Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск модуляторов активности шаперона Hsp70 и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы при помощи методов молекулярного моделирования

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поиск модуляторов активности шаперона Hsp70 и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы при помощи методов молекулярного моделирования"

11-2 3025

На правах рукописи

Черноризов Кирилл Александрович

Поиск модуляторов активпости шаперона №р70 и глицеральдегнд-3-фосфат дегидрогеназы при помощи методов молекулярного моделирования

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА -2011 г.

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты:

Научный руководитель:

д.х.н., профессор Швядас В.К. д.х.н., профессор Курочкин И.Н. д.б.н., профессор Долгих Д.А.

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится « -^ » апреля 2011 г. в 1500 часов на заседании диссертационного

совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической эшимологии, ауд.202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова-

Автореферат разослан « _» марта 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

/

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Поиск лекарственных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с агрегацией нейрональных белков, является одной из актуальных проблем медицины и фармакологии. Перспективными мишенями для создания новых лекарственных препаратов являются белки теплового шока (шапероны), которые способны предотвращать агрегацию разворачивающихся белков и помогать им сворачиваться в нативные конформации, а также глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (ГАФД) - один из важнейших ферментов гликолиза. Нзр70 является ключевым белком в функционировании шаперонного механизма клетки. Модуляция его функционирования в нейронах представляет собой перспективный путь терапии таких заболеваний как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа активно исследуется в связи с поиском лекарственных препаратов против заболеваний, ассоциированных с агрегацией белков, обладающих полиглутаминовыми хвостами (болезнь Хантингтона, спинобульбулярная мышечная атрофия и др.). Большие возможности при поиске путей модуляции активности Нэр70 и ГАФД, а также детальном исследовании трехмерных структур белков и их взаимодействия с ингибиторами представляют методы молекулярного моделирования, эффективность которых в последнее время существенно увеличилась в связи с развитием суперкомпьютерных технологий.

Цели и задачи исследования

• построение и исследование трехмерных структур белков Нзр70 и ГАФД;

• изучение функционирования исследуемых белков с использованием предложенных моделей;

• разработка стратегии модулирования активности Нзр70 и ГАФД;

• ш зШсо поиск лигандов, способных модулировать функционирование исследуемых белков.

Научная новизна Впервые создана и изучена модель полноразмерной трехмерной структуры Нзр70 человека, при помощи молекулярного моделирования исследован механизм взаимодействия его АТФазного и субстрат-связывающего доменов. Предложена стратегия модуляции активности шаперона путем ингибирования связывания комплекса Н5р70:АДФ:Субстрат с фактором нуклеотидного обмена, предложены два участка для связывания ингибиторов, выявлены низкомолекулярные модуляторы, ингибирующие связывание фактора нуклеотидного обмена с комплексом Нзр70:АДФ:Субстрат. Обнаружены ингибиторы, способные образовать ковалентный комплекс с мышечной ГАФД человека, а также селективный ингибитор сперматозоидной ГАФД человека.

Практическая значимость Построенная модель Нзр70 человека может быть использована для дальнейшего изучения механизмов функционирования шаперона, а также для т $Шсо поиска модуляторов Нзр70. Предложенные модуляторы активности Нзр70 человека и найденные ковалентные ингибиторы ГАФД являются прототипами новых лекарственных препаратов.

Апробация работы Результаты работы были представлены на конференциях: «Ломоносов-2007» и «Ломоносов-2010», г. Москва. 2007 и 2010 гг.; Итоговых конференциях по

результатам выполнения мероприятий за 2008 и 2009 годы в рамках приоритетного направления «Живые Системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва. 2008 и 2009 гг.

Публикации По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ. и 4 тезиса конференций.

Объем и структура работы: Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора (2 главы), экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения (6 глав), выводов и списка используемой литературы, включающего 136 ссылок. Работа изложена на 117 страницах, содержит 60 рисунков, 10 таблиц.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Обзор литературы содержит общую информацию о шаперонах. детальное рассмотрение данных рентгеноструктурного анализа (РСА), описание строения шаперона Hsp70, цикла его функционирования и роли в клетке, анализ литературы о существующих фармакологических стратегиях модуляции активности шаперона. В литературном обзоре также собрана информация о строении и функциях глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФД), рассмотрены роль фермента в развитии апоптоза и иейродегенеративных заболеваний, основные стратегии модуляции активности фермента низкомолекулярными соединениями, проведен анализ данных РСА по структуре ГАФД.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для молекулярного моделирования использовали программы VMD 1.8.6. ChemSketch. сервис гомологического моделирования SvvissModel и пакет программ AmberTools 1.2. Симуляции молекулярной динамики и анализ молекулярнодинамических траекторий проводили в пакетах программ Gromacs 3.3.3 и Amber 10. При использовании Gromacs расчеты осуществляли в силовом поле OPLSAA, при использовании Amber - в поле Amber fP99SB. Д™ молекулярного докинга и скрининга баз данных низкомолекулярных соединений использовали программу Lead-Finder. Поиск потенциальных лидерных соединений методом виртуального скрининга проводили в библиотеках химических соединений VitasM-Laboratory (около 300000 соединений), BioPharmics LLC (1856 соединений) и DrugBank (4093 соединения).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск ингибитора взаимодействия Hsp70 с фактором нуклеотидного обмена

Hsp70 - двудоменный АТФ-зависимый белок из класса шаперонов. АТФазный домен, образованный субдоменами 1 и II, гидролизует АТФ, в то время как субстрат-связывающий домен (SBD), образованный альфа-спиральным (aSBD) и бета-листовым субдоменами (PSBD), связывает гидрофобные пептиды {Рис. /). В процессе функционирования АТФазный и субстрат-связывающий домены расходятся, оставаясь связанными лишь междоменным линкером.

Рис. 1. АТФазный домен Hsp70 человека (слева: pdb ID: IHJO) и SBD DnaK E.coli (справа; зеленым отмечен PSBD, желтым - aSBD, красным - субстратный пептид; pdb ID: JDKZ).

Находясь на поверхности клетки в комплексе с субстратным пептидом, Hsp70 способен активировать специфический иммунный ответ по отношению к клеткам, содержащим на своей поверхности представленный Hsp70 пептид. Данное свойство актуально в разработке стратегий противоопухолевой терапии: продлив время связывания Hsp70 с пептидами опухолевой клетки, можно усилить иммуногенный эффект внеклеточного Hsp70, а также улучшить эффективность вакцин типа Oncophage1. Комплекс Hsp70 с пептидом образуется после стадии гидролиза АТФ. его разрушение сопровождается присоединением фактора нуклеотидного обмена (NEF) к субдоменам IB и IIB АТФазного домена Hsp70 (Рис. /). Предложенная стратегия модуляции активности шаперона предполагает предотвращение взаимодействия комплекса Нзр70:АДФ:8 с NEF за счет связывания низкомолекулярного ингибитора с АТФазным доменом. Таким образом, цикл функционирования шаперона будет нарушен и субстратный пептид останется связанным в субстрат-связывающем домене.

Решение задачи проводили в четыре этапа:

1) Описание и анализ зоны взаимодействия Hsp70 с фактором нуклеотидного обмена. Анализ проводили на основании структуры 1НХ1, описывающей комплекс Hsp70 с Bag-доменом фактора нуклеотидного обмена Bag-1, с использованием метода симуляции молекулярной динамики. На основе проведенного исследования был сделан вывод о том, что взаимодействие Hsp70 и Bag-1 основывается на 5 солевых мостиках и 5 стабильных (т.е. существовавших на протяжении >50 % траектории) водородных связях;

2) Построение модели АТФазного домена Hsp70 человека. АТФазный домен является функциональным (т.е. осуществляет гидролиз АТФ в изолированном состоянии) и обладает стабильной пространственной структурой. На данный момент установлена трехмерная структура близкого гомолога Hsp70 человека - Hsc70 быка (PDB ID: 1YUW: Рис. I. слева).

1 Mazzaferro V, Сорра J, Carrabba MG, Rivoltini L, Schiavo M, et al Clin. Cancer Res. 2003;9(9):3235-3245.

Идентичность шаблона с моделируемой структурой составила 89.4%. На основании этой структуры было проведено моделирование АТФазного домена Hsp70 человека;

3) Выбор участков связывания модулятора с АТФазным доменом Hsp70 человека. На поверхности АТФазного домена были выбраны 2 участка для связывания потенциальных ингибиторов. Первый (участок А) находится в области субдомена IIB. Он состоит из а-спирали и элемента р-листа и включает в себя ключевые для взаимодействия с Bag-1 аминокислотные остатки, т.е. является потенциальным участком конкурентного ингибирования по отношению к фактору нуклеотидного обмена. Второй участок (участок В) находится на границе субдоменов IIB и ПА в «шарнирном» районе, конформация которого меняется при раздвижении створок АТФазного домена. Стратегия ингибирования на этом участке заключается в том, чтобы механически лишить створки АТФазного домена возможности раскрыться, заткнув полость, являющуюся «буфером» для движения субдомена IIB. Связываясь с участком В, ингибитор образования комплекса Hsp70 с Bag-1 не будет конкурировать с Bag-1 за место связывания.

4) Скрининг баз данных низкомолекулярных соединении. В процессе поиска ингибиторов взаимодействия Hsp70 с NEF с помощью программы Lead-Finder был проведен скрининг трех баз данных низкомолекулярных соединений: VitasM-Laboratory (около 300000 соединений) - найдено 17 потенциальных ингибиторов связывания Hsp70 с NEF, BioPharmics LLC (1856 соединений) и DrugBank (4093 соединения) - отобраны 3 соединения.

Экспериментальная проверка ингибирующей способности отобранных соединений проводилась в Институте Цитологии РАН (Санкт-Петербург). Предварительно подтверждено ингибирующее действие трех соединений из базы данных Vitas-M. Однако интерпретация экспериментальных результатов затруднена из-за недостатка знаний о структуре и функционировании Hsp70 человека, в частности, о пространственном взаимодействии АТФазного и субстрат-связывающего доменов. Для изучения междоменных взаимодействий требовалась полноразмерная структура Hsp70 человека.

Моделирование полноразмерной трехмерной структуры Hsp70

Полноразмерной трехмерной структуры Hsp70 в базе данных белковых структур (PDB) не обнаружено. В связи с этим была предпринята попытка создать максимально полную структуру Hsp70 человека (hHsp70) с помощью методов молекулярного моделирования.

Рис. 2. Схема построения модели //л-р 70 человека (см.текст). АТФазный домен обозначен синим цветом, аБВО - желтым, В О - зеленым.

Основываясь на первичной

последовательности человеческого Нзр70 и третичной структуре Нзс70 из организма быка (РОВ ГО: 1Уи\¥) была построена модель, описывающая АТФазный домен, (ЗБЕГО и а-спираль 'А' аБЕГО Нзр70 человека. Структура описывает контакт АТФазного домена с субстрат-связывающим доменом в состоянии, когда домены жестко сцеплены друг с другом. Идентичность сконструированной структуры и шаблона составила 88,6%. Для получения полноразмерной структуры требовалось достроить оставшуюся часть а8ВО. охватывающую а-спирали 'В', 'С', ГО". Она была построена по гомологии с аБВО нематоды СаепогНаЬсНИз elegans (РОВ ГО: 2Р32; Рис. 2). В активный центр итоговой модели добавляли молекулу АТФ для того, чтобы изучить стабильность структуры белка как со свободным, так и с занятым АТФазным доменом.

Модели свободного ЬН5р70 и его комплекса с АТФ изучали при помощи молекулярной динамики. Данные среднего квадратичного отклонения (ЯМБО) и визуальный анализ траектории показали. что построенная структура {Рис. 2) стабильна, в виду чего она была принята в качестве рабочей для дальнейшего изучения междоменных взаимодействий шаперона.

Изучение междоменных взаимодействии ЬШр70

В процессе функционирования исследуемого шаперона образующие его домены расходятся с разрывом всех нековалентных взаимодействий, в результате чего остаются связанными исключительно междоменным линкером. С помощью метода управляемой молекулярной динамики было проведено исследование расхождения доменов, выявившее ключевые для этого процесса солевые мостики и показавшее, что обратное сближение доменов не зависит от изменения конформации АТФазного домена. Исследование проводили на построенной в предыдущей части работы модели ИН5р70 со свободным АТФазным доменом.

Разрыв солевого мостика Argl71:GIu516.

По литературным данным (Jiang J. et al.~) расхождение доменов начинается с опосредованного кошапероном Hsp40 разрыва солевого мостика Arg 171 :Glu516, соединяющего а-спираль 'А" субстрат-связывающего домена с субдоменом IA АТФазного домена. Моделирование разрыва было проведено с помощью метода управляемой молекулярной динамики путем раздвижения Са-атомов вышеуказанных аминокислотных остатков с 12 А до 22 А.

Рис. 3. Перестройка солевых мостиков при расхождении доменов ННзрЮ. Красным отменен /?-лист, включающий С1и218 и петлю, фиксирующую АТФ (отмечена серым цветом).

Общая работа, затраченная на раздвижение указанных атомов, составила 34.3 ккал/моль. Примечательно, что после фактического разрыва солевого мостика Аг§171:С1и516 среднее расстояние между петлями АТФазного домена, фиксирующими (3- и у-фосфаты АТФ. сократилось на 2 А (с 8 А до 6 А; Рис. 3). Теоретически подобное движение в нативном ферменте может вызывать гидролиз АТФ. Можно предположить, что солевой мостик А^171:01и516 сдерживает А'ГФазный домен ЬНзр70 от спонтанного гидролиза АТФ. а кошаперон, разрывая мостик, инициирует гидролиз.

Поведение полученной структуры было изучено с помощью симуляции молекулярной динамики. Тенденций к восстановлению разорванной связи А^171:01и516, как и к дальнейшему расхождению доменов, при этом выявлено не было.

2 Jiang J.. Maes E.G.. Taylor A.B., Wang L„ Hinck A.P . et al. // Mol. Cell. 2007. 28(3). P. 422-433.

Разрыв солевого мостика Аг8416:С1и218

Разрыв мостика Аг§171:С1и516 привел лишь к частичному отделению доменов друг от друга, однако окончательного расхождения не произошло. В связи с этим предстояло выявить наиболее стабильные в процессе предыдущих молекулярнодинамических исследований нековалентные связи, разрыв которых мог бы привести к полному расхождению доменов ЬНзр70.

На основании аннотации и исследования междоменных контактов было сделано предположение о том. что ключевым для расхождения доменов взаимодействием остается солевой мостик Аг§416:01и218, соединяющий один из поворотов р-субдомена БВО с субдоменом ПА АТФазного домена. Имитация разрыва выбранного солевого мостика заключалась в увеличении расстояния между Са-атомами взаимодействующих аминокислотных остатков с 12.2 А до 22.2 А. Общая работа, затраченная на разрыв этого солевого мостика, составила 33.4 ккал/моль. Кривая, отображающая этот процесс (Рис. 4), свидетельствует, что для увеличения расстояния с 13.4 А до 14.7 А, связанного с разрывом взаимодействия, необходимо около 7 ккал/моль.

Разрыв солевого мостика И416-Е218

Рис. 4. Работа, затраченная на второй этап симуляции расхождения АТФазного и субстрат-связывающего доменов.

Именно такое количество энергии выделяется при разрыве макроэргической связи в АТФ. Так как 01и218 является частью Р-листа (Рис. 5), принимающего участие в фиксации Р- и у-фосфатов молекулы АТФ, можно предположить, что именно гидролиз АТФ инициирует разрыв солевого мостика Аг£416:01и218. р-лист является жесткой структурой и его опосредованное гидролизом АТФ смещение способно вызвать разрыв ключевого для расхождения доменов солевого мостика.

и

Рис. 5. Структура ИНяр70 после симуляции расхождения доменов. Красным отмечен /З-лист. движение которого сопровождается разрывом второго солевого мостика 01и218:Аг§416. Пунктиром обозначен образовавшийся после расхождения доменов солевой мостик <31и516:А^416.

Симуляция разрыва солевого мостика А^416:01и218 привела к полному расхождению доменов. В процессе моделирования этого процесса был выявлен интересный факт: освободившиеся при разрушении солевых мостиков остатки А^416 и С1и516 в процессе дальнейших исследований образовали друг с другом новый солевой мостик (Рис. 5). При этом аналогичный солевой мостик стерически возможен и для остатков А^171 и 01и218. Проведенное моделирование позволило сделать вывод о важной роли междоменных солевых мостиков А^171:01и516 и А^416:01и218 в функционировании Ш5р70. Они являются ключевыми для связывания АТФазного и субстрат-связывающего доменов, однако по мере расхождения доменов происходит перестройка партнеров, и образуются солевые мостики Аг§171 :С1и218 и А^416:01и516, которые стабилизируют новое структурное состояние шаперона.

Симуляция раздвижения субдоменов I и II

В процессе нуклеотидного обмена АТФазный и субстрат-связывающий домены сходятся обратно, однако силы, заставляющие их это сделать, достоверно неизвестны. Стохастический характер схождения доменов представляется маловероятным. Ввиду того, что нуклеотидный обмен проходит при разобщенных доменах и сопровождается взаимодействием АТФазного домена с фактором обмена нуклеотидов, естественно

предположить, что раздвижение субдоменов I и II фактором нуклеотидного обмена теоретически способно повлиять на схождение АТФазного и субстрат-связывающего доменов. Было проведено моделирование этого процесса. При симуляции раздвижения субдоменов I и II точками приложения силы являлись атомы азога основной цепи аминокислотных остатков ТЬг 14 и 01у203, которые непосредственно взаимодействуют с АТФ/АДФ. Исходное расстояние между ними составляло 7.3 А, конечное - 14.3 А. Моделирование показало, что изменение расстояния между субдоменами I и II не сказывается на взаимодействии доменов друг с другом, т.е. действие фактора нуклеотидного обмена на створки АТФазного домена не влияет на схождение доменов Нзр70.

На основании проведенного исследования предложена следующая схема функционирования ЬНзр70: при взаимодействии с ,1-доменом кошаперона Н5р40 происходит разрыв солевого мостика А^171 :С1и516, который приводит к сближению петель, фиксирующих молекулу АТФ, и способствует ее гидролизу. Гидролиз АТФ. в свою очередь, сопровождается смещением Р-листа, содержащего одну из петель, фиксировавших АТФ, и расположенного в области междоменного контакта остатка 01и218, что влечет за собой разрыв солевого мостика А^416:01и218. Разрыв солевого мостика А^416:01и218 приводит к расхождению АТФазного и субстрат-связывающего доменов, а остаток Аг§416 образует солевой мостик с остатком С1и516, относящимся к субстрат-связывающему домену. Остаток Агц171, в свою очередь, образует новый солевой мостик с Ои218, т.е. происходит перегруппировка солевых мостиков, ранее связывавших АТФазный и субстрат-связывающий домены ЬНзр70.

Построенная и уравновешенная модель Нзр70 человека представлена в депозитарии РМБВ 3 (РМБВ {&. РМ0076412).

Моделирование ГАФД с ковалентно моднцнфнрованным Су$149

Глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа (ГАФД, ЕС 1.2.1.12) - ЫАО'-зависимый фермент гликолиза, осуществляющий реакцию образования 1,3-дифосфоглицерата из глицеральдегид-3-фосфата. Фермент представляет собой гомотетрамер, состоящий из 1332 аминокислотных остатков (масса ~150кДа, Рис. 6). Активные центры ГАФД расположены между субъединицами и состоят из ЫАВ-связывающего участка, субстрат-связывающего участка и каталитического центра, ключевым аминокислотным остатком которого является Суз 149.

3 http://mi.caspur.it/PMDB/main.php

Рис. 6. Глобула ГАФД. Цветами отмечены 4 цепи фермента, алым - молекулы кофактора

NAD+.

ГАФД стабилизирует и доставляет проапоптотический белок Siahl в ядро. Ключевым для образования комплекса ГАФД^аЫ аминокислотным остатком является Cys 149. Ковалентная модификация цистеина может предотвратить связывание с Siahl и таким образом блокировать один из путей развития апоптоза (который наблюдается, в частности, при болезни Паркинсона). Основываясь на этом предположении, был проведен поиск низкомолекулярных ковалентных ингибиторов фермента.

Изучение ковалентных комплексов фермента с потенциальными ингибиторами проводили с помощью метода симуляции молекулярной динамики. Был предложен алгоритм моделирования ГАФД с ковалентно модифицированным Cysl49. При моделировании тиоэфирного интермедиата (в присутствии NADH и со свободным NAD-связывающим центром) особое внимание уделялось расположению фосфатных групп в Pj- и Р5-сайтах. Соответствие полученных данных о положении фосфатных групп субстрата в активном центре литературным данным позволило сделать вывод об адекватности предложенного алгоритма.

При проведении молекулярного моделирования была использована структура ГАФД из мышц человека (PDB ID: 1U8F; Рис. 6), при изучении действия ингибиторов на сперматозоидную ГАФД - модель химерного гетеротетрамера ГАФД, состоящего из трех субъединиц ГАФД E.coli и одной субъединицы сперматозоидной ГАФД крысы (PDB ID: 2VYN). Перед моделированием и проведением докинговых исследований обе структуры были уравновешены с помощью симуляции молекулярной динамики.

Конструирование и параметризация ГАФДс модифицированным Cysl49

Для конструирования модели ГАФД с ковалентно модифицированной SH-группой каталитического цистеина требовалось решить проблему отсутствия в силовом поле Amber ряда необходимых силовых параметров для связей, а также валентных и двугранных углов интересующих нас комплексов, и определить частичные заряды атомов соединений небелковой природы, «пришиваемых» к каталитическому цистеину.

Алгоритм моделирования:

1) Структуру ГАФД уравновешивали с помощью симуляции молекулярной динамики;

2) В уравновешенной структуре убирали водород с серы каталитического цистеина (Cysl49), изменяя тип аминокислотного остатка с CYS (протонированная форма цистеина основной белковой цепи) на CYX (форма цистеина основной белковой цепи с атомом серы, образующим ковалентную связь);

3) В программе ChemSketch минимизировали структуру ковалентно присоединяемого лиганда;

4) На основании полученной в п.З структуры с помощью программы antechamber (из пакета программ AmberTools) генерировали файл, содержащий частичные заряды, а также координаты и связность атомов лиганда. Расчет зарядов проводили в соответствии с силовым полем GAFF;

5) С помощью программы parmchk получали силовые и геометрические параметры для связей, а также валентных и двугранных углов исследуемой молекулы (файл модификаций силовых параметров);

6) Программа для расчета молекулярнодинамических траекторий Sander поддерживает и силовое поле Amber, и GAFF, однако типы атомов в них обозначаются по-разному. В случае работы с нековалентным комплексом типы атомов белка обозначаются в соответствии с силовым полем Amber, лиганд параметризуется в соответствии с GAFF, и в результате такая структура не вызывает ошибок при проведении молекулярнодинамических расчетов. Однако в случае ковалентного присоединения лиганда к белку происходит конфликт в описании связи, валентных и двугранных углов между белком и лигандом. Для решения этой задачи необходимо прописать параметры «гибридных» связей и углов, содержащих как типы атомов белка (описанные в формате силового поля Amber), так и лиганда (описанных в формате силового поля GAFF). Для решения этой проблемы, в ChemSketch создавали молекулу, структура которой полностью описывает ковалентную связь цистеина и ковалентно связанного с ним лиганда (в том числе валентные и двугранные углы, содержащие связь серы цистеина и соответствующего атома лиганда);

7) Для построенной промежуточной структуры получали frcmod-файл (см. п.4 и п.5), в котором типы атомов, относящиеся к цистеину белка, заменяли соответствующими обозначениями из Amber. Полученный гибридный frcmod-файл в дальнейшем подавался на вход программе для расчета молекулярной динамики;

8) Полученные комплексы уравновешивали с помощью метода симуляции молекулярной динамики.

Проверка алгоритма на модели тноэфнрного ннтермедната

В литературе предполагается (Moniot et al. 4), что при образовании тиоэфира в процессе замены восстановленного NADH на NADf фосфатная группа субстрата перемещается из Р,-сайта в Pj-сайт (Рис. 7). Это предположение было проверено при помощи молекулярного моделирования с использованием предложенного алгоритма. Молекулярная динамика комплекса тиоэфирного интермедиата в холоформе показала, что до выхода NADH из NAD-связывающего центра, фосфатная группа субстрата фиксируется остатками Arg231, Thr 179 и 2'-гидроксильной группой рибозы NADH, что соответствует Р5-сайту и согласуется с литературными данными. Затем из активного центра убрали NADH и наблюдали за подвижностью фосфатной группы: она заняла Ргсайт, образовав водородные связи с аминокислотными остатками Ser 148, Thr 150 и Thr208. что также согласуется с литературными данными. Полученные результаты свидетельствуют об адекватности использованного алгоритма моделирования.

Рис. 7. Тиоэфирный интпермедиат в свободном от кофактора активном центре. Фосфат

переместился в Рьсайт.

4 Moniot S. Bruno S, Vonrhein С, Didierjean С, Boschi-Muller S, et al. JBiol Chem. 2008;283(31 ):21693-702

Поиск ковалентных ингибиторов ГАФД in silico

Для выполнения задачи был проведен скрининг способности SH-соединений связываться в активном центре ГАФД в непосредственной близости от SH-группы каталитического цистеина. Критерием эффективности ингибитора считали расположение атома серы каталитического цистеина от серы лиганда на расстоянии, не превышающем 5Ä в 50% запусков нековалентного докинга. В результате проведенного скрининга были отобраны три соединения, потенциально способные ковалентно модифицировать каталитический цистеин фермента. Комплексы найденных веществ с ГАФД были изучены с помощью методов ковалентного докинга и симуляции молекулярной динамики. Ингибирующие свойства веществ, отобранных в результате исследования in silico, проверяли экспериментально.

Скрининг и докинг

В качестве мишени использовали активный центр мышечной ГАФД (1U8F) как в свободном состоянии, так и со связанным коферментом NAD". Скрининг потенциальных ковалентных ингибиторов фермента проводили в специально созданной базе данных низкомолекулярных SH-соединений, при скрининге отбирали соединения со свободной энергией связывания AG не превышающей -5 ккал/моль. Для отобранных кандидатов проводили детальный анализ структуры фермент-ингибиторных комплексов и расположения лиганда в участке связывания для оценки возможности образования дисульфидной связи. Для каждой структуры было проведено по 20 запусков нековалентного докинга как в свободный активный центр, так и в активный центр с кофактором {Рис. 8). После каждого запуска отбирали лидирующую позицию. На основании анализа 20 лидирующих позиций делали вывод о реакционноспособности и эффективности связывания каждого лиганда.

В результате расчетов были отобраны 3 SH-соединения: GSH (Ы-(фенилацетил)-глутатион), NAC (Ы-(феноксиацетил)-Ь-цистеин) иЫМС (Ы-((К)-манделил)-(8)-цистеин) (Таблица 1).

Рис. 8. Активный центр ГАФД. Слева изображена молекула кофактора NAD, справа расположен каталитический Cysl49.

Нековалентный докннг

Результаты расчетов нековалентного докинга представлены в Таблица 1.

Таблица /. Результаты расчетов нековалентного докинга потенциальных ингибиторов. Приведены средние значения по лидирующим позициям 20 запусков.

Ингибитор Структурная формула Форма фермента AG (ккал/моль)

GSH О , \-/-\ /)-NH 0 о \-' О О \-^ о'-1 О о Свободный активный центр -8

Комплекс ГАФД^АО -8

NAC HS О О" Свободный активный центр -7

Комплекс ГАФД^АО -6

NMC О V ^—Ч NH—( И НО О Свободный активный центр -6.5

Комплекс ГАФД^АО -6

Соединение GSH. Нековалентный докинг соединения в свободный активный центр показал, что в 50% запусков атом серы лиганда располагается на расстоянии менее 5А от серы каталитического цистеина, что соответствует критериям предреакционного состояния. Докинг исследуемого соединения в активный центр со связанным NAD показал низкую вероятность предреакционного расположения GSH (10% запусков). Размеров субстрат-связывающего участка в этом случае недостаточно для связывания такой крупной молекулы. Исследуемое соединение способно взаимодействовать лишь со свободным активным центром ГАФД, при этом частично конкурируя с NAD за место в активном центре.

Соединение NAC. По результатам нековалентного докинга в свободный активный центр фермента была выявлена одна четкая позиция связывания, в которой расстояние между атомами серы лиганда и Cysl49 превышает 5Ä. При докинге в активный центр с кофактором соединение NAC заняло предреакционное для образования цистеинового мостика положение в 60% запусков. Это позволило предположить, что NAC обладает высоким сродством к активному центру ГАФД в комплексе с кофактором, не конкурируя с ним за место связывания.

Соединение NMC. Результаты расчетов для NMC привлекли внимание тем, что это соединение обладало хоть небольшой, но равной вероятностью связаться в предреакционном положении как со свободным активным центром (25% запусков), так и в активном центре, занятом кофактором (25% запусков).

Ковалентный докинг и молекулярнодинамическое исследование

Для более детального изучения взаимодействия найденных веществ с ГАФД был использован метод ковалентного докинга как в свободный активный центр мышечной ГАФД, так и в активный центр с кофактором. Для комплексов ГАФД^АС и ГАФД^МС было проведено также молекулярнодинамическое исследование с целью уточнить расположение ковалентно связанных ингибиторов в активном центре фермента.

По данным ковалентного докинга GSH в свободный активный центр ГАФД концевая карбоксильная группа лиганда связывается с Arg231, карбонильная группа глицина - с Hisl76, карбоксильная группа глутамата GSH обращена в раствор. Положение бензольного кольца варьируется: в наиболее вероятной конформации (60% запусков) оно находится в гидрофобном кармане. В силу своих размеров GSH не способен эффективно связаться с активным центром ГАФД в присутствии NAD.

Устойчивость фермент-ингибиторных комплексов и расположение NMC и NAC в активном центре ГАФД, найденное с использованием ковалентного докинга, уточняли с помощью симуляции молекулярной динамики. По результатам исследования комплекса ГАФД^АС карбонильная группа NAC образовала водородную связь с Thrl 79, а карбоксильная - с His 176 (Рис. 9). Исследование комплекса ГАФД^МС показало, что карбоксильная группа лиганда образовала водородные связи с Arg231 и His 176, гидроксильная группа - с Serl 19 (см. Рис. 10). Данные проведенного моделирования подтвердили вывод о том, что GSH, NAC и NMC являются потенциальными ковалентными ингибиторами ГАФД.

Рис. 10. NMC, ковалентно связанный в активном центре ГАФД.

Для проверки адекватности выводов, полученных при исследовании ингибиторов in silico, было проведено экспериментальное исследование ингибирующих свойств выбранных соединений в условиях in vitro.

Рис. 9. NAC, ковалентно связанный в активном центре ГАФД.

Экспериментальная проверка ингибиторных свойств соединений

Изучение ингибирующего действия GSH и NAC на каталитическую активность ГАФД. Результаты экспериментов приведены на Рис. 11. При инкубации соматической ГАФД в присутствии GSH и NAC наблюдали снижение активности фермента во времени: в случае NAC удельная активность снизилась на 35%, в случае GSH - на 55%. Третье из изученных соединений (NMC) не оказывало влияния на активность ГАФД.

ol...............

О 30 60 90 120 150

время, мин

Рис. 11. Изменение активности соматической ГАФД из мышц кролика при инкубации с SH-соединениям: (1) - GSH; (2) - NAC; (3) - NMC. Концентрация белка: 14 мкМ в расчете на тетрамер, концентрация лигандов - 0.56 мМ.

Изучение характера связывания NAC и GSH с ГАФД. Так как действие NAC и GSH может приводить к ковалентной модификации сульфгидрильных групп фермента, представлялось необходимым оценить вклад этого процесса в ингибирование ГАФД. Было исследовано ингибирующее действие двух отобранных соединений в присутствии низкомолекулярного дитиола - дитиотреитола. Добавление дитиотреитола полностью предотвращало ингибирующее действие NAC и GSH и свидетельствовало о том, что ингибирование активности фермента происходит в результате ковалентной модификации белка данными лигандами. Таким образом среди природных SH-соединений были выявлены производные цистеина и глутатиона, способные проявлять ингибирующую активность по отношению к мышечной ГАФД. При отборе соединений были использованы два основных критерия. С одной стороны, эти вещества должны были ковалентно модифицировать сульфгидрильную группу активного центра ГАФД, с другой -взаимодействовать с NAD-связывающим центром. Последнее свойство позволяло бы решить сразу две задачи - высокоспецифично модифицировать сульфгидрильные группы именно в активном центре и приводить к модификации только тех активных центров, которые свободны от кофактора или связывают его относительно непрочно.

Действительно, как показали полученные результаты, связывание ингибиторов и последующая модификация сульфгидрильных групп происходит в двух мономерах тетрамера, то есть не затрагивает активные центры, содержащие прочно связанный кофактор. Именно это обстоятельство позволяет получать гибридные формы тетрамерного фермента, обладающие каталитической активностью (около 50% от исходной), но содержащие ковалентно связанные ингибиторы в двух активных центрах из четырех.

Избирательное ингибирование ГАФД сперматозоидов человека

Избирательное ингибирование сперматозоидной ГАФД представляет интерес для разработки контрацептивных препаратов, так как гликолиз является основным источником энергии для движения сперматозоидного жгутика. Исследование ингибирующих свойств GSH, NAC и NMC по отношению к сперматозоидной ГАФД человека показало, что действие GSH было аналогичным таковому на мышечную ГАФД (удельная активность фермента снизилась до 40%), а NAC повлиял на сперматозоидную ГАФД несколько сильнее, чем на мышечную (удельная активность фермента снизилась до 50%). В то же время добавление NMC, которое не влияло на активность мышечной ГАФД, вызывало снижение активности сперматозоидной ГАФД на -50% (Рис. 12).

100

о4

JQ Н О

о X в S

н «

cd «

св X л Ч а>

NMC, мГАФД

40-

20-

NMC. сГАФД

NAC. сГАФД

20

40

60

80

100 120 140 160

180

время, мин.

Рис. 12. Влияние потенциальных ингибиторов GSH, NAC и NMC на активность сперматозоидной ГА ФД (см.текст). мГА ФД - ГАФД из мышц кролика, сГА ФД - ГА ФД из спематозоидов человека. Концентрация белка: 14 мкМв расчете на тетрамер, концентрация лигандов - 0.56 мМ.

Таким образом было установлено, что ЫМС является перспективным соединением для избирательного ингибирования сперматозоидной ГЛФД. При моделировании в качестве мишени использовали субъединицу сперматозоидной ГАФД крысы из модели 2У)Л\1, идентичность которой со сперматозоидной ГАФД человека составляет 69%. при этом расположение Р5- и Ргсайтов и Суз 149 также идентично. Молекулярное моделирование показало, что ЫМС взаимодействует со свободным активным центром ГАФД, комплекс фермента с ингибитором стабилизирует солевой мостик между карбоксильной группой ЫМС и аргинином и гистидином активного центра ГАФД. Гидроксильная группа лиганда взаимодействует с 01и314. Молекулярное моделирование взаимодействия БН-соединений со сперматозоидной ГАФД показывает, что эффективность ингибирования может быть увеличена путем модификации соединения.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Предложена стратегия модуляции активности шаперона Hsp70 путем использования низкомолекулярных ингибиторов, способных связываться с АТФазным доменом и предотвращать взаимодействия комплекса Нзр70:АДФ:Субстрат с фактором нуклеотидного обмена;

2. Предложены низкомолекулярные ингибиторы, способные стабилизировать комплекс Нзр70:АДФ:Пептид;

3. Разработана модель полноразмерной трехмерной структуры Hsp70 человека:

4. Проведено молекулярное моделирование и описан процесс взаимодействия АТФазного и субстрат-связывающего доменов Hsp70 человека, ключевую роль в котором играют солевые мостики Arg 171 :Glu516 и Arg416:Glu218;

5. Проведено моделирование структур тиоэфирного интермедиата в механизме функционирования ГАФД и ковалентных фермент-ингибиторных комплексов с модифицированным аминокислотным остатком Cysl49 в активном центре фермента;

6. Найдены новые ковалентные ингибиторы ГАФД, в том числе селективные ингибиторы сперматозоидной формы фермента.

Список работ по теме диссертации

1. Черноризов К.А., Швядас В.К. "Моделирование полноразмерной структуры шаперона Hsp70 человека и изучение его междоменных взаимодействий". Acta Naturae, 2010. т.2. №4(7), с. 69-74:

2. Черноризов К.А., Элькина Ю.Л., Семенюк П.И., Швядас В.К., Муронец В.И. "Новые ингибиторы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы: ковалентная модификация NAD-связывающего центра ароматическими тиолами", Биохимия, 2010, т.75, №12, с. 16621669:

3. Чсрноризов К.А. «Моделирование полноразмерного белка Hsp70 человека». Материалы международного молодежного научного форума «Ломоносов-2010»

4. В.И. Муронец. В.И. Буник, Е.В. Шмальгаузен, А.ГГ. Плетень, И.Н. Налетова. Н.В. Позднякова, B.C. Стройлов, К.А. Черноризов, C.B. Стогов, И.А. Севостьянова, Создание препаратов, стимулирующих шаперонную функцию клетки и предназначенных для терапии нейродегенеративных патологий (Государственный контракт № 02.512.11.2249 от «07» июля 2008 г. По теме: «Создание препаратов, стимулирующих шаперонную функцию клетки и предназначенных для терапии нейродегенеративных патологий»), Материалы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые Системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва. 25-27 ноября 2009 г., стр.59;

5. Черноризов К.А. «Поиск ингибитора образования комплекса между Hsp70 и фактором обмена нуклеотида», Тезисы международной научной студенческой конференции «Ломоносов-2007», стр.45;

6. В.И. Муронец, И.Н. Налетова, И.А. Севостьянова, Е.В. Шмальгаузен, C.B. Стогов, Г.Г. Чилов, К.А. Черноризов, Д.К. Нилов, Н.В. Шошина, И.В. Гужова, Б.А. Маргулис, A.A. Пименова, Е.М. Еременко, A.B. Казначеева, Б.С. Оникиенко, Создание препаратов, стимулирующих шаперонную функцию клетки и предназначенных для терапии нейродегенеративных патологий (Государственный контракт № 02.512.11.2249 от «07» июля 2008 г. По теме: «Создание препаратов, стимулирующих шаперонную функцию клетки и предназначенных для терапии нейродегенеративных патологий»), Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые Системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, 8-10 декабря 2008 г.. с. 142;

Список сокращений:

NEF - nucleotide exchange factor, фактор нуклеотидного обмена;

МД - молекулярная динамика;

РСА - рентгеноструктурный анализ;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс;

SBD - substrate binding domain, субстрат-связывающий домен:

RMSD - root mean square deviation, среднеквадратичное отклонение;

GSH - Ы-(фенилацетил)-глутатион;

NAC - ^(феноксиацетил)-Ь-цистеин;

NMC - ^((11)-манделил)-(5)-цистеин.

Подписано в печать:

25.03.2011

Заказ № 5228 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vmw.autoreferat.ru

7 5 07

2010199418

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Черноризов, Кирилл Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ-4

ВВЕДЕНИЕ^

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР-61.1 ШаперонН5р70 -61.1.1 СТРОЕНИЕ ШАЛЕРОНА НБР70 -81.1.2 ЦИКЛ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ Н5Р70 -Ю

1.1.3 Взаимодействие Нбр70 с факторами обмена нуклеотида -121.1.4 Прочие функции Нбр70 и роль шаперонов в апоптотических процессах -141.1.5 Нйр70 и иммунная система -171.1.6 Модуляция шаперонной активности -19 -1.1.7 Обзор трехмерных структур Н5Р70 -231.2 Глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа -271.2.1 Строение глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и механизм ферментативной реакции - 27 -1.2.2 Функции глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы -321.2.3 Стратегии модуляции функционирования глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы - 36

1.2.4 Обзор трехмерных структур глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы - 41

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ-452.1 Методики молекулярного моделирования -452.1.1 Симуляция молекулярной динамики -462.1.2 Молекулярный докинг и скрининг -493, РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ-50

3.1 Поиск ингибитора взаимодействия н5р70 с фактором нуклеотидного обмена 3.1.1 Моделирование структуры АТФазного домена Нбр70 человека

-50-53

3.1.2 Скрининг баз данных низкомолекулярных соединений -58

3.2 Моделирование полноразмерной трехмерной структуры Нбр70 -65

3.2.1 Модель нНбр70, построенная по гомологии со структурами 1У1)\А/ и Юкг -66

3.2.2 конструирование нНзр70 с аБВО, построенным по шаблонам 11ю0 и 2Р32 -69

3.2.2.1 ИНэрУО с а-субдоменом БВО, построенным на основании структуры 11Ю0 -71

3.2.2.2 ИН5р70 с а-субдоменом 5ВР, построенным на основании структуры 2Р32 -74

3.3 Изучение междоменных взаимодействий н№р70 -78

3.3.1 Зона контакта АТФазного и субстрат-связывающего доменов -78

3.3.2 Симуляция раздвижения субдоменов 1 и II -85

3.4 Моделирование глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы с ковалентно модицифированным cys149 -87

3.4.1 Алгоритм конструирования ковалентно модифицированной глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы -87

3.4.2 Проверка алгоритма на модели тиоэфирного интермедиата -90

3.5 Поиск ковалентных ингибиторов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы /л/ втсо -93

3.6 Экспериментальная проверка потенциальных 5Н-ингибиторов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы -97

3.6.1 Изучение ингибирующего действия GSH и NAC на каталитическую активность глицеральдегид-3фосфат дегидрогеназы -100

3.6.2 Селективное ингибирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы сперматозоидов -103

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черноризов, Кирилл Александрович

4. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Предложена стратегия модуляции активности шаперона Нвр70 путем использования низкомолекулярных ингибиторов, способных связываться с АТФазным доменом и предотвращать взаимодействия комплекса Нзр70:АДФ:Субстрат с фактором нуклеотидного обмена;

2. Предложены низкомолекулярные ингибиторы, способные стабилизировать комплекс Н5р70:АДФ:Пептид;

3. Разработана модель полноразмерной трехмерной структуры Нзр70 человека;

4. Проведено молекулярное моделирование и описан процесс взаимодействия АТФазного и субстрат-связывающего доменов Нзр70 человека, ключевую роль в котором играют солевые мостики Аг§171 :Ст1и516 и Аг§416:С1и218;

5. Проведено моделирование структур тиоэфирного интермедиата в механизме функционирования ГАФД и коваленгных фермент-ингибиторных комплексов с модифицированным аминокислотным остатком Суя 149 в активном центре фермента;

6. Найдены новые ковалентные ингибиторы ГАФД, в том числе селективные ингибиторы сперматозоидной формы фермента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Черноризов, Кирилл Александрович, Москва

1. Финкельштейн A.B., Птицын O.E. Физика белка. КДУ, Москва, 2005

2. Ritossa P. Problems of prophylactic vaccinations of infants. Riv 1st Sicroter Ital. 1962;37:79-108.

3. Young JC, Agashe VR, Siegers K, Hartl FU. Pathways of chaperone-mediated protein folding in the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004;5(10):781-91.

4. Noonan EJ, Place RF, Giardina C, Hightower LE. Hsp70B' regulation and function. Cell Stress Chaperones. 2007;12(4):393-402.

5. Song J, Takeda M, Morimoto RI. Bagl-Hsp70 mediates a physiological stress signalling pathway that regulates Raf-l/ERK and cell growth. Nat Cell Biol. 2001;3(3):276-82.

6. Morimoto RT. Cells in stress: transcriptional activation of heat shock genes. Science. 1993 ;259(5100): 1409-1410.

7. Callahan MK, Chaillot D, Jacquin C, Clark PR, Menoret A. Differential acquisition of antigenic peptides by Hsp70 and Hsc70 under oxidative conditions. J Biol Chem. 2002;277(37):33604-9.

8. Brown IR. Heat shock proteins and protection of the nervous system. Ann N Y Acad Sei. 2007;1113:147-58.

9. Multhoff G, Pfister K, Gehrmann M, Hantschel M, Gross C, Hafner M, Hiddemann W. A 14-mer Hsp70 peptide stimulates natural killer (NK) cell activity. Cell Stress Chaperones. 2001;6(4):337-44.

10. Schmitt E, Gehrmann M, Brunei M, Multhoff G, Garrido C. Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy. J Leukoc Biol. 2007;81(1): 15-27.

11. Vogel M, Bukau B, Mayer MP. Allosteric regulation of Hsp70 chaperones by a proline switch. Mol Cell. 2006;21 (3):359-67.

12. Nollen EA, Kabakov AE, Brunsting JF, Kanon В, Höhfeld J, Kampinga HH. Modulation of in vivo HSP70 chaperone activity by Hip and Bag-1. J Biol Chem. 2001;276(7):4677-82.

13. O'Brien MC, Flaherty KM, McKay DB. Lysine 71 of the chaperone protein Hsc70 Is essential for ATP hydrolysis. J Biol Chem. 1996;271(27):15874-S.

14. Hennessy F, Nicoll WS, Zimmermann R, Cheetham ME, Blatch GL. Not all J domains arc created equal: implications for the specificity of IIsp40-Hsp70 interactions. Protein Sei. 2005; 14(7): 1697-1709. ч

15. Гужова И, Новоселов С, Маргулис Б. Шаперон Hsp70 и перспективы его использования в противоопухолевой терапии. Цитология. 2005;47(3): 187-199.

16. Osipiuk J, Walsh MA, Freeman ВС, Morimoto RI, Joachimiak A. Stmcture of a new crystal form of human Hsp70 ATPase domain. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1999;55(Pt 5): 11051107.

17. Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell. Mol. Life Sci. 2005;62(6):670-684.

18. Chang Y, Sun Y, Wang C, Hsiao C. Crystal structures of the 70-kDa heat shock proteins in domain disjoining conformation. J. Biol. Chem. 2008;283(22): 15502-15511.

19. Freeman ВС, Myers MP, Schumacher R, Morimoto RI. Identification of a regulatory motif in Hsp70 that affects ATPase activity, substrate binding and interaction with HDJ-1. EMBO J. 1995; 14( 10):2281 -92.

20. Qian X, Hou W, Zhengang L, Sha B. Direct interactions between molecular chaperones heat-shock protein (lisp) 70 and Hsp40: yeast Hsp70 Ssal binds the extreme C-terminal region of yeast Hsp40 Sisl. Biochcm J. 2002;361(Pt 1У.27-34.

21. Sondermann H, Scheufler C, Schneider C, Hohfeld J, Haiti FU, Moarefi I. Structure of a Bag/Hsc70 complex: convergent functional evolution of Hsp70 nucleotide exchange factors. Science. 2001 ;291(5508): 1553-7.

22. Brehmcr D, Rudiger S, Gassier CS, Klostermeier D, Packschies L, Reinstein J, Mayer MP, Bukau B. Tuning of chaperone activity of Hsp70 proteins by.modulation of nucleotide exchange. Nat Struct Biol. 2001;8(5):427-32.

23. Stuart JK, Myszka DG, Joss L, Mitchell RS, McDonald SM, Xie Z, Takayama S, Reed JC, Ely KR. Characterization of interactions between the anti-apoptotic protein BAG-1 and Hsc70 molecular chaperones. J Biol Chem. 1998;273(35):22506-14.

24. Mitra A, Shevde LA, Samant RS. Multi-faceted role ofHSP40 in cancer. Clin. Exp. Metastasis. 2009;26(6):559-567.

25. Chou C, Forouhar F, Yeh Y, Shr H, Wang C, Hsiao C. Crystal structure of the C-terminal 10-kDa subdomain of Hsc70. J. Biol. Chem. 2003;278(32):30311-30316.

26. Jiang J, Maes EG, Taylor AB, Wang L, Hinck AP, Lafer EM, Sousa R. Structural basis of J cochaperone binding and regulation of Hsp70. Mol Cell. 2007;28(3):422-33.

27. Li J, Wu Y, Qian X, Sha B. Crystal structure of yeast Sisl peptide-binding fragment and Hsp70 Ssal C-terminal complex. Biochem. J. 2006;398(3):353-360.

28. Wang HG, Takayama S, Rapp UR, Reed JC. Bcl-2 interacting protein, BAG-1, binds to and activates the kinase Raf-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1996;93(14):7063-7068.

29. McLellan С A, Raynes DA, Guerriero V. IIspBPl, an Hsp70 cochaperone, has two structuraldomains and is capable of altering the conformation of the Hsp70 ATPase domain. J. Biol. Chem. 2003;278(21): 19017-19022.

30. Polier S, Dragovic Z, Hartl FU, Bracher A. Structural basis for the cooperation of Hsp70 and Hspl 10 chapcrones in protein folding. Cell. 2008;133(6):1068-79.

31. Schuermann JP, Jiang J, Cuellar J, Llorca O, Wang L, Gimenez LE, Jin S, Taylor AB, Demeler B, Morano KA, Hart PJ, Valpuesta JM, Lafer EM, Sousa R. Structure of the Hspll0:Hsc70 nucleotide exchange machine. Mol Cell. 2008;31(2):232-43.

32. Odunuga OO, Longshaw VM, Blatch GL. Hop: more than an Hsp70/Hsp90 adaptor protein. Bioessays. 2004;26( 10): 1058-68.

33. Hartl FU, Hayer-IIartl M. Molecular Chaperones in the.CytosoI: from Nascent Chain to Folded Protein. Science. 2002;295(5561): 1852-1858.

34. Esser C, Alberti S, Hohfeld J. Cooperation of molecular chaperones with the ubiquitin/proteasome system. Biochim Biophys Acta. 2004; 1695(1-3): 171-88.

35. Bronk P, Wenniger JJ, Dawson-Scully K, Guo X, Hong S, Atwood IIL, Zinsmaier KE. Drosophila Hsc70-4 is critical for neurotransmitter exocytosis in vivo. Neuron. 200l;30(2):475-88.

36. Nicholson DW. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death Differ. 1999;6(11): 1028-1042.

37. Gehrmann M, Brunner M, Pfister K, Reichle A, Kremmer E, Multhoff G. Differential up-regulation of cytosolic and membrane-bound heat shock protein 70 in tumor cells by antiinflammatory drugs. Clin Cancer Res. 2004;10(10):3354-64.

38. Ito A, Honda H, Kobayashi T. Cancer immunotherapy based on intracellular hyperthermia using magnetite nanoparticles: a novel concept of "heat-controlled necrosis" with heat shock protein expression. Cancer Immunol Immunother. 2006;55(3):320-8.

39. Suck G. Novel approaches using natural killer cells in cancer therapy. Semin. Cancer Biol. 2006; 16(5):412-8.

40. Browning MJ, Bodmer WF. MHC antigens and cancer: implications for T-cell surveillance. Curr. Opin. Immunol. 1992;4(5):613-618.

41. Bausero MA, Gastpar R, Multhoff G, Asea A. Alternative mechanism by which IFN-gamma enhances tumor recognition: active release of heat! shock protein 72. J Immunol. 2005;175(5):2900-12.

42. Wang R, Kovalchin JT, Muhlenkamp P, Chandawarkar RY. Exogenous heat shock protein 70 binds macrophage lipid raft microdomain and stimulates phagocytosis, processing, and. MHC-II presentation of antigens. Blood. 2006;107(4): 1636-42.

43. Arispe N, Doh M, Simakova O, Kurganov B, De Maio A. Hsc70 and Hsp70 internet with phosphatidylserine on the surface of PC 12 cells resulting in a decrease of viability. FASEB J.2004; 18(14): 1636-1645.

44. Broquet AH, Thomas G, Masliah J, Trugnan G, Bachelet M. Expression of the molecular chaperone Hsp70 in detergent-resistant microdomains correlates with its membrane delivery and release. J. Biol. Chem. 2003;278(24):21601-21606.

45. Nylandsted J, Brand K, Jaattela M. Heat shock protein 70 is required for the survival of cancer cells. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000;926:122-125.

46. O'Brien MC, McKay DB. Threonine 204 of the chaperone protein Hsc70 influences the structure of the active site, but is not essential for ATP hydrolysis. J. Biol. Chem. 1993;268(32):24323-24329.

47. Wilbanks SM, McKay DB. How potassium affects the activity of the molecular chaperone Hse70. II. Potassium binds specifically in the ATPase active site. J. Biol. Chem. 1995;270(5):2251-2257.

48. Jiang J, Prasad K, Lafer EM, Sousa R. Structural basis of interdomain communication in the Hsc70 chaperone. Mol Cell. 2005;20(4):513-24.

49. Sousa MC, McKay DB. The hydroxyl of threonine 13 of the bovine 70-kDa heat shock cognate protein is essential for transducing the ATP-induced conformational change. Biochemistry. 1998;37(44): 15392-15399.

50. Flaherty KM, DeLuca-Flaherty C, McKay DB. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature. 1990;346(6285):623-628.

51. Harrison CJ, Hayer-Hartl M, Di Liberto M, Hartl F, Kuriyan J. Crystal structure of the nucleotide exchange factor GrpE bound to the ATPase domain of the molecular chaperone DnaK. Science. 1997;276(5311):431 -435.

52. Zhu X, Zhao X, Burkholder WF, Gragerov 'A, Ogata CM, Gottesman ME, Hendrickson WA. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK. Science. 1996;272(5268): 1606-1614.

53. Shomura Y, Dragovic Z, Chang H, Tzvetkov N, Young JC, Brodsky JL, Gucrriero V, Hartl FU, Bracher A. Regulation of Hsp70 function by HspBPl: structural analysis reveals an alternate mechanism for Hsp70 nucleotide exchange. Mol. Cell. 2005;17(3):367-379.

54. Liu Q, Hendrickson WA. Insights into Hsp70 chaperone activity from a crystal structure of theyeast Hsp 110 Sse 1. Cell. 2007; 131 (1): 106-120.

55. Worrall LJ, Walkinshaw MD. Crystal structure of the C-terminal three-helix bundle subdomain of C. elegans Hsp70. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007;357(1): 105-110.

56. Cupp-Vickery JR, Peterson JC, Ta DT, Vickery LE. Crystal structure of the molecular chapcrone HscA substrate binding domain- complexed with the IscU recognition peptide ELPPVKIHC. J. Mol. Biol. 2004;342(4): 1265-1278.

57. Arakawa A, Handa N, Ohsawa N, Shida M, Kigawa T, Hayashi F, Shirouzu M, Yokoyama S. The C-terminal BAG domain of BAG5 induces conformational changes of the IIsp70 nucleotide -binding domain for A DP-ATP exchange. Structure. 2010;18(3):309-319.

58. Wisniewska M, Karlberg T, Lehtiö L, Johansson I, Kotcnyova T, Moche M, Schüler II. Crystal structures of the ATPase domains of four human Hsp70 isoforms: HSPAlL/Hsp70-hom, HSPA2/Hsp70-2, HSPA6/Hsp70B', andHSPA5/BiP/GRP78. PLoS ONE. 2010;5(l):e8625.

59. Xu Z, Page RC, Gomes MM, Kohli E, Nix JC, Herr AB, Patterson C, Misra S. Structural basis of nucleotide exchange and client binding by the Hsp70 cochaperone Bag2. Nat. Struct. Mol. Biol. 2008; 15(12): 1309-1317.

60. Liebscher M, Roujeinikova A. Allosteric coupling between the lid and interdomain linker in DnaK revealed by inhibitor binding studies. J. Bacteriol. 2009; 191(5): 1456-1462.

61. Jenkins JL, Tanner JJ. High-resolution structure of human D-glyceraldchyde-3-phosphate dehydrogenase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006;62(Pt 3):290-301.

62. Chuang D, Hough C, Senatorov VV. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, apoptosis, and neurodegenerative diseases. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2005;45:269-90.

63. Foucault G, Nakano M, Pudles J. Role of lysine-183 in D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases. Properties of the N-acetylated yeast, sturgeon muscle and rabbit muscle enzymes. Eur J Biochem. 1978;83(1):113-23.

64. Sirover MA. New nuclear functions of the glycolytic protein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, in mammalian cells. J Cell Biochem. 2005;95(l):45-52.

65. Yun M, Park CG, Kim JY, Park HW. Structural analysis of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Escherichia coli: direct evidence of substrate binding and cofactor-induced conformational changes. Biochemistry. 2000;39(35): 10702-10.

66. Kliman HJ, Steck TL. Association of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with the human red cell membrane. A kinetic analysis. J Biol Chem. 1980;255(13):6314-21.

67. Orru S, Ruoppolo M, Francesc S, Vitagliano L, Marino G, Esposito C. Identification of tissue transglutaminase-reactive lysine residues in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Protein Sci. 2002; 1 l(l):137-46.

68. Arrasate M, Mitra S, Schweitzer ES, Segal MR, Finkbeiner S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 2004;431(7010):805-10.

69. Steffan JS, Agrawal N, Pallos J, Rockabrand E, Trotman LC, Slepko N, llles K, Lukacsovich T, Zhu Y, Cattanco E, Pandolfi PP, Thompson LM, Marsh JL. SUMO modification of I luntingtin and Huntington's disease pathology. Science. 2004;304(5667): 100-104.

70. Suresh S, Bressi JC, Kennedy KJ, Verlinde CL, Gelb MH, Hoi WG. Conformational changes in Leishmania mexicana glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase induced by designed inhibitors. J Mol Biol. 2001 ;309(2):423-35.

71. Nyasse B, Nono J, Nganso Y, Ngantehou I, Schneider B. Uapaca genus (Euphorbiaceae), a good, source of betulinic acid. Fitoterapia. 2008;80(l):32-24.

72. Gregus Z, Nemeti B. The glycolytic enzyme glyceraidehydc-3-phosphate dehydrogenase works as an arsenate reductase in human red blood cells and rat liver cytosol. Toxicol Sei. 2005;85(2):859-69:

73. Sakai K, Hasumi K, Endo A. Two glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isozymes from the koningic acid (heptelidic acid) producer Trichoderma koningii. Eur J Bioehem. 1990; 193(1): 195-202.

74. Fujita SC, Oshima T, Imahori K. Purification and properties of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from an extreme thermophile, Thermus thermophilus strain HB 8. Eur J Bioehem. 1976;64(l):57-68.

75. Kim H, Hol WG. Crystal structure of Leishmania mexicana glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in a new crystal form confirms the putative physiological active site structure. J. Mol. Biol. 1998;278(I):5-11.

76. Isupov MN, Fleming TM, Dalby AR, Crowhurst GS, Bourne PC, Littlechild JA. Crystal structure of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. J. Mol. Biol. 1999;291(3):651-660.

77. Tanner JJ, Hecht RM, Krause KL. Determinants of enzyme thermostability observed in the molecular structure of Thermus aquaticus D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase at 25 Angstroms Resolution. Biochemistry. 1996;35(8):2597-2609.

78. Shen YQ, Li J, Song SY, Lin ZJ. Structure of apo-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Palinurus versicolor. J. Struct. Biol. 2000; 130(1): 1-9.

79. Song SY, Xu YB, Lin ZJ, Tsou CL. Structure of active site carboxymethylated D-gIyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Palinurus versicolor. J. Mol. Biol. 1999;287(4):719-725.

80. Shen YQ, Song SY, Lin ZJ. Structures of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase complexed with coenzyme analogues. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2002;58(Pt 8): 12871297.

81. Cowan-Jacob SW, Kauftnann M, Anselmo AN, Stark W, Grütter MG. Structure of rabbit-muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2003;59(Pt 12):2218-2227.

82. Antonyuk SV, Eady RR, Strange RW, Hasnain SS. The structure of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Alcaligenes xylosoxidans at 1.7 A resolution. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2003;59(Pt 5):835-842.

83. Shin, D.H., Thor, J., Yokota, H., Kim, R., Kim, S.H. Crystal structure of MES buffer bound form of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Escherichia coli. http://www.pdb.org/pdb/explore/explore.do?structureld= 1S7C.

84. Song SY, Gao YG, Zhou JM, Tsou CL. Preliminary crystallographic studies of lobster D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and the modified enzyme carrying the fluorescent derivative. J. Mol. Biol. 1983; 171 (2):225-228.

85. Satchell JF, Malby RL, Luo CS, Adisa A, Alpyurek AE, Klonis N, Smith BJ, Tilley L, Colman PM. Structure of gIyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Plasmodium falciparum. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2005;61(Pt 9): 1213-1221.

86. Ismail, S.A., Park, H.W. Crystal Structure Analysis of Human liver GAPDH. http://www.pdb. org/pdb/explore/explore.do?structureId= 1ZNQ.

87. I to, K., Arai, R., Kamo-Uchikubo, T., Shirouzu, M., Yokoyama, S. Crystal structure of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Pyrococcus horikoshii OT3. http://www.pdb.org/pdb/explore/explore.do? structureId=2CZC.

88. Asada," Y., Kunishima, N. Stnictural study of Project ID aq1065 from Aquifex aeolicus VF5. http://www.pdb.org/pdb/explore/explore.do7structurekh12EP7.

89. Jenkins, J.L., Buencamino, R., Tanner, J.J. High Resolution Structures of Thermus.aquaticus Glyceraldehyde-3-Phosphate ■ Dehydrogenase: Role of 220's Loop Motion in- Catalysis. http://www.pdb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2G82.

90. Nikolaev V.K., Leontovich A.M., Drachev V.A., Brodsky L.I. Building multiple alignment using iterative analyzing biopolymers structure dynamic improvement of the initial motif alignment. Biochemistry. 1997;62(6):578-582.

91. Kiefer F, Arnold K, Kunzli M, Bordoli L, Sclnvede T. The SWISS-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Res. 2009;37(Database issue):D387-392.

92. Arnold K, Bordoli L, Kopp J, Schwede T. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 2006;22(2): 195-201.

93. Van Der Spoel D, Lindahl E, Hess B, Groenhof G, Mark AE, Bercndsen HJC. GROMACS:fast, flexible, and free. J Comput Chem. 2005;26( 16): 1701 -1718.i

94. Stroganov OV, Novikov FN, Stroylov VS, Kulkov V, Chilov GG. Lead finder: an approach to improve accuracy of protein-ligand docking, binding energy estimation, and virtual screening. J Chem Inf Model. 2008;48(12):2371-2385.

95. Guex, N and Peitsch, M.C. Swiss-PdbViewer: A Fast and Easy-to-use PDB Viewer for Macintosh and PC. Protein Data Bank Quaterly Newsletter. 1996;77:7.125. http://opcnbabel.org/wiki/MainPagc.

96. Pavelites JJ, Gao J, Bash PA, Jr ADM. A molecular mechanics force field for NAD+ NADH, and the pyrophosphate groups of nucleotides. Journal of Computational Chemistry. 1997;18(2):221-239.

97. Walker RC, de Souza MM, Mercer IP, Gould IR, Klug DR. Large and Fast Relaxations inside a Protein: Calculation and Measurement of Reorganization Energies in Alcohol Dehydrogenase. The Journal ofPhysical Chemistry B. 2002; 106(44): 11658-11665.

98. Wishart DS, Knox C, Guo AC, Shrivastava S, Hassanali M, Stothard P, Chang Z, Woolsey J. DrugBank: a comprehensive resource for in silico drug discovery and exploration. Nucleic Acids Res. 2006;34(Database issue):D668-72.

99. Wishart DS, Knox C, Guo AC, Cheng D, Shrivastava S, Tzur D, Gautam B, Hassanali M. DrugBank: a knowledgebase for drugs, drug actions and drug targets. Nucleic Acids Res. 2008;36(Database issue):D901-6.134. http://mi.caspur.it/PMDB/main.php.

100. Castrignanö T, De Meo PD, Cozzetto D, Talamo IG, Tramontano A. The PMDB Protein Model

101. Database. Nucleic Acids Res. 2006;34(Database issue):D306-309.136. de Vijldcr JJ, Boers W, Slater EC. Binding and properties of NAD+ in glyccraldehydephosphate dehydrogenase from lobster-tail muscle. Biochim. Biophys. Acta. 1969; 191(2):214-220.