Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и изучение продуцентов никотинамидных коферментов среди дрожжевых микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Поиск и изучение продуцентов никотинамидных коферментов среди дрожжевых микроорганизмов"

РГ8 Ой

2 О ШОП $93

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

ШАКИРЗЯНОВА Мадина Рустамовна

УДК 663.031.6X577.150.8

ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ НИКОТИНАМИДНЫХ КОФЕРМЕНТОВ СРЕДИ ДРОЖЖЕВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1993

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии1 физиологически активых соединений Института микробиологии АН РУз.

Научный руководитель:

академик АН РУз, доктор биологических наук, профессор А. Г. Халмурадов

Официальные оппоненты:

академик АН РУз, доктор биологических наук М. И. Мавлани кандидат биологических наук, доцент Я- Ф. Низаметдинова

Ведущая организация — Институт генетики АН РУз.

О—

Защита • состоится «17» июня 1993 г. в «•У » часов на заседании специализированного совета Д 015.02.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте микробиологии АН РУз по адресу: 700128,

Ташкент-128, ул. А. Кадыри, 7Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан « __мая 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета ^ * £

доктор биологических иаук ' Сафиязов Ж.

ОВШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА' РАБОТЫ

.Актуальность теш. Ореди существующих методов получения физиологически активных соединений, . в частности, никотинамид-ных коферментов (НАД1" и НАДФ") наиболее перспективным и Рентабельным является микробиологический синтез.

■ Никотинамидннм коферментам принадлежит особое место среди метаболитов микробной клетки. Многообразие функций никотина-мидннх коферментов позволяет отнести их в число универседьчнх Оиомолекул, играющих фундаментальную роль в биологическом ми-

Гуо #

Уоп^хи, дос^игнуть1^ в оплести исследования структуры и •туякиий ЬДЯТ# привели к расширению опласти их практического использования. Помимо того, что препараты НАІГ широко применяются в «экологических и биотехнологических исследованиях, ведутся ИНТЄЯСЧВКУЄ•пояски ооластеи возможного его применения В Малинине. В овяеи о чтим разраоотка нових методов и расширение оанка продуцентов НАЛ1’ сохраняют свою чктуялі»чость и данность , до путей никотмня,мил;чыу к^^орм^чт^т? и

ментныч систем. учаптвутих В ИХ ООра.^П^^НМИ , показало о у--

г^л-грорани4? ■ стпогих г^гуляторину м^хачи?моп, по*с п* чирЛіпших

внутриклеточное пост^ячотро ■ НА/Г* ?• КЛеТКЯХ МИТОООТУ-

гчяиямов. Подтему . использование микроорганизмов с нормально 'рункпионируют^й системой регуляторных механизмов в ппомышлен-

• ном маоятаб» нерационально. <Баядчр^ва И, М. , •

Несмотря на то, что дрожки по праву считаются наиоол^е

ло^тупиччи Источниками НА.^", в научной дитеоатуп^ недостаточно просмотрены вопросы, свяяяннн® с поиском пут°и вояд°йствия на

ЛПМ““ пр«к»ей С ПЄЯЬ*> повшвчия ?нуода НАД*, в основном поиск

яу^ом У^ЛИ’-їЄНИЗ' ЛОП/!укТИЗНлОТИ ^УЛЪТУР ПО ОТНО^РИ’-О # ЯТОМУ

»',0'?орме'НТУ от’рвЯИНИОя.в'ГСЯ МОЯИфИКЯШеИ сред и условии кульки-**1* э і 1 ч^'м ■ *

Ак/аг-п-с. о.'т'рм, существует реальная .возможность увеличения продуктивности ПО НА.7;' ПрирСДН'-'Х ятаммов прохХ*Й П ПОМОЩЬЮ

Направленного Му'гагй«аГ5й. |;а«. ПТ^ЛОТЯВЛЯ^ТОЯ ПеГЮПйКТИВНЫМ ПО.-’/Ч^Нй- ООЛ** ”'-«;)!ук,І.ІИРНМХ МУТаНЧ'Ой і.: ЙЧОУД1ЄНН0И регуяяциеи •г-.,<очр кд,, . и г,^рул%1.тяг».о Ч4Г0 и<!И УВ&ЛИЧИВй“ТС« ?гГ*Г'°КТИ'РНОСТт-

^-,;гиг,тт-к-^^«фрріЯ н'діі" 1}та '0НИУЯ.«-Т”Я ИЦ7<м*Сй£НОСТ? “ГО ЗеоТГ'УК-

; **.п*,

' * 4 -

■■ "і-.'іг і' о 'ті-*' пг*л>р настоящего исследования ЯВИЛОСЬ' изу-::“НИ” р,п?л'^нси?т!' попущения ‘.«/тачтов региональных етазлов ?ТОу»гйц с» г>а»р* внооксі'і НАД-продуцирущей способнозгьв. В залечу исследования рхогтл'м •

-покзк региональных пгга>.<мов дрогшей, способные к адагвно-му еиктеэу к.аіГ:

-получение байка мутантов е помощью штрозо-Н-метилмочэ-тткы и огоср напоолее продуктивных мутантов;

-моїнро-физиологическая яэраяврдотюса отобранкыз ?-:утан-

т/^Т; » ’

-иауч*?иа;? основного теі»-:?нта дзградаїш НДТ;+ - НАД-гдкко-гидролагы и клячевого Армента сэлвидЕ-ешгевз НАН4’ - ШЖН-пн-рофогіроргас.?н; •

-иселадовзни* возможности использования полученных мутантов для трансформации некоторых • пройшздшх пиридина у ЕА-Г* ' Нэучи-ц; новизна. Для получения цутаитов. дрдаююй-продуцевт тов ІШГ ь работа прішнеи ілєїод индуцированирго мутагенеза о пойіогію нитроао- Н-кэтша гачавшш. В рзв/гьг^г-е' получена «^анты, кгевосг;огшщ;э .исходный рзде’єд&окіій шгаым по сумарно*;/ ооцеркани» НАЦ+. При игуч-зиаіі кяізчевьк фцрмзЯїов'езлщк?:-сші-т*?н НАЛ1- - КИШ-гарофаффпиазц и ^есгріукишйого фермента пВД-гликогвдролггы Быяыгакк. «у*ав5к - о ■ нарусэшюй рэгуляцлэй НАД*, ЧТО ВІфСйШГСЯ в квгкЗурэкшпй ШЛ-ідатогїщшгзь:. прп откмуляцші сзлвгда-синтеза Н/Щг ка эигсгойгл” прзк£&гт£звгп£-коз. '

Устанозлокы пзрфо-фиоііалоггчбошїз оиегсг: ігутсап’си о 1:2-Ы5ШНЯЭЙ Нйл+-прэд5,цяруюквй СЛОССОВОСЕйЗ ПЭ ер£2КиГ;Г.5 С рз;;і:~ тегьиаа сзегаом. . ...

Вкарвна ползало, что Згзспзгоїйуозз 2і«їч>у1зі£? 5: его і..у-їеяїи сЗланаїзт еаосоЭйэсшз уткшзгіровагь їіогсоторі-’з произвол-ша га;ріідзл:з (3-адзті:лн;;ф:цгла и Бч^їпшшрідої) о еуц:;зтз5Ю;иі; прарэотса в вокошиви Е5ДГ. -

Птвгаг^зо^л геянооть. £ь;за;ад прздугжшкозть ь оічіо:;зппн. сілпдза ЕДУТ из зззззгекл-:-; ггрздуосївгшппазз прп пизко;! ъ-Цгш-т,1ззогш: ойрзБзъгзг.згб ко;срмэита з ісгкхкзаг пззуч&кшх

ь-.паи'-гоз дзпузка.з'г, ч-хо з?і: С7э.::?:ы могут бьпь успешно ііспо.;:ь-говаяі- в і!5л-;рз3иоіоп?і'гз!хоіл є::к?оеє ІЩ+ по кзтода*;, рззраоо-тєзтаіл'. до; лзік: др»з.йіі~сп.тс-ро;наізгзв. В.;зсїє о -ген, оОнару-з,‘;;-;?:2Я -сшооЗкозгь дра:7л-й рада ЗазоЬзпхпусез угі.лігзіїрозг’гь

' . " 0 - . .. 3-аыэтилпиридин и 3-метилпирилин свидетельствует о необходимости разработки новой технологии микробной трансформации указанны*: соединений Б HAS’1" е помощью полученных мутантов.

Зеэ сказанное в подраэделак "Научная новизна” н "Практическая ценность" выносятся на официальную защиту.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на XIV Менделеевском съезде по обшей и прикладной химии ('Ташкент, 1980), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных и Продовольственная программа" (Киев, 1989), X Объединенном симпозиуме биохимических обшеетв СССР-ГДР "Механизмы регуляций неточной активности" (Ташкент, 1989), 20 конференции Федерации Европейских биохимических обвэств "ФЕБО" (Венгрия, 1990), Конгрессе Международного союза микробиологических 'Эбшеств (Япония, 1990), конференции "Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных" (Ташкент, 1990). •

Публикации. Автором опубликовано 10 работ, из которых 3 журнальные статьн. авторское снидетельство и б тезисов докладов . ' '

Структура п'объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 140 наименований, в том числе 80 иностранных. Работа изложена /of страницах машинописного текста, включая 22 рисунка и.10 таблиц.

' ' МАТЕРИАЛЫ К М2Г0ДЫ

3 работе использованы штаммы дролзкей рода Saccharomvces, предоставленные лабораторией коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз.

. В качестве'питательных срез использовали .среды, предложенные Sakai et al.(1973): 1.' Для скрининга (г/л): ггючоаа

50; пэптон - 15; 1!аС1 - 3; KHgPOi - 1; К0КРО4 - 1; -

0.3: дрсязсэьай экстракт -5; pH - 5,0.

' С. Для <?эризптаак1 и’/л): ггакозз - £0; пептон - 15;

КН2?04 - 5; Кг'НРОд - 5; МяЗО» - S; Zn30* - 1.2 «г/л; Са-нантс-

тен&т - 10 !/кг/д: ^«vks-HCI - 5 ысг/д; -ннодотол - 100 мкг/л.

■ Зрогк» внр£?п1в&1и 72 часа при SS-83 С° яз ка-тк* ниц 1?.0 оЗЛшн, з 100. ил кэхбах е 10 11л ер?ды.

НА2Г из биомассы дрожжей экстрагировали дистиллированной водой 5 мин при 85®С. Содержание НАїГ определяли спектрофотометрически' по специфическому его восстановлению в присутствии зтанола в ОД М пирофосфатном буфере (рН-8,8) и дрожжевой ад-когольдегидрогеназы /"Reanai’V (Асатиани,I960).

- Морфологию дрожжевых клеток • изучали ПОД'. микроскопом МБИ-11 при увеличениях 10 х 40 и 10 х SO. ■

Для мутагенной обработки клеток использовали нитро-

зо-Н-метилмачевияу е концентрациях 0,1;0,3 и-0,5%а в .течения 20, 60, 20 и 120 мин. Обработанные мутагеном клетки высевали на сусло-агар м растили 7 суток. • - -

Статистическую обработку данных по виводу ыутеций проводили по Дакшу Г.Ф. (1S60). ' . .

Ауксотрсфнш • КОЛОНИИ ВЫЯВЛЯЛИ пересевом КУЛЬТУР На полноценную и голодную питательные среды. Культуры, ке способные расти ка голодной среде, вырацявадн с добавленийц ростовых Факторов по методу Holliday (1Є56).

Отбор мутантов е повышенной ад-синтеэйрукврй активность» проводили после глубинного культивирования всех полученных мутантов на среде для скрининга прямым определением. ШуГ в культуральной падкости и биомассе. • -

Уделгну» скорость роста культур и удельную скорость .накопления НАД*" определяли по увеличению числа клеток и содержащее НАД+ через каждые 12 часов в течении 4-х суток.

Изучение ферментативных активностей проводили в бескле-точном экстракте после'разрушения клеток в гомогенизаторе Пот-тепа в течении 1-2 мин в холодной 0,25 М сахарозе и'после отделения сблошоз клеток центрифугированием при Ю тыс . со/мин ■О мин. Активность йбД-гликогицролазы определяли по методу Kaplan et al. (.1957), вмралая удельную активность в кМ расщепленного НАД'*’ в минуту ка мг белка ферментативного препарата. НКМН-пипстосфсрилазяую активность определяли по Imsande et ai. (itiri4), шпааая удельнуп активность в нМ образованного мононуклеотида на мг белка в мин.

Тонкослойную хроматограф*® промежуточных продуктов синтеза НАН" проводили на пластинках РЕ! и "Siluf'ol" в 0,5 М.формиате натрия,.рН-3,4 г: в системах изомасляная кислота : аммиак : вода - «5 : і : 33, 0,25 И ацетат аммония, рН-5,5 (Barton et.

ai.,1977).

■ Содоржшэ- белка определяли модифицированию* методом Лоури (Larsen et ai.,,1586).

K0JT!I4SC*E2O 6ltCM?.CCU 3 ходе !СуЛЬТИЗНрС”£НПЯ ОП‘.'«>Д(?ЛЯЛИ грав:метр’,мес5<гг после вь?су1глван::я при 105WC.

’ РЕЗУЛЬТАТЫ ! 1СОЛЕДО3Й . '

1. Продутфстеяиэ НАД* репэдпальйьап! шт&мгячми дрегг.эя рода •

Soccharcrrycss '

■ Из 2В р?гпс?ЕУгакж стазов дрожэй рода Saccnrrcnvce^. _

отяссяпзпсся к 7 бяязгд (теСл.1) наибольшей НАД -снятезиррт."5и гэтизкостая по ножм данян> обладали 5 зтамиоз: 5. uvarun уЕу-3 (2,3 мг НАД’’/г с.з.), S.cerevislae 912а-1' (1,8 гт НАД"/100 мл среди), S.wjxunr-552 (1,7 кг ШЖ*/100 мл среди), S.uvarumV55tf (1,6 ?.т НДЦ+/100 мл среды) и S.vini S29 (1,8 мг HAaViOO мл среды). ■ . ' ' ^

Во все:( исследованных гатаумах ^«ксюладьикй • синтез НАц*-наблюдался з клерках нахоцяпяхея з зкелен^ню-гльней фазе поста (рис.'О. В зависимости от возраста нульч-уры содер/бчин*? НАЛ’ з отобранных дрохяах колебалесь от 1,5 до в vr/r. с. в. при этом наибольшей суммарной продуктивностью на протяжении всего роста отличался rrravM S.cerevisia® 913a-i.' '

Как показал» результаты наших опытов по сценке экзогенного влияния предшественников сэлвидк-синтеэя кофермента - нико-тиначида и аденина (табл.2), рфректизиссть их воздействия на накопление НАЛ* в наследованных ятяммах дроэтсей неодинакова. Так, наибольшее стимулирующее действие было отмечено з 3. uvarm d58 (222Z). .

■ Однако, учитывая суммарную продуктивность культуры, для лоследуте^й мутагенной обработки в качестве исходного родительского штамма отобрали S.'cerevisiae ,У13а-1. в котооом стимуляция првдкрстрекниками биосинтеза НАД” состояла 1*у%.

. Габлі-ща 1

Прздущрованкэ Н/Щ* дргакаш рода Saceharmyc&s ; (ерздЕие вэлшшш из & сштов)'

.Вид дракгсей ' | Штєіім 1 Рос“Р, 1КГ/Ы2 т, ІЛГ/Г С 1 їїродуп- БіїїіЕЕОЄТЬ (кг/ІО&ш

1. S. ооге vlsleD, l.tegen, - (eiiд.ка £з і 10,6 1,34 1 ■*’ ^ А [ і , ■*-».

1833. , (SISa-i ( 19,4 1,11 і 1.8І-К

(5(7) ! 9,3 .0,23 ( 0.S5

15(12) і 8,3 1,54 ! 1,27

S.S.chodati.Stelnsr, (150 1 8,3 0,бо ! 0,71

1924. (235 і 9,9 0,83 t 0.S7

3.S.he terosonijOstsrvai der,1924. (у-si і ( 18,5 1,10 1 1,45

4.S. ovl f onnls, Osterval (Xspaa-QSK 1 7,5 1,03 і 0,77

d-3r(lS2S=. ■ - (Херэо-53 і 9,6 1,06 1 1,02

Б.S.prostossrdovi,sp.nov Kudri avzev,1933. ' (Г-ЗЭ і 7,9 0,54 ! 0,43

6-S.uv£mtt,B3l3orlnck, (552 ■ 1 8,9 1,83 1 • І,63*г

18Э8- (553 . І 10,9 1,45 1 1,53*.-

)923-3 і 4,9 ■2,32« і 1 ЇЙ ) ■*- S *

?-S.vlnii Meysn, 1833. (Сшеравк-оЗ І 0,4 1,05 1 0,0В

(I Эрг1Э“*53 1 8,7 1,67 1 1/45

ІЦоЕіка7рії-25 ! 8,7 1,12 1 о.ез

jHESypH-42 ! 8,0 0,43 і 0,25

} 1*й . ! ю,з 0,53 1 0,53

|ШЛ05223Я-7 1 7,2 0,1В 1 о,із

{Уэ-Яа-1 1 11,2 0,44 ' і 0,41

!5?8-й2-153 І 5,3 1,18 1 0,63

}йз-1 . . ' І 9,0 0,86 і 0,84

{Я-72 ! ю,б 0,61 і 0,64

ІЕ-10 І S»5 1,70 І 0,03

1ІІ-02 і 8,8 1,20 І 1,14

1553-а ' І 7,2 1.&-І ! 1,15

S 815-3 ■ 1 10,4 0,35 і 0,83

10=9 • і 31,і> і; 50 1 1,76*

КЛДГ ш’А’ ілу;ля

Влмянує кіїкотжууидз і: гценкма на п?слігК"’5рнссгь &Д' v і-г/тгнгялЛ хіьчс'Л S.csr«v1si£«s (средние- значения ПТі 6 повторностей)

Отоач ’ ! Ces л соазок і с^?икй+я:'к0гі'лна\<'.'" \

і Pcor, : &л ‘ j І ?ос-т., 1 їж, ! ст:!;<--л:1ц;^5

1 /:'Л і ;,?"/? С. 2 1 МГ/ІЛ.Л і МГ/Г С.Е і

Е5Г; 1 і і.СЬ і 6,0 -і І ; 64 ї IL’-ij -!

Є5;; і •••.., ; с.йз і 5,*: ! 1.?2 ' і £:С;; 1.

Qica-l і 1C.. 7 ! -,0> і : і, с 1 ' l.iu: 1 1Ь7,7

Q'y.) і ::,0 ( *•' Г ... і -*,:7 І : ^ 3 ; ■ іі;;£

vt-i ”’j ! і,б і С,0:: і - - 1 і

гуіснгсі. ■

Д."л п&зтпення “ггсчйїінх лугснтсг; !-:cnosscr-3,rt сб’д^ггтпшгтг itt-czwj !*а?.&рсга Г).Л. (Н^*4;. Е к?.чесгз9 ;.:у7г.гг::.ного ссл/тсрг.

к:і"гого-і,;-пз'?ііл:-:сцбв::щ' (Н?іО. с-':-:-.го:^:'.;-

я~:,я ио.Г/'іеп::* aytzHZ'ct С‘<ага:;аеь сср.^остхг, С.5л R::; -т я'вчсн.н: t'J—.'G и*ла. £і"'”^гл*.'і>зть при sr.is ’дсгг:-: ссст'-.гкла сп-отьйтс'гг^Иїїг: £Д и і П.-жём, ^акепмагькоэ кол'іч^оті’о мср-

!толог:,ччс;с::- и’/гавий ісяе г.а£лшалссг при ої:а ісзьл і: ссс^гі-~;:лс ес-.ч. . -

І.:л йгогогг^с'д'ггс по Н^л^”и«'.ирук!??й сссссбксс-

ТИ НЯ’Л’Л (Ч!~С С.’ІГ^'-’лС С '0 . ■ .

' ••:•••:.-. с.^"::с?гсгнснтг ””у"-ннн:: культур к'яьглла к--Й~;; Пу:с;ЧВ2!П?СГі Д'"Г. ГОСТІ".: -Q1 ~ ї- -ї• ;ОТ:їН-“,

п::~'-;'гко-л;:е, 1:;гс:\инв: ійО - гкг:и:еЕой нкелсїв, сїі'Мі-,

-л-Н-."V" і-'.' ■■-г'тvJ-; СПСГ’С(І';СС?” ПОГ.ТО?НГ'Г‘;>;Ч7 ^ря'.ОДП.1’;' >'*ТСї‘Л'; ТТГЧМОГС !!',\ГЄГЄК:!Я ОС^йр;.,ел:.'Я ЬКуІ'Р;:- її

л-'^оч^^гп г"’; 10'а ":ул^т;:иМ]'95о"‘^} K/’oh'v.'-. .

:itr■ifimr.r.h, ЧТО Л*™:’' f' І" ПЛ,“7Ч!?ННЬТХ ГТГОТОТр1"^':1^!'-. гТТ'Н'ЗБ

'■n-'.’-'V,.'!'1 f)04*^9 вчпомпй Н/'Д-СЛН?9?Т!ЧРСКСТ1 й?'г!'РЯКООТ5 Г П,'> СС-г,.ь-

иаиуп с г.ппііт-е.пкпісі'їм 'ТгЮЛ.Я). Ttnn Г?CV

т!дтъ. ч^о ,.«;,,гснт!1 ^'"'ьР.гтлнвэл!! гнутриклеточно, а гГ0іГ -св«т*>тмроваяи когрррмент б среду.

. - ■ Тлблиид 3

С?СЗрОП2НЭ уутсатл ЛС, среде ДД.Т Сэггчентоцди

П?сгм 1 НАД4-, 1 Г.Г/Г 0.3. 1 £'Д*. | МК7/‘!Л | Рее™,мг/;я! Стглз. | | мг/1СО мл

10 1 0,7 +• 0,2 | 70 0,2 ! 9,8 | 3,5 ’

110 I 2,5 ч- 0,2 \ -10 *• 0,2 1 Ю.2 | 0,7

118 1 1,7 + 0,2 | 20 +• 0,2 ! 2=1,6 ! 6,2

£С0 | 1.5 + 0,2 | 70 * 0,2 1 0,7 ! 3,2

215 \ 1,4 0,2 | СО.'1* 0,3 1 е.з ! 5,4

иС1и • игт*. ] 1,0 + 0,2 ! сО -:- 0,2 1 ю, с | 4,8

Тажк? сСрадсм, з результата г^тлгаппсго т;сздо*"сг2г»я Е”.1 па

З.ССГ5\Чз1?Л 91сГг-1 &ДЛО ЯСЛ7«ЗЯО ЛЛТЬ ^СДТСЗ С ПСВН-

38йЯОГ£ НАЦ-СПЯ'ГЭЗЯртггзеГг еПССССлСС'ГЫЗ.

оЛ:с?5сдсгс-|'5г.!--:о,-1с?:^2с:сая. ::аро:?г£рлстл:?в: иулглтсл

3. с?гз’Лл1гэ 015*тг—1 •

В пгстс^ее .ЗГ-5ГТЛ ПОДТЗерГЦбПС ПрЗДПСДСГгНПЭ ‘О -ГСМ, ’ что мор4сгоп(чес:сг9 группы яздпэтсп пспулпцхаа-'Ма вдкягцкш итль-•Т7?У Дрс::сй1!, псз7с?<7 рмпсобргижз '1Х£&:спяеск:я групп г.сг*? страсть глуб*~т7 ;п"ге.г?г“!;сго эл^-кта (К'/слчет-ко Д.А.', ЮСОЗ.

В езязп с .лпл; представляло гштер^с поучение керг&локзюе-' ктпг пзнеяежгй э пелучзнныл стг^ж как одного :-:з уг«д1ггг.пьга.п дсказа-тельссз НУГЛрСЕаЛЛЯ РОДЦТОЯЬСКОГО етпл.-э.. '

: Скагалссь^ что стз^етзув? ппка стагккя ;;&щг рсяггедьассй

и гсл;":е!шь~;н ^льтурк.ш по мор£слоиш клэтск, резт/зрам п гсо-

МСЛ ПХ ГТГГГЛТСГСОН КОЛСНЛ’Т (табл.4). Исследсгепнне ГГ'ГГСЯТЫ ’"'Э-лп стабпльлне Г.СР70ЛСГЭТЭСКП5 з&рзкгвряждл, ■:$■ "здягдлёсл з ряде пасскрсдгкнй. ■ • -

ССИСГЛ’С-Л ЛСЛЭЛЛСЛ ПгЛг'О п~Л5ТО !'ССЛ.-ДОГйЛ1 -Я ЯВЛЯЛОСЬ ПОГг-

ченле иутзятез 3.сггз-Лллла с повклелкк'! подергг,?гл9’..? Ь’ЛД" вохедсте:ш нлгутпенней регулящ:1! м$?гйол:!?г<о рад" . пел -тсу

сССС'СЭ йТИ!Мг.Л!!в ПрЛВЛЗКоЦЧЛ 1СЛК ’ 'УЛЛ’-Л;1!:! С БНССНСН С лccлт-^т^i'Г;I-

-^,?c.KuЛ активностью, ток к низке?-? НАй-двградативной Ф/чкш-.еп,

Л1.‘50 новее Л!!Е8ННЫе ТйКОВРЙ. ПОЗТСМу, Ш6Я В ЕКДУ О'ГбСП КЭЛСО-

ІлО і 10:00

; f • 20j: &

Р-г.з ; 3:- О

і ! &:: S

! г;..-.:

і:-: ;у?р::

rv.і'і

F: с.--і іОг: З

5s 2 ;

і 5;; 3 [

'.-pro- і -.з

У

І\\

і'-, « \ 1 і

Іг

і г

V. І-

* ■ / ■-1 ; * ТПТі (t ґ Л і V і ; і і і : і г; , •;

! і 1 ї &\. ! \ І

Ь І

і І І ! ; ■ -

Рііс. 2. Дііїігхмїїка накопления НАД’' к НАД— . ггідролабіюй и:;?лБіюст;і у получен . мутантов '' '

♦ - 10

- по

о - 118

й - 206

0 - 215

Н ‘■і

:;ra, пго;ісхс;:::о ~:::e :Л:У :'ори;.:ч;;:'^ y^yyy~ Lvtc'T:'" I'.'.-I" :i Г','?) і;,'"?-і1:'-:соі''л;іг1

. ■ ■ ■і ч ■ с. •' Г’1*''-. Ті :о ,7^» V, ""1C. "'С'-"'- ' j С' 0,~-' Л,'**’ '?,r:V ~

псз с"’*т:гс;^с;~г*г;т:ї ::/:rc";':r'V'! Ух’^ссч ■:у ' v■v“"!, г-

fv. ". --- і - усу :уг -ууу у*"',]У IL 'у. ^ \ .У 'УУ' ^ГГУУІ

уу':'.'"': 'уу " ~'У’уууу ' уі-'у с с 1 ;(У-.--;. 1 г;

,:cг.>;і12 '■ 7:1:'т/у." :

г.'г,' т::". уу~у ::,v".;,rT : у’уутуу: с.!~:у:су'ґ

ргсі'' - -У1''- ■ ’ л у - ссстл/ ‘Л 7 ,и .і’ ^ іу."

?і

уу-~у, С ! '-V' 7 “ УУ, ■ _ Г у-:;"'::: '] '

г^г'-^п^г--; ':с;: ri“fv~y-ry у;".; г.; ■; ■ < ^

н'.с/у';-;я”':у уууу у/ууу^уу у/ у і; о ; ."уу.ууу • у-■

Уус -‘Т-ууу’-'' ті'-л:: ::гтч--: iv уу:уу:уу.. у

чгсуу ууу-'-уоууогп уууг.ггу-’ :-у уууу у т у.-г

'( f і'' ГТ ■-* г> у ч —„-у- ...... ; • , -г»- -. ^

тс"С' п уу;гу:уу гу.у =>нт'‘, г- уугч п у

Г4^ і Т, •.-'•'.-•'Г.ПТ/Т- Г, » Г ^ тчР" У 1 ~ •; . ••

У'УУ- СУГ-'УС'У :• ууу-уу гууу.г ,-у -Г ^у’уу.ггу г-^г-у-^уп 7-7УУ <~'У\ у/\:у-■> ■•:*■■■: ■r-rvr.w--'-

"Г Г'Р.'г-'г-: Т'УЛТТ-'.К'Л , ГїС V, г-.~

Ч-Уг'і-іі- ЧУТ'ЛТ'І ОГ.ЧЯ’-’-^'ГОГі СГ ГН-:г;7?:іПГС УУ''-^

Р'у.у гуу-"""'.. ск'і^ссті::" о!:с‘-"с:м: ~;г‘тг!-::?лг?с'т-г’

зі-кумуляцігей НяД” и, кгксгеп, а:п::ГГіісе^'с--Н/^-г^.гілсгт:і;полг^.:-:.

її

ГІ

О

1 'I

<£> М

- 17 -

э.НАД-гликогидролазкая активность полученных мутантоз

Среди ферментов, гидролизукидах кикоткнамкдные нуклеотиды, патйолэе сироко распространена в природе НАДаза, отлепляющая от нуклеотидов свободный кикотинампд (Irnsande J. et al., 1952, Sundaran Т.К., 1957). З настоянко вреш достаточно хоропо изучены фязикэ-твюескк? свойства я характер регуляции НАД-гли-когі'дролазн в ряде микроорганизмов (Foster, Moat, 1980).

Как показали результаты незкх экспериментов, проведенных на !<утактах дроккей НАД-гликогидролазиая активность при росте 3 контрольной среде колеблется от 3,0 ед. в утаите 215 до 0,2 эд. Е муЕзктэ 10 (табл.6). В присутствии 3 мг/мл различных предшественников существенны” колебаний ферментативной активности з зависимости от вида внесенного преднественника ке отмечалось, хотя внутриклеточная концентрация НАД+ значительно повыпаетсп, з особенности, при добавлении в среду аденина совместно с. никотикамидон.

При внесении в среду культивирования различных концентраций предшественников оказалось, что только в двух мутантах 10 н .215 можно наблюдать зависимость НАД-гликогидролазиой актгі?-ности клеток уутантоз от внутриклеточного синтеза, индуцированного экзогенными ПрЄДП9СТВЄННИКаШ5.

' • Броке того, эти »гутанты отличаются от мутантов 110, 118 а

206 чрезвычайно высокой активностью не только п'ЛДазы, но и НКШ-пирофосфорилазы. При этом мекду 10 н 215 мутантами существует также двукратная разница как в содержании НАД'1’, так и в НДЦазной активности.

Следует откатить, что хараетер изменений НАДазной актит>-ностн в иутантах 10 и 215 отличается незначительно. Гак, против охидатга при. шщу»сп?и - синтеза РЛЧ* адеиином и никотинамк-дсм в глутакте 215 наблюдается почти дзукратноэ снижение гЩ-ззнсй активности. При этом/ как било отмечено прч ачаяк?^ предыдущих эксп?рвкгяталыяас данных, •' тех хе услг.ркях з этоу ':г/г:акте. cy:j;£;cTi?ef:i’0 иягг'проя^ка ип’пв^ость ЕКИН->»-лазы. . Олэдовг.'гзльго, увеличен;-:* ^^утрт'.тетсч-зэго с^г^утануя

пЛД+, ГО-БЇІДІГ'/С'У, СбуСЛ2ПЛ?ГО КЗ ККДУК1;И^Л СКГДОгя

ra, а кнг:--тг‘ро??.нхг!.!>го л потруї гл . .аналог::'.’нк:» -'V---':? г- vy-vs-rre 10 ’«сто лрм qo.;a,-> hv-cokxx к"ч:>Г:Пр'1'-и;?. ;»

'КїїОТ’ТНеі.'КДЧ. ' .

В трех мутантах 110, 118 и 206 исходная НАДазиая актив-

ность очень невелика. При росте этих мутантов'в средах, содержащих предшественники, НАДазная активность практически не отличается от контрольного варианта независимо от внутриклеточного содержания НАД4, вида и концентрации предшественника.

На основании полученных данных молено загсксчита, что снижение исходного уровня НАД-гликогидролазкой функции клетки позволяет в значительной степени увеличить внутриклеточный пул НАД4,■ таким образом доказывая вазгаую роль интенсивности деструкция кхфгрмента при формирования новых сгвдгдов какрооргаака-моБ-продуцентоз НАД*. . '

6..Влияние некоторых производных пиридина на НАД-синтези-' . руюг-ую способность мутантов

Способность микроорганизмов трансформировать пиридиновые соединения была установлена давно. При этом в основном изучалась способность микробов использовать никотин, никотиновую кислоту, кзокикотиновув кислоту, .пиридин как единственные источники углерода и азота (Довгилевич Е.В.,1990). '

В связи с этим представлялось.интересным изучение возможности использования дрожками производных пиридина в качестве аналогов никотиновой кислоты и никотинамида. " ■

Как показали результаты опытов, приведенные в табл. 7, в присутствии алкилпиридннов. имели место существенные изменения как в росте культур., гак и в уровне .синтеза НАД4. Наибольший эффект на внутриклеточный уровень НАД* оказывает наличие ?-яцвтилпирилина в среде кутатавировакия мутантов ю,- но, Ий; мутанта £06 - Корника и 8-метилпирйдина; мутанта 215 -3-метилпиридина. Остальные пирвдинн вызывали снижение внутриклеточного содержания НАД4,

Сравнение внутриклеточного уровня НАІІ в мутантах, -росших в среде с никотинамидом и производными пиридина показывает, что в некоторых случаях стимулирупщий эффект пиридинов на синтез НАД' ппевьтеет таковой никотинамида. Так, 3-ацетїушриднн вызывает Оольиую стимуляцию синтеза НАД'*' в мутантах 10, ПО, 1!Я, Корник - в мутанте 206, З-метилпиридин - в мутанте 215.

Полученные результаты свидетельствуют о тем, . что

5. сеге'/ізіае и его мутанты способны утилизировать некоторые

' Іадлит 5

Влияние пгщшестпенников Ш.ЗХ) на оиоемтчз НДЦ *, иг/г о.в, и Іі:іЩ-Ш!ро;юефор;стзнуа активность п ороіаетпчнпм экстракта мутантов, Ui ІШЛІ/аг оэлклЛнш ісоеднио- данииэ ’.із 6 опирав)

!:;'Г ЙМЫ dob дпоавок + аденнн + никотинаыид +8Д.+ ншктшьшиі + инк к-та + ад.+ ник,к-та

і і АЛ' iiivS.Hnii- pCiT'DOfpn- рняпза НАД* ИНННпн,- pnmnntpn-p nil am НАД’ НКННпн- рпфосфо- рилаэз _ НАД1 H;'’!.!h'VIUnO- тссФорїі- лаеа НА.1Ґ рс:росфЭ- рі!йага НАД* НКШлирп- фООфСрїі-

10 1 -] 0 2. Я Й.Й 10.0 n/Лі 2.2 3.4 ‘А. а "10.0 ' 1.6 . и. ft 4.п 1-;1 • 4. л 1.0 2.0 1:1 2.7 2- §

ля Н 1 ,fi 2. 7 in Й. У а. г а. 4 1. ft 2.6 4.7 2.0 6. а

‘.т 3.0 'A. 7 1П. ft -2.H 8.4 4. ft 1.h 2.4 rti 3.4

г:іб 1.4 И.0 6.0 1.7 v.o 1.2 6.4 1.7 1.3

Влияний. нпрдяїра'тчінитп ‘ яктнпнпеть,

, Таблица 6

<о,зх» .на олосянтеа НАД , мг/г с.в. и НАЛ-гликогидролазиую нм НАД /)чг/мин (орздше данный из б опытов)

штамм ПИМ цоптюк • + адешт + никотинашгд . +адонил+никотнначид

НАД1 НАД-т’икп- гидролаяа НАД1 МАД-ГЛИКО- РПДрСУЯайА НА.Г над-глико- гидролаза НАД+ НАД-глико- гкдраяаза

Ill 2. и 1.7 И. И t.ft ' 3.5 • 1.7 3,6 1.2

110 а.ь ().]>. 3.3 о.г? ■ Я '* з:й ; 0.19 4.7 0.13

11 Г! і. в 0.23 Й.'Н 0.6 0.?1 ' З.б 0.2

,‘Ткі і. її ' О.Ув 3.5 о. уз Я. У о .'г? 4.3 0.28

:лп 1.4 :і.О 1.0 2.3 1.6 3.0 1.8 2.1

•• . Табжца 7

B!W4IW> НРКОТОрЫХ ШфНДИНОРЫХ ПрОИаВОДННХ на биосинте» НАД , МГ/Г с. в.

мутантами дрпго;;ей (сроднив дглпп.'в из Ь опитові .

штамм Сез ДОПЧГіОїС t: НИКОТИН- амид ' + мети.япи-ридик + КОрНИ!" + Й,4-ДИМЭ- тилпирндин + 3,4,6-ТрЖЭ- шпаирщгт + ацетил-пирігдиїї

10 2.3 3. ft 1.2 1 .ft 1.0 . 1.0 4.3

і ю X. V 2. В а.п і •о.б 5.0

11 н 1 .7 ?.. Я 1.7 1.7 2.3 0.6' 3*3

,.-’0Н 1. ft M.fi 2. ft ■ 3.0 1.2 !. Л 8.3

2. і 1-ї 1.4 1.7 Й.Й 1.4 . 1/6 . !.0 1.7

. - ко -

пиридиновые соединения с существенным приростом в содержании НА1Г, очевидно, вследствие способности мутантов трансформировать указанные соединения в никотиновую кислоту или никотина-мид. Представленный данные предполагает, что рассмотренные пиридиновые производные могут быть использованы в качестве аналогов наряду с никотинамидом при ферментации дрохжей с цель» получений НАД1-.Шесте с тем обнаружение трансформации пириди-ноь с помощью полученных мутантов свидетельствует такке о том, что мутанты могут быть применены * разработке новых методов микробиологической трансформации пирпдииов в никотинамаднью коферменты.

ВЫВОДЫ: .

1. В результате скрининга региональных штаммов дрозккек рода Засс^агогсусеэ установлено, что суммарная продуктивность местных штатов сравтв с таковой известных дроияевш продуцентов НАД+. Показано, что максимальный биосинтев кофер-мента имеет место в экспоненциальной фазе роста дрожей.

Посредством химического . мутагенеза с 'помощью нитро-зо-М-метилмочевины получены-мутанты» среди- которых отобраны пять прототрофных клона, существенно превосходящие по продуктивности исходный шташ и отличающиеся от родительского по морфологии, динамике роста к накоплению НАД+. .

3.Изучены БКМН-пирофосфорилазкая и НДй-гликогидролазная

активность мутантов. Показано, что увеличение продуктивности полученных мутантов обусловлено не.увеличением ЗффЭКТИВНОСТЕ с з лы-тдп- С5ШТ5 з а НАД+, а снкиакиеи интенсивности деструкция ко-ферыента. ' . .

4.Впервые показано, что при использовании некоторых производных пиридина, кспольеуеьалх-з зпшгазскот.? синтезе шоито--вой кивотхы и в качэствэ аналогов тататаеащдг-в отдельны): мутантах дрогшей ироиеходат гетизация синтеза НАД'*’.

' СШСОК ОЛУЕБЖОЗйЕЫЯ РйБОГ :

1. Продуцйрогадкэ Ш$ грпбоы РиззтИпп за.’пЬиотиз./Х^.му-Р2Л03 &.Г. ,ГухйК0Е2 ?Л\,?узпзва Д.М.,Еакиргнкова Ы.?.//Тезпск ДОЖ. XIV {.;'ЭЕДЭХ2'Э£СКОГО - съезда ' по о5ц^гй П ЩНКЛЭДКОЙ хк-ыи?..Т&г-геят. 1939-Т.2,еекщк 3,с.£34-335. "

- SI -

2. Получение витаминлнх продуктов с помоиью микроскопии

есіїого гриба Fu^ariim sa^bucinum.Z/ryJiHMOBa -Т.Г.,Супрун .И.«Рузнэвз Д.Н..ШакирэяноЕЗ Ы.Р.Далмурадов А.Г.//Тезисы зга. Всесоюзного симпозиум "Биохимия сельскохозяйственных двотных и Продовольственна! ■ програ>а?з'\Киэв. 23-28 зкт.18В9,с.35. ■

3. ьсгїю festures of HAD biosynthesis from precursors- tt.6

:s regulation in Fusaritm sambuoinun fungus/ №almuradov

6. .©ilysnova T.G. .Ruzieva D.M..Shakirsysnova M. R.//Abstracts ’ X Joint Symposium of Biochemical Societe of USSR a^d GDR loohsnissis of ceLl activity".Tashkent.September 18-2?

989.Moscow.1933,p.Є5.

4. Ко’рэрмвкткыэ витамину кормового препарата грибного

гоисхождения. /Гудямора Г. Г. ,3агсордонец Л. А. .Супруг! С.И.,Ея-'вккяа й.В. .Шакирзянова К.Р.//Тезиен дери. конференции "Проемы штробного синтеза витаминов, и id: произвол ньй:“. Тяп- .

НТ. 12-14. КС9Л 1990.Ташкент: Матоуот. 1980,0.55*57. .

5. HAD production by Fusariurr. sa’nbuclnum cells./Quiyanrava G. .Supnin S.M. jishalmuradov A.G. , Snsklr^yanova №. R.//Abstracts

ШЗ Congress: Bacteriology and mycology. Osaka. Jz-

n. 1530. SsptP-^bar 16-22.Abstr.N 1623.

6,. Jocularities cf HAD biosynthesis in Fussriun sambuolmrr: 11s end its. regulation/Khalmursdov A.3..Gulyanova

3.,Snyeva D.!-j. .Shskirsyanova hi.P..// Abstracts of 20th FEDS Jtlna, • Budapest. Au~est, 1330. sintr.' К 1422.

?.. пр23?г£рог.£}Я-г ш?-кї?піга*.{кда’’9Пйкз!шуітасгггла кэ«:отори-гл^трсчггчэт--.-.; / рууэетзз Т.Г., ругг-эвг. ДДІ., Оупруп о.’.'.,

гок?л И.Д., . Пзгггргяпэга М.?.,. ла.«!урглсз Л.?. // ;1;->:ро5и-~ур. 1QS2„ 53, Н 3> с." 23-20. .

3. СзоззЗ ь-гф-тляпк:;’': дубового гвгкоярлхп./.і^гажиц?? * :. ,Арп'л:.:::пу Г. В. ,Qrr,r?:; С. 11.,?c<V::o'£ ?>.С. Г. Г.

7збекистон Республикаси Фанлар Дкадемиясининг ' г,якроОиология Института

. Шокиряонова Надина Рустамовна "Очитки ішкрооргашвшгар-юрасвдан никотинаивд кофармента шалав чикарувчиларинн вдшршп ва анвдлаш".

Биология фанлари ндазодлигига тавотя этнлган дяссартадаяншг автореферата

• Ндсца хулсса .

Хдагоя 1393 Ёил 17 ишда Узбекистан Фанлар Академняси микробиология шститутинияг мщсус кангашияа оулади. 7С0І28, Гошент-128, А.Кодирий кУчаси 7б, Викройиология института.

Диссертация ши взграи, 4 боб, хулоса ва амалий таклиф, фойдалашлган адабибтлар руйзсати ва изоадан иОорат. -Ид матки /об' оетдан иборат Сулиб, 10 кадаал, 22 аслидан олкнган расмларни уз ичига олган. ■ •

Мадаллай сахароницвт-ачитвдларга тегшли Бассігаголусєз сегеуізіае 9ІЗа-І штадаи їШГ-ашіаб чщувчшшн кобилаятэ щори бУлган мутантлар олш учун асос щшб тавланди. Кимбвий мутагенез йУли'бшюн олинган мутантларда ЩҐ’нинг хунаЗрадаги. мвдори Утмшздош пггашадагидав 2-3 марта щорилиги анщланди. Шунингдвк, улар уз уташадошдан хужайра тузилнши ва хажш кихзтидан, ?сш тезлиги ва НАЛ* нинг хужайрада тупланиши демда НАД-гликогидролаза антивлиги бшюн фарцли • эканлиги курсатпда. НАД+мивдоран щори. даражада б?лиши, коферментнинг эффектов "сэлвиж" синтезига бсглщ булмасдан, НИГншг фермент брдамида парчаланш активлипшинг сусаЯзвш билан Ооглщ эканлиги анщланди. Никотин кислотасини кимбвий ишлаб чзщаршда хомаш'5 сифатида ишлатиладиган 3-мвтилшридин ва 3-ацетилпиридшларни ЗассЬаготусез сеге’ліеіае ачитци мутантлари, НАД+синтезида ' эффектив Узлаштира олш ^сОшгаятлари илк бор курсатилди.