Диссертации » Физико-химическая биология » Молекулярная биология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Подавление экспрессии лейкозных онкогенов с помощью РНК-интерференции
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Подавление экспрессии лейкозных онкогенов с помощью РНК-интерференции"

СПИРИН Павел Владимирович

Подавление экспрессии лейкозных онкогенов с помощью РНК-интер фер енции

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 2 Л ЕН 2010

Москва-2010

Работа выполнена в Лаборатории биологии клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор B.C. Прасолов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор О.Л. Поляновский

доктор биологических наук Н.О. Калинина

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «. 2010 г. в на

заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

« 3

.2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета^у- у //V? Кандидат химических наук /^у/У^/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Злокачественное перерождение клеток, обусловленное структурно-функциональными нарушениями различных генов, в первую очередь активацией протоонкогенов, лежит в основе развития онкологических заболеваний. Особое место среди злокачественных заболеваний человека и животных занимают лейкозы. В случае острых миелоидных лейкозов человека (OMJI) с высокой частотой выявляются мутации генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток крови. В злокачественных клетках больных OMJI с высокой частотой выявляют транслокацию между 8 и 21-ой хромосомами, приводящую к образованию химерного гена AML1-ET0, кодирующего слитный онкобелок AML1-ET0. Мутации гена c-kit у пациентов с OMJI встречаются значительно реже, однако гиперэкспрессия гена c-kit, кодирующего, рецепторную тирозин киназу KIT наблюдается более чем у 80% пациентов с OMJI. Активация этих онкогенов приводит к усилению пролиферативных свойств клеток и их выживаемости, что может лежать в основе злокачественного перерождения гемопоэтических клеток-предшественников, приводящего к развитию OMJI.

Три способа, применяемые в настоящее время для лечения лейкозов (пересадка костного мозга, химиотерапия, лучевая терапия), создают дополнительную опасность для жизни пациентов и являются малоэффективными в большинстве случаев. В связи с этим исследуются и разрабатываются новые возможные терапевтические подходы. Считается, что методы, основанные на принципе РНК-интерференции, могут быть эффективными для борьбы с онкологическими заболеваниями и лейкозами в частности.

В настоящее время механизм РНК-интерференции широко используется для подавления экспрессии генов на посттранскрипционном уровне с целью исследования функциональных свойств генов. Уже получены существенные результаты, представляющие интерес для фундаментальной биологии и

медицины. Во многих лабораториях мира ведутся биомедицинские исследования, нацеленные на изучение способов модуляции экспрессии генов, активация которых может приводить к развитию онкологических заболеваний. В ряде работ была показана принципиальная возможность использования синтетических siPHK для подавления экспрессии самых разных генов-мишеней, в том числе и активированных онкогенов.

Основными ограничениями для широкого применения ситетических siPHK, состоящих из природных нуклеотидов, остаются прежде всего недостаточная стабильность в условиях in vitro и in vivo, а также низкая эффективность их доставки в клетки мишени.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка подхода для эффективного подавления экспрессии активированных «лейкозных» онкогенов AML1-ETO, RUNX1(K83N) и c-kit(N822K) на посттранскрипционном уровне с помощью РНК-интерференции. В задачи работы входило:

1. Создание модельной линии клеток, геном которых содержит «лейкозный» активированный онкоген AMLl-ETO, RUNX1 или c-kit, с точечными мутациями;

2. Дизайн и оценка эффективности действия синтетических модифицированных олигонуклеотидных siPHK (РНК-дуплексов), предназначенных для подавления активности «лейкозных» онкогенов;

3. Получение лентивирусных векторных частиц (рекомбинантных лентивирусов), несущих в своем геноме последовательность, кодирующую shPHK (предшественник siPHK) и оценка эффективности их действия на модельных линиях клеток;

4. Оценка эффективности действия shPHK, направленных против AMLl-ETO, на линии клеток от пациента с острым миелоидным лейкозом.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящий момент основным препятствием для использования интерферирующих РНК в терапевтических целях является несовершенство методов их доставки в клетки-мишени, их нестабильность, а также возможные неспецифические реакции ответа организма на введение чужеродных двуцепочечных последовательностей РНК. Для решения проблемы стабильности в данной работе были использованы оригинальные синтетические siPHK со специфическими химическими модификациями, которые делают их более устойчивыми по сравнению с немодифицированными siPHK.

Для обеспечения стабильного синтеза интерферирующих РНК в клетках-мишенях нами были использованы рекомбинантные ретро- и лентивирусные векторы, направляющие в трансдуцированных клетках синтез шпилечных РНК (shPHK), являющихся предшественницами малых интерферирующих РНК. В данной работе было впервые показано, что шпилечные конструкции, экспрессия которых направляется рекомбинантными лентивирусными векторами, могут быть успешно применены для подавления экспрессии активированных онкогенов AMLl-ETO(t8:21) и c-kit, выявляемых при острых миелоидных лейкозах. Показано, что используемые нами интерферирующие РНК, направленные против AML1-ETO, специфичны исключительно в отношении этого онкогена и никак не влияют на экспрессию эндогенного AML1. Кроме всего, важным этапом работы стало создание перевиваемых модельных клеточных линий, экспрессирующих активированные онкогены AMLI-ETO, RUNX1(K83N) или c-kit(N822K), которые могут быть использованы как для изучения функций этих онкогенов, так и для исследования эффективности потенциальных терапевтических препаратов, направленных на борьбу с лейкозом. Основой для этого стали оригинальные ретровирусные векторы, несущие экспрессирующую кассету: промотор - целевой ген ("лейкозный" онкоген) - IRES - маркерный ген (eGFP), позволяющие осуществлять эффективный перенос и экспрессию целевого и маркерного гена в клетках-мишенях.

Апробация работы. В ходе выполнения работы ее результаты обсуждались на лабораторных семинарах Лаборатории биологии клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Результаты работы были доложены на международных конференциях: Mechanisms of early differentiation: embryogenesis, myogenesis (cardiac differentiation) and hematopoiesis/lymphopoiesis, Barsinghausen, Germany, September 1-5,2008; XVIII Wilsede Meeting, Modern trends in human leukemia and canccr, Wilsede, Germany, June 19-23, 2010; Пленарные лекция на конференции по молекулярной онкологии "Петровские чтения", Россия, Санкт-Петербург, 16 апреля 2010; Российско-французский семинар "Молекулярная биология клеток млекопитающих", Россия, Москва, 5-7 июля 2010.

По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных профильных журналах, а также тезисы 4 докладов на международных конференциях и съездах.

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста и содержит 46 иллюстраций (фотографии, рисунки, таблицы и диаграммы). Библиография включает 243 наименования.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

OMJ1 - острый миелоидный лейкоз;

AML1-ETO- химерный онкоген, возникший в результате хромосомной перестройки t8;21; AML1 (RUNX1) - ген, расположенный на 21-ой хромосоме человека, кодирующий фактор связывания AML] (CBFa);

ЕГО - ген, расположенный на 8-ой хромосоме человека, кодирующий белок-корепрессор транскрипции ЕТО (MTG8);

c-kit - ген, расположенный на 4 -ой хромосоме человека, кодирующий рецептор KIT,

относящийся к семейству рецепторных тирозин кнназ типа III;

IRES - internal ribosome entry site, внутренний сайт посадки рибосомы;

eGFP - ген, кодирующий усиленный зелёный флуоресцирующий белок;

LTR -long terminal repeat, длинный концевой повтор;

SC1- перевиваемые фибробласты эмбрионов мыщи;

НЕК293 - перевиваемые фибробласты почки эмбриона человека;

Kasumi-1 - перевиваемые миелобласты человека линии Kasumi-1, несущие активированный онкоген AML1-ET0, полученные из периферической крови 7-летнего мальчика, больного OMJI после неудачной трансплантации костного мозга. siPHK - малые интерферирующие РНК;

shPHK - малые шпилечные интерферирующие РНК - предшественники siPHK.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание модельной линии клеток, геном которых содержит «лейкозный» активированный онкоген AML1-ET0, RUNX1 или c-kit, с точечными

мутациями

Начальным этапом этой работы было получение линии перевиваемых клеток, в которых осуществляется экспрессия активированных онкогенов, с высокой частотой обнаруживаемых в злокачественных лейкозных клетках человека при острых миелоидных лейкозах. Для этого были сконструированы ретровирусные векторы, содержащие экспрессирующую кассету промотор -целевой ген - IRES - ген eGFP. Так как между целевым и маркерным генами расположен IRES, то экспрессия целевого и маркерного генов будет

осуществляться с сопоставимой эффективностью, что позволит судить об уровне экспрессии целевого трансгена методом проточной цитофлуориметрии.

В качестве целевых генов были использованы химерный онкоген AML1-ЕТО, возникший в результате хромосомной перестройки t(8;21), онкоген RUNX1 (K83N), активированный в результате точечной мутации, приводящей к замене в кодируемом белке аминокислоты лизина на аспарагин в 83 положении, и онкоген c-k.it (N822K), активированный также в результате точечной мутации, приводящей к замене в кодируемом белке аминокислоты аспарагин на лизин в 822 положении. Последовательности целевых генов (онкогенов) были любезно предоставлены нам доктором Кэрол Стокинг (HPI, Hamburg, Germany). Ретровирусные векторы, несущие экспрессирующие кассеты с онкогенами AML1-ETO, RUNX1(K83N) или c-kit(N822K) были использованы для получения инфекционных ретровирусных частиц. В качестве примера, на рисунке 1 представлена схема ретровирусного вектора, несущего экспрессирующую кассету с онкогеном AML1-ETO.

Рис. 1. Рекомбинантный ретровирусный вектор, содержащий экскпрессирующую кассету с целевым геном (АМЫ-ЕТО) и геном ейРР, разделенные ШЕв-последовательностью.

Для получения вирусных стоков была использована стандартная процедура, клетками-продуцентами рекомбинантного вируса служили фибробласты почки эмбриона человека НЕК 293. Титр рекомбинантных вирусных частиц составлял 5x105 - 5x106 GTU/мл. Далее эти вирусные частицы использовали для трансдукции клеток-мишеней SC-1 (эмбриональных фибробластов мыши).

Для получения гомогенной клеточной популяции трансдуцированные клетки были дважды подвергнуты сортировке с помощью FACS Aria (Becton-Dickinson, США).

Эффективность экспрессии внесенных генов оценивали методами проточной цитофлуориметрии (по флуоресценции eGFP) и ОТ-ПЦР. Анализ интеграции провируса в геном трансдуцированных клеток был проведен с помощью Саузерн-блот гибридизации.

Результаты оценки эффективности трансдукции и последующей экспрессии трансгенов с помощью проточной цитофлуориметрии приведены на рис. 2, они хорошо согласуются с результатами анализа методом ОТ-ПЦР. Разделение продуктов ОТ-ПЦР проводили в 1,5% агарозном геле. Количество трансгенных клеток в популяциях составляло 74%, 73% и 71% для клеток, трансдуцированных векторами с генами RUNX1(K83N), AML1-ETO и с-kit(N822K) соответственно.

А.

.Б.

х

3"

к

I

<и

н

I S

0%

74% 1 # >

О

.В.

шэ

73%

"Щ17

71%

размер событий (клеток)

Рис. 2. Гистограммы, иллюстрирующие эффективность экспрессии маркерного гена eGFP и внесённого онкогена в клеточных линиях, трансдуцированных рекомбинатными ретровнрусными векторами, содержащими гены AML1-ETO, RUNXJ(K83N), c-kit(N822K). (А) Гистограмма, иллюстрирующая отсутствие флуоресценции при анализе не трансдуцированных фибробластов линии SC-1. (Б) Гистограмма, иллюстрирующая процент флуоресцирующих фибробластов линии SC-1, трансдуцированных ретровирусным вектором, направляющем синтез RUNX1(K83N) (флуоресценция наблюдается у 74% всей популяции клеток). (В) Гистограмма, иллюстрирующая процент флуоресцирующих фибробластов линии SC-1, трансдуцированных ретровирусным вектором, направляющем синтез AML1-ETO (флуоресценция наблюдается у 73% всей популяции клеток). (Г) Гистограмма, иллюстрирующая процент флуоресцирующих фибробластов линии SC-1, после трансдукции ретровирусным вектором, направляющем синтез мутантного KIT (флуоресценция наблюдается у 71% всей популяции клеток).

Таким образом, были получены популяции клеток, экспрессирующих «лейкозные» онкогены, которые могут служить модельными клетками-мишенями для интерферирующих РНК.

Дизайн и оценка эффективности действия синтетических модифицированных олигонуклеотидных siPHK (РНК-дуплексов), предназначенных для подавления активности «лейкозных» онкогенов. Особенности экспрессирующей кассеты промотор - целевой ген (онкоген) - IRES - ген eGFP позволяют быстро определять эффективность игибирующего действия как синтетических siPHK, так и лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK - предшественников соответствующих siPHK. Деградация общей для обоих генов (как целевого так и маркерного генов) мРНК в результате действия интерферирующих РНК, комплементарных последовательностям мРНК онкогена, приводит к прекращению образования в клетке как онкобелка, так и зеленого флуоресцирующего белка, что количественно может быть оценено на проточном цитофлуориметре. Последовательности siPHK комплементарных мРНК-мишеням активированных онкогенов были выбраны следующим образом: siPHK-AML-ETO была гомологична месту слияния двух онкогенов AML1 и ЕТО\ siPHK-AML-5' гомологична последовательностям, входящим в состав мРНК как самого гена AML1, так и в состав мРНК химерного онкогена AML-ETO; siPHK-AML-3' гомологична фрагменту мРНК только AML1\ siPHK ЕТО гомологична фрагменту мРНК только ЕТО. Схема, показывающая, к каким участкам мРНК онкогенов направлены олигонуклеотиды siPHK-AMLl-ETO, siPHK-AML-5' и siPHK-AML-3', приведена на рис. 3. siPHK-KIT-1 и siPHK-KIT-2 направлены против разных участков гена c-kit: фрагментов 5-го и 9-го экзонов соответственно (Рис.4). siPHK-SCR представляет собой последовательность siPHK, не имеющую гомологии ни с одной из мРНК мыши и человека и была использована в качестве контроля, подтверждающего отсутствие неспецифического действия siPHK дуплексов. Последовательности siPHK были выбраны с использованием программы BioPredSi.

AML5' AML3'

I........ 1 1 ' ..............I

elPHK AML5' sIPHK AML3'

AML1-ET0 AML5' fusion ЕТОЗ'

I_ j_ _ I

eiPHK AML5' siPHK AML1-ETO »IPHKETO

Рис 3. Схема локализации мишеней siPHK в онкогенах AMLl-ЕТО и RUNX1(K83N).

Схема, показывающая к каким участкам мРНК онкогенов направлены олигонуклеотиды siPHK-KIT-1 и siPHK-KIT-2, приведена на рис. 4.

ГГ | 2 \ 3 | 4) 5 | 6 | 7) 8 | 9~|~1сГ | 11 | 12 I 13 I 14 I 13 I 18 I 17 I 18 I 19 I 20 [ 21 [

кТт-1 КГГ-2

Рис. 4. Схема, иллюстрирующая к каким экзонам сплайсированной мРНК гена с-ки соответствуют 51РНК-К1Т-1 (против фрагмента 5-го экзона) и 51РНК-КГГ-2 (против фрагмента 9-го экзона). Схема дана в проекции на кодируемый белок КГГ, где -иммуноглобулиноподобные домены, ТМ - трансмемранный домен, К1 и К2 - первый и второй тирозинкиназные домены, К1 - промежуточный домен.

Нуклеазо-чувствительные сайты Э1РНК были защищены путем введения Т -О-метил-аналогов рибонуклеотидов, по алгоритму, описанному нами ранее. Эксперимент выполняли следующим образом: синтетические в1РНК трансфицировали в клетки, экспрессирующие онкоген, с помощью ироГеЛатте 2000. Через 72 часа клетки снимали и анализировали на цитофлуориметре. Сбор и учет данных производили с помощью программного обеспечения \VinMDI, версия 2.8. На рисунках 5, 6 и 7 представлены зависимости процента флуоресцирующих клеток от трансфицированной в них 81РНК по отношению к контрольным клеткам не трансфицированным 81РНК. Представленные результаты получены из трёх независимых экспериментов (р<0,05).

К (клетки не Ser AHLS AML3' AML1-ET0 ЕГО

трансф.

SÍH-K)

Рис.5 Гистограмма, иллюстрирующая количестово флуоресцирующих клеток в процентах относительно контроля в популяции трансгенных эмбриональных фибробластов мыши, несущих активированный онкоген АМЫ-ЕТО через 72 часа после трансфекции 8]РНК, комплементарных к разным участкам мРНК онкогена. По оси X слева направо: К -контрольный образец - популяция клеток, не трансфицированных б1РНК, Бег - клетки трансфецированные з1РНК-5СК, АМЬ5' - з1РНК-АМЬ-5', АМЬЗ' - 81РНК-АМ1,-3\ АМЫ-ЕТО - «¡РНК-АМЫ-ЕТО, ЕТО - иРНК-ЕТО.

К {клетки не Ser AMLS Ш AHL1-ETO ЕГО

трансф. siFHK!

Рис.6 Гистограмма, иллюстрирующая количестово флуоресцирующих клеток в процентах относительно контроля в популяции трансгенных эмбриональных фибробластов мыши, несущих активированный онкоген RUNX1(K83N) через 72 ч после трансфекции siPHK, комплементарных к разным участкам мРНК онкогена. По оси X слева направо: К -контрольный образец - популяция клеток, не трансфицированных siPHK, Ser - клетки трансфецированные siPHK-SCR, AML5' - síPHK-AML-5', AML3' - siPHK-AML-3', AML1-ETO - siPHK-AMLl-ETO, ETO - siPHK-ETO.

Рис.7 Гистограмма, иллюстрирующая количестово флуоресцирующих клеток в процентах относительно контроля в популяции трансгенных эмбриональных фибробластов мыши, несущих активированный онкоген c-kit (N822K) через 48 ч после трансфекции siPHK, комплементарных к разным участкам мРНК онкогена. По оси X слева направо: К -контрольный образец - популяция клеток, не трансфицированных siPHK, Ser - клетки трансфецированные siPHK-SCR, KIT-1 - siPHK KIT-1, КГГ-2 - siPHK КГГ-2.

Измерение биологической активности siPHK показало, что уже через 72 часа после трансфекции количество клеток SC1-RUNX1(K83N), экспрессирующих репортерный зеленый флуоресцентный белок, сократилось в

2.5 и 1,5 раза при использовании в концентрации 200 нМ siPHK-AML-5' и siPHK-AML-3', соответственно. При этом siPHK-AML-ETO, siPHK-ETO и контрольная siPHK-SCR, не имеющая гомологии с мРНК человека и мыши, не оказывают влияния на экспрессию онкогена RUNX1(K83N) в модельных клетках. В случае клеток SCl(AMLl-ETO), наблюдается более чем двукратное снижение количества флуоресцирующих клеток под действием siPHK-AML1-ЕТО и siPHK-AML-5', при этом остальные siPHK, не имеющие гомологии с онкогеном AML1-ETO, не влияют на его экспрессию.

Измерение биологической активности siPHK показало, что при использовании siPHK-KIT-1 и siPHK-КГГ-2 в концентрации 200 нМ, уже через 48 часов после трансфекции количество клеток SCl-c-kít(N822K), экспрессирующих репортерный зеленый флуоресцентный белок сократилось в

1.6 и 2 раза, соответственно по сравнению с контролем. Таким образом, данные показывают, что полученная нами siPHK-AML-ETO способна эффективно и

14

избирательно подавлять экспрессию слитного химерного гена АМЫ-ЕТО, при этом не влияя на экспрессию нормального АМЫ, экспрессия которого важна для поддержания нормального кроветворения, а к1РНК-К1Т-2 способна эффективно подавлять гиперэкспрессию гена с-Ш, активированного в результате точечной мутации.

Результаты, полученные методом проточной цитофлуориметрии, полностью согласуются с результатами, полученными методом ОТ-ПЦР.

Исследование концентрационной зависимости действия ингибиторов $1РНК показало, что максимальный ингибирующий эффект наблюдается при использовании 51РНК в концентрации 150-200 нМ, однако уже при концентрации 50 нМ происходит достаточно эффективное ингибирование, уровень которого составляет около 70-80% от максимального эффекта. Следует отметить, что снижение количества флуоресцирующих клеток происходит медленнее, чем подавление экспрессии гена на уровне мРНК за счет того, что зеленый флуоресцентный белок достаточно стабилен и его время жизни составляет около 72 часов.

Показано, что только в части популяции клеток, экспрессирующих онкоген, наблюдается снижение флуоресценции до фонового уровня "самофлуоресценции" после добавления синтетической siPHK, в то время как в другой части популяции уровень флуоресценции практически не меняется. Наиболее вероятной причиной этого является недостаточная эффективность трансфекции клеток, при которой з1РНК попадает не во все клетки популяции в достаточной для проявления биологической активности концентрации.

Получение лентивирусных векторных частиц (рекомбинантных лентивирусов), несущих в своем геноме последовательность, кодирующую яНРНК (предшественник й1РНК) и оценка эффективности их действия па модельных линиях клеток Результаты, свидетельствующие о подавлении экспресиии активированного онкогена АМЫ-ЕТО в модельных клетках с помощью

синтетических siPHK, комплементарных к различным участкам мРНК активированных онкогенов, были использованы при конструировании лентивирусных векторов, несущих в своем составе последовательности, кодирующие shPHK шпилечные структуры - предшественники siPHK. Лентивирусные векторы могут обеспечить интеграцию последовательности, кодирующей shPHK в геном клетки-хозяина, в результате чего будет обеспечено долговременное подавление экспрессии гена-мишени. Выбор лентивирусных векторов обусловлен, также способностью рекомбинантных лентивирусов заражать широкий спектр клеток, в том числе, неделящиеся клетки крови. Это может позволить использовать такие векторы для изучения влияния подавления экспрессии онкогенов на восстановление нормальной дифференцировки клеток крови.

Для этого, на основании последовательностей siPHK, подавляющих экспрессию онкогенов и гена eGFP, были сконструированы рекомбинантные лентивирусные частицы, РНК-геном которых содержал последовательности, кодирующие шпилечые структуры shPHK. Основой для таких генетических конструкций послужил лентивирусный вектор pLSLP, в который клонировали последовательность ДНК, кодирующую shPHK - предшественник siPHK, комплементарный месту слияния генов AML1 и ЕТО или фрагменту ДНК гена RUNX1(K83N), входящего в состав слитного онкогена AM LI-ЕТО.

Клонирование проводили с помощью стандартных методов генной инженерии. На рис. 8 представлена карта рестрикции сконструированного лентивирусного вектора pLSLP-AML-ETO-shRNA, несущего шпилечную структуру, специфичную в отношении места слияния AML1-ETO. Аналогичным образом был сконструирован лентивирусный вектор, специфичный в отношении участка гена RUNX1(K83N) общего с AMLI-ETO, векторы, специфичные в отношении c-kit, а также лентивирусный вектор pLSLP-SCR-shRNA, несущий последовательность, кодирующую shRNA-SCR, не имеющую гомологии с мРНК человека и мыши.

Ш1(2)

Рис. 8. Лентивирусный вектор рЬЗЬР-АМЬ-ЕТО-бЫША, направляющий синтез вЬРНК-предшественника $1РНК, комплементарной мРНК онкогена АМН-ЕГО.

С помощью лентивирусной трансдукции сконструированные конструкции, направляющие синтез хЬРНК - предшественников х1РНК, были введены в геном модельных клеток, содержащих активированный онкоген АМЫ-ЕТО, В.иыХ1(К83И) или с-кЩШ22К). Анализ интеграции в геном модельных клеток был проведен с помощью Саузерн-блот гибридизации.

Наличие во всех векторах наряду с последовательностью, кодирующей

вЬРНК, гена устойчивости к пуромицину, позволило получить популяцию

(массовую культуру) клеток, в которых экспрессия "лейкозного" онкогена

полностью подавлена. Результаты анализа экспрессии активированных

онкогенов в модельных клетках 8С-1(ШЖХ1-К83М), трансдуцированных

лентивирусными векторами, показаны на рис.9А. Представлена диаграмма,

иллюстрирующая, что в популяции клеток 8С-1(ШЖХ1-К831Ч),

17

трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющем синтез шпильки-предшественника siPHK, комплементарной участку слияния онкогенов AML1 и ЕГО (shPHK AML1-ETO), нет изменения количества флуоресцирующих по сравнению с популяцией исходных клеток, служивших контролем и трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK SCR. Это свидетельствует об отсутствии неспецифической активности shPHK-AML1-ETO, кодируемой этим вектором. В популяции SC-1(RUNX1-K83N), трансдуцированной лентивирусным вектором, направляющим экспрессию shPHK AML5', наблюдается шестнадцатикратное падение количества флуоресцирующих клеток относительно контроля, что говорит о сильном, а, возможно, даже полном подавлении экспрессии маркерного гена eGFP и целевых онкогенов. На рис. 9Б представлена диаграмма, на которой видно, что в популяции клеток SCl(AMLl-ETO) после трансдуции лентивирусным вектором, направляющем экспрессию shPHK AML1-ETO или shPHK AML5' остается соответственно около 15% и 23% флуорецирующих клеток по сравнению с исходной популяцией и трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK SCR. Это свидетельствует о значительном подавлении экспрессии онкогена и маркерного гена eGFP в клеточной линии SCl(AMLl-ETO), при котором доля флуоресцирующих клеток снижается в шесть раз.

Принимая во внимание данные, представленные на рис.9А и на рис. 9Б, можно сделать вывод о специфичности лентивирусной конструкции, направляющей синтез shPHK AML1-ETO именно в отношении слитного онкогена.

A. SC-1 (RUNX1-K83N)

Б. SCl(AMLl-ETO)

_ 100 5

I

I 80 ¥

5 60

I 40

* го о

Рис. 9. Гистограммы, иллюстрирующие снижение флуоресценции в трансгенных клетках, несущих экспрессирующие кассеты, содержащие в своем составе активированный онкоген и маркерный ген усиленного зеленого флуоресцирующего белка. A. SC1(RUNX1-K83N) -Линия трансгенных фибробластов мыши SC-1, несущих активированный онкоген RUNX1-K83N. Б. SC-1(AML1 -ЕТО) - Линия фибробластов мыши SC-1, несущих активированный онкоген AML1-ETO. По осям X слева направо: К - исходные клетки не трансдуцированные лентивирусным вектором; shPHK SCR - клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK не имеющей гомологии с мРНК мыши и человека; shPHK AML1-ETO - клетки трансдуцированные лентивирусным вектором направляющем синтез shPHK к месту слияния генов AML1 и ЕТО; shPHK AML5' - клетки трансдуцированные лентивирусным вектором направляющем синтез shPHK к 5' концевому участку AML1 общему для онкогена AML1-ETO и RUNX1(K83N).

Результаты, полученные методом проточной цитофлуориметрии, хорошо согласуются с результатами анализа методом ОТ-ПЦР. Электорофореграмма представлена на рис. 10.

SC1(RUNX1) SC1(AML1-ETO)

289 пн —«MI— ». .» QFP

ЗЭК ShA-E shA5' SC1K 98K shA5' shA-E.

¡ AML1-ETO(íB:21! J RUNX1(K83N)

f(: b-aCtin

....................... —J □

Рис. 10. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР отображающая уровень экспрессии генов eGFP, ß-актин, AML1-ETO и RUNX1(K83N) в клетках SCI RUNXl(K83N)(a3CBa) SCI AMLl-ЕТО(справа), трансдуцированных лентивирусными векторными частицами, направляющими синтез shPHK. 99К-контрольный образец не трансдуцированных клеток SCI RUNX1(K83N); shA-E - клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK AML1-ETO; shA5' - клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK AML5'; sclK - клетки исходной линии SC1; 98К-контрольный образец не трансдуцированных клеток SCI AML J-ЕТО.

"ti:;

392 пн—«и»,--* i-

Из полученных данных, следует, что трансдукция трансгенных клеток линии 8С1-Я1ЖХ1(К831Ч) лентивирусным вектором, направляющем синтез бЬРНК шпильки - предшественника 51РНК, комплементарной месту слияния генов АМЫ и ЕТО не влияет на флуоресценцию клеток. Это говорит о специфичности шпильки в отношении слитного онкогена АМЫ-ЕТО. При этом вектор, направляющий синтез бИРИК АМЬ5" против последовательности, общей для исследуемых онкогенов ¡ШМХ1(К83М) и АМЫ-ЕТО, проявляет значительный эффект.

Результаты анализа экспрессии активированных онкогенов в модельных БСМ с-кн (Ш22К), трансдуцированных лентивирусными векторами, представлены на рис. 11.

Приведены результаты, полученные методом проточной цитофлуориметрии в ходе трех независимых экспериментов (р<0,05). Показано, что трансдукция клеток, в которых осуществляется экспрессия маркерного гена еСЕР и мутантного гена с-кк(Ы822К), лентивирусными векторами, направляющими экспрессию бЬРНК К1Т-1 или бЬРНК К1Т-2, приводит к снижению количества флуоресцирующих клеток в 4 и 11 раз, соответственно.

К (клетки без shFbKJ shPVK SCR

Рис. 11 Гистограмма, отражающая процент светящихся клеток в популяции относительно контроля (SCI c-kit (N822K)). По оси X слева направо: Исходная линия SC-1 c-kit (N822K), экспрессирующая онкоген c-kit\ линия SC-1 c-kit (N822K), трансдуцированная shPHK-SCR; вЬлиния SC-1 c-kit (N822K), трансдуцированная shPHK-KIT-1; линия SC-1 c-kit (N822K), трансдуцированная shPHK-KIT-2.

Результаты, полученные методом проточной цитофлуориметрии, находятся в хорошем соответствии с результатами, полученными методом ОТ-ПЦР. На рисунке 12 представлена электрофореграмма разделения продуктов ОТ-ПЦР суммарной РНК, выделенной из клеток после их трансдукции shPHK-экспрессирующими лентивирусными векторными частицами. Данные, полученные в ходе трех независимых экспериментов (р<0,05), были обработаны с помощью программы Gel-Pro Analyzer 4.0. Показано, что shPHK-KIT-1 вызывает снижение экспрессии c-kit в 3,5 раза, shPHK-KIT-2 - в 10 раз.

М К+ 1 2 3 К-

500 пн — АСТВ

700пн—»- c-kit

Рис. 12. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР в исходных я трансдуцированных клетках SCI. М - маркеры (слева указан размер маркеров в п.н.); К+ - SC-1 c-kit (N822K); 1 - SC-1 с-kit (N822K), трансдуцированные shPHK-SCR; 2 - SC-1 c-kit (N822K), трансдуцированные shPHK-KIT-1; 3 - SC-1 c-kit (NS22K), трансдуцированные shPHK-KIT-2; К- - вода (отрицательный контроль).

В ходе выполнения работы нами было показано, что подавление экспрессии онкогенов в клетках, содержащих интегрированный лентивирусный провирус, направляющий синтез shPHK - предшественника siPHK, комплементарного мРНК онкогена-мишени, носит долговременный характер. За начальную точку отсчета в этой группе экспериментов принят момент заражения модельных клеток, экспрессирующих онкоген лентивирусными частицами, направляющими синтез shPHK. Измерения проводились через 6, 10, 30, 60, и 90 дней после трансдукции. Уровень ингибирования онкогена в этих клетках остается неизменным в течение 3 месяцев и составляет не менее 85% по сравнению с контролем.

Эти данные свидетельствуют также, что лентивирусный провирус стабильно интегрирован в геном клеток-мишеней и сохраняет высокую транскрипционную активность.

Оценка эффективности действия shPHK, направленных против AML1-ET0, на линии клеток от пациента с острым миелоидным лейкозом.

На следующем этапе работы было важно проверить эффективность используемых нами рекомбинантных лентивирусов, направляющих синтез shPHK, в клетках человека. Для этих целей была использована линия перевиваемых миелобластов человека Kasumi-1. Эти клетки были получены из периферической крови больного острым миелоидным лейкозом t8;21. Нами было показано, что трансдукция этих клеток рекомбинантными лентивирусными векторами, направляющими синтез шпилечных конструкций shPHK-AMLl-ETO или shPHK- AML5' приводит к снижению уровеня экспрессии AML1-ETO в 8 и 12 раз соответственно по сравнению с контролем. В качестве контроля были использованы клетки Kasumi-1, трансдуцированные лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK SCR, не имеющую гомологии с мРНК человека и мыши. Уровень экспрессии был проанализирован модифицированным нами методом "гнёздного" ОТ-ПЦР. На рисунке 13 представлена электрофореграмма разделения продуктов ОТ-ПЦР, отражающая количество мРНК онкогена AML1-ETO в клетках линии Kasumi-1 после их трансдукции рекомбинантными лентивирусными векторами, pLSLP-AML-ETO-shRNA, pLSLP-AML 1 -5' -shRNA или pLSLP-SCR-shRNA. Оценку количества продукта проводили с помощью программного обеспечения Gel-Pro Analyzer 4.0. Значения, полученные для каждого образцы, были нормированы по гену "домашнего хозяйства" /3-актину (АСТВ). На гистограмме (рис. 14) представлены средние значения, полученные из трёх незвисимых экспериментов.

АСТВ

АМИ-ЕТО

Рис. 13. Электорофореграмма продуктов ОТ-ПЦР в исходных и трансдуцированных клетках линии Kasumi-1. М - маркеры (слева указана величина маркеров); К+ - исходная клеточная линия Kasumi-1; 1 - клеточная линия Kasumi-1, трансдуцированные вектором, направляющем синтез shPHK SCR; 2 - клеточная линия Kasumi-1, трансдуцированные вектором, направляющем синтез shPHK-AML5'; 3 - клеточная линия Kasumi-1, трансдуцированные вектором, направляющем синтез shPHK-AML-ETO; К" - вода (отрицательный контроль); АСТВ - экспрессия гена fl-актин , AML1-ETO - экспрессия гена AML1-ETO.

11 10% 9 В%

|

18% Т

1 8% пп

1.(К) 2. (fihSCR) 3. {shAMLI -ETO) 4. (shAML5')

Рис.14. Гистограмма, отражающая снижение уровня экспрессии мРНК гена АМЫ-ЕТО при трансдукции клеток векторами, направляющими синтез вЬРНК против данного онкогена. По оси X слева направо: 1 - экспрессия онкогена в клетках линии КазшпМ-АМЫ-ЕТО (не трансдуцированые лентивирусным вектором, уровень экспрессии принят за 100%); 2 -уровень экспрессии онкогена в клетках линии Ка$шш-1, трансдуцированных вектором, несущим вЬРНК-ЗСЯ; 3 - уровень экспрессии онкогена в клетках линии Кавшт-!, трансдуцированных вектором, несущим вЬРНК-АМЫ-ЕТО; 4 - уровень экспрессии онкогена в клетках линии Кавшш-!, трансдуцированных вектором, несущим з№НК-АМЬ5.

Результаты, полученные в ходе экспериментов по подавлению экспрессии активированного АМЫ-ЕТО в клетках линии КавитЫ, являются первыми, которые позволили оценить возможность применения рекомбинантных

лентивирусных частиц, направляющих синтез shHYR предшественников siPHK, для модуляции экспрессии активированного "лейкозного" онкогена в злокачественных клетках, полученных от больного.

Кроме всего, результаты, полученные в ходе работы, заложили основу для дальнейших исследований по модуляции экспрессии активированных онкогенов в экспериментальных моделях лабораторных животных с индуцированным лейкозом. Получены первые результаты, показывающие, что введение с помощью ретровирусного вектора активированного онкогена человека AMLl-ET09a в клетки костного мозга лабораторных мышей приводит к развитию у них острого миелоидного лейкоза. Подавление экспрессии активированного онкогена AMLl-ET09a в клетках костного мозга животных с индуцированным лейкозом с помощью рекомбинантных лентивирусных векторных частиц, направляющих в клетках синтез shPHK - предшественника siPHK комплементарной месту слияния AML1-ETO, не приводит к развитию лейкоза. При этом лентивирусные векторы, направляющие siPHK к мРНК бактериальных генов, которые использовались в качестве контроля, не обладают таким антилейкозным действием.

ВЫВОДЫ

1. Получены стабильные линии трансгенных модельных клеток, геном которых содержит экзогенную экспрессирующую кассету промотор - целевой ген - IRES - маркерный ген eGFP. В качестве целевого гена использовалась одна их последовательностей, кодирующая мутантный AML1-ETO, RUNX1(K83N) или C-KIT(N822K). Поскольку в экспрессирующей кассете целевой и маркерный ген находятся под общим промотором и разделены последовательностью IRES, то по уровню экспрессии маркерного гена осуществляется с сопоставимой эффективностью. Это позволяет судить об эктопической экспрессии целевых генов методом проточной цитофлуориметрии.

2. Показано, что такие клетки являются удобной моделью как при поиске новых потенциальных терапевтических средств, направленных на подавление функциональной активности активированных "лейкозных" онкогенов, так и для исследования молекулярных механизмов действия онкогенов.

3. Использование синтетических интерферирующих РНК (siPHK), содержащих модифицированные основания, позволило достичь значительного подавления экспрессии целевого и маркерного генов в модельных клетках. Наличие специфических модификаций в синтетических siPHK позволяет увеличить их устойчивость к действию нуклеаз in vitro и in vivo. Последнее особенно важно, поскольку повышение стабильности синтетических siPHK необходимо для их эффективной доставки в клетки-мишени, при разработке подходов комбинированной терапии с использованием siPHK.

4. Были получены лентивирусные векторные частицы, несущие в своем геноме последовательность, кодирующую одну из 5ЬРНК(предшественник siPHK): shPHK-AMLl-ЕТО, shPHK-AML5\ shPHK-C-KIT-1, shPHK-C-KIT-2. Была осуществлена оценка эффективности их действия на модельных линиях клеток. Показано, что после трансдукции онкоген-экспрессирующих модельных клеток лентивирусными частицами, происходит значительное, не зависящее от времени снижение экспрессии маркерного гена eGFP и целевого онкогена.

5. Была осуществлена оценка эффективности действия shPHK, направленных против AML1-ETO, на линии клеток, полученной от пациента с острым миелоидным лейкозом. Показано, что при использовании рекомбинантных лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK-AML-ЕТО или shPHK-AMLl-5', уровень экспрессии AML1-ETO в трансдуцированных клетках-мишенях снижается в 8 и в 12 раз соответственно по сравнению с контролем.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Спирин П.В., Вильгельм А.Э., Прасолов B.C. Лентивирусные векторы. Молекулярная биология. 2008, 42, с. 913-926.

2. Спирин П.В., Баскаран Д., Рубцов П.М., Зенкова М.А., Власов В.В, Черноловская Е.Л., Прасолов B.C. Сравнение эффективности подавления функциональной активности целевых генов с помощью синтетических модифицированных siPHK и shPHK, экспрессируемых рекомбинантными лентивирусными векторами. Acta Naturae. 2009, 2, с.98-103.

3. Спирин П.В., Баскаран Д., Орлова Н.Н., Рулина А.В., Никитенко Н.А., Черноловская Е.Л., Зенкова М.А., Власов В.В., Рубцов П.М., Чумаков П.М., Стокинг К., Прасолов B.C.. Подавление экспрессии лейкозных онкогенов AML1-ETO и RUNX1(K83N) с помощью РНК-интерференции. Молекулярная биология. 2010,44, с. 876-888.

4. Баскаран Д., Спирин П. В., Прасолов В. С., Активированные лейкозные онкогены, определяющие злокачественное перерождение кроветворных клеток. Молекулярная биология. 2010,44, с. 418-430.

5. Mitkevich V.A., Petrushanko I.У., Kretova O.V., Spirin P.V., Zelenikhin P.V., Prassolov V.S., Tchurikov N., Ilinskaya O.N., Makarov A.A.. Oncogenic с-kit transcript is a target for binase. Cell Cycle. 2010,9,1-5.

6. Рулина A.B., Спирин П.В., Прасолов B.C.. Активированные лейкозные онкогены AML1-ЕТО и c-kit: роль в развитии острого миелоидного лейкоза и современные подходы их ингибирования. Успехи биологической химии. 2010, 50, с. 349-386.

Тезисы конференций

1. Spirin P.V., Orlova N.N., Chernolovskaya E.L., Prassolov V.S.. Mechanisms of early differentiation: embryogenesis, myogenesis (cardiac differentiation) and hematopoiesis/lymphopoiesis, Barsinghausen, Germany, September 1-5, 2008

2. Spirin P.V., Orlova N.N., Nikitenko N.A., Rulina A.V., Stocking C., Fehse В., Prassolov V.S.. XVIII Wilsede Meeting, Modern trends in human leukemia and cancer, Wilsede, Germany, June 19-23, 2010;

3. Прасолов B.C., Спирин П.В.. Пленарная лекция на конференции по молекулярной онкологии "Петровские чтения", Россия, Санкт-Петербург, 16 апреля 2010;

4. Прасолов B.C., Спирин П.В.. Российско-французский семинар "Молекулярная биология клеток млекопитающих", Россия, Москва, 5-7 июля 2010.

Заказ№ 32-а/11/10 Подписано в печать 03.11.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1.25

ч ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.rii; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Спирин, Павел Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.:.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.1.

1. ОСТРЫЙ МИЕЛОИДНЫЙ ЛЕЙКОЗ (ОМЛ).

1.2 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АНОМАЛИИ ПРИ ОМЛ.

1.3 CBF-ОМЛ.

1.3.1 Ген ЛМЫ (R UNX1).

Белок AML1 как активатор и репрессор транскрипции.

Мутации гена AML1.

1.3.2 Ген ЕТО.

Прямые и непрямые взаимодействия белков ЕТО с HD АС.

Взаимодействие белка ЕТО с репрессорами транскрипции PLZF и Gfi-1.

Ядерная локализация белка ЕТО.

1.3.3 Мутантный белок AML1-ETO.

Белок AML 1-ЕТО как репрессор транскрипции.

Белок AML 1-ЕТО как активатор транскрипции.

Потеря функций линиеспецифических факторов транскрипции опосредованная

AML 1-ЕТО.

Взаимодействия AML 1-ЕТО с репрессорами транскрипции PLZF и Gfi-1.

Функции белка AML 1-ЕТО.

1.4 МУТАЦИИ C-KIT И РАЗВИТИЕ ОМЛ.

1.4.1 Структура гена c-kit.

1.4.2 Строение белка KIT.

1.4.3 Альтернативный сплайсинг c-kit.

1.4.4 Ввзаимодействие KIT-SCF и передача сигнала.

Взаимодействие KIT с SCF.

Сигнальные пути, запускаемые KIT.

1.4.5 Нарушения экспрессии c-kit при онкологических заболеваниях.

Гиперэкспрессия KIT.

Аутокринная петля.

Мутации, нарушающие функции KIT.

1.4.6 Роль c-kit в развитии ОМЛ.

2. РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ.

2.1 ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ (PHKi).

2.2 МЕХАНИЗМ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ.

2.3 ВИДЫ МАЛЫХ РНК, ПРИНИМАЮЩИХ УЧАСТИЕ В,

ПОСТТРАНСКРИПЦИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.

2.3.1 siPHK, образующиеся при вирусной инфекции.

2.3.2 Эндогенные siPHK.

2.4 ТЕХНОЛОГИЯ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ.

2.4.1 Синтез siPHK in vitro.

2.4.2 Экспрессия малых РНК внутри клетки.

2.6. ПРИМЕНЕНИЕ ТЕХНОЛОГИИ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ В МЕДИЦИНЕ.

2.6.1 Борьба с вирусными инфекциями.

2.6.2 Терапия онкологических заболеваний.

2.7 ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТЕХНОЛОГИИ РНК

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ.

3. ЛЕНТИВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ.

3.1 Структура генома и жизненный цикл лентивирусов.

3.2 Основные принципы конструирования лентивирусных векторов.

3.3 Проблема образования релликационно-компетентных вирусных частиц.

3.4 Инсерционный мутагенез.

3.5 Проблема доставки генетической информации в клетки-мишени.

3.6 Лентивирусы в генотерапии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Подавление экспрессии лейкозных онкогенов с помощью РНК-интерференции"

Злокачественное перерождение клеток, обусловленное молекулярными структурно-функциональными нарушениями различных генов, в том числе активацией протоонкогенов, лежит в основе целого ряда онкологических заболеваний. В настоящее время общепринятым является представление о том, что этот процесс является многостадийным, и вовлекает, по крайней мере, два активированных онкогена. Для большинства видов опухолей установлены лишь некоторые из онкогенов, участвующих в канцерогенезе. Это затрудняет разработку и выбор терапевтических подходов, и. в частности, терапевтических целей - генов-мишеней и их белковых продуктов.

Особое место среди злокачественных заболеваний человека и животных занимают лейкозы. В случае острых миелоидных лейкозов человека с высокой частотой выявляются мутации генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток крови. Транслокация между 8 и 21-ой хромосомами приводит к образованию химерного гена AML1-ETO, кодирующего слитный белок AML1-ETO, обладающий онкогенными свойствами. Данная мутация обнаруживается примерно у 20% больных М2 OMJI (по классификации FAB). Мутации гена с -kit, расположенного на 4-ой хромосоме, у пациентов с ОМЛ встречаются значительно реже, не более чем в 5% случаев. Примерно в 20% случаев их выявляют у больных CBF-ОМЛ с транслокацией t(8;21). Гиперэкспрессия продукта гена c-kit, рецепторной тирозин киназы KIT, наблюдается более чем у 80% пациентов с ОМЛ.

Мутации гена c-kit приводят к нарушению сигнальных каскадов, которые запускаются в результате активации KIT. Это обуславливает усиление пролиферативных свойств клеток и их выживаемости. AML1-ETO влияет на функции факторов транскрипции или компонентов ко-активаторных комплексов, нарушая дифференцировку и апоптоз клеток. Предполагается, что сочетание этих процессов может быть причиной злокачественного перерождения гемопоэтических клеток-предшественников, приводящего к развитию ОМЛ.

Несмотря на интенсивный поиск подходов к терапии лейкозов; до сих пор не существует схем, позволяющих добиться излечения большинства больных. Три стратегии, применяемые в настоящее время для лечения лейкозов (пересадка костного мозга, химиотерапия, лучевая терапия), создают дополнительную опасность для жизни пациентов и являются неэффективными в большинстве случаев.

Считается, что методы, основанные на принципе РНК-интерференции могут быть перспективными для борьбы с онкологическими заболеваниями. Подход, основанный на принципе РНК-интерференции, является эффективным методом избирательной инактивации экспрессии генов.

Основным препятствием использования интерферирующих РНК в терапевтических целях является несовершенство методов их доставки в клетки-мишени. Одной из удобных и эффективных систем переноса и экспрессии генов в клетках животных и человека in vitro и in vivo являются системы, основанные на использовании лентивирусных векторов. В качестве целевого гена такие векторы несут малую шпилечную РНК — предшественник малой интерферирующей РНК.

Целью работы являлась разработка подхода для эффективного подавления экспрессии активированных «лейкозных» онкогенов AML1-ETO и c-kit на посттранскрипционном уровне с помощью РНК-интерференции.

В задачи работы входило:

Создание модельной линии клеток, геном которых содержит «лейкозный» онкоген AML1-ETO, RUNX1 (K83N) или c-kit с точечными мутациями;

Дизайн и оценка эффективности действия siPHK (РНК-дуплексов), предназначенных для подавления активности «лейкозных» онкогенов;

Получение лентивирусных векторных частиц, несущих в своем геноме последовательность, кодирующую shPHK (предшественник siPHK), и оценка эффективности их действия на модельной линии клеток;

Оценка эффективности действия shPHK, направленных против AML1-ETO, на линии клеток, полученной от пациента с острым миелоидным лейкозом.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ*

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Спирин, Павел Владимирович

выводы

1. Получены стабильные линии трансгенных модельных клеток, геном которых содержит экзогенную экспрессирующую кассету промотор - целевой ген - IRES - маркёрный ген eGFP. В'качестве целевого гена использовалась одна их последовательностей, кодирующая мутантный AMLl-ETO; RTJNX1(K83N) или с-kit(N822K). Поскольку в экспрессирующей кассете целевой и маркёрный ген находятся под общим промотором и разделены последовательностью IRES, то по уровню экспрессии маркёрного гена осуществляется с сопоставимой эффективностью. Это позволяет судить об эктопической экспрессии целевых генов методом проточной цитофлуориметрии.

2. Показано, что такие клетки являются удобной моделью как при поиске новых потенциальных терапевтических средств, направленных на подавление функциональной активности активированных "лейкозных" онкогенов, так и для исследования молекулярных механизмов действия онкогенов.

3. Использование синтетических интерферирующих РНК (siPHK), содержащих модифицированные основания, позволило достичь значительного подавления экспрессии целевого и маркёрного генов в модельных клетках. Наличие специфических модификаций в синтетических siPHK позволяет увеличить их устойчивость к действию нуклеаз in vitro и in vivo. Последнее особенно важно, поскольку повышение стабильности синтетических siPHK необходимо для их эффективной доставки в клетки-мишени, при разработке подходов комбинированной терапии с использованием siPHK.

4. Были получены лентивирусные векторные частицы, несущие в своем геноме последовательность, кодирующую одну из 51гРНК(предшественник siPHK): shPHK-AML 1 -ETO, shPHK-AML5\ shPHK-KIT-1, shPHK-KIT-2. Была осуществлена оценка эффективности их действия на модельных линиях клеток. Показано, что после трансдукции онкоген-экспрессирующих модельных клеток лентивирусными частицами, происходит значительное, не зависящее от времени снижение экспрессии маркерного гена eGFP и целевого онкогена.

5. Была осуществлена оценка эффективности действия вЬРЬЖ, направленных против АМЫ-ЕТО, на линии клеток, полученной от пациента с острым миелоидным лейкозом. Показано, что при использовании рекомбинантных лентивирусных векторов, направляющих синтез зЬРНК-АМЬ-ЕТО или вИРНЬС-АМЫ-5', уровень экспрессии АМЫ-ЕТО в трансдуцированных клетках-мишенях снижается в 8 и в 12 раз соответственно по сравнению с контролем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами был разработан подход для эффективного- подавления экспрессии активированных «лейкозных» онкогенов AML1-ETO и c-kit на посттранскрипционном уровне с помощью РНК-интерференции. Подход, использованный в работе, основан на удачном опыте применения лентивирусных векторов, несущих последовательности, кодирующие shPHK. Однако он отличается использованием оригинальных лентивирусных векторов и оригинальных модельных клеточных линий. Для определения функциональной активности синтетических siPHK и лентивирусных векторов, направляющих в клетках синтез shPHK, в нашей лаборатории была создана модельная линия клеток, геном котрых которых содержит экспрессионную кассету «промотор -целевой ген — IRES - eGFP». В качестве целевого гена была использована последовательность одного из онкогенов: RUNX1(K83N), AML1-ETO или c-kit. Такая модельная клеточная линия позволяет быстро определять эффективность действия интерферирующих РНК (как синтетических siPHK, так и лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK — предшественников siPHK, комплементарных различным участкам этих онкогенов).

Мы показали, что с использованием синтетических модифицированных siPHK можно получить двукратное подавление экспрессии целевого онкогена. Данные, полученные в опытах с синтетическими siPHK, позволили осуществить дизайн и синтез последовательностей ДНК, кодирующих shPHK. Эти последовательности были клонированы в лентивирусный рекомбинантный вектор pLSLP. С помощью лентивирусных векторных частиц данные последовательности были внесены в онкоген-экспрессирующие модельные клетки. Благодаря этому в них осуществляется постоянный внутриклеточный синтез эЬРНК. Анализ популяций трансдуцированных онкоген-экспрессирующих модельных клеток показал десятикратное снижение экспрессии целевого онкогена. Необходимо добавить, что блокирование экспрессии онкогена, опосредованное БИРИК-экспрессирующими лентивирусными частицами, в модельных клетках не зависит от времени. Это свидетельствует о высокой эффективности сконструированных нами лентивирусных векторов.

Также в нашей лаборатории были сконструированы лентивирусные векторы (на основе рЬЯЬР), кодирующие последовательности, направляющие синтез бЬРНК против онкогена АМЫ-ЕТО. Данные векторы при введении их в модельные клетки также вызывали значительное подавление экспрессии целевого гена. В рамках исследования была показана высокая эффективность этих векторов в отношении подавления экспрессии активированного лейкозного онкогена АМЫ-ЕТО в клетках линии Казшш-1, полученных от больного ОМЛ.

Проведенное исследование заложило основу для использования РНК-интерференции с целью подавления "лейкозных" онкогенов у лабораторных модельных животных с экспериментально вызванным лейкозом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Спирин, Павел Владимирович, Москва

1. Баскаран Д., Спирин П. В., Прасолов В: С., Активированные лейкозные онкогены, определяющие злокачественное перерождение кроветворных клеток. Молекулярная биология. 2010, 44, с. 418-430

2. Bennett J.M., Catovsky D., Daniel M.T., Flandrin G., Galton D.A., Gralnick H.R., Sultan C. 1976. Proposals for the classification of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group. Br. J. Haematol. 33,451—458.

3. Gilliland D.G. 1998. Molecular genetics of human leukemia. Leukemia. 12 Suppl 1, S7--12.

4. Frankfurt O., Licht J.D., Tallman M.S. 2007. Molecular characterization of acute myeloid leukemia and its impact on treatment. Curr. Opin. Oncol. 19, 635—649.

5. Peterson L.F., Zhang D.E. 2004. The 8;21 translocation in leukemogenesis. Oncogene. 23, 4255-4262.

6. Satake N., Maseki N., Kozu Т., Sakashita A., Kobayashi H., Sakurai M., Ohki M., Kaneko Y. 1995. Disappearance of AMLl-MTG8(ETO) fusion transcript in acute myeloid leukaemia patients with t(8;21) in long-term remission. Br. J. Haematol. 91, 892-898.

7. Peterson L.F., Boyapati A., Ahn E.Y., Biggs J.R., Okumura A.J., Lo M.C., Yan M., Zhang D.E. 2007. Acute myeloid leukemia with the 8q22;21q22 translocation:secondary mutational events and alternative t(8;21) transcripts. Blood. 110; 799— 805.

8. Bonnet D., Dick J.E. 1997. Human acute myeloid leukemia is organized as ahierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730— 737.

9. Paschka P. 2008. Core binding factor acute myeloid leukemia. Semin, Oncol. 35, 410-417.

10. Harada H., Harada Y., Niimi H., Kyo T., Kimura A., Inaba T. 2004. High incidence of somatic mutations in the AML1/RUNX1 gene in myelodysplasia syndrome and low blast percentage myeloid leukemia with myelodysplasia. Blood. 103,2316-2324.

11. Yamagata T., Maki K., Mitani K. 2005. RUNX1/AML1 in normal and abnormal hematopoiesis. Int. J. Hematol. 82, 1—8.

12. Downing J.R. 2003. The core-binding factor leukemias: lessons learned from murine models. Curr. Opin. Genet. Dev. 13, 48—54.

13. Niebuhr B., Fischer M., Tager M., Cammenga J., Stocking C. 2008. Gatekeeper function of the RUNX1 transcription factor in acute leukemia. Blood Cells Mol. Dis. 40,211-218.

14. Osato M. 2004. Point mutations in the RUNX1/AML1 gene: another actor in RUNX leukemia. Oncogene. 23, 4284-4296.

15. Huang G., Shigesada K., Ito K., Wee H.J., Yokomizo T., Ito Y. 2001. Dimerization with PEBP2beta protects RUNX1/AML1 from ubiquitin-proteasome-mediated degradation. EMBO J. 20, 723—733.

16. Miller J., Horner A., Stacy T., Lowrey C., Lian J.B., Stein G., Nuckolls G.H., Speck N.A. 2002. The core-binding factor beta subunit is required for bone formation and hematopoietic maturation. Nat. Genet. 32, 645—649.

17. Perry C., Eldor A., Soreq P; 2002. RUNX1/AML1 in leukemia: disrupted association with diverse protein partners. Leuk. Res. 26, 221—228.

18. Kitabayashi I., Yokoyama A., Shimizu K., Ohki M. 1998. Interaction and functional cooperation of the leukemia-associated factors AML1 and p300 in myeloid cell differentiation. EMBO J. 17, 2994-3004.

19. Durst K.L., Hiebert S.W. 2004. Role of RUNX family members in transcriptional repression and gene silencing. Oncogene. 23, 4220—4224.

20. Taniuchi I., Osato M., Egawa T., Sunshine M.J., Bae S.C., Komori T., Ito Y., Littman D.R. 2002. Differential requirements for RUNX proteins in CD4 repression and epigenetic silencing during T lymphocyte development. Cell. Ill, 621-633.

21. Izutsu K., Kurokawa M., Imai Y., Maki K., Mitani K., Hirai H. 2001. The corepressor CtBP interacts with Evi-1 to repress transforming growth factor beta signaling. Blood. 97, 2815-2822.

22. Yoshida T., Kanegane H., Osato M., Yanagida M., Miyawaki T., Ito Y., Shigesada K. 2003. Functional analysis of RUNX2 mutations in cleidocranial dysplasia: novel insights into genotype-phenotype correlations. Blood Cells Mol. Dis. 30, 184-193.

23. Miyoshi H., Kozu T., Shimizu K., Enomoto K., Maseki N., Kaneko Y., Kamada N., Ohki M. 1993. The t(8;21) translocation in acute myeloid leukemia results in production of an AML1-MTG8 fusion transcript. EMBO J. 12, 2715-2721.

24. Fukuyama T., Sueoka E., Sugio Y., Otsuka T., Niho Y., Akagi K., Kozu T. 2001. MTG8 proto-oncoprotein interacts with the regulatory subunit of type II cyclic AMP-dependent protein kinase in lymphocytes. Oncogene. 20, 6225-6232.

25. Sacchi N., Tamanini F., Willemsen R., Denis-Donini S., Campiglio S., Hoogeveen. A.T. 1998. Subcellular localization of the oncoprotein MTG8 (CDR/ETO) in neural cells. Oncogene. 16, 2609—2615.

26. Erickson P.P., Robinson Mi, Owens G., Drabkin H:A?. 1994. TKe ETO portion» of acute myeloid leukemia t(8;21) fusion; transcript encodes a highly evolutionarily conserved, putative transcription factor. Cancer Res. 54, 1782—1786.

27. Feinstein* P.G., Kornfeld K., Hogness O.S., Mann R.S. 1995; Identification of homeotic target genes in Drosophila melanogaster including nervy, a proto-oncogene homologue. Genetics. 140> 573—586.

28. Elagib K.E., Goldfarb A.N. 2007. Oncogenic pathways of AML1-ETO in acute myeloid leukemia: multifaceted manipulation of marrow maturation. Cancer Lett. 251, 179-186.

29. Hug B.A., Lazar M.A. 2004. ETO interacting proteins. Oncogene. 23, 4270-4274.

30. Davis J.N., McGhee L., Meyers S. 2003.The ETO (MTG8) gene family. Gene. 303, 1-10.

31. Gelmetti V., Zhang J., Fanelli M., Minucci S., Pelicci P.G., Lazar M.A. 1998. Aberrant recruitment of the nuclear receptor corepressor-histone deacetylase complex by the acute myeloid leukemia fusion partner ETO. Mol. Cell. Biol. 18, 7185-7191.

32. Hildebrand D., Tiefenbach J., Heinzel T., Grez M., Maurer A.B. 2001. Multiple regions of ETO cooperate in transcriptional repression. J. Biol. Chem. 276, 9889— 9895.

33. Odaka Y., Mally A., ElliottL.T., Meyers S. 2000. Nuclear import and subnuclear localization of the proto-oncoprotein ETO (MTG8). Oncogene. 19, 3584--3597.

34. Wang J., Saunthararajah Y., Redner R.L., Liu J.M. 1999. Inhibitors of histone deacetylase relieve ETO-mediated repression and induce differentiation of AML1-ETO leukemia cells. Cancer Res. 59, 2766-2769.

35. Grisolano J.L., O'Neal J., Cain J., Tomasson M.H. 2003. An activated receptor tyrosine kinase, TEL/PDGFbetaR, cooperates with AML1/ETO to induce acute: myeloid leukemia in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9506—9511.

36. Rosenbauer F., Koschmieder S., Steidl U., Tenen D.G. 2005: Effect of transcription-factor, concentrations on leukemic stem cells. Blood. 106, 1519— 1524.

37. Frosina G. 2000. Overexpression of enzymes that repair endogenous damage to DNA. Eur. J. Biochem. 267, 2135-2149.

38. Miyamoto T., Weissman I.L. Akashi K. 2000. AML1/ETO-qxpressing nonleukemic stem cells in acute myelogenous leukemia with 8;21 chromosomal translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 7521-7526.

39. GFHC) and the Groupe Francais de Cytogenetique Hematologique (GFCH). Blood. 101, 1277-1283.

40. Holyoak, T. L. 2001 Recent advances in the molecular and cellular biology of chronic myeloid leukaemia: lessons to be learned from the laboratory. Br J Haematol. 113, 11-23.

41. Andre C., Martin E., Cornu F., Hu W-X., Wang X-P., Galibert F. 1992 Genomic organization of the human c-kit gene: evolution of the receptor tyrosine kinase subclass III. Oncogene. 7, 685-691.

42. Gokkel E., Grossman Z., Ramot B., Yarden Y., Rachavi G., Givol D. 1992 Strucrural organizarion of the murine c-kit proto-oncogene. Oncogene. 7, 14231429.

43. Vandenbark G.R., de Castro C.M., Taylor H., Dew-Knight S., Kaufman R.E. 1992 Cloning and structural analysis of the human c-kit gene. Oncogene. 7(7), 12591266.

44. Yasuda H., Galli S.J., Geissler E.N. 1993 Cloning and functional analysis of the mouse c-kit promoter. Biochem Biophys Res Commun. 191(3), 893-901.

45. Colucci F., Di Santo J. P. 2000 The receptor tyrosine kinase c-kit provides, a critical signal for survival, expansion, and maturation of mouse natural killer cells. Blood. 95, 984-991.

46. Sperling C., Schwartz S., Büchner T., Thiel E., Ludwig W-D: 1997 Expression of the stem cell factor receptor c-kit (cd 117) in acute leukemias. Haematologica. 82, 617-621.

47. Sattler M., Salgia R. 2004 Targeting c-kit mutations: basic science to novel therapies. Leuk Res. 28 (1), 11-20.

48. Chan P. M., Ilangumaran S., La Rose J., Chakrabartty A., Rottapel R. 2003 Autoinhibition of the kit receptor tyrosine kinase by the cytosolic juxtamembrane region. Mol Cell Biol. 23, 3067-3078.

49. Crosier P. S., Ricciardi S. T., Hall L. R., Vitas M. R., Clark S. C., Crosier, K. E. 1993 Expression of isoforms of the human receptor tyrosine kinase c-kit in leukemic cell lines and acute myeloid leukemia. Blood. 82, 1151-1158.

50. Caruana G., Cambareri A. C., Ashman L. K. 1999 Isoforms of c-KIT differ in activation of signalling pathways and transformation of NIH3T3 fibroblasts. Oncogene. 18, 5573-5581.

51. Albanesi C., Geremia R., Giorgio M., Dolci S., Sette C., Rossi P. 1996 A cell- and developmental stage-specific promoter drives the expression of a truncated c-kit protein during mouse spermatid elongation. Development. 122, 1291-1302.

52. Huang E.J., Nocka K.H., Buck J., Besmer P. 1992 Differential expression and processing of two cell associated forms of the kitligand: KL-1 and KL-2. Mol Biol Cell. 3, 349-362.

53. Yuzawa S., Opatowsky Y., Zhang Z., Mandiyan V., Lax I., Schlessinger J. 2007 Structural-Basis for Activation of the Receptor Tyrosine Kinase KIT by Stem Cell Factor. Cell. 130, 323-334.

54. Liu H., Chen X., Focia P. and He X. 2007 Structural basis for stem cell factor-KIT signaling and activation of class III receptor tyrosine kinases. EMBO J. 26, 891901.

55. Blume-Jensen P., Claesson-Welsh L., Siegbahn A., Zsebo K.M., Westermark B., Heldin C.H. 1991 Activation of the human c-kit product by ligand-induced dimerization mediates circular actin reorganization and chemotaxis. EMBO J. 10, 4121-4128.

56. Lemmon M.A., Pinchasi D., Zhou M., Lax I., Schlessinger J. 1997 Kit receptor dimerization is driven by bivalent binding of stem cell factor. J Biol Chem. 272, 6311-6317.

57. Pati S., Gurudutta G.U., Kalra O.P., Mukhopadhyay A. 2010 The structural insights of stem cell factor receptor (c-Kit) interaction with tyrosine phosphatase-2 (Shp-2): An in silico analysis. BMC Res Notes. 22, 3-14.

58. Roskoski Jr.R. 2005 Structure and regulation of Kit proteintyrosine kinase—the stem cell factor receptor. Biochem Biophys Res Commun. 338, 1307-1315.

59. Roskoski Jr.R. 2005 Signaling by Kit protein-tyrosine kinase—the stem cell factor receptor. Biochem Biophys Res Commun. 337, 1-13.

60. Jensen B.M., Akin C., Gilfillan A.M. 2008 Pharmacological targeting of the KIT growth factor receptor: a therapeutic consideration for mast cell disorders Br J Pharmacol. 154, 1572-1582.

61. Thommes K., Lennartsson J., Carlberg M., Ronnstrand L. 1999 Identification of Tyr-703 and Tyr-936 as the primary association sites for Grb2 and Grb7 in the c-kit/stem cell factor receptor. Biochem. J. 341,211-216.

62. Linnekin D. 1999 Early signaling pathways activated by ckit in hematopoietic cells. Int J Biochem. Cell. Biol. 31, 1053-1074.

63. Sun J., Pedersen M., .Ronnstrand L. 2008 Gab2 Is Involved in Differential Phosphoinositide 3-Kinase Signaling by Two Splice Forms of c-Kit. J Biol Chem. 283* (41), 27444-27451.

64. Montagut C., Settleman J. 2009 Targeting the RAF-MEK-ERK pathway in cancer therapy. Cancer Lett. 283(2), 125-134.

65. Chou C.C., Chou M.J., Tzen C.Y. 2010 Prediction of KIT mutation in gastrointestinal stromal tumors by the immunoprofile of the tumor cells. J Formos Med Assoc. 109(1), 25-31.

66. Garrido M., Bastian B.C. 2010 Kit as a therapeutic target in melanoma. J Invest Dermatol. 130(1), 20-27.

67. Mosesson Y., Yarden Y. 2004 Oncogenic growth factor receptors: implications for signal transduction therapy. Semin Cancer Biol. 14, 262-270.

68. Huo L., Sugimura J., Tretiakova M. S., Patton K. T., Gupta R., Popov B., Laskin W. B., Yeldandi A., Teh B. T., Yang X. J. 2005 C-kit expression in renal oncocytomas and chromophobe renal cell carcinomas. Hum Pathol. 36, 262-268.

69. Stec R., Grala B., M^czewski M., Bodnar L., Szczylik C. 2009 Chromophobe renal cell cancer review of the literature and potential methods of treating metastatic disease. J Exp & Clin Cancer Res. 28 (134), 1-6.

70. Lennartson J., Jelacic T., Linnekin D., Shivaakrapa R. 2005 Normal and oncogenic forms of the receptor tyrosine kinase KIT. Stem cells.23, 16-43.

71. Lennartsson J., Voytyuk O., Heiss E., Sundberg C., Sun J., Ronnstrand L. 2005 C-Kit signal transduction and involvement in cancer. Review. Cancer Ther.3, 5-28.

72. Furitsu T., Tsujimura T., Tono T., Ikeda H., Kitayama H., Koshimizu U., Sugahara H., Butterfield J. H., Ashman L. K., Kanayama Y. Matsuzawa Y.,

73. Kitamura Y., Kanakura Y 1993 Identification of mutations in the coding sequence of the proto- oncogene c-kit in a human mast cell leukemia cell line causing ligand-independent activation.of с-kit product. J Clin Invest. 92, 1736-1744.

74. Patnaik M.M., Tefferi- A., Pardanani A. 2007 Kit: molecule of interest for the diagnosis and treatment of mastocytosis and other neoplastic disorders. Curr Cancer Drug Targets. 7, 492-503.

75. Torrent M., Rickert K., Pan B: S., Sepp-Lorenzino L. 2004 Analysis of the activating mutations within the activation loop of leukemia targets Flt-3 and c-Kit based on protein homology modeling. J Mol Graph Model. 23, 153-165.

76. Boissan M., Feger F., Guillosson J-J., Arock M. 2000 C-kit and c-kit mutations in mastocytosis and other hematological diseases. J Leukoc Biol. 67(2), 135-48.

77. Kahler C., Didlaukat S., Feller A.C., Merz H. 2007 Sensitive and reliable detection of KIT point mutation Asp 816 to Val in pathological material. Diag Pathol. 2, 37-41.

78. Longley B.J., Reguera M.J., Ma Y. 2001 Classes of c-kit activating mutations: proposed mechanisms of action and implications for disease classification and therapy. Leuk Res. 25, 571-576.

79. Zaker F., Mohammadzadeh M., Mohammadi M. 2010 Detection of KIT and FLT3 mutations in acute myeloid leukemia with different subtypes. Arch Iran Med. 13(1), 21-25.

80. Schnittger S., Kohl T.M., Haferlach Т., Kern W., Hiddemann W., Spiekermann K., Schoch C. 2006. KIT-D816 mutations in AML1-ETO-positive AML are associated with impaired event-free and overall survival. Blood. 107(5), 17911799.

81. Agrawal N., Dasaradhi P.V., Mohmmed A., Malhotra P., Bhatnagar R.K., Mukherjee S.K. 2003. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 657-685.

82. Вильгельм А.Э., Чумаков С.П., Прасолов B.C. 2006 Интерференция РНК: биология и перспективы применения в биомедицине и биотехнологии. Мол биол. 40(3), 387-403.

83. Van Blokland R., vander Geest N, Mol J.N.M., Kooter J.M. 1994. Transgene-mediated suppression of chalcone synthase expression in Petunia hybrida results from an increase in RNA turnover. Plant J. 6, 861-877.

84. Ingelbrecht I., Van Houdt H., Van Montagu M., Depicker A. 1994. Posttranscriptional silencing of reporter transgenes in tobacco correlates with DNA methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10502-10506.

85. Metzlaff M., O Dell M., Cluster P.D., Flavell R.B. 1997. RNA-mediated RNA degradation and chalcone synthase A silencing in Petunia. Cell. 88, 845-854.

86. Covey S. N., Al-Kaff N. S., Langara A., Turner D. S. 1997 Plants combat infection by gene silencing. Nature. 385, 781-782.

87. Ratcliff F., Harrison B.D., Baulcombe D.C. 1997 A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science. 276, 1558-1560.

88. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-11.

89. Ngo H.,Tschudi C., Gull K., Ullu E. 1998 Double-stranded RNA induces mRNA degradation in Trypanosoma brucei. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 14687-14692.

90. Kennerdell J. R., Carthew R.W. 1998 Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026.

91. Cogoni G., Macino G. 1997. Conservation of transgene-induced posttranscriptional gene silencing in plants and fungi. Trends Plant Sci. 2, 438-443.

92. Gil J., Esteban M. 2000 Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): Mechanism of action. Apoptosis. 5, 107-114.

93. Elbashir S. M:, Harborth J., LendeckelW., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. 2001 Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA* interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498.

94. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. 2001 RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 15, 188-200.

95. Martinez J.,Tuschl-T. 2004 RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev. 18, 975-980.

96. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Harmon GJ. 2000 An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404, 293-296.

97. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. 2001 Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409, 363366.

98. Shuey D.J., McCallus D.E., Giordano T. 2002. RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention. DrugDiscov. Today. 7, 1040-1046.

99. Scherr M., Morgan M.A., Eder M. 2003. Gene silencing mediated by small interfering RNAs in mammalian cells. Curr. Med. Chem. 10, 245-256.

100. MacRae I. J., Ma E., Zhou M., Robinson C.V., Doudna J. A. 2008 In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. Proc Natl Acad Sei USA 105, 512-517.

101. Miyoshi K., Okada T.N., Siomi H., Siomi M.C. 2009 Characterization of the miRNA-RISC loading complex and miRNA-RISC formed in the Drosophila miRNA pathway. RNA. 15, 1282-1291.

102. Wang Y., Juranek S., Li H., Sheng G., Tuschl T., Patel D.J. 2008 Structure of an argonaute silencing complex with a seed-containing guide DNA and target RNA duplex. Nature. 456,921-926.

103. Zeng Y., Cullen B.R. 2002. RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm. RNA. 8, 855-860.

104. Xie Z., Johansen L.K., Gustafson A.M., Kasschau K.D., Lellis A.D., et al. 2004. Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol. 2, E104.

105. Fagard M., Vaucheret H. 2000. Systemic silencing signals. Plant Mol. Biol. 43, 285-293.

106. Baulcombe D.C., Molnar A. 2004. Crystal structure of pl9~a universal suppressor of RNA silencing. Trends Biochem. Sci. 29, 279-281.

107. Pfeffer S., Zavolan M., Grasser F.A., Chien M., Russo J.J., et al. 2004. Identification of virus-encoded microRNAs. Science. 304, 734-736.

108. Aravin A.A., NaumovaN.M., Tulin A.V., Vagin V.V., Rozovsky Y.M., Gvozdev V.A. 2001. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11, 10171027.

109. Vazquez F., Vaucheret H., Rajagopalan R., Lepers C., Gasciolli V., et al. 2004. Endogenous trans-acting siRNAs regulate the accumulation of Arabidopsis mRNAs. Mol. Cell. 16, 69-79.

110. Ambros V., Lee R.C., Lavanway A., Williams P.T., Jewell D. 2003. MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C. elegans. Curr. Biol. 13, 807-818.

111. Kuwabara T., Hsieh J., Nakashima K., Taira K., Gage F.H. 2004. A small modulatory dsRNA specifies the fate of adult neural stem cells. Cell. 116, 779-793.

112. Mochizuki K., Gorovsky M.A. 2004. Small RNAs in genome rearrangement in Tetrahymena. Curr. Opin. Genet.Dev. 14, 181-187.

113. Vazquez F., Vaucheret H., Rajagopalan R., Lepers C., Gasciolli V., Mallory A.C., Hilbert J.L., Bartel D.P., Crete P. 2004 Endogenous trans-acting siRNAs regulate the accumulation of Arabidopsis mRNAs. Mol. Cell. 16, 69-79.

114. Kim V. N. 2005 Small RNAs: Classification, Biogenesis, and Function. Mol Cells. 19(1), 1-15.

115. Lee R.G., Feinbaum R.L., Ambros V. 1993 The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843854.

116. Choudhuri S. 2010 Small, Noncoding RNAs: Biogenesis, Function, and* Emerging Significance in.Toxicology. JBiochem Mol Toxicol. Epub.

117. Kuwabara. T., Hsieh J., Nakashima K., Taira K., Gage F.H. 2004 A. small modulatory dsRNA specifies the fate of adult neural stem cells. Cell. 116, 779-793.

118. Reinhart B.J., Bartel D.P. 2002 Small RNAs correspond to centromere heterochromatic repeats. Science. 297, 1831.

119. Matzke M.A., Birchler J.A. 2005. RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nat. Rev. Genet. 6, 24-35.

120. Schramke V., Allshire R. 2003 Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing. Science. 301, 1069-1074.

121. Aravin A.A., Sachidanandam R., Girard A., Fejes-Toth K., Hannon G.J 2007 Developmentally regulated piRNA clusters implicate MILI in transposon control. Science. 316, 744-747.

122. Birney E. et al. 2007 Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project. Nature. 447, 799-816.

123. Lee Y., Ahn C., Han J., Choi H., Kim J., et al. 2003. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature. 425, 415-419.

124. Denli A.M., Tops B.B., Plasterk R.H., Ketting R.F., Hannon G.J. 2004. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235.

125. Hutvagner G., McLachlan J., Pasquinelli A.E., Balint E., Tuschl T., et al. 2001. A cellular function for the RNAinterference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science. 293, 834-838.

126. Khvorova A., Reynolds A., Jayasena S.D: 2003. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell. 115, 209-216.

127. Grosshans H., Slack F.J. 2002. Micro-RNAs: small is plentiful. J. Cell Biol. 156, 17-21.

128. Yekta S., Shih I.H., Bartel D.P. 2004 MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA. Science. 304, 594-596.

129. Ameres S.L., Martinez J., Schroeder R. 2007 Molecular basis for. target RNA, recognition and cleavage by human RISC. Cell. 130,101-112.

130. Selbach M., Schwanhausser B., Thierfelder N., Fang Z., Khanin R., Rajewsky N. 2008 Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature: 455, 58-63.

131. Saito K., Sakaguchi Y., Suzuki T., Suzuki T., Siomi H., Siomi M.C. 2007 Pimet, the Drosophila homolog of HEN1, mediates 2'-0-methylation of Piwi-interacting RNAs at their 3'-ends. Genes Dev.21, 1603-1608.

132. Provost P., Dishart D., Doucet J., Frendewey D., Samuelsson B., Radmark O. 2002. Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer. EMBO J. 21, 5864-5874.

133. Manche L., Green S.R., Schmedt C., Mathews M.B. 1992. Interactions between double-stranded RNA regulators and the protein kinase DAI. Mol. Cell. Biol. 12, 5238-5248.

134. Elbashir S.M., Harborth J., Weber K., Tuschl T. 2002. Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs. Methods. 26, 199-213.

135. Kim D.H., Longo M., Han Y., Lundberg P., Cantin E., Rossi J.J. 2004. Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase. Nat. Biotechnol. 22, 321-325.

136. Bridge A.J., Pebernard S., Ducraux A., Nicoulaz A.L., Iggo R. 2003. Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat. Genet. 34, 263-264.

137. Chiu Y.L., Rana T.M. 2002. RNAi in human cells: basic structural and functional features of small interfering RNA. Mol. Cell. 10, 549-561.

138. Kim N.V. 2003. RNA interference in functional genomics and medicine. J. Korean Med. Sci. 18,309-318.

139. Bantounas I., Phylactoul L.A., Uney JIB. 2004. RNA interference and the use of small interfering RNA to study gene function in mammalian, systems J. Mol. Endocrinol: 33, 545-557.

140. Brummelkamp T.R:, Bernards R:, Agami R. 2002. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553.

141. Boden D., Pusch O., Silbermann R., Lee F., Tucker L., Ramratnam B.,2004. Enhanced gene silencing of HIV-1 specific siRNA using microRNA designed hairpins. Nucleic*Acids Research. 32, 1154-1158.

142. Lee N.S., Dohjima T., Bauer G., Li H., Li M.J., Ehsani A., Salvaterra P., Rossi J.2002. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505.

143. Miyagishi M., Matsumoto S., Taira K. 2004. Generation of an shRNAi expression library against the whole human transcripts. Virus Res. 102, 117—124.

144. Tiscornia G., Singer O., Ikawa M., Verma I.M. 2003. A general method for gene knockdown in mice by using lentiviral vectors» expressing small interfering RNA. PNAS. 100,1844-1848.

145. Butz K., Ristriani A., Hengstermann A., Denk C., Scheffner M., Hoppe-Seyler F.2003. siRNA targeting of the viral E6 oncogene efficiently kills human papillomavirus positive cancer cells. Oncogene. 22, 5938-5945.

146. Martinez M.A., Clotet B. and Este J.A. 2002. RNA interference of HIV replication. Trends Immunol. 23, 559-562.

147. Tompkins S.M., Lo C.Y., Tumpey T.M., Epstein S.L. 2004. Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101,8682-8686.

148. Giladi H., Ketzinel-Gilad M., Rivikin L., Felig Y., Nussbaum O., Galun E. 2003. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol. Ther. 8, 769-776.

149. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. 2002. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell. 2, 243-247.

150. Wilda M., Fuchs U., Wossmann W., Borkhardt A. 2002. Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference (RNAi). Oncogene. 21, 5716-5724.

151. Wu H., Hait W.N., Yang J.M. 2003. Small interfering RNA-induced suppression of MDR1 P-glycoprotein restores sensitivity to multidrug-resistant cancer cells. Cancer Res. 63, 1515-1519.

152. Zhang L., Yang N., Mohamed-Hadley A., Rubin S.C., Coukos G. 2003. Vector-based RNAi, a novel tool for isoform-specific knock-down of VEGF and anti-angiogenesis gene therapy of cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303, 1169-1178.

153. Song E., Lee S.K., Wang J., Ince N., Ouyang N., Min J., Chen J., Shankar P., Lieberman J. 2003. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat. Med. 9, 347-351.

154. Ghildiyal M., Zamore P.D. 2009 Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10(2), 94-108.

155. Seroogy C.M., Fathman C.G. 2000. The application of gene therapy in autoimmune diseases. Gene Ther. 7, 9—13.

156. Chang, M. I., Panorchan P., Dobrowsky T. M., Tseng, Y., Wirt D. 2005. Single-molecule analysis of human immunodeficiency virus type 1 gpl20-receptor interactions in living cells. J. Virol. 79, 14748--14755.

157. Pages J.C., Bru T.J. 2004. Toolbox for retrovectorologists. Gene Med. 6, 67-82.

158. Depienne C., Mousnier A., Leh H., Le Rouzic E., Dormont D., Benichou S., Dargemont C. 2001. Characterization of the nuclear import pathway for HIV-1 integrase. J. Biol. Chem. 276, 18102-18107.

159. Piller S.C., Caly L., Jans D.A. 2003. Nuclear import of the pre-integration complex (PIC): the Achilles heel of HIV? Curr. Drug Targets. 4, 409-429.

160. Li L., Olvera J.M., Yoder K.E., Mitchell R.S., Butler S.L., Lieber M., Martin S.L., Bushman F.D. 2001. Role of the non-homologous DNA end joining pathway in the early steps of retroviral infection. EMBO J. 20, 3272-3281.

161. Schroder A.R., Shinn P., Chen H., Berry C., Ecker J.R., Bushman F. 2002. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529.

162. Das S.R., Jameel S. 2005. Biology of the HIV Nef protein. Indian J.Med.Res. 121,315-332.

163. Lever A.M., Strappe P.M., Zhao J. 2004. Lentiviral vectors. J. Biomed. Sci. 11, 439-449.189. ufferey R., Nagy D. 1997. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat. Biotechnol. 15, 871—875.

164. Mangeot P.E., Negre D. 2000. Development of minimal lentivirus vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) and their use for gene transfer into human dendritic cells. J. Virol. 74, 8307—8315.

165. Poeschla E.M-, Wong-Staal F. 1998. Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors. Nat. Med. 4, 354-357.

166. Berkowitz R., lives H., 2001. Construction and molecular analysis of gene transfer systems derived from bovine immunodeficiency virus. J. Virol. 75, 3371— 3382.

167. Mselli-Lakhal L., Favier C. 1998. Defective RNA packaging is responsible for low transduction efficiency of CAEV-based vectors. Arch. Virol. 143, 681—695.

168. Olsen J.C. 1998. Gene transfer vectors derived from equine infectious anemia virus. Gene Ther. 5, 1481-1487.

169. Metharom P., Takyar S. 2000. Novel bovine lentiviral vectors based on Jembrana disease virus. J. Gene Med. 2, 176—185.

170. Stewart S.A., Dykxhoorn D.M. 2003. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501.

171. Dull T., Zufferey R. 1998. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471.

172. Rossi G.R., Mautino M.R. 2003. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum. Gene Ther. 14,385-391.

173. Kim V.N., Mitrophanous K. 1998. Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 72, 811—816.

174. Gasmi M., Glynn J: 1999. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828—1834.

175. Mautino M.R., Keiser N. 2000. Improved titers of HIV-based lentiviral vectors using the SRV-1 constitutive transport element. Gene Ther. 7, 1421—1424.

176. Kotsopoulou E., Kim V.N. 2000. A Rev-independent human immunodeficiency virus type 1 (HlV-l)-based vector that exploits a codon-optimized HTV-1 gag-pol gene. J. Virol. 74, 4839-4852.

177. Wagner R., Graf M. 2000. Rev-independent expression of synthetic gag-pol genes of human immunodeficiency virus type 1 and simian immunodeficiency virus: implications for the safety of lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 11, 2403— 2413.

178. Wu X., Wakefield J.K. 2000. Development of a novel trans-lentiviral vector that affords predictable safety. Mol. Ther. 2, 47—55.

179. Cherepanov P., Pluymers W. 2000. High-level expression of active HIV-1 integrase from a synthetic gene in human cells. FASEB J. 14, 1389—1399.

180. Corbeau P., Kraus G. 1998. Transduction of human macrophages using a stable HIV-l/HIV-2-derived gene delivery system. Gene Ther. 5, 99-104.

181. Stitz J., Muhlebach M.D. 2001. A novel lentivirus vector derived from apathogenic simian immunodeficiency virus. Virology. 291, 191—197.

182. Hacein-Bey-Abina S., von Kalle C. 2003. LM02-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415— 419.

183. Bushman F., Lewinski M. 2005. Genome-wide analysis of retroviral DNA integration. Nat. Rev. Microbiol. 3, 848-858.

184. Hacein-Bey-Abina S., von Kalle C. 2003. A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N. Engl. J. Med. 348, 255-256.

185. Trono D. 2003. Virology. Picking the right spot. Science. 300, 1670-1671.

186. Wu X., Li Y. 2003. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751.

187. Cavazzana-Calvo M., Hacein-Bey S. 2000. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-Xl disease. Science. 288, 669—672.

188. Schroder A.R., Shinn P. 2002. HtV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Gell. 110; 521—529.

189. Han Y., Lassen K. 2004. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HlV-l)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. J. Virol. 78, 6122—6133.

190. Zufferey R., Dull T. 1998. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873—9880.

191. Iwakuma T., Cui Y. 1999. Self-inactivating lentiviral vectors with U3 and U5 modifications. Virology. 261, 120—132.

192. Page K.A., Landau N.R. 1990. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64, 5270— 5276.

193. Landau N.R., Page K.A. 1991. Pseudotyping with human T-cell leukemia virus type I broadens the human immunodeficiency virus host range. J. Virol. 65, 162— 169.

194. Akkina R.K., Walton R.M. 1996. High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G. J. Virol. 70, 2581—2585.

195. Naldini L., Blomer U. 1996. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263—267.

196. Altstein A.D., Zhdanov V.M., Omelchenko T.N., Dzagurov S.G., Miller G.G., Zavada J. 1976. Phenotypic mixing of vesicular stomatitis virus and D-type oncornavirus. Int. J. Cancer. 15, 780—784.

197. Schnitzer T.J., Weiss R.A., Zavada J. 1977. Pseudotypes of vesicular stomatitis virus with the envelope properties of mammalian and primate retroviruses. J. Virol. 23. 449-454.

198. Burns J.C., Friedmann T. 1993. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient genetransfer into mammalian and nonmammaliarvcells. Proc. Natl. Acad; Sci: USA; 90^ 8033-8037.

199. Schlegel R>, Tralka T.S. 1983- Inhibition of VSV binding and infectivity by phosphatidylserine: is phosphatidylserine a VSV-binding site? Cell. 32, 639—646.

200. CoihDIA;, Miller;A.D. 2004. Phosphatidylserine: is: not; the cellf surface receptor for vesicular stomatitis virus, j. Virol. 78, 10920-10926.

201. Ory D.S., Neugeboren B.A. 1996. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 11400-11406.

202. Cronin J., Zhang X.Y. 2005. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr. Gene Ther. 5, 387—398.

203. Stein C.S., Martins I. 2005. The lymphocytic choriomeningitis virus envelope glycoprotein targets lentiviral gene transfer vector to neural progenitors in: the murine brain. Mol. Ther. 11, 382-389.

204. Kobinger G.P., Weiner DJ. 2001. Filovirus-pseudotyped lentiviral vector can efficiently and stably transduce airway epithelia in vivo. Nat. Biotechnol. 19, 225-230.

205. Verhoeyen E., Cosset F.L. 2004. Surface-engineering of lentiviral vectors. J. Gene Med; 6, 83-94.

206. Lu. X., Humeau L. 2004. Safe two-plasmid production for the first clinical lentivirus;vector that achieves > 99% transduction in primary cells using a one-step protocol. J. Gene Med. 6, 963-973.

207. Levine B.L., Humeau L.M. 2006. Gene transfer in humans using a conditionally replicating lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 17372-17377.

208. Puthenveetil G., Scholes J. 2004. Successful correction of the human beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector. Blood: 104, 3445—3453.

209. Galimi F., Noll M, 2002. Gene therapy of Faneoni anemia: preclinical efficacy using lentiviral vectors. Blood. 100, 2732—2736.

210. Kordower J.H., Emborg M.E. 2000. Neurodegeneration prevented by lentiviral vector delivery of GDNF in primate models of Parkinson's disease. Science. 290, 767-773.

211. Consiglio A., Quattrini A. 2001. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nat. Med. 7, 310—316.

212. Stein C.S., Kang Y. 2001. In vivo treatment of hemophilia A and mucopolysaccharidosis type VII using nonprimate lentiviral vectors. Mol. Ther. 3, 850-856.

213. Kobinger G.P., Louboutin J.P. 2003. Correction of the dystrophic phenotype by in vivo targeting of muscle progenitor cells. Hum. Gene Ther. 14, 1441—1449.

214. Ikawa M., Tergaonkar V. 2002. Restoration of spermatogenesis by lentiviral gene transfer: offspring from infertile mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 7524—7529.

215. Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю профессору Владимиру Сергеевичу Прасолову за плодотворные дискуссии и помощь, оказанную на всех этапах работы, а также всем сотрудникам лаборатории биологии клетки за всестороннюю поддержку.

216. Особую благодарность выражаю профессору Кэрол Стокинг и сотрудникам Института экспериментальной вирусологии им. Генриха Петте за помощь в постановке отдельных экспериментов и обсуждение результатов.

Информация о работе
  • Спирин, Павел Владимирович
  • кандидата биологических наук
  • Москва, 2010
  • ВАК 03.01.03
Диссертация
Подавление экспрессии лейкозных онкогенов с помощью РНК-интерференции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Подавление экспрессии лейкозных онкогенов с помощью РНК-интерференции - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы