Поиск и идентификация нарушений экспрессии генов в различных опухолях человека

Краснов, Георгий Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск и идентификация нарушений экспрессии генов в различных опухолях человека
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск и идентификация нарушений экспрессии генов в различных опухолях человека"

КРАСНОВ Георгий Сергеевич

ПОИСК И ИДЕНТИФИКАЦИЯ НАРУШЕНИЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В РАЗЛИЧНЫХ ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2011

1 2 МАЙ 2011

4845886

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной геномики (зав. лаб. доктор биологических наук Л.Ю. Фролова) Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель: кандидат химических наук

Вера Николаевна Сенченко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Евгений Александрович Климов доктор биологических наук, профессор Александр Васильевич Карпухин

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится кЛ^сди 2011 г. в -¿У часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан « СМмое./гХ^ 2011 г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в развитых странах мира онкологические заболевания являются второй по распространённости причиной смертности после сердечнососудистых патологий (Jemal et al., 2010), что связано с отсутствием доступных методов диагностики, эффективных для выявления заболевания на ранних стадиях, когда хирургия и другие методы лечения позволяют добиться наилучших результатов. Это делает актуальным поиск потенциальных генов-онкомаркеров, уровень экспрессии которых значительно изменяется в опухоли по сравнению с нормальной тканью. Также в качестве онкомаркеров могут выступать альтернативные транскрипты мРНК (Cheng et al., 2005; Liu et al., 2010) или их белковые продукты, практически отсутствующие в различных нормальных тканях человека (Morre et al., 2009).

Широкая доступность большого объёма геномных, транскриптомных и эпигеномных данных делает востребованной разработку и дальнейшее совершенствование новых методов и программных продуктов, позволяющих получать сведения об онкоассоциированных изменениях уровня экспрессии и других свойствах генов на основе анализа имеющихся баз данных. В настоящее время информацию об этих изменениях наиболее полно представляют данные гибридизации на микрочипах и таговые данные - EST (экспрессируемый фрагмент последовательности, expressed sequence tag), SAGE (серийный анализ экспрессии генов, serial analysis of gene expression), RnaSeq (высокопроизводительное секвенирование).

В настоящий момент существует ряд биоинформатических подходов для выявления потенциальных генов-онкомаркеров, основанных на анализе

2009). Однако при оценке возможных изменений экспрессии генов не учитывается распределение EST по различным клонотекам нормальной и опу-

dbEST - например, GeneHub GEPIS (Zhang et al., 2007) и EDGES (Lu et al., ( fc>

холевой ткани, частота мутаций и наличие альтернативных или аберрантных (не встречающихся в норме) изоформ.

Для экспериментальной проверки предсказанных по данным dbEST изменений используют метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), позволяющий получить точные количественные данные. Однако есть ряд проблем, связанных с этим методом, одна из которых заключается в необходимости определения эффективности реакции (Gevertz et al., 2005; Kubista et al., 2006) и более точного описания кинетики (Lalam, 2006; Rutledge and Stewart, 2008). С другой стороны, на точность результатов ПЦР-РВ влияет выбор контрольных генов, применяемых для нормирования данных. Уровень экспрессии этих генов незначительно отличается в исследуемом типе опухоли и соответствующей нормальной ткани. По данным литературы до сих пор нет единого мнения по поводу выбора приемлемых контрольных генов для рака лёгкого, почки и других видов опухолей.

Известно, что разного рода геномные нарушения - мутации, транслокации, делеции и др. приводят к развитию различных опухолей. Одним из районов, наиболее часто подверженных таким нарушениям, является короткое плечо третьей хромосомы (Зр). Для генов этого района также характерно частое метилирование промоторного участка, приводящее к снижению уровня экспрессии. Известно около десяти областей (т.н. «горячих точек») короткого плеча хромосомы 3 с наиболее частыми нарушениями. Среди них можно выделить два основных района - LUCA и АР20, находящихся на участке Зр21 и подверженных нарушениям во многих видах рака (Wistuba et al., 2000; Zabarovsky et al., 2002; Ji et al., 2005; Angeloni et al., 2007; Hesson et al., 2007; Kashuba et al., 2009). Эти области содержат большое число ге-нов-супрессоров опухолевого роста, как потенциальных (например, ITGA9, APRG2, VILL), так и тех, для которых экспериментально показана опухоле-подавляющая активность, например, RASSF1, SEMA3B (Neufeld et al., 2007; Wang et al., 2008). Для ряда генов этих двух районов показаны снижения уровня экспрессии при раке лёгкого, молочной железы, почки и других опу-

холях (Kashuba et al., 2004; Anedchenko et al., 2008, Pronina et al., 2009). Поиск новых генов-супрессоров опухолевого роста является на сегодняшний день важной задачей не только с точки зрения практического применения -поиска мишеней для последующей разработки методов лечения с использованием таргетной и генной терапии, - но и с точки зрения фундаментальной науки - изучения механизмов онкогенеза.

Цель и задачи исследования. Цель работы - разработка и применение биоинформатического метода для поиска и идентификации нарушений экспрессии генов в девяти распространённых видах рака. Сформулированы следующие конкретные задачи исследования:

1) на основе анализа существующих биоинформатических подходов разработать метод поиска генов-онкомаркеров и контрольных генов; реализовать метод в виде программного продукта;

2) апробировать метод и применить его для поиска генов-маркеров, включая гены короткого плеча хромосомы 3, и контрольных генов;

3) выполнить анализ полученных результатов и сравнить с данными литературы;

4) создать модель для расчёта эффективности ПЦР-РВ и реализовать этот метод в виде программного продукта, позволяющего проводить математическую обработку количественных данных;

5) подтвердить экспериментально изменения уровня мРНК для выбранных генов-онкомаркеров и контрольных генов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработанный био-информатический метод поиска онкоассоциированных генов и реализующее его приложение CompEST включает преимущества имеющихся на настоящий момент других методов и лишён их недостатков; в то же время этот подход дополнен рядом других возможностей - учётом мутаций, нарушений сплайсинга, степени равномерности распределения EST по клонотекам. Приложение CompEST, реализующее данный метод, имеет простой пользовательский интерфейс, что делает программу доступной и удобной для лю-

бого, даже неподготовленного пользователя. Дальнейшее применение этот подход может найти при анализе другого типа транскриптомных таговых данных, полученных методом высокопроизводительного секвенирования (КлаБеч).

Отобранные при помощи разработанного метода гены с потенциально изменённым в опухоли уровнем экспрессии или часто встречающимися нарушениями сплайсинга в дальнейшем могут быть использованы в составе панелей генов при разработке диагностических и, возможно, прогностических наборов.

Впервые предложен и успешно применён биоинформатический метод поиска новых контрольных генов. Контрольный ген ЯРИ1, отобранный в ходе исследования, может быть использован для нормирования данных по оценке изменений экспрессии генов для рака лёгкого и почки. Успешно показана применимость предложенной в диссертационной работе и реализованной в программе «АТГ» («Анализ транскрипции генов») кинетической модели ПЦР-РВ, а также преимущество этой модели по сравнению с другими распространёнными методами расчёта эффективности реакций. Апробация работы. Диссертационная работа представлена и обсуждена на семинаре Лаборатории структурной и функциональной геномики ИМБ РАН им. В.А. Энгельгардта. Результаты работы представлены: на 4-м съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14—20 мая 2010 года; на 6-й Российской конференции по фундаментальной онкологии, Санкт-Петербург, 16 апреля 2010 года; на 5-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 16—20 марта 2009 года; на 4-й международной конференции по проблемам вычислительной биологии, Москва, 20—23 июля 2009 года; на 9-й международной конференции молодых онкологов «Проблемы экспериментальной и клинической онкологии», Киев, 23—24 апреля 2008 года; на Итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2007—2009 гг. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования

и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы», Москва; на 49-й научной конференции МФТИ, 21 ноября 2006 г., Москва; на 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11—15 мая 2008 года.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей в научных журналах и зарегистрирована программа для ЭВМ. Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах, содержит 19 рисунков и 7 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы (283 наименования).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Метод анализа базы данных dbEST и программа CompEST

Предложен биоинформатический метод поиска генов, характеризующихся изменениями уровня мРНК или ее нуклеотидной последовательности в опухоли по сравнению с нормой. Разработанный подход основан на сравнительном анализе коротких последовательностей кДНК - EST, и включает: нормирование данных EST по контрольным генам; учёт неравномерности распределения EST по клонотекам; учёт частоты нарушений сплайсинга, мутаций, повторяющихся элементов и различий этих частот между нормой и опухолью; возможность отбора потенциально белок-кодирующих аберрантных транскриптов. Метод реализован в программе CompEST, которая имеет простой пользовательский интерфейс, что делает ее удобной в работе и доступной для любого, даже неподготовленного пользователя. В программе предусмотрена возможность автоматического обновления файлов данных - нуклеотидных последовательностей геномной ДНК, расположения генов, выравнивания EST и др. с серверов UC Santa Cruz и NCBI.

Нормирование данных с использованием контрольных генов

Одна из основных предпосылок, заложенных в основу всех таговых методов, заключается в том, что число EST для определённого гена коррелирует с уровнем его мРНК. Однако для корректного сравнения числа клонов различных генов в клонотеках нормальной ткани и опухоли и проведения оценки возможных изменений эти значения должны быть нормированы. Одна из особенностей разработанного метода, отсутствующая в ряде других аналогов (Baranova et al., 2001; Zhang et al., 2007; Lu et al., 2009), заключается в применении сразу нескольких контрольных генов для нормирования данных EST.

Предложенный в работе метод предполагает проведение нормирования с учётом того, что чем большее число клонов EST соответствует данному гену, тем сильнее выражена корреляция с действительным уровнем мРНК. Введём обозначения:

Nu - нормированное число EST для целевого гена / в клонотеке j;

E,j - исходное число EST для целевого (не контрольного) гена i в клонотеке J;

N;j - нормированное число EST для целевого гена / в клонотекеj;

Ckj - число EST для контрольного гена к в клонотеке j;

К- общее число контрольных генов;

Pj - общее число EST (представительность) в клонотеке/;

J - общее число клонотек. Метод предполагает расчёт нормированных количеств клонов EST N^ по формуле:

__Eij_

Li{Ckj + aP<<j)WkJ

Здесь: а - постоянный коэффициент, значение которого в CompEST по умолчанию равно 0.5 (оптимальное значение установлено эмпирическим путём);

Wk j - вес контрольного гена к, отражающий степень статистической значимости данных EST;

Pkj ~ дополнительное слагаемое, включённое с целью устранения случаев обращения знаменателя в нуль при отсутствии в клонотеке j клонов EST контрольного гена к (fikj равно ожидаемому числу клонов EST этого гена в соответствии с данными остальных клонотек):

Отбор потенциальных контрольных генов

При исследовании видов рака, для которых отсутствуют данные об оптимальных контрольных генах, можно произвести поиск наиболее подходящих кандидатов с помощью CompEST. Для учёта различных характеристик гена, таких как стабильность числа EST в различных нормальных и опухолевых клонотеках, частоты мутаций, повторяющихся элементов и нарушений сплайсинга, предложена оценочная функция S, значение которой отражает потенциальную степень пригодности определённого гена в качестве контрольного. В общем виде значение S равно:

где множитель F, экспрессионный фактор, отвечает за общий уровень и стабильность экспрессии гена во всех клонотеках (нормальной ткани и опухоли), корректирующий множитель Q отвечает за частоту мутаций, нарушений сплайсинга и повторяющихся элементов в клонах EST, соответствующих данному гену, множители Д- - за степень отличия этих характеристик гена между нормой и опухолью.

Гены с максимальными значениями S могут рассматриваться как наиболее перспективные контрольные гены-кандидаты.

S Q-UDt

Идентификация генов с потенциально изменённым уровнем экспрессии Для поиска генов с изменённой экспрессией в опухоли по сравнению с нормой, разработанный метод также предполагает использование оценочной функции W, аналогично S, отражающей ряд характеристик гена. Эта функция представляет собой произведение двух величин - WF, отражающей оценку изменения экспрессии гена, и Wq, отражающей оценку различий частот нарушений сплайсинга, мутаций и повторяющихся элементов в кло-нотеках опухоли по сравнению с нормальной тканью. В свою очередь, WF -отношение двух экспрессионных факторов: FN для нормальной ткани и FT для опухоли, а множитель Wq - отношение корректирующих множителей

Qn и Qr:

W = w?wQ = fVFn • Qn/Qt

Значения FN, FT, QN, QT вычисляются аналогично значениям компонентов F и Q оценочной функции S, однако отдельно для клонотек нормы и опухоли.

В качестве потенциально инактивированных отбирали гены с минимальными значениями оценочной функции W - те гены, для которых присутствуют клоны EST, равномерно распределённые по клонотеками нормальных тканей, и практически отсутствуют EST (или характеризуются высокой частотой нарушений сплайсинга) в клонотеках опухоли. Аналогично, в качестве генов с повышенным уровнем экспрессии в опухоли отбирали гены с максимальными значениями W.

Идентификация часто встречающихся нарушений сплайсинга

Третья из основных возможностей, предоставляемых программным продуктом CompEST, - поиск встречающихся нарушений сплайсинга. При различных заболеваниях человека, в том числе онкологических, достаточно часто помимо количественных изменений содержания мРНК в клетке, происходят изменения непосредственно и в самом транскрипте (Cheng et al., 2005; Liu et al., 2010). Это могут быть как мутации единичных нуклеотидов,

так и нарушения сплайсинга (в основном, сохранение интрона и пропуск экзона) (Brinkman 2004; Greenman et al., 2007). Наряду с этими достаточно частыми явлениями обнаружены мРНК, для которых старт транскрипции смещён относительно нормального положения на десятки и даже сотни нуклеотидов (Smith et al., 2009; Takahashi and Nagai, 2009; Liu, 2010). Присутствие или отсутствие таких транскриптов в ткани или кровотоке пациента может служить основой для создания эффективных диагностических наборов и систем.

Аберрантные транскрипты, выявленные только в опухолевых клетках и отсутствующие в нормальных тканях, могут включать: транскрипты, не кодирующие белок; ранее не описанные изоформы (в т.ч. активированные при канцерогенезе эмбриональные изоформы); продукты опухолеассоциирован-ных нарушений сплайсинга, способные кодировать белок (Morre et al., 2009). Для этих транскриптов характерно сохранение рамки считывания в результате изменений сплайсинга, а также отсутствие новых стоп-кодонов (как в добавленных участках, так и на их границах). Такие перестройки могут не влиять на синтез белка по матрице данной мРНК, что и стало критерием отбора возможных аберрантных белковых продуктов. Однако при этом активность белка может быть существенно снижена, например, для изоформы 2 каталитической субъединицы теломеразы hTERT, которая характеризуется делецией в кодирующей области (Mavrogiannou et al., 2007; Lincz et al., 2008). Существование таких аберрантных белковых продуктов может быть основой для создания наборов протеомной диагностики.

Таким образом, разработанный биоинформатический метод поиска он-коассоциированных генов, реализованный в приложении CompEST, основан на построении оценочной функции, включающей в себя несколько характеристик каждого гена. Метод позволяет идентифицировать гены с потенциально изменённым уровнем экспрессии в опухоли и часто встречающимися нарушениями сплайсинга, а также контрольные гены, для которых характерны минимальные изменения в опухоли.

Выбор генов с потенциально изменённым уровнем мРНК в различных видах опухолей

С помощью разработанного метода идентифицированы гены с потенциально изменённым уровнем экспрессии при раке толстой кишки, лёгкого, почки, предстательной железы, печени, молочной железы, поджелудочной железы, кожи и головного мозга. Для анализа использованы EST клонотек первичных опухолей и нормальных тканей. При поиске исключены EST, содержащие более 5% несоответствий и 15% повторяющихся элементов.

Идентифицировано 24 гена с пониженным и 12 генов с повышенным уровнем экспрессии в опухолях толстой кишки (Таблица 1). В нашей лаборатории методами ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ подтверждены частые (до 80%) и значительные снижения уровня мРНК генов DES, SLC26A3, ZG16. Анализ биомедицинских публикаций и патентный поиск показали, что ген ZG16 -новый перспективый маркер рака толстой кишки. В ряде работ также обнаружено снижение уровня мРНК генов МЕР1А (Rosmann et al., 2002) и GPRC5A (Acquafreda et al., 2009) при раке толстой кишки, что согласуется с результатами проведённого биоинформатического анализа. Однако для двух генов - AGR2 и EIF4A1 экспериментальная проверка, выполненная в нашей лаборатории, не выявила значительных изменений, предсказанных при помощи CompEST. Эти гены в таблице не представлены.

При помощи CompEST также отобрано около 100 перспективных генов с предположительными изменениями уровня экспрессии для 8-ми других видов рака (Таблица 1). Для большинства этих генов показана связь с онко-генезом, а для многих - предсказанные изменения подтверждены экспериментально согласно данным литературы. Так, например, ген NOLC1 относится к потенциальным онкогенам, поскольку его белковый продукт способен увеличивать скорость прогрессии различных опухолей (Hwang et al., 2009). Повышение уровня экспрессии гена POSTN характерно при раке поджелудочной железы; этот ген перспективен для дальнейшего клиничес-

Таблица 1. Потенциальные гены-онкомаркеры для различных видов рака.

Локализация опухоли Гены с предположительно повышенным уровнем экспрессии Гены с предположительно сниженным уровнем экспрессии

толстая кишка CALU, GSTP1. IMPDH2. KARS, MGAJl MYOID, РКМ2, POLD1P2, POLR3H ATPIF1, CES2, DES, GPRC5A, FUT6. МЕР1А, SLC26A3. PGMJ. ZG16 и др.

молочная железа IP04, GANAB, ZNF207, NONO, NOLCl. USP24, KRT5 GJA4, PPP1R16B

предстательная железа SLC25A3, NME1-NME2, SMG7, MRFAP1, LOCI 00288366, ODC1 MSMB, SEMGI, SEMG2, HSPA1A, NDE1, ALDH1A1

почка LOC100133042, ANXA2, EEF1D, TXNDC5........ СРМ, UM.QP., MMZ SLC12A1, ACSF2, SLC22A8. CDH16, PRSS8

печень PKM2, SNRPB, CCT7j CKAP4. CDC20 HP S3, С LU, TM4SF4, SDS

поджелудочная железа BGN, ANXA2, LUM, POSTN, PGM3, LAMBI SST: PPY. VWAl, CDKN1C, PRKAG2, BRWDI

головной мозг (глиобластома) W.l НА.Ш, ITGAV, GPR62, SMMCC2 STXBP.l РЖ?., \NNAT] FAM107Â, "PLK2 ......

лёгкое SSU72, KLFl LPCAT1 GBP3, SEPTZ TM9SF3, COPBÏ, FTL, FTH. LIMAI, KTN1, [NÇORÎ]

кожа (меланома) CD63. SILV. SNRPB. PRAME, MAGEDI MAGED2. CCT8 TSPAN5, DMKN [.ÂPLP2] С AVI

Примечания: 1) Функции генов описаны в диссертации. 2) Жирным выделены гены, для которых ранее показана связь с онкогенезом. 3) Сплошной линией подчёркнуты гены, для которых получены экспериментальные подтверждения, пунктиром - гены, для которых предсказанные изменения наблюдали для других видов рака; при этом не учитывали публикации с данными крупномасштабных методов (микрочипы и др.). 4) В пунктирную рамку обведены гены, для которых предсказанные изменения не соответствуют изменениям, описанным в литературе для других видов рака.

кого применения в диагностике (Tilman et al., 2007). Показано понижение уровня экспрессии гена CDKN1C при раке молочной железы, обусловленное метилированием промоторной области (Sato et al., 2005). Особый интерес представляют гены, для которых предсказанные изменения уровня экспрессии обнаружены для других видов рака. Так, например, для TXNDC5, отобранного при помощи CompEST в качестве гена с повышенным уровнем экспрессии при раке почки, выявлено повышение уровня экспрессии при раке толстой кишки, шейки матки, желудка и лёгкого (Wang et al., 2007; Zhang et al., 2010). Однако для некоторых генов результаты выполненного в работе анализа не соответствуют экспериментальным данным для других видов рака. Например, для гена NCOR1 с потенциально сниженным уровнем экспрессии при раке лёгкого ранее показано повышение уровня при раке предстательной железы (Ting et al., 2007).

Исследование функциональных свойств выявленных генов свидетельствует о том, что значительная часть из них вовлечена в важные клеточные процессы, чаще всего связанные с онкогенезом, такие как регуляция клеточной пролиферации (CAVI, CLU, CDKN1C, LAMBI, MAGED1, NME1-NME2 и др.), организация внеклеточного матрикса (APLP2, ANXA2, LUM, POSTN, VWA1), ангиогенез (ANXA2, BGN, CAVI, GJA4, ID1, ITGAV) и ряд других. Применение биоинформатических подходов при поиске опухолевых маркеров позволяет учесть характер экспрессии гена в различных тканях. В частности, из анализа исключены гены, высокий уровень экспрессии которых характерен для крови, сосудистых и мышечных тканей: плазминоген PLG, преальбумин TTR, сывороточные амилоиды SA Al и SAA2, миозин гладких мышц MYH11. Их выбор в качестве вероятных генов-онкомаркеров мог быть обусловлен высоким содержанием этих тканей в образцах, из которых получены клонотеки. Кроме того, исключение из анализа генов с высоким уровнем экспрессии в клетках крови - неотъемлемый этап отбора сывороточных онкомаркеров, поскольку

высокое содержание белка в сыворотке крови пациента существенно снижает чувствительность анализа и становится препятствием для эффективного применения потенциальных диагностических маркеров.

Поиск генов хромосомы 3 с изменённым уровнем экспрессии при раке лёгкого и почки

Для идентификации онкоассоциированных генов, локализованных на хромосоме 3 человека, использован разработанный метод анализа базы данных dbEST, реализованный в приложении CompEST, дополненный анализом баз данных Oncomine и SAGE. Для рака почки отобран ряд генов с предположительно изменённым уровнем экспрессии. Среди них:

• 4 гена с предположительно повышенным уровнем экспрессии: IMPDH2 (опухолеассоциированный антиген рака толстой кишки, Зр21.2), МСМ2 (прогностический маркер рака почки, 3q21), SOX2 (маркер степени дифференциации клеток рака желудка, 3q26.3-q27), KALRN {Ъс\2\.2)\

• 6 генов с пониженным уровнем экспрессии: CLDN16 (3q28), SEMA3G (обладает противоопухолевой активностью, Зр21.1), MST1 (известный ген-супрессор, Зр21), KNG1 (3q27), ALS2CL (3р21.31).

Для рака лёгкого идентифицированы:

• 3 гена с предположительно повышенным уровнем экспрессии: ZBED2 (другие гены этого семейства характеризуются повышенным уровнем экспрессии при различных видах рака, 3ql3.2), AGTR1 (терапевтическая мишень для рака молочной железы, 3q21-q25), AMT (Зр21,2-Р21.1);

• 7 генов с пониженным уровнем экспрессии: TNFSF10 (фактор некроза опухолей с высокой селективной противоопухолевой активностью, 3q26), L1MD1 (известный супрессор опухолевого роста, 3р21.3), FRMD4B (Зр14.1), LAMP3 (отмечено понижение уровня экспрессии при раке молочной железы, 3q26.3-q27), ITPR1 (участвует в апоптозе, Зр26-р25), VGLL3 (потенциальный ген-супрессор опухолевого роста,

3pl2.1), WWTR1 (белок участвует в апоптозе, однако для этого гена отмечено повышение уровня экспрессии при раке молочной железы, 3q23-q24).

Таким образом, предложенный метод позволяет провести масштабный поиск генов, вовлечённых в канцерогенез, и выявить новые, не известные ранее опухолевые маркеры.

Новая модель расчёта эффективности ПЦР в реальном времени

Практически все изменения экспрессии генов, предсказанные при помощи методов, основанных на EST, SAGE и микрочипах, требуют экспериментальной проверки точными количественными методами. Для этой цели чаще всего применяют ПЦР в реальном времени. Одна из основных трудностей, связанных с этим методом, заключается в корректном вычислении и учёте эффективности реакции (Е). Эффективность ПЦР-РВ представляет собой величину, отражающую возрастание содержания ампликона за один цикл реакции. На практике значение Е далеко не всегда близко к 100%, и часто такое допущение, хотя и упрощает расчёты, но приводит к значительному искажению результатов. Методы расчёта эффективности в настоящий момент продолжают совершенствоваться. В работе предложена новая модель, описывающая кинетику ПЦР в реальном времени, применимая для расчёта Е путём аппроксимации кинетической кривой уравнением:

dR= _R(F0~R)(P0-sR)_

de (F0 - R)(P0 - eß) + aR(P0 - ей) + bR(F0 - R)e^c где R - концентрация ампликона на цикле с; F0 - исходная концентрация праймеров; Р0 - полимеразы; а, Ь, е, £ - коэффициенты; Е - искомая эффективность реакции. Вывод уравнения представлен в диссертационной работе. Аппроксимация кинетических кривых этим уравнением для определения эффективности и дальнейшая обработка данных ПЦР-РВ реализована в программе «АТГ» (Анализ Транскрипции Генов).

RPN1 - новый контрольный ген, применимый для нормирования данных при оценке изменений экспрессии генов в опухолях лёгкого и почки

ПЦР в реальном времени - основной метод количественной оценки экспрессии генов, который также широко используют для уточнения данных, получаемых при помощи микрочипов. Основные требования, обеспечивающие достоверные и воспроизводимые результаты, полученные этим методом, включают стандартизацию всех этапов исследования, а также нормирование данных, которое позволяет сравнивать уровни экспрессии генов в различных образцах мРНК/кДНК с неизвестной концентрацией. Для нормирования можно использовать количество клеток, массу или объем образца/раствора, концентрацию суммарной или рибосомальной РНК. Однако чаще всего для этого используют содержание мРНК так называемых контрольных генов со стабильным уровнем экспрессии в исследуемых образцах, например, GAPDH, АСТВ, HPRT1, ТВР и др.

Задача данного исследования - идентификация, по крайней мере, одного нового контрольного гена, пригодного для оценки изменений уровня мРНК в таких распространённых типах опухолей, как немелкоклеточный рак лёгкого (HMPJI) и светлоклеточный почечноклеточный рак (СПР). Определены основные принципы отбора контрольных генов:

1. экспрессия гена должна быть стабильна (данные EST, микрочипов и

др.);

2. для гена не должны быть характерны частые нарушения сплайсинга;

3. ген должен относиться к группе «генов домашнего хозяйства» (housekeeping genes);

4. ген должен быть локализован в районе, для которого не характерны частые геномные аберрации при изучаемых типах рака (HMPJI и СПР);

5. ген не должен содержать частые однонуклеотидные полиморфизмы, особенно в транскрибируемой области.

Перекрытие

Рис. 1. Схема отбора потенциальных контрольных генов. Составлен рейтинг наиболее перспективных генов-кандидатов. Проведена поэтапная фильтрация генов согласно экспрессионным данным в нормальных тканях, анализу транскриптомной базы данных Опсоште, данным альтернативного сплайсинга (иС8С) и анализу известных функций белков.

Многоэтапный процесс отбора контрольных генов-кандидатов, включающий анализ dbEST, Oncomine, базы данных хромосомных перестроек Mitelman, позволил идентифицировать ген RPN1 (схема отбора представлена на рис. 1). В качестве начального и основного этапа отбора послужил анализ применимости генов в качестве контрольных на основе построения оценочной функции. При построении этой функции наибольший вес имели компоненты, ответственные за учёт доли кло-нотек, в которых присутствуют соответствующие данному гену EST, и учёт различий нормированного числа EST в норме и опухоли. Наименьший вес имели компоненты, отвечающие за учёт частоты несоответствий и повторов в EST. Средний вес имели компоненты, ответственные за учёт стандартного отклонения количеств EST между различными клонотеками нормы или опухоли, и учёт изменений частоты несоответствий и нарушений сплайсинга в клонотеках опухоли по сравнению с клонотеками нормальной ткани. При анализе базы данных Oncomine обязательным условием отбора генов-кандидатов являлось присутствие не более одного случая значительного повышения или понижения уровня мРНК этих генов во всех исследованных образцах рака лёгкого и почки.

В рак легкого ■ рак почки

Рис. 2. Частота геномных и эпигеномных нарушений в районах хромосомы 3 при раке легкого и почки. А. Результаты гибридизации ДНК на Notl- микрочипах для образцов немелкоклеточного рака лёгкого (HMPJ1) и светлоклеточного почечно-клеточного рака (СПР). Серым цветом показаны стандартные отклонения уровня флуоресценции для различных образцов). Значения в пределах 0,8—1,2 свидетельствуют об отсутствии делеций, амплификаций или метилирования участков в исследуемом районе. Б. Относительная частота хромосомных перестроек при раке легкого и раке почки согласно цитогенетическим данным (Mitelman Database of Chromosome Aberrations and Gene Fusions in Cancer). Расположение гена RPN1 отмечено на хромосоме 3.

При канцерогенезе распространены различные геномные нарушения -мутации, делеции, амплификации, а также гиперметилирование промотор-ных областей генов-супрессоров опухолевого роста, происходящие уже на ранних стадиях развития опухоли. Поэтому дополнительным свидетельством приемлемости применения гена RPN1 в качестве контрольного может стать геномная и эпигеномная стабильность соответствующего хромосомного локуса. В соответствии с базой данных Mitelman (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) ген RPN1 находится в одном из наиболее стабильных при раке легкого и почки районов (рис. 2).

Ген RPN1 кодирует мембранный белок рибофорин 1, часть N-олигосахарил-трансферазного комплекса, связывающего обогащенные остатками маннозы олигосахариды с аспарагиновыми остатками в синтезируемых полипептидных цепях. Показано, что рибофорин 1 необходим для N-гликозилирования и доставки субстрата в активный центр олигосахари-лтрансферазы (Wilson and High, 2007). Эти процессы играют ключевую роль в большинстве тканей, активно синтезирующих белок, в том числе и опухолях.

Экспериментальная проверка применимости гена RPN1 в качестве контрольного

Уровень мРНК генов RPN1, GUSB, GAPDH измерен методом ПЦР-РВ для 28-и образцов HMPJ1, 21-го образца СПР и соответствующих образцов прилегающих гистологически нормальных тканей. Начальную концентрацию образцов мРНК выравнивали при помощи спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc.). Методом ПЦР-РВ оценили вариабельность уровня мРНК гена RPN1 по сравнению с GAPDH для НМРЛ и GUS В для СПР. Значения эффективных пороговых циклов CTeff, отражающие начальную концентрацию транскрипта с учетом эффективности реакций, представлены на рис. 3. Средние значения эффективных пороговых циклов для гена RPN1 достаточно близки между собой, 50% этих значений находится в достаточно узком диапазоне, как для НМРЛ, так и СПР.

Клеточные пути, в которых участвует белковый продукт гена RPN1, не связаны с процессами, в которые вовлечены гены GAPDH (катализ обмена углеводов) и GUSB (гидролиз гликозамингликанов), что позволяет исключить возможность их ко-регуляции и её влияние на результаты. Комбинация генов RPN1 и GAPDH пригодна для нормирования данных при исследовании рака лёгкого, a RPN1 и GUSB - рака почки. Ранее в нашей лаборатории успешно выполнен анализ экспрессии ряда генов-супрессоров опухолевого роста с использованием двух пар контрольных генов, включающих RPN1, в

НМРЛ С IIP

32 30 28

f" Ч-l

„Н 26

22 20

GAPDH (N) GAPDH (Г) RPN1 (N) RPN1 (T) GISfl (N) GUSB(T) AHVJ (N) RPN1 (T)

Гены/образцы

Рис. 3. Эффективные значения порогового цикла Сте{Гдля контрольных генов GAPDH и GUSB и потенциального контрольного гена Л/W/ в 28-и образцах НМРЛ и 21-ом образце СПР. Прямоугольником обозначена область, в которую попадает 50% всех значений (между 25-м и 75-м процентилями). Горизонтальная линия в прямоугольниках - медиана. Ограничивающие

eff

отрезки - максимальные и минимальные значения Ст .

опухолях лёгкого и почки (Анедченко и др., 2008; Кудрявцева и др., 2009; Senchenkoet al., 2010).

Методом сравнительной гибридизации на Notl-микрочипах показано отсутствие делеций, амплификаций и/или метилирования геномного локуса RPN1 во всех 56-и образцах НМРЛ, и только в одном из 42-х образцов СПР обнаружено снижение сигнала (Павлова и др., 2009). Таким образом, совокупность полученных результатов - биоинформатический анализ (рис. 1, 2Б), экспериментальная оценка частоты геномных и эпигеномных нарушений с помощью гибридизации на №э//-микрочипах (рис. 2А) и оценка вариабельности уровня мРНК методом ПЦР-РВ (рис. 3) - позволяет предложить RPN1 в качестве нового контрольного гена для нормирования транскрип-томных данных при исследовании НМРЛ и СПР.

-г X

Ц-------■= --------------- --------

_ 4

I I T: -____________т__________________________________________________________________________________

Т Е- -1 —

Согласно неопубликованным данным Забаровского и соавт., отсутствие делеций и/или метилирования гена RPN1 характерно и для других видов рака - рака молочной железы, шейки матки, простаты, яичников, толстой кишки, что указывает на возможность его использования в качестве универсального контрольного гена для эпителиальных опухолей. Однако для оценки возможности применения гена RPN1 при исследовании других видов рака необходимы дополнительные исследования.

Сравнительный анализ экспрессии генов FTL и FTH, кодирующих субъединицы ферритина, при раке лёгкого

Анализ базы данных dbEST с помощью CompEST выявил потенциальное понижение уровня экспрессии генов лёгкой и тяжёлой цепей ферритина для рака лёгкого. Ферритин - основной переносчик негемового железа в организме, представляющий собой глобулярный белковый комплекс, состоящий из 24 субъединиц (12 тяжёлых субъединиц, FTH и 12 лёгких - FTL) и выполняющий роль основного внутриклеточного депо железа. Многие опухолевые заболевания человека сопровождаются увеличением содержания в сыворотке крови этого белка, однако, возможные изменения экспрессии этих генов на уровне транскрипции в опухолях изучены недостаточно (Milman and Pedersen, 2002; Kashyap et al., 2005), в том числе при немелкоклеточном раке легкого (Fracchia et al., 1999; Zaleska et al., 2005). В связи с этим в ряде работ выдвинуто предположение, что при различных видах рака повышенный уровень сывороточного ферритина может быть связан с его синтезом непосредственно клетками самой опухоли. Однако данных об изменении содержания ферритина в опухолевых клетках на настоящий момент нет - экспрессия генов FTL и FTH, как на уровне транскрипции, так и синтеза белка непосредственно в опухолевых тканях легкого остается малоизученной.

В связи с этим в нашей лаборатории проведено исследование изменения уровня мРНК этих генов в образцах плоскоклеточного рака легкого (ПКРЛ) методом ПЦР в реальном времени. Показано существенное (более 2

раз) и частое снижение уровня мРНК генов FTL и FTH (рис. 4) непосредственно в первичной опухоли уже на первой, а также на последующих стадиях заболевания - в среднем в 11 и 9 раз в 83% и 73% случаев, соответственно.

¡«s

я 1

Он 1 5

л в

0J са о с.

О 0.1 0.01

Рис. 4. Относительный уровень мРНК генов FTL и FTH в образцах ПКРЛ.

Однако далеко не всегда изменения содержания мРНК приводят к соответствующим изменениям количества белка. Одним из основных факторов, определяющих соотношение между содержанием мРНК и белка в клетке, является микроРНК. Повышение содержания в клетке определённой микроРНК негативно сказывается на трансляции мРНК-мишени. При помощи веб-сервисов miRanda (http://www.microrna.org/) и TargetScan (http://www.targetscan.org/) определены наиболее вероятные микроРНК, отвечающие за регуляцию трансляции мРНК генов FTL и FTH. В соответствии с полученными данными, экспрессия гена FTL регулируется тремя микроРНК, содержание двух из которых - hsa-miR-22 и hsa-miR-24 - повышено при раке лёгкого (Cheng et al., 2005; Gao et al., 2010; Liu et al., 2010). Кроме того, для hsa-miR-22 отмечено онкогенное воздействие на клетки бронхов (Liu et al., 2010). Регуляция трансляции гена FTH осуществляется более чем десятью различными микроРНК, для одной из которых, hsa-miR-186, выяв-

FTL 1 .............г,,,,, , 1,................ I,,, FTH Й................Й,

I 1 i ! i i г i i; Г; s И | 1 f i f .j У 1 У У тг У

Образцы кДНК

лено существенное увеличение содержания при аденокарциноме лёгкого (Tang et al., 2010; Zhang et al., 2010).

В то же время, анализ протеомных данных для различных видов рака (базы данных PRIDE, Peptidome, Tranche и др.) показал лишь небольшое число случаев обнаружения белков FTL и FTH в опухолевых образцах. Таким образом, вероятнее всего, подавление экспрессии генов FTL и FTH происходит не только на уровне транскрипции, но и на уровне трансляции. Это говорит о том, что повышение содержания ферритина в сыворотке крови, по-видимому, обусловлено повышенным синтезом FTL и FTH в других тканях организма, либо ускоренным распадом клеток и высвобождением цито-плазматического ферритина.

выводы

1. Разработан биоинформатический метод поиска генов-онкомаркеров, основанный на анализе базы данных dbEST, позволяющий идентифицировать гены с потенциально изменённым в опухоли уровнем экспрессии и часто встречающимися нарушениями сплайсинга. Подход реализован в Windows-приложении CompEST.

2. С помощью CompEST идентифицировано более 100 потенциальных генов-маркеров различных видов рака - толстой кишки, молочной, предстательной и поджелудочной желёз, почки, печени, лёгкого, глиобластомы и меланомы (в том числе 19 генов-маркеров, локализованных на коротком плече хромосомы 3).

3. Разработан новый метод расчёта эффективности ПЦР в реальном времени, использующий аппроксимацию кинетической кривой уравнением, и реализованный в программе «АТГ» (Анализ Транскрипции Генов).

4. Впервые идентифицирован контрольный ген RPN1, пригодный для нормирования количественных данных при исследовании рака лёгкого и почки.

5. Выборочная экспериментальная оценка экспрессии отобранных при помощи CompEST генов-маркеров толстой кишки (ZG16, DES, SLC26A3) подтвердила частое и значительное снижение уровня их мРНК. Для гена ZG16 результаты получены впервые.

6. Предсказанное при помощи CompEST снижение уровня мРНК генов лёгкой и тяжёлой цепей ферритина (FTL и FTH) при раке лёгкого подтверждено методом ПЦР в реальном времени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Г. С. Краснов. Н. Ю. Опарина, А. А. Дмитриев, А. В. Кудрявцева, Е. А. Анедченко, Т. Т. Кондратьева, Е. Р. Забаровский, В. Н. Сенченко. 2011. Новый контрольный ген RPN1 для нормирования количественных данных при раке лёгкого и почки. Молекулярная биология. 45,238-248.

2. V.N. Senchenko, Е.А. Anedchenko, Т.Т. Kondratieva, G.S. Krasnov, A.A Dmitriev, V.l. Zabarovska, T.V. Pavlova, V.l. Kashuba, M.I. Lerman, E.R. Za-barovsky. 2010. Simultaneous down-regulation of tumor suppressor genes RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21 and RASSF1A in primary non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 10, 75.

3. Г.С. Краснов. A.A. Дмитриев, A.B. Кудрявцева, Е.А. Анедченко, Н.Ю. Опарина, В.Н. Сенченко. 2010. Новые программы, используемые при количественной оценке копийности и уровня транскрипции генов. Труды МФТИ. 2,23-27.

4. A.B. Кудрявцева, Е.А. Анедченко, Н.Ю. Опарина, Г.С. Краснов. К.Н. Каш-кин, A.A. Дмитриев, И.Б. Зборовская, Т.Т. Кондратьева, Т.В. Виноградова, М.В. Зиновьева, Е.П. Копанцев, В.Н. Сенченко. 2009. Экспрессия генов FTL и FTH, кодирующих субъединицы ферритина при раке лёгкого и почки. Молекулярная биология. 43,1044-1054.

5. Е. А. Анедченко, А. А. Дмитриев, Г. С. Краснов. Т. Т. Кондратьева, Е. П. Копанцев, Т. В. Виноградова, М. В. Зиновьева, И. Б. Зборовская, Б. Е. Полоцкий, О. В. Сахарова, В. И. Кашуба, Е. Р. Забаровский, В. Н. Сенченко. 2008. Подавление экспресии генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 при немелкоклеточном раке лёгкого. Молекулярная биология. 42, 965-976.

6. Г.С. Краснов. Н.Ю. Опарина. Программа «Идентификация изменений транскриптома» («CompEST»), Номер регистрационного свидетельства 2008613673.

Заказ № 138-а/04/11 Подписано в печать 15.04.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Краснов, Георгий Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы исследования транскрипции генов.

1.1.1. Нозерн-блоттинг.

1.1.2. Вычитающая гибридизация.

1.1.3. Дифференциальный скрининг.

1.1.4. Метод защиты от рибонуклеазы.

1.1.5. Количественные методы.

1.1.6. Серийный анализ экспрессии генов (SAGE).:.

1.1.7. Массовое параллельное секвенирование сигнатур.

1.1.8. Микрочипы.

1.1.9. Метод EST.

1.1.10. Высокопроизводительное секвенирование.

1.1.11. Сравнение описанных технологий.

1.2. Особенности ПЦР в реальном времени.

1.2.1. Метод двойного сравнения и нормирование.

1.2.2. Основные методы расчёта эффективности ПЦР.

1.2.3. Программы, предназначенные для обработки количественных данных метода ПЦР в реальном времени.

1.2.4. Проблема выбора контрольных генов.

1.3. Современные маркеры онкологических заболеваний.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Метод анализа базы данных EST и программа CompEST.

2.1.1. Нормирование числа тагов с использованием контрольных генов.

2.1.2. Отбор потенциальных контрольных генов.

2.1.3. Отбор генов с потенциально изменённым уровнем экспрессии.

2.1.4. Идентификация часто встречающихся нарушений сплайсинга.

2.2. Выбор генов с потенциально изменённым уровнем мРНК в опухоли для различных видов рака с помощью CompEST.

2.2.1. Поиск генов хромосомы 3 с изменённым уровнем экспрессии при раке лёгкого и почки.

2.3. Новая модель расчёта эффективности ПЦР-РВ.

2.3.1. Программа АТГ для расчёта результатов ПЦР-РВ.

2.4. RPN1 — новый контрольный ген для нормирования данных ПЦР-РВ в опухолях лёгкого и почки.

2.4.1. Применение CompEST для отбора потенциальных контрольных генов.

2.4.2. Экспериментальная проверка RPN1 в качестве контрольного гена.

2.5. Сравнительный анализ экспрессии генов FTL и FTH, кодирующих субъединицы ферритина, при раке лёгкого.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и идентификация нарушений экспрессии генов в различных опухолях человека"

Благодаря интенсивному развитию новых технологий накоплен большой объём транскриптомных и геномных данных, полученных с помощью новых высокопродуктивных методов. Доступность этих данных послужила основой для развития области молекулярной биологии — онкотранскриптомики, которая объединяет биоинформатические и экспериментальные методы. Её цель состоит в поиске он-коассоциированных генов и различных изменений транскриптома (например, нарушений сплайсинга), которые в дальнейшем могут быть использованы в диагностике, прогностике, а также для мониторинга лечения различных онкозаболеваний. Основные методы, применяемые на настоящий момент в онкотранскрипто-мике, условно можно разделить на две большие группы — крупномасштабные, позволяющие оценить изменение экспрессии тысяч генов, например, метод коротких таговых последовательностей (EST), высокопроизводительное секвенирование (RnaSeq), микрочипы, серийный анализ экспрессии генов (SAGE), и более точные количественные методы, например, ПЦР в реальном времени. В основу таких методов, как EST, RnaSeq и SAGE заложено понятие тага, представляющего собой короткий участок мРНК с известной последовательностью. Количество тагов для определённого гена коррелирует с уровнем его мРНК [1]. Экспериментальные данные о последовательности транскрипта позволяют определить наиболее характерные для данного типа опухоли мутации и нарушения сплайсинга, приводящие к возможной инактивации белка.

В настоящий момент существует ряд биоинформатических подходов для выявления потенциальных генов-онкомаркеров, основанных на анализе базы данных (БД) dbEST - например, GeneHub GEPIS [2, 3]. Однако при оценке возможных изменений экспрессии генов не учитывается распределение EST по различным кло-нотекам нормальной и опухолевой ткани, частота мутаций и наличие альтернативных или аберрантных (не встречающихся в норме) изоформ. Это не позволяет эффективно использовать весь потенциал dbEST для поиска возможных генов-онкомаркеров.

Для всех онкоспецифичных диагностических признаков, идентифицируемых при анализе dbEST, - изменений уровня мРНК или нарушений сплайсинга - присутствие и степень выраженности этих признаков должны быть, как правило, подтверждены точными количественными методами, например, ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Однако есть ряд проблем, связанных с этим методом, одна из которых заключается в необходимости определения эффективности реакции и более точного описания кинетики [4-7]. С другой стороны, на точность результатов ПЦР-РВ влияет выбор контрольных генов, применяемых для нормирования данных. Уровень экспрессии этих генов не должен значительно отличаться в исследуемом типе опухоли и соответствующей нормальной ткани. По данным литературы до сих пор нет единого мнения по поводу выбора приемлемых контрольных генов для рака лёгкого, почки и ряда других видов опухолей [8-11].

Короткое плечо хромосомы 3 человека при различных видах рака часто подвергается различным нарушениям — делециям, транслокациям, метилированию промоторных областей генов. На хромосоме 3 идентифицировано более десяти районов-«горячих точек» с наибольшей частотой таких нарушений [12, 13]. Два наиболее важных из них - LUCA и АР20, расположены на коротком плече и подвержены изменениям практически при всех видах рака [13]. В этих областях локализовано значительное число генов-супрессоров опухолевого роста (TSG, tumor suppressor gene) -RASSF1, SEMA3B [14, 15] и др., в том числе и потенциальных -ITGA9, APRG2, VILL и др. Изучение изменений экспрессии генов этих районов не только поможет выявить эффективные онкомаркеры, но и позволит глубже проникнуть в молекулярные механизмы канцерогенеза.

Цель настоящей работы — разработка и применение биоинформатического метода для поиска и идентификации нарушений экспрессии генов в девяти распространённых видах рака. Сформулированы следующие конкретные задачи исследования:

1. на основе анализа существующих биоинформатических подходов разработать метод поиска генов-онкомаркеров и контрольных генов; реализовать метод в виде программного продукта;

2. апробировать метод и применить его для поиска генов-маркеров, включая гены короткого плеча хромосомы 3, и контрольных генов;

3. выполнить анализ полученных результатов и сравнить с данными литературы;

4. создать модель для расчёта эффективности ПЦР-РВ и реализовать этот метод в виде программного продукта, позволяющего проводить математическую обработку количественных данных;

5. подтвердить экспериментально изменения уровня мРНК для выбранных ге-нов-онкомаркеров и контрольных генов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработанный биоинфор-матический метод поиска онкоассоциированных генов и реализующее его приложение CompEST включает преимущества имеющихся на настоящий момент других методов и лишён их недостатков, но в то же время этот подход дополнен рядом других возможностей, а именно: учётом мутаций, нарушений сплайсинга, степени равномерности распределения EST по клонотекам. Приложение CompEST, реализующее данный метод, имеет простой пользовательский интерфейс, что делает программу доступной и удобной для любого, даже неподготовленного пользователя. Дальнейшее применение этот подход может найти при анализе другого типа транскриптомных таговых данных, полученных методом высокопроизводительного секвенирования.

При помощи разработанного метода отобрано более 140 потенциальных генов-маркеров с дифференциальной экспрессией для 9 видов рака, включая гены, расположенные на хромосоме 3 человека. По данным литературы для 26 генов предсказанные изменения подтверждены экспериментально, а для 31 генов - предсказанные изменения наблюдали при других видах опухолей. В дальнейшем наиболее перспективные из них могут быть использованы в составе панелей генов при разработке диагностических и прогностических наборов.

Впервые предложен и успешно применён биоинформатический метод поиска новых контрольных генов. Контрольный ген RPN1, идентифицированный в ходе исследования, может быть использован для нормирования данных по оценке изменений экспрессии генов при раке лёгкого и почки. Показана применимость нового метода расчёта эффективности ПЦР-РВ, предложенного в диссертационной работе и реализованного в программе «АТГ» («Анализ транскрипции генов»), а также его преимущество по сравнению с другими распространёнными методами расчёта.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Краснов, Георгий Сергеевич

Выводы

2. С помощью CompEST идентифицировано более 100 потенциальных генов-маркеров различных видов* рака - толстой кишки, молочной, предстательной и поджелудочной желёз, почки, печени, лёгкого, глиобластомы и меланомы (в том числе 19 генов-маркеров, локализованных на коротком плече хромосомы

3).

Заключение

В настоящее время благодаря появлению современных высокопродуктивных методов стало возможным выполнение анализа последовательности и уровня экспрессии всех генов для каждого отдельного организма. Результаты анализа тран-скриптома - синтезируемых в клетках РНК - доступны для мирового научного сообщества в различных базах данных. В связи с этим особенно востребованной является разработка новых программ, выполняющих крупномасштабный анализ экспериментальных данных для решения различных задач. Наиболее информативным представляется сравнение данных для клеток в норме и патологии, позволяющее определить новые гены-онкомаркеры, и наблюдение изменений во времени транскрипционных профилей, отражающих динамику заболевания и эффективность лечения.

Предложенный в настоящей работе метод поиска потенциальных генов-онкомаркеров продемонстрировал свою эффективность при отборе генов с изменённым уровнем экспрессии для девяти различных видов опухолей. При помощи СошрЕБТ отобрано более 140 генов с дифференциальной экспрессией. Эти данные подтверждены выборочно методом ПЦР в реальном времени. В дальнейшем отобранные гены могут быть использованы для создания эффективных диагностических систем. Метод реализован в программе СотрЕ8Т с простым, интуитивно понятным даже неподготовленному пользователю интерфейсом. Программа зарегистрирована в Роспатенте (свидетельство № 2008613673) и доступна на сайте Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта по адресу ftp://ftp.eimb.ru/CompEST.

Отобранный контрольный ген рибофорина, КРЫ1 апробирован при нормировании данных метода ПЦР в реальном времени в Лаборатории структурно-функциональной геномики, где выполнена настоящая работа. Впервые показано понижение уровня мРНК генов, кодирующих лёгкую и тяжёлую цепи ферритина, при раке лёгкого несмотря на наблюдаемое по данным литературы увеличение уровня белка ферритина в сыворотке крови при онкологических заболеваниях. Этот эффект может быть объяснён как распадом опухолевых клеток и высвобождением цитоплазматического ферритина, так и, возможно, возрастанием интенсивности синтеза ферритина в других тканях организма.

Разработанный метод анализа базы данных dbEST может с успехом применяться также и для анализа данных высокопроизводительного секвенирования. Число тагов для этого метода существенно выше, чем для традиционного метода EST, что обеспечивает большую статистическую значимость результатов при поиске генов с дифференциальной экспрессией в опухоли.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Краснов, Георгий Сергеевич, Москва

1. Nagaraj S.H., Gasser R.B., Ranganathan S. A hitchhiker's guide to expressed sequence tag (EST) analysis. 2007. Brief Bioinform. 8(1): p. 6-21.

2. Zhang Y., Luoh S.M., Hon L.S., Baertsch R., Wood W.I., Zhang Z. GeneHub-GEPIS: digital expression profiling for normal and cancer tissues based on an integrated gene database. 2007. Nucleic Acids Res. 35(Web Server issue): p. W152-8.

3. Lu B., Yu J., Xu J., Chen J., Lai M. A novel approach to detect differentially expressed genes from count-based digital databases by normalizing with housekeeping genes. 2009. Genomics. 94(3): p. 211-6.

4. Gevertz J.L., Dunn S.M., Roth C.M. Mathematical model of real-time PCR kinetics. 2005. Biotechnol Bioeng. 92(3): p. 346-55.

5. Kubista M., Andrade J.M., Bengtsson M., Forootan A., Jonak J., Lind K., et al. The real-time polymerase chain reaction. 2006. Mol Aspects Med. 27(2-3): p. 95125.

6. Lalam N. Estimation of the reaction efficiency in polymerase chain reaction. 2006. J Theor Biol. 242(4): p. 947-53.

7. Rutledge R.G., Stewart D. A kinetic-based sigmoidal model for the polymerase chain reaction and its application to high-capacity absolute quantitative real-time PCR. 2008. BMC Biotechnol. 8: p. 47.

8. Liu D.W., Chen S.T., Liu H.P. Choice of endogenous control for gene expression in nonsmall cell lung cancer. 2005. Eur Respir J. 26(6): p. 1002-8.

9. Gresner P., Gromadzinska J., Wasowicz W. Reference genes for gene expression studies on non-small cell lung cancer. 2009. Acta Biochim Pol. 56(2): p. 307-16.

10. Glenn S.T., Jones C.A., Liang P., Kaushik D., Gross K.W., Kim H.L. Expression profiling of archival renal tumors by quantitative PCR to validate prognostic markers. 2007. Biotechniques. 43(5): p. 639-40, 642-3, 647.

11. Jung M., Ramankulov A., Roigas J., Johannsen M., Ringsdorf M., Kristiansen G., Jung K. In search of suitable reference genes for gene expression studies of human renal cell carcinoma by real-time PCR. 2007. BMC Mol Biol. 8: p. 47.

12. Senchenko V., Liu J., Braga E., Mazurenko N., Loginov W., Seryogin Y., et al. Deletion mapping using quantitative real-time PCR identifies two distinct 3p21.3 regions affected in most cervical carcinomas. 2003. Oncogene. 22(19): p. 298492.

13. Senchenko V.N., Liu J., Loginov W., Bazov I., Angeloni D., Seryogin Y., et al. Discovery of frequent homozygous deletions in chromosome 3p21.3 LUCA and AP20 regions in renal, lung and breast carcinomas. 2004. Oncogene. 23(34): p. 5719-28.

14. Neufeld G., Lange T., Varshavsky A., Kessler O. Semaphorin signaling in vascular and tumor biology. 2007. Adv Exp Med Biol. 600: p. 118-31.

15. Wang Y.C., Yu Z.H., Liu C., Xu L.Z., Yu W., Lu J., et al. Detection of RASSF1A promoter hypermethylation in serum from gastric and colorectal adenocarcinoma patients. 2008. World J Gastroenterol. 14(19): p. 3074-80.

16. Maercker C. Protein arrays in functional genome research. 2005. Biosci Rep. 25(1-2): p. 57-70.

17. Bertone P., Snyder M. Advances in functional protein microarray technology. 2005. FEBS J. 272(21): p. 5400-11.

18. NCBIReference Sequence. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ReiSeq/index.html.

19. Claverie J.M. Gene number. What if there are only 30,000 human genes? 2001. Science. 291(5507): p. 1255-7.

20. AltSplice database of alternative spliced events. http://www.ebi.ac.uk/asd/altsplice/humrel2.html.

21. Beaudoing E., Freier S., Wyatt J.R., Claverie J.M., Gautheret D. Patterns of variant polyadenylation signal usage in human genes. 2000. Genome Res. 10(7): p. 1001-10.

22. Tian B., Hu J., Zhang H., Lutz C.S. A large-scale analysis of mRNA polyadenylation of human and mouse genes. 2005. Nucleic Acids Res. 33(1): p. 201-12.

23. Ueda H.R., Hayashi S., Matsuyama S., Yomo T., Hashimoto S., Kay S.A., Hogenesch J.B., lino M. Universality and flexibility in gene expression from bacteria to human. 2004. Proc Natl Acad Sci USA. 101(11): p. 3765-9.

24. Darzacq X., Singer R.H., Shav-Tal Y. Dynamics of transcription and mRNA export. 2005. Curr Opin Cell Biol. 17(3): p. 332-9.

25. Bishop J.O., Morton J.G., Rosbash M., Richardson M. Three abundance classes in HeLa cell messenger RNA. 1974. Nature. 250(463): p. 199-204.

26. Reverter A., McWilliam S.M., Barris W., Dalrymple B.P. A rapid method for computationally inferring transcriptome coverage and microarray sensitivity. 2005. Bioinformatics. 21(1): p. 80-9.

27. Hastie N.D., Bishop J.O. The expression of three abundance classes of messenger RNA in mouse tissues. 1976. Cell. 9(4 PT 2): p. 761-74.

28. Zimmermann C.R., Orr W.C., Leclerc R.F., Barnard E.C., Timberlake W.E. Molecular cloning and selection of genes regulated in Aspergillus development. 1980. Cell. 21(3): p. 709-15.

29. Liang P., Pardee A.B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. 1992. Science. 257(5072): p. 967-71.

30. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. 1993. Biotechnology (N Y). 11(9): p. 1026-30.

31. Ding C.a.C., C.R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. 2003. Proc Natl Acad Sci USA. 100: p. 3059-3064.

32. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein B., Kinzler K.W. Serial analysis of gene expression. 1995. Science. 270(5235): p. 484-7.

33. Brenner S., Johnson M., Bridgham J., Golda G., Lloyd D.H., Johnson D., et al. Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbeadarrays. 2000. Nat Biotechnol. 18(6): p. 630-4.

34. Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. 1995. Science. 270(5235): p. 467-70.

35. Alwine J.C., Kemp D.J., Stark G.R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. 1977. Proc Natl Acad Sci USA. 74(12): p. 5350-4.

36. Hubank M., Schatz D.G. Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA. 1994. Nucleic Acids Res. 22(25): p. 5640-8.

37. Liang P. A decade of differential display. 2002. Biotechniques. 33(2): p. 338-44, 346.

38. Sutcliffe J.G., Foye P.E., Erlander M.G., Hilbush B.S., Bodzin L.J., Durham J.T., Hasel K.W. TOGA: an automated parsing technology for analyzing expression of nearly all genes. 2000. Proc Natl Acad Sci USA. 97(5): p. 1976-81.

39. Jurecic R., Nachtman R.G., Colicos S.M., Belmont J. W. Identification and cloning of differentially expressed genes by long-distance differential display. 1998. Anal Biochem. 259(2): p. 235-44.

40. Hod Y. A simplified ribonucleaseprotection assay. 1992. Biotechniques. 13(6): p. 852-4.

41. Rottman J.B. The ribonuclease protection assay: a powerful tool for the veterinary pathologist. 2002. Vet Pathol. 39(1): p. 2-9.

42. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Real-time PCR in virology. 2002. Nucleic Acids Res. 30(6): p. 1292-305.

43. Becker-Andre M., Hahlbrock K. Absolute mRNA quantification using the polymerase chain reaction (PCR). A novel approach by a PCR aided transcript titration assay (PATTY). 1989. Nucleic Acids Res. 17(22): p. 9437-46.

44. Edwards J.R., Ruparel H., Ju J. Mass-spectrometry DNA sequencing. 2005. Mutat Res. 573(1-2): p. 3-12.

45. McCullough R.M., Cantor C.R., Ding C. High-throughput alternative splicing quantification by primer extension and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. 2005. Nucleic Acids Res. 33(11): p. e99.

46. Wikipedia. http://ru.wikipedia.org.

47. Yamamoto M., Wakatsuki T., Hada A., Ryo A. Use of serial analysis of gene expression (SAGE) technology. 2001. J Immunol Methods. 250(1-2): p. 45-66.

48. Ruijter J.M., Van Kampen A.H., Baas F. Statistical evaluation of SAGE libraries: consequences for experimental design. 2002. Physiol Genomics. 11(2): p. 37-44.

49. Saha S., Sparks A.B., Rago C., Akmaev V., Wang C.J., Vogelstein B., Kinzler K.W., Velculescu V.E. Using the transcriptome to annotate the genome. 2002. Nat Biotechnol. 20(5): p. 508-12.

50. Larochelle W.J., Shimkets R.A., Oncogenomics handbook. Cancer drug discovery and development. 2005, Totowa, N.J.: Humana Press, xvii, 750 p.

51. Chuang S.E., Daniels D.L., Blattner F.R. Global regulation of gene expression in Escherichia coll 1993. J Bacteriol. 175(7): p. 2026-36.

52. Chalifour L.E., Fahmy R., Holder E.L., Hutchinson E.W., Osterland C.K., Schipper H.M., Wang E. A method for analysis of gene expression patterns. 1994. Anal Biochem. 216(2): p. 299-304.

53. Drmanac S., Drmanac R. Processing of cDNA and genomic kilobase-size clones for massive screening, mapping and sequencing by hybridization. 1994. Biotechniques. 17(2): p. 328-9, 332-6.

54. Yauk C.L., Berndt M.L., Williams A., Douglas G.R. Comprehensive comparison of six microarray technologies. 2004. Nucleic Acids Res. 32(15): p. el 24.

55. Kuo W.P., Liu F., Trimarchi J., Punzo C., Lombardi M., Sarang J., et al. A sequence-oriented comparison of gene expression measurements across different hybridization-based technologies. 2006. Nat Biotechnol. 24(7): p. 832-40.

56. Holloway A.J., van Laar R.K., Tothill R.W., Bowtell D.D. Options available— from start to finish—for obtaining data from DNA microarrays II. 2002. Nat Genet 32 Suppl: p. 481-9.

57. Stears R.L., Getts R.C., Gullans S.R. A novel, sensitive detection system for high-density microarrays using dendrimer technology. 2000. Physiol Genomics. 3(2): p. 93-9.

58. Karsten S.L., Van Deerlin V.M., Sabatti C., Gill L.H., Geschwind D.H. An evaluation of tyramide signal amplification and archivedfixed and frozen tissue in microarray gene expression analysis. 2002. Nucleic Acids Res. 30(2): p. E4.

59. Gupta V., Cherkassky A., Chads P., Joseph R., Johnson A.L., Broadbent J., Erickson Т., DiMeo J. Directly labeled mRNA produces highly precise and unbiased differential gene expression data. 2003. Nucleic Acids Res. 31(4): p. el3.

60. Huber M., Wei T.F., Muller U.R., Lefebvre P.A., Maria S.S., Bao Y.P. Gold nanoparticle probe-based gene expression analysis with unamplified total human RNA. 2004. Nucleic Acids Res. 32(18): p. el 37.

61. Колхинский A.M. Г.Д.А., Лысов Ю.П, Михайлович B.M., Наседкина T.B., Турыгин А.Ю., Рубина А.Ю., Барский В.Е., Заседателев A.C. Микрочипы, основанные на трёхмерных гелевых ячейках: история и перспективы. 2004. Молекулярная биология. 38(1): р. 5—16.

62. Stekel D.J., Git Y., Falciani F. The comparison of gene expression from multiple cDNA libraries. 2000. Genome Res. 10(12): p. 2055-61.

63. Brautigam M., Lindlof A., Zakhrabekova S., Gharti-Chhetri G., Olsson B., Olsson O. Generation and analysis of 9792 EST sequences from cold acclimated oat, Avenasativa. 2005. BMC Plant Biol. 5: p. 18.

64. Gulick P.J., Drouin S., Yu Z., Danyluk J., Poisson G., Monroy A.F., Sarhan F. Transcriptome comparison of winter and spring wheat responding to low temperature. 2005. Genome. 48(5): p. 913-23.

65. Yu F., Chen M.H., Kuo L., Huang P., Yang W. Bayesian Hierarchical Modeling and Selection of Differentially Expressed Genes for the EST Data. 2010. Biometrics.

66. Baranova A.V., Lobashev A.V., Ivanov D.V., Krukovskaya L.L., Yankovsky N.K., Kozlov A.P. In silico screening for tumour-specific expressed sequences in human genome. 2001. FEBS Lett. 508(1): p. 143-8.

67. Klimov D., Skoblov M., Ryazantzev A., Tyazhelova T., Baranova A. In silico search for natural antisense transcripts reveals their differential expression in human tumors. 2006. J Bioinform Comput Biol. 4(2): p. 515-21.

68. Lu B., Xu J., Lai M., Zhang H., Chen J. A transcriptome anatomy of human colorectal cancers. 2006. BMC Cancer. 6: p. 40.77. xProfiler. http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler.

69. EuoMoneKyjia. http://biomolecula.ru/.

70. Ellinghaus P., Badehorn D., Blumer R., Becker K., Seedorf U. Increased efficiency of arbitrarily primed PCR by prolonged ramp times. 1999. Biotechniques. 26(4): p. 626-8, 630.

71. Sandhu K.S., Acharya K.K. ExPrimer: to design primers from exon—exon junctions. 2005. Bioinformatics. 21(9): p. 2091-2.

72. Shulzhenko N., Smirnova A.S., Morgun A., Gerbase-DeLima M. Specificity of alternative splice form detection using RT-PCR with a primer spanning the exon junction. 2003. Biotechniques. 34(6): p. 1244-9.

73. Marshall O.J. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. 2004. Bioinformatics. 20(15): p. 2471-2.

74. Wu X., Munroe DJ. EasyExonPrimer: automated primer design for exon sequences. 2006. Appl Bioinformatics. 5(2): p. 119-20.

75. Marino J.H., Cook P., Miller K.S. Accurate and statistically verified quantification of relative mRNA abundances using SYBR Green I and real-time RT-PCR. 2003. J Immunol Methods. 283(1-2): p. 291-306.

76. Yuan J.S., Reed A., Chen F., Stewart C.N., Jr. Statistical analysis of real-time PCR data. 2006. BMC Bioinformatics. 7: p. 85.

77. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. 2001. Methods. 25(4): p. 402-8.

78. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. 2002. Nucleic Acids Res. 30(9): p. e36.

79. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. 2002. Genome Biol. 3(7): p. RESEARCH0034.

80. Luu-The V., Paquet N., Calvo E., Cumps J. Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction. 2005. Biotechniques. 38(2): p. 287-93.

81. Liu W., Saint D.A. Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics. 2002. Biochem Biophys Res Commun. 294(2): p. 347-53.

82. Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. 2005. Genes Immun. 6(4): p. 279-84.

83. Skrzypski M. Quantitative reverse transcriptase real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in translational oncology: lung cancer perspective. 2008. Lung Cancer. 59(2): p. 147-54.

84. Lallemant B., Evrard A., Corabescure C., Chapuis H., Chambon G., Raynal C., et al. Reference gene selection for head and neck squamous cell carcinoma gene expression studies. 2009. BMC Mol Biol. 10: p. 78.

85. Toegel S., Huang W., Piana C., Unger F.M., Wirth M., Goldring M.B., Gabor F., Viernstein H. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. 2007. BMC Mol Biol. 8: p. 13.

86. Hellemans J., Mortier G., De Paepe A., Speleman F., Vandesompele J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. 2007. Genome Biol. 8(2): p. R19.

87. Saviozzi S., Cordero F., Lo Iacono M., Novello S., Scagliotti G.V., Calogero R.A. Selection of suitable reference genes for accurate normalization of gene expression profile studies in non-small cell lung cancer. 2006. BMC Cancer. 6: p. 200.

88. Shulman L.P. Hereditary breast and ovarian cancer (HBOC): clinical features and counseling for BRCA1 and BRCA2, Lynch syndrome, Cowden syndrome, and Li-Fraumeni syndrome. 2010. Obstet Gynecol Clin North Am. 37(1): p. 109-33, Table of Contents.

89. Gossage L., Eisen T. Alterations in VHL as potential biomarkers in renal-cell carcinoma. 2010. Nature Reviews Clinical Oncology. 7(5): p. 277-88.

90. Kim H., Kwon Y.M., Kim J.S., Lee H., Park J.H., Shim Y.M., et al. Tumor-specific methylation in bronchial lavage for the early detection of non-small-cell lung cancer. 2004. J Clin Oncol. 22(12): p. 2363-70.

91. Nakayama H., Hibi K., Takase T., Yamazaki T., Kasai Y., Ito K., Akiyama S., Nakao A. Molecular detection of pi6 promoter methylation in the serum of recurrent colorectal cancer patients. 2003. Int J Cancer. 105(4): p. 491-3.

92. Feng Q., Hawes S.E., Stern J.E., Wiens L., Lu H., Dong Z.M., et al. DNA methylation in tumor and matched normal tissues from non-small cell lung cancer patients. 2008. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 17(3): p. 645-54.

93. Belinsky S.A. Gene-promoter hypermethylation as a biomarker in lung cancer. 2004. Nat Rev Cancer. 4(9): p. 707-17.

94. Nilsson J., Skog J., Nordstrand A., Baranov V., Mincheva-Nilsson L., Breakefield X.O., Widmark A. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. 2009. Br J Cancer. 100(10): p. 1603-7.

95. Mitchell P.J., Welton J., Staffurth J., Court J., Mason M.D., Tabi Z., Clayton A. Can urinary exosomes act as treatment response markers in prostate cancer? 2009. J Transl Med. 7: p. 4.

96. Cummins J.M., He Y., Leary R.J., Pagliarini R., Diaz L.A., Jr., Sjoblom T., et al. The colorectal microRNAome. 2006. Proc Natl Acad Sei USA. 103(10): p. 368792.

97. Lehmann U., Hasemeier B., Christgen M., Muller M., Romermann D., Langer F., Kreipe H. Epigenetic inactivation of microRNA gene hsa-mir-9-1 in human breast cancer. 2008. J Pathol. 214(1): p. 17-24.

98. Lujambio A., Calin G.A., Villanueva A., Ropero S., Sanchez-Cespedes M., Blanco D., et al. A microRNA DNA methylation signature for human cancer metastasis. 2008. Proc Natl Acad Sei USA. 105(36): p. 13556-61.

99. Calin G.A., Liu C.G., Sevignani C., Ferracin M., Felli N., Dumitru C.D., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. 2004. Proc Natl Acad Sei USA. 101(32): p. 11755-60.

100. Gilad S., Meiri E., Yogev Y., Benjamin S., Lebanony D., Yerushalmi N., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. 2008. PLoS One. 3(9): p. e3148.

101. Mitchell P.S., Parkin R.K., Kroh E.M., Fritz B.R., Wyman S.K., Pogosova-Agadjanyan E.L., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. 2008. Proc Natl Acad Sei USA. 105(30): p. 10513-8.

102. Lawrie C.H., Gal S., Dunlop H.M., Pushkaran B., Liggins A.P., Pulford K., et al. Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. 2008. Br J Haematol. 141(5): p. 672-5.

103. Gold P., Freedman S.O. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system. 1965. J Exp Med. 122(3): p. 467-81.

104. Aabo K., Pedersen H., Kjaer M. Carcinoembryonic antigen (CEA) and alkaline phosphatase in progressive colorectal cancer with special reference to patient survival. 1986. Eur J Cancer Clin Oncol. 22(2): p. 211-7.

105. Cole L.A. Human chorionic gonadotropin tests. 2009. Expert Rev Mol Diagn. 9(7): p. 721-47.

106. Madu C.O., Lu Y. Novel diagnostic biomarkers for prostate cancer. 2010. J Cancer. 1: p. 150-77.

107. Leman E.S., Cannon G.W., Trock B.J., Sokoll L.J., Chan D.W., Mangold L., Partin A.W., Getzenberg R.H. EPCA-2: a highly specific serum marker for prostate cancer. 2007. Urology. 69(4): p. 714-20.

108. Bast R.C., Jr., Xu F.J., Yu Y.H., Barnhill S., Zhang Z., Mills G.B. CA 125: the past and the future. 1998. Int J Biol Markers. 13(4): p. 179-87.

109. Beck E.P., Moldenhauer A., Merkle E., Kiesewetter F., Jager W., Wildt L., Lang N. CA 125 production and release by ovarian cancer cells in vitro. 1998. Int J Biol Markers. 13(4): p. 200-6.

110. Shukla V.K., Gurubachan, Sharma D., Dixit V.K., Usha. Diagnostic value of serum CA242, CA 19-9, CA 15-3 and CA 125 in patients with carcinoma of the gallbladder. 2006. Trop Gastroenterol. 27(4): p. 160-5.

111. Harmenberg U., Wahren B., Wiechel K.L. Tumor markers carbohydrate antigens CA 19-9 and CA-50 and carcinoembryonic antigen in pancreatic cancer and benign diseases of the pancreatobiliary tract. 1988. Cancer Res. 48(7): p. 1985-8.

112. Kruit A., Gerritsen W.B., Pot N., Grutters J.C., van den Bosch J.M., Ruven H.J. CA 15-3 as an alternative marker for KL-6 in fibrotic lung diseases. 2010. Sarcoidosis Vase Diffuse Lung Dis. 27(2): p. 138-46.

113. Duffy M.J., Evoy D., McDermott E.W. CA 15-3: uses and limitation as a biomarker for breast cancer. 2010. Clin Chim Acta 411(23-24): p. 1869-74.

114. Heinze T., Schurenkamper P., Minguillon C., Lichtenegger W. Mammary serum antigen (MSA), Ca 549, CA 15-3 and CEA in breast cancer preoperative sensitivity and correlation to prognostic factors. 1997. Anticancer Res. 17(4B): p. 2953-4.

115. Bethea M., Forman D.T. Beta 2-microglobulin: its significance and clinical usefulness. 1990. Ann Clin Lab Sci. 20(3): p. 163-8.

116. Rapellino M., Pecchio F., Baldi S., Scappaticci E., Cavallo A. Clinical utility of tissue polypeptide antigen determination in lung cancer management. 1995. Anticancer Res. 15(3): p. 1065-70.

117. Dey P. Urinary markers of bladder carcinoma. 2004. Clin Chim Acta 340(1-2): p. 57-65.

118. Roos P.H., Molecular Markers as Diagnostic, Prognostic and Susceptibility Predictors in Bladder Cancer, in Touch Briefing. 2008.

119. Luo J., Zha S., Gage W.R., Dunn T.A., Hicks J.L., Bennett C.J., et al. Alpha-methylacyl-CoA racemase: a new molecular marker for prostate cancer. 2002. Cancer Res. 62(8): p. 2220-6.

120. Jiang Z., Wu C.L., Woda B.A., Iczkowski K.A., Chu P.G., Tretiakova M.S., et al. Alpha-methylacyl-CoA racemase: a multi-institutional study of a new prostate cancer marker. 2004. Histopathology. 45(3): p. 218-25.

121. Rubin M.A., Zhou M., Dhanasekaran S.M., Varambally S., Barrette T.R., Sanda M.G., et al. alpha-Methylacyl coenzyme A racemase as a tissue biomarker for prostate cancer. 2002. JAMA. 287(13): p. 1662-70.

122. Hayes J.D., Pulford D.J. The glutathione S-transferase supergene family: regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance. 1995. Crit Rev Biochem Mol Biol. 30(6): p. 445-600.

123. Gonzalgo M.L., Pavlovich C.P., Lee S.M., Nelson W.G. Prostate cancer detection by GSTP1 methylation analysis of postbiopsy urine specimens. 2003. Clin Cancer Res. 9(7): p. 2673-7.

124. Vanaja D.K., Ballman K.V., Morlan B.W., Cheville J.C., Neumann R.M., Lieber M.M., Tindall D.J., Young C.Y. PDLIM4 repression by hypermethylation as a potential biomarker for prostate cancer. 2006. Clin Cancer Res. 12(4): p. 112836.

125. Buxbaum J.L., Eloubeidi M.A. Molecular and clinical markers of pancreas cancer. 2010. JOP. 11(6): p. 536-44.

126. Svatek R.S., Herman M.P., Lotan Y., Casella R., Hsieh J.T., Sagalowsky A.I., Shariat S.F. Soluble Fas—a promising novel urinary marker for the detection of recurrent superficial bladder cancer. 2006. Cancer. 106(8): p. 1701-7.

127. Position C.h.C., Tumor Markers for Diagnosis and Management of Cancer. 2007.

128. Pedraza V., Gomez-Capilla J.A., Escaramis G., Gomez C., Torne P., Rivera J.M., et al. Gene expression signatures in breast cancer distinguish phenotype characteristics, histologic subtypes, and tumor invasiveness. 2010. Cancer. 116(2): p. 486-96.

129. Christos Sotiriou, Pusztai L. Gene-Expression Signatures in Breast Cancer. 2009. The New England Journal of Medicine. 1(1): p. 790-800.

130. Theodorescu D., Wittke S., Ross M.M., Walden M., Conaway M., Just I., Mischak H., Frierson H.F. Discovery and validation of new protein biomarkers for urothelial cancer: a prospective analysis. 2006. Lancet Oncol. 7(3): p. 230-40.

131. National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

132. University of California Santa Cruz, http://www.genome.ucsc.edu/.

133. NCBI UniGene. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=unigene.

134. Greenman C., Stephens P., Smith R., Dalgliesh G.L., Hunter C., Bignell G., et al. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes. 2007. Nature. 446(7132): p. 153-8.

135. Morre D.J., Hostetler B., Weston N., Kim C., Morre D.M. Cancer type-specific tNOX isoforms: A putative family of redox protein splice variants with cancer diagnostic and prognostic potential. 2009. Biofactors. 34(3): p. 201-7.

136. Cheung H.C., Baggerly K.A., Tsavachidis S., Bachinski L.L., Neubauer V.L., Nixon T.J., et al. Global analysis of aberrant pre-mRNA splicing in glioblastoma using exon expression arrays. 2008. BMC Genomics. 9: p. 216.

137. Ku T.H., Hsu F.R. Mining colon cancer specific alternative splicing in EST database. 2005. AMIA Annu Symp Proc. p. 1012.

138. Kadara H., Fujimoto J., Men T., Ye X., Lotan D., Lee J.S., Lotan R. A GprcSa tumor suppressor loss of expression signature is conserved, prevalent, and associated with survival in human lung adenocarcinomas. 2010. Neoplasia 12(6): p. 499-505.

139. Acquafreda T., Soprano K.J., Soprano D.R. GPRC5A: A potential tumor suppressor and oncogene. 2009. Cancer Biol Ther. 8(10).

140. Ye X., Tao Q., Wang Y., Cheng Y., Lotan R. Mechanisms underlying the induction of the putative human tumor suppressor GPRCSA by retinoic acid. 2009. Cancer Biol Ther. 8(10): p. 951-62.

141. Ribelles N., Lopez-Siles J., Sanchez A., Gonzalez E., Sanchez M.J., Carabantes F., et al. A carboxylesterase 2 gene polymorphism as predictor of capecitabine on response and time to progression. 2008. Curr Drug Metab. 9(4): p. 336-43.

142. Mlakar V., Berginc G., Volavsek M., Stor Z., Rems M., Glavac D. Presence of activating KRAS mutations correlates significantly with expression of tumour suppressor genes DCN and TPM1 in colorectal cancer. 2009. BMC Cancer. 9: p. 282.

143. Chapman J.M., Knoepp S.M., Byeon M.K., Henderson K.W., Schweinfest C.W. The colon anion transporter, down-regulated in adenoma, induces growth suppression that is abrogated by El A. 2002. Cancer Res. 62(17): p. 5083-8.

144. Ma Y., Peng J., Liu W., Zhang P., Huang L., Gao B., et al. Proteomics identification of desmin as a potential oncofetal diagnostic and prognostic biomarker in colorectal cancer. 2009. Mol Cell Proteomics. 8(8): p. 1878-90.

145. Higai K., Miyazaki N., Azuma Y., Matsumoto K. Transcriptional regulation of the fucosyltransferase VIgene in hepatocellular carcinoma cells. 2008. Glycoconj J. 25(3): p. 225-35.

146. D'Arrigo A., Belluco C., Ambrosi A., Digito M., Esposito G., Bertola A., et al. Metastatic transcriptional pattern revealed by gene expression profiling in primary colorectal carcinoma. 2005. Int J Cancer. 115(2): p. 256-62.

147. Choi Y.W., Bae S.M., Kim Y.W., Lee H.N., Park T.C., Ro D.Y., et al. Gene expression profiles in squamous cell cervical carcinoma using array-based comparative genomic hybridization analysis. 2007. Int J Gynecol Cancer. 17(3): p. 687-96.

148. Rosmann S., Hahn D., Lottaz D., Kruse M.N., Stocker W., Sterchi E.E. Activation of human meprin-alpha in a cell culture model of colorectal cancer is triggered by theplasminogen-activating system. 2002. J Biol Chem. 277(43): p. 40650-8.

149. Mikula M., Rubel T., Karczmarski J., Goryca K., Dadlez M., Ostrowski J. Integrating proteomic and trans crip tomic high-throughput surveys for search of new biomarkers of colon tumors. 2010. Funct Integr Genomics.

150. Abbott K.L., Nairn A.V., Hall E.M., Horton M.B., McDonald J.F., Moremen K.W., Dinulescu D.M., Pierce M. Focused glycomic analysis of the N-linked glycan biosynthetic pathway in ovarian cancer. 2008. Proteomics. 8(16): p. 321020.

151. Wang Y., Ma Y., Lu B., Xu E., Huang Q., Lai M. Differential expression of mimecan and thioredoxin domain-containing protein 5 in colorectal adenoma and cancer: a proteomic study. 2007. Exp Biol Med (Maywood). 232(9): p. 1152-9.

152. Zhang L., Hou Y., Li N., Wu K., Zhai J. The influence ofTXNDC5 gene on gastric cancer cell 2010. J Cancer Res Clin Oncol.

153. DA VID Bioinformatics Resources 6.7. http://david.abcc.ncifcrf.gov/.

154. Hwang Y.C., Lu T.Y., Huang D.Y., Kuo Y.S., Kao C.F., Yeh N.H., Wu H.C., Lin C.T. NOLC1, an enhancer of nasopharyngeal carcinoma progression, is essential for TP53 to regulate MDM2 expression. 2009. Am J Pathol. 175(1): p. 342-54.

155. Turashvili G., Bouchal J., Baumforth K., Wei W., Dziechciarkova M., Ehrmann J., et al. Novel markers for differentiation of lobular and ductal invasive breast carcinomas by laser microdissection and microarray analysis. 2007. BMC Cancer. 7: p. 55.

156. Oehler V.G., Yeung K.Y., Choi Y.E., Bumgarner R.E., Raftery A.E., Radich J.P. The derivation of diagnostic markers of chronic myeloid leukemia progression from microarray data. 2009. Blood. 114(15): p. 3292-8.

157. Leary J.A., Kerr J., Chenevix-Trench G., Doris C.P., Hurst T., Houghton C.R., Friedlander M.L. Increased expression of the NME1 gene is associated with metastasis in epithelial ovarian cancer. 1995. Int J Cancer. 64(3): p. 189-95.

158. Hamby C.V., Mendola C.E., Potla L., Stafford G., Backer J.M. Differential expression and mutation of NME genes in autologous cultured human melanoma cells with different metastatic potentials. 1995. Biochem Biophys Res Commun. 211(2): p. 579-85.

159. GeneCards. http://www.genecards.org.

160. Kaul D., Wu C.L., Adkins C.B., Jordan K.W., Defeo E.M., Habbel P., et al. Assessing prostate cancer growth with mRNA of spermine metabolic enzymes. 2010. Cancer Biol Ther. 9(9).

161. Whitaker H.C., Warren A.Y., Eeles R., Kote-Jarai Z., Neal D.E. The potential value of microseminoprotein-beta as a prostate cancer biomarker and therapeutic target. 2010. Prostate. 70(3): p. 333-40.

162. Kote-Jarai Z., Leongamornlert D., Tymrakiewicz M., Field H., Guy M., Al Olama A.A., et al. Mutation analysis of the MSMB gene in familial prostate cancer. 2010. Br J Cancer. 102(2): p. 414-8.

163. Brito G.C., Fachel A.A., Vettore A.L., Vignal G.M., Gimba E.R., Campos F.S., et al. Identification of protein-coding and intronic noncoding RNAs down-regulated in clear cell renal carcinoma. 2008. Mol Carcinog. 47(10): p. 757-67.

164. Trasino S.E., Harrison E.H., Wang T.T. Androgen regulation of aldehyde dehydrogenase 1A3 (ALDH1A3) in the androgen-responsive human prostate cancer cell lineLNCaP. 2007. Exp Biol Med (Maywood). 232(6): p. 762-71.

165. Li T., Su Y., Mei Y., Leng Q., Leng B., Liu Z., Stass S.A., Jiang F. ALDH1A1 is a marker for malignant prostate stem cells and predictor ofprostate cancer patients' outcome. 2010. Lab Invest 90(2): p. 234-44.

166. Ji N.Y., Park M.Y., Kang Y.H., Lee C.I., Kim D.G., Yeom Y.I., et al. Evaluation of annexin II as a potential serum marker for hepatocellular carcinoma using a developed sandwich ELISA method. 2009. Int J Mol Med. 24(6): p. 765-71.

167. Zhang F., Zhang L., Zhang B., Wei X., Yang Y., Qi R.Z., et al. Anxa2 plays a critical role in enhanced invasiveness of the multidrug resistant human breast cancer cells. 2009. J Proteome Res. 8(11): p. 5041-7.

168. Keenan J., Murphy L., Henry M., Meleady P., Clynes M. Proteomic analysis of multidrug-resistance mechanisms in adriamycin-resistant variants of DLKP, a squamous lung cancer cell line. 2009. Proteomics. 9(6): p. 1556-66.

169. Unger K., Wienberg J., Riches A., Hieber L., Walch A., Brown A., et al. Novel gene rearrangements in transformed breast cells identified by high-resolution breakpoint analysis of chromosomal aberrations. 2010. Endocr Relat Cancer. 17(1): p. 87-98.

170. Rebouissou S., Vasiliu V., Thomas C., Bellanne-Chantelot C., Bui H., Chretien Y., et al. Germline hepatocyte nuclear factor 1 alpha and lbeta mutations in renal cell carcinomas. 2005. Hum Mol Genet. 14(5): p. 603-14.

171. Shimizu K., Abe M., Tsukada K. Deficiency of methionine synthesis enzyme activity in ascites tumor cells. 1990. Biochem Int. 20(6): p. 1105-10.

172. Xu X., Gammon M.D., Zeisel S.H., Bradshaw P.T., Wetmur J.G., Teitelbaum S.L., et al. High intakes of choline and betaine reduce breast cancer mortality in a population-based study. 2009. FASEB J. 23(11): p. 4022-8.

173. Kress S., Stein A., Maurer P., Weber B., Reichert J., Buchmann A., Huppert P., Schwarz M. Expression of hypoxia-inducible genes in tumor cells. 1998. J Cancer Res Clin Oncol. 124(6): p. 315-20.

174. Yokota S., Yamamoto Y., Shimizu K., Momoi H., Kamikawa T., Yamaoka Y., et al. Increased expression of cytosolic chaperonin CCT in human hepatocellular and colonic carcinoma. 2001. Cell Stress Chaperones. 6(4): p. 345-50.

175. Ramalho F.S., Ramalho L.N., Delia Porta L., Zucoloto S. Comparative immunohistochemical expression of p63 in human cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma. 2006. J Gastroenterol Hepatol. 21(8): p. 1276-80.

176. Saeki A., Tamura S., Ito N., Kiso S., Matsuda Y., Yabuuchi I., Kawata S., Matsuzawa Y. Frequent impairment of the spindle assembly checkpoint in hepatocellular carcinoma. 2002. Cancer. 94(7): p. 2047-54.

177. Hsieh S.Y., Chen W.Y., Shih T.C., Yeh J.Y., Jeng J.T. Dys-regulation ofclusterin in human hepatoma is not associated with tumorigenesis but is secondary to cell response to external tresses. 2005. Mol Carcinog. 43(2): p. 100-7.

178. Matsuda K., Noda C., Ichihara A. Expression of only one of two types of mRNA transcribed from the serine dehydratase gene is repressed in hepatoma cells. 1992. Biochem Biophys Res Commun. 188(1): p. 336-43.

179. Chen W.B., Lenschow W., Tiede K., Fischer J.W., Kalthoff H., Ungefroren H. Smad4/DPC4-dependent regulation of biglycan gene expression by transforming growth factor-beta in pancreatic tumor cells. 2002. J Biol Chem. 277(39): p. 36118-28.

180. Leivo I., Jee K.J., Heikinheimo K., Laine M., Ollila J., Nagy B., Knuutila S. Characterization of gene expression in major types of salivary gland carcinomas with epithelial differentiation. 2005. Cancer Genet Cytogenet. 156(2): p. 104-13.

181. Couch F.J., Wang X., McWilliams R.R., Bamlet W.R., de Andrade M., Petersen G.M. Association of breast cancer susceptibility variants with risk of pancreatic cancer. 2009. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 18(11): p. 3044-8.

182. Tilman G., Mattiussi M., Brasseur F., van Baren N., Decottignies A. Human periostin gene expression in normal tissues, tumors and melanoma: evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells. 2007. Mol Cancer. 6: p. 80.

183. Frommer K.W., Reichenmiller K., Schutt B.S., Hoeflich A., Ranke M.B., Dodt G., Elmlinger M. W. IGF-independent effects of IGFBP-2 on the human breast cancer cell line Hs578T. 2006. J Mol Endocrinol. 37(1): p. 13-23.

184. Sato N., Matsubayashi H., Abe T., Fukushima N., Goggins M. Epigenetic down-regulation of CDKN1 C/p57KIP2 in pancreatic ductal neoplasms identified by gene expression profiling. 2005. Clin Cancer Res. 11(13): p. 4681-8.

185. Trebinska A., Rembiszewska A., Ciosek K., Ptaszynski K., Rowinski S., Kupryjanczyk J., Siedlecki J.A., Grzybowska E.A. HAX-1 overexpression, splicing and cellular localization in tumors. 2010. BMC Cancer. 10(1): p. 76.

186. Kalidas S., Santosh V., Shareef M.M., Shankar S.K., Christopher R., Shetty K.T. Expression ofp67 (Munc-18) in adult human brain and neuroectodermal tumors of human central nervous system. 2000. Acta Neuropathol. 99(2): p. 191-8.

187. Hofer M.D., Browne T.J., He L., Skotheim R.I., Lothe R.A., Rubin M.A. Identification of two molecular groups of seminomas by using expression and tissue microarrays. 2005. Clin Cancer Res. 11(16): p. 5722-9.

188. Siu I.M., Bai R., Gallia G.L., Edwards J.B., Tyler B.M., Eberhart C.G., Riggins G J. Coexpression of neuronatin splice forms promotes medulloblastoma growth. 2008. Neuro Oncol. 10(5): p. 716-24.

189. Davidson B., Stavnes H.T., Holth A., Chen X., Yang Y., Shih I.M., Wang T.L. Gene expression signatures differentiate ovarian/peritoneal serous carcinoma from breast carcinoma in effusions. 2010. J Cell Mol Med.

190. Mansilla F., da Costa K.A., Wang S., Kruhoffer M., Lewin T.M., Orntoft T.F., Coleman R.A., Birkenkamp-Demtroder K. Lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 (LPCAT1) overexpression in human colorectal cancer. 2009. J Mol Med. 87(1): p. 85-97.

191. Xu S., Jia Z.F., Kang C., Huang Q., Wang G., Liu X., et al. Upregulation of SEPT7 gene inhibits invasion of human glioma cells. 2010. Cancer Invest. 28(3): p. 248-58.

192. Xu S., Jia Z.F., Huang Q., Kang C., Wang G.X., Zhang A.L., et al. Study on the anti-invasion effect of SEPT7 gene for U251MG glioma cell in vitro. 2008. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25(3): p. 262-7.

193. Chang H., Jeung H.C., Jung J.J., Kim T.S., Rha S.Y., Chung H.C. Identification of genes associated with chemosensitivity to SAHA/taxane combination treatment in taxane-resistant breast cancer cells. 2010. Breast Cancer Res Treat.

194. Jiang W.G., Martin T.A., Lewis-Russell J.M., Douglas-Jones A., Ye L., Mansel R.E. Eplin-alpha expression in human breast cancer, the impact on cellular migration and clinical outcome. 2008. Mol Cancer. 7: p. 71.

195. Bernheim A., Toujani S., Saulnier P., Robert T., Casiraghi O., Validire P., et al. High-resolution array comparative genomic hybridization analysis of human bronchial and salivary adenoid cystic carcinoma. 2008. Lab Invest 88(5): p. 46473.

196. Logozzi M., De Milito A., Lugini L., Borghi M., Calabro L., Spada M., et al. High levels of exosomes expressing CD63 and caveolin-1 in plasma of melanoma patients. 2009. PLoS One. 4(4): p. e5219.

197. Lewis T.B., Robison J.E., Bastien R., Milash B., Boucher K., Samlowski W.E., et al. Molecular classification of melanoma using real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction. 2005. Cancer. 104(8): p. 1678-86.

198. Han F., Gu D., Chen Q., Zhu H. Caveolin-1 acts as a tumor suppressor by down-regulating epidermal growth factor receptor-mitogen-activated protein kinase signaling pathway in pancreatic carcinoma cell lines. 2009. Pancreas. 38(7): p. 766-74.

199. Felicetti F., Parolini I., Bottero L., Fecchi K., Errico M.C., Raggi C., et al. Caveolin-1 tumor-promoting role in human melanoma. 2009. Int J Cancer. 125(7): p. 1514-22.

200. Rolny C., Capparuccia L., Casazza A., Mazzone M., Vallario A., Cignetti A., et al. The tumor suppressor semaphorin 3B triggers a prometastatic program mediated by interleukin 8 and the tumor microenvironment. 2008. J Exp Med. 205(5): p. 1155-71.

201. Varshavsky A., Kessler O., Abramovitch S., Kigel B., Zafftyar S., Akiri G., Neufeld G. Semaphorin-3B is an angiogenesis inhibitor that is inactivated by furin-likepro-protein convertases. 2008. Cancer Res. 68(17): p. 6922-31.

202. Wang S.H., Liu N.H., Wang J., Bai H., Mao L. Critical role of deltaDNMT3B4/2 in regulating RASSF1A promoter-specific DNA methylation in non-small cell lung cancer. 2008. Chin Med J (Engl). 121(17): p. 1712-21.

203. Richter A.M., Pfeifer G.P., Dammann R.H. The RASSF proteins in cancer; from epigenetic silencing to functional characterization. 2009. Biochim Biophys Acta. 1796(2): p. 114-28.

204. Young A.C., Craven R.A., Cohen D., Taylor C., Booth C., Harnden P., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. 2009. Clin Cancer Res. 15(24): p. 7582-7592.

205. Kashuba V.I., Pavlova T.V., Grigorieva E.V., Kutsenko A., Yenamandra S.P., Li J., Wang F., Protopopov A.I., Zabarovska V.I. et al. High mutability of the tumor suppressor genes RASSF 1 and RBSP3 (CTDSPL) in cancer. PLoS One. 2009 May 29; 4(5):e5231.

206. He Y., Mou Z., Li W., Liu B., Fu T., Zhao S., Xiang D., Wu Y. Identification of IMPDH2 as a tumor-associated antigen in colorectal cancer using immunoproteomics analysis. 2009. Int J Colorectal Dis. 24(11): p. 1271-9.

207. Dudderidge T.J., Stoeber K., Loddo M., Atkinson G., Fanshawe T., Griffiths D.F., Williams G.H. Mcm2, Geminin, and KI67 define proliferative state and are prognostic markers in renal cell carcinoma. 2005. Clin Cancer Res. 11(7): p. 2510-7.

208. Tani Y., Akiyama Y., Fukamachi H., Yanagihara K., Yuasa Y. Transcription factor SOX2 up-regulates stomach-specific pepsinogen A gene expression. 2007. J Cancer Res Clin Oncol. 133(4): p. 263-9.

209. Kuo S.J., Chien S.Y., Lin C., Chan S.E., Tsai H.T., Chen D.R. Significant elevation of CLDN16 and HAPLN3 gene expression in human breast cancer. 2010. Oncol Rep. 24(3): p. 759-66.

210. Katoh M. CLDN23 gene, frequently down-regulated in intestinal-type gastric cancer, is a novel member of CLAUDIN gene family. 2003. Int J Mol Med. 11(6): p. 683-9.

211. Kigel B., Varshavsky A., Kessler O., Neufeld G. Successful inhibition of tumor development by specific class-3 semaphorins is associated with expression of appropriate semaphorin receptors by tumor cells. 2008. PLoS One. 3(9): p. e3287.

212. Hergovich A., Kohler R.S., Schmitz D., Vichalkovski A., Cornils H., Hemmings B.A. The MST1 and hMOBl tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. 2009. Curr Biol. 19(20): p. 1692-702.

213. Ateeq B., Tomlins S.A., Chinnaiyan A.M. AGTR1 as a therapeutic target in ERpositive and ERBB2-negative breast cancer cases. 2009. Cell Cycle. 8(23): p. 3794-5.

214. Li J.F., Huang Y., Chen R.L., Lee H.J. Induction of apoptosis by gene transfer of human TRAIL mediated by arginine-rich intracellular delivery peptides. 2010. Anticancer Res. 30(6): p. 2193-202.

215. Sharp T.V., Al-Attar A., Foxier D.E., Ding L., de A.V.T.Q., Zhang Y., et al. The chromosome 3p21.3-encoded gene, LIMD1, is a critical tumor suppressor involved in human lung cancer development. 2008. Proc Natl Acad Sci USA. 105(50): p. 19932-7.

216. Weng Y.I., Hsu P.Y., Liyanarachchi S., Liu J., Deatherage D.E., Huang Y.W., et al. Epigenetic influences of low-dose bisphenol A in primary human breast epithelial cells. 2010. Toxicol Appl Pharmacol. 248(2): p. 111-21.

217. Sedlak T.W., Snyder S.H. Messenger molecules and cell death: therapeutic implications. 2006. JAMA. 295(1): p. 81-9.

218. Chan S.W., Lim C.J., Guo K., Ng C.P., Lee I., Hunziker W., Zeng Q., Hong W. A role for TAZ in migration, invasion, and tumorigenesis of breast cancer cells. 2008. Cancer Res. 68(8): p. 2592-8.

219. Human Genome Project. http://www.ornl.gov/sci/techresources/HumanGenome/faq/genenumber.shtml.

220. Tu Z., Wang L., Xu M., Zhou X., Chen T., Sun F. Further understanding human disease genes by comparing with housekeeping genes and other genes. 2006. BMC Genomics. 7: p. 31.

221. Rhodes D.R., Yu J., Shanker K., Deshpande N., Varambally R., Ghosh D., et al. ONCOMINE: a cancer microarray database and integrated data-mining platform. 2004. Neoplasia 6(1): p. 1-6.

222. Al-Shahrour F., Carbonell J., Minguez P., Goetz S., Conesa A., Tarraga J., et al. Babelomics: advanced functional profiling of transcriptomics, proteomics and genomics experiments. 2008. Nucleic Acids Res. 36(Web Server issue): p. W341-6.

223. Wilson C.M., Roebuck Q., High S. Ribophorin I regulates substrate delivery to the oligosaccharyltransferase core. 2008. Proc Natl Acad Sci USA. 105(28): p. 9534-9.

224. Demirhan O., Tastemir D., Hasturk S., Kuleci S., Hanta I. Alterations in pi6 and p53 genes and chromosomal findings in patients with lung cancer: Fluorescence in situ hybridization and cytogenetic studies. 2010. Cancer Epidemiol.

225. Gronbaek K., Hother C., Jones P.A. Epigenetic changes in cancer. 2007. APMIS. 115(10): p. 1039-59.

226. Entschladen F., Drell T.L.t., Lang K., Joseph J., Zaenker K.S. Tumour-cell migration, invasion, and metastasis: navigation by neurotransmitters. 2004. Lancet Oncol. 5(4): p. 254-8.

227. Milman N., Pedersen L.M. The serum ferritin concentration is a significant prognostic indicator of survival in primary lung cancer. 2002. Oncol Rep. 9(1): p. 193-8.

228. Wang W., Knovich M.A., Coffman L.G., Torti F.M., Torti S.V. Serum ferritin: Past, present andfuture. 2010. Biochim Biophys Acta. 1800(8): p. 760-9.

229. Koorts A.M., Viljoen M. Ferritin and ferritin isoforms II: protection against uncontrolled cellular proliferation, oxidative damage and inflammatory processes. 2007. Arch Physiol Biochem. 113(2): p. 55-64.

230. Koorts A.M., Viljoen M. Ferritin and ferritin isoforms I: Structure-function relationships, synthesis, degradation and secretion. 2007. Arch Physiol Biochem. 113(1): p. 30-54.

231. Mertz J.R., Theil E.C. Subunit dimers in sheep spleen apoferritin. The effect on iron storage. 1983. J Biol Chem. 258(19): p. 11719-26.

232. Essen A., Ozen H., Ayhan A., Ergen A., Tasar C., Remzi F. Serum ferritin: a tumor marker for renal cell carcinoma. 1991. J Urol. 145(6): p. 1134-7.

233. Oncomine. http://www.oncomine.org/.

234. Sammarco M.C., Ditch S., Banerjee A., Grabczyk E. Ferritin L and H subunits are differentially regulated on a post-transcriptional level. 2008. J Biol Chem. 283(8): p. 4578-87.

235. Cheng A.M., Byrom M.W., Shelton J., Ford L.P. Antisense inhibition of humanmiRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth andapoptosis. 2005. Nucleic Acids Res. 33(4): p. 1290-7.

236. Tang N., Zhang J., Du Y. Curcumin promoted the apoptosis of cisplain-resistant human lung carcinoma cells A549/DDP through down-regulating miR-186*. 2010. Zhongguo Fei Ai ZaZhi. 13(4): p. 301-6.

237. Zhang J., Du Y., Wu C., Ren X., Ti X., Shi J., Zhao F., Yin H. Curcumin promotes apoptosis in human lung adenocarcinoma cells through miR-186* signaling pathway. 2010. Oncol Rep. 24(5): p. 1217-23.

Информация о работе

Краснов, Георгий Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Поиск и идентификация нарушений экспрессии генов в различных опухолях человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы