Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОДВИЖНОСТЬ БЕЛКОВ В МЕМБРАНАХ БАКТЕРИЙ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ПОДВИЖНОСТЬ БЕЛКОВ В МЕМБРАНАХ БАКТЕРИЙ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДША ЛЕНИНА ИГСТШТ ШШШИ ИИШИ А.Н.БАІА

КАЛРЕДЬЯНЦ Арсевий Сунбатовдч .

ПОДНШЮСТЬ БЕЛКОВ В МШБВШХ ВАКТЕРИЙ И '/' ФУНКЦИОШТОВАНИВ ШМЕРШШХ ОШЙНГШХ СИСТШ

(Еводогкческая дшия ^03,00.04,)

Автореферат

дмосергацм m сояскаддв ученое отвсевв кандидата биологических ваук

\

Моодоа - 1976

ЗіІСЩ^ЛІіЛ)

Работе выполнена в лаборатории эяодюцмовно! биохимии ■ субгмточЕшс структур Ордена Ленина Института биохимия имени 1.В.Баха АН СССР.

Научные руководители: доктор биологических наук

Д.Н.Островский академик А.И.Опарин

Офааиахыше оппоненты: доктор биологических наук

А.В.Котельннкова кандидат химических наук Р. И Давыдов

На официальный отзыв работа направлена в Московски* Государственна Университет им.И.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " / " (Лг 1976 г.

Задіта состоите« "_"_*_1976 р.

на заседании Ученого Совета Ордена Ленина інстщтута би охикии км.А.Н*£аха АН СССР (Москва, Ленинский пр., 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического отделение АН СССР {Носкве, Ленинский пр., 33). - .- ■ .

Ученый секретарь - :.г.< кандидат биологических наук

861.,I-

-Т'^г- /В. Н.Дьячкозз/

• ' *

Функционирование биологических иембран во иногом связано с работой ферментов и ферментных систем, вахкейЕей особенностью которых является естественная ишобил'лзавдя в ыаг-риксе ыеибраны. В этой сзяэа многие исследования ¡¿ем бравы направлены на изучение характера связей, степени иыиобллиза-ции, взаимоотношений белков друг с другой а о липиднын кои-поазнтои ее. В этом направлении за последние годя достигну! больной прогресо: приыоненио инфоризтивных физических ИЗТ0-доз позволила взглянуть на ценйраву не как на жесткое и фиксированное во времени образование, а как на структуру с дина-шипыни белок-липидныыи связями и компонентами, спососныиа к тепловой диффузии ( , Hlcoleon , 1972; Edldln ,1974).

Однако, если относительно динамических свойств липвдоз в иец-бравах имеется обширная информация с надеаными количественны-иг оценками, то пока в литературе мошо найти линь несколько случаев, где была показана подвизность иеибрашшх белков* С другой стороны, в настоящее время далеко не ясно, каким образом реализуется подвизнозть мембранных компонентов в функционировании мембраны. Видимо пришло время, когда от констатации общего факта динамической природы Сиомембраш необходимо переходить к изучение подвигаости мембранных компонентов и ее роди для протекания конкретных процессов в функционирования конкретных ферментов а ферментных систем.

При выполнении настоящей работы ма старались обнаружить а количественно оценить такие виды диффузии белков в иеибраках бактерий, которые могли бы быть вахны с точки зрения функционирования. В качестве задачи » 2 было решено исследовать пут модификации подвизностн меибраыаых балков через изменения ли-пидного изтрикса меибраицр тем,чтобы выяснить, как подобная модификация скахется на функционирования мембранных ферцентов.

Анализ полученных в работа результатов позволяет сформулировать представления о дыхательных ферментных ансамблях как данакичееккх образованиях о конечный врвценеч лизни. В ходе работы обнаружен новый для барао^швреш-уод^диффу^иа! назван-

ба^пс^врад-у^ц^да^у^иа

Узсз. Лпш с:ш;з, г.^д. k;Ï. ¡LA. X^-i^ï^a,

ъЛ-ЖШ

ный "мгхфазной дгффузией", при которой фиксированное место на поьерхвоаіа белка ниеет ограниченное время пребывания как в фазе иеиЗргвн, так и во внешней среде. Развиваются также новые представления о механизме действия мембранотропного енти-баотаяа граигцздааа г : ионное взаимодействие граьшцадина с фосфолгпадаиа ыеибран приводах к "заморезиванию" участков мембраны и фгзогочт обособлению фосфолипядов, «го является непосредстве нн о а причиной нарушения действия мембранных дыхатель-шл ферментов, изменения их положения в ыеибравнои иатряксе я нарушения проницаемости мембраны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В рабоге жсзользовали культуру Ш.сгососсиэ 1уоо<}еііііспв в догери^мячесаой фазе, выращенную на мясопептоннои бульоне при 30%. Культуру психро^ильных бактерий Равийоиопаа Пиогеа-сеав вырадавалл на иясопептонном агаре на чашках Петри; до-середины логарифмической фазы.

Клеточные мембраны иикрококна выделяли путей лизиса бактерий лзэсцимси в присутствии ДНКазы в гипотонической среде О последуиздм осаддением центрифугированием*

Окоэдазкые активности измеряли полярографичеоки на приборе ьР-7 с тзраозтатируемой ячейкой (Иольц, Островский, 1965). Двгидрогееаэы измеряли до изменению оптической плотности ( =600 вл) акцептора 2,б-дихлорфе в олинд офе нола в присутствия иенадяона.

*

Степень Босстановленности цитохроиов в суспензии ыеибраа измеряли вз дгЙерснцга льном спектрофотометре ДСФ-2. Кинетику зосстанозлзная дыхательных переносчиков исследовала н& спектрофотометре шласЫ -356, применяя двухвалковую стому. Для создания аааэробгоза в ячейке применяли глюкозооксидазу. Расчет степені восстановивниэсти цитохромов вели согласна ііоїй-зо2 и Іисен^овой (1964).

5 качестве парамагнитных зондов использовала стабильные имаиохсиыше радиолы: 2,2,6,6-тетраиетид-4-пальметидоилаіа-домперадлп-І-оісид (І) в 2Д4-карбокситстрадецад/2-зїил-4,4-

сода-

сн3-снг-(снг)І2чї-н -

п

СН^-* СНд

<

саГТ;на

з

диметил-З-оксазолидниилокоил (П). Зонди вводили в суспаазис неибран из водной эмульсии. В работе была применена спиновая метяа-спии-иеченный эталзниин:Ч (£-н-этяленаивно-протюнил)-сясал-2,2,6,6 теграметилпипервдмн-Г-оксил (О). Зхлючонке метка осуществляли путей периешивааия суспензии мембран в присутствия 5.ЇО~^11 метки при 4° б течение Ці часов о последувцим извлечением из мембран аесвпзавааися о оехком части иыацоксилькых ра-* — -дакалов- Регистрация) сигналов ЭПР проводила ва радиоспектрометре РЭ-1301. Расчеі времени корреляция врачательной диффузии ( Тс, ) во спектрам ШР проводила по иатоду Вассермана (1968), а в области медленных вращений эопда использовали методику

Кияпвіаот А.И. «І а1.(і97і).

Липиды виде ля л а по мотодуфодча (1957). Для изучения жир-нокислотаого состава общио липиды подвергала кислому нетанози-эу. Полеченные метиловые эфары жирных кяолот анализировала ва газохидкоствоц хроматографа "Руе".

Белок определял» по методу Лоури (1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Латеральная по^виднортъ белковых комтоиевтов электрон-транспрртной.цеті в мембрана» Соктеоий.

- Поставав перед собой задачу исследовать интересные для функционировании виды диффузия мембранных белков мы акцеатд-рогали своё внимание ва иногоксапонентжой мембранной фор- •

игнтаой системе - цепа переноса электрона и протона., При этой; было peseao в первуп очередь оценить возможность диффузии;бед-kobui переносчиков дыхательной цепи в латеральной направлении по мембране, поскольку такой тип подвижности мсает играть.клп-чевуи роль в акте передачи электрона между соседаиая.компонентами цепи*- С этой целы» было применено несколько экспериментальных подходов.

I• Исследование функционирования дыхательной,цепи в мембранах бактерий,, выращенных в присутствии антибиотика хд ора ц$е никола.

Как известно, хлорамфенвкол (левомицатвн) подавляет синтез белка в клетке (как цитоплаэматического, теки мембранного) , вследствие чего мембрана "саиревает" (Островский и др., 1973). Если.перенос электрона осуществляется благодаря диффузионному взаимодействию белковых компонентов, которое, лимитирует перенос в целом подыхотальной цепа (т.е. оксид аз иjd: активность), то.оксадазная активность,.отнесенная к-количеству; переносчиков в мембране,, долхва уменьшаться посла "озирания? вследствие уменьаеная концвнтрадии. переносчиЕОВ в ыембране. В то se время,, если дыхательная цепь.функционирует в виде ве-распадавцегося блока или, если-оксидазнаяактивность лимитируется передачей элаатрона между ко*щдексаыи цепа через небелковый жирорастворимый.пзревосчик,. то относительная скорость-дкхавая в.левомацегазовых клеткахне долхна измениться по-сравнение с натакгныии. В проведенных трех экспериментах, в которых клетки : Miorococcuaajflodeiictlcua< вы ранда вали • в присутствии левомацетава было рассчитано, что доля липида в- мембранах ле-вомацетвновых клеток повысается^с-30^ (контроль);до АО; 36,8 и 39,Принимаем,, что скорость лаьитирувдей реакция^т. ) в дыхательной цепи определяется уравнением: т •K.Î.O , ; где С1 и С^- концентрации двух сталкивающихся компонентов,. а К -коастанта. Пра.С* « Сп ж справедливости!постулата о свободном, двззсаиа белков скорость дыхания, ;; отнесенная к количеству переносчиков, „догааауиеньгатьсяг 1,36, 1,22 н в 1,32 раза.соответственно разной стзиени "оянрениа" мемираныв трдхояыах. Экспериментально найденаыа ци$ры сведены ъ табл.1,- ез которой .

видно, чіо относительные скороми поглощения кислорода з ле-вомицетиновтс клетках иевьпе по сравненав с инггктюлій на величину,. бдзэкуп к расчетной.

Таблица І

Степень замедления дыхания в клетках Шсгососсиз іуаодеікіісив , выраценньас в присутствии левсиацетиаа

Номер Относеииз поглощения кислорода (отнесенного а со^ер-огшта »алию цатокроыов) в контрольных клетках к таховоиу г ' яевсиицетановых клетках. Субстрат дыхания-©£,-кето-глутарозая кислота

цит.а цит.в пит. с

I? 1,55 . 1,30 1,25

I 1,31 0,95 0,94

г 1,26 1,19 ІД5

3х 1,45 1,26 1,28 •

ХВ качестве контрольних клеток бэтой опыте и сп оль зев ела клетки вз 4,5 часовой культуры (иоиевт добавки антибиотика); в двух других опытах контрольная культура росла 7,5 часоз (до момента прекращения действия антибиотика).

Таким образом мояно думать,.что реакция,ляїитпруюцая ды-хэвие,,представляет собой соударение длЗДукдаруюздх белкогых компонентов;: однако возио.їно и,иное объяснение этого явленая. Есля часть дыхательных цепей в иеибране в. лиСой данный иоиент диссоциирована (обратимо) и совсем не переносит электроны, то /варение" моїетувеличиїь число таких цепей и теи понизить ды-хатеяьнуо активность,, хотя цехаввзи передачи взекірова по ас--социироваквым цепям будет при этой соответствовать иодела це* пи.в виде единого блока. При любой трактовке все.же на основании приведенных дашых мозно говорить о склонности дыхательной цепи ферментов к диссоциации, по крайней мере . а- одной точке.

-е-

І

2. функционирование дыхательной цепа з кзмбравах бактерий, адаптированных к низкий температурам.

верно допущение о той, что скорость дыхания лишта-руется ¿¿^узава белковых переносчиков в иеибраае, то оксидаз-аая акта га ос гз нлзгяи долана быгь чувствительна к огеюни раз-хгзенгостх (вязкости) лапидного натрикса иембраны, поскольку последняя вгаяет на скорости діі&їузии неубранных ксипадевтсв ( І«е ЄЇ ей. , 1973; РараЬ(Цорои1оа в* аі. , 1973; Латові еї аі* , 1974). Нэ нескольких факторов« позволяющих зз^ваать вязкость ыеыбравы, нами бил выбрав лирнокислотциЯ состав 4ос£олдпздсв. Как известно, адаптация иикрооргениэиов к аззкза твьгературеы приводит к накоплению фосфолипидов с бо-23е юротіа^а я невЁсыпенныия углзводородниип цешшн, что приводят к р^зглззнаэ пеибравы ( Е&ГасЪапі еі аі. , 1971; Ниоае «г , 7974). в наших экспериментах подобнуо адаптацию проведала на псах? о$ а льны х бг-ктариях Рвеціотопая Пиогвнсепв . Азамз згрзокнелотного состава общих лип вдов бактерий, выра-ценвых вра температурах 2°, 10° и 24° такзе выявив значительное увехачезиз общего количества ненасыщенных жирных кислот с пезазеваеы температуры (70,4^,, 62,65Ь а 59,5% соответственна). Далее бага ясс-ведованз скорость дыхания клеток при 24° на экзогенной субстрате. Поскольку при развитии бактерий ігри разных температурах нога а било азедать изменение содержания перекал агов, в табл.2 приведены оксидазные активности, отне-егзвае к содерженив цитохроиов. Как видно,С ПСНИіЄНЯЄІІ ТЄМПЄ-ратуры вііраиавания скорость окислендп экзогенного палата клет-кама прг 24°, отнесенная к содержави» цитохоомов В я О возрастает. й то ас время содерзашв цитохрошв а клешах Р.йио-гевеепв (на «г оедка) почти вв зависало от тешшратурц вы— ргщэавгя. Такии образои, мои о полагать, что в мембрано кяа-хох, шрз^епнкх при более низкцх тенлерагурах. вследствие бо-гее рзздакЕзого натрикса, скорости латеральной диффузии кок-поз«атоз эгзктрснхравспортноЯ цепи увеличены при одной И той . хз температуре. Эхо, л своп очередь, приводит к добяндеемому хвзхаченюо скорости окисления субстратов.

Таблица 2

Скорость окисления яблочной кислоты, отнесенная к содерхани» цитохроиов В и С в-суспензии клеток Рзеийотоиая Пиоге&сепз , выращенных ври

различных температурах (отн.един.)

Температу- й опыта I: : 2 3

ра выращивания В' Ро: * • • • : цаг.в:ци». 4 • с:пит.в адт. с цит.вгцат.с *

24 !1/ I I I I- I

10 8,85- 8,* 0,79 0,63 3,13 2,48

2: 5,7 5,6 1,25 1,55 4,08 3,64

^ за единицу приняты оксидаэныа активаооти в. 5 иМ О^/шш* висшь цитохроиа в в'4 вУ Ог/ийн.нмоль цитохрснюс.

Итак, приведенные два различных экспериментальных подхода дают возможность интерпретации результатов на основе допущения зевисииости переноса электрона по дыхательной цепи от: латеральной диффузии переносчиков в иеибраве- Однако, сознавая известную спекулятивность такого вывода.( поскольку вообще' трудно;анализировать работу какой-либо отдельной фериент-иой системы в целоД клетке, особенно при изменении округавдей среды) мы рассиатривази результаты этих двух экспериментов,, как не доказательства;,а как указекия ка-гозшшосгь латеральной подвижности1 белковых компонентов дыхательной цели бактерий.

3; Цездепочечшй перенос электрона в ыеибранах бектерай.

С целью получения более праиых доказательств латеральной диффузии белковых переносчиков электрона а прогона в цембране бактеретследуюхяй этап работы заключался в исследовав аи дыхательной-цепи в изолированных ис цбргн ах К* 1уео<1 е&г Хсив « В атсм эксперименте ма воспользовались одвдаввым вамиравее.

Бзйїгдзагем, что мембрана выделенная из н.іувоЛеіісгісиа > после прогрева теряет значительно часть яаш -дегидро-геназы, созрозахдаемой рядон белков, я то вреия как палат-дегідрогеназа я все остальные компоненты дыхательной цепа остается в мембране. Активность дегідрогеназ как выброшенных, так в оставгяхся в иеибране не ингибируегск фмквков и др., 1974). В тагах мембранах исследовала во.с становление ближай-сего соседа паш -дегвдрогеназы по цепи - цитохрона (зярэраствориаый переносчик - невагинон 1ІХ-9 я цепи этого ни-кроорганязиа находится за цитохроиом £555}* Как видно- из таб-гаад 3, максимальная стопе н» восстановленное« цитохроиоа а анаэробных условиях от наш в прогретых мембранах почти ве отзлчаегся от таковоа в исходных аеыбрангх, разницаполет бать оогясвена за счет незначительной инактивации цитохронов пра прогреве. Действительно, отношения степени восстановленно-ста цятохрехов от яаш к степени воссталовденности от мала-тз в прогретых мембранах близки к единице. Такий обраэш, в мембранах с почти на порядок снихеыним содержанием НАШ -де-гадрогеваэа бдяхайпшй сосед ее ро дыхательной цепи цитохрой

способен восстанавливаться до таков хе степени как и в ин-тактных мембранах. Это может ознгчсіь, что цитохром В^^ її (или) дегідрогеназа наш способны к латеральному перемещении вдоль игиЗреаы.

Таблице 3

Э££ект тепловой обработки мембран на содержание и степень восставзвдеввоста цитохремов от Вия и мала та

Дитохроиы ___

_а_ _ 1 £556, І ®5в0_ .¿Д.

Содезхавде цитохремов в прогретых мембранах в % от контроля______________97____100___100__87_

епкт / контр. А / А .

2АШ / уаш^ 0£о 0,75 0,80 0,67 .

~ ~~ "огзт ~ 0,97 0,98 ~ 0,95*" *оТэ5

А ЮИ / * малат _ '

Г - агепзаь во'гстаЕоаЕЄйнос"г""ї цитсхроиаз~от "ЯАШЇ нія иалата"» оснтеых (прогретых) и кк .гродьнцх мембранах в анаэробных

усховзях.

- 9 -

Как альтернативные в принципе сучествовадя и другий возможные трактовки результатов этого эксперимента. Например,, кохно допустить, что цитохромы находятся в мембране в виде непрерывной сети,.по которой аозгт распространяться электрон* Однако расчет показывает, что, еела егть из цитохро-иовв иохет иметь место,.то на весьма ограниченней участке: мембраны, в то не время как элект р оза о а а о ско пиче с к и а цито-- -химический анализ свидетельствует о диффузной распределении ферментов дыхательной цепи м. Ijeodeikticua по всей мембране (Харатьнн и др.,Д9?4). Другая азьтернатавнав трактовка по--лученных нами результатов связана с наличием аирораствориаого, хорово дш^фундирующего переносчика ШС^. Не исключено, что в мембранах почти лшаеиных, ваш -дегидрагеназы восстановлен вие цитохромов B^jg мохет осуществляться через менахзнон (перенос электрона на атом учаотхяцела обращается благодаря возникновению пула.восстановленного ШСд за счет роботы сствв-шхея интактвых цепей). Для проверки этой возможности била про- ^ ведена инактивация иевахцвона ультрафиолетова излучением в мембранах, предварительно подвергнутых тепловой обработке. Как оказалось, такая процедура не влияла-на скорость И;отегени восста-ноздйиности цитохроаа B55g ot наш ,, что свидетельствовало о непричастности>иеиах^инона к наблюдаемому процессу. Таким образом, чіо-видимоцу;, предположение о летеральвой ди^узиц коїш о— центов дыхательной цепи является.наиболее обоснованней.

С цель» оцен кискор осте йнаблюдае м ойд и$фу з иябыл о проведено исследование кинетикивосстановлеиия цат охр см ов в дефицитных по до гидр ore цзз с исыбршах ох Ніш в auaapoCsitx уровнях*.Выло обнаружено,„ что в токих условиях после введения субстрата все цитохроиы восстанавливаются сицхрадво с временем по-лувосстанозлевия около 80 сек. при 30°. На оышзаииз кинетических данных:была вычислена коистонта скорости реакции взаимодействия наш -дегидрогеназы с остальной частью дыхательно^ цещг:(К » ЗЛОІ® и.моль"1. сек.-1 при 30°), а исследование температурной зависимости этой константы (рис.1) позволило рассчитать энергию активации реакции л диапазоне роста.микроорганизма. (Ка=*2Р,9 ккдл/моль). В яредподоасаиа диффуэмонно-димимруемого

характера э"оЗ реакция (на что указывает небольшое значение Еа) ыозно воспользоваться уравнением Дебая-Сиолуховского для

Рас.I.Температурная зависимость константы скороста (К) восста-нозленияци-тохроков в анаэробных условиях от АН в мембранах, подвергнутых темплсшой обработке. Т-абсолитная температура

такого тапа реакций, даюдиа возможность рассчитать коэффициент г.агерагьной диффузии компонентов дыхательной цепа. Рассчитанное значение этого коэффициента оказалось в пределах ало-11 - 2.10 суг сек."1 при 30°, что хорошо согласуется с ведачивзца коэффициента диффузия, полученными в опытах при азученза лагеральвоЯ подвижности комплекса флюоресцентное ан-гзтелз-аатгггя з кеабраиох эуяориоюв ( , Е<Ц41л ,1970; Ваалк , 1973).

Какое же отношение яиеет обнаруженная латеральная пад-визность кохзснентов дыхательной цепи в первнооу электрона? Как было обнаружено, начальная скорость восстановления двто-хроиов в прогретых лембренах от игавд (обусловленная диффу-' згза компонентов) почти на два псрчдка ниже КАШ -оксидаз-но2 актаэяоота этого же препарата (соответствует скорости переноса злектроаа вдоль цепи). Это в своз очередь, до-зида-коиу, озЕ8<ае1, что транспорт электрона осугествляется по

-II -

clруктурио-объедгневной система дкхателышх переносчик03. В ТО S3 время отдельные компоненты дыхательной цепи способны к латеральному перемещению в мембрсве, за счет чего обеспечи-ваехся иежцепочечный перенос элзктрсаа. Танки образом нам представляется, что альтернатива "окспсома (дыхательный ансамбль) или свободная диффузия?" не существует (по крайней мере в случае нашего объекта)..Скорее всего транспорт злек--трона осуществляется по ансамбли ферментов, который является динамичной структурой с когечвыа временем:хазиИ.В свою очередь, такая динамичность дыхательной цепи моает обеспечивать большую надеаность в работе последней, а такие быть ваашат моментом,в процессе обновления пула дыхательных £ер-иентов»

D; Ыежфазная. дифФдэдя бедкой р мембоеяаг pi; ^gpdeUctlcue

Установление факта латеральной д^фуаиц белкозцх ко*лю-нентов дахательнод цепи U.lyeodeikticua заставило нас обратить внимание на.другой:вид,псдвахности мембранных белков,, могущий иметь значение. для протекания.мембрено-завасимих функций, в частности, дяц работы дыхагельноз цегад и систзш окислительного фосфорилировавня в целоц; ^именно.на вреща-те льну» диффузию; Для исследования этого тяпадодв;{.иости была применена спиновая метка Ш.коэ&лентиосвязываидгяся преимуществе нн оскар б оке ильными группаия белков ( Sherbet and Lalehi , 1973).,На-рио.2 видно, что спектр 9ПР опзн-мечевных мембран слозный и является суперпозицией по кравшей мере двух спектров о разлнчнныи паргыетргии ^ .-: Зведепие парамагнитного колплокса 0,111 в водную суспензии ыембрБн, который, как.известно,.усиряет.спектр ЭПРшткл в доступной для него водном пространстве^эьеняех оуииарный спектр . (рис.2,6) В позволяет: определить. Зс сек. для: метки недоступной влиянию феррицианида. При рассмотрении несколь-вк зоэмохностей обьяснеиия локализации спив-метлнв м амбре не наиболее обоснованным оказывается ситуация, когда феррициенвд-достудввя часть метка экспонирована.в окрухаюдуо среду ("поверхностная" метка),а феррадиандд.- недоступная часть - в гидрофобную часть мембраны ("внутренняя" метка).

Для тэге, чтобы следить за поведекиеи молекул белка (ила учггткоэ ползкугы), рэсполосенних в фазе мембраны и несущих "внутреннев" метку, мы прибегли к избирательному восстановлен!!» "гаьерхаостнсй" метки аскорбатом в условиях сушетвен-ао снаггнзоЗ тепловое диффузии меморашшх кодпоаентов (0°С), После дезйтаианутного воздействия аскороата ва холо-

» а «мыьки его «ы получали вивір № с X -2,7Д0"9сек. (при с^), что близко к 'Х Для спектра на рис.2.Пос-ге быстрого перенесения ампулы с образцом из льда в резонатор радиоспектрометра при 24°С наблюдается постеленное усложнение Ссріш спектра и приближение его к форме спектра для мембран, не обработанных аскорбиновой кислогоД. Вычисленное Тс в зтеи сяучее не является параметром врацекяя иеткн, но позволяет качественно судить о перераспределения радака^іа между двумя Б0зко;аыця локализациями (обозначай его Те ). На раз.За псказана зависимость ЗҐ^* от времена для этого процесса. Контрольная кривая показывает, что эта кинетика не ногат бнг$ объяснена простим прогревом образца от О^С до 24°С.

В отдельной опыте было показано, что восстановление радикала генорбатоа в условиях налах экспериментов - необратимо* Тагам обрезе/, изменение Тс с0 временем в данном эк-всей вероятности, являєтся следствием тепловой дзйузїи иоле нуд белка, приводящей к выходу "внутренней" мет-га из фазы мембраны на поверхность. Интересно отметить, что предваргтельная обработка мембран глотаравгщ альдегидом предотвращает изменение параметра во времени (ряс.3б).

Итак, из винеприведенных экспериментов маяло заключить, что зззедсгьие тепловой диффузии определенные участки белковых молекул (именно места прикрепления парамагнитной метки) выходят из гидрофобной фазы мембрани в скруяавау» среду. Если такая даїфуаия мембранных белков действительно имеет место, то п?я введении агента, способного •'потушить" раді«ал, в окружа-Еаув среду али в фазу мембраны мы некем в к&хдом еду ще цаблс-дать два процесса - биструю гибель доступной для данного агента матки і бозае медленную гибель той часта метки, которся ста-

Рис.2. Спектри ЭПР спин-меченшх ценбрац Я.Іуасхіеік*їсиа до (а) и послз(б) добавка 0,Ш К^рв(сл

Рис.3. Характер изменения во времени параметра сггл -

новой меткн в ііеибреиах ' м.Іуео<іеі!сіісив э зависимости от различной предобработки мембран:

а) меченное мембраны обработаны 2ДСГ^У а скор батом при 0°С в течение 10 мин., отмыты па холоду и в О мин. перенесены в резонатор радиоспектрометра (2^°С);

б) меченные мембраны инаубированы с 5р> гдюгероінц альдегидом при комнатной температуре 1,5 часа, отмыты, а затеи обработаны так, как в случае а);

в) меченные мембраны охлаждали да 0°0 и а О пин. пере*- . несены в резозатор радиоспектрометра (24°С) (контроль).

нозатся доступной вследствие диффузии белка. На рис.4 видно, что действительно после добавки 0,0511 аскорбата к меченным мембранам ягбяодается двухстедийное уменьшение а и пли туда сигнала 32?. Одновременно с этим в первой фазе реакции происходит увеличение параметра , которое выходит на плато во второй фазе со значениен 2,8.1О"9 сек.,

По-вадиио^у, первая фаза реакции соответствует взаимодействии "поверхностной" метки с аскорбатом. В результате этого вся метка ва поверхности оказывается восстановленного чей свидетельствует зиьченяе Зс в конце первой фазы, характерное для "внутреннел" метки. Поскольку аскорбат не способен проникать через гидрофобный барьер мембраны,.только диффузия белков мосет объяснясь наличие 2-й фазы реакции; Дайсхвитель-бо, предварительная фиксация:глотароэым альдегид.о«-мембран (рис.46), почта полностьо предотвращает вторую фазуренкцин, тогда как первая фгза остается без : изменений. При.уменьшении ' концентрации аскорбата в Ю рез скорость реекциц во.второй фазе остается неизменной, в то время как скорость реакции-в первой фаза уменьшается.Следовательно, вторая.Фаза действительно лзмлтаруется дзгфузией белка при избытке восстановителя»

3 опытах со восстановлении метки от субстратов дыхания ил гаде. zzz^zzz две gasu изменения интенсивности- линии спектра ШР во времена,.ясадая из которых:является реакцией.1-го порядка (рис.5а). Однако в этой случае1 Тс^ уменьшается со* врзденек (рас.Зв). Иы. предполагаем, что первая ^--быстрая фаза отражает взга^адгЕствие с ввнутреняеа,гиеткой:каких-то восстановленных компонентов дыхательной цепИу возыохно гидрофобного витаизна К^ (иевехааон IÎX-9). Вовскком:случае,,при.обличении мягким ультрафиолетон, который избирательно инактавирует в кгабреве u. lyaodeikticua 95^ ватвмийа К2 (ЛукояноваиКоро-гевэ, 1973), шг.Ее каблодали существенного уненыаевия амплитуда снгве1£ ЬЗ после введения субстрата (кривая "б" на рис.5), газам образш, в отличие от предыдущего экспериоента, здесь в взрвуо фазу реакции довольно быстро восстанавливается "внутреи--нзя" метка (при этом зиеньвается вплоть до значения

5Д0~10 сев., которое, вероятно, соответствует ИОЮНгаЮеДЬВОЙ

Рйс.4» Кяветика варанетра (в) в амплитуды низкополе-

еой компоненты спектра ЭПР (ота,ед.)-{с» с) кгткк в мембранах И. ІувойеІИісиа пооле добавки 0,05!| асхорбата. В случае б) вечеиные иембраны инкубирована 1,5 часа с гдвтаровъщ альдегидон и отиыты.

Рис.5. Изменение во времени параметра Т^^ (») и амплитуды визкодолввой кошіовенти спектра ЭЯР ¿^ (ота.ед.) - (а,б) метки в цекбрана* И» гувчйеіїсїісчя после добавки 8 ыЦ палата.В случае б) меченнда изибраны перед введение« субстр&та подвергали воздействия удьтраіао-4 летового излучения.

позерхвоствса локализации метка), а-вторая фаза со от ветствует зосстгноз^евив "поверхностзой" метка. По-видимому,.и.в этой саучсе, лазь при вадачиядаффузии меченных молекул белка может прогзоага восстановление метки, экспонированной в водуi гадрофобныа переносчиком•

Сушзруя все три типа экспериментов,,чы приходим к заключена», что белки мембраны *..lysod%iktiwa способна к тепловой да£фузиа такого вида*, что фиксированное место на' поверхности мембранного белка иаеет конечное время жизни как в гидрофобной фазе мембраны, так и во внешней среде. Время релак-са^ая молекулы или ее части из одной фазы в другую Тр,.измеренное в зтагтрзх экспериментах сходно ( 15, '** 12 И:

IS «au^tj, via отрезает равновероятность перехода молекула кэ зке sa внутрь исиСраиио* фбэы миаоборот, Из предста&вев-еых дгвнь-х,. в ссчалзиав,. невозможно определить более конкретный вад Д8ффуэиа;-мц мазем лись предположить, что имеем дело ибо с вращательной диффузией белка, относительно оса пароллельве! поверхности мембраны Си таким образом допуская частичку» погруженность мембранных белков в Фазу, измбрвны), либо "переход," модеме кз гидрофобной фазы ва поверхность мембраны..Йо-вкдамому, возможны и другие варианты (рис.6)•

Однако основной чертой данного вида диффузии является переход участков или всеЕ молекулы через-границу раздела двух фаз: веды з мембраны, поз тому этотвад подвижности- мембранных бежкоа «а.предлагаем цъэывать "мажфазвая диффуэин".-

Hsiioo заученно uoscs иазть обнаруженный тип диффузии для фуккздонироьакня'ucMdpt-tiii? Несомненно, что белок, способ- . еый сереата через Гранину ридсла Соэ вода-мембране». ыохст претендовать на роль тргшеиеыбр&квого переносчика водораство-ргаах веществ (субстратов, ионов в т.д.По-видимому,, наличие

тгкоЯ диффузия мозпо объяснить работу дегидрогеваэ - в эл&втрои-пгреаосках мембранах, которые способны акцептировать электроа от в^зрсажкасдах в мембрану с}бстрахов.к'в то же вреин взоаио-действовать в згарорастворяаымц * езрево&ккамв.

t

Рис.6. Различные виды двазевия белков в uoutíptne, при которых белковая молекула (или ч«ть ее) пераадачзскя находится в фазе мембраны иди на ее поверхности: X. вращательная диффузия относительно оси параллельной плоскости мембраны; 2. поступательная диффузия в направлении перпендикулярной плоскости мембраны; S. колебания при фиксированной подохедкн участка белковой молекулы,

На основе иегф&зной диффузии АТФаз возиошо осуществляется транспорт нуклеотидов в гидрофобные области меиСрани для азоэнергетического синтезе АТФ (Козлов, 1975)* Одцако, если бы любая из перечисленных функций лимитировалась наблюдаемый видом диффузии, то времена релаксации ее дозхны бала быть по крайней мере на три порядка меньше обнаруженных, Саєдієт вие-сте с те« отметить, что і приведенных экспериментах мы регистрируем суммарный диффузионный процесс, и поэтому изыерекное нами значение 1р представляет собой усреднение некоего спектра времен релаксации, кзхдое из которых характеризует диффузию определенного типа белка и мохет существенно отличаться от Тр. Кроне того,.разумно допустить, что специфическое связывание фермеата с соответствующим субстратом монет значительно -сниіать энергетический барьер наблюдаемего наиз типа дяФіу-зия (например, путей изменения конформации) а тем самым повывать вероятность диффузии*'

le -

E. Кзцзкаяаа л-лттзд-белковых взаимодействий в мембранах Д. lysodelkticna пои действии грамицидина ^ ♦

Из псзтулароганнмх выие динашческих свойств белковых компонентов СсктерлальноЯ мембраны, в частности ферментов электроз-трагснортной цепи ы. lyeodeikticua , как след--стзге вытекает зависимость катализируемых'.етиыя белками реакций от состоящая липидов. В этой связи.было проведено изучение едпяехя циклопептодного антибиотика.грамицидина s на работу дахателько!! цепа и.lyeodeikticua * Выбор этого сое-дазекия был обусловлен имеющимися сведениями.о той, что, с. одасй стелена, грамицидин 3 взаимодействует с заряженными фосфоланздама мембраны через аминогруппы орнитика,, с другой стороны -сн язхяется ингибитором целого ряда оксидоред^ктаз . в клетках бгхтерай и разобщителем окислительного фосфор шифрованна (Иванов, 1974; Котелькикова ид?., 1973,.1974; Булгакова, Силаев, 1971) . Как оказалось, в слу-iae изолированных мембран B-lysodetkrticue грамицидин s по-видимоцу взаимодействует с дыхательной цепью на разных ее участках, ингибируя как озсадазные активности в целом (рис.7),,так и*дегидроге-наэны£ (рлз.З) н терональный участок цепи (рис.7,3).. Однако, чувствительность ж антибиотику этих участков оказалась различной. Особенно необычно происходило ингибироваше яаш -■ дегадрогеназвой активности: угнетаемая малыми;концентрациями аатхбазтзка, оаа активировалась^ начиная с некоторого значения концентрации. Цаэзествешшй характер действия антибио-тзка и надзчгз характерных.изломов на кривых цнгибирования тестируемых активностей указывает на опосредование: влияния : егс на мембранные ферменты. Таким^ опосредзшдаи звеном,. вероятно,. является фосфоаипидный компонент, мембраны;. Исходя из; этого аредпзаогения, мохно одадать изменение ицгибирусцего депстзаа граацгдана при изнекгнии белок-липидных взаааодей-стзий. Sas сказалось, присутствие в среде измерения нейоно-гегнего детергента тратсна Х-100 (1/1) полносты» снимает ин-гибируидее дзЕствхе грыавддлна на наш: - и.малат-деги— дрогеваза, по-зяди1оиу,.за счет ослабления взаимодействия ла-пвда с бехкоз. Досавочаыип аргументами в пользу нарулевая

400 600 1200 1600 2000'

■мкг грамицидина мг оелка

400 ЄОО 1200 1600 2000

[лкг гтомитіияяна «г белка

Ряс.7. Действие граиициднна е на потребление виолорода цеи-бранеыи и. 1уво<1еШ1еиц .

1 наш -оксидаэа,

2 - иалат-оксядаза,

3 - аскорбат - ТШД (тетрацзіалпарафвнвлендиааив) -

оксидаза.

Рис.8. Действие граиициднна з на двгидрогеназные активноеїй иеіібран ы. Іуеоаеік^ісаа

1 - кіш -дегидрегенеза,

2 - иалаг-дегидрогеназа,

3 - лактат-дегадрогеваза

граагавдпаси гидрофобных взаимодействий в мембране могут слу--хить результат исследования норупеная проницаемости протопластов u. lysadeUcticua под действием этого антибиотика..

ддя регистрации изменений, происходящих в нейбраяе при связывании грамицидина, в мембраны были включены два парамаг-еетных зонда, которые,локализуясь в липидах, позволяют следить за охрухавием, как вблизи полярных группировок липидсв (зонд I). так и в ооласги углеводородных цепей (зонд И). Как оказалось, грамицидин в концентрациях полностью подавляющ* ыалат-дегддрсгевазную активность, увеличивает время корреляции вра-цгтельноа аа^узии ( ) в 1,5 раза для аонда П (с 1,6.10*^ до 2,4.10~Э сек.) и в 3 раза для зонда I (с 3,2.10"® до 8,8. Ю~ сек.). Такое изменение в параметре мохет быть интерпретировано как следствие ксвденсации(повышения шпсро вязкости) структуры вблизи зонда. На основании вышеизложенных данных ш предполагаем, что за счет ионного взаимодействия амино-

групп орнатана в грамицидине с кислыми фосфолипнданн мембраны антибиотик "сливает" две соседние молекулы липпда. При этом, с одной стороны, происходит локальное обеэдвизивоние ("замора-зизгнае") фосфоляшцов.с другой - нейтрализация зарядов фос-фолдпадов и дасперсионные взаимодействия гидрофобных частей соседних молекул грамицидина могут привести к локальному умень-пенап объема, занимаемого лапидаиа. В итоге'в мембране вязкость скрукеяия ферментов оказывается повыиенной, что повлечет изменение их каталитических свойств; например,, для таких ферментов будет снизена скорость латеральной и вращательной диффузии. В го ха apeits конденсация липэдеых областей моэ&т вызвать перераспределение белков в лнпадном натрикса, так что некоторые Сзлка ва^дутиз тзснойсаязис ли!5здоа, ззняв более пер'.ферк-чггкоа пологенае в мембране. Было предположено,; что одним из sassx ферментов является ДАШ -дегидрогеназа, а восстановление дегадрогенэзной активности при увеличении концентрации: граняцидига отражает постепенное уменьшение связи наш -де-гидрогеназы с лапидои.

Из выгелздоаснных представлений следовали некоторое;предсказания проверяемые экспериментально..Например, если для дей-

- 21 -

ствия антибиотика ваано эжктростатаческое взаимодействие с $ос$олипидаыи, то диадетильное производное грамицидина с бло-кированными^аманогруппамя не долмо.оказывать действие на мембрану. Действительно, диацеталграшгдпдая ке.влиял ни на одну из тестируемых нами реакций в концентрациях,, превышающих иак--скмально ингвбаруюиие для исходного грамицидина. На основании допущения уменьшения связи: каш- -дегидрогеньзы с янпидами следует, что в мембранах, обработанных грамицидином э наш -дегидрогеназа долзна быть более доступна агентам,,действующим из окрузающей среды,, например протевназам. На рис.9 представлены: результаты протеолаза мембран, обработанных грамицидином н.контрольных.Как видно, действительно в "грамицидиновых" мембранах НАШ" -дегядрогенеэа значительно лучаз атаковалась протеиназоЯ.

Рио.Э..Влияние обработки мембран м..1уао<1о1к*±оив грамицидином; з на чувствительностьч НАШ -дег и др огенб зикпр от о о-лизу*

Иембрашь- И. Хуво<1в1к11с1ш инкубировали при- 370 0: бактериальной протекнааой,. взятой в соотношении 1:70 по мембранному белну;-;!:- активность: наш- -дегадрогеназыв контрольных мембранах;; 2 - активность, наш -дегадрогеназыв мембранах, предобработанных грамицидином.(0,7 мг/мг белка,мембран).

«а

- 22 -

Тгхая обрггои, с большой вероятностью предполагаемый механизм дзгзтзая грамицидина б на б&ктериальные мембраны ссотзетстгует действительности, что позволяет отнести это сое-дазенге з отдельнуп группу мембран о-актившх веществ - "флюид-кэдгфгкаторов". Не исключено, что подобный тип модификации мембранных ферментов иозет осуществляться под действием естественных регуляторов, что^таким образом1позволяет выделить особый унакальний способ рефляции активности ферментов на основе изменения лекальной структуры их окружения.

ВЫВОДЫ

X. Показана способность к латеральному перемещению белковых компонентов дыхательной цепи в бактериальных мембранах.

2. На основании изучения степени восстановленноети и ки-Еэтака восстановления цитохромав в нативных и обедненных по ваш -дегидрогеназе мембрсцах >1. 1уво<1«1к*1сив рассчитай ко-эф^яадент латеральной диффузии НАШ -дегидрогенезы и (или) цатохрома В556 Д =8.1О"1"-2ДО-11 сМ^/сек. при 30°. Перенос электронов, обусловленный д^Фузией дыхательных переносчиков происходят в 100 раз медленней, чей перенос вдоль цепи.

3. Сформулированы представления о дыхательных ферментных ансамблях как динамических образованиях с конечным временем ХИЗЕИ.

4. На основании кинетики времени корреляции вращательной да^фузен спиновой метки а кинетики восстановления ее от водо-ц аарзраствораыых доноров делается заключение, что мембранные беля способны к тепловой диффузии такого вида, когда фиксированное место на поверхности белка имеет ограниченное время пребывания лак в фазе мембраны, так и во смешней среде. Время релаксации молекулы или части молекулы из одной фазы в другую составляет Х5 минут* Предлагается называть 'втот вид диффузии мембранных белков "мегфазвая диффузин". Высказывается пред-полехеназ об участии подобной диффузии в процессах биосинтеза мембраны, транспорта игенерироззкив макроэргических со единена Л.

- 23 -

5. На основании поведения парамагнитного гидрофобного зонда г мембране к. lyeodeiktictm к активности ыгибрэшшх ферментов при добавлении циклопептядного антибиотика іраиицидина s развиваются новые представления о механизме действия этого антибиотика: ионное взаимодействие грамицидина с фосфол«гидами мембран приводит х "замораживанив" участков мембраны и фазовому обособлению фосфолапидоз, что является непосредствен-вой причиной наруиения действия мембранных дыхательных ферментов, изменения их положеная в мембранном иатраксе в нарупеняя проницаемости мембраны. Таким образом антибиотик грамицидин£ относится к группе веиеств, изменявших ану тркиембрсннуо вяз— кооть к дкффуаио мембренвих кокяопонтол.

СПЯСШ РАБОТ,ШУБЛИ20ВІНШИ: ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

X. А.С.Капредьянц, В.И.Баншов, Г.Л.Григорян и Д.Н.Осгровсквй.

Подвижность белковых молекул в мембранах бактерий Micrococcus lyeodelkticoa . Биохимия, 39, ЇІСЗ, -1974.

2.A.S.Xspr«ljanK, V.I.BlnyukoT, D.B.Oatготакії, Q.L.Gi-lgorifcfl Mobility of Protein Uoleculea In liicro coccus lys о delicti cue membrane* УЕВЗ Letters, $0, 33* 1974*

3. И.ГЛукова, А.С.Копрельянц и Д.Н.ОстртскиИ. Действие ле-

вомицетинфлорамфеникола) на биосинтез мсмбргншх белков, структуру в некоторые функции мембран бактерий Uicroooccua Ijegdeikticue . Биохимия, £0, 775, I97S.

А. А.С.Еапрсдьянц я Д.Я*Островский. Латеральная диффузия белковых компонентов дыхательного ансамбля ulcrococcue lyeo delict і cue . Биохимия, 40, 1210, 1975. 5* Г.А.Баландина, Е.Л.Моисеева, А.С.Капрельяпц, Д.Н.Островская, И.11 .Цфасман. Адаптация мембранных ферментных систем х хояцду 7 психрофильных бактерий, вызывающих порчу мясных продуктов. 1£а те „знали 14-го международного конгресса по холоду, иосква, 1975.

б* Д.В.ОсгрОБсзаЛ, В.Г.Булгэкова, И.Г.Жукова, А.С.Капредьяиц, Э.Г.Рогезцев к И .12 .Симакова. Изменение липид-белковых взаимодействия в мембране бактерий при действий грамицидина 2 * Биохимия, Ч, 175, 1976»

Материалы диссертации обсуждались на следующих научных конференциях;

I* Басзаергетана. Симпозиум, Вильнюс, 1974. 2. Патучзниз и применение иммобилизованных ферментов. Симпозиум, Таллин, 1974.

Виохимия митохоадрий. Симпозиум, Москва, 1974.

4. Конференция молодых ученых Института биохимии им.Д.Н.Баха ¿Н СССР, Исскга, 1974.

5. ИанробислоггчесггВ съезд. Ереван, 1975.

6. Изучение механизма действия антибиотиков. Симпозиум, Ленинград, 1975. -

7. Фгзиологическая роль поверхностно-активных веществ. Симпозиум, Черновцы, 1975.

в. Биоэнергетика я митохондрия. Ыезкдународный коллоквиум, Варна, 1975.

9. 1!ехдуварцдвн2 конгресс по холоду» Иосква, 1975.

Подп. к и»^. 27/а г. ________

Тяпогр»фмд 1030 Госплана ОСИ?