Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в термофильных железовосстанавливающих сообществах

Непомнящая, Яна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в термофильных железовосстанавливающих сообществах
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в термофильных железовосстанавливающих сообществах"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

НЕПОМНЯЩАЯ ЯНА НИКОЛАЕВНА

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В ТЕРМОФИЛЬНЫХ ЖЕЛЕЗОВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ СООБЩЕСТВАХ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 НОЯ 2010

Москва, 2010 г.

004613155

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, проф. Нетрусов Александр Иванович

Научный консультант:

доктор биологических наук Слободкнн Александр Игоревич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ножевникова Алла Николаевна

кандидат биологических наук Ботвинко Ирина Васильевна

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская область

Защита состоится 2010 года в 15 ч. 30 мин. на заседании

диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «2[» октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.Ф. Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Железо - четвертый по распространенности химический элемент земной коры. Микробное восстановление Fe(III) является основным путем окисления органического вещества в некоторых пресноводных, морских и почвенных природных экосистемах (Lovley, 1991; Thamdrup, 2000). Термофильные железовосстанавливающие микроорганизмы являются компонентом микробных сообществ термальных экосистем, которые представляют большой интерес для исследования и рассматриваются как аналоги древнейшей биосферы. Процессы, протекающие в них, могут моделировать древнейшие биоценозы (Заварзин, 2001; Stetter, 2006). Термофильные прокариоты, способные восстанавливать Fe(III), могли играть существенную роль в ранней биосфере Земли, вероятно, характеризовавшейся повышенными температурами и высоким содержанием соединений железа (Lovley, 2004; Слободкин, 2005), восстановление Fe(III) микроорганизмами, вероятно, служило первым и основным окислителем органического углерода (Walker, 1987) и могло быть первым возникшим типом метаболизма (Lovley, 2005). Микробная железоредукция оказывает влияние на хозяйственную деятельность человека, участвуя в процессах биокоррозии металлов, оглеение почв, удаление органических загрязнителей, восстановлении токсичных и радиоактивных химических элементов [As(V), Cr(VI), V(V), Tc(VII), U(VI)] с образованием малорастворимых соединений, что может быть использовано при разработке технологий биоремедиации. Минералы, формирующиеся при микробном восстановлении металлов, могут найти применение в современных нанотехнологиях, а также как носители в высокочувствительных методах анализа (Lee and Newman, 2003; Lovley et al., 2004; Chernyh et al., 2007).

Процессы биогенного восстановления Fe(III) включают в себя энзиматические и биотически опосредованные реакции, и осуществляется микроорганизмами из разных филогенетических групп прокариотных доменов: Bacteria и Archaea. Термофильные железоредукторы не представляют собой единой филогенетической группы и к настоящему времени включают в себя представителей более двадцати родов бактерий и шести родов архей (Слободкин, 2005). Для восстановления нерастворимых оксидов Fe(III) в нейтральных средах обитания железоредукторы используют разные физиологические стратегии и биохимические механизмы (Stams et al., 2006; Gralnick and Newman, 2007; Lovley, 2008). Исследования структуры термофильных микробных сообществ, восстанавливающих нерастворимые оксиды Fe(III) в условиях свободного и ограниченного контакта клеток с минералом, важно для расширения знаний о таксономическом и физиологическом разнообразии железоредукторов, понимания взаимодействия клеток и акцептора в природных экосистемах и характеристики таксономических групп прокариот в конкретных физиологических условиях. Детальное исследование физиологических возможностей восстановления оксидов Fe(III) проводилось на представителях мезофильных бактерий родов Shewanella и Geobacter (Reguera et al., 2005; Gorby et al., 2006). Сведения о стратегиях восстановления оксидов Fe(III) у термофильных микроорганизмов ограничены исследованиями гипертермофильных архей рода Pyrobaculum

(Feinberg et al., 2008). Информация о физиологических механизмах восстановления нерастворимых соединений трёхвалентного железа у термофильных бактерий отсутствует. Большинство предыдущих исследований термофильных железовосстанавливающих прокариот базировалось на таксономическом описании отдельных видов бактерий и архей. Изучение филогенетического состава термофильных микробных сообществ, восстанавливающих оксид Fe(Ill) в условиях свободного и ограниченного контакта клеток с минералом до представленного исследования не проводили.

В связи с вышеизложенным, исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов в термофильных железовосстанавливающих сообществах представляет научный и практический интерес.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение филогенетического разнообразия микроорганизмов в термофильных анаэробных сообществах участвующих в процессах микробного восстановления минералов Fe(III). В задачи входило:

Исследовать филогенетический состав прокариот в термофильных накопительных культурах, способных восстанавливать нерастворимый слабокристаллический оксид Fe(III) используя различные физиологические стратегии.

Выделить чистые культуры термофильных микроорганизмов, способных участвовать в восстановлении соединений Fe(III) и исследовать их фенотипические и генотипические свойства.

Охарактеризовать филогенетические группы термофильных прокариот, входящих в состав железовосстанавливающих микробных сообществ, представители которых до настоящего времени не поддавались культивированию.

Научная новизна работы. Впервые проведен филогенетический анализ термофильных железовосстанавливающих микробных сообществ развивающихся при наличии и отсутствии прямого контакта клеток прокариот со слабокристаллическим оксидом Fe(III).

Выделен и охарактеризован новый таксон термофильной бактерии Moorella humiferrea, sp. nov. (DSM 23265T, BKM B-26037) Для нового изолята показана способность восстанавливать нерастворимый оксид Fe(III) с помощью растворимых веществ переносчиков, в частности гуминовых кислот, и установлены минимальные концентрации этих веществ, при которых протекает процесс микробной железоредукции.

В составе железовосстанавливающих микробных сообществ, молекулярными методами выявлены микроорганизмы относящиеся к филогенетическому типу Planctomycetes, анаэробные термофильные представители которого до настоящего времени не поддавались культивированию. Впервые получены устойчивые накопительные культуры термофильных анаэробных планктомицетов. Определены температурные границы и концентрации кислорода, допустимые для роста представителей Planctomycetes.

Полученные результаты расширяют представления о микробном разнообразии термофильных анаэробных железовосстанавливающих сообществ, о функциональных взаимодействиях и физиологических механизмах восстановления нерастворимых минералов Ре(Ш) микроорганизмами в термальных местах обитания. Данные исследования могут послужить основой для разработки методов выделения чистых культур относящихся к новым таксонам прокариот.

Практическое значение. Исследуемые микробные сообщества выделены из уникальных природных экосистем, требующих бережного отношения. Полученные данные являются необходимой базой для дальнейших исследований этих экосистем, а также будут необходимы при выработке эффективных мер по сохранению этих природных объектов от загрязнения. Прокариоты способные к железоредукции и адаптированные к высоким температурам представляют интерес как компоненты искусственно создаваемых сообществ, способных к биодеградации загрязняющих природу веществ в теплом климате, а также как источники термостабильных ферментов, используемых в пищевой промышленности, при очистке сточных вод, в молекулярной биологии.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на XVI, XVII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва 2009, 2010), Международной конференции по биологии термофильных микроорганизмов «ТЬептюрИПез 2009» (Пекин, 2009), V Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009), Международном конгрессе «ЕхиеторЬПез 2010» (Понта-Делгада, 2010), а также на ежегодных аттестациях научных работ кафедры микробиологии, МГУ имени М.В. Ломоносова (2009,2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных

работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 138 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 194 ссылки, содержит 7 таблиц и 31 рисунок.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научным руководителю д.б.н., проф. А.И. Нетрусову и консультанту д.б.н. А.И. Слободкину за внимание, помощь при проведении работы, в интерпретации полученных результатов и подготовке рукописи диссертационной работы. Искреннюю признательность автор приносит всем сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ за предоставление технической базы, помощь в освоении методик, содействие в процессе работы и дружескую поддержку. Особо автор благодарит к.б.н. Г.Б. Слободкину за помощь в освоении методик, постановке и проведении эксперимента и обработке полученных результатов. Автор выражает глубокую признательность

