Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск, идентификация и изучение экспрессии генов-кандидатов псориатического процесса

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск, идентификация и изучение экспрессии генов-кандидатов псориатического процесса"

На правах рукописи

Брускин Сергей Александрович

ПОИСК, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ ПСОРИАТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

ООЗ1641Вь

Москва-2008

003164186

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им Н И Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Пирузян

Доктор биологических наук, профессор Элеонора Суреновна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор Сулимова

Галина Ефимовна

Институт общей генетики им Н И Вавилова РАН

Доктор биологических наук, профессор Вейко

Владимир Петрович ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова

Защита состоится «¿У» ^/у-/^.7^2008 г в 14® часов на заседании Диссертационного совета Д 21^013 01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу 117545, г Москва, 1-й Дорожный проезд, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан «/У » р 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук , Заиграева

Галина Григорьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Псориаз - заболевание кожи, является сложной генетически обусловленной патологией, в проявлении которой задействованы большие группы (сети) взаимодействующих генов/белков При этой патологии запуск патологического процесса происходит внешними триггер 1ми окружающей среды (психо - эмоциональные стрессы, инфекции и пр) Патология на данный момент неизлечима, а лечение направлено на увеличение периодов ремиссии и на снижение тяжести болезни В среднем псориазом страдает 3% населения мира, причем имеется четкая регионально-этническая дифференциация распространенности заболевания Псориаз редко приводит к летальному исходу, однако существенно влияет на качество жизни пациентов и часто приводит к инвалидности В последнее время псориазом болеет все больше молодежи, что впоследствии скажется на потере трудоспособности части взрослого населения, поэтому необходимо уже сейчас начинать разработку эффективных терапий и ранней диагностики псориаза

Развитие любого многофакторного заболевания обусловлено двумя основными детерминантами - генетической предрасположенностью и запускающими заболевание триггерами Локусы, связанные с псориазом, локализованы, по крайней мере, на 8 различных хромосомах и обозначаются как PSORS (Psoriasis Susceptibility) PSORS1 - PSORS9

В патогенезе многофакторных заболеваний важным является вопрос, касающийся роли триггеров внешней среды Некоторые из данных триггеров (например, инфекции) могут приводить к различному уровню экспрессии цитокинов у различных индивидуумов Другие могут влиять на эпигенетические модификации (например, возможно опосредованные RUNX) Псориаз может быть спровоцирован стимулами внешней среды, такими как инфицирование стрептококком, повреждение (феномен Кебнера), стресс (нейропептиды), курение и алкоголь

Характер питания и лекарственные препараты также могут провоцировать многофакторные заболевания Среди токсинов N-нитросоединения являются основными кандидатами на роль триггеров многофакторных заболеваний Поэтому является важным изучение полиморфизма генов системы биотрансформации ксенобиотиков

Так как псориаз обусловлен разрегулированной работой генетического аппарата, то эффективным методом в разработке подходов для диагностики, лечения и создания лекарственных препаратов является поиск критических звеньев патологического процесса, а именно, генов-кандидатов и соответствующих белковых продуктов Если генетические исследования многофакторных заболеваний продвинулись в достаточной степени как в

«г

России, так и за рубежом, то применение постгеномных технологий с целью выявления биомаркеров и исследования патогенеза данной патологии остаются задачей ближайшего будущего К настоящему моменту, по существу, не опубликовано работ по комплексному использованию транскриптомики и протеомики для изучения псориаза Благодаря стремительному развитию геномных и постгеномных технологий, пользуясь литературными источниками и базами данных, можно выделить известные ассоциированные с данными патологиями гены, на основании компьютерных исследований составить карты и сети, содержащие гены-кандидаты, и выделить подпроцессы, которые могут являться критическими в развитии патологий Далее необходимо полученные результаты экспериментально проверить с помощью стандартных молекулярно-биологических методов

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось проведение поиска, выявления и изучения экспрессии генов-кандидатов псориатического процесса

В рамках работы были поставлены следующие задачи • Изучить возможную ассоциацию ферментов систем деградации

ксенобиотиков у больных псориазом, на примере гена NAT2

• Изучить изменение экспрессии генов БАХ, BCL-2, CASP3 и TP53 при пс ориазе

• С использованием методов информационной биологии определить круг генов-кандидатов патогенеза при псориазе

• Проанализировать уровни экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора API, в пораженной псориазом коже

• Идентифицировать белки, участвующие в развитии очага поражения у больных псориазом

Научная новизна работы Впервые на основе анализа информационного материала при помощи программы «MetaCore®» компании GENEGO Inc (США) определены гены-маркеры патологического процесса при псориазе, белки которых могут рассматриваться как потенциальные мишени для подбора индивидуализированной лекарственной терапии

Впервые изучена возможная ассоциация полиморфизма гена системы биотрансформации ксенобиотиков (NAT2) и псориаза

Впервые методом двумерного электрофореза проведено сравнение белковых профилей в пораженной и непораженной псориазом коже

Практическая значимость работы. Данные, полученные при анализе экспрессии генов-кандидатов патогенеза при псориазе, могут способствовать разработке новых диагностикумов и идентификации новых мишеней лекарственных препаратов для лечения данного заболевания

Апробация результатов работы. Основные положения и результаты работы были представлены на научно-практических конференциях «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004), «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2005), «Генетика в XXI веке современное состояние и

перспективы развития» (Москва, 2004), на 4-ом съезде Европейской ассоциации дерматовенерологов в 2006г в Финляндии, на межлабораторном семинаре Института общей генетики им Н И Вавилова РАН (Москва, 2007), на межлабораторном семинаре Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва, 2007),

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на страницах машинописного текста, включая /6 таблиц, рисунок и фотографии Список

цитируемых литературных источников включает 31 наименований

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Псориаз: характеристика заболевания и генетика патологии

В данной главе приведена клиническая характеристика заболевания и эпидемиология псориаза, обсуждается характер наследования заболевания Особое внимание уделяется вопросу о роли триггеров внешней среды в патогенезе данного заболевания В главе рассматриваются локусы, связанные с псориазом, локализованные, по крайней мере, на восьми хромосомах человека Глава завершается обсуждением рабочей модели иммунопатогенеза псориаза Особое внимание уделено процессам, происходящим в коже человека при развитии псориаза - в бессимптомной коже (предпсориатическая или визуально непораженная кожа больного), в которой уже возник ряд молекулярных изменений, и при появлении хронических поражений (псориатических бляшек)

Глава 2. N-ацетилтрансферазы человека

В главе обсуждается фенотип ацетилирования у человека и полиморфизм гена NAT2 Приведен список аллелей NAT2 у человека Обсуждается ассоциация фенотипа ацетилирования с рядом многофакторных заболеваний, в числе которых ряд онкологических заболеваний, астма, диабет I типа, системная красная волчанка

Глава 3. Транскрипционный фактор АР-1

В главе обсуждаются компоненты транскрипционного фактора АР-1, участие их в ответе клеток на действие ряда сигнальных молекул, их участие в процессах развития кожи, а также механизмы регуляции экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора АР-1

Глава 4. Материалы и методы

В главе приведен перечень бактериальных штаммов и сред для выращивания Е colt, составы использованных буферов

Приведены методы выделения ДНК и РНК, определения фенотипа ацетилирования, генотипа ацетилирования на микрочипах, мультиплексной полимеразной цепной реакции, обратной транскрипции, полуколичественной полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени

Приведены методы определения активности каспазы-3 в образцах кожи колориметрическим методом, определения содержания белка р53 в образца* кожи методом Вестерн-блот гибридизации Приведен метод двумерн ого электрофореза

О, атистическая обработка данных проводилась с использованием программы STATISTIC А 6 О

Глава 5. Результаты и обсуждение

5.1. Сравнительное изучение фенотипа ацетилирования и полиморфизма гена NAT2

Для того чтобы провести сравнительный анализ результатов по полиморфизму N-ацетилирования, получаемых с использованием метода определения ацетилирующей способности индивидуума (фенотип ацетилирования) и метода аллель-специфичной гибридизации на микрочипе (генотип ацетилирования), были проведены следующие исследования.

Фенотип ацетилирования был определен в группе волонтеров методом тестирования скорости ацетилирования сульфадимезина. Генотип NAT2 в популяционной выборке волонтеров определяли методом гибридизации ДНК на биочипе и на основании полученных результатов рассчитывали предполагаемые фенотипы ацетилирования. Как видно из представленных данных, частота медленных ацетиляторов в популяционной выборке составляет 45% (рисунок 1) и достоверно не отличается (р>0.01) от результатов, полученных при определении фенотипа ацетилирования методом тестирования скорости ацетилирования (47%). 60

50

40

30

20

10

о

Быстрые ацетиляторы, % Медленные ацетиляторы, %

■ Фенотипиоование ■Генотипирование

Рисунок 1. Частота фенотипов быстрых и медленных ацетиляторов по локусу NAT2 в московской выборке волонтеров, рассчитаная согласно данным фенотипирования и генотипирования

Сравнительные характеристики и предполагаемые области применения двух подходов (количественное определение скорости ацетилирования и качественное определение генотипа ацетилирования) для определения статуса ацетилирования у индивидуумов представлены в таблице 1

Таблица 1. Сравнительные характеристики и области применения методов определения фенотипа и генотипа ацетилирования _

Фенотипирование Генотипирование

Возможн ости Точное количественное определение фенотипа ацетилирования За счет одного измерения суммируются все возможные полиморфизмы в кодирующей области гена ЫА Т2 и промоторной области Точное качественное определение фенотипа ацетилирования (быстрый или медленный) За счет одного измерения определяются известные полиморфизмы в кодирующей области гена NA Т2

Область применения Предсказание риска токсичности или положительного эффекта от применения лекарственных препаратов Выявление предрасположенности к заболеваниям в зависимости от скорости ацетилирования Проведение популяционных исследований по генетическому полиморфизму ацетилированию Выявление предрасположенности к заболеваниям в зависимости от генотипа гена NAT2

На основании полученных данных и сравнительного анализа можно сделать следующие заключения Метод определения ацетилирующей способности индивидуума для выявления фенотипа ацетилирования за одно измерение позволяет суммировать все известные полиморфизмы и количественно определить уровень ацетилирования у индивидуума На основании этого можно предложить этот метод для количественной оценки скорости ацетилирования у индивидуума и более точного предсказания риска токсичности или, наоборот, положительного эффекта от применения лекарственных препаратов Метод гибридизации ДНК на олигонуклеотидной матрице (биочипе) позволяет достаточно точно определить генотипы и аллели, а также распределение частот аллелей и генотипов в популяционных выборках индивидуумов На основании этого можно предположить, что созданный гелевый микрочип даст возможность проводить популяционные

исследования по генетическому полиморфизму ацетилирования индивидуумов без фенотипирования, в том числе и с целью установления корреляции между генотипом ацетилирования и предрасположенностью данного индивидуума к заболеваниям

5.2. Полиморфизм гена NAT2 и его ассоциация с псориазом

На основании литературных данных, свидетельствующих о том, что полиморфизм гена NAT2 строго ассоциируется с рядом онкологических заболеваний, а также в связи с имеющимися литературными данными о взаимосвязи фенотипа ацетилирования с другим системным воспалительным аутоиммунным барьерным заболеванием - системной красной волчанкой (SLE), нами было высказано предположение о возможной взаимосвязи фенотипа ацетилирования и псориаза

Основываясь на результатах по взаимосвязи между фенотипом и генотипом ацетилирования и на возможности использования биологических микрочипов для определения генотипа NAT2, нами было проведено исследование группы больных псориазом (180 человек) и здоровых волонтеров (99 человек)

В таблице 2 показано распределение частоты встречаемости шести однонуклеотидных замен в позициях 282, 341, 481, 590, 803 и 857 гена NAT2 у больных псориазом и здоровых индивидуумов Это основные, наиболее часто встречающиеся замены в московской выборке, вносящие вклад в изменение фенотипа ацетилирования Частота встречаемости ни одной из замен достоверно не различаются (р>0 01) в выборке здоровых волонтеров и больных псориазом Это указывает на отсутствие роли ряда ксенобиотиков, а также продуктов их биотрансформации за счет ацетилирования N-ацетилтрансферазой, в запуске или развитии патогенеза псориаза

Также не выявлено достоверного отличия (р>0 01) между скоростью ацетилирования у больных псориазом и здоровых индивидуумов

Таблица 2 Сравнение распределения частот встречаемости однону!>леотидных замен в позициях 282, 341, 481, 590, 803 и 857 гена №АТ2 у больны к псориазом (слева) и здоровых индивидуумов (справа) в г. Москве

282 341 481

АА* 0,50 0,59 0 33 0,28 0,42 0,35

Аа 0,42 0,37 0,46 0,57 0,49 0,58

аа 0,08 0,04 0,21 0,15 0,09 0,07

590 803 857

АА 0,43 0,55 0,35 0,30 0,95 0,92

Аа 0,48 0 40 0 52 0,56 0 05 0,07

аа 0,09 0,05 0,13 0,14 0,00 0,01

А - аллель дикого типа, а - аллель мутантного типа

Следует, однако, подчеркнуть, что у больных псориазом выявлена достоверная ассоциация (р<0 01) с полиморфным сочетанием 282С/Т 341 С/С 481 С/Т 590G/A 803A/G 857А/А в гене NAT2

f>.3. Изменение некоторых апоптических медиаторов и эффекторов в коже у больных псориазом

В нормальном эпидермисе кератиноциты поддерживают точное и тонко сбалансированное соотношение между клеточной пролиферацией и клеточной дифференцировкой При созревании кератиноцитов в псориа гических бляшках нарушены клеточная дифференциация и клеточная пролиферация Если нормальный цикл созревания кератиноцитов составляет 28-30 дней, то при псориазе наблюдается его ускорение в восемь раз и сокращение цикла созревания кератиноцитов до 3-4 дней [Bowcock, Cookson, 2004] Кроме того, в псориатической коже отмечаются изменения в процессе апопто ¡а, что приводит к утолщению рогового слоя кожи

Нами было изучено изменение соотношения продуктов генов БАХ и BCL-2 в пораженной и непораженной коже больных псориазом и его изменение после лечения методом полуколичественной ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией Лечение пациентов проводилось препаратом Глутоксим® Эффективность лечения оценивалась по изменению индекса PASI

На рисунке 2 показано влияние успешного лечения препаратом «Глутоксим®» на соотношение мРНК генов Вах/Вс1-2 Соотношение Вах/Вс1-2 изменилось достоверно (р<0 01)

До лечения

После лечения

□ среднее

|—| станд 1—' отклонение

—р 1,96*станд. ""^отклонение

Рисунок 2 Изменение соотношения мРНК генов в коже больных псориазом до и после лечения препаратом «Глутоксим®»

Независимо от пути развития сигнала на апоптоз ключевая роль в процессе отводится каспазам, ферментам, осуществляющим деградацию белков и нуклеиновых кислот в клетке Вследствие того, что каспаза-3 является, если не ключевой, то одной из самых важных эффекторных каспаз, мы определяли изменение ее активности в пораженной коже больных псориазом, а также изучили влияние лечения пациентов на изменение активности каспазы в коже больного

Однако здесь мы не получили достоверного отличия активности фермента (рисунок 3) в группе больных до и после лечения (р>0 01)

0 85 0 80

0 75

0 70

065

0 60

0 55

050

среднее

0 45

До лечения

После лечения

I—I станд 1—1 отклонение

"I- 1,96+стаид отклонение

Рисуно» 3 Изменение активности белка каспазы-3 в коже больных псориазом до и после лечения препаратом «Глутоксим®»

5.4. Компоненты транскрипционного фактора АР-1 как гены -кандидаты при псориазе.

Нашей задачей было произвести поиск генов-кандидатов на развитие псориагического процесса Классический генетический подход в поиске генов-кандидатов заключается в семейном анализе и установлении генетических ассоциаций между проявлением болезни и сцепленными с этим проявлением локусами На данный момент высокоинформативным инструментом изучения экспрессии больших групп генов являются результаты экспериментов, в которых экспрессия генов оценивается количественно с помощью биологических микрочипов В своих биоинформационных исследованиях мы использовали базу данных GEO

DataSets (http //www nebí nlm nih gov/geo/), в которой в виде электронных таблиц собраны результаты экспериментов оценки уровня экспрессии генов на микрочипах Для дальнейшего анализа нами была отобрана запись GDS1391, в которой представлена информация об уровне экспрессии генов в коже трех здоровых волонтеров, а также в пораженной и непораженной коже четырех больных псориазом

На данный момент в рамках стремительного развития постгеномных технологий появляются программные продукты, позволяющие концентрировать и систематизировать большие объемы генетической информации, выстраивать гипотезы генных сетевых взаимодействий Одной из таких программ является программный продукт MetaCore® компании GENEGO Inc (США) В результате информационного анализа экспрессии около 12000 генов на биологических микрочипах с помощью программы MetaCore нами было установлено, что число генов, изменивших свою экспрессию более чем в 1,5 раза при псориазе, составляет 7563

На первом этапе мы сравнили уровни экспрессии генов (транскриптом) в пораженной коже больных псориазом и в коже здоровых волонтеров Для всех генов был установлен порог изменения уровней экспрессии равный 2, то есть программа будет работать только с теми генами, уровень экспрессии которых изменен (увеличен или уменьшен) более чем в 2 раза в пораженной коже, по сравнению с уровнем экспрессии тех же генов в коже здоровых волонтеров

Анализ транскриптомных данных показал, что при псориазе преимущественно наблюдается увеличение транскрипции множества генов Обилие генов, существенно увеличивших свою экспрессию при псориазе в ключевых процессах клеточного метаболизма, свидетельствует в пользу того, что патологический процесс в пораженной коже в целом обусловлен именно увеличением транскрипционной активности генов в клетках кожи, что совпадает с литературными данными о гиперактивности пролиферативной

способности кератиноцитов кожи и ускоренных процессах дифференцировки клеток кожи [Liu Y et al., 2007].

Если представить распределение генов, изменивших свою транскрипцию в пораженной коже больных псориазом по сравнению с кожей здоровых волонтеров, по их участию в различных молекулярно-генетических процессах, то основными измененными процессами в коже при псориазе являются иммунный ответ, клеточный цикл, воспаление, пролиферация и др. (рисунок 4).

1од(рУа1ие)

1. Ре гуляй ня клеточного никла

2. Иммунный ответ, фагосома

3. Презентация антигена

4. Актнвзиня нентрофнлов

5. Воспаление. JAK.-ST.VI путь

6. Воспаление, амфотернн

7. Контроль повреждения ДНК в. Позитивна я регуляция клеточного деления

9. Регуляй ня клеточного никл а. нктерликнн

10. Негативная регуляция клеточного деления

11. Адгезия клеток, интегрин 12 Воспаление, НК-клетки

13. Воспаление, роль интерферона

14. Фаг опито*

15. Воспаление, роль 1Ь-4

16. Регуляция пнтоск&тета

17. Сигнальный путь ТСГ-Ьаа

18. Клеточный никл. переходС2-М

19. Роль г ист амина в воспалении

20. Адгезия клеток, взаимодействия с участием лейкоцитов

Рисунок 4. Основные процессы, измененные в коже больных псориазом, по сравнению с кожей здоровых волонтеров

Большой интерес для нас представляло сравнение уровней экспрессии генов в пораженной части кожи больных псориазом по отношению к визуально непораженной части кожи, находящейся на расстоянии не более 3 см от пораженной псориазом кожи одного и того же больного. Такое сравнение позволяет максимально исключить влияние побочных факторов на чистоту эксперимента. Для всех генов был установлен порог изменения уровней экспрессии равный 2. Мы сравнивали данные от 4-х пациентов.

На рисунке 5 показаны первые 20 наиболее измененных процессов в пораженной коже больных в сравнении с непораженной кожей. Как видно, этими процессами являются развитие эпидермиса, кератинизация, дифференциация кератиноцитов, метаболизм липидов и другие.

10 15 20 25 30 35 40

-1од(рУа1це)

1 Развитие эпидермиса

2. Кератинизация

3. Организация и биогенез цитоскелета

4. Липидный метаболизм

5. Гомеостаз холестерола

6. Организация филаментов

7. Дифференцировна кератиноцитов

8. Негативная регуляция клеточного деления

9. Морфогенез эпителия

10. Регуляция мышечных сокращений

11. Развитие кожи

12. Иммунный ответ

13. Процесс мышечных сокращений

14. Гомеостаз ионов кальция

15. Ответ на АФК

16. Ответ на вирусную инфекцию

17. Каскад ^К-БТАТ

18. Метаболизм глюкозы

19. Клеточная адгезия

20. Импорт белка в ядро

Рисунок 5. Первые 20 наиболее измененных процессов в пораженной коже в сравнении с непораженной кожей больных псориазом.

Далее мы выдвинули гипотезу, что для изменения экспрессии больших групп координировано работающих генов, что мы можем наблюдать при псориазе, задействованных в тех или иных процессах в клетке (множество разрегулированных процессов при псориазе), необходимо, чтобы, прежде

всего, изменили свою экспрессию ключевые транскрипционные факторы, инициирующие каскадные процессы.

Нами проанализированы измененные при псориазе клеточные процессы с целью их детального описания. При этом для дальнейшего анализа мы выбрали 10 процессов с самым высоким значением величины р-уа1ие. Для визуализации генетических процессов на уровне генных сетевых взаимодействий мы использовали карты сетевых взаимодействий генов, наложив на них изменения в уровнях экспрессии генов. При этом выбирали карты взаимодействий генов, описывающие основные измененные процессы в клетке. Карты сетевых взаимодействий генов отличаются от генных сетей тем, что в них информация о генных взаимодействиях систематизирована и выстроена в соответствии с современными представлениями о конкретном молекулярно-генетическом процессе, описанном с помощью данной карты. На рисунке 6 приведены условные обозначения, используемые на картах сетевых взаимодействий генов.

<ь <1

Mí

кии азы

кнназы

протеннкнназы

липидкиназы фосфат азы

фосфат азы протат фосфат азы лшшд фосфатазы фосфолнпазы фосфолипазы

протеазы

протеазы металлопротеазы

СТР азы

С-альфа

КА8 -семейство

G бета гамма ^^ общие

^^ гетеротримеры

М

tí lí X

каналы лиганд завнстшь нон зависимые транспортеры

^ оепки

Ч факторы транс крнпцш молекулы

Афосфоляияды

-,&мемб рани ы е *)гликопротенны ^ неорганические

^Глнганды

jпростые реакции Щ метаболические

расширяемые сети ^^ глобальные

| связывающие Ь белки

Km GPCR

Í рецепторы с киназной . активностью W ядерные 9 рецепторы

митохондрии

□

не специфична

цитоплазма

внеклеточная

алпостдпместн

в СШ11ШЕ

С раагаппение

см

коватеггная модификация

с» конкуренция ну гидролиз

фосфорилированп»

" 'дефосфорширование рг гроцесшы-белка связывание в активном центре связывание в Rr регугягорном

трансформация

грансаокация

Рисунок 6. Условные обозначения, используемые на генов.

I умяич«аям | ум*ныо*км*

картах сетевых взаимодействий

На рисунке 7 приведена карта сетевых взаимодействий генов при передаче сигнала от ЕвР рецептора в клетку и изменение экспрессии ее компонентов в пораженной коже больных псориазом по сравнению с кожей здоровых волонтеров. Видно, что, хотя уровень экспрессии рецептора не изменен значительно, существенно изменен уровень экспрессии всех его лигандов (от 2 раз для ЕСБ до более чем в 30 раз для ЕГчВВ2). Также обращает на себя внимание и то, что изменена экспрессия генов, которые активируются различными путями после связывания рецептора с лигандом.

Рисунок 7. Карта сетевых взаимодействий генов при передаче сигнала от ЕСР рецептора в клетку и изменение экспрессии генов, участвующих в данном пути, в пораженной коже, в сравнении с кожей здоровых волонтеров.

На рисунке 8 показано сетевое взаимодействие генов при передаче сигнала от ЕОР рецептора (БОРЯ) в клетку и изменение экспрессии генов, участвующих в данном пути, в пораженной коже, в сравнении с непораженной. Как видно, в пораженной коже значительно изменена экспрессия только транскрипционных факторов (с-Роб, с-Мус и ЭТАТЗ, примерно в 2,5-3 раза). Если сравнить данные, представленные на рисунке 8,

с данными, представленными на рисунке 7, то мы увидим, что ни медиаторы передачи сигнала, такие как GRB2, She, SOS, h-Ras, c-RAF, MEK1/2 и др , ни лиганды, ни рецептор не изменили свою экспрессию, а активированными в пораженной коже в сравнении с непораженной остались только c-Fos, с-Мус и STAT3 Однако необходимо отметить, что, если в сравнении со здоровыми, с-М>с и c-Jun увеличивали экспрессию почти в 7 раз, то в сравнении с непораженной кожей c-Jun не изменил экспрессию, а с-Мус увеличил всего в 3 раза, c-Fos и STAT3 увеличивали экспрессию в 13 и 11 раз, соответственно, в сравнении со здоровыми и всего в 2,7-3 раза в сравнении с непораженной кожей Все это свидетельствует в пользу того, что изменения процессов метаболизма происходят не только в пораженной, но и в непораженной коже, причем непораженная кожа больных псориазом, в смысле измененных метаболических процессов, занимает промежуточное положение между кожей здоровых людей и пораженной кожей [Nickoloff and Nestle, 2004]

Мы проанализировали вышеобозначенные карты генных взаимодействий при псориазе и пришли к выводу, что во всех исследуемых процессах в качестве основных транскрипционных факторов, изменивших свою экспрессию при псориазе, присутствуют только компоненты транскрипционного фактора АР-1 и транскрипционный фактор NF-kB Фактор NF-kB, как известно, активируется при иммунных ответах и не является специфичным для псориаза, поэтому мы его исключили из генов-кандидатов

Напротив, компоненты транскрипционного комплекса АР-1 могут являться генами-кандидатами при псориазе по следующим причинам Известно, что транскрипционный фактор АР-1 представляет собой группу парных комплексов, образованных ДНК-связывающими белками, входящими в семейства Jun, Fos и ATF Фактор АР-1 обеспечивает ответ клеток на действие ростовых факторов, цитокинов, нейротрансмиттеров и других межклеточных сигнальных молекул В регуляции активности АР-1 участвуют G-белки, адаптерные белки, МАР-киназы и другие компоненты

внутриклеточных регуляторных систем. Зависимые от АР-1 гены играют важную роль в регуляции пролиферации, морфогенеза, апоптоза и дифференцировки клеток. Транскрипционный фактор АР-1 участвует в поддержании базального уровня экспрессии многих генов. Он является одной из главных мишеней для соединений, вызывающих клеточную пролиферацию или дифференцировку.

Рисунок 8. Карта сетевых взаимодействий генов при передаче сигнала от ЕСК рецептора в клетку и изменение экспрессии генов, участвующих в данном пути, в пораженной коже, в сравнении с непораженной у больных псориазом.

Известно, что АР-1 обеспечивает ответ клеток на действие различных сигнальных молекул: цитокинов, пептидных гормонов, нейротрансмиттеров, ростовых и паракринных факторов. Активация АР-1 также происходит в экстремальных для клеток условиях: при тепловом шоке, гипоксии, в присутствии ксенобиотиков и токсинов, под действием УФ-облучения и ионизирующей радиации, а также при изменении осмотического давления и динамическом воздействии на плазматические мембраны.

Все это обусловливает возможность участия генов АР-1 системы в патогенезе воспалительных барьерных заболеваний Действительно, при анализе данных экспрессионных микрочипов нами выявлено, что экспрессия генов c-Fos, c-Jun и JunB увеличена в 10-20 раз при псориазе

5.5. Анализ уровней экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора API

На основании биоинформационного анализа мы выдвинули предположение о возможной ключевой роли белков компонентов траш крипционного фактора API в развитии поражения и сравнили экспрессию генов JUNB, JUND и ATF4 в пораженной псориазом коже по сравнению с непораженной

Для анализа уровня экспрессии мы использовали метод полимеразной цепной реакции в реальном времени Обработку результатов полимеразной цепной реакции проводили методом 2"ДЛСт согласно [Livak and Schmittgen, 2001|

На рисунке 9 показано изменение уровня экспрессии генов JUNB, JUND и ATF4 в пораженной псориазом коже в сравнении с непораженной кожей этих же больных (№№ 1 -4)

Видно, что экспрессия гена JUNB в пораженной коже увеличена по сравнению с непораженной в 2,5 раза (у больного №2) и до 7 раз (у больного №1) Экспрессия гена JUND увеличена у больных №1 и №3 в 2,5 и 4,5 раза, а гена ATF4 уменьшена в 1,5 и 5 раз, соответственно У больного №2 экспрессия генов JUND и ATF4 практически не изменилась Так же на рисунке 9 показано изменение уровня экспрессии генов JUNB, JUND и A TF4 в пораженной псориазом коже в сравнении с непораженной кожей у больного №4 У этого больного экспрессия всех изучаемых генов снижена (JUNB уменьшена в 1,3 раза, JUND в 2,6 раза, ATF4 в 1,7 раза)

Рисунок 9. Изменение уровня экспрессии генов Л11УВ, JUND и АТР4 у больных псориазом в пораженной коже по сравнению с непораженной.

5.6. Идентификация новых белков, участвующих в развитии очага поражения у больных псориазом

(на базе Института биомедицинской химии РАМН) В данном исследовании мы использовали биопсии пораженной и непораженной кожи от трех пациентов больных псориазом Типа I.

После электрофореза и окрашивания гелей серебром мы идентифицировали 10 новых пятен, которые не встречались (или их интенсивность была существенно ниже) в непораженной коже и которые проявили себя в очаге поражения.

На рисунках 10 и 11 приведены электрофореграммы разделения белков в двух направлениях в пораженной и непораженной коже от одного пациента. Красной рамкой показаны пятна, которые изменены в пораженной коже по сравнению с непораженной.

3 р1 10

Рисунок 10. 20-электрофорез белков кожи, пораженной псориазом.

Пятна были вырезаны из геля 3 мм2) и белки из них были идентифицированы Белки из пятен № 1, 2, 3, 4 были идентифицированы методом МАЬБ1-ТОР масс-спектрометрии, а белки из пятен 5-10 были идентифицированы методом папоЬС-МЗ/МБ масс-спектрометрии Результаты идентификации белков приведены в таблице 3

Таблица 3 Идентифицированные белки, различающиеся в пораженной и непораженной псориазом коже__

Пятно, номер %Vol

Название белка Пораженная кожа Непораженная кожа

Кератин 17

1 Кератин 14 1,97±0,92 0,18±0,06

Кератин 16

2 SCCA2/SCCA1 0,28±0,09 0,066±0,02

3 Антиген чешуйчатой клеточной карциномы, SCC antigen 0,35±0,18 0,03±0,01

4 Енолаза 1 0,87±0,22 0,40±0,14

5 Супероксиддисмутаза [Мп] 0,22±0,03 0,11±0,02

6 Галлектин 7, Gal-7 1,14±0,41 0,19±0,01

7 Белок SI00-А9 0,54±0,03 0

8 Белок S100-A9 0,15±0,07 0

9 Белок S100-A7 (Псориазин, Psonasin) 0,51±0,16 0

10 Белок S100-A7 (Псориазин, Psonasin) 1,36±0,37 0,02±0,03

Заключение

В этом разделе представлены полученные в работе результаты, а также приводятся новые литературные данные, свидетельствующие о возможных новых механизмах регуляции патогенетического процесса при псориазе

Выводы

1 Проведенный биоинформационный анализ сетевых взаимодействий генов позволил отобрать гены, кодирующие белки-компоненты транскрипционного фактора АР-1, как возможные гены, влияющие на развитие патологического процесса при псориазе

2 Показано, что в отличие от корреляции скорости ацетилирования с предрасположенностью к другому многофакторному заболеванию системной красной волчанке, нами не показана ассоциация между псориазом и скоростью ацетилирования Тем не менее, полиморфное сочетание 282С/Т 341 С/С 481 С/Т 5900/А 803АЮ 857А/А показало ассоциацию с заболеванием

3 Определение соотношения транскриптов генов ВАХ/ВСЬ2 до и после успешного лечения у больных псориазом дает основание считать, что это соотношение может быть маркером степени тяжести псориатического процесса

4 Проведено количественное измерение экспрессии генов Л1ЫВ, ЛМО и А ТР-4 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени, в результате чего было экспериментально показано изменение экспрессии данных генов в пораженной псориазом коже

5 С помощью протеомного анализа образцов псориатической кожи установлены 10 маркерных белков, присутствующих только в пораженной коже Данные белки могут рассматриваться как потенциальные мишени действия фармакологических препаратов при лечении псориаза

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 С А Брускин. М К Саркисова, Ан Л Пирузян Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и индиЕ.идуалыюй фармакотерапии Материалы Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» Минск С 219-221 2004

2 ИВ Голденкова, Ан Л Пирузян, М К Саркисова, С А Брускин. Р М Абдеев, А Махулаева, И М Корсунская Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и

индивидуальной фармакотерапии кожных заболеваний на примере витилиго и псориаза, Материалы III Съезда генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития», ТI С 63 , Москва , 2004

3 С А Брускин. А С Глотов, Т В Наседкина, Л А Радкевич, И В Голденкова Разработка микрочипа быстрого скрининга генотипа и установления фенотипа ацетилирования для метаболической и генетической паспортизации человека с целью ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии, 1Т+М&Ес'2005, С 201-204 Гурзуф, Украина, 2005

4 Кожекбаева Ж М , Глотов А С , Брускин С А , Голденкова И В , Пирузян Э С , Заседателев А С , Наседкина Т В Разработка биочипа для определения аллельных вариантов NAT2 гена VI Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», С 76, Звенигород, 2005

5 С А Брускин, А В Марахонов, И В Голденкова-Павлова, Э С Пирузян Термостабильные ферменты для наработки новых терапевтических и профилактических препаратов и диагностических систем, Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов», С 537-542 , Алушта, 2006

6 ИМ Корсунская, Л В Егоренкова, Э С Пирузян, С А Брускин. Р М Абдеев, И В Голденкова-Павлова, Л Т Тогоева, С С Олейник, Ан Л Пирузян Роль системы апоптоза в патогенезе псориаза Клиническая дерматология и венерология №6, С 13-17, 2006

7 ИВ Голденкова-Павлова, С А Брускин. Р М Абдеев, Е В Маркарова, С Г Бигвава, Л А Радкевич, X А Курданов, Ж М Кожекбаева, А С Глотов, О А Гра, А С Заседателев, Т В Наседкина, Э С Пирузян Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у человека Генетика Т 42 № 8 с 14431450, 2006

8 С А Брускин. Ж М Кожекбаева, Т В Наседкина, И В Голденкова-Павлова Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у человека, Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», С 21, Москва, 2006

9 Z М Kozhekbaeva, О A Gra, A S Glotov, I V Goldenkova-Pavlova, S A Bruskin. E V Markarova, E S Piruzyan, T V Nasedkina N-acetyltransferase 2 (NAT2) gene polymorphisms in psoriasis and colon cancer patients from the Moscow population// Supplementary of Eur J Hum Genet Nice France, June 16-19 2007

10 Ж М Кожекбаева, А С Глотов, О А Гра, И В Голденкова-Павлона, С А Брускин. Е Е Агафонова, Е В Маркарова, Р М Абдеев, И М Корсунская, Ан. JI Пирузян, В Е Барский, А. С Заседатедев, Т В Наседкина Определение точечных мутаций гена NAT2 с помощью биологических микрочипов// Молекулярная биология №41, стр 725-733, 2007

11 Э С Пирузян, Т,А Никольская, Р М Абдеев, С А Брускин АР-1 система транскрипционных факторов как гены-кандидаты при псориазе// Молекулярная биология т 41, С 1069-1080, 2007

12 Брускин С А . Абдеев РМ, Пирузян ЭС Изучение изменения соотношения мРНК генов BAX/BCL-2 в коже больных псориазом Приложение к журналу "Открытое образование" Материалы XV Международной конференции и дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" 1Т^М&Ес'2007 Украина, Крым, Ялта-Гурзуф С 47-49, 2007

13 R М Abdeev, S A Brouskin. Т A Nikolskaya, Е S Piruzian Survey of psoriasis candidate genes by using biomfirmatics In Abstract Book of Four Internationa! Symposium on Computational Methods m Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources Russia, Moscow, p 71,2007

14 S A Brouskin. RM Abdeev, ТА Nikolskaya, ES Piruzian Companson of psoriasis and Crohn's disease pathological processes at the level of gene network interactions by bioinformatics methods In Abstract Book of Four International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources Russia, Moscow, p 86, 2007

15 S A Bruskm. R M Abdeev, S A Moshkovsky, I M.Korsunskaya, E S Piruzyan Study of protein profiles in psoriatic plaques and healthy skin//Abstr book 6th Annual Cytokines and Inflammation Conf, 28-29 January, Orlando, USA 2008

15 С А Брускин. И В Голденкова-Павлова, И М Корсунская, Ан JI Пирузян Патент №2311643 от 06/04/2006 «Способ оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом»

17 Корсунская И М , Брускин С А , Ан JI Пирузян, Абдеев Р М Патент по заявке 049747 от 21 декабря 2006 г «Способ оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом»

Подписано в печать 17 01 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 11 Тираж 100 экз

Тшкярафия «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Брускин, Сергей Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ПСОРИАЗ: ХАРАКТЕРИСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЯ И ГЕНЕТИКА ПАТОЛОГИИ.

1.1. Клиническая характеристика заболевания.

1.2. Эпидемиология псориаза.

1.3. Генетика псориаза.

1.4. Наследование псориаза.

1.5. Рабочая модель иммунопатогенеза псориаза.

1.6. Триггеры внешней среды.

Глава 2. N-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА.

2.1. Гены, кодирующие N-ацетилтрансферазы человека.

2.2. Фенотип ацетилирования.

• 2.3. Полиморфизм гена NAT2.

2.4. Ассоциация фенотипа ацетилирования с различными многофакторными заболеваниями.

Глава 3. ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР АР-1.

3.1. Характеристика транскрипционного фактора АР-1.

3.2. Кожа как система для изучения регуляции и функций АР-1.

3.3. Регуляция АР-1.

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Определение фенотипа ацетилирования.

4.2. Выделение ДНК из крови.

4.3. Разработка микрочипа быстрого скрининга генотипа и установления фенотипа ацетилирования у больных псориазом.

4.4. Определение генотипа ацетилирования на микрочипах.

4.5. Мультиплексная полимеразная цепная реакция.

4.6. Гибридизация меченого ПЦР-продукта на микрочипе.

4.7. Забор, хранение и гомогенизация образцов кожи.

4.8. Выделение РНК кисло-фенольным методом.

4.9. Выделение РНК на колонках Qiagen.

4.10. Обратная транскрипция.

4.11. Полуколичественная полимеразная цепная реакция.

4.12. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

4.13. Определение активности каспазы-3 в образцах кожи колориметрическим методом.

4.14. Определение содержания белка р53 в образцах кожи методом Вестерн-блот гибридизации.

4.15. Экстракция белков для изофокусировки и электрофореза.

4.16. Двумерный электрофорез.

4.17. Анализ изображений.

4.19. Идентификация белков.

4.20. Процедуры молекулярного клонирования.

4.21. Биоинформационный анализ и базы данных.

4.22. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Сравнительное изучение фенотипа ацетилирования и полиморфизма гена NAT2.

5.2. Полиморфизм гена NAT2 и его ассоциация с псориазом.

5.3. Изменение некоторых апоптических медиаторов и эффекторов в коже у больных псориазом.

5.4. Компоненты транскрипционного фактора АР-1 как гены - кандидаты при псориазе.

5.5. Анализ уровней экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора АР

5.6. Идентификация новых белков, участвующих в развитии очага поражения у больных псориазом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск, идентификация и изучение экспрессии генов-кандидатов псориатического процесса"

Псориаз - заболевание кожи, является сложной генетически обусловленной патологией, в проявлении которой задействованы большие группы (сети) взаимодействующих генов/белков. При этой патологии запуск патологического процесса происходит внешними триггерами окружающей среды (психо - эмоциональные стрессы, инфекции и пр.). Патология на данный момент неизлечима, а лечение направлено на увеличение периодов ремиссии и на снижение тяжести болезни. В среднем псориазом страдает 3% мирового населения, причем имеется четкая регионально-этническая дифференциация распространенности заболевания с пиком среди европеоидных этнических групп. Псориаз редко приводит к летальному исходу, однако существенно влияет на качество жизни пациентов и часто приводит к инвалидности. В последнее время псориазом болеет все больше молодежи, что впоследствии скажется на потере трудоспособности части взрослого населения России, поэтому необходимо уже сейчас начинать разработку эффективных терапий и ранней диагностики псориаза.

Развитие любого мультифакторного заболевания обусловлено двумя основными детерминантами - генетической предрасположенностью и запускающими заболевание триггерами. Локусы, связанные с псориазом, локализованы, по крайней мере, на 8 различных хромосомах и обозначаются как PSORS (Psoriasis Susceptibility) PSORS1 - PSORS9.

Важным является вопрос, касающийся роли триггеров внешней.среды в патогенезе мильтифакторных заболеваний. Некоторые из данных триггеров (например, инфекции) могут приводить к различному уровню экспрессии цитокинов у различных индивидуумов. Другие могут влиять на эпигенетические модификации (например, возможно опосредованные RUNX).

Псориаз может быть спровоцирован стимулами внешней среды, такими как инфицирование стрептококком, повреждение (феномен Кебнера), стресс (нейропептиды), курение и алкоголь.

Характер питания и лекарственные препараты также могут провоцировать многофакторные заболевания- Среди токсинов N-нитросоединения являются основными кандидатами на роль триггеров многофакторных заболеваний. Поэтому является важным изучение полиморфизма генов системы биотрансформации ксенобиотиков.

Так как псориаз обусловлен разрегулированной работой генетического аппарата, то эффективным методом в разработке подходов для диагностики, лечения и создания лекарственных препаратов является? поиск критических звеньев патологического процесса, а именно, генов-кандидатов и соответствующих белковых продуктов. Если генетические исследования много факторных заболеваний продвинулись в достаточной: степени? как в России, так и за рубежом, то применение постгеномных технологий с целью выявления биомаркеров и исследования патогенеза данной патологии остаются задачей ближайшего будущего. К настоящему моменту, по существу, не опубликовано работ по комплексному использованию транскриптомики и протеомики для изучения псориаза. Благодаря стремительному развитию геномных и постгеномных технологий, пользуясь литературными источниками и базами данных, можно выделить известные ассоциированные с данными патологиями гены, на основании компьютерных исследований, составить карты и сети, содержащие гены-кандидаты, и выделить подпроцессы, которые могут являться критическими в развитии патологий. Далее необходимо это экспериментально проверить с помощью стандартных молекулярно-биологических методов.

Цель работы: провести поиск, выявить и изучить экспрессию генов-кандидатов при псориазе.

Задачи:

1. Изучить возможную ассоциацию ферментов систем деградации ксенобиотиков у больных псориазом, на примере гена NAT2.

2. Изучить изменение экспрессии генов В АХ, BCL-2, CASP3 и TP 53 при псориазе.

3. С использованием методов информационной биологии определить круг генов-кандидатов патогенеза при псориазе.

4. Проанализировать уровни экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора API в пораженной псориазом коже.

5. Идентифицировать белки, участвующие в развитии очага поражения у больных псориазом.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Брускин, Сергей Александрович

выводы

1. Проведенный биоинформационпый анализ сетевых взаимодействий генов позволил отобрать гены, кодирующие белки-компоненты транскрипционного фактора АР-1, как возможные гены, влияющие на развитие патологического процесса при псориазе.

2. Показано, что в отличие от корреляции скорости ацетилирования с предрасположенностью к другому многофакторному заболеванию системной красной волчанке, нами не показана ассоциация между псориазом и скоростью ацетилирования. Тем не менее, полиморфное сочетание 282С/Т 341 С/С 481 С/Т 590G/A 803A/G 857А/А показало ассоциацию с заболеванием.

3. Определение соотношения транскриптов генов BAX/BCL2 до и после успешного лечения у больных псориазом дает основание считать, что это соотношение может быть маркером степени тяжести псориатического процесса.

4. Проведено количественное измерение экспрессии генов JUNB, JUND nATF-4 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени, в результате чего было экспериментально показано изменение экспрессии данных генов в пораженной псориазом коже.

5. С помощью протеомного анализа образцов псориатической кожи установлены 10 маркерных белков, присутствующих только в пораженной коже. Данные белки могут рассматриваться как потенциальные мишени действия фармакологических препаратов при лечении псориаза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Заболевания с наследственной предрасположенностью делят на две группы: моногенные и полигенные. Моногенные заболевания развиваются вследствие изменений лишь в одном гене, которые приводят к возникновению патологического процесса. Как правило, ген, вовлеченный в патогенез моногенных заболеваний, достаточно легко идентифицируется и для успешного лечения таких болезней одно и тоже лекарство можно применять для всех индивидуумов. Однако такой подход не применим для лечения сложных, называемых также многофакторными, патологий, в развитии которых участвует целый ряд генов, полиморфные варианты которых определяют риск и тяжесть заболевания.

Изучение этиологии, патогенеза, а также генетический анализ многофакторных заболеваний - трудные задачи. Ввиду того, что такие патологии обусловлены сочетанным влиянием многих аллеломорфов разных локусов, наблюдается широкий полиморфизм патологических состояний, т.е. наблюдается непрерывный спектр переходов от субклинических форм к формам с ярко выраженными клиническими симптомами. Истинная тяжесть заболевания определяется индивидуальной клинической картиной пациента, которая обусловлена уникальностью процессов метаболизма каждого индивидуума, определяемой его генетическим статусом.

Поиски генетических маркеров, наличие которых в организме обусловливает восприимчивость организма человека к определенному заболеванию, ведутся на протяжении не одного десятка лет и имеют большое значение. Это объясняется тем, что только генетический подход позволяет приблизиться к пониманию биологической сущности заболеваний, а получаемые при таком подходе данные дают возможность выделять группы риска развития исследуемой патологии. При этом следует принимать во внимание и индивидуальный полиморфизм генов, продукты которых могут и не иметь прямого отношения к данной патологии, а именно, индивидуальные генетические особенности организма, определяющие кинетику метаболических превращений лекарственных препаратов, и, следовательно, гетерогенность в реакции пациентов на лекарственные препараты, а также в отношении побочных эффектов лекарственных препаратов. Факторы индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов, как и факторы индивидуальной предрасположенности человека к различным заболеваниям, требуют разработки научных основ для определения критериев соответствующей лекарственной терапии для каждого отдельного пациента.

Многофакторные хронические воспалительные заболевания, затрагивающие барьерные органы, к числу которых относятся псориаз, атопический дерматит, болезнь Крона, астма и другие, хотя и различаются в отношении их общей патофизиологии, тем не менее, обладают некоторыми общими ключевыми характеристиками, включающими рецидивность воспаления и пораженные органы. Более того, области генетического сцепления, которые были идентифицированы в независимых исследованиях, часто перекрываются.

В наших исследованиях в качестве модельной многофакторной патологии выступает заболевание псориаз. Оно имеет все атрибуты многофакторной патологии - запускается триггерами внешней среды у индивидуумов с генетической предрасположенностью. Основные направления молекулярно-генетических исследований патогенеза этого заболевания заключены в идентификации ключевых генов патогенеза и соответствующих им белков, как основных мишеней для разработки новых подходов к лечению.

Проведенное исследование показало, что фенотип ацетилирования зависит от генотипа Ы-ацетилтрансферазы-2, установлена связь между полиморфизмом гена и активностью фермента NAT2. Также мы показали возможность использования полученного в сотрудничестве с Центром биологических микрочипов ИМБ РАН биологического микрочипа для определения генотипа NAT2 и предсказания соответствующего ему фенотипа. Хотя нам не удалось выявить ассоциации между фенотипом ацетилирования и риском развития заболевания (доля медленных ацетиляторов в группе больных и здоровых достоверно не различалась), мы, тем не менее, выявили ассоциацию с полиморфным сочетанием 282С/Т 341 С/С 481 С/Т 590G/A 803A/G 857А/А в гене NAT2, р<0.01)

На основании произведенного нами анализа литературных данных мы предположили о возможном изменении экспрессии ряда генов, которые являются основными медиаторами или эффекторами апоптоза. В, числе этих генов: В АХ, BCL-2, CASP-3 и TP 53. Определение уровня экспрессии этих генов мы проводили в пораженной коже больных псориазом до и после лечения пациента. Лечение проводилось препаратом «Глутоксим®» с иммуномодулирующим действием.

В группе больных псориазом с эффективным лечением, соотношение мРНК генов BAXIBCL-2 в пораженной коже в сравнении с этим же участком после успешного лечения изменилось достоверно (р<0.01). Это говорит о том, что данный параметр может являться достаточно эффективным критерием как состояния патологического процесса, так и эффективности лечения.

Каспаза-3, как уже отмечалось ранее, является одной из ключевых эффекторых каспаз. Активность каспазы-3 у различных больных псориазом индивидуальна и не выявляет никакой закономерности.

На основании произведенного нами анализа литературных данных и баз данных мы идентифицировали ряд генов, которые в контексте с вышеизложенным представляются важными для исследования. В их числе

114 гены, кодирующие транскрипционный фактор АР-1 (C-JUN, JUNB, JUND, C-FOS, FOSB, FRA-1 и FRA-2 и др.)- Идентификация белков, кодируемых перечисленными генами, является важным аспектом проводимых в настоящее время исследований в связи с тем, что именно они являются основными мишенями для разработки новых подходов к лечению псориаза.

С помощью метода ПЦР в реальном времени мы показали увеличение экспрессии генов JUNB и JUND в коже больных псориазом. Это говорит о том, что данный параметр может являться достаточно эффективным критерием как состояния патологического процесса, так и эффективности лечения.

С помощью протеомного анализа образцов псориатической кожи были установлены 10 маркерных белков, присутствующих только в пораженной коже и отсутствующие в непораженной коже у больных псориазом. Данные белки могут рассматриваться как потенциальные мишени действия фармакологических препаратов при лечении псориаза.

Теория цитокиновой сети, для объяснения возникновения псориаза, сформулирована свыше 15ти лет назад [Nickoloff, 1991]. Согласно этой теории, именно цитокины, а не другие, небелкового типа медиаторы воспаления, такие как эйкозаноиды, руководят многоклеточными взаимодействиями, которые происходят среди различных иммуноцитов, таких как дендритные клетки и Т-клетки, а также перекрестным взаимодействие между иммуноцитами и эпидермальными кератиноцитами, что в итоге приводит к образованию псориатической бляшки. В новых работах того же автора [Nickoloff, 2007] сообщается, что псориаз является результатом взаимодействий между иммунными клетками и кератиноцитами в коже. Природа этих сигналов стала в настоящее время более понятной, выявилась потенциальная роль IL-23 и Thl7 ответов.

В настоящее время па новых моделях начинают выявляться механизмы регуляции патогенеза зависимых от Т-клеток хронических воспалительных заболеваний [Sugiyama et al, 2005] постулируется, что помимо адаптивной

115 иммунной системы, клетки врожденной иммунной системы, включающие нейтрофилы, моноциты, макрофаги, антиген-презентирующие клетки и Т лимфоциты, а также натуральные киллеры, также вовлечены в патогенетические пути при псориазе [Bos et al, 2005; Gaspari et al, 2006].

В последние годы основное внимание уделялось разработке адекватных моделей, на которых в настоящее время ведутся работы по идентификации этапов развития псориатического процесса. Это различные трансгенные, накаутированные или реконструированные модели, например иммунодефицитные SCID (Severe combined, immunodeficiency) - мыши с трансплантированной на них вовлеченной (с видными поражениями) или невовлеченной (без визуальных поражений) псориатической кожей. [Gudjonsson et al, 2007]. Несмотря на определенные ограничения, эти модели позволяют отразить ряд аспектов псориатического процесса.

Таким образом, если ранее изучение псориаза заключалось в измерении параметров клеточных инфильтратов, то в настоящее время начинается новый уровень исследований, направленных на изучение молекулярных путей патогенеза при псориазе и идентификацию белковых мишений для фармакологического эффекта. В этих исследованиях важнейшее значение имеет выявление механизмов регуляции экспрессии всех генов, задействованных в сложной сети, участвующей в развитии псориатического процесса.

Недавно открытые новые регуляторные механизмы в патогенезе хронических воспалительных кожных заболеваний свидетельствуют о сложности регуляции экспрессии генов, вовлеченных в патогенез [Sonkoly et al, 2007].

Среди псориаз-специфических микроРНК, т.е. miRNAs, со сверхэкспрессией при псориазе, идентифицирована кератиноцит -специфическая miRNA (miR - 203) и лейкоцит - специфическая miRNA (miR - 146). В панели из 21 различных органов и тканей человека, miR - 203 проявляет высокую специфичность экспрессионных профилей именно в коже.

Эти результаты свидетельствуют о том, что нарушение регуляция на уровне микроРНК также вовлекается в патогенез псориаза и вносит свой вклад в дисфункцию взаимодействия между резидентными и инфильтрирующими клетками в коже.

Данные, полученные нами при анализе экспрессии генов-кандидатов патогенеза при псориазе, могут способствовать идентификации новых мишеней лекарственных препаратов для лечения заболевания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брускин, Сергей Александрович, Москва

1. Akerblom Н. К., Vaarala О., Hyoty Н., Iloncn J. and Knip М. (2002). Environmental factors in the etiology of type 1 diabetes.// Am J Med Genet.-V.115(1).- P.18-29.

2. Angel P, Imagawa M, Chiu R, Stein B, Imbra RJ, Rahmsdorf HJ, Jonat C, Herrlich P, Karin M. (1987) Phorbol ester-indueible genes contain a common cis element recognized by a TPA-modulated trans-acting factor.// Cell.-V.49(6).-P.729-39.

3. Angel P, Karin M. (1991). The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation.// Biochim Biophys Acta.- V. 1072(2-3).-P.129-157.

4. Angel P, Szabowski A, Schorpp-Kistner M. (2001) Function and regulation of AP-1 subunits in skin physiology and pathology.// Oncogene.-V.20(19).-P.2413-23.

5. Angel P, Szabowski A. (2002) Function of AP-1 target genes in mesenchymal-epithelial cross-talk in skin.// Biochem Pharmacol.- V.64(5-6).-P.949-56.

6. Bach J. F. (2002). The effect of infections on susceptibility to autoimmune and allergic diseases.// N Engl J Med.- V.347(12).- P.911-20.

7. Baer A. N., Woosley R. L. and Pincus T. (1986). Further evidence for the lack of association between acetylator phenotype and systemic lupus erythematosus.// Arthritis Rheum.- V.29(4).- P.508-14.

8. Barker J. N. (2001). Genetic aspects of psoriasis.// Clin Exp Dermatol.- V.26(4).- P.321-5.

9. Bhalerao J. and Bowcock A. M. (1998). The genetics of psoriasis: a complex disorder of the skin and immune system.// Hum Mol Genet.- V.7(10).-P.1537-45.

10. Bigler C. F., Norris D. A., Weston W. L. and Arend W. P. (1992). Interleukin-1 receptor antagonist production by human keratinocytes.// J Invest Dermatol.- V.98(l).- P.38-44.

11. Bonifati C, Ameglio F. (1999) Cytokines in psoriasis.// Int J Dermatol.- V.38(4).-P.241-51.

12. Bos J. D. and De Rie M. A. (1999). The pathogenesis of psoriasis: immunological facts and speculations.// Immunol Today.- V.20(l).- P.40-6.

13. Bos JD, de Rie MA, Teunissen MB, Piskin G. (2005) Psoriasis: dysregulation of innate immunity. //Br J Dermatol.- V.152(6).-P.1098-107.

14. Bowcock A. M. and Cookson W. O. (2004). The genetics of psoriasis, psoriatic arthritis and atopic dermatitis.// Hum Mol Genet.- V.13 Spec No 1.-P.R43-55.

15. Bradford M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.// Anal Biochem.- V.72.- P.248-54.

16. Brandrup F. (1984). Psoriasis in first-degree relatives of psoriatic twins.// Acta Derm Venereol.- V.64(3).- P.220-6.

17. Broder S. and Venter J. C. (2000). Whole genomes: the foundation of new biology and medicine.// Curr Opin Biotechnol.- V.l 1(6).- P.581-5.

18. Burden A. D., Javed S., Bailey M., Hodgins M., Connor M. and Tillman D. (1998). Genetics of psoriasis: paternal inheritance and a locus on chromosome 6p.// J Invest Dermatol.- V.l 10(6).- P.958-60.

19. Capon F., Dallapiccola B. and Novelli G. (2000). Advances in the search for psoriasis susceptibility genes.// Mol Genet Metab.- V.71(l-2).- P.250-5.

20. Capon F., Munro M., Barker J. and Trembath R. (2002). Searching for the major histocompatibility complex psoriasis susceptibility gene.// J Invest Dermatol.- V.l 18(5).- P.745-51.

21. Carroll J. M., Romero M. R. and Watt F. M. (1995). Suprabasal integrin expression in the epidermis of transgenic mice results in developmental defects and a phenotype resembling psoriasis.// Cell.- V.83(6).- P.957-68.

22. Cascorbi I., Brockmoller J., Mrozikiewicz P. M., Muller A. and Roots I. (1999). Arylamine N-acetyltransferase activity in man.// Drug Metab Rev.-V.31(2).- P.489-502.

23. Chen L, Glover JN, Hogan PG, Rao A, Harrison SC. (1998) Structure of the DNA-binding domains from NFAT, Fos and Jun bound specifically to UNA.// Nature.- V.392(6671).-P.42-8.

24. Chen L., Glover J. N., Hogan P. G., Rao A. and Harrison S. C. (1998). Structure of the DNA-binding domains from NFAT, Fos and Jun bound specifically to UNA.// Nature.- V.392(6671).- P.42-8.

25. Chinenov Y, Kerppola TK. (2001) Close encounters of many kinds: Fos-Jun interactions that mediate transcription regulatory specificity.// Oncogene.-V.20(19).- P.2438-52.

26. Curran T, Peters G, Van Beveren C, Teich NM, Verma IM. (1982) FBJ murine osteosarcoma vims: identification and molecular cloning of biologically active proviral DNA. //J Virol.- V.44(2).-P.674-82.

27. Daly A. K. (2003). Pharmacogenetics of the major polymorphic metabolizing enzymes.// Fundam Clin Pharmacol.- V.17(l).- P.27-41.

28. Danese S., Sans M. and Fiocchi C. (2004). Inflammatory bowel disease: the role of environmental factors.// Autoimmun Rev.- V.3(5).- P.394-400.

29. Duffy D. L., Spelman L. S. and Martin N. G. (1993). Psoriasis in Australian twins.// J Am Acad Dermatol.- V.29(3).- P.428-34.

30. Elder J. Т., Nair R. P., Guo S. W., Henseler Т., Christophers E. and Voorhees J. J. (1994). The genetics of psoriasis.// Arch Dermatol.- V. 130(2).-P.216-24.

31. Evans W. E. and Johnson J. A. (2001). Pharmacogenomics: the inherited basis for interindividual differences in drug response.// Annu Rev Genomics Hum Genet.- V.2.- P.9-39.

32. Farber E. M., Nail M. L. and Watson W. (1974). Natural history of psoriasis in 61 twin pairs.// Arch Dermatol.- V. 109(2).- P.207-11.

33. Gaspari AA. (2006) Innate and adaptive immunity and the pathophysiology of psoriasis. //J Am Acad Dermatol.- V.54(3 Suppl 2).-P.S67-80.

34. Gilbert S. Omenn A. G. M. (2003). Integration of Pharmacogenomics into Medical Practice. Pharmacogenomics. A. R. Mark: 135-161.

35. Grant D. M., Hughes N. C., Janezic S. A., Goodfellow G. H., Chen H. J., Gaedigk A., Yu V. L. and Grewal R. (1997). Human acetyltransferase polymorphisms.// Mutat Res.- V.376(l-2).- P.61-70.

36. Groves R. W., Mizutani H., Kieffer J. D. and Kupper T. S. (1995). Inflammatory skin disease in transgenic mice that express high levels of interleukin 1 alpha in basal epidermis.// Proc Natl Acad Sci U S A.- V.92(25).- P. 11874-8.

37. Gruaz-Chatellard D., Baumberger C., Saurat J. H. and Dayer J. M. (1991). Interleukin 1 receptor antagonist in human epidermis and cultured keratinocytes.// FEBS Lett.- V.294(l-2).- P. 137-40.

38. Gudjonsson JE, Johnston A, Dyson M, Valdimarsson H, Elder JT. (2007) Mouse models of psoriasis.// J Invest Dermatol.- V.127(6).-P. 1292-308.

39. Guillaudeux Т., Janer M., Wong G. K., Spies T. and Geraghty D. E. (1998). The complete genomic sequence of 424,015 bp at the centromeric end of the HLA class I region: gene content and polymorphism.// Proc Natl Acad Sci U S A.- V.95(16).- P.9494-9.

40. Gunnarsson I., Kanerud L., Pettersson E., Lundberg I., Lindblad S. and Ringertz B. (1997). Predisposing factors in sulphasalazine-induced systemic lupus erythematosus.// Br J Rheumatol.- V.36(10).- P. 1089-94.

41. Hagmeyer BM, Angel P, van Dam H. (1995) Modulation of AP-1/ATF transcription factor activity by the adenovirus-ElA oncogene products.// Bioessays.- V.17(7).-P.621-9.

42. Hazzalin С A, Mahadevan LC. (2002) MAPK-regulated transcription: a continuously variable gene switch?//Nat Rev Mol Cell Biol.- V.3(l).-P.30-40.

43. Hess J, Angel P, Schorpp-Kistner M. (2004) AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings.// J Cell Sci.- V.l 17(Pt 25).-P.5965-73.

44. Hill CS, Wynne J, Treisman R. (1994) Serum-regulated transcription by serum response factor (SRF): a novel role for the DNA binding domain. //EMBO J.- V. 13(22).-P.5421-32.

45. Horrocks C., Holder J. E., Berth-Jones J. and Camp R. D. (1997). Antigen-independent expansion of T cells from psoriatic skin lesions: phenotypic characterization and antigen reactivity.// Br J Dermatol.- V. 137(3).- P.331-8.

46. Jones D. A., Yawalkar N., Suh K. Y., Sadat S., Rich B. and Kupper T. S. (2004). Identification of autoantigens in psoriatic plaques using expression cloning.//J Invest Dermatol.- V. 123(1).- P.93-100.

47. Karin M, Liu Z, Zandi E. (1997). AP-1 function and regulation.// Curr Opin Cell Biol.- V.9(2).-P.240-246.

48. Karin M. (1995) The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. //J Biol Chem.- V.270(28).-P. 16483-6

49. Kastan M. В., Zhan Q., el-Deiry W. S., Carrier F., Jacks Т., Walsh W.

50. V., Plunkett B. S., Vogelstein B. and Fornace A. J., Jr. (1992). A mammalian cell125cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia.// Cell.- V.71(4).- P.587-97.

51. Kato R. and Yamazoe Y. (2000). History of drug metabolism research in Japan.// Drug Metab Rev.- V.32(l).- P.45-79.

52. Kormeili Т., Lowe N. J. and Yamauchi P. S. (2004). Psoriasis: immunopathogenesis and evolving immunomodulators and systemic therapies; U.S. experiences.// Br J Dermatol.- V.151(l).- P.3-15.

53. Krishnan B. R., Jamry I. and Chaplin D. D. (1995). Feature mapping of the HLA class I region: localization of the POU5F1 and TCF19 genes.// Genomics.- V.30(l).- P.53-8.

54. Krueger J. G. (2002). The immunologic basis for the treatment of psoriasis with new biologic agents.// J Am Acad Dermatol.- V.46(l).- P. 1-23; quiz 23-6.

55. Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature.- V.-227(5259).P.680-5.

56. Lander E. and Kruglyak L. (1995). Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporting linkage results.// Nat Genet.-V.ll(3).- P.241-7.

57. Lee W, Mitchell P, Tjian R. (1987) Purified transcription factor AP-1 interacts with TPA-inducible enhancer elements.// Cell.- V.49(6).-P.741-52.

58. Liu Y, Krueger JG, Bowcock AM. (2007) Psoriasis: genetic associations and immune system changes.// Genes Immun.- V.8(l).-P.l-12.

59. Livak KJ, Schmittgen TD. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.// Methods.- V.25(4).-P.402-8.

60. Lomholt G. (1954). Psoriasis on the Faroe Islands; a preliminary report.// Acta Derm Venereol.- V.34(l-2).- P.92.

61. Luger ТА, Schwarz T. (1990) Evidence for an epidermal cytokine network. //J-Invest Dermatol.- V.95(6Suppl).-P.100S-104S.

62. Maas-Szabowski N, Shimotoyodome A, Fusenig NE. (1999) Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. /Я Cell Sci.- V.l 12(Pt 12).-P.l843-53.

63. Mallon E. and Bunker С. B. (2000). HIV-associated psoriasis.// AIDS Patient Care STDS.- V.14(5).- P.239-46.

64. Matthews D., Fry L., Powles A., Weber J., McCarthy M., Fisher E., Davies K. and Williamson R. (1996). Evidence that a locus for familial psoriasis maps to chromosome 4q.// Nat Genet.- V.14(2).- P.231-3.

65. Mease P. J., Goffe B. S., Metz J., VanderStoep A., Finck B. and Burge D. J. (2000). Etanercept in the treatment of psoriatic arthritis and psoriasis: a randomised trial.// Lancet.- V.356(9227).- P.385-90.

66. Mechta-Grigoriou F, Gerald D, Yaniv M. (2001) The mammalian Jun proteins: redundancy and specificity. //Oncogene.- V.20(19).-P.2378-89

67. Mohrenweiser H. W. (2003). Pharmacogenomics: Pharmacology and Toxicology in the Genomics Era. Pharmacogenomics. A. R. Mark: 29-49.

68. Nacak M., Aynacioglu A. S., Filiz A., Cascorbi I., Erdal M. E., Yilmaz N., Ekinci E. and Roots I. (2002). Association between the N-acetylation genetic polymorphism and bronchial asthma.// Br J Clin Pharmacol.- V.54(6).-P.671-4.

69. Nickoloff B. J. (1991). The cytokine network in psoriasis.// Arch Dermatol.- V. 127(6).- P.871-84.

70. Nickoloff B. J. and Wrone-Smith T. (1998). Superantigens, autoantigens, and pathogenic T cells in psoriasis.// J Invest Dermatol.- V. 110(4).-P.459-60.

71. Nickoloff B. J., Nestle F. O. (2004). Recent insights into the immunopathogenesis of psoriasis provide new therapeutic opportunities.// J Clin Invest.- V.l 13(12).- P. 1664-75.

72. Nickoloff B. J., Schroder J. M., von den Driesch P., Raychaudhuri S. P., Farber E. M., Boehncke W. H., Morhenn V. В., Rosenberg E. W., Schon M. P. and Holick M. F. (2000). Is psoriasis a T-cell disease?// Exp Dermatol.- V.9(5).-P.359-75.

73. Nickoloff BJ, Qin JZ, Nestle FO. (2007) Immunopathogenesis of psoriasis.// Clin Rev Allergy Immunol.- V.33(l-2).-P.45-56.

74. Obermayer-Straub P., Strassburg C. P. and Manns M. P. (2000). Autoimmune hepatitis.// J Hepatol.- V.32(l Suppl).- P. 181-97.

75. Ockenfels H. M. (2003). Trigger factors for psoriasis.// Hautarzt.-V.54(3).- P.215-23.

76. Ortonne J. P. (1999). Recent developments in the understanding of thepathogenesis of psoriasis.// Br J Dermatol.- V.140 Suppl 54.- P. 1-7.128

77. Peters В. P., Weissman F. G. and Gill M. A. (2000). Pathophysiology and treatment of psoriasis.// Am J Health Syst Pharm.- V.57(7).- P.645-59; quiz 660-1.

78. Plumbe S. (1824). Practical treatise on desease of the skin // Underwood. London.-.

79. Prinz J. C. (2001). Psoriasis vulgaris~a sterile antibacterial skin reaction mediated by cross-reactive T cells? An immunological view of the pathophysiology of psoriasis.// Clin Exp Dermatol.- V.26(4).- P.326-32.

80. Reddy SP, Mossman ВТ. (2002) Role and regulation of activator protein-1 in toxicant-induced responses of the lung.// Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.- V.283(6).-P.L1161-78.

81. Reidenberg M. M., Levy M., Drayer D. E., Zylber-Katz E. and Robbins W. C. (1980). Acetylator phenotype in idiopathic systemic lupus erythematosus.// Arthritis Rheum.- V.23(5).- P.569-73.

82. Reisman D. and Loging W. T. (1998). Transcriptional regulation of the p53 tumor suppressor gene.// Semin Cancer Biol.- V.8(5).- P.317-24.

83. Sambrook J. and Russell D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition 999 c.

84. Schon M. P. (1999). Animal models of psoriasis what can we learn from them?// J Invest Dermatol.- V.l 12(4).- P.405-10.

85. Shaulian E, Karin M. (2001) AP-1 in cell proliferation and survival. //Oncogene.-V.20(19).-P.2390-400.

86. Shaulian E, Karin M. (2002) AP-1 as a regulator of cell life and death. //Nat Cell Biol.- V.4(5).-P.E131-6.

87. Shen L. X., Basilion J. P. and Stanton V. P., Jr. (1999). Single-nucleotide polymorphisms can cause different structural folds of mRNA.// Proc Natl Acad Sci U S A.- V.96(14).- P.7871-6.

88. Sonkoly E, Wei T, Janson PC, Saaf A, Lundeberg L, Tengvall-Linder M, Norstedt G, Alenius H, Homey B, Scheynius A, Stahle M, Pivarcsi A. (2007) MicroRNAs: novel regulators involved in the pathogenesis of Psoriasis? //PLoS ONE.- V.2(7).-P.e610.

89. Sonnhag C., Karlsson E. and Hed J. (1979). Procainamide-induced lupus erythematosus-like syndrome in relation to acetylator phenotype and plasma levels of procainamide.// Acta Med Scand.- V.206(4).- P.245-51.

90. Sun X., Shimizu H. and Yamamoto K. (1995). Identification of a novel p53 promoter element involved in genotoxic stress-inducible p53 gene expression.// Mol Cell Biol.- V.15(8).- P.4489-96.

91. Takeda A, Higuchi D, Takahashi T, Ogo M, Baciu P, Goetinck PF, Hibino T. (2002) Overexpression of serpin squamous cell carcinoma antigens in psoriatic skin.// J Invest Dermatol. -V.l l8(l).-P.147-54.

92. Teraoka Y., Naruse Т. K., Oka A., Matsuzawa Y., Shiina Т., Iizuka

93. M., Iwashita K., Ozawa A. and Inoko H. (2000). Genetic polymorphisms in the130cell growth regulated gene, SCI telomeric of the HLA-C gene and lack of7association of psoriasis vulgaris.// Tissue Antigens.- V.55(3).- P.206-11.

94. Vansant J., Woosley R. L., John J. T. and Sergent J. S. (1978). Normal distribution of acetylation phenotypes in systemic lupus erythematosus.// Arthritis Rheum.-V.21(2).- P. 192-5.

95. Vogelstein B. and Kinzler K. W. (1992). p53 function and dysfunction.// Cell.- V.70(4).- P.523-6.

96. Wagner EF. (2001) АР-1—Introductory remarks.// Oncogene.-V.20(19).-P.2334-5.

97. Watson W., Cann H. M., Farber E. M. and Nail M. L. (1972). The genetics of psoriasis.// Arch Dermatol.- V. 105(2).- P. 197-207.

98. Wisdom R. (1999) AP-1: one switch for many signals.// Exp Cell Res. V.253(l).-P.180-5.

99. Wong P., Banerjee K., Massengill J., Nowell S., Lang N. and Leyland-Jones B. (2001). Validity of an ELISA for N-acetyltransferase-2 (NAT2) phenotyping.// J Immunol Methods.- V.251(l-2).- P. 1-9.

100. Wrone-Smith T. and Nickoloff B. J. (1996). Dermal injection of immunocytes induces psoriasis.// J Clin Invest.- V.98(8).- P. 1878-87.

101. Zhou Y. and Chaplin D. D. (1993). Identification in the HLA class I region of a gene expressed late in keratinocyte differentiation.// Proc Natl Acad Sci U S A.- V.90(20).- P.9470-4.

102. Zschieschang P., Hiepe F., Gromnica-Ihle E., Roots I. and Cascorbi I. (2002). Lack of association between arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2) polymorphism and systemic lupus erythematosus.// Pharmacogenetics.- V.12(7).-P.559-63.

103. Артамонов В. В., Любченко Л. Н., Шабанов М. А., Немцова М. В., Залетаев Д. В. (2004) Изучение ассоциации полиморфных маркеров гена

104. NAT2 со спорадическим раком молочной железы // Молекулярная биология.-Т.38(3).-С.457-62

105. Вавилин В.А., Макарова С.И., Ляхович В.В., Гавалов С.М. (2002) Ассоциация полиморфизма генов ферментов биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков с особенностями бронхиальной астмы у детей // Генетика.- Т.38(4).-С. 539-545.

106. Гра О.А., Глотов А.С., Кожекбаева Ж.М., Макарова О.В., Самочатова Е.В., Заседателев А.С. and Т.В. Н. (2006). Опыт использования биочипов для анализа полиморфных вариантов гена CYP1A1 при лейкозах у детей.// Мед. генетика.- V.46.- Р.34-38.

107. Макарова О. В., Викторова Т. В., Янбаева Д. Г., Корытина Г.Ф., Якупова Э.В., Каримова JI.K. (2003) Полиморфизм генов метаболима ксенобиотиков у рабочих нефтехимических производств // Генетика.- Т. 39(9). С. 1268-1274.

108. Турпаев К.Т. (2006) Роль фактора транскрипции АР-1 в интеграции внутриклеточных сигнальных систем // Молекулярная биология.-Т.40(6).-С.945-961

109. Федорова О.Е., Синицка О.Н., Тихомирова Л.П., Вишневская Я.В., Заседателев А.С. and Т.В. Н. (2006). Анализ точечных мутаций в гене BRCA1 методом гибридизации с гидрогелевыми микрочипами.// Молекулярная биология.- Т.40.- С.31-36.