспособительное значение в ответ на любое воздействие. Она проявляется не только активацией гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГГАКС), изменением нейро-медиаторного баланса, но и интенсификацией свободно-радикальных процессов с мобилизацией антиоксидантной системы. При любых стрессор-ных воздействиях происходит усиление генерации активных форм кислорода (АФК) (Саприн А.Н., Калинина Е.В., 1999). Процесс свободно-радикального окисления (СРО) в настоящее время признан абсолютно универсальным и общебиологически значимым механизмом при развитии любого вида патологии. Нарушение баланса про- и антиоксидантной систем в организме приводит к развитию так называемого окислительного стресса (ОС), который сопровождает и осложняет течение фактически всех заболеваний (J.M.McCord, 1996; Скулачев В.П., 1998). В этих условиях очень важна своевременная мобилизация антиоксидантной защиты (АОЗ), которая участвует в снижении уровня реакционноспособных соединений, препятствуя тем самым проявлению их токсического действия в тканях. Некоторые ткани (мозг, сетчатка, легкие) обладают повышенной чувствительностью к окислительному стрессу, что связано с особенностями их строения и метаболизма (Halliwell В., 1992). При патологических состояниях в мозговой ткани создаются условия для дополнительной генерации радикальных продуктов, повышения интенсивности окислительной деструкции белков и липидов, что приводит к нарушению структуры и функции клеточных мембран (Гуляева Н.Б., Ерин А.Н., 1995; Evans Р.Н., 1.993; Yotz М.Е., et.al., 1994; Halliwell В., 1989; Федорова Т.Н. с соавт., 1999).

Интенсификация процессов окислительной модификации компонентов клеточной мембраны мозга, в частности белков, может быть причиной изменений, связанных со способностью мембран генерировать и проводить нервный импульс, а также с нарушением рецепторных, медиаторных и энергетических систем. Возможно, это является одним из патогенетических звеньев возникновения психических расстройств, и, в первую очередь, таких, как депрессия и деперсонализация, в развитии которых стресс, в том числе и эмоциональный, играет существенную роль.

атной системы организма: повышение секреции эндорфинов и/или изменение чувствительности опиатных рецепторов (Мороз Б.Т., Нуллер Ю.Л. с соавт., 1990; Нуллер Ю.Л., Михаленко И.Н., 1988), тогда как для депрессивного расстройства характерны нарушения адренокортикальных взаимодействий. Поэтому актуально не только изучение спектра стероидных гормонов и интенсивности ОС у больных с депрессией и синдромом деперсонализации, но также и оценка влияния на эти показатели блокатора опиатных рецепторов налоксона.

Данные об особенностях окислительной модификации белков в плазме крови больных с расстройствами психики в литературе отсутствуют. Не проводилось также комплексного анализа свободно-радикальных процессов и секреции кортикостероидов. Между тем исследование показателей окислительного стресса, в частности окислительной модификации белков, и уровня кортикостероидов (кортизола, кортизона и кортикостерона) в плазме крови больных с депрессией и синдромом деперсонализации, возможно, позволит приблизиться к пониманию патогенетических механизмов этих тяжелых состояний.

Цель исследования - изучение интенсивности ОС с использованием комплекса биохимических показателей, отражающих степень окислительной модификации белков плазмы крови и состояние антиоксидантной системы (АОС) при параллельном исследовании спектра кортикостероидов у больных с депрессией и синдромом деперсонализации.

В соответствии с целью исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать зависимость окисления триптофана и тирозина очищенных белков (человеческого сывороточного альбумина - ЧСА и супер-оксиддисмутазы - СОД) в среде Фентон от времени инкубации, концентрации компонентов среды Фентон, действия радикальных ловушек (этанол, маннитол). Проанализировать степень структурных изменений окисленных белков, используя методы гельпроникающей хроматографии (ГПХ) и электрофореза.

2. Исследовать состояние прооксидантной системы на примере спонтанного и МКО белков, используя метод определения карбонильных производных аминокислотных остатков и образования битирозина в плазме крови здоровых людей и больных с психическими расстройствами (депрессия, деперсонализация). Определить характер изменения структуры (агрегация, фрагментация) окисленных белков плазмы крови во всех обследуемых группах с помощью электрофореза и по уровню образования кислоторастворимых низкомолекулярных пептидов.

3. Исследовать состояние АОС по активности ее ферментативных и неферментативных компонентов, направленных на дисмутацию 02" и раз-

рушение Н2О2 в эритроцитах и плазме крови всех обследуемых пациентов.

4. Провести определение уровня кортикостероидов (кортизол, кортизон, кортикостерон) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) высокого давления у здоровых и больных. Исследовать концентрации кортикостероидов в плазме крови до и после введения бло-катора опиатных рецепторов налоксона у больных с деперсонализацией.

Научная новизна. Впервые разработаны методические условия исследования окислительной модификации белков по степени окисления триптофана и образованию битирозина очищенных белков в системе Фен-тон и показана целесообразность использования данной методики для оценки состояния прооксидантной системы плазмы крови у больных с 'психическими расстройствами.

Впервые проведен всесторонний анализ интенсивности окислительной деструкции очищенных белков и белков плазмы крови больных с психическими расстройствами (депрессия и деперсонализация), позволяющий судить об изменениях не только их первичной структуры, но и пространственной ориентации (по агрегации и фрагментации) белковых молекул.

Впервые проведено комплексное определение основных показателей антиоксидантной системы (ферментативная и неферментативная дисмута-ция 02*~, ферментативное и неферментативное расщепление Н202) плазмы крови и эритроцитов больных с депрессией и деперсонализацией.

Впервые исследованы концентрации кортизола, кортизона и кортико-стерона в плазме крови больных с синдромом деперсонализации. Изучено влияние блокатора опиатных рецепторов налоксона на эти показатели у больных с деперсонализацией.

Положения, выносимые на защиту.

1. Окислительная деструкция очищенных белков в системе Фентон осуществляется комплексом генерируемых реакционноспособных соединений, действие которых проявляется в зависимости от условий реакции и приводит к разной степени нарушений структурной организации белка. Подобный механизм изменения белковых молекул может играть роль в патогенезе психических нарушений.

2. Изменения уровня кортикостероидов у больных с психическими расстройствами сочетаются с состоянием окислительного стресса, от длительности и интенсивности которого зависят особенности металлкатализи-руемого окисления белков плазмы крови больных с депрессией и деперсонализацией.

реакции Фентон не только ОН*, но и, в зависимости от длительности и интенсивности стресса, других реакционноспособных соединений типа С03", феррил- и перферрил-ионов. Предложен комплекс биохимических исследований, позволяющих оценить состояние про- и антиоксвдантной систем у больных с психическими расстройствами. Использованный метод определения концентрации кортикостероидов (кортизола, кортизона и кортико-стерона) и показателей окислительного стресса может служить дополнительным критерием объективной оценки состояния больного. Показан нормализующий эффект блокатора опиатных рецепторов налоксона на секрецию кортикостероидов у больных с синдромом деперсонализации. Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе и учтены при разработке критериев дифференциальной диагностики синдромов депрессии и деперсонализации.

Апробация работы. Положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийских и международных конференциях: Behavioral Pharmacology of Anxiety and Depression (20-23 November, 1997, England); 13lh cogress of Pathological and Clinical Physiology ( Brno, 1998); 12th Biennial European Society for Neurochemistry General meeting, StPetersburg, Russia, July 19-24, 1998; «Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Россия, Санкт-Петербург, 8-10 сентября 1999); 41st International Conference on the Biochemistry of Lipid (13-16 Sept. 2000, Halle, Germany), а также на заседании проблемной комиссии и на совещаниях отделения клинических и экспериментальных исследований новых психотропных средств НИИ им. В.М. Бехтерева.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает в себя 23 работы отечественных и 162 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 12 рисунками и 8 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На начальной стадии работы нами была проведена серия опытов с использованием очищенных белков (ЧСА и СОД) с целью выбора оптимальных условий для оценки степени окислительной модификации белков плазмы крови по окислению триптофана и тирозина. Структурные изменения окисленных белков изучались с помощью методов электрофореза (Laemmli U.K., 1970) и ГПХ с использованием прибора HP-1090 с колонкой, заполненной Superose-12 («Pharmacia»), После выполнения модельных опытов проводилось исследование показателей свободно-радикального окисления в крови больных с психическими расстройствами. С этой целью

было обследовано две группы пациентов. Первая - с депрессивным синдромом - 11 человек в возрасте от 18 до 40 лет (7 женщин и 4 мужчины). Вторую группу обследованных больных составили 8 пациентов с синдромом деперсонализации, из них 6 женщин и 2 мужчины. Период болезни пациентов ко времени проведения исследования составлял 0,5-5 лет. Диагностика психических расстройств (депрессии, деперсонализации) проводилась согласно DSM-IV- критерий - д.м.н., проф. Нуллером Ю.Л. и старшим научным сотрудником 10-го отделения научно-исследовательского психоневрологического института им. В.М.Бехтерева к.м.н. Бутомой Б.Г.

Контролем служили те же показатели 38 практически здоровых добровольцев в возрасте 20-40 лет без признаков психических нарушений.

Забор крови из локтевой вены у испытуемых осуществляли в утреннее время натощак. В качестве антикоагулянта использовали раствор гепарина. Эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием в течение 15 минут при 4000g. Отмывали 3 раза изотоническим раствором NaCl. Отмытые эритроциты крови гемолизировали раствором трис-HCl 0,05М (рН 7,4) («Sigma» USA) в соотношении 1:10.

Для оценки влияния степени ОС на возникновение и течение психических расстройств был использован комплекс биохимических показателей, отражающих состояние АОС и интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови. Был проведен сравнительный анализ анти- и прооксидантной систем с целью выявления нарушения их баланса и изменений в соотношениях компонентов АОС у обследуемых больных.

Активность прооксидантной системы организма исследовали на примере спонтанного и металлкатализируемого окисления (МКО) белков в нативной плазме по методу Левина (Levine R.L. и др., 1990) в модификации Дубининой Е.Е. (Дубинина Е.Е. и др., 1995), где интенсивность окислительной деструкции белков плазмы крови оценивали по уровню карбонильных производных. Другим методом изучения МКО белков плазмы крови была оценка изменения интенсивности окисления их тирозиновых и триптофановых остатков (Davies K.J.A. и др.,1987) в условиях, отработанных постановкой модельных опытов. Степень структурных изменений окисленных белков исследовали по уровню образования низкомолекулярных кислоторастворимых пептидов в надосадочной жидкости, анализируемых при 254 нм, 272 нм и 280 нм, и с помощью электрофореза. Электрофорез белков проводили по методу Laemmli (Laemmli U.K., 1970) в градиенте полиакриламидного геля с 2% раствором додецилсульфата натрия (ДДС-Na).

Активность антиоксидантной системы плазмы крови отражали следующие показатели: общая и ферментативная дисмутация 02*~ (Костюк В. А. и др., 1990), а также ферментативное и неферментативное расщепление Н202 (Left J.A., 1992). Специфическую активность СОД определяли

после специальной обработки плазмы и эритроцитов смесью спирта с хлороформом и кристаллическим КН2Р04 по методу Дубининой Е.Е. (Дубинина Е.Е., 1988). В гемолизированных эритроцитах изучали ферментативную активность супероксиддисмутазы (Дубинина Е.Е., 1988) и каталазы (Beutler Е., 1975).

Определение концентрации кортикостероидов плазмы крови обследуемых пациентов проводили с помощью микроколоночной обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии с использованием преформи-рованного градиента ацетонитрила в воде и твердофазной экстракции в качестве подготовки проб (Gamper N.L., et.al., 1996). Для оценки влияния блокатора опиатных рецепторов налоксона на уровень кортикостероидов в плазме крови больных с синдромом деперсонализации внутривенно вводили 0,4% раствор этого препарата.

Статистическую обработку результатов проводили на PC, используя программный продукт «Statistica 5,0 for Windows».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Окислительная модификация очищенных белков

При проведении сравнительного анализа степени окисления триптофана и тирозина ЧСА (1 мг/мл) и эритроцитарной СОД (0,25 мг/мл) в зависимости от концентрации компонентов системы Фентон и времени инкубации белка были использованы концентрации Бе++, ЭДТА и Н202, близкие к тем, которые используются в литературе для анализа реакции Фентон (Уш Б. , е1.а1., 1992; Ыарр! АЛ., 1998). К двум часам инкубации в среде Фентон в фосфатном буфере фактически весь триптофан СОД и ЧСА окисляется. В течение 24-х часов наблюдается постепенное нарастание уровня битирози-на ЧСА. При окислении СОД наиболее высокие значения битирозина зарегистрированы после трехчасовой инкубации (рис. 1).

При исследовании чувствительности ряда очищенных белков (СОД, трипсин, тромбин, ЧСА) к свободно-радикальному окислению в системе Фентон, компоненты которой были уменьшены в 16, 8, 4 и 2 раза по сравнению с исходными: Бе^ - 1,0x1 О^М, ЭДТА - 0,43 х 10"4М и Н202 - 0,05М, нами были получены очень близкие показатели окисления триптофана для трипсина, ЧСА и тромбина (рис. 2). Инкубацию осуществляли в течение двух часов при 37°С. Интенсивность окисления триптофановых остатков белков постепенно нарастала с увеличением концентрации компонентов системы Фентон. Для всех белков, кроме СОД, наибольшие изменения уровня триптофана выявлены при исходной концентрации компонентов системы Фентон. СОД оказалась наиболее чувствительной к действию ра-

дикальных продуктов: резкое сшшение уровня триптофана регистрировали при уменьшении компонентов смеси Фентон в 16 раз.

350"

зоо-

250200" 150" 100"

350"

эоо-

250" 200 150-ТОО _ 50

—»—А -•—В

Рис. 1. Зависимость степени окисления триптофана и тирозина ЧСА и СОД в системе Фентон от времени инкубации.

По вертикали - % содержания битирозина (I) и % содержания триптофана (П). По горизонтали - время в часах. А - СОД; В - ЧСА. Концентрация компонентов системы Фентон: Ре++-2,0x10"4М; ЭДТА - 0,86x10"4М; Н202 - 0,1 М.

I П

Рис. 2. Зависимость интенсивности окисления триптофаповых и тнрозиновых остатков белков от концентрации компонентов системы Фентон.

По вертикали - % содержание битирозина (I) и % содержание триптофана (11). По горизонтали - концентрация компонентов системы Фентон в условных единицах из расчета, что 1,0 соответствует концентрации Ре**- 1,0х10"4М, ЭДТА - 0,43хЮ'4М; Н2Сь - 0,05 М. А - тромбин; В - трипсин; С - СОД; О - ЧСА.

Образование битирозиновых сшивок во всех исследуемых белках увеличивалось с возрастанием концентрации компонентов системы Фентон.

При проведении опытов с СОД и трипсином был зарегистрирован наиболее высокий уровень битирозина при наименее низкой концентрации компонентов среды Фентон (разведение в 16 раз) по сравнению с другими белками. Низкое содержание битирозина выявлено после инкубации тромбина в среде Фентон.

Таким образом, окисление тирозина и триптофана исследуемых белков происходит с разной скоростью в зависимости от уровня компонентов системы Фентон и времени инкубации. Наиболее чувствительным белком оказалась СОД.

Одновременно с процессами окисления аминокислот наблюдались структурные изменения изучаемых белков, что было показано с помощью методов ГПХ и электрофореза. Наиболее выраженные структурные изменения выявлены у СОД, окисление которой сопровождалось быстрой потерей ее активности: уже через 1 час инкубации СОД в присутствии Бе^/ЕДТА с перекисью водорода, независимо от используемого буфера (карбонатного, фосфатного) и рН среды (7,4 и 9,5), активность СОД полностью ингибируется.

Действие компонентов среды Фентон при анализе степени окисления субстратов связывают в основном с генерацией ОН*. Однако, регистрация тирозиновых сшивок через 24 часа ставит под сомнение возможность влияния только гидроксильных радикалов. С целью выяснения возможных причин снижения Н202 нами проводилось определение содержания Н202 системы Фентон в 0,0125М боратном буфере (рН 9,5) и 0,065М фосфатном буфере с рН 9,5 и рН 7,4. Измерение концентрации Н202 в различных буферных системах осуществляли при длине волны 230нм в инкубационной смеси, содержащей ЧСА - 0,5мг/мл, Ре^ - 2,0хЮ"4М, ЭДТА - 0,86х10"4М. Наиболее выраженное разрушение Н202 наблюдали в карбонатном буфере уже через 2 часа (табл. 1), но в этих условиях зарегистрирован наиболее высокий уровень битирозина. Через 24 часа инкубации было отмечено снижение концентрации Н202. Степень этого снижения не одинакова в опытах с использованием разных буферов. Так, в опытах с карбонатным и боратным буферами мы практически не регистрировали содержание Н202, с фосфатным буфером при рН 9,5 - концентрация Н202 снижается в 2 раза, а при рН 7,4 - в среднем на 30%. Однако независимо от содержания перекиси водорода наблюдалось нарастание битирозина в белке. Если в щелочной среде с использованием фосфатного и боратного буферов уровень би-тирозиновых сшивок близок друг к другу, то при использовании бикарбо-натного буфера концентрация их была в 2 раза выше, что свидетельствует об участии других реакционных соединений в процессе окисления тирозиновых остатков белка.

Таблица 1

Изменение концентрации перекиси водорода в среде Фептоп в зависимости от используемой буферной системы и pH инкубационной среды (М±т)

Буферные системы Концентрация перекиси водорода в пробе, М Содержание битирози-на ЧСА, %

Начальная Через 2 часа инкубации Через 24 часа инкубации Через 2 часа инкубации Через 24 часа инкубации

Фосфатный буфер, 0,065 М, рН 7,4 0,107+0,006 0,092+0,014 0,067±0,007 104+18 241±18

Фосфатный буфер, 0,065 М, рН 9,5 0,108+0,008 0,081 ±0,012 0,048±0,005 138±18 338+22

Карбонат-бикарбонатный буфер 0,1 М, рН 9,5 D,099±0,001 Следовые количества Не определяется 222+29 633±43

Боратный буфер, 0,0125 М, рН 9,5 0,109+0,026 0,069±0,032 Не определяется 143±30 306+10

Для выяснения интервала времени, в течение которого происходит снижение содержания Н202 системы Фентон в карбонатноом буфере, нами проводилось определение концентрации перекиси водорода в инкубационной смеси в течение первых 20 минут инкубации через каждые 5 минут. Уже на 10 минуте инкубации концентрация Н202 снижалась до 0,03М, и через 20 минут мы отмечали лишь следовые количества Н202. При использовании 0,065М фосфатного буфера с рН 7,4 и 9,5 и 0,0125 М боратного буфера с рН 9,5 выраженного снижения концентрации Н202 не наблюдалось. Таким образом, разрушение Н202 в системе Фентон связано, в основном, с присутствием в инкубационной смеси карбонатного буфера.

С целью выяснения возможной роли генерируемого в системе Фентон ОН' радикала в окислении аминокислотных остатков белков нами были проведены опыты с использованием радикальных ловушек: маннитола и этанола. При анализе влияния различных концентраций маннитола (от 16мкМ до 123мМ) на степень окисления триптофановых остатков ЧСА в течение двухчасовой инкубации нами было зафиксировано только незначительное антиоксидантное действие при высоких его концентрациях (рис. 3). Так как ОН* радикал обладает очень коротким временем существования (10"9с), мы предположили, что в системе создается его недостаточная стационарная концентрация и, соответственно, машгатол не успевает нейтрализовать ОН*. Чтобы доказать это, мы увеличили концентрацию компонентов системы Фентон в 5 раз. Однако и в этих условиях маннитол в концентрации - 16 мМ, 25 мМ и 32 мМ не предохранял триптофан от окисления. Отсутствие эффекта маннитола в качестве ловушки ОН'при окислении триптофана, видимо, связано с тем, что ЧСА обладает большим сродством к ОН', чем маннитол, и быстрее перехватывает радикал. Константа скоро-

сти реакции ЧСА с ОН" при рН 7,0 составляет 7,8xlO10M'1/s"1, в тех же условиях- 1,7x109M"Vs"' (Buxton G.V., et.al., 1988).

а маннитола

з содержания триптофана —О—концентрация маннитола в мМ \ Рис. 3. Влияние маннитола на окисление трнптофановых остатков ЧСА.

Маннитол полностью тормозил образование битирозиновых сшивок у ЧСА после одно- и двухчасовой инкубации. Через 24 часа инкубации он фактически не обладал защитным действием: нами было зарегистрировано образование битирозина, которое составляло около 187% по сравнению с контрольной пробой - 200%. Возможно, торможение образования битирозина ЧСА в первые часы инкубации объясняется взаимодействием маннитола не только с ОН", но и с тирозил-радикалом.

Результаты, полученные при изучении действия этанола на окисление тирозиновых и триптофановых остатков ЧСА в системе Фентон свидетельствуют о возрастании антирадикального действия этанола при окислении триптофана по мере увеличения концентрации спирта от 17 мМ до 1 М в течение 1 часа (рис. 4). При окислении тирозина и образовании битирозиновых сшивок максимальную антирадикальную активность этанола мы регистрировали при его концентрации 240 мМ и 480 мМ в инкубационной смеси (рис. 5). Этанол в высоких концентрациях (1 и 2М) в течение часовой инкубации не обладал антирадикальной активностью. Через 24 часа инкубации антирадикальная способность этанола также была снижена.

Полученные разнонаправленные результаты действия маннитола и этанола на окисление тирозина и триптофана отражают специфику процессов генерации реакционных соединений в системе Фентон и подтверждают, что в зависимости от условий реакции может происходить образование не только ОН", но и других реакционноспособных соединений.

120

га

.ЦюО

ВО

х а. н о;

О.

<и

1200

1000

^ 800

600

400

200

га

с: о

к ^

СО о. ь

:т

или "А содержания триптофана ЧСА

-концентрация этанола в мМ"

Рис. 4. Влияние этанола на окисление триптофановых остатков ЧСА.

г—% содержания битирозина ЧСА —О— концентрация этанола в мМ

Рис. 5. Влияние этанола на образование битирозина ЧСА.

Разработанные нами методические условия для оценки интенсивности окислительной модификации белков были использованы в дальнейшей работе при изучении состояния ОС у больных с депрессией и деперсонализацией.

2. Активность прооксидаитной системы у больных

с психическими расстройствами 2.1. Спектрофлуориметрическая регистрация окисления триптофана и образования битирозина

Образование битирозина происходит с разной интенсивностью у обследованных больных. Через 2 часа инкубации плазмы крови с системой Фентон у пациентов с синдромом деперсонализации наблюдали повышение уровня битирозиновых сшивок на 227%, а у пациентов с депрессией -только на 141% по сравнению с контрольными пробами без реактива Фен-тон. Через 24 часа инкубации плазмы крови больных с деперсонализацией уровень битирозина возрастал до 361%, а при депрессии отмечалась тенденция к снижению по сравнению со здоровыми людьми (рис. 6). Окисление триптофана имело однотипный характер у обследованных нами здоровых людей и пациентов с психическими расстройствами.

400

2ч аса

24 часа

Время инкубации.

I Здоровые люди П Пациенты с деперсонализацией О Пациенты с депрессией

Рис. 6. Образование битирозина после инкубации плазмы крови с системой Фентои

2.2. Спонтанная окислительная модификация белков

При анализе спонтанной окислительной деструкции белков плазмы крови больных с депрессивным синдромом было обнаружено статистически достоверное повышение уровня 2,4-ДНФгидразонов только при длине волны 270 нм (табл. 2). У пациентов с синдромом деперсонализации на этой длине волны наблюдалась тенденция к повышению интенсивности окислительной модификации белков (21%). Во всех обследованных группах больных при измерении карбонильных производных не было выявлено никаких различий в уровне 2,4-ДНФгидразонов белков плазмы крови при длине волны 363 нм.

2.3. Металлкаталпзируемое окисление белков

Статистически достоверное повышение продуктов МКО при длинах волн 270 нм и 363 нм выявлено при анализе МКО белков плазмы крови у пациентов с депрессией при расчете на 1 мл плазмы крови и 1 г белка. У пациентов с синдромом деперсонализации различия были достоверны только при длине волны 363 нм (табл. 2).

Таблица 2

Окислительная модификация белков плазмы крови у пациентов с психическими расстройствами (М±ш)

Группы обследуемых Спонтанная окислительная модификация белков (Ед. ОП) Металлкатализируемая окислительная модификация белков (Ед. ОП)

людей 270 нм 363 им 270 нм 363 нм

на 1 мл плазмы на 1 мг белка на 1 мл плазмы на I мг белка на 1 мл плазмы на 1 мг белка на 1 мл плазмы на 1 мг белка

Здоровые п=16 го £ со о «t s S «л 6,04+0,21 VO гч го ё 43 ГО 00 1 ю' m о со" а о о ОО" ■ч- 35,40±0,58 о о 51 о о оС ОО ■ч-

Пациенты с синдромом де-персона-лиза-ции п-7 4,84+0,45 67,30+6,52 5,88+0,35 81,80±5,57 г 39,30+2,61 545,00+36,40 40,20±0,98 558,00+16,70

Пациенты с депрессивным синдромом п=8 6,05+0,18 83,40+3,28 Г 6,62+0,42 87,90±5,41 г-§ (N 565,00±9,40 41,00+1,60 563,00±15,20

Р.-2 Р.-з <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

2.4. Анализ надосадочной жидкости окисленных белков

Окислительная модификация белков связана с изменением их структурной организации, сопровождающейся фрагментацией с образованием низкомолекулярных компонентов, либо агрегацией белковых молекул (Da-vies К.J.А., 1987). Проведенный нами анализ надосадочной жидкости, полученной после осаждения белков 20% раствором ТХУ, позволил выявить достоверное повышение уровня продуктов фрагментации белков за счет МКО по сравнению со спонтанной окислительной деструкцией белков плазмы крови у всех обследованных испытуемых. При анализе продуктов

фрагментации окисленных белков плазмы крови после их спонтанного и металлкатализируемого окисления были обнаружены статистически достоверные различия у больных с синдромом деперсонализации при всех длинах волн (254 нм, 272 нм и 280 нм). У больных с депрессивным синдромом достоверные различия по сравнению со здоровыми были отмечены лишь при 270 нм и 280 нм. Следует отметить, что полученные значения ниже, чем у больных с деперсонализацией, при всех длинах волн.

2.5. Электрофорез Электрофореграммы окисленных белков плазмы крови здоровых пациентов и больных с психическими нарушениями отличаются друг от друга. Окисление белков за счет системы Ре/Н202 у здоровых людей приводит к увеличению низкомолекулярных фракций в пределах от 50 до 14 Кда. При депрессии на электрофореграммах более выражена фракция 20 КДа. При деперсонализации преобладали низкомолекулярные фрагменты в пределах от 20 до 14 Кда.

Таким образом, исследование интенсивности окислительной модификации белков и степени фрагментации окисленных белков плазмы крови свидетельствуют об усилении этих процессов у больных с психическими расстройствами по сравнению со здоровыми. Это может приводить к нарушению структуры белковых молекул и ослаблению их функций: снижению каталитической и протеолитической активности, нарушению мембранных структур и рецепторного аппарата клетки.

3. Активность антиоксидантиой системы у больных с психическими расстройствами

3.1. Ферментативное и неферментативное расщепление Н202 в плазме крови

В плазме крови больных с психическими расстройствами было выявлено достоверное повышение неферментативного и снижение ферментативного расщепления Н202 (табл. 3). В присутствии металлов переменной валентности распад Н202 может быть сопряжен с дополнительной генерацией ОН*, что могло явиться одной из причин выявленного повышения окислительной деструкции белков плазмы за счет МКО.

3.2. Определение способности плазмы (ферментативной и неферментатпвнон) к дисмутации супероксидного анион-радикала Активность супероксиддисмутазы больных с расстройствами психики не отличалась от ее активности у здоровых. В процесс дисмутации 02"~ могут включаться помимо самого фермента другие компоненты плазмы, реагирующие с радикалом (церулоплазмин, трансферрин, мочевая кислота

и т.д.). Суммарная способность плазмы к дисмутащш 02"~ у больных с депрессией достоверно выше, чем у здоровых. У пациентов с синдромом деперсонализации данный показатель не отличался от его значений у здоровых людей (табл. 3). Неравномерное угасание активности защитных ферментов приводит к увеличению роли неферментативных компонентов АОЗ и, как следствие, к дополнительной генерации АФК и других реакционно-способных соединений.

Таблица 3

Антиоксидантпая система крови пациентов с психическими расстройствами (М ± га)

Группы обследо- Неферментативное расщепление Н2О2 в мМ х 104 на Ферментативное расщепление Н2О2 в мМ х 104 на Общая способность плазмы к дисмутации <Э2"~ в усл. ед. на Активность супероксид-дисмутазы в усл. Ед. на Активность каталазы эритроцитов вмМхЮ4 на Активность супероксид-дисмугазы эритроц. в усл. Ед. на

ванных пациентов 1 мл плазмы 1 мг белка 1 мл плазмы 1 1 мг белха 1 мл плазмы 1 мг белка 1 мл плазмы 1 мг белка 1 мл эрит-[ роцитов | 1 мг гемоглобина 1 мл эрит- 1 роцитов 1 мг гемоглобина

Здоровые п=32 2,65+0,43 0,038+ 0,006 14,70+0,72 0,20+0,01 21,8010,60 о о" +1 со гч сГ 38,5012,62 0,4910,03 2,20+0,07 j гп о* ■н m оо СП о S" о" 17,30+0,95

Пациенты с деперсонализацией п=8 7,07+0,47 0,098± 0,007 г-00 о* ё 00 0,16±0,02 21,40+2,03 | <ч о о" -н оэ CN о" 45,60± 4,03 0,5910,06 ■л сч СП Я in m 0 0" -н СЛ VI о" 15,30+1,56

Пациенты с депрессией п=11 СП so Я" «П 0,083± 0,008 1 11,9011,41 0,16±0,02 28,3013,86 0,40+0,06 34,1014,15 0,48+0,04 1,98+0,05 , 5,5310,24 и-1 о о" +1 so »/-> о" 15,40+1,12

Р)-2 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Рьз <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Рм <0,05 < 0,05

3.3. Определение ферментативной антиоксидантной системы

эритроцитов

Обнаружено достоверное снижение активности каталазы эритроцитов в обеих группах больных. Активность супероксиддисмутазы эритроцитов у больных с расстройствами психики не отличалась от активности СОД эритроцитов здоровых (табл. 3). Дисбаланс активностей этих ферментов в эритроцитах стимулирует накопление Н202 и выход ее избытка в межклеточное пространство.

Анализ показателей про- и антиоксидантной систем плазмы крови и эритроцитов больных с психическими расстройствами свидетельствует о более выраженной степени ОС у пациентов с деперсонализацией по сравнению с депрессивными больными (рис. 7).

А.

4. Анализ спектра кортикостероидов плазмы крови

При проведении исследования было показано, что из 6 определяемых показателей спектра кортикостероидов (кортизол, кортизон, кортикосте-рон, 11-дезоксикортизол, 11-дезоксикортикостерон и тестостерон) наиболее вариабильны кортизол, кортизон и кортикостерон. У пациентов с синдромом деперсонализации обнаружено статистически достоверное снижение уровня кортизола и повышение кортикостерона, что косвенно может свидетельствовать о повышенном содержании эндорфинов (Szalay K.S., Stark Е., 1981). У больных с депрессией наблюдали статистически достоверное повышение уровня кортизола и снижение кортикостерона. На фоне высокого содержания кортизола не отмечалось повышения его неактивного метаболита кортизона. Таким образом, у больных с изучаемыми нами психическими расстройствами выявлена разная направленность метаболизма кортикостероидов (рис. 8). Содержание других кортикостероидов (11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона и тестостерона) фактически не отличается во всех обследованных группах людей. Выявленное снижение уровня кортизола и повышение концентрации кортикостерона в плазме крови больных с деперсонализацией, вероятно, носит адаптационный характер, определяя метаболизм многих биологически активных веществ.

кортизол кортизон кортикостерон

ВЗдоровыелюди ППациенты с деперсонализацией О Пациенты с депрессией |

Рис. 8. Содержание кортикостероидов в плазме крови пациентов с расстройствами психики.

5. Влияние блокатора опиатных рецепторов налоксона на уровень кортикостероидов в плазме крови больных с синдромом деперсонализации

Предполагается, что в патогенезе деперсонализации большую роль играет нарушение опиатной системы организма, и показано положительное терапевтическое действие налоксона у больных с синдромом деперсонализации (Нуллер Ю.Л., 1997). Для изучения влияния налоксона на уровень кортикостероидов плазмы крови концентрацию гормонов определяли в пробах, взятых до и после введения налоксона. Результаты иследования представлены в таблице А. После введения 4,0 мг налоксона содержание кортизола достоверно повысилось по сравнению с его уровнем на фоне введения физиологического раствора (плацебо), прирост кортизона был несколько меньшим, а содержание кортикостерона не изменялось. Эти результаты совпадают с литературными данными, свидетельствующими о повышении уровня кортизола после введения налоксона здоровым испытуемым (Бе1ка1а в., е!а1., 1994). Однако было обнаружено, что повышение концентрации кортизола после введения налоксона совпадало по времени с терапевтическим эффектом налоксона, что косвенно указывает на участие в патогенезе деперсонализации как опиатной, так и стероидной систем.

Таблица 4

Влияние налоксона на содержание кортикостероидов в плазме крови у больных деперсонализацией (М±т)

Группы обследованных пациентов Концентрация кортизола (нг/мл) Концентрация кортизона (нг/мл) Концентрация кортикостерона (нг/мл)

Здоровые (п=36). Введение катетера 30,5012,65 22,48±3,24 9,61+1,69

Больные с деперсонализацией п=8. Введение катетера 13,98±0,95*" 16,7712,54 13,90+2,66

Через 30 мин после введения катетера 11,91+1,36 14,4512,63 10,45+2,01

Через 15 мин после введения плацебо 10,2111,09 13,84+2,22 9,61+1,10

Через 15 мин после введения 0,4 мг налоксона 11,53+2,50 15,90+2,56 7,97+1,20

Через 15 мин после введения 4,0 мг налоксона 18,6413,35* 20,3313,17* 9,9312,01

** - р<0,001 - достоверность различий между больными и здоровыми; * - р<0,05 - достоверность различий у больных после введения налоксона и плацебо.

Итак, полученные результаты дают основание предполагать, что усиление интенсивности окислительной модификации белков плазмы крови,

дисбаланс компонентов ферментативной и неферментативной антиокси-дантной защиты и разнонаправленные нарушения уровня кортикостерои-дов, выявленные у больных с депрессией и деперсонализацией, могут иметь значение в патогенезе исследуемых психических заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика определения степени окислительной деструкции белков по уровню образования битирозина и окислению триптофана для оценки интенсивности окислительного стресса у больных.

2. Высокие значения интенсивности окислительной модификации белков плазмы крови по карбонильным производным выявлены у больных с депрессией. У больных с синдромом деперсонализации наблюдалось повышение количества карбонильных групп за счет металлкатализируемого окисления белков плазмы крови только при 363 нм.

3. Более высокий уровень образования битирозина белков плазмы крови обнаружен при их окислении у больных с деперсонализацией по сравнению с тем же показателем у здоровых и больных депрессией. У больных с синдромом деперсонализации сильнее выражены изменения структуры окисленных белковых молекул плазмы крови в сравнении со здоровыми и больными депрессией.

4. Повышение интенсивности неферментативного расщепления Н202 и снижение интенсивности ее ферментативного распада наблюдали в плазме крови больных с психическими расстройствами. У пациентов с депрессией отмечали повышение суммарной дисмутации 02*~. При определении ферментативной антиоксидантной системы эритроцитов обнаружено достоверное снижение активности каталазы в обеих группах больных.

5. Выявлены следующие нарушения секреции кортикостероидов: а) у больных с депрессией повышение, а у больных с деперсонализацией снижение концентрации кортизола в плазме крови по сравнению со здоровыми; б) концентрация кортикостерона в плазме крови больных деперсонализацией повышена по сравнению со здоровыми; в) концентрация кортизона плазмы крови больных с депрессией и деперсонализацией не отличается от его уровня в плазме крови здоровых испытуемых.

6. Внутривенное введение блокатора опиатных рецепторов налоксона увеличивало концентрацию кортизола в плазме крови больных с деперсонализацией.

7. Комплексное исследование интенсивности окислительного стресса и уровня кортикостероидов может быть использовано в качестве одного из

объективных критериев оценки состояния больных с психическими расстройствами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Influence of naloxon in corticosteroid content and state of oxidative system in blood in depressive patient with manifested syndrome of depersonalization // Behavioral Pharmacology of Anxiety and Depression. England. 20-23 November, 1997. № 8. - P. 6-7. (соавт.: Dubinina E.E., Nuller Ju.L., Kovrugina C.V., Soliternova I.B., Kudrjashova O.A.).

2. Oxidative stress in patients with neuropsychiatric disorders // 13th Congress of Pathological and Clinical Physiology. - Brno, 1998. - P. 20-21. (соавт.: Dubinina E.E., Konovalov P.V., Nuller Ju.L., Kovrugina C.V., Soliternova I.B., Leonova N.V., Kudrjashova O.A.).

3. Anti- and Prooxidant Systems and Corticosteroids in the Patients With Depersonalization // J. Neurochemistry. 1998. V.71. Suppl.l. S23 с. (соавт.: Dubinina E.E., Nuller Ju.L., Kovrugina C.V., Gamper N.L., Soliternova I.B., Kudrjashova O.A., Leonova N. V.).

4. Использование налоксона для лечения деперсонализации и исследования ее патогенеза // Обозрение психиатрии и медицинской психологии имени В.М. Бехтерева. - 1999, № 2. - С. 56-59 (соавт.: Нуллер Ю.Л., Дубинина Е.Е., Кушнир О.Н., Гампер Н.Л.).

5. Свободнорадикальные процессы у пациентов, страдающих расстройствами психики (депрессия, деперсонализация) // Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты. Междунар. конф. СПб, 8-10 сенг. Цитология. - 1999. - Т. 41, № 9. - С. 794 (соавт.: Дубинина Е.Е., Нуллер Ю.Л., Гампер H.JL, Ковругина С.В., Куд-ряшова О.А., Солитернова И.Б., Бутома Б.Г.).

6. The oxidative modification of blood plasma proteins and antioxidant defence in patients with mental disorders (depression, depersonalisation). //41st International Conference on the Biochemistry of Lipid. Sept.13-16, 2000. Halle, Germany. Chemistiy and physics of lipide. - V.107/1. T. 4/15. - P. 67 (соавт.: Dubinina E.E., Leonova N.V., Gamper N.L., Soliternova I.B., Nuller Yu.L., Butoma G.B., Gavrovskaj S.V., Kovrugina S.V., Kusmich E.V.).

7. Окислительная модификация белков плазмы крови больных психическими расстройствами (депрессия, деперсонализация) // Вопросы медицинской химии (в печати, соавт.: Дубинина Е.Е., Леонова Н.В.,.Гампер Н.Л., Солитернова И.Б., Нуллер Ю.Л., Бутома Г.Б., Ковругина С.В.).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Морозова, Марина Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Активные формы кислорода

1.2. Окислительная модификация белков

1.2.2. Окислительная модификация белков, ее причины и особенности в организме

1.2.2. Металлкатализируемое окисление белков

1.2.3. Битирозин: образование и биологическая роль в 22 тканях

1.2.4. Биологическое значение окисления белков в 24 организме

1.2.5 Окислительный стресс и окисление белков

1.3 Особенности свободнорадикальных процессов в нервной ткани

1.4 Роль окислительного стресса в функциональной активности мозга в норме и при патологических состояниях

1.5 Значение окислительного стресса при развитии психических расстройств

1.6. Секреция кортикостероидов и опиатных пептидов при стрессорной реакции. Влияние активных форм кислорода на кортикостероидные и опиатные рецепторы ткани мозга

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Окислительная модификация очищенных белков

2.2. Исследование прооксидантной системы организма

2.2.1. Методика определения железо-зависимого образования битирозина и окисления триптофана в плазме 51 крови

2.2.2. Окислительная модификация белков плазмы крови

2.2.3. Анализ надосадочной жидкости

2.2.4. Электрофорез

2.3. Исследование антиоксидантного статуса организма

2.3.1. Определение ферментативной и неферментативной способности плазмы и эритроцитов крови к дисмута- 55 ции Ог*

2.3.2. Определение способности плазмы и эритроцитов к расщеплению Н2О

2.4. Определение концентрации кортикостероидов в плазме крови

2.5. Введение налоксона больным с синдромом деперсо-нализаци

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Окислительная модификация очищенных белков

3.2. Активность прооксидантной системы у больных с психическими расстройствами

3.2.1. Спектрофлуориметрическая регистрация окисления триптофановых остатков и образования битирозиновых сшивок белков плазмы крови

3.2.2 Спонтанная окислительная модификация белков

3.2.3 Металлкатализируемое окисление белков

3.2.4 Анализ надосадочной жидкости окисленных белков

3.2.5 Электрофорез

3.3. Активность антиоксидантной системы у больных с психическими расстройствами

3.3.1 Ферментативное и неферментативное расщепление

Н2С>2 в плазме крови

3.3.2. Определение способности плазмы (ферментативной и неферментативной) к дисмутации 02*~

3.3.3. Определение ферментативной антиоксидантной активности эритроцитов

3.4. Анализ спектра кортикостероидов у больных с депрессией и деперсонализацией

3.5. Влияние блокатора опиатных рецепторов налоксона на уровень кортикостероидов в плазме крови больных с синдромом деперсонализаци

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Показатели свободно-радикального окисления и уровень кортикостероидов у больных с депрессией и деперсонализацией"

Актуальность проблемы исследования.

Со времени введения Г. Селье в научный лексикон термина "стресс" рамки этого понятия значительно расширились. Однако основная суть его осталась неизменной: стресс - это системная реакция организма, имеющая приспособительное значение в ответ на любое воздействие. Она проявляется не только активацией гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГГАКС), изменением нейромедиаторного баланса, но и интенсификацией свободно-радикальных процессов с мобилизацией антиоксидантной системы. При любых стрессорных воздействиях происходит усиление генерации активных форм кислорода (АФК) (Саприн А.Н., Калинина Е.В., 1999). Процесс свободно-радикального окисления (СРО) в настоящее время признан абсолютно универсальным и общебиологически значимым механизмом при развитии любого вида патологии. Нарушение баланса про- и антиоксидантной систем в организме приводит к развитию так называемого окислительного стресса (ОС), который сопровождает и осложняет течение фактически всех заболеваний (1.М.МсСогс1, 1996; Скулачев В.П., 1998). В этих условиях очень важна своевременная мобилизация антиоксидантной защиты (АОЗ), которая участвует в снижении уровня реакционноспособ-ных соединений, препятствуя тем самым проявлению их токсического действия в тканях. Некоторые ткани (мозг, сетчатка, легкие) обладают повышенной чувствительностью к окислительному стрессу, что связано с особенностями их строения и метаболизма (НаШлуеИ В., 1992). При патологических состояниях в мозговой ткани создаются условия для дополнительной генерации радикальных продуктов, повышения интенсивности окислительной деструкции белков и липидов, что приводит к нарушению структуры и функции клеточных мембран (НаШ,\\'е11 В., 1989;

Evans P.H., 1993; Yotz M.E., et.al., 1994; Гуляева Н.Б., Ерин A.H., 1995; Федорова Т.Н. с соавт., 1999).

Интенсификация процессов окислительной модификации компонентов клеточной мембраны мозга, в частности белков, может быть причиной изменений, связанных со способностью мембран генерировать и проводить нервный импульс, а также с нарушением рецепторных, ме-диаторных и энергетических систем. Возможно, это является одним из патогенетических звеньев возникновения психических расстройств, и, в первую очередь, таких, как депрессия и деперсонализация, в развитии которых стресс, в том числе и эмоциональный, играет существенную роль.

Если депрессия сопровождается изменением гомеостаза в ответ на длительное стрессорное воздействие, то деперсонализация - реакция на острый стрессор. При этом отчетливая гипоалгезия или полная аналге-зия, характерная для выраженной деперсонализации, позволяет предположить, что в патогенезе деперсонализации большую роль играет нарушение опиатной системы организма: повышение секреции эндорфинов и/или изменение чувствительности опиатных рецепторов (Нуллер Ю.Л., Михаленко И.Н., 1988; Мороз Б.Т., Нуллер Ю.Л. с соавт., 1990), тогда как для депрессивного расстройства характерны нарушения адренокор-тикальных взаимодействий. Поэтому актуально не только изучение спектра стероидных гормонов и интенсивности ОС у больных с депрессией и синдромом деперсонализации, но также и оценка влияния на эти показатели блокатора опиатных рецепторов налоксона.

Данные об особенностях окислительной модификации белков в плазме крови больных с расстройствами психики в литературе отсутствуют. Не проводилось также комплексного анализа свободно-радикальных процессов и нарушений секреции кортикостероидов. Между тем исследование показателей окислительного стресса, в частности окислительной модификации белков, и уровня кортикостероидов (корти-зола, кортизона и кортикостерона) в плазме крови больных с депрессией и синдромом деперсонализации, возможно, позволит приблизиться к пониманию патогенетических механизмов этих тяжелых состояний.

Цель исследования - изучение интенсивности ОС с использованием комплекса биохимических показателей, отражающих степень окислительной модификации белков плазмы крови и состояние антиоксидант-ной системы (АОС) при параллельном исследовании спектра кортикостероидов у больных с депрессией и синдромом деперсонализации.

В соответствии с целью исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать зависимость окисления триптофана и тирозина очищенных белков (ЧСА и СОД) в среде Фентон от времени инкубации, концентрации компонентов среды Фентон, действия радикальных ловушек (этанол, маннитол). Проанализировать степень структурных изменений окисленных белков, используя методы гельпроникающей хроматографии (ГПХ) и электрофореза.

3. Исследовать состояние АОС по активности ее ферментативных и неферментативных компонентов, направленных на дисмутацию и разрушение Н2О2 в эритроцитах и плазме крови во всех обследуемых пациентов.

4. Провести определение уровня кортикостероидов (кортизол, кортизон, кортикостерон) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) высокого давления у здоровых и больных. Исследовать концентрации кортикостероидов в плазме крови до и после введения блокатора опиатных рецепторов налоксона у больных с деперсонализацией.

Научная новизна.

Впервые разработаны методические условия исследования окислительной модификации белков по степени окисления триптофана и образованию битирозина очищенных белков в системе Фентон и показана целесообразность использования данной методики для оценки состояния прооксидантной системы плазмы крови у больных с психическими расстройствами.

Впервые проведено комплексное определение основных показателей антиоксидантной системы (ферментативная и неферментативная дисмутация (V-, ферментативное и неферментативное расщепление Н2О2) плазмы крови и эритроцитов больных с депрессией и деперсонализацией.

Впервые исследованы концентрации кортизола, кортизона и корти-костерона в плазме крови больных с синдромом деперсонализации. Изучено влияние блокатора опиатных рецепторов налоксона на эти показатели у больных с деперсонализацией.

Положения, выносимые на защиту.

2. Изменения уровня кортикостероидов у больных с психическими расстройствами сочетаются с состоянием окислительного стресса, от длительности и интенсивности которого зависят особенности металлка-тализируемого окисления белков плазмы крови больных депрессией и деперсонализацией.

Научно-практическая значимость. Разработана методика определения степени окислительной модификации белков по уровню образования битирозина, которая успешно использована для анализа степени интенсивности окислительного стресса у больных. Показана возможность участия в реакции Фентон не только ОН*, но и, в зависимости от длительности и интенсивности стресса, других реакционноспособных соединений типа СОз*~, феррил- и перферрил-ионов. Предложен комплекс биохимических исследований, позволяющих оценить состояние про- и антиоксидантной систем у больных с психическими расстройствами. Использованный метод определения концентрации кортикостероидов (кортизола, кортизона и кортикостерона) и показателей окислительного стресса может служить дополнительным критерием объективной оценки состояния больного. Показан нормализующий эффект блокатора опиат-ных рецепторов налоксона на секрецию кортикостероидов у больных с синдромом деперсонализации. Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе и учтены при разработке критериев дифференциальной диагностики синдромов депрессии и деперсонализации.

-11

Апробация работы. Положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийских и международных конференциях: Behavioral Pharmacology of Anxiety and Depression (20-23 November, 1997, England); 13th cogress of Pathological and Clinical Physiology ( Brno, 1998); 12th Biennial European Society for Neurochemistry General meeting, St.Petersburg, Russia, July 19-24, 1998; "Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты" (Россия, Санкт-Петербург, 8-10 сентября 1999); 41st International Conference on the Biochemistry of Lipid (13-16 Sept. 2000, Halle, Germany), а также на заседании проблемной комиссии и на совещаниях отделения клинических и экспериментальных исследований новых психотропных средств НИИ им. В.М.Бехтерева.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит из Введения, четырех глав собственных исследований, Выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает в себя 23 работы отечественных и 162 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 12 рисунками и 8 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Морозова, Марина Геннадьевна

ВЫВОДЫ

2. Высокие значения интенсивности окислительной модификации белков плазмы крови в по карбонильным производным ыявлены у больных с депрессией. У больных с синдромом деперсонализации наблюдалось повышение количества карбонильных групп за счет металлкатали-зируемого окисления белков плазмы крови только при 363 нм.

3. Более высокий уровень образования битирозина белков плазмы крови обнаружен при их окислении у больных с деперсонализацией по сравнению с тем же показателем у здоровых и больных с депрессией. У больных с синдромом деперсонализации сильнее выражены изменения структуры окисленных белковых молекул плазмы крови по сравнению со здоровыми и больными с депрессией.

4. Повышение интенсивности неферментативного расщепления Н2О2 и снижение интенсивности ее ферментативного распада наблюдали в плазме крови больных с психическими расстройствами. У пациентов с депрессией отмечали повышение суммарной дисмутации Ог ~. При определении ферментативной антиоксидантной системы эритроцитов обнаружено достоверное снижение активности каталазы в обеих группах больных.

6. Внутривенное введение блокатора опиатных рецепторов налок-сона вызывает увеличение концентрации кортизола в плазме крови больных с деперсонализацией.

7. Комплексное исследование интенсивности окислительного стресса и уровня кортикостероидов может быть использовано в качестве одного из объективных критериев оценки состояния больных с психическими расстройствами.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Комплекс биохимических показателей крови, отражающих состояние про- и антиоксидантной систем, может быть использован учреждениями здравоохранения в системе диагностических и профилактических мероприятий у пациентов для своевременного назначения антиоксидантной терапии. Показатели интенсивности металл-катализируемой окислительной модификации белков плазмы крови и уровень кортикостероидов плазмы крови предлагаются в качестве «специфических маркеров» для дифференциальной диагностики синдромов депрессии и деперсонализации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Морозова, Марина Геннадьевна, Санкт-Петербург

1. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестник РАМН. М. - Медицина. - 1998. - № 7. - С. 43-45.

2. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И., Козлов A.B., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Биофизика. 1991. - Т. 29. - С. 4-245.

3. Гамалей И.А. Роль активных форм кислорода в регуляции функций клетки // Автореферат дисс. докт. биол. наук. Санкт-Петербург. - 1999.

4. Гуляева Н.В., Ерин А.Н. Роль свободнорадикальных процессов в развитии нейродегенеративных заболеваний. (Болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера) // Нейрохимия,- 1995,- Т. 12, № 2,- С. 3-15.

5. Дмитриев Л.Ф. Цитохром в5 и токоферол обеспечивают функционирование липидно-радикальных циклов и преобразование энергии в мембранах//Биохимия. 1998. - Т. 63, вып.10. - С. 1447-1450.

6. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма // Укр. Биохим. Журнал,- 1989.Т. 108, вып. 1(4).-С. 3-18.

7. Дубинина Е.Е. Антиоксидантная система плазмы крови // Укр. Биох. Журн. 1992. - Т. 64. - № 2. - С. 3-14.

8. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Повотов И.Е. Окислительная модификация белков плазмы крови человека. Метод выделения // Вопр. Мед. Химии,- 1995,- Т.41. С. 24-26.

9. Дубинина Е.Е., Шугалей И.В. Окислительная модификация белков // Успехи современной биологии. 1993. - Т.113.-С.71-81.

10. Ерин А.Н., Гуляева Н.В., Никушкин Е.В. Свободнорадикальные механизмы в церебральных патологиях // Б. Э. Б. М. 1994. - Т. 118, №10. - С. 343-348.

11. Ивкова М.Н., Веденкина Н.С., Бурштейн Э.А. Флуоресценция триптофановых остатков сывороточных альбуминов // Молекулярная биология. 1971. - №5. - С. 214-222.

12. Коган А.Х., Грачев C.B., Елисеева C.B., Болевич С. Углекислый газ -универсальный ингибитор генерации активных форм кислорода клетками (к расшифровке одной загадки эволюции) // Известия АН, Серия Биологическая. 1997. - №2. - С. 204-217.

13. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева З.В. Простой чувствительный метод для определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопр. Мед. Химии,- 1990,- Т. 36, № 2. -С. 88-91.

14. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных процессов // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, №4.-С. 442-455.

15. Нуллер Ю.Л. Депрессия и деперсонализация //Л. Медицина. -|1981. -208 с.

16. Саприн А.Н., Калинина Е.В. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов // Успехи биологич. Химии. 1999. - Т. 39. - С. 289-326.

17. Скулачев В.П. Возможная роль активных форм кислорода в защите от вирусных инфекций//Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 12. - С. 1691-1694.

18. Тимашев С.Ф. Физико-химия мембранных процессов // М. Химия. -1998.

19. Филаретов Ф.А., Подвигина Т.Т., Филаретова Л.П. Адаптация как функция гипофизарно-адренокортикальной системы // Санкт-Петербург. Наука. 1994.

20. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид кислорода и токсичность кислорода // В книге "Свободные радикалы в биологии". Ред. Прайор У. -М. Мир. - 1979. -Т. 1. - С. 272-314.

21. Шамб У., Сеттерфилд Ч., Вентворс Р. Перекись водорода. // М. Иностр. литер. - 1958. - 578 с.

22. Шестак К.П., Сергеева М.Г., Зайцев С.В., Харченко Е.П. и др. Анализ новых опиатоподобных пептидов радиорецепторным методом. // Укр. биохим. журнал. 1990. - Т. 62, №2. - С. 23-29.

23. Харченко Е.П., Соколова Т.В., Калихевич В.Н. и др. Димеры из регуляторных пептидов как инструмент анализа их действия // Докл. АН СССР. 1987. - Т. 297, №5. - С. 1264-1267.

24. Al-Damluji S., Bouloux P., White A., Besser M. The role of alpha-2-adrenoreceptors in the control of ACTH secretion; interaction with the opioid system // Neuroendocrinology. 1990. - V. 51. - P. 76-81.

25. Amici A., Levine R.L., Tsai L., Stadtman E.R. Conversion of amino acid residues in proteins and amino acid homopolimers to carbonyl derivatives by metal-catalyzed oxidation reactions // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 3341-3346.

26. Babior B.M. The enzymatic basis for 02* production by human neutrophils // Canad. J. Physiol. Pharmacol. 1982. - V. 60, № 11. - P. 1327.

27. Beutler E. Red cell metabolism // New York; London.- 1975,- P. 89-90.

28. Bickford P.C., Chadman K., Williams B., Shukitt-Hale B., Holmes O., Taglialatela G., Joseph J. Effect of normobaric on two indexes of synaptic function in fisher 344 rats // Free Radic. Biol. Med. 1999. - V. 2, №7/8. - P. 817-824.

29. Bielski B.H. J. Generation of Iron(IV) and Iron(V) Complexes in Aqueous Solutions // Metods in enzymology. 1990. - V.186. - P.108-113.

30. Blandin C.C., Delavean T. Structural modifications of Human P2 microglobulin treated with free radicals // Free Radic. Biol. Med. 1990. - V. 9, Suppl. 1. - P. 84.

31. Bosch-Morell F., Flone L., Marin N., Romero F.J. 4-Hydroxynonenal inhibits glutathion peroxidase: protection by glutathione // Free Radic. Biol. Med. -1999. Y.26, №11/126. - P. 1383-1387.

32. Buxton G.V., Greenstock C.L., Helman W.P., Ross A.B. J. Critical Review of Rate constants for Reactions of Hydrated Electrons, Hydrogen Atoms and Hydroxyl Radicals (OH'/O*-) in Aqueous Solution // Phys. Chem. Ref. Data. -1988 -V. 17.-P. 513-886.

33. Cabelli D.E., Bielski H.J. Use of polyaminocarboxylates as metal chelators // In: Packer L., Glazer A.N., eds. Methods in enzymology. 1990. - N. Y.: Academic Press - V. 186. - P. 116-120.

34. Cadenas E., Pasker L., Dekker M. Handbook of Antioxidants // New York, Basel, Hong Kong. 1996.

35. Cadet J.L., Brannock C. Free Radicals and the pathobiology of brain dopamine systems // Neurochem. Int. 1998. - V. 32. - P. 117-131.

36. Carrol B. j., Curtis G.C., Mendels J. Neuroendocrine regulation in depression // Arch. Gen. Psychiat. 1976. - №9. - P. 1051-1058.

37. Chow C.K. Vitamin E and Oxidative Stress // Free Rad. Biol Med. 1991. - V. 11, №2. -P. 215-232.

38. Colton C.A., Gilbert D.L. An endogenous source of superoxide anion in central nervous system // Oxygen Radicals in Biol, and Med. 4th Int. Congr. New York - London. - 1988. - P. 1005-1010.

39. Condell R.A., Tappel A.L. Evidence for suitability of Glutetion Peroxidase as a protective enzyme: studies of oxidative damage, renaturation and proteolysis // Arch. Biochem. Biophys. 1983 - V. 223 - P. 407-416.

40. Connor J.R., Tucker P., Johnson M., Snyder B. Ceruloplasmin levels in the human superior temporal gyrus in aging and Alzheimer's disease // Neurosci Lett. 1993. - V. 159, №1-2. - P. 88-90.

41. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxigen radicals //1. General aspects. J. Biol. Chem. - 1987. - V. 262, №20 - P. 9895-9901.

42. Davies K.J. A., Delsignore M.E. Protein damage and degradation by oxygen radicals. III. Modification of secondary and tertiary structure. // J. Biol. Chem.- 1987. V. 262, №20 - P. 9908-9913.

43. Davies K.J. A., Delsignore M.E., Lin S.W. Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino acids // J. Biological Chemistry. -1987. V. 262, №20 - P. 9902-9907.

44. Davies K.J. A., Goldberg A.L. Oxygen radicals stimulate intracellular proteolysis and lipid peroxidation by independent mechanisms in erithrocytes // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262 - P. 8220-8226.

45. Davies K.J. A., Lin S.W. Degradation of oxydatively denaturated proteins in E. Coli. // Free Radie. Biol. Med. 1988. - V. 5 - P. 215-223.

46. Davies K.J. A., Lin S.W., Pacifici R.E. Protein damage and degradation by oxigen radicals. IV. Degradation of denatured protein // J. Biol. Chem. 1987.- V. 262, №20 P. 9914-9920.

47. Davison A.J., Kettle A.J., Fatur D.J. Mechanism of the ingibition of catalase by ascorbate. Roles of active oxygen species, copper and semidehydroascorbate // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 1193-1200.

48. Dean R.T., Cheeseman R.N. Restriction of free radical attact on monoamine oxidase in the mitochondrial membrane by vitamin E // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1987. - V. 148. - P. 1277-1282.

49. Dean R.T., Fu S., Stocker R., Davies M. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation // Biochem J. 1997. - V. 324. - P. 1-18.

50. Dean R.T., Giesy S., Davies M.J. Reactive species and their accumulation on radical-damaged proteins // Trends Bisci. 1993. - V. 18. - P. 437-441.

51. Dean R.T., Hunt J. V., Grant A.J., Jamamoto Y., Niki E. Free radical damage to proteins: the influence of the relative localization of radical generation, antioxidants, and target proteins // Free Radic. Biol. Med. 1991. - V. 11 - P. 161-168.

52. DeanR.T., Thomas S.M., Garner A.C. Free-radical-mediated fragmentation of monoamine oxidase in the mitochondrial membrane. Roles for lipid radicals // Biochem. J. 1986. - V. 240. - P. 489-494.

53. Dubinina E.E., Babenko G.A., Shcherbak I.G. Molecular heterogeneity of plasma superoxide dismutase // Free Rad. Biol. Med.- 1992. Vol. 13, №1. - P. 1-7.

54. Dyatlov V.A., Makovetskaia V. V, Leonhardt R., Lawrence D.A., Carpenter D.O. Vitamin E enhances Ca2+-mediated vulnerability of immature cerebellar granule cells to ischemia // Free Radic. Biol. Med. 1998. - V. 25, №7 - P. 793-802.

55. Evans P.H. Free radicals in brain metabolism and patology // Br. Med. Bull. -1993.-V. 49, №3 -P. 577-587.

56. Extein J., Pottash A.L. C., Gold M.S. A possible opioid receptor dysfunction in some depressive disorders // Annals N. Y. Academy Sei. 1982. - P. 113-119.

57. Farber J.M., Levine R.L. Sequence of a peptide susceptible to mixed-function oxidation. Probable cation binding site in glutamine synthetase // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 4574-4578.

58. Fucci L., Oliver C.N., Coon N.J., Stadtman E.R. Inactivation of key metabolic enzymes by mixed-function oxidation reactions: possible implications in protein turnover and aging // Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 1983. - V. 80. P. 1521-1525.

59. Gamaley LA., Klyubin I.V. Roles of reactive oxygen species: signaling and regulation of cellular functions // Int. Reviev Cytology. 1999. - V. 188. - P. 203-255.

60. Garthwaite J. Glutamate, nitric oxide and cell-cell signaling in the nervous system // TINS. 1991 - V. 14, №2 - P. 60-67.

61. Gebicki S., Gebicki J.M. Formation of peroxides in amino acids and proteins exposed to oxygen free radicals //Biochem. J. 1993. - V. 289 - P. 743-749.

62. Geremia E. Baratta D., Zafarana S., Giordano R., Pinizotto M.R., La

63. Rosa M.G., Garozotto M.R. Antioxidant enzymatic systems in neuronal and glial cell-enriched fractions of rat brain during aging // Neurochem. Res. -1990.-V.15.-P. 719-723.

64. Giulivi C., Davies K.J.A. Dityrosine and tyrosine oxidation products are endogenous markers for the selective proteolysis of oxidatively modified red blood cell hemoglobin by (the 19S) proteosome // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268, №12. - P. 8752-8759.

65. Gmeiner B., Seelos C. Phosphorylation of tyrosine prevents dityrosine formation in vitro // FEBS Lett. 1989. - V. 255. - P. 395-397.

66. Gold M.S., Pottash A.L. C., Sweeney D.R., Kleber H.D., Redmond D.E. Rapid opiate detoxification: Clinical evidence of antidepressant and antipanic effects of opiates // Am. J. Psychiatry. 1979. - V. 136. - P. 982-983.

67. Gold M.S., Pottash A.L. C., Sweeney D., Martin D., Extein J. Antimanic, antidepressant, and antipanic effects of opiates: clinical, neuroanatomical,, and biochemical evidence // Annals N.Y. Academy Sci. 1982. - P. 140-150.

68. Goss S.P. A., Singh R.J., Kalyanaraman B. Bicarbonate Enhances the Peroxidase Activity of Cu, Zn-Superoxide dismutase // J. Biol. Chem. 1999. -V. 274. - P. 28233-28239.

69. Gotz M.E., Kuning G., Riederer P., Youdim M.B.H. Oxidative stress; Free Radical Production in neural degeneration // Pharmacol. Ther. 1994. - V. 63 -P.37-122.

70. Gow A., Friedrich V.L., Lazzarini R.A. Many Naturally occuring Mutations of Myelin Proteolipid Protein Impair its Intracellular Transport // J. Neurosci. Res. 1994. - V.37, №5. - P. 574-583.

71. Grossman A. Opioids and stress: The role of ACTH and epinephrine// Neuropeptides and stress / Eds. Y. Tache, J.E. Morley, M.R. Broun. New York: Springer. 1989. - P. 313-323.

72. Gruñe T., Blasig I.E., Sitte N., RoloffE., Haseloff R.,

73. Davies K.J.A. Peroxynitrite increases the degradation of aconitase and other cellular proteins by proteasome // J. Biol. Chem. 1998,- V. 273: 1085710862.

74. Gruñe T., Reinheckel T., Davies K.J.A. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells // FASEB J. 1997. - V. 11. - P. 526-534.

75. Gruñe T., Reinheckel T., Joshi M., Davies K.J.A. Proteolysis in cultured liver epitelial cells during oxidative stress role of the multicatalytic proteinase complex, proteasome // J. Biol. Chem. - 1995. - V. 270, № 5. - P. 2344-2351.

76. Gsell W., Conrad R., Majida H., Emin S., Lutz F., Zline W., et. al. Decreased catalase activity but unchanged superoxide dismutase activity in brains of patients with dementia of Alzheimer type // J. Neurochem.- 1995,- Vol. 64, №3.-P. 1216-1223.

77. Gutteridge J.M.C. Antioxidant properties of the protein caeruloplasmin, albumin and transferrin: A study of their activity in serum and synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V. 869.-P. 119-127.

78. Gutteridge J.M. C., Quinlan G.J., Clark I.A., Halliwell B. Aluminium salts accelerate peroxidation of membrane lipids stimulated by iron salts // Biochem. Biophys. Acta. 1985. - V. 835. - P. 441-447.

79. Gutteridge J.M. S., Wilkins S. Copper salt-dependent hydroxyl radical formation damage to proteins acting as antioxidants // Biochem. Biophys. Acta. 1983. -V. 759. - P. 38-41.

80. Halliwell B. Superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase: solutions to the problems of living with oxygen // New Phytol. 1974. - V. 73, №6. - P. 1075-1086.

81. Halliwell B. Reactive Oxygen Species and the Central Nervous System // In: Free Radical in the Brain. Aging, Neurological and Mental Disorders. Packer L., Prilipco L., Christen Y. eds. Springer-Verlag, Berlin, N. Y., London.- 1992.-P. 21-40.

82. Halliwell B. Mechanisms involved in the generation of free radicals // Path. Biol. 1996.-V. 44, № 1,-P. 6-13.

83. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: An overview // In: Parker L.; Glazer A.N., eds. Methods in enzymology. New York: Academic Press. 1990. - V. 186. - P. 1-85.

84. Harbuz M.S., Lidhman S.L. Stress and the hypothalamo-pituitary-adrenal axis: Acute, Chronic and immunological activation // J. Endocrinol. 1992. - V.134. -P. 327-339.

85. Heinecke J.W., Li W., Daehnke H.D., Goldstein J.A. Dityrosine, a specific marker of oxidation, is synthesized by the myeloperoxidase-hydrogen peroxide system of human neutrophils and macrophages // J. Biol. Chem. 1993,- V. 268, №25. - P. 4069-4077.

86. Hodgson E.K., Fridovich I. The interaction of bovine erithrocyte superoxide dismutase with hydrogen peroxide: inactivation of the enzyme // Biochemistry.- 1975. -V. 14. P. 5294-5299.

87. Hodgson E.K., Fridovich I. The interaction of bovine erithrocyte superoxide dismutase with hydrogen peroxide: chemiluminescence and peroxidation // Biochemistry. 1975. - V. 14. - P. 5299-5303.

88. Holtzman M.J. Arachidonic Acid Metabolism // Am. Rev. Respir. Dis. 1991.- Y. 143, №1. P. 188-203.

89. Huggins T.G., Wells-Knecht M.C., Detorie N.A., Baynes J.W., Thorhe S.R. Formation of o-tyrosine and dityrosine in proteins duringradiolytic and metal-catalyzed oxidation // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 12341-12347.

90. Hunt J. V., Simpson J.A., Dean R.T. Hydroperoxide-mediated fragmentation of proteins // Biochem. J. 1988. - V. 250. - P. 87-93.

91. Javoy-Agid F. Dopaminergic Cell Death in Parkinson's Disease // In " Free Radicals in the Brain. Aging, Neurological and Mental Disorders", Ed. by Packer L., Prilipko L., Christen Y., Springer-Yerlag, Berlin., N. Y., London. -1992.-P. 99- 108.

92. Jewett S.L., Rocklin A.M., Ghanivati M., Abel J.M., Marach J.A. A new look at a time-worn system: oxidation of Cu Zn-SOD by H2O2 // Free Radie. Biol. Med. 1999. - V. 26, №7/8. - P. 905-916.

93. Karem L.R., DizdarogluM., Simie M.G. OH'radical-induced products of tyrosine peptides // Int. J. Radiat. Biol. 1984. - V. 46. - P. 715-724.

94. Kikugawa K., Kato T., Hayasaka A. Formation of dityrosine and other fluorescent amino acids by reaction of amino acids with lipid hydroperoxides // Lipids. -1991. V. 26. - P. 922-929.

95. Kim Y.S., Han S. Nitric oxide protects Cu, Zn-superoxide dismutase from hydrogen peroxide-induced inactivation // FEB S Letters. 2000. - V. 479. - P. 25-28.

96. Kline N.S., Li C.H., Lenmann H.E., Lajtha A., Laski E., Cooper T. PEndorphin induced changes in schizophrenic and depressed patients // Arch. Gen. Psychiatry. 1977. - V. 43. - P. 1111 -1113.

97. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembley of the head of the bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-682.

98. Left J.A., Oppegard M.Q., Curiel T.J., Brown K.S., Schooley R.T., Repine J.E. Progressive increases in serum catalase activity in advancinghuman immunodeficiency virus infection // Free Rad. Biol. Med.- 1992. V. 13, №2. - P. 143-149.

99. Levine R.L., Garland D., Oliver C.N., Amici A., Climent J., Lenz A., Ann B., Shaltiel S., Stadtman E.R. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins // Method Enzymol. 1990. - V. 186. - P. 464478.

100. Levine R.L., Stadtman E.R. Protein Modification with Aging // In: Handbook of the biology aging. E.L. Schneider, J.W. Rowe eds. San Diego: Acad. Press.- 1996,- P. 184-197.

101. Lo W.D., Betz A.L. Oxigen Free Radical Reduction of Brain Capillary Rubidium Uptake // J. Neurochem. 1986. - V.46, № 2. - P.394-398.

102. Mac Lennan A.J., Drugan R.C., Hyson R.L., Maier S.F., Madden J., Barchas J.D. Corticosterone: a critical factor in an opioid form stress-induced analgesia //Science. 1982. - V. 215. - P. 1530-1532.

103. Malencik D.A., Zhao Z., Anderson S.R. Determination of dityrosine, phosphotyrosine, phosphothreonine by high performance liquid chromatography // Analyt. Biochem. 1990. - V. 184. - P. 353-359.

104. Marcilatt O., Zhang Y., Lin S.W., Davies K.J.A. Mitochondria contain a proteolytic system which can recognize and degrade oxidatively-denaturedvproteins //Biochem. J. 1988. - V. 254. - P. 677.

105. Marklund S.L., Holme E., Hellner L. Superoxide Dismutase in extracellular fluids // Clin. Chim. Acta. 1982. - V. 126, № 1. - 41-51.

106. Martinez-Cayuela M. Oxygen free radicals and human disease // Biochimie. 1995.-V. 77, №3.-P. 147-161.

107. Martins E.A. L., Meneghini R. DNA Damage and Lethal Effects of Hydrogen Peroxide and Menadione in Chinese Hamster Cells: Distinct

108. Mechanisms are Involved // Free Radic. Biol. Med. 1990. - V.8, №5 - P.433-440.

109. Mickel H.S., Oliver C.N., Starke-Reed P.E. Protein oxidation and myelinolysis occur in brain following rapid correction of hyponatriemia. Biochem. Biophys. Resear. Comm. 172: 92-97; 1990.

110. Mino M. Clinical Uses and Abuses of Vitamin E in Children //P. S. E. B. M. 1992. - V.200. - P. 266-270.

111. Modell S., Yassouridis A., Huber J., Holsboer F. Corticosteroid receptor function is decreased in depressed patients // Neuroendocrinology. 1997. - V. 65.-P. 216-222.

112. Mukhopadhyay C.K., Chatterjee I.B. NADPH-initiated cytochrome P450-mediated free metal ion-independent oxidative damage of microsomal proteins // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269, № 18. - P. 13390-13397.

113. Nappi A.J., Vass E. Hydroxyl radical formation via iron-mediated Fenton chemistry is inhibited by methylated catechols // Biochim. Biophys. Acta. -1998.-V. 1425.-P. 159-167.

114. Nicolas P., Li C.H. p-Endorphin-(l-27) is a naturally occurring antagonist to etorphine-induced analgesia//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V. 82. - P. 3178-3181.

115. Ogino T., Okada S. Oxydative damage of bovine serum albumin and other enzyme proteins by iron chelate complexes // Biochem. Biophys. Acta. 1995. -V. 1245. - P. 359-365.

116. Ohyashiki T., Kamata K., Takeuchi M., Matsui K. Contribution of peroxidation products to oxidative inactivation of rat liver microsomal glucose-6-phoshatase // J. Biochem. 1995. - V. 118. - P. 508-514.

117. Oliver C.N. Inactivation of enzymes and oxidative modification of protein by stimulated neutrophils // A. B. B. 1987. - V. 253. - P. 62-72.

118. Oliver C.N., Ahn B.W., Moreman E.J., Stadtman E.R. Age-related changes in oxidized proteins // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262, № 12. - P. 5488-5491.

119. Pacifici R., Davies K.J.A. Protein degradation as an index of oxidative stress // Methods in enzymology. 1990. - V. 186. - P. 485-502.

120. Pacifici R. E, Kono Y., Davies K.J.A. Hydrophobicity as the signal for selective degradation of hydroxyl radical-modified hemoglobin by the multicatalytic proteinase complex, proteasome // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268, №21.-P. 15405-15411.

121. Pantke U., Volk T., SchmutzlerM., Kox W.J., Sitte N., Grune T. Oxidized proteins as a marker of oxidative stress during coronary heart surgery // Free Radic. Biol. Med. 1999. - Y. 27, № 9/10. - P. 1080-1086.

122. Pryor W.A., Church D.P. Aldehydes, hydrogen peroxide, and organic radical as mediators of oxygen toxicity // Free Rad. Biol. Chem. -1991. V. 11. - P. 41-46.

123. Qian S. Y., Buettner G.R. Iron and dioxygen chemistry is an important route to initiation of biological free radical oxidations: an electron paramagnetic resonance spin trapping study // Free Radic. Biol. Med. 1999. - V. 26, № 11/12.-P. 1447-1456.

124. Racz K., Glaz E., Kiss R., Lada G., Varga J., Vida G., Gleria K.D., Medzihradszky K., Lichtwald K. Adrenal cortex newly recognized periferal site of action of enkephalin // Biochem. Biophys. Res. Comm. - 1980. - V.97. -P. 1346-1353.

125. Radi R., Bush K.M., Cosgrove T.P., Freeman B.A. Reaction of xantine oxidase-derived oxidants with lipid and protein of human plasma // Arch. Biochem. Biophys. 1991. - V. - 286, №1. - P. 117-125.

126. Reznik A.Z., Packer L. Oxidative damage to protein: spectrophotometric method for carbonyl assay // Method Enzymol. 1994. - V. 233. - P. 357-363.

127. Richards D.S. H., Dean R.T., Jessup W. Membrane proteins are critical targets in free radical mediated cytolysis // Biochim. biophys. acta. 1988. - V. 946. - P. 281-288.

128. Rush J.D., Koppenol W.H. J. Oxidizing Intermediates in the Reaction of Ferrous EDTA with Hydrogen Peroxide // Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 6730-6733.

129. Salo D.S., Pacifici R.E., Lin C.W, Giulivi C., Davies K.J.A. Superoxide dismutase undergoes proteolysis and fragmentation following oxidative modification and inactivation // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265, №20. - P. 11919-11927.

130. Schigenaga M.K., Hagen T., Ames B.N. Oxidative damage and mitochondrial decay in agind // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. -P. 10771-10778.

131. Siems W.G., Grune T., Esterbauer H. 4-Hydroxynonenal formation during ishemia and reperfiision of rat small intestine // Life Sci. 1995. - V. 57. - P. 785-789.

132. Sitte N., Merker K., Grune T. Proteasome-dependent degradation of oxidized proteins in MRC-5 fibroblasts // FEBS Lett. 1998. - V. 440. - P. 399-402.

133. Siu G.M., Draper H.H. Metabolism of malondialdehyde in vivo and in vitro // Lipids. 1982. - V. 17. - P. 349-355.

134. Smith M.A., Sayre L.M., Anderson V.E., Beal M.F., Kowall N., Richey P.L., Perry G. Oxidative damage in Alzgeimer's disease // Nature. -1996. Y.382. - P.120-121.

135. Snyder S.H. The opiate receptor and morphine-like peptides in the brain // Am. J. Psychiatry. 1978. - V. 135 - P. 645-652.

136. Sobel H., Ajie H. Modification in amino acids of dead sea scroll parchments // Free Radic. Biol. Med. 1992. - V.13. - P.701-702.

137. Sram R.J., Binkova B. Side Effects of Psychotropic Therapy // In " Free Radicals in the Brain. Aging, Neurological and Mental Disorders", Ed. by Packer L., Prilipko L., Christen Y., Springer-Verlag, Berlin., N. Y., London. -1992. P. 153-166.

138. Stadtman E.R. Protein oxidation and aging // Science. 1992. - V. 257. - P. 1220-1224.

139. Stadtman E.R. Metal ion-catalysed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences // Free Radic. Biol. Med. 1990. - V. 9, №4. - P. 315-325.

140. Stadtman E.R. Oxidation of proteins by mixed-function oxidation systems: implication in protein turnover, ageing and neutrophil function // Trends Biochem. Sci. 1986. - V. 11. - P. 11.

141. Stadtman E.R. Oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins by radiolysis and by metal-catalyzed reaction // Annu. Rev. Biochem. 1993.-V. 62.-P. 797-821.

142. Stadtman E.R., Oliver C.N. Metall-catalyzed oxidation of proteins. Physiological consequences//J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 2005-2008.

143. Starke-Reed P.E., Oliver C.N. Protein oxidation and proteolysis during aging and oxidative stress // Arch. B. B. 1989. - V.275. - P.559-567.

144. Stewart P.M., Krozowski Z.S. // In: Vitamins and Hormones. Ed. by

145. G. Litwack. Acad. Press. San Diego, London, Boston, N. Y., Sydney, Tokyo, Toronto. 1999. - V. 57. - P. 249-324.

146. Sun Yi. Free Radicals, Antioxidant Enzymes, and Carcinogenesis // Free Rad. Biol. Med. 1990. - V. 8. - P. 583-599.

147. Suzuki Y.J., Forman H.J., Senian A. Oxidants as stimulators of signal transduction // Free Rad. Biol. Med. 1997. - V. 22, № 1/2. - P. 269-285.

148. Szalay K.S., Stark E. Effect of beta-endorfin and alpha-MSH on the corticosteroid production of isolated adrenal zona glomeruosa and zona fasciculata cells // Acta endocrinol. -1981. V. 97, Suppl. 243. - P. 17-20.

149. Szweda L.I., Stadtman E.R. Iron-catalyzed oxidative modification of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroids: structural and functional changes // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 30963100.

150. Terenius L. Opioid receptors and their ligands // Neuropeptides and stress. Eds. Y.Tache, J.E.Morley, M.R.Brown. New York etc.: Springer. - 1989. - P. 247-255.

151. Terman G.W., Liebskind J.C. Relation of stress-induced analgesia to stimulation-produced analgesia//Ann. N.Y. Acad. Sei. 1986. - V. 467. - P. 300-308.

152. Tew D., de Montellano P.R.O. The myoglobin protein radical. Coupling of Tyr-103 to Tyr-151 in the H202-mediated cross-linking of sperm whale myoglobin // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263, № 33. - P. 17880-17886.

153. Turrens J.F., Boveris A. Generetion of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria // Biochem. J. 1980. - V. 191. -P. 421-427.

154. Uchida K., Kawakishi S. Identification of Oxidized Histidine Generated at the Active Site of Cu, Zn-Superoxide Dismutase Exposed to H202 // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 2405-2410.

155. Ushisima Y., Nakano M., Goto T. Production and identification of ditirosine in horseradish peroxidase-H202-tyrosine system // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. - V. 125, № 3. - P. 916-918.

156. Van der Vliet A., Bast A. Effect of oxidative stress on receptors and signal transmission // Chem. Biol. Interact. 1992. - V. 85. - P. 95-116.

157. Vannucci R.C. Experimental Biology of Cerebral Hypoxia-Ischemia: Relation to Perinatal Brain Damage // Pediatric Res. 1990. - V. 27, № 4. - P. 317-326.

158. Von Sonntag C. The Chemical basis of radiation biology // London: Taylor and Francis. 1987.

159. Walling C. Fen ton's reaction revisited // Acc. Chem. Res. 1975. - V. 8. - P. 125-131.

160. Weiss S.J. Neutrophil mediated methemoglobin formation in the erythrocyte. The role of superoxide and hydrogen peroxide // J. Biol. Chem. -1982. V. 257, № 6. - P. 2947-2953.

161. Wells-Knecht M.C., Huggins T.G., Thorpe S.R., Dyer D.G.,

162. Baynes J.W. Oxidized amino acids in lens protein with age. Measurement of otyrosine and dityrosine in the aging human lens // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 12348-12352.

163. Winterbourn C., Pichorner H., Kettle A.J. Myeloperoxidase-dependent generation of a tyrosine peroxide of neutrophils //Arch. Biohem. Biophys. -1997. -V. 338, № 1. P. 15-21.

164. Yin D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores // Free Radic. Biol. Med. 1996. - V. 21, № 6. - P. 871-888.

165. Yin D., Lingnert H., Ekstrond B., Brunk U.T. Fenton reagents may not initiate lipid peroxidation in an emulsified linoleic acid model system //Free Radical Biol. Med. 1992. - V. 13. - P. 543-556.

166. Yu B.P. Aging and Oxidative stress: Modulation by Dietary Restriction. // Free Radic. Biol. Med. 1996. - V. 21, № 5. - P. 651-668.

167. Yu Y., Zhang L., Yin X., Sun H., Uhl G.R., Wang J.B. n Opioid Receptor Phosphorylation, Desensitization, and Ligand Efficacy. // J. Biol. Chem. -1997. V. 272, № 46. - P. 28869-28874.

168. Zaidi A., Michaels M.L. Effect of reactive oxygen species on brain synaptic plasma membrane Ca++-ATPase // Free Radic. Biol. Med. 1999. - V. 27, № 7/8. - P. 810-821.

169. Zaleska M. m., Floyd R.A. Regional lipid peroxidation in rat brain in vitro: possible role of endogenous iron // Neurochem. Res. 1985. - V. 10. - P. 397410.

170. Zelman F.P., Thienhaus O.J., Bosman H.B. Superoxide dismutase activity in Alzheimer's disease: Possible mechanism for paired helical filament formation // Brain Res. 1989. - V. 476. - P. 160-162.

Информация о работе

Морозова, Марина Геннадьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Показатели свободно-радикального окисления и уровень кортикостероидов у больных с депрессией и деперсонализацией - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы