Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологический способ получения флавинадениндинуклеотида

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Хромова, Мария Геннадьевна, Москва



У

¿/ с?

л

1/ с

с/ /

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

на правах рукописи УДК: 577.15.013:663.18

ХРОМОВА МАРИЯ ГЕННАДЬЕВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛАВИНАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор технических наук профессор В.М. Кантере

кандидат биологических наук

Н.П.Королев

Москва. 1999

Содержание:

Введение.......................................................................................................6

Обзор литературы.....................................................................................10

Глава 1. Характеристика флавинадениндинуклеотида........................10

1.1. Общие сведения о ФАД..........................................................10

1.2. Физико-химические и фармакологические

свойства ФАД..........................................................................11

1.3. Лечебное действие....................................................................14

1.4. Синтез флавинов микроорганизмами...................................17

Глава 2. Биосинтез флавинов микроорганизмами..............................26

2.1. Влияние состава питательной среды на рост продуцентов.............................................................................28

2.2. Влияние источников углерода................................................30

Глава 3. Пути синтеза ФАД...................................................................31

3.1. Химический синтез ФАД........................................................31

3.2. Ферментативный синтез ФАД..............................................37

3.3. Биосинтез ФАД......................................................................43

Заключение по обзору литературы..........................................................48

Экспериментальная часть..........................................................................50

Глава 4. Материалы и методы исследования......................................50

4.1. Объект и методы исследования...........................................50

4.2. Материалы, применяемые при проведении исследования..........................................................................50

4.3. Методы исследования..........................................................52

4.3.1. Определение количества бактерий нефелометрическим методом.............................................52

4.3.2. Определение значений pH ................................................53

4.3.3. Биосинтез ФАД....................................................................53

4. 3.4.Методы определения и выделения ФАД..........................57

Глава 5. Обсуждение результатов........................................................63

5.1. Поиск активных бактериальных штаммов-продуцентов ФАД.........................'......................63

5.2. Изучение возможности получения мутантного

штамма В. ammoniagenes АТСС 6871................................66

5.3. Влияние источников углерода на рост

мутантного штамма № 65....................................................68

5.4. Влияние концентрации пирувата Na

на накопление биомассы и ФАД- образование...............71

5.5. Зависимость ФАД-синтезирующей активности мутантного штамма 65 от времени выращивания биомасы..........................................................72

5.6.Влияние возраста и дозы посевной кулыуры.....................75

5.7.Получение ацетонового порошка из биомассы

клеток мутантного штамма 65............................................78

5.8.Сохранность ацетонового порошка.....................................80

5.9.Влияние концентрации предшественника - РМФ- Ма

на образование ФАД.............................................................82

5.10.Влияние концентрации АТФ -И а

на образование ФАД............................................................83

5.11 .Влияние концентрации сухих клеток

на биосинтез ФАД..................................................................84

5.12. Влияние концентрации буферов

на ФАД- образование...........................................................86

5.13.Влияние величины рН- буфера

на биосинтез ФАД...................................................................87

5.14. Влияние объема буфера на биосинтез ФАД.......................89

5.15. Влияние продолжительности реакции на

биосинтез ФАД.......................................................................90

5.16. Влияние температуры реакционной среды

на биосинтез ФАД..................................................................91

5.17. Выделение ФАД из реакционной среды..............................92

Глава 6. Рекомендации по разработке биотехнологического способа

получения ФАД с помощью бревибактерий...............................94

6.1. Описание технологического процесса

получения ФАД.......................................................................94

6.2. Физико-химические свойства

полученного препарата ФАД.............................................109

6.3. Расчет технико-экономических показателей........................110

Выводы...........................................................................................................—113

Список литературы.........................................................................................115

Приложение......................................................................................................125

SUMMARY

The biotechnological method of FAD production by selection of the high-active mutant strain Brevibacterium ammoniagenes ATSS 6871 is worked out for the first time. The metod is based on enzymatic bioconversion of dinucleotid predecessor (ATF-Na and RMF-Na) into coenzyme in the reactivity media.

As the result of screening the culture Brevibacterium ammoniagenes is selected and the mutant strain is obtained on its base. This strain prossesses the most FAD - synthesized ability under certain conditions of cultivation.

The conditions of FAD - synthesized strain Brevibacterium ammoniagenes growing are selected and the parameters of performing FAD biosynthesize reactions are carried out.

The method of evolving coenzyme from the reactivity media and its purify is developed. This method allows to obtain FAD preparation containing nor less then 90,2 % of the basic substance. The final preparation contains nor more then 5% of flavin admixture.

б

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Недостаток витамина В2 (рибофлавина)в организме приводит к серьёзным изменениям в обмене веществ. Нарушается синтез белков и нуклеиновых кислот, обмен ряда аминокислот, углеводов и фосфолипидов. Функционирует рибофлавин в клетках как составная часть двух коферментных форм : флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинаде-ниндинуклеотида (ФАД), осуществляющих реакции дегидрирования в процессе метаболизма. При ряде заболеваний (гепатоциррозах и др. болезнях печени, диффузионных кератитах, конъюктивитах, экземах, дерматитах, стоматитах, ряде аллергий и алкоголизме) патологические изменения в тканях могут возникнуть вследствие нарушения реакций фосфорилирования и нуклеотидирования витамина В2 до ФАД. Эффектным средством профилактики и лечения перечисленных заболеваний является флавинат (динатриевая соль ФАД). Результаты клинического исследования флавината показьюают, что по сравнению с витамином В2, он более эффективно и пролонгированно сохраняет повышенный уровень флавинов в печени, влияет на уровень холестерина и фосфолипидов в печени.

Производство ФАД может быть осуществлено двумя способами: 1) химический способ. Недостаток - очень дорогостоящий, многостадийный процесс, не являющийся экологически чистым из-за использования вредных для организма соединений, таких как пиридин,

дициклогексилкарбодиимид и др.;

2) биотехнологический способ с использованием микроорганизмов. Активным продуцентом ФАД является дрожжеподобный гриб ЕгетоШесшт авЬЬуи, который использовался при промышленном производстве ФАД. Однако этот процесс имеет некоторые недостатки: низкий выход продукта и большие потери при его очистке. Как более прогрессивный метод предложен ферментативный синтез при помощи бактерий с добавлением в среду предшественников ФАД .Этот метод нуждался в совершенствовании из-за ряда трудностей- соблюдение строгой стерильности, длительность ферментации.

Научная новизна. Разработан биотехнологический способ получения ФАД с помощью нового, отселекционированного, высокоактивного мутантного штамма Вге\1Ьас1епит аттоша§епе8 АТСС 6871 №65. Метод основан на энзиматической биоконверсии предшественников динуклеотида (АТФ-Ма и РМФ-Ыа) в реакционной среде в кофермент, где в качестве биокатализатора впервые используются высушенные ацетоном клетки продуцента.

Подобраны условия выращивания ФАД - синтезирующего штамма № 65 и отработаны параметры проведения реакции биосинтеза ФАД.

Модифицирован разработанный ранее метод выделения кофермента из реакционной среды и очистки , что позволяет получить препарат ФАД с содержанием не менее 90,2% основного вещества.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработана технология получения конкурентоспособного на мировом рынке и рынке России кофермента на основе отечественного сырья экологически чистым методом. Биотехнологический способ получения ФАД относится к малоотходным технологиям и достаточно прост в аппаратурном оформлении. Требования, предъявляемые к микробиологическому оборудованию , менее жесткие, чем

требования к оборудованию для химических производств.

Разработан опытно-прмышленный регламент на производство ФАД и наработаны опытные партии препарата.

Цель и задачи исследования. Целью диссертации является разработка биотехнологического способа получения ФАД альтернативного химическому синтезу и более эффективного по сравнению с ранее существующими биотехнологическими способами.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

- провести поиск продуцентов кофермента среди бактерий, принадлежащих к родам Micrococcus, Brevibacterium, Coiynebacterium, Alcaligenes;

- изучить возможность получения мутантного штамма Brevibacterium ammo-niagenes АТСС 6871 с высокой продуктивностью ФАД с помощью генетикоселекционных методов;

- исследовать влияние возраста посевной культуры на уровень биосинтеза ФАД;

- изучить влияние условий культивирования штамма и состава ферментационной среды на рост В. аттопладепез;

- разработать способ обработки полученных клеток культуры, обеспечивающий высокий выход ФАД;

- подобрать оптимальные условия проведения реакции биосинтеза обработанными ацетоном клетками В. ammoniagen.es;

- разработать технологическую схему получения ФАД биотехнологическим способом.

ю

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 1. Характеристика флавинадениндинуклеотида ( ФАД ) .

1.1. Общие сведения о ФАД.

В 1938 году [118] Варбург и Христиан выделили из почек и печени овцы и лошади и дрожжей флавинадениндинуклеотид как кофактор оксидазы Д-аминокислот. Структура ФАД была установлена на основании идентификации продуктов его расщепления, которыми оказались ФМН и АМФ . Позднее строение ФАД было доказано синтезом из серебряной соли рибофлавин - 5'- фосфата и 2', 3'- изопропилиденаденозин - 5' - бензилхлорфосфата [ 75 ].

I 2

Флавинадениндинуклеотид, Р - (рибофлавин-5') - Р - ( аденозин - 5') пирофосфат - ФАД ( рис. 1 ) - состоит из молекулы рибофлавина, этерифицированной по первичной гидроксильной группе остатком фосфорной кислоты и соединенной фосфоангидридной связью с аденозин - 5' - фосфатом (АМФ) [ 7 ].

Рис Л Л Структура ФАД.

Эмпирическая формула флавината С27Н33015К9Р2.

Молекулярный вес - 785,55

Динуклеотид благодаря своему большому значению в жизнедеятельности организма является одним из важнейших препаратов витаминной и фармакологической промышленности. ФАД является одной из форм флавиновых коферментов и входит в состав многих окислительно - восстановительных систем [71].

1.2 Физико-химические и фармакологические свойства ФАД.

ФАД представляет собой порошок желто-оранжевого цвета хорошо растворимый в воде и практически не растворимый в спирте.

ФАД имеет подобный рибофлавину спектр поглощения А шах ( 5 ) в воде : 450 ( 11,3*10®), 375 ( 9,3*10'), 263 ( 38,0*10') нм [ 72 ]. В водном растворе ФАД при возбуждении ультрафиолетовым светом флуоресцирует ( желто-зеленая флуоресценция ) с ] тах 520-530 нм, причем интенсивность флуоресценции составляет 18 - 20 % таковой для рибофлавина [ 7,16,119,120 ].

В отличие от рибофлавина ФАД в водных растворах устойчивее к фотолизу примерно более чем в 20 раз, однако в водных растворах при нагревании он быстро дезактивируется : при 100° С за 4 ч активность ФАД на 30 %. Для стабилизации ФАД к растворам прибавляют этилендиаминотетрауксусную кислоту [ 20 ]. В щелочных растворах он быстро расщепляется. ФАД является слабой двухосновной кислотой.

Флавиновый кофермент - ФАД - легко присоединяет водород ( протон и электрон ) по положениям 1 - N и 5 - N изоаллоксазинового цикла, отщепляя его, как правило, от восстановленных форм никотинамидных коферментов (НАД-Н и НАДФ-Н) или в некоторых случаях непосредственно от субстрата - донора водорода. При восстановлении

ФАД образуются промежуточные окрашенные семихиноидные формы и затем, с присоединением всего двух электронов и двух протонов, -бесцветные дигидросоединения : дигидро-ФАД ( ФАД-Н2 ); обратимо окисляющиеся кислородом воздуха или цитохромами а, Ь, с в организме вновь в исходные окисленные коферментные формы (ФАД ).

Флавиновые ферменты имеют значительно более высокий окислительно - восстановительный потенциал,то есть, обладают большей

способностью к восстановлению, чем рибофлавин (- 0,21 В ) или ФАД

, 0 0

(от - 0,187 до - 0,191 В при 20 С, - 0,219 В при 30 С при рН 7).

ФАД образует эквимолекулярные хелатные комплексы с металлами : Са, М§, Ва, Сё, Мп , Со , N1. При действии азотистой кислоты происходит дезаминирование ФАД ( в структуре аденина ) с образованием 6-окси (дезамино) - ФАД.

Воздействие света в щелочной среде приводит к расщеплению ФАД с образованием люмифлавина.

Составной частью флавиновых ферментов является витамин В2 -рибофлавин. Недостаток рибофлавина в организме приводит к серьезным нарушениям в обмене веществ, связанных с дефицитом флавиновых коферментов и, соответственно, ослаблением и подавлением активности ферментов, в состав которых входит ФАД или ФМН. При ряде заболеваний ( себоррейный дерматит ("вульгарной", "розовой"), лицевой рассеянной фолликулярной волчанки, при тяжелых формах

эндогенного арибофлавиноза, при заболевании глаз-диффузионных кератитах, конъюктивитах, при гепатоциррозах и других болезнях печени) патологические изменения в тканях могут возникнуть вследствии нарушения реакций фосфорилирования и нуклиотидирования В2 до ФАД. Биосинтез ФАД может нарушаться и в следствие снижения образования АТФ, вызванного, в частности, длительным применением антибиотиков и сульфамидов. Во всех этих случаях эффективным средством профилактики и лечения перечисленных выше заболеваний является ФАД [ 64 ].

В нашей стране в качестве лекарственного средства применяется флавинат - динатриевая соль флавинадениндинуклеотида. Флавинат поступает в организм с пищей, связываясь со специфическими белками он образует ферменты, которые катализируют окислительно -восстановительные реакции в процессах обмена аминокислот, липидов и углеводов, непосредственно участвуют в тканевом дыхании и окислительном фосфорилировании [ 1 ].

За рубежом аналогичный препарат выпускается под названиями : АдеНауш, Е^Паут, Паутт, Р1аука1 и др.

1.3. Лечебные действия.

Флавинат, в отличии от применения рибофлавина, можно вводить парентерально и он оказывается эффективным при нарушении

всасывания рибофлавина в желудочно-кишечном тракте [29]. Результаты экспериментального изучения флавината показали, что по сравнению с В2 он более длительно и в большей степени сохраняет повышенный уровень флавинов в печени животных. Отмечают более выраженное влияние препарата на уровень холестерина и фосфолипидов в печени. Активирует окислительно восстановительные процессы в тканях глаз при субъконъюктивальном и внутривенном введении препарата кроликам. В эксперименте установлено повышение физической работоспособности животных под влиянием препарата.

Малотоксичен, не оказывает местнораздражающего действия [17]. Биологическая активность флавината определила спектр терапевтического применения :

в офтальмологической практике при дистрофических поражениях сетчатки глаза, активируя окислительно восстановительные процессы в тканях глаза, способствует стабилизации процесса. Терапевтический эффект выражается в улучшении остроты зрения и адаптации к темноте, в расширении поля зрения, уменьшении центральной абсолютной екомы и исчезновении относительной екомы. Вводится препарат внутримыше- чно (медленно) - под конъюнктиву глазного яблока. Внутримышечно обычно вводят взрослым по 0,002 г (2 мг.) 1 - 3 раза в день, детям - 0,001-0,002 г.

в сутки. Курс лечения продолжается от 5 - 30 дней и более (до 40 дней ). При необходимости курс лечения повторяют через 6 месяцев [30].

При комплексной терапии глаукомы вводят внутримышечно по 0,002 г. препарата 1 раз в день ежедневно в течении 10 дней.

При лечении заболеваний печени вызывает улучшение общего состояния, уменьшение болей кожного зуда, сокращение размеров печени, а так же спо собствует нормализации содержания билирубина, белковых фракций крови.

При лечении кожных заболеваний (псориаз, себорея и др.,) вызывает улучшение клинической картины болезни .(Применение : внутри -мышечном (медленно) по 0,002 г. 3 раза в день в течении 1 месяца).

В гематологической клинике эффективен при лечении наследственных гемолитических анемий, обусловленных носительством аномального нестабильного гемоглобина, при дефиците гпюкозо - 6 - фосфатде гидро-геназы или 6 - фосфоглюконатгидрогеназы в случаях гемолитического криза или постоянной гемолитической анемии при необходимости -приема условно противопоказанных этим больным препаратов.

Форма выпуска : флавинат - 0,002 г. для инъекций. В ампулах вместимостью 3 мл ; по 5 ампул в упаковке в комплекте с 5 ампулами воды для инъекций по 2 мл.

Хранение : в защищенном от света месте при комнатной температуре.

1.4. Синтез флавинов микроорранишсами.

Существует сравнительно много публикаций, пок