Планктомицеты сфагновых болот: филогенетическое разнообразие и экологические функции

Иванова, Анастасия Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Планктомицеты сфагновых болот: филогенетическое разнообразие и экологические функции
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Планктомицеты сфагновых болот: филогенетическое разнообразие и экологические функции"

На правах рукописи

Иванова Анастасия Олеговна

ПЛАНКТОМИЦЕТЫ СФАГНОВЫХ БОЛОТ: ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ

Специальность 03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4 О и Ч п

I о

Москва - 2008

003452462

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

С.Н. Дедыш

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

М.М. Умаров

кандидат биологических наук Т.П. Турова

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита диссертации состоится « 24 » ноября 2008 г. в 1200 ч. на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, к. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.В. Хижняк

Актуальность проблемы.

Planctomycetes - это обособленная филогенетическая группа в пределах домена Bacteria, объединяющая почкующиеся организмы с необычной морфологией и ультраструктурой клеток, не имеющие пептидогликана в составе клеточной стенки и обладающие рядом характеристик, несвойственных другим бактериям (König et al., 1984; Schlesner & Stackebrandt, 1986; Liesack et al., 1986; Fuerst, 1995,2004; Ward et al., 2006).

Первый представитель этой группы бактерий, Planctomyces bekefii, был описан Гимези в 1924 г. при микроскопическом анализе проб воды (Gimesi, 1924). Этот морфологически уникальный организм является типовым видом рода Planctomyces, однако он до сих пор не получен в культуре, равно как и ряд других видов этого рода. Первый изолят этих сложных в культивировании бактерий удалось получить лишь в 1973 г. Стэйли, применившему для их выделения разбавленные питательные среды (Staley, 1973). В дальнейшем, для выделения планктомицетов был разработан целый ряд сред и подходов, позволивших изолировать представителей этой группы бактерий из различных водных и наземных местообитаний (Schmidt et al, 1978; Schlesner, 1994; Fuerst, 1997; Wang et al., 2002; Elshahed et al., 2007). Тем не менее, до недавнего времени число узаконенных таксонов планктомицетов включало лишь 6 родов (Planctomyces, Gemmata, Isosphaera, PireUula, Rhodopirelliila, Blastoptrellulä) и 10 видов (Ward et al., 2006).

Физиологическое и метаболическое разнообразие организмов в пределах Planctomycetes остается слабо изученным. Все полученные в чистых культурах планктомицеты являются аэробными хемоорганотрофами. Ряд штаммов способен к сбраживанию углеводов (Hirsch & Müller, 1985; Schlesner, 1986). Знания о существующих метаболических типах планктомицетов были недавно пополнены открытием анаэробных автотрофных представителей этой группы бактерий, осуществляющих процесс анаэробного окисления аммония - «Anammox» (Strous et al, 1999; Jetten et al., 2005; Kartal et al., 2007). Первоначально, эти организмы были обнаружены в очистных биореакторах, однако дальнейшие исследования с применением молекулярных методов выявили их широкое распространение в морских водоемах и эстуариях (Kuypers et al., 2002; Schmid et al., 2002; Schubert et al., 2006). «Апаштох»-планктомицеты пока не выделены в чистых культурах и имеют статус "Candidatus", однако их характеристики детально изучены. Число известных экофизиологических типов планктомицетов также невелико. За исключением умеренного термофила Isosphaera pallida (Giovannoni et al., 1987), все известные до недавнего времени планктомицеты являлись мезофиллами и нейтрофилами.

Сложность культивирования планктомицетов долгое время сдерживала накопление знаний об их распространении в природных экосистемах. Считалось, что эти организмы типичны только для водных местообитаний. С введением в практику новых молекулярных подходов, позволяющих идентифицировать микроорганизмы in

situ, без их культивирования, было обнаружено, что планктомицеты являются одной из численно репрезентативных групп бактерий как в водных, так и наземных местообитаниях с различными физико-химическими характеристиками (Zarda et al., 1997; Neef et al., 1998; Derakshani et al., 2001; Kirkpatrick et al., 2006). Применение молекулярных методов для исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов сфагновых болот, представляющих одну из доминирующих наземных экосистем Северного полушария, выявило, что планктомицеты являются важным компонентом их микробного сообщества (Dedysh et al., 2006). Это было неожиданной находкой, так как сфагновые болота имеют кислую реакцию среды (рН 3.5-5.5), а все ранее описанные планктомицеты были способны расти в диапазоне рН 6.0-8.5. В ходе дальнейших исследований было получено несколько изолятов болотных планктомицетов (Куличевская и др., 2006), что открывало возможности изучения их физиологии, экологии и природы осуществляемых ими процессов.

Таким образом, настоящее исследование было направлено на исследование ранее неизвестных ацидофильных представителей филогенетической группы Planctomycetes, населяющих одну из важнейших наземных экосистем бореальной и тундровой зон Северного полушария.

Цели и задачи исследования.

Цель работы - изучить филогенетическое разнообразие и функциональную роль планктомицетов в микробных сообществах сфагновых болот.

Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Определить численность планктомицетов в сфагновых болотах различного трофического статуса и уровня кислотности, а также характер распределения этих бактерий по профилю болот.

2. Оценить филогенетическое разнообразие планктомицетов в болотах.

3. Охарактеризовать чистые культуры болотных планктомицетов и определить их таксономический статус.

4. Установить функциональную роль планктомицетов в микробных сообществах сфагновых болот.

Научная новизна и значимость работы.

С помощью метода in situ гибридизации с флуоресцентно-мечеными 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными зондами, разработанными для детекции представителей филогенетической группы Planctomycetes (метод FISH), было установлено, что планктомицеты являются неотъемлемым и численно важным компонентом микробного сообщества сфагновых болот севера России, составляя до 14% общей численности бактерий в этих экосистемах.

отличны от ранее изученных представителей Planctomycetes. Впервые проведена дифференцированная оценка популяционной численности отдельных групп планктомицетов с использованием набора 16S рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов, разработанных для отдельных групп болотных планктомицетов. Выявлено четкое различие состава сообществ планктомицетов, населяющих аэробную и микроаэробно-анаэробную части профиля сфагновых болот.

Описано и узаконено 2 новых рода и 2 новых вида порядка Planctomycetales'. Schlesneria paludicola gen. nov., sp. nov. и Singulisphaera acidiphila gen. nov., sp. nov. Это первые ацидофильные организмы, выявленные в пределах Planctomycetales. Установлена способность ацидофильных планктомицетов к деградации широкого спектра биополимеров - ксилана, пектина, эскулина, пуллулана, хондроитин-сульфата, ламинарина и фукоидана, что свидетельствует об их участии в процессах трансформации органического вещества в кислых болотных экосистемах. Типовые штаммы новых родов и видов депонированы в международных коллекциях микроорганизмов АТСС, DSMZ и ВКМ.

Практическая значимость.

Сформирована база данных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК планктомицетов, населяющих северные сфагновые болота. База данных может быть использована для разработки молекулярных методов детекции этих микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.

Разработаны и апробированы 16S рРНК-специфичные флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для дифференцированной детекции основных групп болотных планктомицетов, в том числе зонды для ацидофильных планктомицетов Schlesneria paludicola, Singulisphaera acidiphila и 'Zavarzinella formosa'.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. European Large Lakes Symposium, Tartu, Estonia, 2006.

2. Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии: II Международная молодежная школа-конференция», Москва, ИНМИ РАН, 2006.

3. 10-th International Symposium on Wetland Biogeochemistry: Frontiers in Biogeochemistiy, Annapolis, Maryland, USA, 2007.

4. 10-th Symposium on Aquatic Microbial Ecology, Faro, Portugal, 2007.

Публикации.

Материалы диссертации содержатся в 8 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 5 тезисах.

Объем н структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на страницах, включая № таблиц, »^рисунков и списка литературы из /Й наименований, из них {¿L - на русском и английском языке.

Место проведения работы и благодарности.

Работа была выполнена в отделе микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН с 2005 по 2008 годы под руководством д.б.н. С.Н. Дедыш.

Образцы торфа болот различного географического расположения были предоставлены автору А.В. Воробьевым, к.б.н. И.С. Куличевской, к.б.н. Т.А. Панкратовым (ИНМИ РАН), а также были получены самим автором.

Исследованные в работе изоляты планктомицетов были выделены к.б.н. И.С. Куличевской и к.б.н. С.Э. Беловой (ИНМИ РАН). Определение филогенетического положения изолятов проводилось д.б.н. С.Н. Дедыш. Исследования ультратонкого строения клеток планктомицетов были проведены совместно с д.б.н. О.И. Баулиной (МГУ им. Ломоносова). Анализ хинонов был проведен к.х.н. Б.П. Баскуновым (ИБФМ РАН, г. Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены к.б.н. A.M. Лысенко (ИНМИ РАН).

Работа была выполнена при финансировании в рамках программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», гранта РФФИ 06-04-49148 и проекта ФЦНТП «Ведущие научные школы» № РИ-112/001/027.

Автор выражает искреннюю благодарность всем вышеупомянутым участникам данной работы, а также особую признательность д.б.н. С.Н. Дедыш и акад. Г.А. Заварзину за полезные советы и поддержку на всех этапах работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектами исследования были образцы торфа сфагновых болот бореальной зоны России (Табл. 1).

Экстракцию микробных клеток из сфагнового торфа проводили с использованием гомогенизатора BagMixer 100 "MiniMix" (Interscience, Франция) и прилагающихся к нему стерильных пакетов BagFilter®. К 2 г торфа добавляли 20 мл стерильной дистиллированной воды, обрабатывали с помощью гомогенизатора в течение 10 минут при максимальной частоте. Затем отбирали 0.5 мл полученной суспензии и фиксировали с использованием 4%-го раствора формальдегида в фосфатном буфере (NaCl - 8.0 г, КС1 - 0.2 г, Na2HP04 - 1.44 г, NaH2P04 - 0.2 г, Н20 - 1 л, рН 7.0) в течение 1.5 часов. Образец осаждали и промывали фосфатным буфером. Фиксированные образцы ресуспендировали в растворе 100% этанола и фосфатного буфера (1:1, об:об) и до анализа хранили при -20°С.

Таблица 1. Характеристика образцов сфагнового торфа, использованных в настоящем исследовании

Болото, расположение, время отбора образцов Трофность болота рн Число клеток, выявленных окраской ДАФИ и гибридизацией с зондами на бактерии и планктомицеты, г'1 сырого торфа*.

EUB338-mix (N*10s) PLA46+PLA886 (NxlO7)

ДАФИ, (NxlO") % от EUB338-mix

Бакчарское, Томская обл, 56°8Г1М, 82°50'Е 08 2005,08 2006 Олиго-мезотрофное 4 0-4 5 4 5±0 2 13 2±1 7 1 1±0 2 25

Обское, Томская обл 56°33'1чГ, 83°06'Е 08 2006 Мезотрофное 5 5-6 0 7 6±1 3 10 9±1 8 6 4±0 9 84

Ближнее, Томская обл 56°50'М, 83°04'Е 08 2006 Евтрофное 58 3 5±0 6 7 2±1 2 4 8±0 7 13 8

Обуховское, Ярославская обл, 58°1\Г, 38Е, 05 2006 Олиготрофное 45 3 2±0 7 11 2±1 4 3 1±0 7 96

Муксалма, Архангельская обл 65°1\[, 35°Е, 07 2006 Олиго-мезотрофное 48 3 2±0 5 7 0±1 2 3 3±0 5 103

Секирное, Архангельская обл 65°1М, 35°Е, 07 2006 Олиго-мезотрофное 40 2 9±0 5 3 8±0 6 3 1±0 7 108

Торфяное, Архангельская обл 650И, 35°Е, 07 2006 Олиго-мезотрофное 38 2 0±0 3 4 2±0 7 1 9±0 3 94

Дубровское, Вологодская обл 58°30'Ы, 37°20'Е 07 2005 Олиго-мезотрофное 53 6 6±0 7 13 7±1 6 6 7±1 3 102

Валдайское, Новгородская обл, 57°36'М, 33°10'Е 07 2007 Олиготрофное 41 8 9±1 6 26 4±3 9 1 9±0 3 20

*Данные представлены для слоя торфа 0-10 см, в котором была выявлена максимальная численность клеток планктомицетов

Нанесенные на стёкла фиксированные препараты клеток или торфяных экстрактов обрабатывали раствором лизоцима (1 мг в 1 мл 0.05 М EDTA и 0.1 М TRIS HCl, 1:1, pH 8.0) для увеличения проницаемости клеточных стенок бактерий. Для гибридизации использовали набор рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов (Табл. 2). Гибридизацию препаратов с зондами проводили в соответствии с методикой Stahl & Amann (1991) при температуре 46°С. Общую численность микробных клеток в торфе определяли окрашиванием препаратов 1 мкМ раствором ДНК- специфичного красителя ДАФИ (4',6'-диамидино-2-фенилиндол).

Таблица 2. Олигонуклеотидные зонды, использованные в настоящем исследовании

Зонд Целевые организмы Нуклеотидная последовательность (5*-3') Целевой участок 16S рРНК Форма- МИД, %* NaCI, MM8 Ссылка

EUB338 I EUB338 II EUB338 III Bacteria OCTGCC TCCCGTAGGAGT GCAGCCACCCGTAGGTGT GCTGCCACCCGTAGGTGT 338-355 20 225 Amann et al, 1990, Daims et al, 1999

PLA46 Pïmctomycetes GACTTGCATGCCTAATCC 46-63 30 112 Neef et al, 1998

PLA886 Planaomvcetes GCCTTGCGACCATACTCCC 886-904 35 80 Neef et al, 1998

NLIMIII 301 Группа hosphaera-Smguhsphaera CCCAGTGTGCCGGGCCAC 301-318 20 225 Liu & Seviour, 2001

Sin-644 SmgulHphacra audiphtla ATGCCCCTCCAGACTCGT 644-661 20 225 данная работа

Sin-588 AGCGACAGACGCACGAAT 588-605 20 225 данная работа

ShI-129 Schlesneria spp CTCGCCCTGGGGGTACGT 129-146 20 225 данная работа

ShI-117 TACGTCACCTACGTGATC 117-134 20 225 данная работа

Zav-999 'Zavarzinella ' spp TTCGGAGACGTACCGCTC 999-1016 20 225 данная работа

B39-620 Группа OP3 GAAGGCAGTTCTCCGATT 620-637 20 225 данная работа

AnPir-422' Pu elhtla spp GACAGCGATTTACAACCC 422-439 20 225 данная работа

9 - концентрация формамида в гибридизационном буфере, 6 - концентрация №С1 в буфере для промывки,

* - зонд используется в сочетании с немеченным олигонуклеотидом 5'-ОАСАСССОТТТАСААССС-3'

Препараты анализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 (Иена, Германия) со светофильтрами Zeiss 20 для СуЗ-меченных зондов и Zeiss 02 для окраски ДАФИ. Определение численности целевых групп в образцах торфа осуществляли путем учета количества гибридизованных с зондами клеток в 100 полях зрения, с последующим расчётом численности популяций на 1 г влажного торфа.

Выделение тотальной ДНК из образцов торфа производили с использованием набора "FastDNA SPIN kit for soil" (BiolOl, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Для анализа филогенетического разнообразия планктомицетов в образцах торфа выделенную тотальную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификацию фрагментов генов 16S рРНК планктомицетов (около 1350 пар нуклеотидов) проводили с использованием высоко специфичного для планктомицетов прямого Pla46F (Neef et al., 1998) и обратного универсального бактериального Univl390R (Zheng et al., 1996) праймеров на амплификаторе РЕ GeneAmp PCR System 9700 ("Perkin-Elmer Applied Biosystems", США). Проверку продуктов ПЦР осуществляли

путем их электрофореза в 1.2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией продуктов реакции с помощью УФ-трансиллюминатора. Полученные ампликоны были клонированы с использованием набора "pGem-T Easy Vector Systemll" (Promega) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Отбор рекомбинантных клонов осуществляли путем прямой амплификации клонированных фрагментов с использованием вектор-специфичных праймеров. Выделение плазмидной ДНК из клонов проводили с использованием набора "Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System" (Promega). Определение нуклеотидных последовательностей репрезентативных клонов было проведено на секвенаторе ABI 377А ("Perkin-Elmer Applied Biosystems", США) компанией "Силекс" (Москва, Россия).

Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей осуществляли с использованием программы SeqMan (Lasergene 7.0; DNA Star Package). Сравнение полученных последовательностей с таковыми в базе данных GenBank проводили с использованием программы Blast2 (http://vvww ebi ас uk/blast2/). Построение филогенетических дендрограмм производили с использованием программного пакета ARB (httpV/www.arh-home de). Статистическую достоверность дендрограмм рассчитывали с использованием программного пакета Phylip с помощью "bootstrap"-анализа путем построения 1000 альтернативных деревьев.

Поиск уникальных последовательностей в 16S рРНК болотных планктомицетов и создание олигонуклеотидных зондов для специфической детекции отдельных групп этих бактерий осуществляли с использованием функции "Probe Design" пакета ARB. Специфичность зондов проверяли путем тестирования в базе данных Ribosomal Database Project (httpV/rdp.cmc msu cdii). Синтез зондов, меченых флуоресцентным красителем СуЗ, осуществлялся компанией "Синтол" (Москва, Россия).

Культивирование планктомицетов проводили на среде следующего состава (г/л): КН2Р04-0.05; MgS04x7H20-0.05; раствор микроэлементов №44 (Staley et al., 1992) -1мл; №-ампициллин-0.2; №ацетилглюкозамин-1.0; пептон и дрожжевой экстракт- по 0.05; pH 5.8-6.0. Динамику роста культур прослеживали путем определения оптической плотности суспензий на Eppendorf Biophotometer (длина волны 600 нм). Способность к деградации биополимеров исследовали, прослеживая увеличение концентрации С02 в газовой фазе экспериментальных флаконов с использованием ИК-газоанализатора "Инфралит-4" (Dessau, Германия). Проверку чувствительности к антибиотикам проводили на агаризованных средах путем наложения на газоны культур тест-дисков с различными антибиотиками (Oxoid). Определение других физиологических и биохимических свойств бактерий проводили в соответствии с общепринятыми методиками (Методы общей бактериологии, 1991).

Результаты исследований

1. Выявление представителей филогенетической группы Planctomycetes в сфагновых болотах различного географического расположения и трофического статуса. In situ гибридизация фиксированных образцов торфа с эквимолярной смесью флуоресцентно-меченых зондов PLA46 и PLA886, специфичных для представителей Planctomycetes, показала присутствие планктомицетов в образцах торфа всех исследованных в работе болот (Табл. 1). Выявленные зондами клетки имели шаровидную или эллипсоидную форму и были собраны в агрегаты или цепочки (Рис. 1). Их численность в верхнем (0-10 см) слое болотного профиля варьировала в диапазоне 1.1-6.7х107 клеток г"1 сырого торфа, составляя от 2 до 14% общего числа клеток бактерий. Наибольшая численность планктомицетов была зарегистрирована в менее кислых (рН 5.5-6.0) низовых и мезотрофных болотах, а наименьшая - в более кислых (рН 3.8-4.5) олиготрофных верховых болотах.

1.1. Распределение планктомицетов по профилю болот. Исследование распределения популяционной плотности планктомицетов показало, что во всех изученных болотах максимум их численности приурочен к верхнему аэробному слою (0-10 см) профиля (Рис. 2). Численность клеток, выявленных зондами PLA46+PLA886, плавно снижалась вниз по профилю, составляя на глубине 40-50 см 0.5-3.7*106 клеток в г"1 сырого торфа. В двух случаях, в болотах Ближнее и Бакчарское (Томская обл.) в микроаэробно-анаэробной части профиля, на глубине 3040 см, был обнаружен второй локальный максимум численности клеток планктомицетов. Для проверки достоверности существования данного максимума было проведено более детальное исследование, охватывающее шесть различных локусов болота Бакчарское. Для всех исследованных профилей было характерно

Рис. 1. 1п ¡¡Ш гибридизация торфа, отобранного из слоя 0-10 см сфагнового болота, с флуоресцентно-меченными олигонуклеотидными зондами РЬА46 и РЬА886. А -флуоресцентная микрофотография гибридизации с СуЗ-меченными зондами, Б -окраска ДАФИ, В - фазовый контраст.

Численность клеток, N><10 г'1 сырого торфа 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 0.0 0.5 1.0 1.5

0-10 10-20 20-30 30-40 г 40-50

К о §> 0-10 10-20 20-30 30-40 40-50

Рис. 2. Распределение численности клеток, выявленных гибридизацией торфа с зондами РБА46 и РЬА886, по профилю различных сфагновых болот: (А) болото Ближнее (Томская обл., рН 5.8), (Б) болото Дубровское (Вологодская обл., рН 5.3), (В) болото Обуховское (Ярославская обл., рН 4.5), (Г) болото Секирное (Архангельская обл., рН 3.9), (Д) и (Е) локусы в пределах болота Бакчарское (Томская обл., рН 4.0-4.5) с доминированием сфагновых мхов и осоки, соответственно. Пунктирная линия -уровень стояния воды в момент отбора образцов.

наличие двух четко выраженных максимумов численности планктомицетов. Первый максимум был приурочен к верхнему (0-10 см) аэробному слою болотного профиля. Численность клеток, выявленных в этом слое зондами РЬА46 и Р1.А886, варьировала в диапазоне 0.5-1.5*107 клеток г"1 сырого торфа. В нижележащих слоях торфа наблюдалось резкое снижение численности целевых организмов, которое сменялось на глубине 30-40 см (в микроаэробно-анаэробном слое профиля) вторым всплеском их плотности. Значения численности планктомицетов в слое 30-40 см были сопоставимы с таковыми в аэробном слое и составляли 0.4-0.7хЮ7 клеток г"1 сырого торфа. Природа и филогенетическая принадлежность планктомицетов, развивающихся в микроаэробно-анаэробном слое болотного профиля были неясны и требовали дальнейших исследований.

2. Оценка филогенетического разнообразия представителей РктсЮтусЛея в сфагновых болотах. Для анализа филогенетического разнообразия планктомицетов были использованы 3 образца тотальной ДНК, экстрагированной из сфагнового торфа. Два образца были получены из торфа верхних аэробных слоев (0-10 см) болот Обуховское (Ярославская обл.) и Бакчарское (Томская обл.), тогда как третий образец был выделен из торфа микроаэробно-анаэробного слоя (30-40 см) болота Бакчарское, в котором было выявлено существование второго максимума численности

А)

В)

.0 2.0 4.0 6.0 8.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 0.0 0.5 1.0 1.5

Б)

планктомицетов. С использованием пары праймеров Pla-46F и Univ-1390R из всех исследуемых образцов тотальной ДНК были ПЦР-амплифицированы фрагменты размером около 1350 пар оснований, что соответствовало ожидаемому размеру ампликонов в данной реакции. Полученные ампликоны были клонированы, в результате чего была сформирована библиотека из 77 клонов (57 и 20 клонов из торфа аэробной и микроаэробно-анаэробной зон профиля, соответственно).

Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов генов 16S рРНК показало, что подавляющее их большинство (74 клона из 77) принадлежали представителям порядка Planctomycetales филогенетической группы Planctomycetes (Рис. 3). Последовательностей генов 16S рРНК, близких к таковым у «Апаттох»-планктомицетов, в торфе выявлено не было. Это логичный результат, так как существование «Апаттох»-планктомицетов в сфагновых болотах весьма маловероятно в силу отсутствия энергетического субстрата этих организмов -аммония. Нуклеотидные последовательности 3-х клонов - О-Ох-37, В-Ап-5 и В-Ап-13 - обнаруживали высокий уровень сходства (97.3-99.3%) с таковой у клона В39 (АМ162486), полученного ранее в ходе анализа филогенетического разнообразия бактерий в сфагновом торфе болота Бакчарское (Dedysh et al., 2006). Клоны этой группы формировали отдельный филогенетический кластер и обнаруживали наибольшее сходство (86-88%) с нуклеотидными последовательностями 16S рДНК бактерий филогенетической группы-кандидата ОРЗ, не имеющей пока культивируемых представителей.

2.1. Разнообразие планктомицетов в аэробной части болотного профиля.

Состав библиотек клонов генов 16S рРНК планктомицетов, полученных из образцов торфа аэробной части профиля двух сфагновых болот различного географического расположения, Бакчарское (Томская обл.) и Обуховское (Ярославская обл.), обнаруживал значительное сходство (Рис. 4А и Б). Более половины клонов (от 53 до 61% их общего числа) принадлежали к филогенетической группе родов Isosphaera-Singulisphaera, причем ни одна из этих последовательностей не была идентична или высоко сходна (>97% сходства) с таковыми у таксономически описанных планктомицетов. Двадцать клонов обнаруживали наибольшее сходство (88.8-92.8%) с последовательностью гена 16S рРНК Isosphaera pallida, нейтрофильного планктомицета из термального источника (Рис. 3). Одиннадцать клонов принадлежали к кластеру, образованному ацидофильным планктомицетом Singulisphaera acidiphila (93.8-95.5% сходства последовательностей) Описание этого таксона приведено в разделе 3.2 настоящей работы. Нуклеотидная последовательность одного клона обнаруживала наибольшее сходство (96%) с последовательностью гена 16S рРНК 'Nostocoida limicola IIP Ben 224, таксономически ^охарактеризованного планктомицета из активированного ила (Liu et al., 2001).

13 peat bog clones* ,

Smguhsphaera acidiphila MOB10r J peat bog clone O-Ox-48 i peat bog clone B-Ox-3 1 peat bop clone B-Oi-33 'Notfocoida hmicola III' strain Ben224 peat bog clone O-Ox-54

peat bog clone O-Qx-47 peat bog clone O-Ox-5 peat bog clones*

peat bog clone B-An-24 peat bog clone B-An-2 5

hocphaeta pallida DSM9630T I peat bog clone B-An-2 I peat bog clone B-An-6 iix> peat bog clone B-An-17 I peat bog clone B-An-11 J Zavarztnella jormosa' isolate A10

1- Gemmata-Uke isolate JW10-3f1

peat bog clone O-Ox-18 peat bog clone-B-Ox-37 peat bog clones* Gemmata obicuriglobus UQM 2246T Gemmata-hke strain Schlesner 633 Gemmata-like strain JW9-3fl peat bos clone B-An-26 peat bog clone O-Ox-24 peatbog clone B-Ox-42

peat bog clones*

peat bog clone B-Ox-44 ¿Sr peat boc clone B-An-21

'- Sphagnum peat bog clone Molly75

peat boc clone B-An-ls peat Dog clonc B-An-29

— forested wetland clone FW123 peat bog clone B-An-1

peat clone B86 peat bog clone B-An-16 peat bos clone B-An-20 j— peat bog clone O-Ox-17 1— peat bog clone O-Ox-3 peat bog clone B-An-19

— peat bog clone B-An-30 peat bog clone B-An-8

Sphagnum peat bog clone Molly 19 alastopirellula marina 1J-AM1313 Pirelhtla italeyi DSM6068

^peat bog clone B-An-22 peat bog clone B-Ox-34 Sen Ie.s Her i a paludicola MPL7 at bog clone O-Ox-53 t bog clone O-Ox-51 it bog clone O-Ox-lO r.it bog clone O-Ox-22 Plane tomyces hmnophilus DSM3776T Planctomvces biasihensis DSM53057 Planctomyces maris DSM8797T 'Anammox' group

ShM17 ShH29

peat bog clone B-An-5 peat clone B39 peat bog clone O-Ox-37 peat bog clone B-An-13

Рис. 3. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа клонированных нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК болотных плаиктомицетов и других представителей Р1ап&отусе(е5. Клоны, полученные из аэробного и микроаэробно-анаэробного слоев профиля болота Бакчарское, имеют обозначения В-Ох и В-Ап, соответственно. Клоны, полученные из аэробного слоя профиля болота Обуховское, обозначены как О-Ох. В качестве внешней группы использована нуклеотидная последовательность гена 168 рРНК СМогоЫит 1ипко!а. Маркер - 0.1 замещений на нуклеотидную последовательность. *- группы клонов генов 168 рРНК из торфа аэробного слоя (0-10 см) профиля болот Бакчарское (В-Ох) и Обуховское (О-Ох). Цифры внутри трапеций означают число клонов в данной группе. Скобками показаны спектры детекции зондов, использованных в настоящей работе.

А) Б) В)

Рис. 4. Состав библиотеки клонов генов 16в рРНК планктомицетов в образцах торфа из аэробной и микроаэробно-анаэробной части болотного профиля: (А) и (Б) аэробный слой (0-10 см) торфа болот Обуховское и Бакчарское, соответственно; (В) микроаэробно-анаэробный слой (30-40см) профиля болота Бакчарское.

Вторая по численности (от 26 до 35% их общего числа) группа клонированных последовательностей генов 168 рРНК принадлежала к филогенетическому кластеру рода Сетта/а. Последовательности этой группы клонов обнаруживали отдаленное сходство (86.9-91.6%) с последовательностью генов 16Б рРНК СеттШа оЪ$сип%1оЬж.

Четыре клона обнаруживали высокое сходство (98.0-98.8%) с последовательностью гена 16Б рРНК ацидофильного планктомицета ЗсЫеьпепа ра!исИсо1а. Этот организм также был выделен из кислого сфагнового торфа, а его описание приведено в разделе 3.1 настоящей работы. Помимо этого, из торфа болота Обуховское были получены два клона, относящиеся к группе рода Р1ге1Ша, но обнаруживающие весьма отдаленное сходство (88.7-90.2%) с последовательностями генов 16Б рРНК таксономически описанных представителей этой группы.

Таким образом, в торфе аэробной части профиля сфагновых болот нами были выявлены планктомицеты, относящиеся к филогенетическим группам родов Isosphaera-Singulisphaera, Сетта1а, БсЫеъпег'ш и Ри-е11и1а. В полученных библиотеках клонов доминировали последовательности ЬозрИаега- подобных организмов. За исключением клонов, близких к БсЫезпепа ра1исИсо1а, уровень сходства выявленных в торфе последовательностей генов 168 рРНК с таковыми у таксономически охарактеризованных планктомицетов составлял от 87 до 96%.

2.2. Разнообразие планктомицетов в микроаэробно-анаэробной части болотного профиля. Для анализа разнообразия планктомицетов в микроаэробно-анаэробной части болотного профиля был использован торф, отобранный с глубины 30-40 см болота Бакчарское, Томской области. Состав библиотеки клонов генов 16Э рРНК, полученных из этого образца, представлен на Рис. 4В.

Большая часть клонированных последовательностей (45%) принадлежала к группе, представленной родом Р1ге11и1а. Эти клоны обнаруживали лишь очень отдаленное сходство (85.7-89.7%) с последовательностями генов 168 рРНК таксономически описанных представителей этой группы планктомицетов и значительно большее сходство (95.2-98.7%) с последовательностями клонов Мо11у75

(AY775524), Molly 19 (AY775494) и B86 (AM 162476), полученных ранее из сфагновых болот США и России (Morales et al., 2006; Dedysh et al., 2006).

Вторая по численности группа клонированных последовательностей принадлежала к группе Gemmata-'Zavarz'mella', обнаруживая отдаленное сходство (86.3-89.8%) с Gemmata obscuriglobus. Четыре клона относились к кластеру, образованному ацидофильным планктомицетом 'Zavarzinella formosa', недавно выделенным из сфагнового торфа (Kulichevskaya et al., в печати). Уровень сходства этих последовательностей с таковой гена 16S рРНК 'Zavarzinella formosa' был очень высок и составлял 99.5-99.7%. Минорные группы клонов были представлены последовательностями планктомицетов группы lsosphaera-Singulisphaera (15% клонов) и Schlesnerla (5% клонов).

Таким образом, разнообразие планктомицетов в торфе микроаэробно-анаэробной части болотного профиля значительно отличалось от такового в его аэробной части. Большинство клонированных последовательностей генов 16S рРНК планктомицетов, полученных из торфа слоя 0-10 см, принадлежали представителям группы lsosphaera-Singulisphaera, тогда как в торфе слоя 30-40 см наиболее многочисленную группу клонов составляли последовательности генов 16S рРНК группы рода Pirellula Как в аэробной, так и в анаэробной части профиля существенную часть клонов составили последовательности планктомицетов группы Gemmata

2.3. Дифференцированная оценка численности отдельных групп планктомицетов и их распределения по профилю болота. Так как состав библиотек клонов не всегда точно отражает численное соотношение отдельных организмов в составе изучаемого микробного сообщества, с помощью метода FISH была проведена дифференцированная оценка популяционной плотности отдельных групп планктомицетов в образцах торфа, отобранных по профилю болота Бакчарское. Спектр использованных зондов включал зонд NLIMIII 301, обладающий групповой специфичностью для представителей группы lsosphaera-Singulisphaera (Liu & Seviour, 2001), а также разработанные в настоящем исследовании новые зонды, специфичные к выделенным из болот ацидофильным планктомицетам - Schlesneria paludicola, Smgulisphaera acidiphila, 'Zavarzinella formosa' и отдельным группам клонов генов 16S рРНК планктомицетов, выявленным в сфагновом торфе (Табл. 2; Рис. 3). Так как в числе клонов, полученных с применением праймеров Pla-46F и Univ-1390R, были 3 последовательности, не принадлежащие планктомицетам (клоны группы ОРЗ), для них был разработан отдельный зонд, В39-620, который также был применен для анализа торфа.

Численность клеток, выявленных гибридизацией с зондами PLA46+PLA886, снижалась вниз по профилю от 5.1><107 до 0.6ХЮ7 клеток г"1 торфа (Рис.5А). Применение зонда В39-620, разработанного для целей специфической детекции

Численность клеток, N><10'' гсырого торфа

Рис. 5. Распределение численности клеток плапктомицетов, выявленных в торфе путем гибридизации с группо-специфичными зондами, по профилю сфагнового болота Бакчарское: (А) общая численность представителей Р1апс1отусе1ех (черный цвет), группы-кандидата ОРЗ (белый цвет), группы Ьохркаеп^пщиШриаега (серый); (Б) '2а\'аг7,шеИа' *рр. (белый с точками), ЗсЫевпепа $рр. (серый), РЬеНиЫ врр. (черный).

населяющих болота представителей группы-кандидата ОРЗ, показало, что обнаруживаемые им клетки также имеют шаровидную форму, а их численность варьирует в диапазоне 0.6-4.6x106 клеток г'1 торфа, составляя от 9 до 20% числа клеток, выявляемых зондами РЬА46+РЬА886. Природа микроорганизмов группы ОРЗ пока неизвестна, но они, по всей видимости, не могут быть отнесены к планктомицетам. Так как они попадают в спектр детекции зонда РЬА46, расчет численности клеток планктомицетов в образцах торфа был скорректирован и производился по разнице числа клеток, выявляемых зондами РЬА46+РЬА886 и зондом В39-620: Кланктом1щетов = ^ЬА46+Р1_А886 - N039.620- В итоге, диапазон варьирования популяционной плотности представителей Р1апс1отусе1ея в исследуемом профиле составил 0.5-4.6x107 клеток г"1 торфа. Максимум численности планктомицетов (4.6x107 клеток г"1 торфа) был приурочен к верхнему слою (0-10 см) аэробной части болотного профиля. Вглубь по профилю численность планктомицетов снижалась, но на глубине 30-40 см находился второй локальный максимум плотности Р1апс1отусе1ез (0.9х107 клеток г"1 торфа).

Применение зондов, специфичных для отдельных групп планктомицетов, показало, что наиболее многочисленной была группа (Рис.

5А). Численность ее представителей варьировала в диапазоне 0.1-3.7хЮ7 клеток г"1 торфа, а характер ее профильного распределения был аналогичен таковому для общего числа планктомицетов. Численность представителей рода БсЫеБпепа была максимальна в аэробной части профиля (3.8-5.0х106 клеток г"1 торфа) и резко снижалась под уровнем стояния воды, составляя лишь 0.2x106 клеток г"1 торфа на

А)

Б) 2%

Isosphaera-Singulisphaera

0 'Zavarzinella'

□ Pirellula

□ Schlesneria 0 другие

Рис. 6. Соотношение численности клеток отдельных групп планктомицетов, выявленных методом FISH в образцах сфагнового торфа из аэробной (А) и микроаробно-анаэробной (Б) зон профиля болота Бакчарское. А - слой 0-10 см, Б - слой 30-40 см.

глубине 40-50 см (Рис. 5Б). Популяционная плотность планктомицетов группы Pirellula менялась по профилю незначительно и составляла 1.0-2.1х106 клеток г'1 сырого торфа. Необычный характер распределения по профилю болота, с резко выраженным всплеском популяционной численности (до 4.4x106 клеток г"1 торфа) на глубине 30-40 см, был выявлен для представителей рода 'Zavarzinella'. В остальных слоях профиля численность 'Zavarzinella' была практически одинакова и составляла 1.3-1.8х10б клеток г1 торфа.

Дифференцированная оценка численности отдельных групп планктомицетов позволила более точно оценить структуру сообществ этих бактерий в аэробной и микроаэробно-анаэробной частях болотного профиля (Рис. 6). В торфе аэробной части профиля (Рис. 6А) большинство клеток (80%) принадлежали к группе Isosphaera-Singulisphaera, что соответствовало результатам анализа библиотеки клонов генов 16S рРНК планктомицетов, полученных из этого образца (Рис. 4Б). Вторую по численности группу (10% общего числа выявленных клеток планктомицетов) составляли представители рода Schlesneria. Доли планктомицетов рода 'Zavarzinella'' и группы Pirellula были одинаковы и составляли по 4%. В торфе же микроаэробно-анаэробной части профиля, в месте второго локального максимума численности планктомицетов, доминировали представители рода 'Zavarzinella', составляя 45% общего числа планктомицетов (Рис. 6Б). В этом образце наблюдалось также значительное увеличение доли представителей группы Pirellula (20%), тогда как доля планктомицетов рода Schlesneria, напротив, была очень низкой (2%). Незначительная часть клеток (около 2-3%), не выявленных гибридизацией с использованными в работе зондами, по всей вероятности, принадлежали к группе рода Gemmata, для которой не удалось разработать соответствующий зонд.

Таким образом, дифференцированная оценка численности отдельных групп планктомицетов подтвердила принципиальное различие состава сообществ этих бактерий, населяющих аэробную и микроаэробно-анаэробную части профиля болота.

3. Характеристика новых таксонов планктомицетов, выделенных из сфагновых болот. В настоящей работе были детально охарактеризованы 7 штаммов планктомицетов, выделенных из сфагнового торфа и представляющих неизвестные ранее таксоны порядка Planctomycetales. Новые изоляты являлись психротолерантными и умеренно ацидофильными организмами, растущими в диапазоне температур от 4 до 32°С и pH 4.2-7.2. Три штамма относились к филогенетической группе, представленной родом Planctomyces, а четыре других штамма - к филогенетической группе, представленной родом Isosphaera, однако они обнаруживали лишь отдаленное родство (около 89-90% сходства последовательностей гена 16S рРНК) с таксономически описанными представителями этих родов. Анализ морфологических, физиологических, хемотаксономических и генотипических характеристик новых изолятов позволил установить их принадлежность к 2 новым родам и 2 новым видам порядка Planctomycetales: Schlesneria paludicola gen. nov., sp. nov. и Singulisphaera acidiphila gen. nov., sp. nov. (Рис. 7).

Singulisphaera acidiphila MOBIO' (A.M850678) Singulisphaera acidiphila P02 Singulisphaera acidiphila MPL1015 Singulisphaera acidiphila BG32

Isosphaera sp. strain Schlesner 640

• 'Nostocoida hmicola III 'strain Ben 224

I«11 'Nostocoida hmicola III 'strain Ben 222 'Nostocoida hmicola III" strain Ben 225

- Isosphaera sp strain Schlesner 657

Isosphaera sp. strain Schlesner 666

- Isosphaera pallida

Gemmata oBscurigiobus Gemmata-like strain Schlesner 633 Gemmata-hke strain JW9-3A Gemmala-like isolate JW10-3fl - 'Zavarzmellaformosa' strain A10

, Schlesneria paludicola MPL7 (AMI62407)

__WM Schlesneria paludicola MOB77

1001 1 " ' 1

_ Schlesneria paludicola SB2

I2i Planctomyces sp. strain Schlesner 638 Planctomyces sp. strain Schlesner 642 Planctomyces hmnophilus I'X) I— Planctomyces maris 1- Planctomyces sp. strain Schlesner 130

— Blastopirellula marina PMIula staleyi

Planctomyces branliensis

Рис. 7. Филогенетическая деидрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК планктомицетов, изолированных из сфагновых болот (выделены жирным шрифтом), и других представителей Р1апс1отусе1е$. В качестве внешней группы использована нуклеотидная последовательность гена рРНК СЫогоЫит Ит1со1а. Маркер -0.1 замещений на нуклеотидную последовательность.

3.1. Характеристика Schlesneria gen. nov. Schlesneria (Schles.ne'ri.a. N.L. fem. n. Schlesneria, в честь немецкого микробиолога Хайнца Шлезнера, внесшего выдающийся вклад в развитие знаний о разнообразии планктомицетов и их экологии).

Представители рода Schlesneria имеют одиночные, собранные попарно или в розетки грамотрицательные клетки эллипсоидной формы (Рис. 8А). Заключены в капсулу. Размножаются почкованием (Рис. 8Б). Материнские клетки неподвижны; дочерние клетки подвижны посредством двух субполярных жгутиков. Один из полюсов клетки покрыт кратеровидными структурами, характерными для клеток планктомицетов, и имеет лимоновидный выступ (Рис. 8В). На поверхности клеток имеются многочисленные фибриллярные выросты. В отличие от представителей рода P/anclomyces, клетки Schlesneria имеют короткие и редко встречающиеся стебельки. На агаризованных средах образуют мелкие (диаметр 1-3 мм) неокрашенные колонии. Аэробные хемоорганотрофы. Предпочтительные субстраты - сахара и N-ацетилглюкозамин. Обладают слабыми гидролитическими свойствами. Каталазо- и оксидазо- положительные. Уреаза отсутствует. Умеренные ацидофилы и мезофилы. Чувствительны к NaCl. Основной хинон - менахинон МК-6. В составе клеток доминируют Ci6:0 и Ci6:iüj7c жирные кислоты. Основные нейтральные липиды- п-Сц полиненасыщенные алкены, п-С26-2.25- и п-С24-2.23-диолы. Содержание пар Г+Ц в ДНК 54.4 - 56.5 моль %. Род принадлежит к филогенетической группе Planctomycetes, порядку Planctomycetales, семейству Planctomycetaceae. Типовой вид- Schlesneria paludicola.

Рис. 8. Морфология и ультрагонкое строение клеток йМетсш ра1шИсо1а МРЬ7Т. Фазово-контрастные микрофотографии клеток в стационарной фазе роста (А), маркер-10 мкм, и почкующихся клеток (Б), маркер - 5 мкм. Электронная микрофотография негативно окрашенных клеток, демонстрирующая полярно расположенные кратеровидные структуры (В), маркер - 0.5 мкм. Ультратонкий срез вегетативной клетки (Г): КС, клеточная стенка; ВЦМ, внутрицитоплазматическая мембрана; П, парифоплазма; Р, рибоплазма; Н, нуклеоид; маркер - 0.5 мкм. Фото В и Г получены Баулиной О.И.

Schlesneria paludicola sp. nov.

Schlesneriapaludicola (pa.lu.di'co.Ia. L.n.palus -udis болото; L. suff. -cola обитатель; N.L. n. paludicola болотный обитатель).

Основные характеристики указаны при описании рода. Клетки длиной 1.3-2.1 мкм и шириной 0.6 - 1.5 мкм (Рис. 8А). В качестве источников углерода используют D-глюкозу, N-ацетилглюкозамин, D-целлобиозу, D-мальтозу, D-сахарозу, D-трегалозу, фукозу и салицин. Гидролизуют фукоидан, хондроитин 6-сульфат, ламинарии, пектин, пуллулан, ксилан и желатин, но не крахмал, лихенан, целлюлозу или хитин. В качестве источника азота используют аммоний, N-ацетилглюкозамин, пептон, дрожжевой экстракт, а также некоторые аминокислоты (аланин, аспартат, глутамин и треонин). В факторах роста не нуждаются. Устойчивы к ампициллину, стрептомицину, хлорамфениколу, линкомицину и новобиоцину, но чувствительны к неомицину, канамицину и гентамицину. Растут при температуре от 4 до 32°С, при оптимуме 15-26°С, и в диапазоне pH 4.2-7.5, при оптимуме 5.0-6.2. Рост ингибируется при содержании NaCl в среде выше 0.5%. Местообитания - кислые болота. Типовой штамм MPL7 = АТСС ВАА-1393 =VKM В-2452 , изолирован из сфагнового торфа болота Бакчарское, Томской обл.

3.2. Характеристика Singulisphaera gen. nov. Singulisphaera (Sin.gu.li.sphae'ra. L. adj. singuli одиночная, отдельная; L. fem. n. sphaera сфера; N.L. fem. п. Singulisphaera, одиночная сферическая клетка).

Грамотрицательные клетки сферической формы, одиночные, в парах или в виде бесформенных агрегатов (Рис. 9А). Размножаются почкованием. Клетки заключены в капсулу. Кратеровидные структуры равномерно распределены по поверхности клеток. Неподвижны. Стебельки отсутствуют. Прикрепляются к поверхностям посредством фибриллярного материала (Рис. 9Б). На агаризованных средах образуют непрозрачные и непигментированные колонии. Аэробные хемоорганотрофы, способные к росту в микроаэробных условиях. Предпочтительные субстраты - сахара и N-ацетилглюкозамин. Способны гидролизовать ряд биополимеров. Имеют каталазу, цитохром-оксидазу и уреазу. Умеренные ацидофилы и мезофилы. Чувствительны к NaCI. Основной хинон - менахинон МК-6. В составе клеток доминируют Ci6o, С,8 ,й>9с и С182<ы6с,12с жирные кислоты. Основные нейтральные липиды - n-C3i полиненасыщенные алкены и сквален. Содержание пар Г+Ц в ДНК 57 8 - 59 9 моль %. Род принадлежит к филогенетической группе Planctomycetes, порядку Planctomycetales, семейству Planctomycetaceae Типовой вид - Singulisphaera acidiphila

Рис. 9. Морфология и ультратонкое строение клеток Singulisphaera aciiliphila. Фазово-контрастные микрофотографии клеток в 10-суточной жидкой культуре (А) и 30-суточной культуре на агаризованной среде (Б); стрелками указан фибриллярный материал («holdfast substance»), обеспечивающий прикрепление клеток к поверхности; маркер - 10 мкм. Сканирующая электронная микрофотография клеток штамма (В): п, почка; маркер - 1 мкм. Электронная микрофотография ультратонкого среза вегетативной клетки штамма МОВЮ1 (Г): КС, клеточная стенка; ВЦМ, внутрицитоплазматическая мембрана; П, иарифоплазма; Р, рибосомы; Н, нуклеоид; маркер - 0.2 мкм. Фото В и Г получены О.И. Баулиной.

Singulisphaera aciiliphila sp. nov.

Singulisphaera acidiphila (a.ci.di'phi.la. N.L. n. acidum кислота L. adj. acidus кислый; Gr. adj. philos любящий; N.L. fern. adj. acidiphila предпочитающий кислые местообитания).

Основные характеристики указаны при описании рода. Клетки диаметром 1.62.6 мкм (Рис. 9). В качестве источников углерода используют D-глюкозу, N-ацетилглюкозамин, D-целлобиозу, D-мальтозу, D-сахарозу, D-трегалозу, D-фукозу, D-фруктозу, D-галактозу, D-лактозу, D-маннозу, D-рамнозу, D-рибозу и салицин. Гидролизуют ламинарин, пектин, хондроитин 6-сульфат, пуллулан, ксилан, лихенан и желатин, но не крахмал, целлюлозу или хитин. В качестве источника азота используют аммоний, N-ацетилглюкозамин, пептон, дрожжевой экстракт, а также некоторые аминокислоты (аланин, аспартат, аргинин, триптофан, глицин, глутамин и треонин). В факторах роста не нуждаются. Устойчивы к ампициллину, стрептомицину, хлорамфениколу, линкомицину, канамицину и новобиоцину, но чувствительны к неомицину и гентамицину. Растут при температурах от 4 до 33°С, с оптимумом при 20-26°С, и в диапазоне рН 4.2-7.5, с оптимумом при 5.0-6.2. Рост ингибируется при содержании NaCl в среде свыше 0.5%. Местообитания - кислые болота. Типовой штамм МОВЮт =АТСС ВАА-1392Т =VKM B-2454T=DSM 18658т, изолирован из сфагнового торфа болота Обуховское, Ярославская обл.

4. Функциональная роль планктомицетов в микробных сообществах сфагновых болот. В ходе недавних исследований планктомицеты были обнаружены в качестве одного из основных компонентов целлюлозолитического бактериального сообщества кислых болот, а также сообществ, развивающихся в процессе разложения фитомассы сфагновых мхов (Панкратов и др., 2006; Куличевская и др., 2007). Для выявления роли планктомицетов в этих сообществах был проведен анализ способности изолятов планктомицетов к деградации различных биополимеров, в том числе основных компонентов биомассы сфагнума - целлюлозы, пектина и ксилана.

4.1. Деградация гетерополисахаридов. Исследование метаболического потенциала изолированных из болот чистых культур планктомицетов показало их способность к деградации ряда гетерополисахаридов. Все штаммы обладали способностью гидролизовать пектин, ксилан, ламинарин и хондроитин 6-сульфат. Ни один из изученных болотных планктомицетов не был способен деградировать хитин и целлюлозу при росте в чистых культурах.

4.2. Планктомицеты как компонент целлюлозолитического сообщества.

Анализ структуры сообщества планктомицетов, развивающегося при разложении целлюлозы в кислом торфе, проводили с использованием образца торфяной суспензии, инкубированной с целлюлозой в течение 55 дней при 20°С. Клетки планктомицетов образовывали скопления, покрывающие микрочастицы целлюлозы (РисЛОА-Г). Общая численность планктомицетов в образце составляла 6.0x108 клеток мл"1, что соответствовало 10% от общей численности бактерий и на порядок превышало численность планктомицетов в контроле без внесения целлюлозы.

Дифференцированная оценка численности отдельных групп планктомицетов, развивающихся в целлюлозолитическом сообществе, была проведена методом in situ гибридизации со специфичными зондами (Табл. 2). Наибольшее число клеток планктомицетов (53%) связывалось с зондом, специфичным для представителей группы Isosphaera- Singulisphaera Их численность составила 3.2хЮ8 клеток мл"1. Доля представителей рода 'Zavarzinella' составила 33% общего числа клеток планктомицетов. Третью по численности группу составляли представители рода Schlesneria, популяционная численность которых составила 7% общего числа планктомицетов. Примечательно, что ни один из представителей этих групп планктомицетов, выявленных в составе целлюлозолитического сообщества (hosphaera-Singulisphaera, Schlesneria и 'Zavarzinella'), не был способен к деградации целлюлозы в чистой культуре.

Для выяснения причин высокой численности клеток планктомицетов в целлюлозолитическом сообществе был поставлен модельный опыт, в котором оценивалась возможность развития планктомицета на минеральной среде с целлюлозой в присутствии организма-целлюлозолитика (Рис. 10Д). В качестве последнего была использована культура ацидотолерантного целлюлозолитического стрептомицета Streptomyces sp. штамм ACTR, выделенного Т.А. Панкратовым из

Рис. 10. Выявление клеток планктомицетов в составе целлюлозолитического сообщества: А и В - флуоресцентные микрофотографии гибридизации с СуЗ-мечеными зондами РЬА46 и РЬА886; Б и Г - фазовый контраст. Маркер - 5 мкм. Д - динамика численности клеток .'Ип^аИ^р/шет ас'кИркИи штамм МОВЮ в модельном опыте на среде с целлюлозой в присутствии и в отсутствии культуры целлюлозолитического Ъ/гер/ошусеь «р. штамм ЛСТК.

исследуемого сообщества (Панкратов, Дедыш, в печати). В жидкую среду с целлюлозой вносили культуры планктомицета БищиИзркает ас\сИрЫ\а штамм МОВЮ и стрептомицета Лгер/о/нусез ер. штамм АСТЯ и прослеживали динамику роста планктомицета в ходе инкубации в статических условиях при 20°С в течение 25 суток. Контролем служила аналогичная среда с целлюлозой, инокулированная чистой культурой планктомицета. После 14-дневной инкубации с целлюлозой численность клеток штамма МОВЮ возросла в четыре раза и составила 8.3*108 клеток мл"', тогда как численность клеток данного штамма в контроле осталась без изменения (1.5х108 клеток мл"'). Возможность активного развития в бинарной культуре с целлюлозолитическим стрептомицетом и неспособность к росту на целлюлозе в чистой культуре предполагают вторичную роль планктомицетов в целлюлозолитических сообществах, которая сводится к использованию соединений, образующиеся в ходе разложения целлюлозы организмами-гидролитиками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение традиционных культуральных методов исследования оказывается малорезультативным в случае изучения разнообразия и оценки численности медленно растущих, трудных в культивировании организмов. Представители филогенетической группы Planctomycetes являют собой яркий пример микроорганизмов, исследование экологии которых неэффективно без привлечения молекулярных методов. В настоящей работе для исследования планктомицетов болотных экосистем были применены два различных молекулярных подхода: 1) метод, основанный на экстракции тотальной ДНК с последующей амплификацией генов 16S рРНК целевой группы организмов и оценкой их разнообразия и 2) метод FISH с зондами, специфичными для отдельных групп выявленных в образцах торфа групп планктомицетов. Сочетание этих двух методов позволило не только исследовать разнообразие, но и оценить численность и структуру сообществ планктомицетов in situ. Проведенный молекулярный анализ доказал, что планктомицеты являются неотъемлемым и численно значимым компонентом микробного сообщества северных сфагновых болотных экосистем. Численность клеток планктомицетов в верхнем аэробном слое болотного профиля достигала 6.2x107 г"1 сырого торфа, составляя до 14% общего числа бактерий, выявляемых в торфе методом прямого учета клеток.

Анализ разнообразия представителей Planctomycetes в сфагновых болотах показал, что большинство их филогенетически отличны от описанных ранее планктомицетов и обнаруживают лишь отдаленное родство с известными представителями родов Isosphaera, Gemmata, Planctomyces и Pirellula. Некоторые из выявленных молекулярными методами болотных планктомицетов были изучены и охарактеризованы в настоящей работе. Три изолята, принадлежащие к группе рода Planctomyces, были описаны в качестве нового рода и вида Schlesneria paludicola. Четыре других изолята, обнаруживающие отдаленное родство с планктомицетами рода Isosphaera, были описаны в качестве нового рода и вида Singulisphaera acidiphila. Эти новые планктомицеты способны расти в условиях низких значений pH и температуры, характерных для сфагновых болот. Так как все ранее охарактеризованные представители Planctomycetes были нейтрофилами, способными к росту в диапазоне pH 6.0-8.5, описание первых ацидофильных планктомицетов существенно расширяет спектр известных экофизиологических типов представителей этой малоизученной группы бактерий. Способность ацидофильных планктомицетов к деградации ряда гетерополисахаридов, а также их присутствие в качестве постоянного компонента целлюлозолитических сообществ, что свидетельствует об их участии в процессе деструкции органического вещества в северных болотных экосистемах.

выводы

1. Установлено, что представители филогенетической группы Planctomycetes являются неотъемлемым компонентом микробного сообщества сфагновых болот различного трофического статуса и географического расположения, составляя от 2 до 14% общего числа клеток бактерий. Численность планктомицетов в болотах возрастает при увеличении значений pH болотной воды.

2. Молекулярный анализ показал присутствие в сфагновых болотах планктомицетов, принадлежащих к филогенетическим кластерам родов Isosphaera, Gemmata, Planctomyces и Pirellula Подавляющее большинство (90%) выявленных в торфе последовательностей генов 16S рРНК планктомицетов обнаруживали лишь отдаленное сходство (87-96%) с таковыми у таксономически описанных представителей этой группы.

3. Максимум численности планктомицетов в болотах приурочен к верхней аэробной части профиля, где преобладают представители группы Isosphaera-Smgulisphaera. В некоторых из исследованных болот обнаружен также второй локальный максимум численности клеток планктомицетов в микроаэробно-анаэробной части болотного профиля, где доминируют представители рода 'Zavarzinella\

4. Выделенные из болот штаммы планктомицетов описаны в качестве двух новых родов и двух новых видов порядка Planctomycetales - Schlesneria paludicola gen. nov., sp. nov. и Singulisphaera acidiphila gen. nov., sp. nov. Это первые ацидофильные представители Planctomycetales.

5. Планктомицеты являются важным компонентом гидролитических микробных сообществ сфагновых болот. Функциональная роль исследованных планктомицетов состоит в способности гидролизовать растворимые гетерополисахариды и использовать продукты гидролиза структурных полисахаридов, таких как целлюлоза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Экспериментальные статьи

1. Иванова А.О., Дедыш С.Н. Высокая численность планктомицетов в анаэробных слоях сфагнового болота// Микробиология, 2006, Т. 75. №6, с. 823-827.

2. Kulichevskaya I.S., Ivanova А.О., Belova S.E., Baulina O.I., Bodelier P.L.E., Rijpstra W.I.C., Sinninghe Damste J.S., Zavarzin G.A., Dedysh S.N. Schlesneria paludicola gen. nov., sp. nov., the first acidophilic member of the order Planctomycetales from Sphagnum-dominated boreal wetlands// International Journal of Systematic and Evolutionaiy Microbiology, 2007, V.57 (11), p. 2680-2687.

3. Kulichevskaya I.S., Ivanova A.O., Baulina O.I., Bodelier P.L.E., Sinninghe Damste J.S., Dedysh S.N. Singulisphaera acidiphila gen. nov., sp. nov., a non-filamentous, Isosphaera-like planctomycete from acidic northern wetlands// International Journal of Systematic and Evolutionaiy Microbiology, 2008, V.58 (5), p.l 186-1193.

1. Kulichevskaya I.S., Ivanova A.O., Dedysh S.N. In situ detection and isolation of planctomycetes from Sphagnum peat bogs and humic lakes of Rybinsk Reservoir catchment area, northwestern Russia. Abstracts, European Large Lakes Symposium. 11-15.09.2006. Tartu, Estonia. P. 71.

2. Иванова A.O., Куличевская И.С., Дедыш С.Н. Численность, распределение по профилю и разнообразие планктомицетов в северных сфагновых болотах. Материалы II Международной молодежной шкопы~конферет\ии «Актулъные аспекты современной микробиологии». Москва, ИНМИ РАН. 1-3.11.2006. МАКС Пресс, Москва. С. 58-60.

3. Ivanova А.О., Kulichevskaya I.S. and Dedysh S.N. Abundance and cultured diversity of the Planctomycetes in acidic northern wetlands. Abstracts, l(fh international symposium on wetland biogeochemistry • Frontiers in biogeochemistry 1-4.04.2007. Annapolis, Maryland, USA. P. 35.

4. Ivanova A.O., Kulichevskaya I.S. and Dedysh S.N. Wide distribution of planctomycetes in Sphagnum-dominated wetlands and humic lakes of northern Russia. Abstracts, ]0"' Symposium on Aquatic Microbial Ecology. 2-7.09.2007. Faro, Portugal. P.132.

5. Kulichevskaya I.S., Ivanova A.O. and Dedysh S.N. Novel acidophilic members of the phylum Planctomycetes from northern wetlands. Abstracts, I0'h Symposium on Aquatic Microbial Ecology. 2-7.09.2007. Faro, Portugal. P. 133.

Тезисы

Заказ № 176/10/08 Подписано в печать 21.10 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

ч\ ООО "Цифровичок", тел (495)797-75-76,(495)778-22-20 х / www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванова, Анастасия Олеговна

Часть 1. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель и задачи работы.

Научная новизна и значимость работы.

Практическая ценность.

Апробация работы.

Публикации.

Объем и структура.

Место проведения работы и благодарности.

Часть 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОМ ГРУППЫ PLANCTOMYCETES. И

1.1. Филогения.

1.2. Таксономия планктомицетов.

1.2.1. Таксономически охарактеризованные представители класса Planctomycea.

1.2.1.1. Род Planctomyces.

1.2.1.2. Группа, представленная родами Pirellula-Blastopirellula-Rhodopirellula.

1.2.1.3. Род Gemmata.

1.2.1.4. Род Isosphaera.

1.2.2. Планктомицеты группы «Апаттох».

1.3. Особенности строения клеток планктомицетов.

1.4. Физиология представителей Planctomycetes.

1.5. Хемотаксономические характеристики планктомицетов.

1.5.1. Структура клеточной стенки.

1.5.2. Состав хинонов.

1.5.3. Состав липидов.

1.5.4. Состав ДНК.

1.5.5. Организация генома.

Глава 2. ЭКОЛОГИЯ ПЛАНКТОМИЦЕТОВ.

2.1. Среды обитания.

2.2. Развитие в ассоциациях с водорослями, губками, ракообразными и термитами.

2.3. Экологические функции планктомицетов.

2.4. Исследование экологии и разнообразия планктомицетов с применением молекулярных методов.

Глава 3. ПЛАНКТОМИЦЕТЫ КАК КОМПОНЕНТ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ СФАГНОВЫХ БОЛОТ.

3.1. Биосферная значимость сфагновых болот и их характеристики как местообитания микроорганизмов.

3.2. Выявление планктомицетов в составе микробных сообществ сфагновых болот.

Часть 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Исследования нативного торфа.:.

4.1.1. Образцы торфа, использованные для определения разнообразия и численности планктомицетов.

4.1.2. Молекулярные методы исследования.

4.1.2.1. Оценка разнообразия планктомицетов в болотах путем экстракции тотальной ДНК из торфа и последующего ПЦР-1 анализа.

4.1.2.1.1. Экстракция тотальной ДНК из образцов торфа.

4.1.2.1.2. Экстракция ДНК из микробных клеток.

4.1.2.1.3. ПЦР-амплификация генов 16S рРНК планктомицетов.

4.1.2.1.4. Получение библиотеки клонов генов 16S рРНК планктомицетов.

4.1.2.1.5. Выделение плазмидной ДНК, очистка, секвенирование.

4.1.2.1.6. Филогенетический анализ.

4.1.2.2. Оценка численности планктомицетов в болотах с использованием метода FISH.

4.1.2.2.1. Процедура фиксации образцов торфа.

4.1.2.2.2. Процедура гибридизации фиксированных образцов с

4.1.2.2.3. Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов.

4.1.2.2.4. Создание зондов для специфической детекции отдельных групп болотных планктомицетов.

4.1.2.2.5. Микроскопический анализ.

4.1.2.2.6. Учет клеток микроорганизмов в образцах торфа.

4.2. Изучение чистых культур болотных планктомицетов.

4.2.1. Объекты исследования.

4.2.1.1. Культуры планктомицетов, выделенные из сфагновых болот,,

4.2.1.2. Бактерии, использованные в качестве тест-культур.

4.2.2. Состав питательных сред.

4.2.3. Методы исследования морфологических и физиологических характеристик изолятов.

4.2.4. Аналитические методы.

4.2.5. Трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия.

4.2.6. Определение состава хинонов.

4.2.7. Анализы состава жирных кислот и липидов.

4.2.8. Определение нуклеотидного состава ДНК и ДНК-ДНК гомологии.

4.2.9. Фотодокументирование материалов и обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. ВЫЯВЛЕНИЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕН ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОИ ГРУППЫ PLANCTOMYCETES В СФАГНОВЫХ БОЛОТАХ.

5.1. Численность планктомицетов в сфагновых болотах различного географического расположения и трофического статуса

5.2. Распределение планктомицетов по профилю болот

Глава 6. ОЦЕНКА ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ PLANCTOMYCETES В СФАГНОВЫХ БОЛОТАХ.

6.1. Разнообразие планктомицетов в аэробной части болотного

6.2. Разнообразие планктомицетов в микроаэробно-анаэробной части болотного профиля.

6.3. Дифференцированная оценка численности отдельных групп планктомицетов и их распределения по профилю.

6.3.1. Разработка зондов для детекции болотных планктомицетов.

6.3.2. Применение зондов для дифференцированной оценки численности отдельных групп болотных планктомицетов.

Глава 7. ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ТАКСОНОВ ПЛАНКТОМИЦЕТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СФАГНОВЫХ БОЛОТ.

7.1. Род Schlesneria.

7.2. Род Singulisphaera.

Глава 8. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПЛАНКТОМИЦЕТОВ В МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВАХ СФАГНОВЫХ БОЛОТ.

8.1. Деградация гетерополисахаридов.

8.2. Планктомицеты как компонент целлюлозолитического сообщества

Введение Диссертация по биологии, на тему "Планктомицеты сфагновых болот: филогенетическое разнообразие и экологические функции"

Актуальность проблемы.

Planctomycetes — это обособленная филогенетическая группа в пределах домена Bacteria, объединяющая почкующиеся организмы с необычной морфологией и ультраструктурой клеток, не имеющие пептидогликана в составе клеточной стенки и обладающие рядом характеристик, несвойственных другим бактериям (Konig et al., 1984; Schlesner, Stackebrandt, 1986; Liesack et al., 1986; Fuerst, 1995, 2004; Ward et al., 2006).

Первый представитель этой группы бактерий, Planctomyces bekefii, был описан Гимези в 1924 г. при микроскопическом анализе проб воды (Gimesi, 1924). Этот морфологически уникальный организм является типовым видом рода Planctomyces, однако он до сих пор не получен в культуре, равно как и ряд других видов этого рода. Первый изолят этих сложных в культивировании бактерий удалось получить лишь в 1973 г. Стэйли, применившему для их выделения разбавленные питательные среды (Staley, 1973). В дальнейшем, для выделения планктомицетов был разработан целый ряд сред и подходов, позволивших изолировать представителей этой группы бактерий из различных водных и наземных местообитаний (Schmidt et al., 1978; Schlesner, 1994; Fuerst, 1997; Wang et al., 2002; Elshahed et al., 2007). Тем не менее, до недавнего времени число узаконенных таксонов планктомицетов включало лишь 6 родов (Planctomyces, Gemmata, Isosphaera, Pirellula, Rhodopirellula, Blastopirellula) и 10 видов (Ward et al., 2006).

Физиологическое и метаболическое разнообразие организмов в пределах Planctomycetes остается слабо изученным. Все полученные в чистых культурах планктомицеты являются аэробными хемоорганотрофами. Ряд штаммов способен к сбраживанию углеводов (Hirsch & Muller, 1985; Schlesner, 1986). Знания о существующих метаболических типах планктомицетов были недавно пополнены открытием анаэробных автотрофных представителей этой группы бактерий, осуществляющих процесс анаэробного окисления аммония - «Апашшох» (Strous et al., 1999; Jetten et al., 2005; Kartal et al., 2007). Первоначально, эти организмы были обнаружены в очистных биореакторах, однако дальнейшие исследования с применением молекулярных методов выявили их широкое распространение в морских водоемах и эстуариях (Kuypers et al., 2002; Schmid et al., 2002; Schubert et al., 2006). «Апашшох» - планктомицеты пока не выделены в чистых культурах и имеют статус "Candidatus", однако их характеристики детально изучены. Число известных экофизиологических типов планктомицетов также невелико. За исключением умеренного термофила Isosphaera pallida (Giovannoni et al., 1987b), все известные до недавнего времени планктомицеты являлись мезофиллами и нейтрофилами.

Сложность культивирования планктомицетов долгое время сдерживала накопление знаний об их распространении в природных экосистемах. Считалось, что данные организмы типичны только для водных местообитаний. С введением в практику новых молекулярных подходов, позволяющих идентифицировать микроорганизмы in situ, без их культивирования, было обнаружено, что планктомицеты являются одной из численно репрезентативных групп бактерий как в водных, так и наземных местообитаниях с различными физико-химическими характеристиками (Zarda et al., 1997; Neef et al., 1998; Derakshani et al., 2001; Kirkpatrick et al., 2006). Применение молекулярных методов для исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов сфагновых болот, представляющих одну из доминирующих наземных экосистем Северного полушария, выявило, что планктомицеты являются важным компонентом их микробного сообщества (Dedysh et al., 2006). Это было неожиданной находкой, так как сфагновые болота имеют кислую реакцию среды (рН 3.5-5.5), а все ранее описанные планктомицеты были способны расти в диапазоне рН 6.0-8.5. В ходе дальнейших исследований было получено несколько изолятов болотных планктомицетов (Куличевская и др., 2006), что открывало возможности изучения их физиологии, экологии и природы осуществляемых ими процессов.

Цель и задачи исследования.

Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:

2. Оценить филогенетическое разнообразие планктомицетов в болотах.

3. Охарактеризовать чистые культуры болотных планктомицетов и определить их таксономический статус.

4. Установить функциональную роль планктомицетов в микробных сообществах сфагновых болот.

Научная новизна и значимость работы.

С помощью метода in situ гибридизации с флуоресцентно-мечеными рРНК-специфичными олигонуклеотидными зондами, специфичными для представителей филогенетической группы Planctomycetes (метод FISH), было установлено, что планктомицеты являются неотъемлемым и численно важным компонентом микробного сообщества сфагновых болот севера России, составляя до 14% общей численности бактерий в этих экосистемах.

Впервые осуществлена оценка филогенетического разнообразия планктомицетов в сфагновых болотах путем формирования и анализа библиотеки клонов генов 16S рРНК этих бактерий. Показано, что болотные планктомицеты филогенетически отличны от ранее изученных представителей Planctomycetes. Впервые проведена дифференцированная оценка популяционной численности отдельных групп планктомицетов с использованием набора рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов, разработанных для отдельных групп болотных планктомицетов. Выявлено четкое различие состава сообществ планктомицетов, населяющих аэробную и микроаэробно-анаэробную части профиля сфагновых болот.

Описано и узаконено 2 новых рода и 2 новых вида порядка Planctomycetales: Schlesneria paludicola gen. nov., sp. nov. и Singulisphaera acidiphila gen. nov., sp. nov. Это первые ацидофильные организмы, выявленные в пределах Planctomycetales. Установлена способность ацидофильных планктомицетов к деградации широкого спектра биополимеров - ксилана, пектина, эскулина, пуллулана, хондроитин-сульфата, ламинарина и фукоидана, что свидетельствует об их участии в процессах трансформации органического вещества в кислых болотных экосистемах. Типовые штаммы новых родов и видов депонированы в международных коллекциях микроорганизмов АТСС, DSMZ и ВКМ.

Практическая значимость.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. European Large Lakes Symposium, Tartu, Estonia, 2006.

3. 10-th International Symposium on Wetland Biogeochemistry: Frontiers in Biogeochemistry, Annapolis, Maryland, USA, 2007.

4. 10-th Symposium on Aquatic Microbial Ecology, Faro, Portugal, 2007.

Публикации.

Материалы диссертации содержатся в 8 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 5 тезисах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 134 страницах, включая 18 таблиц, 28 рисунков и списка литературы из 170 наименований, из них 13 - на русском и 157 на английском языке.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Иванова, Анастасия Олеговна

выводы

2. Молекулярный анализ показал присутствие в сфагновых болотах планктомицетов, принадлежащих к филогенетическим кластерам родов Isosphaera, Gemmata, Planctomyces и Pirellula. Подавляющее большинство (90%) выявленных в торфе последовательностей генов 16S рРНК планктомицетов обнаруживали лишь отдаленное сходство (87-96%) с таковыми у таксономически описанных представителей этой группы.

3. Максимум численности планктомицетов в болотах приурочен к верхней аэробной части профиля, где преобладают представители группы Isosphaera-Singulisphaera. В некоторых из исследованных болот обнаружен также второй локальный максимум численности клеток планктомицетов в микроаэробно-анаэробной части болотного профиля, где доминируют представители рода 'Zavarzinella'.

4. Выделенные из болот штаммы планктомицетов описаны в качестве двух новых родов и двух новых видов порядка Planctomycetales — Schlesneria paludicola gen. nov., sp. nov. и Singulisphaera acidiphila gen. nov., sp. nov. Это первые ацидофильные представители Planctomycetales.

5. Планктомицеты являются важным компонентом гидролитических микробных ■ сообществ сфагновых болот. Функциональная роль исследованных планктомицетов состоит в способности гидролизовать растворимые гетерополисахариды и использовать продукты гидролиза структурных полисахаридов, таких как целлюлоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение традиционных культуральных методов исследования оказывается малорезультативным в случае изучения разнообразия и оценки численности медленно растущих, трудных в культивировании организмов. Представители филогенетической группы Planctomycetes являют собой яркий пример микроорганизмов, исследование экологии которых невозможно без привлечения молекулярных методов. В настоящей работе для исследования планктомицетов болотных экосистем были применены два различных молекулярных подхода: 1) метод, основанный на экстракции тотальной ДНК с последующей амплификацией генов 16S рРНК целевой группы организмов и оценкой их разнообразия и 2) метод FISH с зондами, специфичными для отдельных групп выявленных в образцах торфа планктомицетов. Сочетание этих двух методов позволило не только исследовать разнообразие, но и оценить численность и структуру сообществ планктомицетов in situ. Проведенный молекулярный анализ доказал, что планктомицеты являются неотъемлемым и численно значимым компонентом микробного сообщества северных сфагновых болотных экосистем. Численность клеток планктомицетов в верхнем

7 1 аэробном слое болотного профиля достигала 6.7x10 г" сырого торфа, составляя до 14% общего числа бактерий, выявляемых в торфе методом прямого учета клеток.

Анализ разнообразия представителей Planctomycetes в сфагновых болотах показал, что большинство их филогенетически отличны от описанных ранее планктомицетов и обнаруживают лишь отдаленное родство с известными представителями родов Isosphaera, Gemmata, Planctomyces и Pirellula. Некоторые из выявленных молекулярными методами болотных планктомицетов были изучены и охарактеризованы в настоящей работе. Три изолята, принадлежащие к группе рода Planctomyces, были описаны в качестве нового рода и вида Schlesneria paludicola. Четыре других изолята, обнаруживающие отдаленное родство с планктомицетами рода Isosphaera, были описаны в качестве нового рода и вида Singulisphaera acidiphila. Эти новые планктомицеты способны расти в условиях низких значений рН и температуры, характерных для сфагновых болот. Так как все ранее охарактеризованные представители Planctomycetes были нейтрофилами, способными к росту в диапазоне рН 6.0-8.5, описание первых ацидофильных планктомицетов существенно расширяет спектр известных экофизиологических типов представителей этой малоизученной группы бактерий. Способность ацидофильных планктомицетов к деградации ряда гетерополисахаридов, а также их присутствие в качестве постоянного компонента целлюлозолитических сообществ свидетельствует об их участии в процессе деструкции органического вещества в северных болотных экосистемах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Анастасия Олеговна, Москва

1. Вомперский С.Э., Цыганова О.П., Ковалёв А.Г., Глухова Т.В., Валяева Н.А. Заболоченность территории России как фактор связывания атмосферного углерода// Круговорот углерода на территории России. М.: Изд-во Моск. Правительства, 1999. С. 124-145.

2. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии. М.: Наука. 1984.

3. Головченко А.В., Полянская Л.М., Добровольская Т.Г., Васильева Л.В., Чернов И.Ю., Звягинцев Д.Г. Особенности пространственного распределения и структуры микробных комплексов болотно-лесных экосистем//Почвоведение. 1993. № 10. С. 78-89.

4. Головченко А.В., Семёнова Т.А., Полякова А.В., Ипишева Л.И. Структура микромицетного комплекса олиготрофных торфяников южно-таёжной подзоны Западной Сибири// Микробиология. 2002. Т. 71. № 5. С. 667-674

5. Добровольская Т.Г., Полянская Л.М., Головченко А.В., Смагина М.В., Звягинцев Д.Г. Микробный пул в торфяных почвах // Почвоведение. 1991. № 7. С. 69-76.

6. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: ИКЦ "Академкнига", 2002. 202 с.

7. Заварзин Г. А. Почкующиеся бактерии// Микробиология. 1961. Т. 30. С. 952-975.

8. Куличевская И.С., Панкратов Т.А., Дедыш С.Н. Выявление бактерий филогенетической группы Planctomycetes в сфагновых болотах с помощью молекулярных и культуральных подходов// Микробиология. 2006. Т. 75. № з. с. 389-396.

9. Куличевская И.С., Белова С.Э., Кевбрин В.В., Дедыш С.Н, Заварзин Г.А. Анализ бактериального сообщества, развивающегося при разложении сфагнума. //Микробиология. 2007. Т. 76. № 5. С. 702-710.

10. Ю.Панкратов Т.А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия прокариотных микроорганизмов в сфагновых болотах с использованием метода FISH// Микробиология. 2005. Т. 74. № 6. С. 722-728.

11. Панкратов Т.А., Дедыш С.Н., Заварзин Г.А. Ведущая роль представителей Actinobacteria в процессах аэробной деструкции целлюлозы в сфагновых болотах// ДАН. 2006. Т. 410. № 4. С. 438-442.

12. Панкратов Т.А., Дедыш С.Н. Целлюлозолитические стрептомицеты из сфагновых болот и факторы, определяющие их активность// Микробиология. (В печати).

13. Разумов А.С. Gallionella kljasmiensis (sp. п.) как компонент бактериального планктона// Микробиология. 1949. Т. 18. №5. С. 442-446.

14. Amann R.I., Krumholz L., Stahl D.A. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology// J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 762-770.

15. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation// Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143-169.

16. Arrigo K. R. Marine microorganisms and global nutrient cycles// Nature. 2005. V.437. P. 349355.

17. Bauer M., Lombardot Т., Teeling H., Ward N.L., Amann R., Glockner F. Archaea-like genes for C-l-transfer enzymes in Planctomycetes: phylogenetic implications of their unexpected presence in this phylum// J. Mol. Evol. 2004. V. 59. P. 571-586.

18. Bauld J., Staley J.T. Planctomyces maris sp. nov.: a marine isolate of the Planctomyces-Blastocaulis group of budding bacteria// J. Gen. Microbiol. 1976. V. 97. P. 45-55.

19. Bomar D., Giovannoni S., Stackebrandt E. A unique type of eubacterial 5S rRNA in members of the order Planctomycetalesll J. Molec. Evol. 1988. V. 27 (2). P. 121-125.

20. Boschker H.T.S., Nold S.C., Wellsbury P., Bos D., de Graaf W., Pel R., Parkes R.J., Cappenberg Т.Е. Direct linking of microbial populations to specific biogeochemical processes by 13C-labelling of biomarkers//Nature. 1998. V. 392. P. 801-805.

21. Boschker H.T.S., de Graaf W., Koster M., Meyer-Reil L.A., Cappenberg Т.Е. Bacterial populations and processes involved in acetate and propionate consumption in anoxic brackish sediment// FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 35. P. 97-103.

22. Bowman J.P., McCuaig R.D. Biodiversity, community structural shifts, and biogeography of prokaryotes within Antarctic continental shelf sediment// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 2463-2483.

23. Brummer I.H.M., Felske A.D.M., Wagner I. Diversity and seasonal changes of uncultured Planctomycetales in river biofilms// Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 5094-5101.

24. Buckley D., Huangyutitham V., Nelson T.A., Rumberger A., Thies J.E. Diversity of Planctomycetes in Soil in Relation to Soil History and Environmental Heterogeneity// Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72 (7). P. 4522 -4531.

25. Chen H.W., Kuspa A., Keseler I.M., Shimkets L.J. Physical map of the Myxococcus xanthus chromosome//J. Bacteriol. 1991. V. 173 (6). P. 2109-2115.

26. Chistoserdova L., Vorholt J.A., Thauer R.K., Lidstrom M.E. C-l transfer enzymes and coenzymes linking methylotrophic bacteria and methanogenic archaea// Science. 1998. V. 281. P. 99-102.

27. Chistoserdova L., Jenkins C., Kalyuzhnaya M.G., Marx C.J., Lapidus A., Vorholt J.A., Staley J.T., Lindsrom M.E. The enigmatic Planctomycetes may hold a key to the origins of methanogenesis and methylotrophy// Mol. Biol. Evol. 2004. V. 21. P. 1234-1241.

28. Chouari R., Paslier D.L., Daegelen P., Ginestet P., Weissenbach J., Sghir A. Molecular evidence for novel planctomycete diversity in a municipal wastewater treatment plant// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 7354-7363.

29. Collins M.D., Jones D. Distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implication//Microbiol. Rev. 1981. V. 45 (2). P. 316-354.

30. Collins M.D. Analysis of isoprenoid quinones// Methods Microbiol. 1985. V. 18. P. 329-366.

31. Daims H., Brtihl A., Amann R., Schleifer K.-H., Wagner M. The domain-specific probe EUB338 is insufficient for the detection of all Bacteria: Development and evaluation of a more comprehensive probe set// Syst. Appl. Microbiol. 1999. V.22. P. 434-444.

32. Dedysh S.N., Panikov N.S., Tiedje J.M. Acidophilic methanotrophic communities from Sphagnum peat bogs// Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64 (3). P.922-929.

33. Dedysh S.N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S., Liesack W. Phylogenetic analysis and in situ identification of Bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog// Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 2110-2117.

34. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates// Eur. J. Biochem. 1970. V. 12. P. 133-142.

35. Erdmann, V. A., Wolters J. Collection of published 5S, 5.8S and 4.5S ribosomal RNA sequences//Nucleic Acids Res. 1986. V. 14 (Suppl.). P. rl-r59.

36. Fieseler L., Horn M., Wagner M., Hentschel U. Discover у of the novel candidate phylum "Poribacteria" inmarine sponges// Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 3724-3732.

37. Franzmann P. D., Skerman V. B. Gemmata obscuriglobus, a new genus and species of the budding bacteria// Ant. v. Leeuwenhoek. 1984. V. 50 (3). P. 261-268.

38. Freitag Т. E., Prosser J. I. Community structure of ammonia-oxidizing bacteria within anoxic marine sediments// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V.69. P. 1359-1371.

39. Frenzel P., Dedysh S., Karofeld E. Methane oxidation in mudbottoms: rates, localization, and organisms// Abstracts, International Symposium: Structure and function of soil microbiota. 1820.09.2003. Marburg. Germany. P.76.

40. Friedrich А. В., Merkert H., Fendert Т., Hacker J., Hentschel U. Microbial diversity in the marine sponge Aplysina cavernicola (formerly Verongia cavernicola) analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH)// Mar. Biol. 1999. V. 134. P.461-470.

41. Fuerst J.A., Webb R.I. Membrane-bounded nucleoid in the eubacterium Gemmata obscuriglobus!I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P. 8184-8188.

42. Fuerst, J. A. The planctomycetes: emerging models for microbial ecology, evolution and cell biology//Microbiology. 1995. V. 141 (7). P.1493-1506.

43. Fuerst J. A. Planctomycetes: a phylum of emerging interest for microbial evolution and ecology// WFCC Newsletter. 2004. V. 38. P. 1-11.

44. Fuerst J. A. Intracellular compartmentation in planctomycetes// Annu. Rev. Microbiol. 2005. V. 59. P. 299-328.

45. Gebers R., Wehmeyer U., Roggentin Т., Schlesner H., Koelbel-Boelke J., Hirsch P. 1985. Deoxyribonucleic acid base compositions and nucleotide distributions of 65 strains of budding bacteria// Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V. 35 (3). P. 260-269.

46. Geitler L. Torulopsidosira n. gen., ein neuer hefeartiger Pilz, und andere knospende Mikroorganismen//Arch. Mikrobiol. 1955. V. 22. P. 324-334.

47. Geitler L. Die angebliche Cyanophyceae Isosphaera pallida is ein hefeartiger Pilz// Arch. Mikrobiol. 1963. V. 46. P. 238-242.

48. Gimesi N. Planctomyces bekejii Gim. nov. gen. et sp. Hydrobiologiai Tanumalmanyok. 1924. Budapest: Kiadja a Magyar Ciszterci Rend. P. 1-8.

49. Giovannoni S. J., Godchaux W., Schabtach E., Castenholz R. W. 1987a. Cell wall and lipid composition of Isosphaera pallida, a budding eubacterium from hot springs// J. Bacteriol. 1987a. V.169 (6). P. 2702-2707.

50. Giovannoni S. J., Schabtach E., Castenholz R. W. Isosphaera pallida, gen., and comb.nov., a gliding, budding eubacterium from hot springs// Arch. Microbiol. 1987b. V. 147. P.276-284.

51. Glockner F. O., Fuchs В. M., Amann R. Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: A first comparison based on fluorescence in situ hybridization// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65(8). P. 3721-3726.

52. Gorham E. Nothern peatlads: role in carbon cycle and probable responses to climate warming// Ecol.Appl. 1991. V. 1. P. 182-195.

53. Henrici А. Т., Johnson D. E. Studies of freshwater bacteria. II. Stalked bacteria, a new order of schizomycetes// J. Bacteriol. 1935. V. 30. P. 61-93.

54. Hirsch P., Miiller M. 1985. Planctomyces limnophilus sp. nov., a stalked and budding bacterium from freshwater// Syst. Appl. Microbiol. 1985.V. 6, P. 276-280.

55. Hirsch P., Muller M. Methods and sourses for the enrichment and isolation of budding, nonprosthecate bacteria from freshwater//Microbiol. Ecology. 1986. V. 12. P. 331-341.

56. Hugenholtz P., Pitulle C., Hershberger K. L., Pace N. R. Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring// J. Bacteriol. 1998. V. 180 (2). P. 366-376.

57. Ishii K., Mussmann M., MacGregor B.J., Amann R. An improved fluorescence in situ hybridization protocol for the identification of bacteria and archaea in marine sediments// FEMS Microbiol. Ecol. 2004. V. 50. P. 203-212.

58. Jenkins C., Kedar V., Fuerst J. A. Gene discovery within the planctomycete division of the domain Bacteria using sequence tags from genomic DNA libraries// Genome Biol. 2002. V. 3. P. 6.

59. Kahan D. Thermophilic microorganism of uncertain taxonomic status from the hot springs of Tiberias (Israel)//Nature. 1961. V. 192(4808). P. 1212-1213.

60. Kieser H. M., Kieser Т., Hopwood D. A. A combined genetic and physical map of the Streptomyces coelicolor A3 (2) chromosome// J. Bacteriol. 1992. V. 174 (17). P. 5496-5507.

61. Kirkpatrick J., Oakley В., Fuchsman C., Srinivasan S., Staley J.K., Murrey J.W. Diversity and distribution on Planctomycetes and related bacteria in the suboxic zone of the Black Sea// Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 3079-3083.

62. Kivinen E., Pakarinen P. Geographical distribution of peat resources and major peatland complex types in the world// Ann. Acad. Sci. Fennicae A. 1981.V. 132. P. 1-28.

63. Kohler Т., Stingl U., Meuser K., Brune A. Novel lineages of Planctomycetes densely colonize the alkaline gut of soil-feeding termites (Cubitermes spp.)// Environ. Microbiol. 2008. V. 10 (5). P. 1260-1270.

64. Kolbel-Boelke J., Gebers R., Hirsch P. Genome size determinations for 33 strains of budding bacteria// Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V. 35 (3). P. 270-273.

65. Konig E., Schlesner H., Hirsch P. Cell wall studies on budding bacteria of the Planctomyces/Pasteuria group and on a Prosthecomicrobium sp.// Arch. Microbiol. 1984. V. 138. P.200-205.

66. Kremer C., Pettolino F., Bacic A., Drinnan A. Distribution of cell wall components in Sphagnum hyaline cells and in liverwort and hornwort elaters// Planta. 2004. V. 219. P. 1023-1035.

67. Kulichevskaya I.S, Baulina O.I., Bodelier P., Rijpstra W.I.C. Zavarzinella formosa gen. nov., sp. nov., a Novel Stallked, Gemmata-\\ke Planctomycete from Siberian Peat Bog// Int. J. Syst. Evol. Microbiol, (in press).

68. Kuske C. R., Barns S. M., Busch J. D. Diverse uncultivated bacterial groups from soils of the arid southwestern United States that are present in many geographic regions// Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3614-3621.

69. Kuypers M. M.M, Sliekers A. O., Lavik G., Schmid M., Jorgensen В. В., Kuenen J. G., Sinninghe Damste J. S., Strous M., Jetten M. S. Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea// Nature. 2003. V. 422 (6932). P. 608-611.

70. Kuypers M M.M., Lavik G., Woebken D., Schmid M., Fuchs B.M., Amann R., Jorgensen B.B., Jetten M.S.M. Massive nitrogen loss from the Benguela upwelling system through anaerobic ammonium oxidation// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 6478-6483.

71. Leblond P., Redenbach M., Cullum J. Physical map of the Streptomyces lividans 66 genome and comparison with that of the related strain Streptomyces coelicolor A3(2)// J. Bacteriol. 1993. V. 175 (11). P. 3422-3429.

72. Lappalainen E. Global peat resources// International peat Society. 1996. P. 368.

73. Li L., Kato C., Horikoshi K. Bacterial diversity in deep-sea sediments from different depths// Biodivers. Conserv. 1999. V. 8. P. 659-677.

74. Liesack W., Konig H., Schlesner H., Hirsch P. Chemical composition of the peptidoglycan free cell envelopes of budding bacteria of the Pirella!Planctomyces group// Arch. Microbiol. 1986. V. 145. P. 361-366.

75. Liesack W., Stackebrandt E. Occurrence of novel groups of the domain Bacteria as revealed by analysis of genetic material isolated from Australian terrestrial environment// J. Bacteriol. 1992.V. 174. P. 5072-5078.

76. Lindsay M. R., Webb R. I., Fuerst J. A. Pirellulosomes: A new type of membrane-bounded cell compartment in planctomycete bacteria of the genus Pirellula// Microbiology. 1997. V.143. P. 739-748.

77. Lindsay M. R., Webb R. I., Strous M., Jetten M. S., Butler M. K., Forde R. J., Fuerst J. A. Cell compartmentalisation in planctomycetes: novel types of structural organisation for the bacterial cell// Arch. Microbiol. 2001. V. 175 (6). P. 413-429.

78. Liu J.-R., Seviour R.J. Design and application of oligonucliotide probes for fluorescent in situ identification of the filamentous bacterial morphotype Nostocoida limicola in activated sludge// Environ. Microbiol. 2001. V. 3. P. 551-560.

79. Liu J.-R., McKenzie C.A., Seviour E.M., Webb R.I., Blackall L.L., Saint C.P., Seviour R.J. Phyiogeny of the filamentous bacterium 'Nostocoida limicola' III from activated sludge// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 195-202.

80. Llobet-Brossa E., Rossello-Mora R., Amann R. Microbial community composition of Wadden Sea sediments as revealed by fluorescence in situ hybridization// Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64 (7). P. 2691-2696.

81. Lopez-Garcia P., Lopez-Lopez A., Moreira D., Rodriguez-Valera F. Diversity of free-living prokaryotes from a deep-sea site at the Antarctic Polar Front// FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 36 (2-3). P. 193-202.

82. Meyer R.L, Risgaard-Petersen N., Allen D.E. Correlation between anammox activity and microscale distribution of nitrite in a subtropical mangrove sediment// Appl. Environ. Microbiol. 2005.V. 71. P. 6142-6149.

83. Miskin I. P., Farrimond P., Head I. M. Identification of novel ba cterial lineages as active members of microbial populations in a freshwater sediment using a rapid RNA extraction procedure and RT-PCR// Microbiology. 1999. V. 145. P. 1977-1987.

84. Mitchell C.P., Branfireum B.A. Hydrogeomorphic controls on reduction-oxidation conditions across boreal upland-peatland interfaces// Ecosystems. 2005. V. 8. P. 731-747.

85. Mulder A., van de Graaf A.A., Robertson L.A., Kuenen J.G. Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor// FEMS Microbiol. Ecol. 1995. V.16. P. 177184.

86. Neef A., Amann R., Schlesner H., Schleifer K.-H. Monitoring awidespread bacterial group: in situ detection of Planctomycetes with 16S rRNA-targeted probes// Microbiology. 1998. V. 144. P. 3257-3266.

87. Nichols D. S., Nichols P. D., McMeekin T. A. A new П-С31 9 polyene hydrocarbon from Antarctic bacteria// FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 125. P. 281-285.

88. Norris Т. В., Wraith J. M., Castenholz R. W., McDermott T. R. Soil microbial community structure across a thermal gradient following a geothermal heating event// Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68 (12). P. 6300-6309.

89. Owen R. J., Lapage S. P., Hill L. R. Determination of base composition from melting profiles in dilute buffers// Biopolymers. 1969. V. 7. P. 503-516.

90. Pearson A., Budin M., Brocks J. J. Phylogenetic biochemical evidence for sterol synthesis in the bacterium Gemmata obscuriglobus!I Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003. V. 100. P. 15352-15357.

91. Peterson S. N., Fraser С. M. The complexity of simplicity// Genome Biol. 2001. V. 2, P. 2.

92. Quan Z.-X., Rhee S.-K., Zuo J.-E., Yang Y., Bae J.-W., Park J.R., Lee S.-T., Park Y.-H. Diversity of ammonium-oxidizing bacteria in a granular sludge anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) reactor// Environ. Microbiol. 2008. V. 10 (11). P. 3130-3139.

93. Rappe M.S., Giovannoni S.J. The uncultured microbial majority// Annu. Rev. Microbiol. 2003. V. 57. P. 369-94.

94. Ravenschlag K., Sahm K., Pernthaler J., Amann R. High bacterial diversity in permanently cold marine sediments// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P.3982-3989.

95. Reynolds E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy//J. Cell Biol. 1963. V. 17. P. 208-212.

96. Rich J.J., Dale O.R., Song В., Ward B.B. Anaerobic ammonium oxidation (Anammox) in Chesapeake Bay Sediments// Microb. Ecol. 2008. V. 55. P. 311-320.

97. Risgaard-Petersen N., Meyer R.L., Schmid M., Jetten M.S.M., Enrich-Prast A., Rysgaard S., Revsbech N.P. Anaerobic ammonium oxidation in a estuarine sediment// Aquatic Microbial. Ecol. 2004. V. 36. P. 293-304.

98. Roussel Y., Pebay M., Guedon G., Simonet J.M., Decaris B. Physical and genetic map of Streptococcus thermophilus A054// J. Bacteriol. 1994. V. 176 (24). P. 7413-7422.

99. Rysgaard S., Glud R.N., Risgaard-Petersen N., Dalsgaard T. Denitrification and anammox activity in Arctic marine sediments// Limnol. Oceanogr. 2004. V. 49. P. 1493-1502.

100. Schlesner H., Hirsch P. Assignment of ATCC 27377 to Pirella gen. nov. as Pirella staleyi comb, nov.// Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. V. 34 (4). P. 492-495.

101. Schlesner H. Pirelulla marina sp. nov., a budding, peptidoglycan-less bacterium from brackish water// Syst.Appl. Microbiol. 1986. V. 8. P. 177-180.

102. Schlesner H., Stackebrandt E. Assignment of the genera Planctomyces and Pirella to a new family Planctomycetaceae fam. nov., and description of the order Planctomycetales ord.nov.// Syst. Appl. Microbiol. 1986. V. 8. P. 174-176.

103. Schlesner H., Hirsch P. Rejection of the genus name Pirella for pear-shaped budding bacteria and proposal to create the genus Pirellula gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37 (4). P. 441.

104. Schlesner H. Planctomyces brasiliensis sp. nov., a halotolerant bacterium from a salt pit// Syst. Appl. Microbiol. 1989. V. 12. P. 159-161.

105. Schmidt J.M., M.P.Starr. Current sightings, at the respective type localities and elsewhere, of Planctomyces bekefii Gimesi 1924 and Blastocaulis sphaerica Henrici and Johnson 1935// Curr. Microbiol. 1980a. V. 4. P. 183-188.

106. Schmidt J.M., Starr M.P. Some ultrastructural features of Planctomyces bekefii, morphotype I of the Blastocaulis-Planctomyces group of budding and appendaged bacteria// Curr. Microbiol. 1980b. V.4. P. 189-194.

107. Schmidt J.M., Sharp W.P., Starr M.P. Metallicoxide encrustations of the nonprosthecate stalks of naturally occurring populations of Planctomyces bekefii!I Curr. Microbiol. 1982. V. 7. P. 389-394.

108. Schmitt-Wagner D., Friedrich M.W., Wagner В., Brune A. Phylogenetic diversity, abundance, and axial distribution of bacteria in the intestinal tract of two soilfeeding termites (Cubitermes spp.)//Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 6007-6017.

109. Schubert C.J., Edisch-Kaiser E., Wehrli В., Thamdrup В., Lam P., Kuypers M.M.M. Anaerobic ammonium oxidation in a tropical freshwater system (Lake Tanganyika)// Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 1857-1863.

110. Sheng Y., Smith L.C., Glen M.M., Kremenetski K.V., Frey K.E., Velichko A.A., Lee M., Beilman D.W., Dubinin P. A high resolution GIS-based inventory of the west Siberian peat carbon pool// Gl. Bioch. Cycl. 2004. V. 18. P. 1-14.

111. Sinninghe Damste J.S., Strous M., Rijpstra W.I., Hopmans E.C., Geenevasen J.A., van Duin A.C., van Niftrik L.A., Jetten M.S. Linearly concatenated cyclobutane lipids form a dense bacterial membrane//Nature. 2002. V. 419 (6908). P. 708-712.

112. Sirminghe Damste J.S., Rijpstra W.I.C., Schouten S., Fuerst J.A., Jetten M.S.M., Strous M. The occurrence of hopanoids in planctomycetes: implications for the sedimentary biomarker record// Org. Geochem. 2004. Y. 35. P. 561-566.

113. Sittig M., Schlesner H. Chemotaxonomic investigation of various prosthecate and/or budding bacteria // Syst. Appl. Microbiol. 1993. Y. 16, P. 92-103.

114. Stahl D.A., Amann R. Development and application of nucleic acid probes// In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. 1991. Wiley, New York, N.Y. P. 205-248.

115. Stackebrandt E., Ludwig W., Schubert W., Klink F., Schlesner H., Roggentin Т., Hirsch P. Molecular genetic evidence for early evolutionary origin of budding peptidoglycan-less eubacteria//Nature. 1984. V. 307 (5953). P. 735-737.

116. Stackebrandt E., Wehmeyer U., Liesack W. 16S ribosomal RNA- and cell wall analysis of Gemmata obscuriglobus, a new member of the order Planctomycetales// FEMS Microbiol. Lett. 1986. V. 37. P. 289-292.

117. Staley J.T. Budding bacteria of the Pasteuria-Blastobacter group// Can. J. Microbiol. 1973. V. 19(5). P. 609-614.

118. Staley J.T., Marshall K.C., Skerman V.B.D. Budding and prosthecate bacteria from fresh water habitats of various trophic states// Microb. Ecol. 1980. V. 5. P. 245-251.

119. Starr M.P., Schmidt J.M. Planctomyces stranskae (ex Wawrik 1952) sp. nov., nom. rev., and Planctomyces gultaeformis (ex Hortobagyi 1965) sp. nov., nom. rev.// Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. V. 34(4). P. 470—477.

120. Strous M., Fuerst J.A., Kramer E.H., Logemann S., Muyzer G., van de Pas-Schoonen K.T., Webb R., Kuenen J.G., Jetten M.S. Missing lithotroph identified as new planctomycete// Nature. 1999. V. 400 (6743). P. 446-449.

121. Strous M., Jetten M.S.M. Anaerobic oxidation of methane and ammonium// Annu. Rev. Microbiol. 2004. V. 58. P. 99-117.

122. Tal Y., Watts J.E.M., Schreier H.J. Characterization and abundance of anaerobic ammonia oxidizing (anammox) bacteria in biofilters of recirculating aquaculture systems// Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 2896-2904.

123. Thauer R.K. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson// Microbiology. 1998. V.144. P. 2377-2406.

124. Tekniepe B.L., Schmidt J.M., Starr M.P. Life cycle of a budding and appendaged bacterium belonging to morphotype IV of the Blastocaulis-Planctomyces group// Curr. Microbiol. 1981. V. 5. P. 1-6.

125. Thamdrup В., Dalsgaard T. Production of N2 through anaerobic ammonium oxidation coupled to nitrate reduction in marine sediments// Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68 (3). P. 1312-1318.

126. Thamdrup В., Dalsgaard Т., Jensen M.M., Ulloa O., Farias L., Escribano R. Anaerobic ammonium oxidation in the oxygen-deficient waters off northern Chile// Limnol. Oceanogr. 2006. V. 51. P. 2145-2156.

127. Tiuremnov S. N. Peat Deposits. Nedra. Moscow. 1976. P. 487.

128. Trimmer M., Nicholls J.C., Deflandre B. Anaerobic ammonium oxidation measured in sediments along the Thames estuary, United Kingdom// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. p. 6447-6454.

129. Wagner M., Horn M. The Planctomycetes, Verrucomicrobia, Chlamydiae and sister phyla comprise a superphylum with biotechnological and medical relevance// Current Opinion in Biotechnology. 2006. V. 17. P. 241-249.

130. Wang J., Jenkins C., Webb R.I., Fuerst J. A. Isolation of Gemmata-like and Isosphaera-like planctomycete bacteria from soil and freshwater// Appl. Environ. Microbiol., 2002. V. 68 (1). P. 417-422.

131. Ward D.M., Weller R., Bateson M.M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured inhabitants in a natural community//Nature. 1990. V. 345. P. 63-65.

132. Ward N., Rainey F. A., Stackebrandt E., Schlesner H. Unraveling the extent of diversity within the order Planctomycetalesll Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61 (6). P. 2270-2275.

133. Ward-Rainey N., Rainey F.A., Schlesner PI., Stackebrandt E. Assignment of hitherto unidentified 16S rDNA species to a main line of descent within the domain Bacteria// Microbiology. 1995. V. 141. P. 3247-3250.

134. Ward-Rainey N., Rainey F.A., Wellington E.M., Stackebrandt E. Physical map of the genome of Planctomyces limnophilus, a representative of the phylogenetically distinct planctomycetes lineage// J. Bacteriol. 1996. V. 178 (7). P. 1908-1913.

135. Webster N.S., Wilson K.J., Blackall L.L., Hill R.T. Phylogenetic diversity of bacteria associated with the marine sponge Rhopaloeides odorabilell Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67 (1). P. 434-444.

136. Weisburg W.G., Hatch T.P., Woese C.R. Eubacterial origin of chlamydiae// J. Bacteriol. 1986. V. 167. P. 570-574.

137. Woese C.R. Bacterial evolution// Microbiol. Rev. 1987. V. 51 (2). P. 221-271.

138. Zarda В., Hahn D., Chatzinotas A., Schonhuber W., Neef A., Amann, R., Zeyer J. Analysis of bacterial community structure in bulk soil by in situ hybridization// Arch. Microbiol. 1997. V. 168. P.185-192.

139. Zheng D., Aim E.W., Stahl D.A., Raskin L. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies// Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62 (12). P. 4504-4513.

140. Zhou J., Fries M.R., Chee-Sanford J.C., Tiedje J.M. Phylogenetic analyses of a new group of denitrifiers capable of anaerobic on toluene and description of Azoarcus tolulyticus sp. nov.//Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V.45. P. 500-506.

141. Zhou J., Davey M.E., Figueras J.B., Rivkina E., Gilichinsky D., Tiedje J.M. Phylogenetic diversity of a bacterial community determined from Siberian tundra soil DNA// Microbiology. 1997. V. 143. P. 3913-3919.

Информация о работе

Иванова, Анастасия Олеговна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Планктомицеты сфагновых болот: филогенетическое разнообразие и экологические функции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы