Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск в ядах змей соединений, активных в отношении никотиновых рецепторов ацетилхолина и потенциал-активируемых кальциевых каналов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Поиск в ядах змей соединений, активных в отношении никотиновых рецепторов ацетилхолина и потенциал-активируемых кальциевых каналов"

На правах рукописи

Горбачева Елена Владимировна

ПОИСК В ЯДАХ ЗМЕЙ СОЕДИНЕНИЙ, АКТИВНЫХ В ОТНОШЕНИИ НИКОТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНА И ПОТЕШЩАЛ-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ

03 00 02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 ОНТ 2008

ПУЩИНО-2008

003448822

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель

кандидат биологических наук, Вульфиус Екатерина Анатольевна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Колесников Станислав Сергеевич

доктор биологических наук Тихонов Денис Борисович

Ведущая организация

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится «13» ноября 2008 г в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 002 038 01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, Московской обл, г Пущино, ул Институтская, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу 142290, Московская обл, г Пущино, ул Институтская, д 3

Автореферат разослан октября 2008 г Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ТИ Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рецепторы и каналы играют важную роль в быстрой синаптической передаче сигнала в центральной и периферической нервной системе, регуляции освобождения нейротрансмитгеров, в формировании потенциала действия, быстрого изменения внутриклеточной концентрации ионов, запуске каскада биохимических реакций Рецепторы и каналы участвуют в когнитивной функции мозга, формировании памятного следа, а нарушения их работы или экспрессии приводят к тяжелым нейродегенеративным заболеваниям (болезнь Паркинсона, Альцгеймера, снижение порога чувствительности и др ) Существует большое разнообразие рецепторов и каналов, поэтому необходимо иметь избирательные обратимые и необратимые агенты для их исследования Наличие высокоактивных и избирательных инструментов дает возможность исследования физиологических процессов и направленного вмешательства Источником таких соединений (антагонистов, реже активаторов) являются яды змей, пауков, моллюсков, рыб Так, с помощью а-бунгаротоксина (из яда змей семейства Е1аргс1ае) был выделен и подробно изучен мышечный ацетилхолиновый рецептор Из яда пауков изолированы токсины, избирательно блокирующие К+ каналы, из яда моллюсков - токсины, высокоизбирательно, но обратимо блокирующие различные подтипы никотинового рецептора ацетилхолина (пАСЬЯ) и потенциал-активируемые Са2+-каналы Ь-типа Несмотря на наличие большого числа селективных пептидных и белковых токсинов, потребность в новых лигандах остается очень высокой Такие соединения могут быть обнаружены в новых или мало изученных ядах О нейроактивных пептидах из яда змей семейства УгрепсЬе известно очень мало Поиск новых нейроактивных веществ в ядах змей этого семейства перспективен, так как в результате могут быть получены соединения с новыми фармакологическими свойствами

Настоящая работа посвящена поиску новых избирательных пептидов, содержащихся в ядах змей семейства У1репс1ае и способных блокировать пАСЫ^ и потенциал-активируемые Са2+-каналы

В идентифицированных нейронах Ьутпаеа stagnalls экспрессируются пАСЬЯб и потенциал-управляемые ионные каналы (кальциевые, калиевые, натриевые) нескольких подтипов Известно, что пАСЫ^ и потенциал-активируемые Са2+-каналы нейронов Ь

stagnalis по многим свойствам сходны с аналогичными структурами нейронов позвоночных Поэтому нейроны прудовика могут использоваться для поиска соединений, активных по отношению к этим мшценям, к тому же по сравнению с нервными клетками млекопитающих они являются более доступными

Цели и задачи исследования

Основной целью данной работы был поиск в ядах змей семейства Vipendae новых нейроакгивных компонентов, избирательных в отношении nAChRs и потенциал-акгивируемых кальциевых каналов, и их характеристика В связи с этим были поставлены следующие задачи

(1) подробная характеристика подтипов nAChRs в идентифицированных нейронах прудовика

(а) подтверждение содержания в этих нейронах однородной по ионному механизму популяции nAChRs,

(б) сравнение nAChRs нейронов прудовика с разными подтипами nAChRs позвоночных по чувствительности к агонистам и антагонистам,

(2) подбор условий для испытания цельных ядов и их фракций,

(3) оценка активности ядов змей семи видов по отношению к nAChRs и потенциал-акгивируемым Са2+-каналам,

(4) исследование действия полипептидных фракций, полученных в результате разделения ядов змей семейства Viperidae с использованием различных видов жидкостной хроматографии, на nAChRs и потенциал-активируемые Са2+-каналы и фракций яда кобры - на Са2+-каналы

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате работы установлено, что в мембране идентифицированных нейронов из париетальных ганглиев прудовика содержатся nAChRs, контролирующие только хлорную проводимость, что согласуется с результатами, полученными ранее на неидентифицированных нейронах (Кислое, Казаченко, 1974) (других nAChRs не обнаружено) и по фармакологическому профилю сходные с al подтипом nAChRs позвоночных (Vulfius et al, 2001, 2005) Идентифицированные нейроны содержат также

потенциал-активируемые Са2+-каналы, что дает возможность испытывать новые соединения одновременно на двух мишенях

Впервые показано, что яды змей семейства Vipendae активны в отношении а7 подобных рецепторов и потенциал-активируемых Са2+-каналов Выявлены, полипептидные фракции, избирательные к той или другой мишени Обнаружена способность яда кобры (сем Elapidae) блокировать потенциал-активируемые Са2+-каналы Полученные данные свидетельствуют о возможности использования ядов змей семейства Viperidae в качестве нового источника активных и избирательных веществ, способных блокировать ионные каналы и рецепторы

Апробация полученных данных и публикации

Результаты работы были представлены на Международном симпозиуме "Neuroscience for Medicine and Psychology" (Sudak, 2006 г), 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука ХХ1-го века» (Пущино, 2006 г), Всероссийская конференция "Фундаментальная наука и клиническая медицина" (Санкт-Петербург, 2007 г ), XX Съезде Физиологического общества им И П Павлова (Москва, 2007 г), Международной школе PENS SUMMER COURSE "Contemporary Problems of Neurobiology Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity" (Kazan, 2007 г), Совместной Российско-Германской конференции "Neuroreceptors structure, mechanism of action, and role m pathology" (Москва, 2007 г), II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007 г), Международной конференции Nicotinic Acetylcholine Receptors 2008 (Cambridge, 2008 г)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано И работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 96 страницах машинописного текста с использованием 35 рисунков, 3 таблиц и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы Список литературы содержит 140 ссылок

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена на идентифицированных нейронах L stagnalis, изолированных из большого и малого париетальных ганглиев (RPV2, RPV3, LP1-3), с помощью метода фиксации мембранного потенциала в условиях внутриклеточной перфузии Экспериментальные условия сходны по конфигурации с "whole-ceir-варианточ метода пэтч-кламп Нейроны изолировали механически после мягкой ферментативной обработки по методике, разработанной в лаборатории Изолированный нейрон помещали в камеру на пипетку (диаметром 10-20 мкм) с отрицательным давлением, заполненную раствором состава CsCl 95 мМ, СаС12 03 мМ, EGTA 2 мМ, HEPES 10 мМ, рН 72 Раствор в пипетке контактировал с электродом, задающим потенциал мембраны Опыты проводили при постоянном протоке через камеру наружного раствора состава NaCl 80 мМ, КС1 1 6 мМ, ВаСЬ 4 мМ, MgCU 1 5 мМ, Tnzma-HCl 4 мМ, рН 7 6 Хорошо проникающий через Са2+-каналы Ва2+ был использован вместо Са2+ во избежание возможного влияния на мембрану клеток Са2+ -активируемой фосфолипазы Аг, которая содержится в ядах змей, или других Са2+-зависимых компонентов яда

Проток приостанавливали на время инкубации с ядом (4-7 мин) и во время аппликации агонистов Ацетилхолин (ACh) апплицировали на всю поверхность клетки импульсами длительностью 4 с с интервалами не меньше 6 мин Ток через Са2+-каналы возбуждали скачком потенциала длительностью 200 мс от поддерживаемого уровня (-60 - -70 мВ) в сторону деполяризации Токи регистрировали с применением самодельного усилителя, АЦП конвертора DigiData 1200В, (Axon Instraments Inc, США) Для сбора и анализа данных использовался пакет лицензионных программ pClamp 6 0 (Axon Instruments Inc, США), а для графических работ Sigma Plot 10 0, Ongin 8 0, Visio Действие ядов оценивали по изменению ответов на ACh или скачок потенциала в момент пика. Блок рассчитывали как отношение максимального значения тока, индуцированного данной концентрацией ACh или сдвигом потенциала после обработки ядом, к среднему из двух контрольных значений до и после отмывания (30-50 мин) Все эксперименты проводили при температуре 20-23 "С в осенне-зимний период

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика объекта

Ранее было показано, что ответ на АСЬ в неидентфицированных нейронах Ь ¡¡а^Ьз обусловлен ионами хлора (Кислов, Казаченко, 1974) В опытах, проведенных нами на идентифицированных нейронах ЯРУ2, ЯРУЗ, ЬР1-3, ответ на АСЬ не менялся при двукратном снижении наружной концентрации и полностью зависел от концентрации СГ во внутриклеточном растворе, потенциал реверсии описывался уравнением Нернста для СГ Таким образом, наши эксперименты подтвердили тот же ионный механизм на идентифицированных нейронах, которые использовались нами в дальнейшем

Известно, что потенциал действия в нейронах прудовика формируется токами через потенциал-активируемые На+, К+ и Са2+-каналы По последним литературным данным в нейронах прудовика экспрессируются различные типы Са2+-каналов (ЭраПогс! ег а1, 2003) Чтобы выяснить вклад Ка+ и Са2+ тока в ответ на деполяризующий скачок потенциала, мы провели серию экспериментов по замене 100% в наружном растворе на непроникающий через канал М-метил-О-глюкозамии (Ы-теШу1-0-е1исатте) Оказалось, что вклад Ка^ незначителен (менее 10% от входящего тока) По потенциал-зависимости и кинетике Са2+ ток, по-видимому, представляет сумму токов через различные типы Са2+-каналов Каждый из испытанных блокаторов Са2+-каналов Ь-типа нифедипин и Ы-типа ш-конотоксин ОУ1А слабо блокировали ответ, вызванный деполяризацией Эти данные указывают на участие нескотьких типов Са2+-каналов в формировании входящего тока

Ранее в лаборатории было показано, что длинные а-нейротоксины и а-конотоксин 1т1 в концентрациях от 10 до 300 нМ блокируют пАСЫ^ нейронов прудовика, а такие лиганды пАСЫ1 как цитизин и никотин являются полными агонистами (УиШиэ с! а1, 2001, 2005) На этом основании было сделано предположение о сходстве изучаемых пЛСЫ15 с а7 подтипом пАСЬЛб позвоночных, хотя есть некоторое сходство с другими подтипами (а1р1Г5, аЗр2/а6)

Мы продолжили исследование характеристики пАСЬЯб с помощью агонистов и антагонистов обладающих разной избирательностью Оказалось, что холин, неспособный активировать гетеромерные пАСЬЯб вплоть до концентрации 10 мМ, вызывал ответы,

сходные с ответами на АСЬ, при этом в насыщающих концентрациях (1 мМ) вызывал ток 90-100% от максимального ответа на АСЬ (Рис 1)

ACh Choline

Рис 1 Ответы одной клетки на ацетилхолин (ACh) и холин (Choline) в разных концентрациях Момент и продолжительность аппликации обозначены горизонтальной линией над осциллограммами здесь и на последующих рисунках

Подтверждены данные по действию а-конотоксина Iml высокая блокирующая способность, две группы клеток с различными IC50 280 и 7 нМ Величина IC50 280 лежит в диапазоне концентраций, характерных для а7 nAChRs позвоночных, a величина IC50 7 нМ на 1-1 5 порядка ниже Недавно было показано, что этот а-конотоксин также имеет высокое сродство к a3ß2 подтипу nAChRs человека (Ellison et al, 2004) Для того, чтобы отбросить предположение о сходстве nAChRs нейронов прудовика с a3ß2, мы испытали а-конотоксин МИ, высоко избирательный для a3ß2/a6 (Cartier et al, 1996, Mcintosh et al, 2004) Он оказался на 3 порядка слабее, чем а-конотоксин Iml (Рис 2) Избирательный антагонист а9 nAChRs - а-конотоксин VCI.I. также был неэффективен а-Кокотоксины (Gl, MI, SIA), эффективно взаимодействующие с nAChRs мышечного типа, не блокировали ответ нейронов на ACh Эти данные позволяют считать маловероятным сходство nAChRs нейронов прудовика с a3ß2/a6, о9 и мышечными nAChRs

Дополнительно были испытаны антагонисты стрихнин (специфический антагонист глициновых рецепторов, но блокирующий также все гомоолигомерные nAChRs), а-конотоксин Imll (близкий по сродству к а7 nAChR человека с а-конотоксином Iml, но связывающийся с другим участком nAChRs, предположительно в устье канала (Ellison et al, 2003)), и агонисты диметилфенилпиперазин (частичный агонист а7 nAChR птиц, но полный агонист а7 nAChR млекопитающих), суберилдихолин

(не испытывавшийся на нейронах позвоночных полный агонист мышечных nAChRs, частичный агонист для сходных с а 7 nAChRs нейронов Aplysta (Kehoe, Mcintosh, 1998))

l/l conlr

02 -

OA -

1 0

06 -

di-

ll

80001 0 001 0 01 01 1 10 100 1000 Concentrations, pM

Рис 2 Зависимость амплитуды тока от концентрации а-конотоксинов

Оказалось, что (1) стрихнин блокирует пАСЬЯв нейронов $Ш£па11з (1С5о4мкМ), (2) димегилфенилпиперазин способен вызвать ответ равный 85% от максимального ответа на АСЬ, что указывает на сходство пАС1Лх прудовика с а7 пАСЫ^ млекопитающих, (3) суберилдихолин — полный агонист, а не частичный как на а7-подобных пАСЫ^э Ар1уна, (4) а-Конотоксин 1т11 оказался слабее 1т1 на 4 порядка (Ю50 400 мкМ), возможно это связано с различием в ионной селективности каналов пАСЫ^ моллюсков и позвоночных

В таблице 1 приводится сравнение по фармакологическому профилю пАСЫ^ нейронов Ь ¡1а§па115 с другими типами пАСЫ^

Видно, что, несмотря на некоторые отличия, рецепторы идентифицированных нейронов прудовика больше всего имеют сходство с а7 подтипом рецептора млекопитающих Все это позволяет использовать идентифицированные нейроны прудовика как тест-объект для испытания новых агентов, избирательных в отношении а7 пАСЫ^ и параллельно в отношении потенциал-активируемых Са2+-каналов

Таблица 1. Сравнение по фармакологическому профилю пАСИЯз идентифицированных нейронов /.утлаеа 5(адлэ//з с различными подтипами пАСЬКб позвоночных.

Кутпаеа а! Лр1у$ш «8 а9 а4р2 «304 «Зр2/а6 «РуЗ

Эф{ активность атомистов*

АСН ПОЛНЫЙ полный полный 'полный •1« 1111."и ; ПОЛНЕЙ полный полный ' полный

Цитизин ПОЛНЫЙ полный ; полный ПОЛНЫЙ НЭ иМНК полный часгич но

Холин полный ПОЛНЫЙ НО но НО НЭ но но

Никотин полный полный лолм:.ш полный НЭ полный полный полный

Диметил-фенилпиперазин полный частич ;. ПОЛНЫЙ пол«: '.л ш полный НО но

Суборилдихолии полный НО Шчаст НО НО НО но НО полный

Способность антагонистов блокировать АСИЯв

Длинные нейротоксины + + ' : + + + + + + + + + + ¡¡ЯШ ■ + + 4

Короткие нейротоксины + + + но • ■ ■ + + +

1ш1 + + + + .......... НО + • - + + :. ¡вй

МП - « • но - + + +

Vc 1.1 - но - - - -

Стрихнин + + + + + + ...... + + + но НО НО

1т11 : + + но НО но - +

GI.MI.SIA - - - - - - + + У

Серым цветом обозначено сходство, '-способность вызвать ответ, равный максимальному ответу на АСИ в насыщающей концентрации. (НО) не определено. (НЭ) нет эффекта агониста. количество Ж и (-) сила действия антагониста

Действие цельных ядов змеи на nAChRs ч потенциал-активируемые Са1*-каналы нейронов прудовика L. stasnahs

Мы испытали способность цельных ядов шести видов змей семейства Vipendae африканской шумящей гадюки Bitis arietans, эфы Echis multisquamatus, гадюки Никольского Vípera mkolskii, гюрзы V lebetma, гадюки степной V renardi и щитомордника Gloydius saxatihs, а также яда кобры Naja kaouthia (сем Elapidae) блокировать nAChRs и потенциал-активируемые Са2+-каналы нейронов прудовика L stagnalis Поскольку в яде кобры содержатся хорошо охарактеризованные а-нейротоксины, действующие на nAChRs L stagnalis, он был взят в качестве стандарта Кроме того, мы проверили способность этого яда блокировать потенциал-активируемые Са2+-каналы

Все выбранные нами яды в той или иной степени способны ингибироватъ индуцируемый ACh ток (Рис ЗА, 4) Из рисунков видно, что яды снижают ответ нейрона на ACh и замедляют кинетику ответа Практически полный блок обнаружился при использовании яда кобры в концентрации 0 5 мг/мл Степень уменьшения ответа на ACh и замедления кинетики зависели от концентрации, однако при повышении концентрации яда гадюк и щитомордника до 10 мг/мл полного блока ответов на ACh не происходило, максимальный эффект составлял от 30 до 70% от контроля (Рис 4) Эффекты были частично обратимы или необратимы вовсе, причем даже через 30-50 минут отмывания яда полное восстановление ответов на ACh не наблюдалось По активности в отношении nAChRs яды всех змей семейства Viperidae, кроме щитомордника каменистого, были близки

Скачок потенциала в сторону деполяризации вызывал входящий ток с относительно медленной инактивацией (Рис ЗБ, контроль) Контрольные опыты указывают, что большой вклад в ответ составлял Ва2+-ток через Са2+ каналы, поскольку 1) при добавлении в наружный раствор Со2+, Ni2+ или Мп2+в концентрациях 5-10 мМ ответ на сдвиг потенциала отсутствовал, 2) при использовании наружного раствора исходного состава (СаС12 вместо ВаСЬ) скачок потенциала вызывал сходный входящий ток, но с более быстрой инактивацией Вклад К+-тока отсутствовал, тк Ва2+ снаружи и Cs+ изнутри бчокируют К+-каналы Таким образом, в ответ на деполяризацию мы регистрировали практически чистый Ва2+ток через Са2+-каналы

Naja kaouthia ACh 5pM

0,5 mg/ml

u

Vipera renardi ACh SmM

control

•20mV f -60 mV

0,5mg/m!

KiJ

>nfrnl -'

-20mV -60mV

2mg/mlJ

control I

-¿umv p -60 mV

1_

control

Рис. 3. Влияние цельных ядов трех видов змей (А) Ответы трех нейронов на АС1г (Б) Ва2*- ток через потенцал-активируемые Са2*-каналы в трех других нейронах в ответ на деполяризующий скачок до -20 от поддерживаемого уровня. Все ответы нормированы по контролю непосредственно перед аппликацией АСИ или деполяризующим скачком потенциала. Значения калибровок общие для всех треков (А) и (Б).

se * О

к

ш «

nAthRs

ЦЦ

Штт

-г Ря^лтяж*. ^ | ^ ^

О

5

Гюрза Т

Ca - каналы

Я

"

Гаде© OHÖ^H"»*

Рис. 4. Относительное уменьшение амплитуды тока, вызванного АСИ (слева), и Ва2*-тока через потенцал-активируемые Са2*-каналы в ответ на деполяризующий скачок до -20 или 0 тУ от поддерживаемого уровня (справа). Здесь и на последующих рисунках каждый столбик представляет собой среднюю величину блока, полученную в 2-5 опытах на отдельных нейронах. Для ядов, испытанных более чем на 3 нейронах и более, указана стандартная ошибка. Концентрации цельных ядов 10 мг/мл, за исключением яда кобры (0.5 мг/мл).

Все испытанные яды уменьшали ток в ответ на скачок потенциала На рисунке ЗБ показано действие ядов трех змей на Ва2+ ток Блок, вызванный каждым из ядов в концентрации 2-10 мг/мл (яд кобры в концентрации 0,5 мг/мл), составил от 40 до 60% (Рис 4) Эффект зависел от концентрации, но полного подавления Ва2+-тока мы не наблюдали Как и в случае с током, вызванным ACh, яд щитомордника оказался самым слабым, яды других змей, включая кобру, по активности мало отличались друг от друга В связи с этим мы исключили яд щитомордника из дальнейших исследований В отличие от действия на рецепторы ACh, через 5-15 мин отмывания яда наблюдалось полное восстановление Ва2+ тока

Определение активности ядов было затруднено побочными эффектами Несмотря на полную замену Са2+ в наружном растворе на Ва2+, что должно привести к инактивации фосфолипаз Аг, содержащихся в ядах, в ряде опытов в течение 1-2 мин обработки происходило увеличение электротеской утечки и видимое в микроскоп уменьшение тургора клетки Особенно это касалось яда кобры Возможными причинами неспецифического действия ядов могли быть (1) наличие связанного с мембраной Са2\ количества которого достаточно для активации фосфолипазы Аг, (2) содержание в ядах змей лизофосфолипидов, которые могут встраиваться в мембрану и изменять ее физические свойства, (3) высокое содержание цитотоксинов, которые могут разрушать мембрану клеток Из-за побочных эффектов мы не могли повышать концентрацию ядов

Таким образом, яды змей семейства Vipendae обладают способностью блокировать nAChRs, сходные с а7, и потенциал-акгивируемые Са2+-каналы в нейронах прудовика, а яд кобры способен блокировать обе мишени Следующим шагом было фракционирование цельных ядов с использованием различных методов жидкостной хроматографии На первом этапе использовали метод гель-фильтрации

Действие фракций яда африканской гадюки В arietans

В результате гель-фильтрации из яда африканской гадюки получено девять полипептидных фракций фракция I - самая высокомолекулярная, фракция IX -низкомолекулярная Наиболее активными по блокированию nAChRs оказались фракции II-III и VII (блок 60%), а Са2+-каналов - фракции V и VII (блок 80-90%) (Рис 5)

nAChRs

№ фракции

Ca2* - каналы

Na фракции

Рис. 5. Относительное уменьшение амплитуды тока при активации пАСИРэ, и потенциал-активируемых Са2ч-каналов в ответ на деполяризующий скачок потенциала в присутствии фракций яда африканской гадюки. Концентрации всех фракций 10 мг/мл (здесь и дальше концентрации даны в пересчете на цельный яд).

На рисунке 6А представлено влияние фракции VII на ответы нейронов прудовика на АС11. Видно значительное снижение ответа (блок 80%) и замедление его кинетики. На рисунке 6Б показано действие фракции VII на максимальный входящий Ва2+ ток в ответ на деполяризацию, блок в момент пика составил 70%. Кроме того, происходил сильный сдвиг вольт-амперной характеристики в положительную область (Рис. 6В).

А Б В ACh ЗмМ •'mv I-1

Рис. 6. Действие VII фракции яда африканской гадюки на ответы нейронов на ACh (А) или скачок потенциала (Б). В - Вольт-амперная характеристика Ва2* тока в контроле и в присутствии фракции VII.

Фракции 11-Ш были подвергнуты дальнейшему разделению методом ионообменной хроматографии, а V и VII - обращено-фазовой хроматографии.

После обращенно-фазовой хроматографии фракции VII яда африканской гадюки были обнаружены 16 пиков (1-16), часть которых для удобства предварительного тестирования была объединена в 7 полипептидных подфракций.

На рисунке 7 представлены средние ветчины подавления тока под влиянием различных подфракций VII фракции. В среднем подфракция 10-11 обладает наибольшей активностью против пАСЫ^ (50%) и слаба против Ва2+ тока, тогда как подфракция 12-15-самая сильная против потенциал-активируемого Ва*^ тока (30%), но ненамного слабее против пАСЬЯэ. Необходимо отметить, что способность любой подфракции значительно уступала силе действия неразделенной фракции VII. По-видимому, это связано или с потерями активных соединений при хроматографии, или суммарным эффектом полилептидов, входящих в состав фракции. По данным масс-спектрометрии обе эти фракции содержат наборы пептидов с молекулярными массами в диапазоне от 1000 до 3000 дальтон, причем набор пептидов различен в каждой фракции.

nAChRs

о с ш

1 2 3-8 9 12-15 16 № подфракции

Ca2* - каналы

1 2 3-8 9 10-11 16 № подфракции

Рис. 7. Относительное уменьшение амплитуды тока при активации nAChRs и потенцал-активируемых Са2*-каналов в ответ на деполяризующий скачок потенциала до -20 или 0 mV от поддерживаемого уровня под влиянием полипептидных подфракций, полученных из фракции VII яда африканской гадюки. Концентрации подфракций 50 мг/мл.

В результате ионо-обменной хроматографии объединенной фракции II-III яда африканской гадюки были получены 14 подфракций (1-14), 10 из них были испытаны на нейронах прудовика (Рис. 8). Полипептиды фракций 5 и 6 проявили активность в отношении nAChRs, сопоставимую с активностью исходной фракции. В то же время ни одна из подфракций II-III фракции не вызывала снижения Ва2+ потенциал-активируемого

тока больше, чем на 30%. Таким образом, полипептиды фракций 5 и 6 обладают избирательностью в отношении пАСЬ!^, как и исходная фракция Н-Ш. Анализ фракций 5 и 6 с помощью масс-спектрометрии показал наличие в этих фракциях белков с молекулярными массами в диапазоне от 25 до 35 килодальтон.

nAChRs

фл

Са2*-каналы

ЬЙШ

го 60 50

40

t » Ш

га ю oJ.

пП1 In

2а 4 5 6 7 9 11 12 13 14 Na лодфракции

2а 4 5 6 7 9 11 12 13 14 Ns лодфракции

Рис. 8. Относительное уменьшение амплитуды тока при активации nAChRs или потенцал-активируемых Са2*-каналов в ответ на деполяризующий скачок потенциала под влиянием полипептидных подфракций II-III фракции яда африканской гадюки. Концентрации всех подфракций 50 мг/мл.

В результате хроматографии фракции V было получено 6 подфракций, ни одна из которых не подавляла ACh-вызванный ток; подфракция 1 проявила умеренную активность в отношении Са2+-каналов, хотя и в 2 раза меньшую, чем исходная фракция V (Рис. 9).

50-

3U-

¿3 20-

10-

0

nAChRs

,т т С]

1Ш1 *Г,-'„ 1

1 2 3 4 5 6 № подфракции

1т

Ca -каналы

* Ii

ш -Г, I

1 2 3 4 5 6

№ подфракции

Рис. 9. Относительное уменьшение амплитуды тока при активации пАСЬЯэ или потенцал-активируемых Са2*-каналов в ответ на деполяризующий скачок под влиянием полипептидных подфракций V фракции яда африканской гадюки. Концентрации всех подфракций 50 мг/мл.

Таким образом, пептиды и их смеси, полученные в результате хроматографического разделения яда Bilis anelans, обладают активностью и относительной избирательностью в отношении двух мишеней Подфракции VII(12-1S) и V(l) по способности блокировать Ва2+ток через нотенциал-активируемые Са2+-каналы в два и более раз превышают остальные и слабее подавляют ток, вызванный ACh, а подфракции VII(lO-ll), 11-111(5) и И-Ш(6) сильнее остальных по способности блокировать nAChRs и слабо влияют на Ва2+ ток, вызванный деполяризацией

Действие фракций ядов других змей

Яды гадюки Никольского, степной гадюки, эфы и кобры были также раздетсны методом гель-фильтрации, а полученные фракции были испытаны на нейронах прудовика Фракции ядов этих змей также блокировали nAChRs и потенциал-активируемые Са2+-каналы, причем некоторые из них обладали определенной избирательностью (Рис 10)

Из одиннадцати фракций яда степцой гадюки пять (II, III, IV, VII, IX) достаточно хорошо блокировали nAChRs и шесть (II, III, IV, VII, VIII, IX) - потенциал-акгивируемые Са2+-каналы При этом фракция IX оказалась избирательной в отношении потенциал-активируемых Са2+-каналов Следует отметить, что активность фракций яда степной гадюки против обеих мишеней была значительно выше, чем фракций из яда других змей (Рис 5, 10)

Из одиннадцати фракций яда эфы три проявили способность блокировать обе мишени, при этом действие фракций 1 и VIII на потенциал-активируемые Са2+-каналы было очень сильным (Рис 10) Однако существенной избирательности выявить не удалось Из семи фракций яда гадюки Никольского наиболее активными блокаторами nAChRs оказались фракции I и VI, а потенциал-активируемых Са2+ -каналов — III и VI , при этом фракция I гораздо слабее подавляла ответ на деполяризацию, а фракция III была значительно слабее в отношении nAChRs

Поскольку цельный яд кобры не сильно отличался от ядов змей семейства Viperidae по влиянию на ток, вызванный смещением потенциала, мы проверили действие фракций этого яда на потенциал-активируемый Ва2+ ток Из яда кобры было получено восемь фракций, из которых только одна, VII, обладает значительной активностью блок Ва2+ тока достигал 80% На nAChRs фракции яда кобры испытаны не были

100 I

о с; ш

II Ш IV* V VI VII VIII IX* X XI N2 фракции из яда степной гадюки

10080 ^ 60 I 40-I 20 0

т1{шийж

я

!!! IV V V! V!! V!!! !Х X X! № фракции из яда эфы

111 IV

V! VII

N8 фракции из яда гадюки Никольского

ШШ

I

III IV V VI VIIVIII

N8 фракции из яда кобры

Рис. 10. Способность фракций ядов змей блокировать пАСИРэ (левые столбики в каждой паре) и потенциал-активируемые Са2* каналы (правые столбики в каждой паре) в нейронах прудовика. Концентрации фракций 5-20 мг/мл; ' - концентрации < 1 мг/мл (наиболее активные фракции выделены большей интенсивностью окраски).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов мы установили, что в идентифицированных нейронах двух париетальных ганглиев £ экспрессируются

пАСЫи, однородные по ионному механизму ответа на АСЬ Все эти рецепторы управляют хлорной проводимостью, как было показано ранее для неидентифицированных нейронов прудовика (Кислов, Казаченко, 1974) Подтверждено и дополнено новыми данными предположение о сходстве этих пАСЬЯз с а7 подтипом пАСЬЯв нейронов позвоночных В частности показано (1) ответ на АСЬ подавляется а-кобратоксином, избирательным антагонистом пАСЫЪ мышечного типа и нейронных гомоолигомерных пАСЫ^ позвоночных, но не а-конотоксинами И, М1, Б1А - бчокаторами мышечных пАСЫЪ, (2) ток, вызванный ацетилхолином или другими агонистами пАСЬЯб, подавляется низкими концентрациями а-конотоксина 1ш1, избирательного антагониста а7 и, по некоторым данным, аЗР2 пАСЬЯб, но не а-конотоксином МП, высоко избирательным антагонистом аЗр2/а6 рецепторов, (3) пАСЬЯб прудовика отличаются от другого гомоочигомерного пАСЬЯ позвоночных, а9, по отсутствию чувствительности к а-конотоксину \'С11 и по высокой эффективности агонистов цитизина и никотина, (4) холин, полный агонист а7 пАСЬЯв, но очень слабый частичный агонист на всех гетеромерных пАСЫ^ позвоночньтх, является полным агонистом пАСЬЯб прудовика, (5) стрихнин, антагонист рецепторов глицина и гомоолигомерных пАСЬЯв позвоночных, блокир\ ет пАСЬЯв прудовика На этом основании мы пришли к заключению, что идентифицированные нейроны прудовика могут быть использованы в качестве тест-объекта для скрининга соединений, активных по отношению к а7 типу пАСЬЯя

Поскольку все нейроны прудовика генерируют входящий Са2+ ток в ответ на сдвиг потенциала в сторону деполяризации, эти нейроны могут быть также параллельно использованы для поиска блокаторов соответствующих каналов

В результате испытания цельных ядов семи видов змей впервые обнаружена способность этих ядов блокировать а7 подобные пАСИЯз и потенциал-активируемые Са2+ каналы Проведено исследование активности фракций, полученных а результате разделения ядов пяти видов змей с использованием различных видов жидкостной хроматографии В целом, проведен анализ 69 различных фракций При этим обнаружены фракции, обладающие наибольшей активностью и избирательностью по отношению к

пАСЬКв и потенциал-активируемым Са2+ -каналам Наиболее избирательными по отношению к пАСЫ^ оказались высокомолекулярные фракции яда африканской гадюки и гадюки Никольского В отношении потенциал-активируемых Са2+-каналов избирательными оказались низкомолекулярные фракции ядов тех же змей Таким образом, в ядах змей семейства Угрепс1ае впервые обнаружены активные избирательные блокаторы а7-подобных пАСЬЯв и потенциал-активируемых Са2+-каналов, а в яде кобры (сем Е1ар!с1ае) - блокатор(ы) Са2+-каналов В дальнейшем предстоит уточнить тип(ы) потенциал-активируемых Са2+-каналов, чувствительных к найденным соединениям и выяснить структуру полипептидов, проявляющих обнаруженные виды активности

ВЫВОДЫ

1. Показано, что идентифицированные нейроны из париетальных ганглиев Ьутпаеа stagnalls содержат анион-проводящие пАСЬЯв, по фармакологическому профилю сходные с а7 подтипом пАСЫ^ позвоночных, и потенциал-активируемые Са2+ каналы Поэтому они могут использоваться для поиска новых соединений, избирательных в отношении этих мишеней

2 Обнаружена способность цельных ядов змей семейства УрегиЬе блокировать а7 подобные пАСЬЯб и потенциал-активируемые Са2+ каналы, а также способность яда кобры (семейство Е1арн1ае) блокировать последние

3 Проведен анализ активности 69 фракций, полученных в результате разделения ядов пяти видов змей с использованием различных видов жидкостной хроматографии Выявлено 16 фракций яда гадюк, обладающих наибольшей способностью блокировать пАСЬЯб и/или Са2+ каналы Показано, что яд кобры содержит одну фракцию активную в отношении Са2+каналов

4 Выявлена избирательность трех фракций яда гадюк в отношении а7 подобных пАСЫ^ и трех фракций в отношении потенциал-активируемых Са2+-каналов

5 В яде африканской гадюки впервые идентифицированы две группы полипептидов, одни из которых хорошо и избирательно блокируют а7 подобные пАСЬЯв, а другие - избирательно блокируют потенциал-активируемые Са2+-каналы

6. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования ядов змей семейства У:репс1ае с целью получения новых нейроактивных соединений

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи

1. IE Kasheverov, MN Zhmak, С A Vulfius, E.V Gorbacheva, DYu Mordvintsev, R van Elk, А В Smit, VI Tsetlin. «а-Conotoxin analogs with additional positive charge show increased selectivity towards Torpedo cahformca and some neuronal subtypes of nicotinic acetylcholine receptors» FEBS Journal, v 273, p 4470-4481,2006

2. ЕВ Горбачева, В Г Старков, В И Цетлин, ЮН Уткин, ЕА Вульфиус «Яды змей семейства Viperidae способны блокировать никотиновые холинорецепторы и потенциал-активируемые Са2+-каналы идентифицированных нейронов прудовика Lymnaea stagnalis» Биол Мембраны, том 25, № 1, с 17-22,2008

Е V. Gorbacheva, V G Starkov, VI Tsetlin, Yu N Utkin, and С A Vulfius «Viperidae Snake Venoms Block Nicotinic Acetylcholine Receptors and Voltage-Gated Ca2+ Channels in Identified Neurons of Fresh-Water Snail Lymnaea stagnalis» Biochemistry (Moscow) Supplement Series A Membrane and Cell Biology, Vol 2, No 1, pp 14-18,2008

Тезисы докладов

1. E.V. Gorbacheva, С A Vulfius, IE Kasheverov, M N Zhmak, U N Utkin, VI Tsetlm «Characterization of nicotinic acetylcholine receptors in Lymnaea stagnalis neurons by ionic selectivity and sensitivity to specific а-conotoxins», International interdisciplinary congress "Neuroscience for Medicme and Psychology", p 81, Sudak, 2006

2. ЕВ Горбачева «Действие цельных ядов змей на ионные каналы изолированных нейронов Lymnaea stagnalis», 10-ая Путинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", с 108, Пущино, 2006

3 ЕЛ. Горбачева «Сходство и отличия никотиновых рецепторов ацетилхолина нейронов прудовика от рецепторов позвоночных», 10-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", с 108, Пущино, 2006

4 Е.В Горбачева «Идентификация в ядах змей семейства Viperidae блокаторов никотиновых рецепторов ацетилхолина и потенциалозависимых кальциевых каналов», Всероссийская конференция "Фундаментальная наука и клиническая медицина" Десятая медико-биологическая конференция "Человек и его здоровье", с 132, Санкт-Петербург, 2007

5. ЕВ Горбачева, Е А Вульфиус, Ю Н Уткин «Действие цельных ядов змей на никотиновые рецепторы ацетилхолина и потенциалозависимые ионные каналы в нейронах Lymnaea stagnahs», XX Съезд Физиологического общества им И П Павлова, с 198, Москва, 2007

6. E.V. Gorbacheva «Novel neurotoxic peptides from Bitis arietam venom» PENS SUMMER COURSE "Contemporary Problems of Neurobiology Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity", p 33, Kazan, 2007

7. С Vulfius, E. Gorbacheva, О Tumina, Y Utkin, I Kasheverov, V Tsethn «Lymnaea stagnalis neurons as a model for screening peptides active at acetylcholine- and voltage-gated ionic channels» Совместная Российско-Германская конференция "Neuroreceptors structure, mechanism of action, and role m pathology", p 22, Moscow, 2007

8 E А Вульфиус, E.B Горбачева, О Б Тумина, И Е Кашеверов, М Н Жмак, Ю Н Уткин, В И Цетлин «Характеристика никотиновых рецепторов ацетилхолина в нейронах моллюска по фармакологическому профилю Сравнение с нейрональными рецепторами позвоночных», II Съезд Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН, Цитология, т 9, с 729730, Санкт-Петербург, 2007

9. С A Vulfius, E.V. Gorbacheva, OB Tumina, IE Kasheverov, MN Zhmak, Y N Utkin, VI Tsetlin «Nicotinic acetylcholine receptors of molluscan neurons comparison with vertebrate neuronal receptors according to pharmacological profile» Nicotinic Acetylcholine Receptors 2008, p 71, Cambridge, 2008

Подписано в печать 08 10 2008 г

Печать трафаретная

Заказ №912 Тираж ЮОзкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferalru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горбачева, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. НИКОТИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АЦЕТИЛХОЛИНА.

1.1.1. Рецепторы нейротрансмиттеров.

1.1.2. Классификация рецепторов.

1.1.3. Строение. . а. Состав. 1 ' б. Структура. в. Участок связывания ацетилхолина.

1.1.4. Функциональные свойства.

1.1.5. Фармакологические свойства. а. Агонисты. б. Антагонисты.

1.1.6. Рецепторы нейронов моллюсков. а. nAChRs нейронов Aplysia californica. б. nAChRs нейронов Lymnaea stagnalis.

1.1.7. ACh-связывающий белок (AChBP).

1.2. ПОТЕНЦИАЛ-АКТИВИРУЕМЫЕ Са2+-КАНАЛЫ.

1.2.1. Различные типы Са" тока по физиологическим и фармакологическим свойствам.

1.2.2. Структура и некоторые молекулярные свойства потенциалакгивируемых Са +-каналов.

1.2.3. Разнообразие потенциал-активируемых Са2+-каналов.

1.2.4. Потенциал-активируемые Са2+-каналы нейронов

Lymnaea stagnali.

1.3 ЯДЫ ЗМЕЙ - ИСТОЧИК АКТИВНЫХ АГЕНТОВ ДЛЯ

ИССЛЕДОВАНИЯ РЕЦЕПТОРОВ И КАНАЛОВ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.Объект.

2.2. Изолирование нейрона.

2.3. Внутриклеточная перфузия.

2.4. Изготовление пипетки.

2.5. Конструкция камеры и система протоков.

2.6. Растворы.

2.7. Апликация агонистов и возбуждение тока через Са2+-каналы.

2.8. Регистрация трансмембранного тока.

2.9. Электрофизиологическая установка.

2.10. Обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ПО ХАРАКТЕРИСТИКЕ ОБЪЕКТА.

3.1. ИОННЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АЦЕТИЛХОЛИНА.

3.1.1. Участие Na+.'.

3.1.2. Участие К+.

3.1.3. Участие С1".

3.2. СРАВНЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ АЦЕТИЛХОЛИНА И АГОНИСТОВ.

3.2.1. Ацетилхолин.

3.2.2. Холин.

3.2.3. Цитизип.

3.2.4. Проверка аддитивности действия ацетилхолина и цитизина.

3.2.5. Диметилфеиилпиперазин.

3.2.6. Суберилдихолин.

3.3. ДЕЙСТВИЕ а-КОНОТОКСИНА IMI НА ТОК, ВЫЗВАННЫЙ РАЗЛИЧНЫМИ АГОНИСТАМИ.

3.3.1. а-Конотоксин Iml против ацетилхолина.

3.3.2. а-Конотоксин Iml против цитизина.

3.3.3. а-Конотоксин Iml против диметилфенилпиперазина.

3.3.4. а-Конотоксин Iml против суберилдихолипа.

3.4. ДЕЙСТВИЕ ДРУГИХ а-КОНОТОКСИНОВ И АНТАГОНИСТОВ.

3.4.1. Действие а-конотоксина МП.

3.4.2. Действие а-конотоксина Vc I.I.

3.4.3. Действие а-конотоксина [D12KJS1A.

3.4.4 Действие а-конотоксина Imll.

3.4.5. Действие стрихнина.

3.4.6. Действие а-конотоксинов [A10L]PnIA и [A10L,D14K]PnIA.

3.4.7. Проверка аддитивности действия Iml и [AlOLJPnIA.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПО ХАРАКТЕРИСТИКЕ ОБЪЕКТА.

5. ПОИСК В ЯДАХ ЗМЕЙ Б ЛОКАТОРОВ nAChRs И Са2+-КАНАЛОВ.

5.1. ДЕЙСТВИЕ ЦЕЛЬНЫХ ЯДОВ.

5.2. ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИЙ ЯДА АФРИКАНСКОЙ ГАДЮКИ B.arietans.

5.3. ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИЙ ДРУГИХ ЯДОВ ЗМЕЙ.

6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПО ПОИСКУ В ЯДАХ ЗМЕЙ БЛОКАТОРОВ nAChRs И Са2+-КАНАЛОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск в ядах змей соединений, активных в отношении никотиновых рецепторов ацетилхолина и потенциал-активируемых кальциевых каналов"

Лиганд- и потенциал-управляемые ионные каналы играют ведущую роль в электрогенезе клеток, в том числе, в быстрой синаптической передаче сигнала в центральной и периферической нервной системе, регуляции освобождения нейротрансмиттеров, в формировании потенциала действия, быстром изменении внутриклеточной концентрации ионов,' запуске каскада биохимических реакций. Рецепторы и каналы участвуют в управлении всех функций организма, в когнитивной функции мозга, в формировании памятного следа, а нарушения их работы или экспрессии приводят к тяжелым нейродегенаратнвным заболеваниям.

Множественность подтипов рецепторов и каналов требует иметь в руках большой набор высокоактивных и избирательных агентов для исследования механизма отдельных этапов физиологических процессов и направленного вмешательства. Богатым источником высокоактивных антагонистов (и, реже, активаторов) являются яды змей, пауков, моллюсков, рыб. Яды змей представляют собой многокомпонентные смеси соединений в основном полипептидной природы, имеющие разные мишени в организме жертвы. Благодаря этому возможно одновременное поражение этих мишеней и быстрая смерть или обездвиживание. К настоящему времени наиболее подробно исследованы яды змей семейства Elapidae. В ядах крайтов, кобр и мамбы содержатся длинные а- нейротокенны, имеющие высокое сродство к никотиновым ацетилхолиновым рецепторам (nAChRs) мышц. С помощью одного из них - а-бунгаротоксина (а-ВТх) был помечен, выделен и подробно исследован nAChR электрического органа ската. Есть немногочисленные сведения о наличии в ядах элапид полипептидов, блокирующих потенциал-активируемые каналы. Из яда моллюсков рода Conus получены а- и со-конотоксины с высокой избирательностью к разным подтипам рецепторов и каналов, некоторые из которых вошли в фармакологическую практику.

Несмотря на наличие большого числа селективных пептидных и белковых токсинов, потребность в новых лигандах остается очень высокой. Такие соединения могут быть обнаружены в новых или мало изученных ядах. О нейроактивных пептидах из яда змей семейства Viperidae известно очень мало. Поиск в ядах этих змей компонентов, активных в отношении различных типов рецепторов и ионных каналов, представляется перспективным, так как в результате могут быть получены соединения с новыми фармакологическими свойствами, которые могут быть применены как для исследования каналов, так впоследствии и для практических медицинских целей.

Важно подобрать объект, на котором будет производиться поиск. Широкое распространение получил метод экспрессии лнганд- и потенциал-управляемых каналов, при котором точно известна мишень. Однако свойства экспрессированых рецепторов не всегда совпадают со свойствами нативных [Nicke et ai. 2004]. Причины могут заключаться в неправильной сборке рецепторов (стехиометрия и последовательность субъединиц), в альтернативном сплайсинге генов, редактировании РНК, отличиях посттрансляционной модификации рецепторов при экспрессии. Поэтому важно дополнительно испытывать вещества па нативных рецепторах.

В нейронах прудовика Lymnaea stagnalis экспрессируются nAChRs и потенциал-управляемые ионные каналы (кальциевые, калиевые, натриевые). Известно, что nAChRs и Са -каналы нейронов прудовика по многим свойствам сходны с аналогичными структурами нейронов позвоночных. Поэтому нейроны прудовика могут использоваться для предварительного поиска соединений, активных на эшх мишенях, к тому же они более доступны по сравнению с нервными клетками млекопитающих.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Горбачева, Елена Владимировна

выводы

1. Показано, что идентифицированные нейроны из париетальных ганглиев

Lymnaea stagnalis содержат анион-проводящие nAChRs, по фармакологическому

2+ профилю сходные с а7 подтипом nAChRs позвоночных, и потенциал-активируемые Са каналы. Поэтому они могут использоваться для поиска новых соедииений, избирательных в отношении этих мишеней.

2. Обнаружена способность цельных ядов змей семейства Viperidae блокировать а7 подобные nAChRs и потенциал-активируемые Са2+-каналы, а также способность яда кобры (семейство Elapidae) блокировать последние.

3. Проведен анализ активности 69 фракций, полученных в результате разделения ядов пяти видов змей с использованием различных видов жидкостной хроматографии. Выявлено 16 фракций яда гадюк, обладающих наибольшей способностью блокировать nAChRs и/или Са -каналы. Показано, что яд кобры содержит одну фракцию, активную в отношении

Са2+ -каналов.

4. Выявлена избирательность трех фракций яда гадюк в отношении а7

9+ подобных nAChRs и трех фракций в отношении потенциал-активируемых Са -каналов.

5. В яде африканской гадюки впервые идентифицированы две группы полипептидов, одни из которых хорошо и избирательно блокируют al подобные nAChRs, а другие - избирательно блокируют потенциал-активируемые Са2+-каналы.

6. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования ядов змей семейства Viperidae с целью получения новых нейроактивных соединений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов мы установили, что в идентифицированных нейронах двух париетальных ганглиев L. stagnalis экспрсссируются nAChRs, однородные п<э ионному механизму ответа на ACh. Все эти рецепторы управляют хлорной проводимостью, как было показано ранее для нендентифицированных нейронов прудовика (Кислов, Казаченко, 1974). Подтверждено и дополнено новыми данными предположение о сходстве этих nAChRs с al подтипом nAChRs нейронов позвоночных. В частности, показано: (1) ответ на ACh подавляется а-кобратоксином, избирательным антагонистом nAChRs мышечного типа и нейронных гомоолигомерных nAChRs позвоночных, но не а-конотоксинами GI, MI, SIA — блокаторами мышечных nAChRs; (2) ток, вызванный ацегилхолином или другими агонистами nAChRs, подавляется низкими концентрациями а-конотоксина Iml, избирательного антагониста' а7 и, по некоторым данным, аЗр2 nAChRs, но не а-конотоксином МП, высоко избирательным антагонистом аЗр2/а6 рецепторов; (3) nAChRs прудовика отличаются от другого гомоолигомерного nAChR позвоночных, а9, по отсутствию чувствительности к а-конотоксину Vc I.I. и по высокой эффективности агонистов цитизина и никотина; (4) холин, полный агонист al nAChRs, но очень слабый частичный агонист всех гетеромерных nACliRs позвоночных, является полным агонистом nAChRs прудовика; (5) стрихнин, антагонист рецепторов глицина и гомоолигомсрных nAChRs позвоночных, блокирует nAChRs прудовика. На этом основании мы пришли к заключению, что идентифицированные нейроны прудовика могут быть использованы в качестве тест-объекта для скрининга соединений, активных по отношению к al типу nAChRs.

Поскольку все нейроны прудовика генерируют входящий Са2+ ток в ответ на сдвиг потенциала в сторону деполяризации, эти нейроны могут быть также параллельно использованы для поиска блокаторов соответствующих каналов.

В результате испытания цельных ядов семи видов змей впервые обнаружена способность этих ядов блокировать al подобные nAChRs и потенциал-активируемые Са каналы. Проведено исследование активности фракций, полученных в результате разделения ядов пяти видов змей с использованием различных видов хроматографии. В целом, проведен анализ 69 различных фракций. При этим обнаружены фракции, обладающие наибольшей активностью и избирательностью по отношению к nAChRs и потенциал-акгивируемым Са -каналам. Наиболее избирательными по отношению к nAChRs оказались высокомолекулярные фракции яда африканской гадюки и гадюки Никольского. В отношении потенциал-активируемых Са -каналов избирательными оказались низкомолекулярные фракции ядов тех же змей. Таким образом, в ядах змей семейства Viperidae впервые обнаружены активные избирательные блокаторы al-подобных nAChRs и потенциал-активируемых

Са2+

-каналов, а в яде кобры (сем.

Elapidae) - блокатор(ы) Са2+-каналов. В дальнейшем предстоит уточнить тип(ы) 2+ потенциал-активируемых Са -каналов, чувствительных к наиденным соединениям и выяснить структуру полипептидов, проявляющих обнаруженные виды активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горбачева, Елена Владимировна, Пущино

1. Вульфиус Е.А., Зеймаль Э.В. // Характеристика холинорецепторов гигантских нервных клеток брюхоногих моллюсков // В кн.: Синаптические процессы. Киев, Наукова Думка 1967, стр. 121-135

2. Катц Б. // Нерв, мышца, синапс // Москва, Мир, 1968, стр. 59-91

3. Кислов А.Н., Казаченко В.II. // Ионные токи активированной холинорецептивной мембраны изолированных гигантских нейронов прудовика // В сб.: Биофизика живой клегки Пущино, 1974, 4: 39-44

4. Костюк П.Г., Крышталь О.А. Цыдренко А.Я. // Разделение натриевых и кальциевых каналов в поверхностной мембране нервных клеток моллюсков // Нейрофизиология 1976,8: 183-191

5. Крышталь О.А., Пидопличко В.И. // Внутриклеточная перфузия гигантских нейронов улитки // Нейрофизиология 1975, 7: 327-329

6. Пономарев В.Н., Нарушевичус Э.В., Чемерис Н.К. // Блокирующее действие ионов никеля, кобальта, марганца, и магния на величину входящего тока через кальциевые каналы нейронов прудовика Lymnaea stagnalis II Нейрофизиология 1980, 12: 211-213

7. Скок В.И., Селянко А.А., Деркач В.А., // Нейрональные холинорецепторы // Москва, Наука, 1987

8. Скок М.В. // Н1котинов1 рецептори нейронного типу: будова i функцп у клггинах р1зного похождения // Укр. 6ioxiM. ж. 2004, 76: 5-15

9. Ahlijanian М.К., Wcstenbroek R.E., Catterall W.A. // Subunit structure and localization of dihydropyridine-sensitive calcium channels in mammalian brain, spinal cord, and retina //Neuron 1990, 4: 819-832

10. Alkondon M., Albuquerque E.X. // Diversity of nicotinic acetylcholine receptors in rat hippocampal neurons. I Pharmacological and functional evidence for distinct structural subtypes // J. Pharmacol Exp Ther. 1993, 265: 1455-1473

11. Alkondon M., Pereira E.F.R., Cortes W.S., Maelicke A., Albuquerque E.X. // Choline is a selective agonist of al nicotinic acetylcholine receptors in rat brain neurons // Eur. J. Neurosci. 1997, 9: 2734-2742

12. Andreev A.A., Veprintsev B.N., Vulfius C.A. // Two-component desensitization of nicotinic receptors induced by acetylcholine agonists in Lymnaea stagnalis neurones // J. Physiol. 1984, 353: 375-391

13. Arias H.R. // Topology of ligand binding sites on the nicotinic acetylcholine receptor // Brain Research Reviews. 1997, 25:133-191

14. Ascher P. and Nowak L. // The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture // J. Physiol. 1988, 399: 247-266

15. Barnard E.A. // Receptor classesand the transmitter-gated ion channels //Trends in Biochem. Sci. 1992, 17: 368-374

16. Bean B.P. // Classes of calcium channels in vertebrate cells // Annu. Rev. Physiol. 1989a, 5k 367-384

17. Bean B.P. // Neurotransmitter inhibition of neuronal calcium currents by changes in channel voltage dependence //Nature 1989b, 340: 153-156

18. Bertrand D., Ballivet M., Rungger D. // Activation and blocking of neuronal nicotinic acetylcholine receptor reconstituted in Xenopus oocytes // Proc Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87: 1993-1997

19. Bertrand D., Bertrand S., Ballivet M. // Pharmacological properties of the homomeric al receptor//Neurosci. Lett. 1992,146: 87-90

20. Buisson В., Gopalakrishnan M., Arneric S.P., Sullivan J.P., Bertrand D. // Human a4p2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor in HEK 293 cells: a patch-clamp study // J. Neurosci 1996, 16: 7880-7891

21. Carbone W., Lux H.D. // A low voltage-activated, fully inactivating Ca channel in vertebrate sensory neurones //Nature 1984, 310: 501-502

22. Cartier G.E., Yoshikami D., Gray W.R., Luo S., Olivera B.M. and Mcintosh J.M., // A new a-conotoxin which targets a3|32 nicotinic acetylcholine receptors // J.Biol.Chem. 1996,271: 7522-7528

23. Castro N.G. and Albuquerque E.X. // а-Bungarotoxin-sensitive hippocampal nicotinic receptor channel has a high calcium permeability // Biophys. J. 1995, 68: 516-524

24. Catterall W.A. // Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2002, 16: 521-555

25. Celie P.H.N., van Rossum-Fikkert S.E., van Dijk W.J. Brejc K., Smit A.B., Sixma Т.К. // Nicotine and carbamylcholine binding to nicotinic acetylcholine receptors as studied in AChBP crystal structures //Neuron 2004, 41: 907-914

26. Celie P.H.N., Kasheverov I.E., Mordvintsev D.Y., et.al. // The AChBP — a-conotoxin structure: toward receptor-selective ligands for nicotinic receptors // Nature, Structural and Molecular Biology 2005, 12: 582-588

27. Chang F.C., Hosey M.M. // Dihydropyridine and phenylalkylamine receptors associated with cardiac and skeletal muscle calcium channels are structurally different // J. Biol. Chem. 1988,263: 18929-37

28. Chemeris N.K. Bocharova L.S., Geletyuk V.I. // Trypsin-induced masking of tetrodotoxin receptor of the sodium channels in mollusk neurons // Bioehimica et Biophysica Acta. 1980, 599: 731-735

29. Chemeris N.K., Kazachenko V.N., Kislov A.N., Kurchikov A.L. // Inhibition of acetylcholine responses by intracellular calcium in Lymnaea stagnalis neurones // J. Physiol 1982,323: 1-19

30. Curtis B.M., Catterall W.A. // Phosphorylation of the calcium antagonist receptor of the voltage-sensitive calcium channel by cAMPdependent protein kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82: 2528-32

31. Curtis B.M., Catterall W.A. // Purification of the calcium antagonist receptor of the voltage-sensitive calcium channel from skeletal muscle transverse tubules // Biochemistry 1984, 23: 2113-18

32. De Jongh K.S., Merrick D.K., Catterall W.A. // Subunits of purified calcium channel: a 212-kDa form of al and partial amino acid sequence of a phosphorylation site of an independent p subunit//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86: 8585-89

33. De Jongh K.S., Warner C., Catterall W.A. // Subunits of purified calcium channels. a2 and 5 are encoded by the same gene // J. Biol. Chem. 1990, 265: 14738^11

34. De Weille J.R., Schweitz H., Maes P., Tartar A., Lazdunski M. // Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, M: 2437-2440

35. Di Virgilio F and Solini A. // P2 receptors: new potential players in atherosclerosis // Br J Pharmacol 2002, \35: 831-8421. OA

36. Doorty K.B., Bevan S., Wadsworth J.D.F., Strong P.N. // A novel small conductance Caiactivated K+ channel blocker from Oxyuranus scutellatus Taipan venom // J. Biol. Chem. 1997.272: 19925-19930

37. Dubel S.J., StaiT T.V., Hell J.B., Ahlijanian M.K., Enyeart J.J., et al. // Molecular cloning of the al subunit of an co-conotoxin-sensitive calcium channel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89; 5058-62

38. Elgoyhen A.B., Johnson D.S., Boulter J., Vetter D.E., Heinemann S. // a9: An acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells // Cell 1994, 79: 705-715

39. Elgoyhen А.В., Vetter D.E., Katz E., Rothlin C.V., Heinemann S.F., Boulter J. // alO: A determinant of nicotinic cholinergic receptor function in mammalian vestibular and cochlear mechanosensory hair cells // Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98; 3501-6

40. Ellis S.B., Williams M.E., Ways N.R., Brenner R., Sharp A.H., et al. // Sequence and expression of mRNAs encoding the al and a28 subunits of a DHP-sensitive calcium channel // Science 1988, 241: 1661-64

41. Ellison M, Mcintosh JM, Olivera BM. // Alpha-conotoxins Iml and Imll. Similar alinicotinic receptor antagonists act at different sites // J Biol Chem. 2003, 278: 757-64

42. Galzi J-L., Devillers-Thiery A., Hussy N., Bertrand S., Changeux J-P., Bertrand D. // Mutations in the channel domain of a neuronal nicotinic receptor convert ion selectivity from cationic to anionic // Nature 1992, 359: 500-505

43. Gakhova E.N., Zherelova O.M., Kislov'A.N., Krasts I.V., Chemeris N.K. and Veprinsev B.N. // Isolated neurons in nudibranchia mollusk: kinetics of Ca and Na currents upon action potential generation // Сотр. Biochem. Physiol 1979, 64A: 313-316

44. Gerzanich V., Anand R., Lindstrom J. // Homomers of a8 and al subunits of nicotinic receptors exhibit similar channel but contrasting binding site properties // Mol. Pharmacol. 1994, 45:212-220

45. Gotti C., Moretti M., Gaimarri A., Zanardi A., Clementi F., Zoli M., // Heterogeneity and of complexity native brain nicotinic receptors // Biochemical Pharmacology 2007, 74: 1102-1111

46. Gray R., Rajan A.S., Radcliffe K.A., Yakehiro M., Dani J.A. // Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine //Nature 1996, 383: 713-716

47. Hamilton S.L., Yatani A., Hawkes M.J., Redding K., Brown A.M. // Atrotoxin: a specific agonist for calcium currents in heart // Science 1985, 229: 182-184

48. Hansen S.B., Talley T.T., Radio Z., Taylor P. // Structural and ligand recognition characteristics of an acetylcholine-binding protein from Aplysia californica // J.Biol.Chem. 2004, 279: 24197-24202

49. Hess P., Lansman J.B., Tsien R.W. // Differential modes of Ca channel gating behaviour favoured by dihydropyridine Ca agonists and antagonists // Nature 1984, 311: 538-44

50. Janes R. // a-Conotoxins as selective probes for nicotinic acetylcholine receptor subclasses // Current Opinion in Pharmacology 2005, 5: 280-292

51. Jay S.D., Ellis S.B., McCue A.F., Williams M.E., Vedvick T.S., et al. // Primary structure of the gamma subunit of the DHP-sensitive calcium channel from skeletal muscle // Science 1990,248: 490-92

52. Jerelova O.M., Krasts I.V., Veprintsev B.N. // The effect of sodium, calcium and magnesium on the amplitude of the action potential from giant neurons of Limnaea stagnalis//Сотр. Biochem. Physiol. 1971. 40A: 281-293

53. Johnson D.S., Martinez J., Elgoyhen A.B., Heinemann S.F., Mcintosh J.M. // a-Conotoxin Iml exhibits subtype-specific nicotinic acetylcholine receptor blockade: preferential inhibition of homomeric al and a9 receptors // Mol. Pharmacol. 1995, 48: 194-199

54. Karlin A. and Akabas M.H. // Toward a structural basis for the function of nicotinic acetylcholine receptors and their cousins // Neuron 1995, j5: 1231-1244

55. Karlin A. // Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors // Nature 2002, 3i 102-114

56. Kazachenko V.N., Kislov A.N., Veprintsev B.N. //Cholinoreceptive membrane inactivation caused by depolarization of Lymnaea stagnalis neurones // Сотр. Biochem. Physiol. 1979, 63C: 61-66

57. Kehoe JS. // Ionic mechanisms of a two-component cholinergic inhibition in Aplysia neurons // J. Physiol (Lond) 1972 a, 225: 85-114

58. Kehoe JS. // Three acetylcholine receptors in Aplysia neurons // J. Physiol (Lond) 1972 b, 225: 115-146

59. Kehoe JS., Mcintosh J.M. // Two distinct nicotinic receptors, one pharmacologically similar to the vertebrate a7-containing receptor, mediate CI currents in Aplysia neurons // J. Neurosci. 1998,18:8198-8213

60. Kehoe JS., Sealock R., Bon C. // Effects of a-toxins from Bungarus multicinctus and Bungarus caeruleus on cholinergic responses in Aplysia neurones // Brain Res. 1976, 107: 527-540

61. Khiroug S.S., Harkness P.C., Lamb P.W., Sudwccks S.N., Khiroug L., Millar N.S., Yakel J.L. // Rat nicotinic ACh receptor a7 and P2 subunits co-assemble to form functional heteromeric nicotinic receptor channels // J. Physiol. (London) 2002, 540: 425-434

62. Magoski N.S., Syed N.I., Bulloch A.G.M. // A neuronal network from the mollusc Lymnaea stagnalis // Brain Res. 1994, 645: 201-214

63. Martin-Moutot N., Charvin N., Leveque C., Sato K., Nishi Т., et al. // Interaction of SNARE complexes with P/Q-type calcium channels in rat cerebellar synaptosomes // J. Biol. Chem. 1996. 271: 6567-70

64. McArdle J.J, Lentz T.L., Witzemann V., Schwarz H., Weinstein S.A., Schmidt J.J., Waglerin-1 selectively blocks the epsilon form of the muscle nicotinic acetylcholine receptor // J Pharmacol. Exp. Ther. 1999, 289: 543-50

65. McEnery M.W., Snowman A.M., Sharp A.H., Adams M.E., Snyder S.H. // Purified co-conotoxin GVIA receptor of rat brain resembles a dihydropyridine-sensitive L-type calcium channel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, M: 11095-99

66. Mcintosh J.M., Azam L., Staheli S., Dowell C.,. Lindstrom J.M, Kuryatov A., Garrett J.E., Marks M.J., and Whiteaker P.// Analogs of a-Conotoxin Mil are selective for a6-containing nicotinic acetylcholine receptors // Mol. Pharmacol. 2004, 65: 944-952

67. Miljanicr G.P. // Ziconitide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronicpain// Curr. Med. Chem. 2004, П: 3029-3040f

68. Mikami A., Imoto K., Tanabe Т., Niidome Т., Mori Y., et al. // Primary structure and functional expression of the cardiac dihydropyridine-sensitive calcium channel // Nature 1989, 340: 230-33

69. Millar N.S. // Assembly and subunit diversity of nicotinic acetylcholine receptors // Bioch. Soc. Trans. 2003, 31: 869-874

70. Mori Y., Friedrich Т., Kim M-S., Mikami A., Nakai J., et al. // Primary structure and functional expression from complementary DNA of a brain calcium channel // Nature 1991,350: 398-402

71. Mourier G., Servent D., Zinn-Justin and S. Menez A. // Chemical engineering of a three-fingered toxin with anti-a7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor activity // Protein Engineering2000,13: 217-225

72. Nirthanan S. Gwee M. // Three-finger neurotoxins and the nicotinic acetylcholine receptor, forty years on // J. Pharmacol. Sci. 2004, 94: 1-17

73. Nowycky M.C., Fox A.P., Tsien R.W. // Three types of neuronal calcium channel with different calcium agonist sensitivity // Nature 1985, 316: 440-43

74. Olale F., Gerzanich V., Kuryatov A., et.al. // Chronic nicotine exposure differentially affects the function of human аЗ, а4, and а7 neuronal nicotinic receptor subtypes // J Pharmacol Exp Ther. 1997, 283: 675-683

75. Olivera, BM, WR Gray, R Zeikus, JM Mcintosh, J Varga, J Rivier, V De Santos, and LJ Cruz //Peptide neurotoxins from fish-hunting conc snails // Science 1985,230: 1338-1343

76. Ortells M. О and Lunt G.G. // Evolutionary history of the ligand-gated ion-channel superfamily of receptors // TINS 1995, 18: 121-127

77. Papke R.L., Bencherif М., Lippiello P. // An evaluation of neuronal nicotinic acetylcholine receptor activation by quaternary nitrogen compounds indicates that choline is selective for the al subtype //Neurosci. Lett. 1996, 2ЛЗ\201-204

78. Papke R.L. Heinemann S.F. // Partial agonist properties of cytisine on neuronal nicotinic receptors containing the |32 subunit//Mol. Pharmacol. 1994, 45: 142-149

79. Pereira E.F., Alkondon M., Mcintosh J.M., Albuquerque E.X. // a-Conotoxin-Iml: а competitive antagonist at a-bungarotoxin-sensitive neuronal nicotinic receptors in hippocampal neurons // J Pharmacol Exp Ther. 1996, 278: 1472-1483

80. Perez-Reyes E., Kim H.S., Lacerda A.E., Home W., Wei X.Y., et al. // Induction of calcium currents by the expression of the alpha 1-subunit of the dihydropyridine receptor from skeletal muscle // Nature 1989, 340: 233-36

81. Reuter H. // The dependence of slow inward current in Purkinje fibres on the extracellular calcium-concentration // J. Physiol. 1967, 192: 479- 92

82. Reuter H. // Properties of two inward membrane currents in the heart // Annu. Rev. Physiol. 1979,41: 413-24

83. Role L.W., Berg D.K. // Nicotinic receptors in the development and modulation of CNS synapses//Neuron 1996,16: 1077-1085

84. Rossetto O., Morbiato L., Caccin P., Rigoni M., Montecucco C. Presynaptic enzymatic neurotoxins // J. Neurochem. 2006, 97: 1534-1545

85. Rothlin C.V., Katz E., Verbitsky M., Elgoyhen A.B. // The a9 nicotinic acetylcholine receptor shares pharmacological properties with type A y-aminobutyric acid, glycine, and type 3 serotonin receptors // Mol. Pharmacol. 1999, 55: 248-254

86. Ruth P., Rohrkasten A., Bicl M., Bosse E., Regulla S., et al. // Primary structure of the beta subunit of the DHP-sensitive calcium channel from skeletal muscle // Science 1989, 245: 1115- 18

87. Sargent P.B. // The diversity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors // Annu. Rev. Neurosci. 1993,16:403-443

88. Sather W.A., Tanabe Т., Zhang J-F., Mori Y., Adams M.E., et al. // Distinctive biophysical and pharmacological properties of class A (BI) calcium channel ai subunits // Neuron 1993,Ц: 291-303

89. Schmidt J.J., Weinstein S.A., Smith L.A. Molecular properties and structure-function relationships of lethal peptides from venom of Wagler's pit viper, Trimeresurus wagleri // Toxicon. 1992,30: 1027-1036

90. Servent D., Winckler-Dietrich V., Hu H.Y., Kessler P., Drevet P., Bertrand D., Menez A. // Only snake curaremimetic toxins with a fifth disulfide bond have high affinity for the neuronal al nicotinic receptor // J. Biol. Chem. 1997, 272: 24279-24286

91. Sine S.M. and Engel A.G. // Recent advances in Cys-loop receptor structure and function // Nature 2006, 440: 448-455

92. Singer D., Biel M., Lotan I., Flockerzi V., Hofmann F., et al. // The roles of the subunits in the function of the calcium channel // Science 1991. 253: 1553-57

93. Snutch T.P., Tomlinson W.J., Leonard J.P., Gilbert M.M. // Distinct calcium channels are generated by alternative splicing and are differentially expressed in the mammalian CNS. //Neuron 1991,7: 45-57

94. Spafford J.D., Munno D.W., vanNierop P., Feng Z.P., Jarvis S.E., Gallin W.J., Smit A.B.,

95. Zamponi G.W., Syed N.I. // Calcium channel structural determinants of synapticitransmission between identified invertebrate neurons // J. Biol. Chem. 2003, 278: 42584267

96. Stea A., Tomlinson W.J., Soong T.W., Bourinet E., Dubel S.J., et al. // The localization and functional properties of a rat brain сцд calcium channel reflect similarities to neuronal Q- and P-type channels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 9L 10576-80

97. Takahashi M., Seagar M.J., Jones J.F., Reber B.F., Catterall W.A. // Subunit structure of dihydropyridine-sensitive calcium channels from skeletal muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84: 5478-82

98. Tanabe Т., Takeshima H., Mikami A., Flockerzi V., Takahashi H., et al. // Primary structure of the receptor for calcium channel blockers from skeletal muscle // Nature 1987, 328: 313-18

99. Tauc L., Gerschenfeld H. //A cholinergic mechanism of inhibitory synaptic transmission in a molluscan nervous system // J. Neurophysiol. 1962, 25: 236-262

100. Tsetlin V. // Snake venom a-neurotoxins and other 'three-finger' proteins // Eur. J. Biochem. 1999, 264: 281-286

101. Tsetlin V.I., Hucho F. // Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications // FEBS Lett. 2004, 557: 9-13

102. Tsien R.W., Lipscombe D., Madison D.V., Bley K.R., Fox A.P. // Multiple types of neuronal calcium channels and their selective modulation // Trends Neurosci. 1988, 11: 431-38

103. Unwin N. // Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4 A ° resolution // J Mol Biol. 2003,46: 967-989

104. Vazquez R.W., Oswald R.E. // Identification of a new amino acid residue capable of modulating agonist efficacy at the homomeric nicotinic acetylcholine receptor, a7 II Mol. Pharmacol. 1999,55: 1-7

105. Vulfius C.A., Krasts I.V., Utkin Yu.N., Tsetlin V.I. // Nicotinic receptors in Lymnaea stagnalis neurons are blocked by a-neurotoxins from cobra venoms // Neurosci. Lett. 2001,309: 189-192

106. Vulfius C.A., Tumina O.B., Kasheverov I.E., Utkin Yu.N., Tsetlin V.I. // Diversity of nicotinic receptors mediating СГ current in Lymnaea neurons distinguished with specific agonists and antagonist // Neurosci. Lett. 2005, 373: 232-236

107. Watanabe T.X., Itahara Y., Kuroda H., Chen Y.N., Kimura Т., Sakakibara S. Smooth muscle relaxing and hypotensive activities of synthetic calciseptine and the homologous snake venom peptide FS2. // Jpn. J. Pharmacol. 1995, 68: 305-313

108. Witcher D.R., De Waard M., Sakamoto J., Franzini-Armstrong C., Pragnell M., et al. // Subunit identification and reconstitution of the N-type Ca2+ channel complex purified from brain // Science 1993, 261: 486-89

109. Yamazaki Y., Koike H., Sugiyama Y., Motoyoshi K., Wada Т., Hishinuma S., Mita M., Morita T. Cloning and characterization of novel snake venom proteins that block smoothmuscle contraction // Eur. J. Biochem. 2002, 269: 2708-2715

110. Yamazaki Y. and Morita T. Structure and function of snake venom cysteine-rich secretory proteins // Toxicon 2004, 44: 227-231

111. Yang S.N., Larsson O., Branstrom R., Bertorello A.M., Leibiger В., et al. // Syntaxin 1 interacts with the L-D subtype of voltage-gated Ca2+ channels in pancreatic beta cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 10164-69

112. Zeimal E.V. and Vulfius E.A. // The action of cholinomimetics and cholinolytics on the Gastropod neurons //Neurobiology of invertebrates 1968, Budapest, Academiai kiado, P. 255-265t

113. Zhang Z-w. Vijayaraghavan S., Berg D.K. // Neuronal acetylcholine receptors that bind a-bungarotoxin with high affinity function as ligand-gated ion channels // Neuron 1994, 12: 167-177

114. СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙа.о. — аминокислотный остаток

115. ВАХ — вольт-амперная характерстика

116. ЦНС ■— центральная нервная системаэдс — электродвижущая сила1. ACh — ацетилхолин

117. AChBP — ацетилхолин-связывающий белока-ВТх — а-бунгаротоксин нейротоксин из яда змеи полосатый крайт,

118. Bungarus multicinctus Choi — холин Cyt — цитизин SbCh — суберилдихолин Str — стрихнин

119. DMPP — диметилфенилпиперазин

120. ECso— концентрация агониста, способная вызывать ток, равный половине отамплитуды максимального ответа GABA — гамма-аминомасляная кислота GIu — глутаматI

121. Gly — глицин 5НТ — серотонин1ша\ — амплигуда тока в момент пика1С5о— концентрация антагониста, уменьшающая в два раза ответ на агонист1.l, Imll — а-конотоксиньг из морского моллюска Conus imperialis

122. MI, МП, GI, PnIA — а-конотоксины из Com/s magus, С. geographus, С. permaceus,соответственно MLA — метилликаконитин nAChR — никотиновый рецептор ацетилхолина Nic — никотин

123. NMDA — N-MeTHJi-D-acnapraT

124. NMDG+— N-метил-О-глюкозамин (N-methyl-D-glucamine)

125. NTH, a-CTx, WTx —альфа-нейротоксины из из яда кобр Naja oxiana и N. kaouthia (соответственно: короткий, длинный и слабый)

126. D12K.SIA, AlOLjPnIA, [A10L,D14K]PnIA — мутанты соответствующих а-коногоксинов Pca,PNa— проницаемость для Са2+, Na+ Rin) Rout—- внутриклеточный и наружный раствор. Rs— рецепторы

127. Vh — поддерживаемый потенциал