Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазмидные векторы на основе гена бета-галактозидазы Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Плазмидные векторы на основе гена бета-галактозидазы Escherichia coli"

% и о; АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШШКИНА

На правах рукопион УДК: 577.213.7 577.217.52

ЧЫОНГ НАМ ХАЙ

Ш1АЗШШШ ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ ГЕНА /»-ГАШТСЭДДАЕЫ Евскег1оЫ.а оо11.

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

дпооертадпп на соискание ученоЯ степени . , кандидата биологических наук

!.'яоква - 1988

Работа выполнена в группе белковой инженерии ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина Академии наук СССР.

Научные руководители: академик Ю.А.Овчинников

кандидат химических наук В.А. Ефимов

Официальные оппоненты: доктор химических наук Ю.А.Берлин

Ведущая организация: ВНИИгенетика Минмедбиопрома. -

Завдата диссертации состоится " 22 " июня 1988 г. в 10 часов на заседании Специализированного совета Д 0023501 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР, г.Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР.

кандидат химических наук В.Д.Смирнов

Автореферат разослан "

1988 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

Д 0023501 кандидат химичеоких наук

В.А.Несмеянов

Актуальность проблемы.

"""Э-Галактозидаза Е.ооН и нодирукщкй ее 1аог ген являются в ¡гнас,тдяцее время одними кз наиболее хорошо изученных объектов молекулярной биологик. Известна их полная аминокислотная и нуклео-тидная последовательность. Детально исследован механизм генетической регуляции синтеза этого фермента, изучены его физические и химические свойства, разработаны простые и удобные методы тестирования и выделения. Все это создало предпосылки для широкого использования гена Г -галактозидазы и его фрагментов при конструировании различных плазмидных и фаговых векторов, предназначенных для клонирования и сиквенса, мутагенеза и экспрессии исследуемых целевых фрагментов ДНК.

Цель работы.

Настоящая работа является частью исследования по конструированию векторов для клонирования, экспрессии и направленного мутагенеза фрагментов ДКК, проводимых в группе белковой инженерии Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР. В задачу работы входило: конструирование серии плазмидных векторов на основе гена 1аог для клонирования и экспрессии искусственных генов небольших белков и пептидов; клонирование и изучение экспрессии искусственного гена одного из функционально важных фрагментов бактериоопоина в полученных векторах; создание на основе гена 1ао2 плазмидной системы для определения активности синтетических промоторов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате проделанной работы было сконструировано несколько новых плазмидных векторов для клонирования и регулируемой экспрессии искусственных генов в составе гибридных белков с и -концевыми фрагментами Р -галактозидазы в.ооН различной длины. С помощью полученных векторов была осуществлена экспрессия искусственного гена функционально важного фрагмента бактериоопоина. Было установлено, что длина лядерной последовательности р-галактозидазы в составе гибридного белка существенно влияет на выход гибрида и стабильность штамма продуцента. Показано, что способность гибридных молекул белка образовывать нерастворимые клеточные агрегаты является необходимым уоловием для достижения высокого выхода целевого полипептида и позволяет, в принципе, значительно упроотить схему его выделения, и очистки. На основе полусинтетического гена Р -галактозидазы е.ооП и синтетического терминатора транскрипции бактериофага га был сконструирован проиоторпробкыЯ

вектор рН2. С помощью этого вектора были клонированы промотор гена х бактериофага f¿ , р промотор фага Л и его мутанты и измерена их функциональная активность. Показано, что размер спейсе-ра между консервативными (-35) и (-10) районами промотора существенно влияет на его активность.

I. Конструирование плазмидных векторов для клонирования и экспрессии на основе гена lacZ и изучение экспрессии Функционально вакного фрагмента гена бактетоопскна.

При попытках осуществления в бактериальных клетках прямой экспрессии небольшое гетерологичных белков и пептидов часто возникают проблемы, связанные с крайней нестабильностью последних. Одним из возможных путей их преодоления является получение этих соединений в составе более крупных и более стабильных гибридов. В качестве белков-носителей в этих случаях чаще всего используются некоторые бактериальные белки или их фрагменты. Одним из таких белков является ß-галактозидаза е.coli . Ранее было показано, что большой фрагмент ß-галактозидазы е.coli, содержащий первые 1005 а.о., а такяе его гибрида с некоторыми полипептидами, образуют в процессе биосинтеза в цитоплазме клеток E.coli нерастворимые агрегаты, что позволило предотвратить разрушение входящих в их состав целевых полипептидов внутриклеточными протеиназами. Недостатком этой системы является сравнительно небольшой выход целевого полипептида, поскольку доля последнего в молекулярной массе химерного белка невелика. Возможным путем повышения выхода является уменьшение длины лидерной последовательности Р-галактозидазы до минимума, еще обеспечиваицего стабильность химерного белка в протоплазме клетки.

В связи с этим представлялось интересным сконструировать на основе гена Р-галактозидазы ряд экспрессирующих векторов, отличающихся друг от друга лишь длиной встроенного 5 -концевого фрагмента структурного гена lacZ и исследовать с их помощью на примере экспрессии искусственного гена функционально важного фрагмента бактериоопсина зависимость между выходом и стабильностью образующегося химерного белка и длиной лидерной последовательности р-галактозидазы.

Из большого числа возможных вариантов по длине фрагментов структурного гена ß-галактозидазы нами были выбраны три; первый из них содержал 1005 кодонов -галактозидазы с N -конца, второй 380 кодонов, а третий 280 кодонов. Выбор этих фрагментов был обус-

ловлен наличием в гене 1асг в соответствующих местах уникальных сайтов узнавания рестриктазами ЕсоМ , С1а1 и Есойу .

С учетом того, что фрагмент искусственного гена бактериоопси-на, который предполагалось клонировать и экспрессировать имел на 5 -конце 2 о ой I-сайт, все плазмидаые векторы конструировались таким образом, чтобы часть гена 1асг , кодирующая С-конец фрагмента £> -галакт о з идаз ы, содержала Е о ой I -сайт. При конструировании этих векторов учитывалось и то, что в месте слияния гена 1ас2 о клонируемым геном должна сохраняться рамка считывания.

1.1.1. Конструирование плазмидного вектора рО1005.

Первой плазмвдой в этой серии явилась илазмида рв 1005. Она оодеркит большую часть гена 1аог , кодирукщую 1005 а.о. Р-галак-тозидазы. Схема ее получения представлена на рис. I.

Первой задачей при конструировании плазмиды рйЮСб являлось получение фрагмента, содержащего промотор-операторную часть и большую чаоть структурного гена 1ас2 , т.е. фрагмент Есойу-ЕооШ от плазмиды рОВРМО. в плазмдце роврюо имеются три ЕоойУ-сайта,

Рио. I. Схема конструирования плазмидного вектора роюсз .

причем один из них находится в структурной части гена lacZ . Для получения фрагмента, содержащего промотор, оператор и начало гена lacZ плазмиду pGBPloo сначала подвергали частично^ гидролизу ферментом EcoRV . После этого полученные фрагмента ДНК подвергали исчерпывающему гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRl . После завершения этой реакции проводили препаративное электрофоретичес-кое разделение продуктов гидролиза на 1% агарозном геле. Фрагмент EcoRV-Bcoi<x длиной около SOOO п.о., содержащий PO-iacz , выделяли электроэлкцией.

Параллельно бчл приготовлен вектор для введения полученного фрагмента. Для этого плазмвду piisi , которая была получена ранее в нашей лаборатории, подвергали гидролизу ферментами EcoKi иНраХ. Продукты гидролиза также подвергали препаративному электрофорети-ческому разделешпо на агарозном геле и выделяли большой KcoRI-Hpai фрагмент. После дотирования вектора pHSl с выделенным фраг-м'ентом EooRV-KcoKl , синтезированные рекомбинантные молекулы ДНК трансформировали в клетки е.coli KI2 <л.поз . Селекция полученных при этом рекомбинантных клонов проводилась при рассеве на чашки с агаром в присутствии ампициллина, изопропил-Р-о-гиогалактозида (ИПТГ) и 5-брол!о-4-хлоро-3-индолил-р-с>-галактопиранозида ( Х-еа Среди выросших колоний отбирались обладающие ярко голубой окраской. Из отобранных колоний выделяли плазмвдную ДНК. Ее структура подтверждалась рестрикционкым анализом.

I.I.2. Конструирование плазмидкых векторов pG280 и pG280l.

Векторы рС280 и pG280i кодируют лидерную последовательность, содержащую 280 N -концевых а.о. Р -галактозидазы. Для создания век тора рС280плазмидную ДНК pGioo5 расщепляли эндонуклеазой С1а1. После этого липкие концы, образованные действием ciai , достраивались с помощью ДНК-полимеразы I (фрагмента Кленова) в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтри|юсфатов. Полученную ДНК pGioos подвергали гидролизу ферментом Hindin. При этом удалялась большая часть гена lacZ к часть ДНК шгазмиды Р&Ю05 . Дяя введения EcoRX -сайта в 3 -конец фрагмента гена lacZ , полученный после препаративного электрофоретического выделения большой Hindlil-ciai фрагмент шгазмиды р&юо% лигировали с синтетически.! дуплексом, содержащим на одном конце последовательность, соответствувдую половинному Hindin -сайту, а на другом репарированный ücoRi-сайт. В результате дотирования в полученной плазмиде восстанавливался Hindxxi-сайт, а ciai-сайт исчезал, вместо него образовывался KcoRi -сайт на 3 -конце фрагмента гена lacZ . Таким образом была

получена плазмида pG280. Второй вектор этой серки,рогаох , конструировался аналогично, исходя из плазмиды pGBPioo (рис. 2).

279 ■

IK С1" Рье

Й1Е Ь» Tit

Рио. 2. Схема конструирования плазмидных векторов рйгзо и pü2aoi.

' Изучение экспрессии функционально важного фрагмента гена

бактериоопсина в плазмидных векторах pGioo;?. роззо . nG?eo и оа?вот.

Выбранный для экспрессии функционально важный сегмент молекулы бактериородопсина (БР) представляет собой фрагмент 198-231. Этот фрагмент содержит остаток лизина в положении 216, который является местом связывания бактериоопсгаа (БО) и ретиналя. Как и другие мембранные белки БО сильно гидрофобен, поэтому предполагалось, что он будет токсичен для клеток к.coli в больших количествах. Введение его в состав гибридного белка о (З-галактозидазой позволило бы решить эту проблему. С другой стороны, нам прелстан-лялось интересным изучить как длина лидерной последовательности -галактозидазы в гибридном белке влияет на выход гибрида и стабильность штвша продуцента. Поэтому, кроме вышеописанных плазмид-ных векторов pGl005 , pG280 и pG2aoi, использовалась ранее полученная в напей лаборатории плазмида рсзао, кодирующая 330 -концевых а.о. £ -галактозвдазы. Плазмида рсзао отличается от плаза/-

ды pGl005 только длиной фрагмента структурного гена laoZ .

1.2.1. Клонирование фрагмента 198-231 бактериоопсина в плаз-МИДНЫХ векторах pGIOQ5 . pG3B0 . pG230 и pG28QI .

Дня осуществления экспрессии фрагмента 198-231 БО из вышеописанных векторов вырезали короткий фрагмент EcoRl-BamKl и вместо него вводили клонированный фрагмент гена БО. Структура этого синтетического полинуклеотида, полученного ранее в нашей лаборатории, была выведена на основе первичной структуры соответствующего белка и генетического кода с учетом частоты использования различных кодонов в ДНК E.coli . Этот синтетический фрагмент гена БО был ранее клонирован в плазмиде pRH . Помимо кодирующей части, в нем также содержались инициирующий и терминирующий кодоны, а на его концах были предусмотрены сайты узнавания эндонуклеазами EcoRI и Bamfil . Схема выщепления синтетического гена из несущей его плазмиды pRH и получения плаэмвд, кодирующих синтез соответствующего ему пептида, представлена на рис. 3. Нужно отметить, что при' слиянии генов сохранялась рамка считывания.

Все процедуры рестрикционного гидролиза при получении векторов и выщепления фрагмента гена БО из плазмиды pRH , а также по-следукщее их выделение и очистка были проведены аналогично.

Затем линейные молекулы векторов pGl005 , pG380 t pG230 иди pG280l ( EooRI-bojtiHI ) лигировались с фрагментом EooRi-Bamnl гена БО, и полученные при этом рекомбинантные ДНК трансформировались в клетки е. coli KI2 JMI03 . Трансформанты высевались на агаризован-ную lb-среду, содержащую ампициллин, ИГГГГ и x-gal . ш выросших колоний отбирались ярко голубые, которые затем скринировались на присутствие гена БО гибридизацией с одним из входящих в его состав олигонуклеогддов после введения в последний -метки. Из отобранных колоний выделяли плазмвдные ДНК, а их структуру подтверждали рестрикционным анализом.

Таким образом были получены плазмиды рИ005НН t pG3B0RH f pG?.80RH ( pG2BOXRH), кодирующие синтез гибридных белков, состоящих из фрагментов Р-галактозидазы различной длины и фрагмента БО. Условия транскрипции и трансляции генов химерных белков в этих плазмидах были созданы за счет регуляторной области lac -оперона.

1.2.2. Экспрессия фрагмента бактериоопсина в составе гибридных белков с фрагментами ß-галактозидазы различной длины.

Для определения уровня экодреосии гибридных белков плазмиды

Рис. 3. Конструирование экспрессирувдих плазмидных векторов,

кодирующих синтез фрагмента 198-231 БО в составе г/.сридных белков с фрагментами р-галактозкдазы разлитой длины. (ВН-фрагмент гена БО, ß-Gal-Фрагмент гена Р-галактозидазы).

pGI005KH,pG380KH, PG280EH и рс28СШШ трансформировали в клетки E.ooli KI2 HB10I или VX902 . Трансформанты та соответствущнх итаммов бактерий выращивали на ьв -бульоне, содержащем ампициллин и ИПТГ, в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием и из полученных биомасс приготовляли образцы для электрофореза в пол;:-акрюгамидком геле (ПААГ) в присутствии sbs по методике Лам/ли. После электрофореза белковые полосы обнаруживали прокрашгванпа.] геля кушасси. Результаты электрофореза представлены на рис. 4. Суг.я по молекулярным весам, отмеченных звездочками, белковых полос, он:: представляют собой гибридные белки. Для подтверждения этого предположения проводились эксперименты по иммуноблотингу. Для этого после электрофореза белки переносились на нкгроцелтюлозный фильтр. По окончании перекоса половину фильтра прокрашивали амкдочеркым и оставляли в качестве контроля-, а вторую часть фильтра оилыьали ог 3D3, и проводили обработку сначала о поликлональной антисывои/.'коЛ к ЕР в присутствии БСА, затем о коньюгатом с перокс;!дазой, к нако-

нец окрашивали раствором диаминобензидина в присутствии перекиси водорода.

Результаты иммуноблотинга белковых полос на нитроцеллюлозном фильтре показали, что отмеченные белковые полосы с молекулярными весами около II4000 и 50000(рис. 4) действительно являются гибридными белками. Относительное содержание этих гибридных белков в бактериальных клетках определялись о помощью денситометрирования белковых полос на полиакриламщшом геле после электрофореза. Результаты определения представлены в таблице I.

Результаты исследования экспрессии гибридных белков показали, что длина лидерной последовательности f1 -галактозидазы в составе гибридных белков существенно влияет на выход гибрида и стабильность штамма продуцента. Было показано, что в штамме е.coli HBI0I в случае самого длинного гибрида (бежа I005RH ) выход последнего был достаточно высок и составлял до 30$ от общего количества клеточного белка (табл. I). В то же время более короткий гибрид давал худший результат. Переход к другому штамму-реципиенту - VL902 приводил в случае гибрида эзонн к значительному повышению выхода целевого белка, что может быть отнесено за счет свойств самого штамма-реципиента, являющегося Xon-мутантом, т.е. штаммом, дефектным

Рис. 4. Гель-электрофорез в 7,5/5 ПМГ суммарных белков, выделенных из трансформированных клеток Е.coli плаз-мидами pGI005RH(a-> и pG380i{H(ö) # Стрелка-га показаны положения белков-маркеров и их молекул массы. Звездочками отмечено положение на геле гибридных белков. ВРВ-Бромфеноловый синий.

а ь

15ÜÖ80

V-v» ===== — 78880

v ' " "9 f

C-*-*-. -»- 45880

~ . ""-'Г 37000

Таблица I

Уровень синтеза различных гибридных белков, состоящих из фрагментов бактериоопсина и А -галактозидазы в штаммах и.созд.

Плазмида Штамм-реципиент IS.coli. Количество гибридного белка (процент от сумм, клеточного белка)

PGI005RH HBIOI' 28

PG38QRH hbioi 5-6

PG380RH 'Л, 9 02 24

PG230RH HBIOI -

pG280KH VL902* 1,5

pG280Ii<H HBIOI -

pG230IKH VL902* 1,6

♦ Штамм не стабилен при повторной ферментации.

по синтезу ряда внутриклеточных протеиназ.

В случае же самого короткого из сконструированных гибридов ни один из реципиентов не позволил получить удовлетворительных результатов из-за нестабильности штаммов VL902/pG280RH и VL902/pG230XRH , что, по-видимому, является следствием свойств БО как мембранного белка. Подобный эффект также наблюдался при попытке экспрессии высокогидрофобных белков таких как белки оболочки вируса (Дюбуа, 1986 т.). В нашем случае, значительный вклад фрагмента БО в коротком гибриде, вероятно уже способен резко изменить свойства последнего, что несомненно должно сказаться на устойчивости рекомбинанткых штаммов. Как показали параллельные опыты, выполненные в нашей группе о другими пептидами, эти же векторы в а?а'.где V1902 обеспечивали очень выоокий уровень экспрессии гибридных белков и полученные на' их- основе штаммы продуценты были достаточно отабилъны.

Как уже отмечалось выше, способность гибридных белков на основе большого фрагмента (1005 а.о.) £-галактозидазы накапливаться в больших количествах в процессе акопрессии химерных генов в клетках s.ooll основана на их плохой растворимости в воде. Вследствие этого они образуют в цитоплазме клеток нерастворимые агрегаты, собирающиеся на внутренней.стороне мембраны и препятствующие прогеи-назной деградации белкового продукта. При разрушении таких клеток

ультразвуком в отсутствие детергента и последующем низкоскоростном центрифугировании гибридный белок был найден только в клеточном дебрисе и полностью отсутствовал в супернатанте.

Аналогичный результат был получен нами при анализе клеток к.coli , трансформированных плазмвдой pGl005RH . В этом случае гибридный белок был также найден исключительно в мембранной фрак-ЦЮ1 и полностью отсутствовал в супернатанте (см. рис. 5).

Улектрофоретическая картина в случае штамма Б.coli YL902/pG3a0RJ была иной и указывала.на содержание в супернатанте до 1Ъ% от общего количества гибридного белка в клетке.

В случае шгазмиды pG230HH, кодарукадей минимальный лидер Р-галактозидаэы картина была прямо противоположной и свидетельствовала о хорошей растворимости образующегося гибридного белка в цитоплазме клеток. Соотношение между количествами гибридного белка, найденными в супернатанте и клеточкам дебрисе равнялось приблизительно 8:2. Таким образом наблэдалась обратная зависимость между выходом соответствующего химерного белка и его растворимостью в цитоплазме клеток ¡¿.coli, которая в свою очередь являлась функцией длины лидерной последовательности Р -галактозидазы, возрастая при уменьшении последней.

Оптимальная длина я -концевого фрагмента Р -галактозидазы в составе гибрида с фрагментом бактериоопсина, по-видимому, близка к достигнутой при конструировании вектора pG330i<H , хотя эта длина может быть иной в случае экспрессии других белков или пептидов. Необходимым условием для достижения высокого выхода химерного белка является его способность образовывать в цитоплазме s.coli нерастворимые белковые агрегаты, что позволяет, в принципе, не только предотвратить,его разрушение внутриклеточными цротеиназами, но и значительно упростить схецу выделения к очистки, применяя на первых этапах, вместо колоночной хроматографии, более простые процедуры экстракции и переосавденкя (результаты такой процедуры, применяемой для белка 1005RH представлены на рис. 5).

2. Конструирование промотор-пхюбного вектора на основе гена 1ас2 .

Простота и удобство определения ферментативной активности ß-галактозидазы в лизатах клеток к.coli с помощью различных хромо-генных субстратов обусловили широкое использование гена ß -галактозидазы в качестве генетического маркера при конструировании, так называемых, пробных векторов, предназначенных для идентификации и

— хл. —

а б в г

Рис. 5. Электрофореграмма выделения гибридного белка Ю05НЯ.

(а) - суммарный. клеточный экстракт, (б) - надосадочнак жидкость, (в) - мембранная фракция, (г) - белок Ю05НЯ после трехкратной экстракции.

измерения сигналов инициации и термпнацшг транскрипции, инициации трансляции и др.

В раьжах изучения структурно-функциональных особенностей бактериальных промоторов нами на основе гена Хаог была сконструирована промотор-пробная плазмзда рН2. Она содержала: полускнтеткчес-кий ген р -галактозидазы, лишенный промотора, но сопряженный с природным участком инициации трансляции (участок ШаЯн-Долгарко); расположенные перед геном 1ас2 ЗооН1 и Х1го1 -сайты для введения исследуемых промоторов; расположенный сразу после гена р-галакто-зидазы терминатор бактериофага fd , необходимый для предотвращения дальнейшей транскрипции на область ог1 плазмиды к обеспечквап-ций стабильность всей системы.

2.1. Конструирование терминатора транскрипции бактерлотага .

Тергдинатор транскрипции бактериофага га был получен химико-ферментативным путем из следующих синтетических олигонуклеоткдов:

5-AGCTT GT CGАС CGATA CAATTAAAG G CT С ОДИГОКуКЛеоТВД-29-I

5-OTGTCTAGAGGTAOCAAAA-AAAAAGGCTG 0ЛИГ0Нукле0ТИД-29-2

5-GAAAAG GAG С 3 TTIAAT T GTAT CG GT CGA CA ОЛИГОИуКЛеоТИД-31

5-CTTTTGCAGCCTTTT2TTTTCGTAC0TCTAGACAG 0ЛИГ0КуКЛе0ТИД-35

Данные олигонуклеотиды спивались с пшощью Т4-ДНК-лигазы следующим образом: в реакцию вводили четыре олигонуклеотида, среди которых только олигонуклеотид-35 был т> -фосфорилирован по 5 -концу. После отккга добавляли Т4-Д(Ш-^гигазу. При этом происходило ошиванне только мезду олкгонуклеотвдом-29-I и -35, составлягацими верхнюю цепь терминатора. Затш весь комплекс подвергали электро-форетическому разделению в 8% денатурирующем ПААГ для отделения верхней нити от олигонуклеотидов 29-2 и 31.

Вторая нить получалась аналогично. Отличие заключалось только в том, что вместо фосфорилированного олигонуклеотвда-35 в реакцию вводился фосфорилированный олигонуклеотид-29-2.

После откига синтезированных таким образом нитей, был получен терминатор транскрипции бактериофага fd , структура которого представлена ниже. На концах его последовательности имеются сайты эн-донуклеаз Hir,dlil. к i-vall • . ______..............

HindHI PvutI

AGCTTOTCOACCGATACAATTiUiAGijOTO'JTTT^K/jAGGCTTTTXTTTTGGTAOCTCTAGACAG !

ACAGCTGGCTAKTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCATGGAGATCTGTC |

2.2. Конструирование ллазмивд pHI.

Для создания плазмиды pHI (рио. 6) в качестве исходной ио-пользовалась полилинкерная плазмида pH 2.

Первоначально плазмиду pH 2 расщепляли двумя ферментами Hindin и Pvull. Продукты гидролиза подвергали электрофор етичес-кому разделению на I% агарозном геле. Выделяли большой фрагмент . Pvull-Hin аш (около 2300 п.о.) и лиг провали его о синтетическим терминатором бактериофага fä. . Полученными рекомбинантными ДНК трансформировали в клетки е.coli hbioi. Выросшие на агарюованной среде, содержащей ампициллин, колонии переносили на нктроцеллюлов-ный фильтр и проводили селекцию клонов на содержание терминатора фага fd гибридизацией с олигонуклеотвдом-29-2 после введения в последний ® х1 -метки. Из отобранных клонов выделяли плазмидауи ДНК, структуру которой подтверждали реотрикциоюпш анализом и сиквенсом.

■Hindin

Tfd

- ыямш ■

Hindlll P^11

Рис. 6. Схема конструирования плазшци pHI.

2.3. Конструирование плазмидн рН2.

На основе плазмида pHI была создана плазмида рН2, содержащая рабочую систему для тестирования активности промоторов. Схема получения этой плазмиды представлена на рис. 7. * '

Источникам полусинтетического гена lacz явилась плазмида рР32 , сконструированная в нашей лаборатории ранее. Для выделения гена' lacz плазмвду p?S2 расщепляли эндонухлеазами xhol и Hindin . Продукты гидролиза подвергали электрофоретическому разделению в агарозном геле. Малый фрагмент (около 3000 п.о.) выделяли из .ага-розного геля электроэлюцией. Параллельно вектор pHI расщепляли теми же двумя ферментами. После этого фрагмент гена lacZ лидировали с большим Xhoi-Hind фрагментом pHI. Синтезированными реком-бинантными ДНК трансформировали клетки е. coli hbxoi . Селекция клонов, содержащих плазмиду рН2, проводилась рестрикционным анализом плазмидных ДНК, выделенных из выросших колоний.

2.4. Введение синтетических промоторов в плазмнду РН2.

Ранее в нашей лаборатории химико-ферментативным путем были получены синтетический промотор Pj, бактериофага А и промотор гена х бактериофага fa . Кроме того были синтезированы глутантные варианты промотора 5, : PMI, РМ2, РМЗ и РМ4, которые отличались размерами

Рис. Схелза конструирования игазлшды рН2.

спейсера между (-35) и (-10) областями: делеция одной п.о. (РЖ и РМ2), двух п.о. (К,-13) ели вставка четырех п.о. (Р»й) (рис. 8). Все эти промоторы были клонированы в плазмиде рнэг . Для сравнительного изучения актизноети промоторов они были переклонированы в плаз.'.шду рН2 по ЕсоК1 и ХЬо! сайтам (рис. 9). .

Промотор фага вводами по ЕсоШ -сайту (при этом он встраивался в двух ориентадиях), а для введения ^-промоторов плазмиду рН32 , содержащую промотор % , сначала расщепляли нуклеазой ВатНХ , полученные липкие концы достраивали ДНК-полимеразой-1 в присутствии всех дезоксинуклеозвдтрифосфатов, среди которых был сс -атт? . Затем ДНК подвергали гидролизу ферментом ЕсоЫ . Продукты гидролиза выделяли электрофорезом в 8% ЕААГ. Малый Есой1-ВалН1 фрагмент (около 100 п.о.), содержащий промотор , алшровали о геля. Аналогично выделяли дгутантные й,-промоторы.

Параллельно вектор рН2 расщепляли ферментом ХЬо1 . Липкие концы также достраивали о помощью ДНК-полимеразы I в присутствии всех дезоксинуклеозидтрифосфатов. "Затем плазмидную ДНК обрабатывали ЕзоКХ и большой хио1-КооК1 фрагмент выделяли електрофорезом в

Pfd

470 -60 -50 -40 -30 -20 ' -10 1 10 20

MTTCTTTGAAGTCTOTCGGGOTTCCTCITAATGTTTTTGATGGA

GAAACTSCAGAAAGCGOGAAGGAGAATTAGAAAAAGI'ACC'Í'TAAGCGAÁACOAAGA^^^^ EooRI ' EeoRI

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 1 10 20

mttcagataacgatctgcogtgatmattatctctggcggtgttgacataaatac^

GTCTATTGGTAGACGCCACTAT'MAA^GAGACGGCCACMCTGTATXTATGGTGACCGCCACTAGGACTCGTC

EcoRI

BaaiíH

I

trj

PM1

PÜI2

pu3

PM4

..CGGTGTTGACATAAA-ACCACTGCOGGTGATACTGAGCACA... . .GCGACAACTGTATTT-'ÍGGTGACGGCGACTATGACTCGTGT...

..CGGTGTTGACATAA-TACGACTGGOGGTGATACTGAGCACA... ..GCCACAACTGTATT-ATGGTGACCGCGACTATGACTCGTGT...

..CGGTGTTGACATAAA—CCACTGGCGGTGATACTGAGCAOA... .. GCCAGAAGTGTATTT—GGTGACCGCCACTA'ÍGACTCGTGT...

.. CGGTGTTGAQATAAAagctTACCACTGGCGG'rGATACTGAGCACA... .. GCCACAACTGTATTTtcgaATGGTGACCGQCACTATGACTCGKG'E. ..

L

pñc.B. urpyKTypa ciiHTeTHiecKnx npowoTopoB: J¥d,PMi,.m2,PM3,Hii4 ¡i ' B¡

Рио, 9. Схема клонирования синтетических промоторов фага в плазмиде рН2.

агарознам геле.

После этого промоторы, имеющие лишай Есо5И -конец и тупой БшпН1-кокец лигкровали с приготовленным вектором рН2, что обеспечивало правильную ориентацию промоторов по отношению к гену 1асг. Синтезированными рекомбинантными ДНК трансформировали клетки Е.соИ НБЮ1. Селекция клонов, содержащих плазмиды с промоторами, проводилась при рассеве клеток на агаризованную ьв-среду с ампициллином и х-са1 • Отбирались голубые колонии, которые затем дополнительно скркнцроваллсь на присутствие плазмидных ДНК о промоторами гибрвдизацией о 32Р-иеченкк.чи олигонуклеотвдами, входящими в оостав последних.

Структура вставок и их ориентация подтверждались рестрикцион-кым анализом и прямым определением последовательности. Таким образам были получены плазмиды рН2-1,, рН2-М1, рН2-М2, рН2-МЗ, рН2-М4 и рН2-гс1, содержащие соответственно промоторы РЩ, РМ2, РМЗ, РШ и промотор гена х фага fd .

Таблица 2

Определение активности Р -галактозидазы синтетических промоторов.

Промоторы Активность Р-галактозидазы

(в единицах по Миллеру,X1000)

генах фага fd (нчп

а.

РМ1 РМ2 РМЗ РМ4

16,3 17,9 6,3

3,9 0,001

2.5. Определение активности синтетических промоторов.

Для определения активности синтетических промоторов плазмидн рН2-?4 рН2-ь , рН2-М1, рН2-М2, рН2-.\!3 и рН2-ЬЙ трансформировали в клетки к.ооН сзнзб. Клетки высевали на агаркзованную ьв-среду, о ампициллином и Х-Йа1 или на среду Макконки с ампициллином. У выросших трансформантов определяли активность р-галактозидазы по стандартной методике Миллера, используя о-нктрофенил-Р-о-галахто-зид в качестве хромогенного субстрата. Дяя более корректного сравнения, кроме активности р-галактозидазы, определялась такав ак- _ • тивность Р-лактамазы, которая конститутивно синтезируется в этих плазмидах, что позволяет оценить копнйность плазмид. Для сравнения определяли активность Я-галактозидазы в клетках, трансформированных плазмидой рН2 (система без промотора). Результаты определения активности промоторов представлены в таблице 2.

Результаты определения активности А-галактозидазы показывают, что синтетический промотор ^, имеющий природную структуру обладает наибольшей активностью, а размер спейсера между консервативными районами (-35) и (-10) существенно влияет на активность промоторов. ' Стоит убрать одну и.о. Т/А в положении -26 (промотор РГД)таи пару А/Т в положении -27 (промотор РМ2), или же две п.о. в положениях -26 и -25 (промотор РМЗ), сразу значительно снижается активность этих промоторов. А вставка четырех п.о. Двот/тссл между положениями -20 и -26 (промотор РЖ) в структуре промотора фактически сводит его активность до уровня фона. Наши данные показали, что малейшее изменение в расстоянии спейсера между консервативными (-35) и (-10) районами влияет на эффективность процесса транскрип- ■ ции, и в конечном счете на уровень экспрессии данного белка.

Выводы

1. Сконструирована серия плазмвдных векторов, пригодных для экспрессии генов небольших белков и пептидов на основе фрагментов гена 1ао2! различной длины.

2. Осуществлены клонирование и экспрессия функционально важного фрагмента бактериоопсина в этих векторах. Результаты экспрессии показали, что длина лцдерной последовательности Р-галактозидазы

в составе гибридного белка существенно влияет на выход гибрида и стабильность штамма продуцента.

3. Показано, что способность гибридных молекул белка образовывать нерастворимые клеточные агрегаты является необходимым условием для достижения высокого выхода целевого полипептвда и позволяет, в принципе, значительно упростить схему его выделения и очистки.

4. На основе гена la.cz была сконструирована система, удобная для определения активности различных промоторов, и с ее помощью проведено сравнительное тестирование промотора гена х бактериофага

, а также промотора.бактериофага Л и его мутантов, полученных химико-ферментативным способом.

По теме диссертации опубликована следующая работа:

Чахмахчева О,Г., Мирских О.В., Чыонг Нам Хаи, Щимов В.А. Экспрессируидие плазмидные векторы на основе фрагментов гена р-галактозидазы Escherichia ooli . Биоорганическая химия, 1987, т.13, И 3, 0.350-358.

J

Подписало в почать 30.05.88г. Заказ 1 в О 8 Тираж 10 0 Формат 60x84/10

Москва. Типография ВАСХНИЛ