Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и изучение экспрессии генов-кандидатов при аутоиммунных заболеваниях на примере псориаза и болезни Крона

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Поиск и изучение экспрессии генов-кандидатов при аутоиммунных заболеваниях на примере псориаза и болезни Крона"

На правах рукописи

□03058141

Брускин Сергей Александрович

ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-

КАНДИДАТОВ ПРИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ НА ПРИМЕРЕ ПСОРИАЗА И БОЛЕЗНИ КРОНА

03 00 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 2007

003058141

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им Н И Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ-

Доктор биологических наук, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор биологических наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится " " мая_ 2007г в__часов па заседании

Диссертационного совета Д 002 214 01 в Институте общей генетики им НИ Вавилова РАН по адресу 119991,ГСП-1, Москва, ул Губкина, 3, факс (095) 132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им Н И Вавилова РАН

Автореферат разослан" " апреля 2007 г

Пирузян Элеонора Суреновна

Даниленко Валерий Николаевич

Поляков Александр Владимирович

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г Н. Полузина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Псориаз - заболевание кожи, и болезнь Крона - заболевание эпителия кишечника, являются сложными генетически обусловленными патологиями, в проявлении которых задействованы большие группы (сети) взаимодействующих генов/белков При обеих патологиях страдает иммунная система (заболевания имеют аутоиммунную природу), а запуск патологического процесса происходит внешними триггерами окружающей среды (психо - эмоциональные стрессы, инфекции и пр) Обе патологии на данный момент неизлечимы, а лечение направлено на увеличение периодов ремиссии и на снижение тяжести болезни Показано, что на генетическом уровне обе патологии тесно связаны около пяти генетических локусов вовлечены как в развитие псориаза, так и болезни Крона В среднем псориазом страдает 3% мирового населения, причем имеется четкая регионально-этническая дифференциация распространенности заболевания с пиком среди европеоидных этнических групп В России и СНГ эпидемиологическая картина псориаза неполна, имеется всего несколько работ (Кешилева 3 Б, Оразымбетова Д А, Тимофеева Л Н, 2000, Джеткисбаева 3 С , Баткенова Г Р , 2002, Мордовцев В Н , Алиева П М , Сергеев А С , 2002, Пирузян Ан Л , 2005), но можно утверждать, что процент больных псориазом составляет не менее 3% Псориаз редко приводит к летальному исходу, однако существенно влияет на качество жизни пациентов и часто приводит к инвалидности В последнее время псориазом болеет все больше молодежи, что впоследствии скажется на потере трудоспособности части взрослого населения России, поэтому необходимо уже сейчас начинать разработку эффективных терапий и ранней диагностики псориаза

Болезнь Крона является тяжелой патологией Поражает около 0,15% населения, но, в отличие от псориаза, лечится только хирургически и приводит к инвалидности Чрезвычайно актуальна ранняя диагностика

болезни Крона, так как на данный момент диагноз ставится только при полостной операции кишечника Часто на поздних стадиях болезнь Крона переходит в онкозаболевание Важно подчеркнуть, что среди внекишечных проявлений болезни Крона часто встречается псориаз

Так как обе выбранные патологии обусловлены разрегулированной работой генетического аппарата, то эффективным методом в разработке подходов для диагностики, лечения и создания лекарственных препаратов является поиск критических звеньев патологического процесса, а именно, генов-кандидатов и соответствующих белковых продуктов Если генетические исследования аутоиммунных заболеваний продвинулись в достаточной степени как в России, так и за рубежом, то применение постгеномиых технологий с целью выявления биомаркеров и исследования патогенеза данных патологий остаются задачей ближайшего будущего К настоящему моменту, по существу, не опубликовано работ по комплексному использованию транскриптомики и протеомики для изучения псориаза и болезни Крона Благодаря стремительному развитию геномных и постгеномных технологий, пользуясь литературными источниками и базами данных, можно выделить известные ассоциированные с данными патологиями гены, на основании компьютерных исследований, составить карты и сети, содержащие гены-кандидаты, и выделить подпроцессы, которые могут являться критическими в развитии патологий Далее необходимо это экспериментально проверить с помощью стандартных молекулярно-биологических методов

Цель работы провести поиск и изучить экспрессию генов-кандидатов при аутоиммунных заболеваниях на примере псориаза и болезни Крона Задачи

1 С использованием методов информационной биологии определить круг генов-кандидатов патогенеза при псориазе и болезни Крона

2 Разработать основу для создания микрочипов быстрого скрининга генотипа и установления фенотипа Для этого

- провести сбор информационного и клинического материала у здоровых индивидуумов и пациентов с псориазом,

определить фенотип ацетилирования и особенности распределения фенотипа ацетилирования в группах здоровых индивидуумов и пациентов с псориазом,

3 Изучить ассоциацию полиморфизма гена NAT2 с псориазом

4 Изучить изменение экспрессии генов В АХ, BCL-2, CASP3 и р53 при псориазе

5 Провести сравнительный анализ данных экспрессии генов ВАХ, BCL-2, CASP3 и р53 в коже больных псориазом до и после лечения пациентов

Научная новизна работы

Впервые на основе анализа информационного материала при помощи программы «MetaCore®» компании GENEGO Inc (США) определены общие гены-маркеры патологического процесса при псориазе и болезни Крона, белки которых могут рассматриваться как потенциальные мишени для подбора индивидуализированной лекарственной терапии

Впервые изучена активность каспазы-3 в пораженной и непораженной коже больных псориазом до и после лечения пациента иммуномодулирующим препаратом

Практическая значимость.

Данные, полученные при анализе экспрессии генов-кандидатов патогенеза при псориазе и болезни Крона, могут способствовать разработке новых диагностикумов и идентификации новых мишеней лекарственных препаратов для лечения псориаза и болезни Крона

Апробация результатов работы

Результаты работы были представлены на научно-практических конференциях в Минске «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» 2004, Гурзуфе - «1Т+М&Ес'2005» в 2005г, на Конференции «Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития», Москва 2004 г и на 4-ом съезде Европейской ассоциации дерматовенерологов в 2006г в Финляндии

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц, 31 рисунок и 3 фотографии Список цитируемых литературных источников включает 249 наименований

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Воспалительные барьерные заболевания и болезнь Крона

В данной главе приводится характеристика воспалительных барьерных заболеваний, затрагивающих слизистые поверхности или кожу, которые объединяют несколько патофизиологических и клинических характеристик Приведены области генетического сцепления Ряд генетических локусов, вовлеченных как в развитие псориаза, так и болезни Крона, являются перекрывающимися Обсуждается существенное увеличение заболеваемости псориазом и болезнью Крона, что ясно свидетельствует об инфекционных и токсических агентах, ассоциированных с сопутствующими изменениями в образе жизни пациентов Так, изменение условий жизни привело к появлению большого числа воспалительных заболеваний слизистых

поверхностей у «индустриальных» (промышленных) наций, которые до двадцатого века были редкими или полностью отсутствовали у данного населения (Bach 2002) Наиболее ярким примером является болезнь Крона, которая была неизвестна до 1920г (Svensson, Westrom et al 1984), а в настоящий момент охватила до 0,15% населения Северо-Западной Европы и Северной Америки (Binder 2004), атопический дерматит и астма, которые охватывают до 20% детей в ряде стран (таблица 1)

Таблица 1. Характеристика воспалительных барьерных болезней

Болезнь Основное проявление Проявление на других органах Ключевые элементы патофизиою гни Вовчеченце бактериальной фторы OMIM Гене- тическ ая пред-распол оженно сть % больных в популяции

Болезнь Крона Подвздошная , ободочная и толстая кишка Суставы, кожа, глаза ТН1-ответ, высокая экспрессия TNF и IL12 Да 266600 +++ 0 15%

Язвенный колит Ободочная и толстая кишка Сус гавы, кожа, глаза, ле! кие высокая экспрессия TNF, активация неитрофилов Да 191390 ++ 0 3%

Атоническая экзема Кожа Ле1кие (астма) ТН2-ответ, высокий уровень IgE, тучные клетки Вероятно 603165 ++ 20% (current birth cohorts)

Астма Легкие ТН2-ответ, высокий уровень IgE, тучные клетки Неизвестно 600807 ++ 10%

Саркома Бека Ле! кие Глаза, кожа, печень THl-огвет, HLADRB1 Неизвестно 181000 ++ 0 05%

Псориаз Кожа Суставы, подвздошная кишка ТН1 -ответ, высокая экспрессия TNF Весьма вероя гно 177900 +++ 2%

Ювениль-ный паро-донтит Десна/ параденциум ТН1 -ответ, высокая экспрессия TNF и IL8 Да 150650 + 0 01%

Глава 2. Псориаз: характеристика заболевания и генетика патологии

В главе 2 приведена клиническая характеристика заболевания и эпидемиология псориаза, обсуждается роль цитокинов в развитии патологического процесса и приводится модель наследования псориаза Особое внимание уделяется вопросу о роли триггеров внешней среды в патогенезе аутоиммунных заболеваний В главе рассматриваются локусы, связанные с псориазом, локализованные, по крайней мере, на восьми хромосомах человека Глава завершается обсуждением рабочей модели иммунопатогенеза псориаза Особое внимание уделено процессам, происходящим в коже человека при развитии псориаза - в бессимптомной коже (предпсориатическая или визуально непораженная кожа больного), в которой возникает уже ряд молекулярных различий, и при появлении хронических поражений (псориатических бляшек)

Глава 3. N-ацетилтрансферазы человека

В главе обсуждается фенотип ацетилирования у человека и полиморфизм гена NAT2 Приведен список аллелей NAT2 у человека Обсуждается ассоциация фенотипа ацетилирования с рядом мультифакториальных заболеваний, в числе которых ряд онкологических заболеваний, астма, диабет 1 типа, системная красная волчанка

Глава 4. Материалы и методы

В главе приведены перечень бактериальных штаммов и сред для выращивания Е coli, составы использованных буферов

Приведены методы выделения ДНК и РНК, определения фенотипа ацетилирования, генотипа ацетилирования на микрочипах, мультиплексной полимеразной цепной реакции, полуколичественной полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией

Приведены методы определения активности каспазы-3 в образцах кожи колориметрическим методом, определения содержания белка р53 в

образцах кожи методом Вестерн-блот гибридизации, описаны процедуры молекулярного клонирования.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы STATISTICA 6.0.

Глава 5. Результаты и обсуждение.

5.1. Ген NAT2, как возможный ген-кандидат при псориазе и разработка микрочина быстрою скрининга генотипа и установления фено гииа ацетилирования у больных псориазом.

Совместно с Лабораторией биологических микрочипов ИМБ им. В.А. Эпгельгардта РАН нами была проведена работа по созданию удобного для применения в диагностической практике биочипа, предназначенного для выявлен и вд функционально значимого полиморфизма NAT2 гена у больных псориазом.

Схематическое изображение биологического микрочипа (биочипа).

Структура микрочшш

Настоящий биочип позволяет определять 9 участков полиморфизма гена NAT2\ G191A, С282Т, Т341С, С481Т, G590A, A803G. G857A. Т859С и 859del. (Рисунок I)

Т859

Т859

ст С282 Т431 С481 С 590 А 803 С857 859С

С191 С282 Т431 С 481 С 5 90 А 803 С 857 8 59 С

191Л ШТ 341С 48П 590А 803С 857А 859(1с1

191А 2821' 341С 481 1 590 А 803С 857А 859ае1

Рисунок ], Схема расположения о.шюпук.чеотндных проб ни микрочине. В двух самых верхних строках каждой колонки расположены последовательности дикого типа, к нижних строках -- соответствующие им муТаитиые варианты, содержащие вариабельный нуклеотид в центральном положении.

5.2. Сравнительное изучение фенотипа ацетил и рования и генотипа N.472.

Фспотип ацетилирования был определен в группе волонтеров методом тестирования скорости ацетилирования сульфадимезина.

СКОРОСТЬ

Рисунок 2. Распределение индивидуумов по скороеп н ацетилирования. По оси абсцисс - количественные показатели скорости ацегилированиа; но оси ордин$1 -количество (в %) индивидуумов.

Генотип NAT2 в популяционной выборке волонтеров определяли методом гибридизации ДНК на биочипе и на основании полученных результатов рассчитывали предполагаемые фенотипы ацетилирования Как видно из представленных данных, частота медленных ацетиляторов в популяционной выборке составляет 44% (рисунок 2) и достоверно не отличается от результатов, полученных при определении фенотипа ацетилирования методом тестирования скорости ацетилирования

Результаты по определению взаимосвязи фенотипа и генотипа ацетилирования у индивидуумов представлены на рисунке 3

•Ó Г 7 -6/ 6 5/ 7 •5/'6 5Г5 6/'13

6 г 12

5/ 13 -5/ 12 '4/ ¡3 4/12 '4/ 7 г4/ 6 -41*5 4/ 4

30 40 50 60 70 80 90 100

Рисунок 3 Взаимосвязь фенотипа и генотипа ацетилирования По оси ординат отмечены генотипы ацетилирования, рассчитанные по результатам гибридизации ДНК на биочипах, по оси абсцисс - количественные показатели фенотипов, рассчитанные по результатам определения скорости ацетилирования Черными кружками обозначена конкордантность между фенотипом и генотипом Светлыми кружками обозначены несоответствия по этим показателям

Сравнительные характеристики и предполагаемые области применения двух подходов (количественное определение скорости ацетилирования и

качественное определение генотипа ацетилирования) для определения статуса ацетилирования у индивидуумов представлены в таблице 2

Таблица 2. Сравнительные характеристики и области применения методов определения фенотипа и генотипа ацетилирования _

Фенотипирование Генотипирование

Возможности Точное количественное определение фенотипа ацетилирования За счет одного измерения суммируются все возможные полиморфизмы в кодирующей области гена ЫАТ2 и промоторной области Точное качественное определение фенотипа ацетилирования (быстрый или медленный) За счет одного измерения определяются известные полиморфизмы в кодирующей области гена ИАТ2

Область применения Предсказание риска токсичности или положительного эффекта от применения лекарственных препаратов Выявление предрасположенности к заболеваниям в зависимости от скорости ацетилирования Проведение популяционных исследований по генетическому полиморфизму ацетилированию Выявление предрасположенности к заболеваниям в зависимости от генотипа гена ЫА Т2

На основании полученных данных и сравнительного анализа можно сделать следующие заключения Метод определения ацетилирующей способности индивидуума для выявления фенотипа ацетилирования за одно измерение позволяет суммировать все известные полиморфизмы и количественно определить уровень ацетилирования у индивидуума На основании этого можно предложить этот метод для количественной оценки скорости ацетилирования у индивидуума и более точного предсказания риска токсичности или, наоборот, положительного эффекта от применения лекарственных препаратов Метод гибридизации ДНК на олигонуклеотидной матрице (биочипе) позволяет достаточно точно определить генотипы и аллели, а также распределение частот аллелей и генотипов в популяционных выборках индивидуумов На основании этого можно предположить, что созданный гелевый микрочип даст возможность проводить популяциоиные

исследования по генетическому полиморфизму ацетилирования индивидуумов без фенотипирования, в том числе и с целью установления корреляции между генотипом ацетилирования и предрасположенностью данного индивидуума к заболеваниям

5.3. Полиморфизм TZH&NAT2 и его ассоциация с псориазом

На основании литературных данных, свидетельствующих о том, что полиморфизм гена NAT2 строго ассоциируется с рядом онкологических заболеваний, а также в связи с имеющимися литературными данными о взаимосвязи фенотипа ацетилирования с другим системным воспалительным аутоиммунным барьерным заболеванием - системной красной волчанкой (SLE), нами было высказано предположение о возможной взаимосвязи фенотипа ацетилирования и псориаза

Основываясь на результатах по взаимосвязи между фенотипом и генотипом ацетилирования и на возможности использования биологических микрочипов для определения генотипа NAT2, нами было проведено исследование группы больных псориазом (180 человек) и здоровых волонтеров (99 человек)

На рисунке 4 показано распределение частоты встречаемости шести однонуклеотидных замен в позициях 282, 341, 481, 590, 803 и 857 гена NAT2 Это основные, наиболее часто встречающиеся замены в московской выборке, вносящие вклад в изменение фенотипа ацетилирования Как видно на представленной диаграмме, частота встречаемости ни одной из замен достоверно не отличается в выборке здоровых волонтеров и больных псориазом Это указывает на отсутствие роли ряда ксенобиотиков, а также продуктов их биотрансформации за счет ацетилирования N-ацетилтрансферазой, в запуске или развитии патогенеза псориаза В связи с этим, на основании полученных нами результатов, ген NAT2 не может рассматриваться как ген-кандидат при псориазе

Рисунок 4. Сравнение распределения частоты встречаемое! и однонуклеотидных замен и позициях 2К2, 341, 4)il, 590, КОЗ и 857 гена NAT2 у больных псориазом и здоровых индивиду умов к I. Москве

5,4. Гены, участвующие is йпоптозе, как гены-кандидаты при псориазе.

При созревании кератиноцитов в псорнатических бляшках нарушен клеточный цикл, дифференциация клеток и апоптоз. На основании этого нами рассматривались гены В АХ, BCL-2, CA SPS и р5% как возможные i сны-кандидаты при псориазе.

Нами было изучено изменение соотношения продуктов генов ВАХ и BCL-2 в пораженной и непораженной коже больных псориазом и его изменение после лечения, а также определение этих параметров у здоровых индивидуумов методом полу количественной ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией. В таблице 3 приведены результаты этих экспериментов.

Следует отметить, что соотношение мРНК BAXIBCL-2 у шести здоровых волонтеров достоверно не различалось между индивидуумами.

Таблица 3 Изменение соотношения мРНК BAX/BCL-2 в коже больных псориазом в

сравнении с контролем, а также после лечения

Пораженная кожа ло лечения в сравнении со здоровой кожей здоровых людей Пораженная кожа в сравнении с непораженной кожей больных Пораженная кожа после лечения в сравнении с пораженной кожей до лечения Пораженная кожа после лечения в сравнении со здоровой кожей здоровых людей Эффект лечения (по изменению индекса PASI)

Пациент 1 т - т -

Пациент 2 т X - +

Пациент 3 - - +

Пациент 4 т 1 - +

Пациент 5 т 1 - +

Пациент 6 т 1 т +

Пациент 7 т 1 - +

Пациент 8 т т +

Пациент 9 г 1 - т -

Пациент 10 - - - +

Пациент 11 т - +

Пациент 12 т 1 - +

Пациент 13 т т +

Пациент 14 т - т +

Пациент 15 т 1 -

Ранее (Ан JT Пирузян, 2005) была показана эффективность лечения псориаза иммуномодулирующим препаратом «Глутоксим®» На основе этих результатов нами было выдвинуто предположение о том, что после лечения иммуномодулирующим препаратом изменения должны проявиться на уровне генов-кандидатов Мы сравнили изменение соотношения мРНК BAX/BCL-2 в пораженной коже до и после лечения, а также после лечения в сравнении со здоровой коже здоровых индивидуумов Эффективность лечения оценивалась по изменению индекса PASI Оказалось, что у 10 пациентов происходит достоверное снижение соотношения мРНК BAX/BCL-2 после лечения, а у двух из пяти пациентов с неизменившимся

13

соотношением мРНК BAX/BCL-2 эффекта от лечения не наблюдалось. При этом, если сравнить соотношение мРНК BAX/BCL-2 в коже у больных псориазом с соотношением в коже здоровых индивидуумов, то у 8 пациентов с успешным лечением наблюдалось выравнивание данного показателя. В тоже время, у 4 пациентов после лечения соотношение мРНК BAX/BCL-2 все еще оставалось выше, чем у здоровых, несмотря па достоверное снижение соотношения в результате лечения.

Вследствие того, что каспаза-3 является, по всей видимости, если не ключевой, то одной из самых важных эффектор пых каспаЗ, мы определили изменение ее активности в пораженной коже больных псориазом, а также изучили влияние лечения больных на изменение активности каспазы-3 в коже больного.

На рисунке 5 показано распределение активности каспазы-3 в коже больных до лечения (25 человек) и после лечения (15 человек), а также здоровых волонтеров (7 человек). Однако, при разделении пациентов с эффективным лечением на три группы (по активности каспазы-3 в коже до лечения): меньше, чем у здоровых; па уровне, сопоставимом с уровнем у здоровых; па уровне, существенно большем, чем уровень у здоровых, мы получили данные, свидетельствующие об изменении уровня активности каспазы-3 в сторону нормализации (рисунок 6).

дни*"*:- ii >жлЗчигСепта

Ы -.-•-—•---------.---

1 I

: 1:11!

('2

0.0 I

Рисунок 5. Активность каспазы-3 в коже Go.'iьмe.j\ псориазом до н после лечения и к норме

AtrtWitt*:> t. > ,>;л>ЗЭЫ 3 ' '"SWil

№хтз Ь«1н Voaemw«

■ЗврГ VfriW*«

MOO

иидкйл лктиамс^ гь i-->-:iH'V . к 'Ji'4* > схвдняй с имиягш активность "J»C'<i!!j '

Hlpiigfl

Группы rl jциLLн(uм С pi .....ОI- а.ГHiFMLli:TtrHJ ИЙСГТВ1Ы-Э Б KOAt ДО Л£Ч«НнЙ

Рисунок 6. Динамика изменения активности каспазы-3 в результате лечения пациентов с псориазом

Таким образом, в список генов-кандидатов при псориазе могут быть включены гены ВАХ, ВСЬ-2, САШ.

5.5 Поиск ген о в-кандидатов при псориазе и болезни Крона с помощью методов информационной биологии.

Нашей задачей было произвести поиск генов-кандидатов при псориазе и болезни Крона. Классический генетический подход в поиске генов-кандидатов заключается в семейном анализе и установлении генетических ассоциаций между проявлением болезни и сцепленными с этим проявлением локусами. На данный момент высокоинформативным инструментом изучения экспрессии больших групп генов являются результаты экспериментов, в которых экспрессия генов оценивается количественно с помощью биологических микрочипов. В своих биоинформацнонныХ исследованиях мы (совместно с P.M. Авдеевым, Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН) использовали базу данных

GEO DataSets (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), в которой в виде электронных таблиц собраны результаты экспериментов оценки уровня экспрессии генов на биочипах. Нами были отобраны для дальнейшего анализа по одной записи для псориаза (GDS1391) и болезни Крона (GDS1330).

На данный момент в рамках стремительного развития постгеномных технологий появляются программные продукты, позволяющие концентрировать и систематизировать большие объемы генетической информации, выстраивать гипотезы генных сетевых взаимодействий и пр. Одной из таких программ является программный продукт «MetaCore®» компании GENEGO Inc. (США). Всю обработку данных биологических микрочипов и поиск генов-кандидатов при псориазе и болезни Крона мы проводили, используя именно этот программный продукт.

lnq(pV#lu«t)

1. Cytoilfeletoft remodeling i. Q %cmji'<nij ar-d adhetior»

3, MAPK ca»c*ie Psrt Ilr Mas 1 • MAMK2-4 ■ ERK5 ft 3NK pathwiy

4, rrjf, l^tit ar.d cyt9fk*l«t»1 remod#ling

5, MAP« cascade. Part IV. Map J- Nudear fvftCbpn of p39-MAPK

6, MflPK cascade Part I, Map 1, ERK-relatad patlwayf

7, Role of VOR in regulation of gene» involved m ostc»por«tt e. IHUPk cttcad»- Part t. H№ 2. 8tk- RPS/HKNK signaling

9. CrpiS'Ulh ViGF and angmpcietia lugnabng

10, MftPK cascade Part J], Map 2 - MAP-JifJ-i - EPK/3M< pathway; interaction wth №«1/2

11, M4PK cflitsdf Part JV. Map 1 Generic p36-MAPK c«eada

12, IrJagnn o«-ti,dc in iignflting

13, TPQ ift «It procext

14, QKCftJ signaling p«hwa f

15, C».£B pathway

16, Angulation of Ol/S frantitioo (part

17, ATM/AT* regulation ol GL/S checkpoint

18, IGF-SI i<flnahng 19.3NK pathway

20. Pleefcitrm homology proiem§ Interactions. Part 131

21, API «tiv«m by M40P proteins and c-R.JP/c 1 *olatod path^a y

22. IFH gamma ugialing

23, £G- signaling pathway

¿a. Putative erythropoietin signaling pathway t<

25, Kas family GTPases in fc-naie cascades (tehen">e>

26. flrcjl trans VHibon re qui at a-'

27. ftole of AP-i in nkgulttion of «Alula* mBtatolii^

28. MGF signaling pathway

29, AKT ngiial ug

30, MAPK cascade- Part i, Map H - gnii nucltocyWrfasmjc s

Рисунок 7. Некоторые процессы с измененной но отношению к контролю экспрессией генов (В- псориаз, □ - болезнь Крона)

В результате информационного анализа экспрессии около 12000 генов па биологических микрочипах с помощью программы «МссаСоге®» было установлено, что число генов, изменивших свою экспрессию более чем в 1,5 раза при псориазе, составляет 7563, а при болезни Крона 2500. Анализ моле куля рно-ген етйческих процессов, насыщенных генами с измененной по отношению к контролю экспрессией, представлен на рисунке 7. Видно, что при патогенезе как псориаза, так и болезни Крона, изменена работа генетического аппарата таких процессов, как передача клеточных сигналов, иммунный ответ, регуляция клеточного цикла и другие.

* О ®&в 6 О й ЯЪ й 6 о ® © о в

аг Ж

ше ф с:

" , 4* 9 г 1

* 1яяе » вя а " V пГ*

<?Ю№а1№1

■

СН Лиасп

10« » ЙЭ ЬИ)6>' ф „ |

ст Ат Ат А " »

ЙИ да-2* И«)

1

гена лрн пс орган

1

Умммчгна >кец>«снч енпетп^швп) I Уклпш» лсс^ессия стот*етст*)»и№го

«га 1фн !О.тг1КЙ Кроха

О

©

Рисунок 8. Фрагмент карты взаимодействии генов при МАРК каскаде.

Указаны кодпигкты трэмехркпшю иного фахтор& АР-1

Особое внимание мы обратили на измененную экспрессию важнейших транскрипционных факторов, как узловых интеграторов запуска различных

генетических процессов в клетке Используя имеющиеся и систематизированные в программе «МйаСоге®» карты взаимодействий генов, мы установили, что транскрипционный фактор АР-1 существенно изменил экспрессию, как при псориазе, так и при болезни Крона Транскрипционный фактор АР-1 - это группа парных комплексов, образованных ДНК-связывающими белками, входящими в семейства 1ип, Роб, АТБ и др - всего около 16 различных белков, связывающихся друг с другом в различных сочетаниях На рисунке 8 представлена карта генных взаимодействий при МАРК-киназном каскаде с указанием некоторых компонентов АР-1 и их измененной экспрессией Мы предполагаем, что измененная экспрессия АР-1 фактора может являться одним из ключевых факторов для инициации и течения патологического процесса в коже больных псориазом и в эпителии кишечника пациентов с болезнью Крона Фактор АР-1 обеспечивает ответ клеток на действие ростовых факторов, цитокинов и других сигнальных молекул Зависимые от АР-1 гены играют важную роль в регуляции пролиферации, морфогенеза, апоптоза и дифференцировки клеток, то есть в тех процессах, где наблюдаются основные изменения при выбранных патологиях На рисунке 9 представлены хромосомы человека с обозначенными локусами чувствительности к псориазу, болезни Крона и другими генетически схожими аутоиммунными мультифакториальными патологиями Видно, что около половины компонентов фактора АР-1 расположены именно в пределах этих локусов Таким образом, сочетая методы классической генетики, технологии биологических микрочипов и методы информационной биологии, установлены гены-кандидаты для псориаза и болезни Крона, кодирующие различные компоненты транскрипционного фактора АР-1

3

п

1

н

О

3 <1

В 9 -о 11 12

р н =1

__/

1:-

'4 15 16 17

и —

19 21

ш Болезнь Крона ■ Саркоидоз Пгврваз Экзеаи Астма

Периодонтит Пс ормапгче скин артрит

локалнзазщя тти-п . хомпонентоЕ трангкр нгасконмого фактора АР-1 Е области кжуго!., ;1(<01Ш1ф01 аню>1\ I пспр назогя жУнлн болезньы Крона.

^ - локализация геноЕ, коэшонентоЕ транскрипционного фактора АР-1 области локусвЕ, ассоцкнр01 амиьк с псорказога нЬвш болезют Крона.

Рисунок. 9 Локализация различных компонентов I ранскринциоино!о факгора АР-1 на хромосомах человека (карта хромосом с обозначением областей сцепления с барьерными заболеваниями из &1ге1Ьег е1. а!,, 21)05)

Заключение

Мультифакториальиые хронические воспалительные заболевания, затрагивающие барьерные органы, к числу которых относятся болезнь Крона, псориаз, атонический дерматит и астма и другие, хотя и различаются в отношении их общей патофизиологии, тем не менее, обладают некоторыми общими ключевыми характеристиками, включающими рецедивность

воспаления и пораженные органы Более того, области генетического сцепления, которые были идентифицированы в независимых исследованиях, часто перекрываются

В наших исследованиях в качестве модельной мультифакториальной патологии выступают два заболевания - псориаз и болезнь Крона Оба заболевания имеют все атрибуты мультифакториальной патологии -запускаются триггерами внешней среды у индивидуумов с генетической предрасположенностью Основные направления молекупярно-генетических исследований патогенеза этих двух заболеваний заключены в идентификации ключевых генов патогенеза и соответствующих им белков, как основных мишеней для разработки новых подходов к лечению

На основании произведенного нами анализа литературных данных и баз данных мы идентифицировали ряд генов, которые в контексте с вышеизложенным представляются важными для исследования В числе этих генов ВАХ, BCL-2, CASP3 и гены, кодирующие транскрипционный фактор АР-1 (C-JUN, JUNB, JIJND, C-FOS, FOSB, FRA-1 и FRA-2 и др)

Включение в наше исследование генов, имеющих отношение к процессу апоптоза, было обусловлено прежде всего тем, что в процессе пролиферации кератиноцитов при псориазе происходит нарушение клеточного цикла и 3-х кратное ускорение клеточного деления Механизм образования верхних слоев эпителия (роговой слой) в псориатических бляшках остается невыясненным

Идентификация белков, кодируемых перечисленными генами, является важным аспектом проводимых в настоящее время исследований в связи с тем, что именно они являются основными мишенями для разработки новых подходов к лечению псориаза и болезни Крона Данные, полученные нами при анализе экспрессии генов-кандидатов патогенеза при псориазе и болезни Крона, могут способствовать идентификации новых мишеней лекарственных препаратов для лечения псориаза и болезни Крона

Выводы

1 На основании исследования фенотипа ацетилирования и генотипа 1Ч-ацетилтрансферазы-2 установлена связь между полиморфизмом гена и активностью фермента NAT2, а также показана возможность использования биологического микрочипа для определения генотипа NAT2 и соответствующего ему фенотипа

2 Полиморфизм гена NAT2 не показал ассоциации с псориазом, и ген NAT2 не может рассматриваться как ген-кандидат при псориазе

3 Установлено, что в коже больных псориазом маркеры апоптоза -В АХ, BCL-2 и каспаза-3 изменены повышено соотношение мРНК BAX/BCL-2 и изменена активность каспазы-3

4 На основании результатов определения соотношения мРНК BAX/BCL-2 и определения уровня активности каспазы-3 в коже больных псориазом до и после лечения препаратом «Глутоксим®» сделан вывод о том, что соотношение мРНК BAX/BCL-2 и уровень активности каспазы-3 могут являться показателями состояния патологического процесса в коже больных псориазом

5 На основании биоинформационного анализа данных впервые установлено, что гены, кодирующие компоненты транскрипционного фактора АР-1, могут являться генами-кандидатами как при псориазе, так и при болезни Крона

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в научных журналах

1 И М Корсунская, JI В Егоренкова, Э С Пирузян, С.А. Брускин, Р М Абдеев, И В Голденкова-Павлова, JI Т Тогоева, С С Олейник, Ан Л Пирузян Роль системы апоптоза в патогенезе псориаза Клиническая дерматология и венерология 2006, №6, С 13-17

2 ИВ Голденкова-Павлова, С.А. Брускин, Р М Абдеев, Е В Маркарова, С Г Бигвава, Л А Радкевич, X А Курданов, Ж М Кожекбаева,

А С Глотов, О А Гра, А С Заседателев, Т В Наседкина, Э С Пирузян Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у человека Генетика 2006 Т 42 № 8 с 1443-1450

3 Ж М Кожекбаева, А С Глотов, О А Гра, И В Голденкова-Павлова, С. А. Брускин. Е Е Агафонова, Е В Маркарова, Р М Абдеев, И М Корсунская, Ан Л Пирузян, В Е Барский, А С Заседателев, Т В Наседкина Определение точечных мутаций гена NAT2 с помощью биологических микрочипов Молекулярная биология 2007, №4

Тезисы докладов на конференциях

1 И В Голденкова, Ан Л Пирузян, М К Саркисова, С.А. Брускин, Р М Абдеев, А Махулаева, И М Корсунская Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии кожных заболеваний на примере витилиго и псориаза, Материалы III Съезда генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития», Т I с 63 , Москва , 2004

2 Кожекбаева Ж М , Глотов А С , Брускин С.А., Голденкова И В , Пирузян Э С , Заседателев А С , Наседкина Т В Разработка биочипа для определения аллельных вариантов NAT2 гена, VI Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», С 76, Звенигород, 2005

3 С.А. Брускин. А С Глотов, Т В Наседкина, Л А Радкевич, И В Голденкова, Разработка микрочипа быстрого скрининга генотипа и установления фенотипа ацетилирования для метаболической и генетической паспортизации человека с целью ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии, 1Т+М&Ес'2005, С 201-204 Гурзуф, Украина, 2005

4 С.А. Брускин, А В Марахонов, И В Голденкова-Павлова, Э С Пирузян, Термостабильные ферменты для наработки новых терапевтических

и профилактических препаратов и диагностических систем, Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов», С 537-542 , Алушта, 2006

5 С.А. Брускин, Ж М Кожекбаева, Т В Наседкина, И В Голденкова-Павлова, Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у человека, Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», С 21, Москва, 2006

6 Z М Kozhekbaeva, О A Gra, A S Glotov, I V Goldenkova-Pavlova, S.A. Bruskin, E V Markarova, E S Piruzyan, T V Nasedkina N-acetyltransferase 2 {NATI) gene polymorphisms in psoriasis and colon cancer patients from the Moscow population// Supplementary of Eur J Hum Genet Nice France, June 16-19 2007

7 С.А. Брускин, M К Саркисова, Ан JI Пирузян Метаболическая и генетическая паспортизация человека для ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии Материалы Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» Минск 2004 с 219-221

Патенты

1 С.А. Брускин, И В Голденкова-Павлова, И М Корсунская, Ан Л Пирузян Патент №111066 «Способ оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом»

2 Корсунская И М , Брускин С.А., Ан Л Пирузян, Абдеев Р М Заявка на патент 049747 от 21 декабря 2006 г «Способ оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом»

Подписано в печать 12 04 2007 г Исполнено 13 04.2007 г Печать трафаретная

3акяз№317 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 ЛУУУЛУ autoreferat ш