сотрудникам H.A. Кострикиной (ИНМИ РАН), к.б.н. H.A. Черных (ИНМИ РАН), к.б.н. Т.В. Колгановой (Центр «Биоинженерия» РАН), д.б.н. Т.Г. Юдиной (МГУ), к.б.н. Л.Ю. Русину (МГУ) за помощь на отдельных этапах работы. Автор искренне благодарит д.б.н. В.В. Алешина (Институт физико-химической биологии МГУ им. Белозерского) за помощь в проведении филогенетического анализа, ценные советы и доброе отношение. Выражаю признательность к.б.н. В.А. Щербаковой (ИБФМ РАН) за ценные советы и поддержку. Выражаю искреннюю благодарность семье и друзьям за дружескую поддержку.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили образцы воды и осадка из семи наземных гидротерм кальдеры Узон и Долины Гейзеров (Камчатка), отобранные в ходе экспедиции в сентябре 2008 (табл. 1).

Таблица 1. Характеристики природных образцов наземных гидротерм Камчатки, использованных для получения накопительных культур термофильных железовосстанавливающих микроорганизмов._

Обозна чение Место отбора Описание пробы Т,°С рн

1814 Узон, Оранжевое поле Чёрный крупнозернистый осадок из небольшого источника 76-80 6,6

1823 Узон, Восточное поле Серо-чёрный осадок из ист. Трещинный 74-85 6,5

1835 Узон, руч. Извилистый Серый осадок из горячего источника в ложе ручья с отложениями серы и железа по краям 77-86 6,2-6,5

1850 Узон, Восточное поле Чёрный осадок из небольшого источника с белыми нитчатыми обрастаниями 78 6,2

1860 Узон, 03. Фумарольное Бурый глинистый осадок из мелководного источника у края озера 84 6,8

1861 Узон, участок Тростниковый Чёрный осадок из источника с охристыми отложениями 60 6,2

1864 Долина Гейзеров, горячий ручей из гейзера Грот Чёрный осадок из горячего ручья с бурым дном и высшей растительностью по краям 78 7,7

Температура и рН в месте отбора пробы. рН измерен при температуре пробы.

Состав сред и условия культивирования. Для получения и культивирования накопительных и чистых культур термофильных железовосстанавливающих анаэробных микроорганизмов использовали

слабоминерализованную среду, описанную ранее (S¡obodkin et al., 1997), содержащую 0,2 г/л дрожжевого экстракта в качестве фактора роста. Газовая фаза СОг (100%). рН среды 6,8-7,0 (20°С). В качестве донора электронов вносили ацетат (9 мМ) или лактат (14 мМ). Акцептором электронов служил слабокристаллический оксид железа(Ш) (минерал ферригидрит), либо суспендированный в среде [свободный ферригидрит, (конечная концентрация Fe(III) в среде - 90 мМ), либо заключенный в гранулы альгината кальция (конечная концентрация Fe(III) в среде - 70 мМ]. В качестве экзогенного медиатора железоредукции добавляли 9,10-антрахинон-2,6-дисульфонат (АХДС) в количестве 0,1 мМ. Свободный ферригидрит, гранулы альгината с ферригидритом и без последнего получали по методикам описанным ранее (Slobodkin et al., 1997; Nevin et al., 2000). Приготовление сред и культивирование накопительных культур производили с использованием техники культивирования анаэробных микроорганизмов Хангейта (Hungate, 1969).

Изучение морфологии клеток, контроль чистоты культур и оценку роста микроорганизмов проводили прямым микроскопированием (световой микроскоп Микмед 1, JIOMO, с фазово-контрастным устройством).

Электронно-микроскопические исследования*. Препараты

ультратонких срезов для электронно-микроскопических исследований готовили по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Для изучения культур микроорганизмов в сканирующем микроскопе фиксацию проводили 2,5%-ным глутаровым альдегидом. Напыление образцов проводили платиной на приборе фирмы LKB, Швеция. Форму и поверхность исследуемого материала изучали с помощью микроскопов «Атгау» (США) и «CamScan» (Великобритания) при ускоряющем напряжении 20 kV.

♦За проведение электронно-микроскопических исследований автор благодарит K.6.H. H.A. Кострикину (ИНМИ РАН) и д.б.н. Т.Г. Юдину (МГУ им. М.В.Ломоносова).

Культуральные свойства и физиологические особенности чистой культуры нового изолята изучали по общепринятым методикам ( Powell, 1983; Герхард и др.,1984; Boone and Whitman, 1988).

Аналитические методы. Определение летучих жирных кислот и спиртов в продуктах метаболизма определяли по методикам, описанным ранее (Слободкин и др., 1995). Молекулярный водород определяли газохроматографически на хромотографе Chrom 5 (Чехия), детоктор -катарометер, газ-носитель - азот, подвижная фаза - активированный уголь марки АГЗ, минимальный порог чувствительности по водороду - 2-Ю"5 об.%). Концентрацию образующегося Fe(II) измеряли спектрофотометрически с 2,2-дипиридилом (Резников и др., 1970). Нерастворимые формы железа растворяли в оксалатном буфере, как описано ранее (Гаврилов и др., 2003). Определение концентрации H2S проводили колориметрическим методом (Truper and Schlegel, 1964).

Выделение ДНК и определение нуклеотидного состава. ДНК из

накопительных культур выделяли и очищали методом Мармура с некоторыми модификациями (Park, 2007). Фрагменты генов 16S рРНК были получены путем прямой амплификации геномной ДНК согласно известному протоколу ПЦР-амплификации для получения фрагментов ДНК с дальнейшим анализом методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ, Muyizer et al., 1993). Использовали универсальный праймер Uni515F (Lane, 1991), содержащий CG-clamp на 5'-конце (Muyizer et al., 1993) в паре с Bacteria-специфичным праймером Bac-907R (Muyizer et al., 1995) или Archaect-специфичным праймером Arch-915R (Casamayor et al., 2002). Полученные продукты амплификации разделяли с помощью ДГГЭ, проводимому согласно протоколу (Muyizer et al., 1997) с денатурирующим градиентом от 35% до 65%, (где 100% денатурант содержал 7М мочевину и 40% формамид). Фрагменты ДНК из индивидуальных полос, полученных в ходе ДГГЭ, были перенесены в 20 мкл стерильной воды путем пассивной диффузии ДНК из геля в течение ночи при 4°С. Нуклеотидные последовательности ДНК из индивидуальных полос определяли методом ферментативного секвенирования на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems DNA Sequencer 373A, используя стандартный протокол и набор реактивов ("Fluorescent dye Cycle Sequencing kit", "Perkin-Elmer", США). Полученные спектрограммы нуклеотидных последовательностей были отредактированы вручную при помощи программы BioEdit и депонированы в GenBank под номерами НМ003692-НМ003777.

Филогенетический анализ. Идентификацию нуклеотидных последовательностей с последовательностями генов 16S рРНК, содержащимися в базе данных GenBank NCBI проводили при помощи программы BLAST (Altschul et al., 1990). Последовательности, имеющие 100%-ную идентичность фрагментов рибосомальных генов друг с другом включены в анализ и представлены на дереве одним организмом. Нуклеотидные последовательности выравнивали в автоматическом режиме с помощью программы CLUSTALW (Thompson et al., 1994) и корректировали вручную. Построение бескорневых филогенетических деревьев производили с использованием Neighbour-Joining алгоритма в программе MEGA 4,0 (Tamura et al, 2007). В качестве внешней группы была взята последовательность Thermococcus celer, с регистрационным номером в GenBank - AY099174. Для оценки устойчивости топологии полученных деревьев применяли метод bootstrap (1000 альтернативных деревьев). На дендрограммах представлены значения выше 60%.

Определение Г+Ц состава ДНК* проводили по методу Герхарда, основанному на анализе кривых температур плавления ДНК (Герхардт и др.,

1984)._

*3а определение Г+Ц состава ДНК автор благодарит к.б.н. Н.А. Черных (ИНМИ РАН)

Флуоресцентная in situ гибридизация*. Детекцию планктомицетов осуществляли путем гибридизации фиксированных образцов накопительных культур с эквимолярной смесью 16S рРНК-специфичного зонда PLA886, меченого флуоресцентным красителем СуЗ, разработанного для целей

определения представителей филогенетической группы Planctomycetes (Neef et al., 1998). Гибридизацию и окрашивание препаратов ДНК-специфичным флуоресцентным красителем - ДАФИ (4,6-диамидино-2-фенилиндол) проводили согласно методике описанной ранее (Панкратов и др., 2005). Препараты анализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа

Zeiss Axio Imager Dl (Zeiss, Иена, Германия)._

*3а любезно предоставленный зонд автор благодарит д.б.н. С.Н. Дедыш (ИНМИ РАН)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1, Получение железовосстанавливающих накопительных культур.

Для получения накопительных культур анаэробных термофильных железовосстанавливающих микроорганизмов использовали семь проб осадка и воды, отобранных из наземных гидротерм Камчатки (см. табл. 1). В целях исследования физиологических механизмов восстановления Fe(III) использовали три варианта среды, имитирующих возможные взаимодействия микроорганизмов и оксида Fe(III): (1) среда со свободным ферригидритом -возможность прямого контакта клеток с минералом; (2) среда с ферригидритом, включённым в гранулы альгината - отсутствие прямого контакта клеток с минералом; (3) среда с ферригидритом, включённым в гранулы альгината, и добавлением 0,1 мМ 9,10-антрахинон-2,6-дисульфоната (АХДС) - при отсутствии прямого контакта клеток с минералом между ними возможен перенос электронов за счёт экзогенного растворимого медиатора. АХДС -растворимый медиатор железоредукции, способный переносить электроны от клеток микроорганизмов к поверхности нерастворимого акцептора электронов по циклическому механизму за счёт многократных процессов окисления-восстановления (Lovley et al., 1996). В качестве потенциальных доноров электронов для восстановления Fe(III) нами были выбраны ацетат - один из важнейших метаболитов анаэробного разложения органического вещества, и лактат - распространённый продукт брожения термофильных микроорганизмов. Температуры, выбранные для инкубирования (60, 65 и 80°С), были близки к температурам в местах отбора проб.

Общее количество начальных накопительных культур составило 54. После 3 последовательных 5% (об.) пересевов было получено 30 накопительных культур термофильных микроорганизмов (Табл. 2).

В накопительных культурах со свободным ферригидритом образовавшийся чёрный осадок обладал магнитными свойствами. Измерение конечной концентрации Fe(II) после 7-30 суток инкубирования показало наибольшее количество Fe(II) в накопительных культурах со свободным ферригидритом. Накопительных культур, способных к восстановлению такого же количества Fe(III) за счёт образования эндогенных медиаторов, получить не удалось. При отсутствии прямого контакта клеток с ферригидритом, добавление АХДС значительно стимулировало железоредукцию.

2. Филогенетический анализ биоразнообразия накопительных культур термофильных железовосстанавливающих микробных сообществ

Общая характеристика филогенетического состава накопительных культур. Из 22 накопительных культур железовосстанавивающих микробных сообществ была выделена тотальная ДНК, с помощью таксон-специфичных праймеров к доменам Bacteria и Archaea амплифицированы фрагменты генов 16S рРНК, проведено их разделение методом ДГГЭ и определены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК индивидуальных полос.

Таблица 2. Восстановление ферригидрита железовосстанавливающими

накопительными культурами термофильных микроорганизмов из гидротерм Камчатки.

Образец Т Fe(II), ммоль/л*

(см. инкуба Условия культивирования

табл. 1) ции, Свободный Ферригидрит, Ферригидрит,

"С ферригидрит включенный в включённый в

гранулы альгината гранулы альгината, + АХДС

Ацетат Лактат Ацетат Лактат Ацетат Лактат

1814 65 20,3 11,0 6,4 4,9 14,9 23,2

80 - - - - -

1823 80 - - - - - -

1835 80 - - - - - -

1850 65 28,0 14,0 3,6 1,8 20,9 22,0

80 - - - - 5,0 6,4

1860 80 25,6 24,7 - - 2,4 3,5

1861 60 30,0 30,0 10,5 4,3 11,6 18,2

1864 65 30,0 30,0 2,5 4,2 6,8 15,6

"Конечная максимальная концентрация образовавшегося Ре(П) через 7-30 дней инкубации

**- железоредукции не отмечено, концентрация Ре(П) менее 0,1 ммоль/л

Общее количество полученных индивидуальных полос составило 110. После анализа нуклеотидного состава соответствующих полос, нуклеотидные последовательности, имеющие сходство 100% и полученные из одной накопительной культуры, рассматриваются нами как идентичные и относящиеся к одному организму. Для дальнейшего анализа 86 полученных нуклеотидных последовательностей были разделены на три группы. (1) Филотипы, нуклеотидные последовательности которых имеют сходство не ниже 94% с сиквенсами представителей известных культивируемых родов микроорганизмов, и рассматриваемые нами как члены этого рода. Критерий сходства нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК в 93-94% является граничным в современной практике описания новых родов прокариот. (2) Филотипы, имеющие сходство нуклеотидных последовательностей на уровне 90-92% с культивируемыми микроорганизмами. (3) Филотипы, нуклеотидные последовательности которых имеют сходство с сиквенсами культивируемых

микроорганизмов менее 90%, и чьими ближайшими родственниками являются некультивируемые микроорганизмы. Проведённый филогенетический анализ показал, что большинство полученных сиквенсов принадлежат представителям прокариот родственным к термофильным анаэробным бактериям. 65 обнаруженных филотипа могут быть отнесены к 23 родам выделенных и описанных прокариот. Для 21 филотипа наиболее близкородственными являются некультивируемые микроорганизмы. Большинство обнаруженных филотипов бактерий принадлежит к филогенетическому типу Лт/см/е^ (58 сиквенсов, 72%). Также были найдены представители следующих филогенетических типов (в скобках указано количество детектированных сиквенсов): АсйпоЬас1епа (2), Адш/1сае (1), Вас/его/^е/е.? (2), ИШоБркае (1), Р1апсЮтусе1е,<: (3), РшеоЬа^епа (1), ¿р1'гос/1ае1м (1), (2),

ТИегто^ае (10). Наиболее часто встречаются сиквенсы представителей родов бактерий СагЬоху^Жегтт (7) и ТИегтоапаегоЬаМег (7). Археи были представлены 5 сиквенсами представителей родов РугоЪасиЫт, ВезиЦигососсш и ТИегто/йит (все тип СгепагсИае^а). Виды, способные к железоредукции, известны среди родов бактерий СагЬохуёоЛегтш, СагЬохуёосеПа, Пегттсо1а, ПегтоапаегоЬас/ег, ТИегтоИЛоЪаМег, Ткегтоьтиз, ТЪегтоХща, Thermovenabulum и археи РугоЪасиЫт. Количество сиквенсов, относящихся к этим родам, составляет 54% от общего числа полученных сиквенсов.

Различия филогенетического состава при наличии и отсутствии контакта с минералом. Количество детектированных филотипов в накопительных культурах с разными возможностями контакта клеток с минералом составило: свободный ферригидрит — 22 (рис. 1, 2); ферригидрит в гранулах альгината - 32 (рис. 3, 4); ферригидрит в гранулах альгината + АХДС - 32 (рис. 5, 6). При свободном доступе к ферригидриту большинство детектированных микроорганизмов составляют представители родов, для которых показана способность к железоредукции. При отсутствии прямого контакта детектируются как известные железоредукторы, так и организмы, для которых способность к восстановлению Ре(Ш) неизвестна. Наиболее часто в накопительных культурах как при наличии, так и в отсутствие контакта с ферригидритом детектируются представители родов СагЪохуйохиегтш, ТИегтоапаегоЬас1ег и ТИегто^а, которые, очевидно, обладают наиболее эффективными механизмами железоредукции в диапазоне температур 60-70°С. Вероятно, реализация той или иной стратегии железоредукции является специфическим свойством для вида или штамма, а не для всех представителей рода в целом. Именно члены родов СагЬохусЬэЖегтиз и ТкегтоапаегоЪас1ег были первыми описанными железоредукторами из наземных гидротерм (Б1оЬо<Иап й а1., 1997; 1999).

Необходимо отметить, что в средах, содержащих альгинат и АХДС, создаются потенциальные условия для развития микроорганизмов, способных использовать эти вещества в качестве донора или акцептора электронов, т.е. количество экологических ниш в этих условиях выше, чем в среде со свободным ферригидритом. Кроме того, гранулы альгината могут способствовать развитию биоплёнок и стимулировать рост микроорганизмов, требующих прикрепления к поверхности твёрдого субстрата.

кГ 61 J3_F_Ac (HM003702) 71П— 61 _5_F_Ac (HM003704) L Uncultured bacterium clone WC49 (GQ461703) Uncultured bacterium done 071020-ONK-PVA2-6 (FJ037668) Thermincola carboxydiphila (AY603000) 61_7_F_Ac (HM003706) Thermincola ferriacetica (AY631277) — Syntrophobotulus glycolicus (X99706)

- Lutispora thermophila (AB186360) Carbcxydocella thermautdropbica (NR_025660) Carboxydocella sporoproducens (AY673988) Carboxydocella ferrireducens (EF092457) Thermolithobactercarboxydivorans (DQ09S862) 64_2_F_AC (HM003712) Thermolithobacter ferrireducens (AF282254) »J—ei_6_F_Ac (HM003705) , Moorella glycerini (NR_029198) ^— Moorella thermoautotrophica (X77849)

Moorella perchloratireducens (EF060194) lcrj— Carboxydothermus hydrogenoformans (CP000141) I— Carboxydothermus siderophilus (EF542810)

-Thermoanaerobacter uzonensis (FJ360438)

-50_3_F_Ac (HM003694)

n 50_4_F_AC (HM003695) L Thermoanaerobacter tengcongensis (DQ115806) 50_2_F_Ac (HM003693)

Caldanaerohacier hydroihermalis (EF1Э5126)

Caldanaerobacter uzonensis (EFS30068) Thermovenabulum ferriphilus (AY033493) 64_1_F_Ac (HM003711) Thermovenabulum sp. strain R270 (EU443729)

-Uncultured bacterium clone DTB120 (EF205540)

-61_4_F_AC (HM003703)

tTr

— Ceobacterlovleyi (AY914177) Thermanaerovibrio velox (AF161069) 61_1_F_Ac (HM003700)

Thermanaerovibrio sp.strain R101 (FN556061) Thermoanaerovibno acidaminovorans (P001818) 50_1_F_Ac (HM003692) Thermosulfidibacter takaii (AB282756)

61_2_F_Ac (HM003701) Thermotoga lettingae (NR_027542) Thermotoga elfii (NR_026201)

Рисунок I. Филогенетическая дендограмма, построенная на основе сравнения генов 16Б рРНК бактерий для накопительных культур с суспендированным в среде ферригидритом и ацетатом (филотипы, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом, номера вепБапк представлены). Масштабная линейка - 10% различия последовательностей.

Г Carboxydocella thermautotrophica (NR_025660) P— Carboxydocella sporoproducens (AY673988)

64_1_F_L (HM003713) L- Carboxydocella ferrireducens (EF092457) -Lutispora thermophila (AB186360)

61_4_F_L (HM003710)

d61-

T—й

Syntnophobotulus glycolicus (X99706) 61_3_F_L (HM003709)

Moorella glycerini (NRJD29198) i— Moorella thermoautotrophlca (X77849) '-Moorella perchloratireducens (EF060194) , 50_3_F_L (HM003698)

'-Thermoanaerobacter uzonensis (FJ360438)

1шГ

JCE

Thermoanaerobacter tengcongensis (DQ115806) L Thermoanaerobacter subterraneus (EU109461) г Catdanaerobacter hydrothermalis (EF195126) | 501F L (HM003696) 7tL Caldanaerobacter uzonensis (EF530068)

-50_2_F_L (HM003697)

^г-Carboxydothermus hydrogenoformans (CP000141) L Carboxydothermus siderophitus (EF542810) Thermovenabulum ferriphilus (AY033493) Thermovenabuhm sp. strain R270 (EU443729)

— Thermanaerovibrio velox (AF161069)

— 61_1_F_L (HM003707)

дз1— Thermoanaerovibrio acidaminovorans (P001818) L Thermanaerovibrio sp. strain R101(FN556061) ■ 61_2_F_L (HM003708) - ®

эГп

I— i

10%

Thermotoga lettingae (NR_027542) Thermotoga etfii (NR_026201)

Рисунок 2. Филогенетическая дендограмма, построенная на основе сравнения генов 168 рРНК бактерий для накопительных культур с суспендированным в среде ферригидритом и лактатом (филотипы, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом, номера ОепВапк представлены). Масштабная линейка -10% различия последовательностей.

В присутствии альгината и Ре(Ш) в устойчивых накопительных культурах в большом количестве обнаружены микроорганизмы, имеющие лишь отдалённое родство с известными культивируемыми видами. Полученные результаты могут послужить основой для разработки методов выделения чистых культур, относящихся к новым таксонам.

L-=f

61_4_FG_Ac (HNI003729)

Caloramator viterhiensis (NR_025044) Caloramatorproteoclastkus (NR_026265)

-Uncultured bacterium clone ELAND 40 (AY858502)

2_FG_Ac (HM003727) di- 50_6_FG_AC (HM003719) — Caldicellulosiruptorsaccharolyticus (CP000679)

- Caldanaerobium fijiensis (EF507903)

- 61_5_FG_Ac (HM003730)

Mahella australiensis (NR_025758)

J0J|— 64_6_FG_Ac (HM003742)

'-Gelria glutamics (AF321Q86)

69J-Moorella glycerini (NR_029198)

Bf-50_3_FG_ Ac (HM003716)

mni— Moorella thermoautotrophica (X77849) L Moorella perchloratireducens (EF060194)

Uncultured bacterium done D2 (AY526501) 61_3_FG_Ac (HM003728) 50j4_FG_Ac (HM003717) Uncultured bacterium done D21R45C97 (FM956859) 64_5_FG_AC (HM003741)

jxi- Uncultured done SHBZ1659 (EU638507)

'-64_3_FG_Ac (HM0Q3739)

991—50_5_FG_AC (HM003718) led '— Thermoana erobacter uzonensis (FJ360438)

'-Thermoanaembacter subterráneas (EU109461)

-64_2_FG_AC (HM003738)

741- Carboxydothermus hydrogenoformans (CP000141) "I- Carboxydothermus siderophllus (EF542810) Thermovenabulum femphilus (AY033493) Caldanaerovirga acetigignens (EF530069) 64_1_FG_AC (HM003737) S0J_FG_Ac (HM003714) Thermodesulfovibrio hydrogertiphilus (EF081294) Thermodesulfovibrio aggregans (AB021302) Thermodesulfovibrio thiophilus (AB231857) 50_2_FG_AC (HM003715) Thermodesulfovibrio islandicus (NR_026321) Thermodesulfovibrio yellowstonii Blastopirellula marina (X62912)

Pirellula staleyi (M34126) Unidentified Planctomvcetaies OPB17 (AF027057) Uncultured bacterium doneHAW-R60-B-1249d-F (FN436200)

-50_7_FG_AC (HM003720)

93-61_6_FG_AC (HM003731)

1-64_7_FG_AC (HM003743)

64_4_FG_Ac (HM003740) Thermotoga hypogea (NR_029205) 61_1_FG_AC (HM003726) Thermotoga lettingae (NR_027542) Thermotoga elfii (NR_026201)

Рисунок 3. Филогенетическая дендограмма, построенная на основе сравнения генов 168 рРНК бактерий для накопительных культур с ферригидритом, заключенным в гранулы альгината, и ацетатом (филотипы, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом, номера вепБапк представлены).. Масштабная линейка - 10% различия последовательностей.

МоогеНа д!усепЫ (Ш_029198) 1001 '—МоогеНа тиШеп (АР487538) 97150 4 Рв_1. (НМ003724) "-61~3 рв I. (НМ003734) ды—643_РС_1 (НМ003745) \_щ-Сатоху<1осе11а Я^егтаи1ЫгорЫса (NR_025660) I- СагЬохуёосеИа 1етге<!исеп^ (ЕГ092457) 61_4_РО_1. (НМ003735) ТЬегто51пи$ сагЬохусЛюгапз (АУ519200) юр г— 61_5_Рв_Ь (НМ003736)

Са/огата?огсоо№аа5)У (М!*_024955) 1001 Р1апШ1ит МдМит (АВ088361)" ' НапШит уиппапепзе Ш0119659) 54_1_Рв_Ь (НМ003744) СагЬохуёо(Ьегтиз Ьус1годепок>гтапз (СР000141 50_3_Рв_Ь (НМ003723) 103,50-5^0-1- (НМ003725)

~ТЬегтоапаеюЬас(ег игопепв/з ^360438) Г50-2-р<!-1- (НМ003722) э°100г-ТЬвгтоапаеюЬасАегзиЫепапеиз (Еи 109461) эдП- ТЬеппоапаегоЬаЫег ¡епдсопдепв^з (00115806) _1_РС_1- (НМ003721) -СаМапаегоЬаЫег ЬуёгЫЬегтаНз (ЕЯ195126) юс,—61_1_РО_1. (НМ003732)

ипсиНигес! с!опв 5НВ21659 (Еиб38507)

ТЬегтсЛода Ьуродеа (N1? 029205)

-61_2_Рв_и (НМ003733)

ПегтЫода /еНтдае (ЫН_027542) ПегтЫода е/й:« (МК_026201)

Рисунок 4. Филогенетическая дендограмма, построенная на основе сравнения генов 168 рРНК бактерий для накопительных культур с ферригидритом, заключенным в гранулы альгината, и лактатом (филотипы, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом, номера ОепВапк представлены). Масштабная линейка - 10% различия последовательностей.

Различия филогенетического состава в зависимости от донора электронов.

Количество филотипов, в исследуемых накопительных культурах, составило 58 сиквенсов для сообществ использующих ацетат и 28 сиквенсов для сообществ использующих лактат в качестве потенциальных доноров электронов для железоредукции (см. рис. 1-7). В накопительных культурах с ацетатом присутствует значительно больше представителей некультивируемых прокариот, чем на среде с лактатом (19 и 2). Теоретически, лактат является более энергетически выгодным субстратом, который может сбраживаться даже в отсутствие внешнего акцептора электронов. Очевидно, в природных микробных сообществах, использованных для получения накопительных культур, ацетат служит более важным интермедиатом разложения органического вещества и к его использованию способно большее количество микроорганизмов.

fi50_1_FGa_Ac (HM003746)

Carboxydothermus siderophilus (EF542810) — Carboxydothermus hydrogenoformans (CP000141) L 64_1_FGQ_Ac (HM003771)

m-50_5_FGQ_Ac (HM003750)

'-Thermoanaenbader usonensis (FJ360438)

Gelria glutamica (AF321086) y61_4_FGQ_Ac (HM003762) -50_3_FGQ.Ac (HM003748) -Planililum yunnanense (DQ119659) - 64_3_FGQ_Ac (HM003773)

- Uncultured bacterium clone D21R45C97 (FM956859)

- 50_4_FGQ_AC (HM003749)

- Uncultured bacterium clone D2 (AY526501) i— 61 9_FGQ Ac (HM003767)

™ 61_1_FGQ_AC (HM003759)

- Uncultured Symbiobacterium clone SHBZ1659 (EU638507) -IWoomlla perchtoratireducens (EF060194) -Moorella glycerini (NR_029198)

- Desulfotomaculum acetoxidans (NR_027608) 61_5_FGQ_Ac (HM003763)

Peiotomacufum thermopmpionicum (AB035723) Thermincola ferriacetica (AY631277) 64_4_FGQ_Ac (HM003774) Ferribader thermoa utotrophicus (AF282252) ¡Tj- Thermoiithoba cter carboxydivorans (DQ095862) L Thermolithobader ferrireducens (AF282254) Catoramator (/zo/?/e/M<i(AY102936) Caloramator australicus (EU409943) 50_6_FGQ_Ac (HM003751)

Caldicellulosirvptor saccharolylicus (CP000679) Gracilibader thermobterans (DQ117469) Uncultured bacterium clone KCL40b 13 24 (FJ638569) 61 2 FGQ Ac (HM003760) Olsenella profuse (FN178467) Eggerthella sinensis (AY321958)

Cryptobaderium curium (NR_027524)

616_FGQ_Ac (HM003764) 61_7_FGQ_Ac (HM003765) Uncultured bacterium clone: SwB31fl (AB266943) Bacteroides acidofatiens (AB021164)

Prevctella bivia (L16475) Dysgonomonas /wfsfad/i'(FN356023) Kaistetta koreensis (AY294611) Giltisia sandarakina (AY694007) Flavobaderium algicola (AB455265)

-Spirochaeta thermophila (X62809)

- Spirochaeta xylanolyttcus (AY735097)

-61_8_FGQ_Ac (HM003766)

- Uncultured bacterium clone 23c11 (EF515355)

50_2_FGQ_Ac (HM003747) Fervidobaderium sp. strain 1445t(EU851047) Fervidobaderium changbaicum (AYG78719)

-64_2_FGQ_Ac (HM003772)

-60 1 FGQ Ac(HM003753)

-61~3_FGQ_Ac ((HM003763)

toor Thermotoga lettingae (NR_027542) '—Thermotoga elfii (NR_026201)

Рисунок 5. Филогенетическая дендограмма, построенная на основе сравнения генов 16Б рРНК бактерий для накопительных культур с ферригидритом, заключенным в гранулы альгината, и АХДС, с ацетатом в качестве донора электронов (филотипы, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом, номера СепВапк представлены). Масштабная линейка - 10% различия последовательностей.

Carboxydothermus hydrogenoformans (CP0QQ'\41) Carboxydothermus siderophiius (EF542810) — 50_1_FGQ_L (HM003752)

-Thermoanaerobacter usonensis (FJ 360438)

-Gelria giutamica (AF321086)

— 64_2_FGQ_L (HM003776) 61_3_FOQ_L (HM003770) 64_3_FGQ_L (HM003777) Moorella glycerini (NR_029198) Moorella thermoa utotrophica (X77849) Moorella perchloratireducens (EF060194)

]i—Fem'bacterthermoautotrophicus (AF282252) 1— Thermolithobacterferrireducens(AF2B2254) - Thermincola fem'acetica (AY631277) -Desulfotomaculum acetoxidans (NR_027608)

Pelotomaculum thermoprvpionicum (AB035723) Pelotomaculum isophthaticicum (AB232785) Pelotomaculum terephthaiicicum(AB091323) 61_2_FGQ_L (HM003769)

-Pelotomaculum pmpionicicum (AB154390)

-GraciUbacter tfrermo'olerans (DQ117463}

— Caloramator uzoniensis (AY102936)

— Caloramatoraustraiicus (EU409943) -PlanHilum yunnanense (DQ119659)

-Anoxybacillus amyloiyticus (AJ618979)

I-Anoxybacillus flavithermus (NC_011567)

^этг 60_1_FCQ_L (HM003756)

"—Anoxybacillus bogrovensis (AM409184) Caldicellulosiruptor hydrothermalis (EF100908) Caldicellulosiruptor saccharolyticus (CP000S79)

-ThermobHida cellulolytica (AJ298058)

-Salana multivorans (AJ400627)

-Thermoleiphiium minutum (AJ458464)

nr 61_1_FGQ_L (HM003763)

Uncultured bacterium doneKCL40b 13 24 (FJ638569)

-Olsenella profusa (FN178467)

-Eggerthella sinensis (AY321958)

-Cryptobacterium curtum (NR_027524)

Thermotoga iettingae (NR_027542) Thermotoga elfii (NR_026201) Fervidobacterium changbaicum (AY878719) 64_1_FGQ_L (HM003775) Fervidobacterium sp. strain1445t (EU851047)

Рисунок 6. Филогенетическая дендограмма, построенная на основе сравнения генов 168 рРНК бактерий для накопительных культур с ферригидритом, заключенным в гранулы альгината, и АХДС, с лактатом в качестве донора электронов (филотипы, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом, номера вепЬапк представлены). Масштабная линейка - 10% различия последовательностей.

3. Новые анаэробные термофильные бактерии, полученные из накопительных культур термофильных железовосстанавливающих микроорганизмов

3.1. Общая характеристика штамма новой термофильной ацетогенной бактерии

Выделение. Из накопительной культуры 64_Г;С<3_Ь железовосстанавливающего микробного сообщества, полученной инокулированием образца осадка и воды наземной гидротермы Долины Гейзеров был выделен новый изолят. Новый штамм был назван 64_РОС)т.

Морфология клеток. Клетки штамма 64_РО()т представляли собой прямые или изогнутые, в стационарной фазе роста, палочки размером 0,3-0,5x2,0-5,0 мкм. Исследование ультратонких срезов показало наличие клеточной стенки грамположительного типа. В стационарной фазе роста наблюдали терминальные эндоспоры с булавовидным спорангием. Деление клеток происходило образованием поперечной перетяжки.

Параметры роста изолята. Штамм 64_РСртрос в диапазоне температур от 46 до 70°С, рост не наблюдали при температурах культивирования 37 и 75°С. Время удвоения клеток штамма 64_РО<Зт в среде с лактатом и АХДС при температуре 65°С составляло 2 ч. 6 мин. Рост штамма 64_РС(3Т наблюдали при рН от 5,5 до 8,5. Оптимум рН лежал в диапазоне значений нейтральной среды от 6,5 до 7,0. При оптимальных температуре и значении рН среды рост штамма 64_РС(}Т наблюдали при концентрации до 15 г/л ЫаС1, с оптимумом от 0 до 5 г/л N301.

В присутствии АХДС (20мМ) в качестве акцептора электронов штамм 64_РО<Зт окислял глицерин, дрожжевой экстракт, лактат, пептон и пируват. В отсутствии акцепторов электронов штамм 64_РСС2Т был способен сбраживать галактозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, пептон и пируват. Следующие субстраты были проверены, но не поддерживали рост штамма 64_РО()т в присутствии или отсутствии АХДС: формиат, ацетат, пропионат, бутират, оксалат, малат, фумарат, метанол, этанол, пропанол, бутанол, бензоат, ацетон, глицин, валин, аланин, глюкоза, манноза, целлобиоза, фильтровальная бумага, альгинат, крахмал и оливковое масло. Штамм 64_РСС) в отличие от типовых штаммов рода МоогеПа не использовал молекулярный водород в качестве донора электронов с АХДС или ферригидритом и 0,1 мМ АХДС, и был не способен к хемолитоавтотрофному росту в присутствии Н2/С02 (80:20 об/об). Рост штамма 64_РО(}т облигатно зависел от присутствия в среде дрожжевого экстракта (минимальная концентрация необходимая для роста составляла 0,05 г/л).

В качестве конечных акцепторов электронов с лактатом в качестве донора электронов, штамм 64_РС(2Т восстанавливал следующие неорганические соединения: АХДС, гуминовые кислоты, нитрат, перхлорат, тиосульфат. Продуктом восстановления тиосульфата был сероводород, нитрата - аммоний, перхлората - хлорид. Штамм 64_РОС>т не восстанавливал Ре(Ш)-ЭДГА, цитрат Ре(Ш), Мп02, фумарат, сульфат, сульфит, серу и кислород в среде с лактатом или глицерином в качестве доноров электронов.

Восстановление ферригидрита штаммом 64_РС(^Т. В условиях культивирования штамма 64_РСС)Т с ферригидритом, суспендированным в среде или заключенным в гранулы альгината, рост и восстановление Ре(Ш) возможны в присутствии низких концентраций в среде растворимых веществ переносчиков электронов. Гуминовые кислоты стимулировали рост и образование Ре(П) клетками штамма 64_РОС?т в концентрациях 0,25 и 0,5 г/л. Дальнейшее увеличение концентрации гуминовых кислот не влияло на рост и восстановление железа исследуемой культурой. Добавление АХДС стимулировало рост и образование Ре(П) штаммом в диапазоне концентраций АХДС от 0,01 до 0,2 мМ. Дальнейшее увеличение количества АХДС до 1 мМ не влияло на рост и железоредукцию (рис. 7).

Рисунок 7.

Рост штамма

б4к;дт и

образование железа двухвалентного при различных концентрациях АХДС в среде.

В экспериментах урожай клеток коррелировал с образованием Ре(П). Концентрация образованного железа двухвалентного в среде составляла около 8 мМ, при концентрациях АХДС 0,1, 0,2, 0,5 и 0,01 мМ, при таких незначительных концентрациях АХДС, исходя из молярного соотношения АХДС и Ре(П) (1 молекула АХДСН2 способна восстановить 2 молекулы Ре(ОН)з), не могло образоваться такое количество Ре(П). Следовательно, АХДС выступает в этих реакциях в качестве переносчика электронов от клеток к минералу по циклическому механизму, многократно восстанавливаясь и окисляясь в прежнее состояние. Минимальная концентрация АХДС, необходимая для обеспечения клеток энергией в результате регенерации шатл-соединения путем восстановления Ре(Ш), составила 0,05 мМ.

Продукты метаболизма. Продукты метаболизма были измерены в культуре выросшей в оптимальных условиях с максимальным урожаем клеток в стационарной фазе роста. При росте штамма 64_РОС)т с АХДС в качестве акцептора электронов лактат окислялся не полностью, с образованием в жидкой фазе ацетата в соотношении 1,5:1. Рост штамма 64_РО(}т на фруктозе также приводил к образованию в жидкой фазе ацетата. Образования других продуктов в жидкой и газовой фазах не происходило.

АСЮБ. шМ

I 1 Ре (II), шМ * клетки

Нуклеотидный состав ДНК. Содержание ГЦ пар в ДНК штамма 64_FGQ составило 51 мол.%.

Филогенетический анализ. На основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК штамма 64_FGQT с другими представителями термофильных микроорганизмов было показано филогенетическое положение нового изолята в монофилитической группе представителей рода МоогеПа внутри семейства Thermoanaerobacteraceae класса Clostridia (рис. 8). Сходство с ближайшим организмом М. glycerini DSM 11254 т составляет 96%.

Рисунок 8. Дендограмма представителей рода МоогеПа, построенная на основе сравнения генов 168 рРНК, показывающая

филогенетическое положение нового штамма МоогеПа Иитг/еггеа. Шкала отражает 1 замену на 10 нуклеотидов.

ко Г

Moorella Ihermoaulolroptiica DSM 1954T(L091 68)

Moorella thermoacetica DSM 521T (AY656675) L Moorella perchloratiredixens ATCC BA/V531 (EF0S0194) —Moorella Лшйэтез DS M232851 (GQ872425)

-Moorefia muten'DSM 14980 (AF487538)

^ MooretlaglyceriniDSM 11254T(U82327) - Thermoanaercbacter uzonensis (EF530067j 0.1

Выделенный из горячего источника Долины Гейзеров новый штамм 64_FGQT обладает характерными признаками рода Moorella. Штамм 64_FGQT является строгим анаэробом и умеренным термофилом. Согласно данным филогенетического анализа, изолят попадает в кластер термофильных гомоацетогенных бактерий, сходство с ближайшим организмом М. glycerini DSM 11254 т составляет 96%. На основании фенотипических и генотипических отличий нового штамма 64_FGQT от других представителей рода Moorella (см. табл. 3) мы считаем правомерным отнесение изолята к новому виду рода Moorella и предлагаем название Moorella humiferrea, sp. nov.

Описание Moorella humiferrea, sp. nov. Moorella humiferrea (hu.mi.fer.re'a. L. adj. humi - гумус; L. n. ferrum - железо; N. L. fem. adj. humiferrea, имеющая отношение к гумусу и железу).

Колонии округлые белые. Клетки - прямые или изогнутые палочки, одиночные или в цепочках из нескольких клеток, размером 2-5x0,3-0,5 мкм, с перитрихальным жгутикованием. Клеточная стенка грамположительного типа. В стационарной фазе роста образует термостабильные споры. Деление посредством перетяжки. Облигатный анаэроб и гетеротроф. Термофил, рост в диапазоне температур 46-70°С, с оптимум 65°С. Спектр утилизируемых субстратов (с акцептором электронов) включает: глицерин, дрожжевой экстракт, лактат, пептон и пируват. Сбраживает арабинозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, пептон и пируват. Штамм 64_FGQT использует в качестве акцепторов электронов АХДС, гуминовые кислоты, нитрат, перхлорат, тиосульфат. Ферригидрит восстанавливает в присутствии небольших количеств растворимых веществ-переносчиков электронов.

Характеристика М. китг/еггеа М. perchloratireducens M. mulderi M. glycerini М. thermoautotrophica M. thermoacetica

Место выделения Долина Гейзеров, Камчатка Подземное газовое хранилище Анаэробный биореактор Иеллоустоунски йнациональный парк Образцы почвы и осадка Конский навоз

Размер клеток (мкм) 0,3-0,5x2-5 0,5x2-9 0,4-0,6x2-8 0,4-0,6x3-6,5 0,8-1,0x3-6 0,4x2,8

Температурные пределы для роста (оптимум), °С 46-70 (65) 40-70 (55-60) 40-70 (65) 43-65 (58) 36-70 (55-58) 45-65 (55-60)

Оптимум рН 7,0 6,5-7,0 7,0 6,3-6,5 5,7 6,9

Содержание ГЦ пар в ДНК, мол.%. 51 58 54 55 54 54

Доноры электронов и источники углерода: Н2-С02 Формиат Метанол Глюкоза Манноза Целлобиоза - + + + + + + + + + + + + + + + +/- +/-+ +

Акцепторы электронов: Нитрат Перхлорат + + + + + + + +

Ссылки данное исследование Balk et al., 2008 Balk et al., 2003 Slobodkin et al., 1997 Wiegeletal., 1981 Fontaine et al., 1942

Образует ацетат при окислении и сбраживании органических субстратов. Содержание Г+Ц в ДНК составляет 51 мол. %. Регистрационный номер последовательности гена 16S рРНК штамма 64_FGQT в GenBank - GQ872425. Типовой штамм 64_FGQT (=ВКМ В-26031, = DSM 23265т). Выделен из сообщества микроорганизмов, способных использовать слабокристаллический оксид Fe(III) в качестве акцептора электронов, полученного из наземной гидротермы Долины Гейзеров (Камчатка).

3.2. Общая характеристика новых представителей филогенетического типа Planctomycetes

В результате филогенетического исследования в трех накопительных культурах с ацетатом и ферригидритом в гранулах альгината были обнаружены микроорганизмы, ближайшими родственниками которых являются некультивируемые прокариоты. Накопительные культуры, содержащие эти микроорганизмы, были получены из образцов Восточного поля, участка Тростниковый (кальдера Узон) и гейзера Грот (Долина Гейзеров). Ближайшей в GenBank была последовательность гена 16S рРНК принадлежащая бактериальному клону, впервые полученному при описании филогенетического разнообразия Иеллоустонского национального парка (США, Hugenholts et al., 1998) и в дальнейшем детектированному молекулярными методами в Австрии, Германии и Греции (номера нуклеотидных последовательностей в GenBank АМ902600, FN436200, EF444704, соответственно). Уровень сходства нуклеотидных последовательностей составил 96%. Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК определил данные микроорганизмы в единый кластер с таксономически описанными представителями типа Planctomycetes (см. рис. 4).

Флуоресцентная in situ гибридизация. Принадлежность найденных бактерий к филогенетическому типу Planctomycetes была подтверждена флуоресцентной in situ гибридизацией клеток с таксон-специфичным зондом PLA886. Во всех экспериментах, проводимых с культурами Planctomycetes, наличие бактерий детектировали методом флуоресцентной in situ гибридизацией клеток.

Морфология клеток. Клетки были эллипсоидной формы, имели кратерообразные структуры, пили и размер 2,0-4,0 мкм (рис. 9, 1) Культуры клеток образовывали стебельковые выросты цитоплазмы и группировались между собой, образовывая "розеточные" структуры (рис. 9,2).

Параметры роста. Диапазон температур для роста составляет 46-70°С, с оптимумом - 65°С. Рост отсутствовал при температурах культивирования 37 и 75°С. В экспериментах по определению концентраций кислорода воздуха, допустимых для развития микроорганизмов, было установлено отсутствие способности развиваться в аэробных и микроаэробных условиях культивирования (3% кислорода).

В результате множественных попыток выделить чистые культуры микроорганизмов принадлежащих к филогенетическому типу Planctomycetes методом предельных разведений и высевом в среды с антибиотиками была выявлена устойчивость Planctomycetes к антибиотикам: ампициллину (100 мкг),

пенициллину (10 мкг) и карбоксициллину (10 мкг). Культуры не требовали добавления дрожжевого экстракта в качестве фактора роста. При наблюдении в световой микроскоп препаратов исследуемых накопительных культур доминирующими являются клетки представителей типа Planctomycetes (около 90%), также встречаются единичные прямые палочки. В накопительных культурах, в которых были идентифицированы Planctomycetes, невооруженным глазом были видны белые, иногда желтоватые, образования на поверхности гранул альгината. При наблюдении в световой микроскоп клетки обнаруживаются непосредственно во фрагментах альгинатных гранул. Как правило, клетки не просматривались при фазово-контрастной световой микроскопии из-за плотных пленок альгината. Также было замечено, что приготовлению препаратов клеток для микроскопирования должно предшествовать тщательное встряхивание (vortex, 5 мин.) пробирок с культурами. В условиях культивирования с ацетатом, суспендированным в среде ферригидритом и с добавлением 0,2% раствора альгината рост представителей типа Planctomycetes не отмечался. Микроорганизмы детектировали в условиях замещения ферригидрита на другой растворимый акцептор [цитрат Fe(III), нитрат] в присутствии гранул альгината в среде. Представители типа Planctomycetes не развивались при культивировании с цитратом Fe(III) или нитратом в условиях замещения гранул альгината жидким субстратом.

Рисунок 9.

Микрофотографии клеток представителей типа Р1апс1отусе1ез 1 -негативное окрашивание; 2-сканирующая электронная микроскопия

Представители филогенетического типа Planctomycetes формируют обособленную глубокую линию в домене Bacteria, имеют уникальные последовательности в гене 16S рРНК противопоставляющие их остальным бактериям и характеризуются специфической морфологией и ультраструктурой клеток, заключающейся в компартментализации внутриклеточного материала и образовании уникальных мембранных структур. Некультивируемые представители планктомицетов повсеместно представлены в природных экосистемах и детектируются с использованием различных молекулярно-генетических подходов. При поиске в нуклеотидной базе данных (GenBank) по

ключевым словам «Planctomycetes, 16S rRNA» обнаруживаются 8564 нуклеотидных последовательности. Несмотря на такое широкое распространение некультивируемых планктомицетов в различных экосистемах выделены в чистую культуру и валидно описаны всего девять родов этого филогенетического типа. Чистые культуры представителей Planctomycetes являются аэробными хемогетеротрофными микроорганизмами. За исключением умеренно термофильного штамма Isosphaera pallida (диапазон температур для роста составляет 34-55, с оптимумом 41°С, Giovannoni et al., 1987) представители типа Planctomycetes являются мезофильными аэробными бактериями. Мезофильные анаэробные представители планктомицетов, осуществляющие процессы анаэробного окисления аммония, поддерживаются в лабораторных условиях, однако в чистую культуру не выделены и представлены в GenBank как 'Candidatus' (Strous et al., 1999, Jetten et al., 2005). Сведения о культивируемых термофильных анаэробных планктомицетах до настоящего исследования отсутствовали.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного анализа определен филогенетический состав термофильных железовосстанавливающих микробных сообществ из наземных гидротерм Камчатки развивающихся при наличии и отсутствии прямого контакта клеток прокариот со слабокристаллическим оксидом Ре(Ш). Железовосстанавливающие накопительные культуры, полученные в разных условиях, различаются по филогенетическому составу. К таксономическим группам прокариот, культивируемые представители которых могут принимать участие в восстановлении нерастворимых соединений трёхвалентного железа при повышенных температурах, относятся следующие филогенетические типы: АсИпоЬас/епа, Адш/юае, Вас1его\йе1е5, Ь'Игохр^ае, Р1апс1отусе!ез, РгсХеоЬаМепа, БркоскаМеъ, $упег%Ые1ез, Т1хегтоЮ%ае, СгепагсИаеоШ, во всех культурах количественно преобладают филотипы, относящиеся к филогенетическому типу ПгткМея. Специфических филогенетических групп микроорганизмов, которые преобладают либо в условиях свободного, либо ограниченного доступа клеток к ферригидриту, в присутствии и отсутствии экзогенного переносчика электронов не выявлено. Наиболее часто в накопительных культурах, как при свободном, так и при ограниченном доступе к ферригидриту детектируются представители родов СагЬохуйоШегтш и ТИегтоапаегоЬааег, которые, очевидно, обладают наиболее эффективными механизмами железоредукции в исследованном диапазоне температур. Вероятно, реализация той или иной стратегии железоредукции является специфическим свойством для вида или штамма, а не для всех представителей рода в целом, и играет физиологическую роль в конкретных местах обитания и может оказаться значимой при смене экологических условий. Установлено, что филогенетическое разнообразие микроорганизмов выше в присутствии в среде культивирования ацетата в качестве потенциального донора железоредукции, чем лактата. При повышенных температурах культивирования значительно

уменьшается количество и филогенетическое разнообразие прокариот. Представители гипертермофильных архей филогенетического типа Crenarchaeota детектируются при температуре инкубации 80°С. Показано, что в присутствии в среде гранул альгината в накопительных культурах обнаружены микроорганизмы, ближайшими родственниками которых являются некультивируемые организмы.

Из термофильной накопительной культуры железовосствнавливающих микробных сообществ, полученной из Долины Гейзеров, в чистую культуру выделен анаэробный термофильный штамм 64_FGQT. Выявленные морфологические, физиологические и филогенетические различия нового изолята с близкородственными микроорганизмами позволяют отнести его к новому виду рода Moorella - Moorella humiferrea, sp. nov. Новый штамм 64_FGQT способен восстанавливать ферригидрит в присутствии незначительного количества в среде гуминовых кислот, такое абиотическое восстановление Fe(III) обеспечивает клетку энергией для поддержания роста. В наземных гидротермах с обильными отложениями окисных соединений железа трехвалентного и отсутствии других используемых для роста соединений, новый изолят, возможно, получает энергию для роста и жизнедеятельности в результате регенерации веществ переносчиков, которая обеспечивается восстановлением Fe(III). Такими веществами в данных гидротермах могут выступать гуминовые кислоты, способные к многократному восстановлению и окислению и, следовательно, даже их незначительные количества играют важную роль в восстановлении Fe(III). Согласно концепции «внеклеточного переноса электронов» (Hernandez and Newman, 2001; Stams et al., 2006; Lovley, 2008) экзогенный медиатор железоредукции биотически восстанавливается (энзиматическое восстановление), получая электроны от клетки бактерии, который, в свою очередь, передает электроны к минералам Fe(III), химически восстанавливая последний (неэнзиматическое восстановление). Несмотря на то, что конкретные механизмы, приводящие к уменьшению степени окисления металла, могут быть различными, как прямая энзиматическая, так и биотически опосредованная неэнзиматическая железоредукция сопровождаются переносом электронов, генерируемых в реакциях микробного метаболизма. Полученные результаты расширяют наши возможности в понимание экологической роли нового изолята в микробных железовосстанавливающих сообществах в природных экосистемах.

Обнаружено, что в присутствии гранул альгината и Fe(III), в устойчивых накопительных культурах детектируются микроорганизмы филогенетического типа Planclomycetes, имеющие лишь отдалённое родство с известными культивируемыми видами. Впервые получен культивируемый представитель анаэробных термофильных планктомицетов. Обнаруженный микроорганизм восстанавливает ферригидрит и цитрат Fe(III) в присутствии в среде гранул альгината и не развивается в условиях замещения гранул альгината жидким субстратом, по-видимому, в данных условиях культивирования, клетки не способны развиваться в жидкой среде и требуют прикрепления к твердому субстрату. Проведенное исследование расширяет наши знания в понимание

биологии представителей типа Р1аШотусе1ез и может оказаться полезным в разработке методов для выделения чистых культур относящихся к новым таксонам, принципиально отличающихся от других микроорганизмов и обладающих, возможно, неизвестными интересными и функционально значимыми свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Железовосстанавливающие накопительные культуры термофильных микроорганизмов, полученные при наличии или отсутствии прямого контакта клеток с минералом Ре(Ш), имеют различный филогенетический состав, однако, во всех культурах количественно преобладают филотипы, относящиеся к филогенетическому типу Пгт1си1ез. Наиболее часто в накопительных культурах как при наличии, так и в отсутствие прямого контакта клеток с ферригидритом, выявляются представители родов СагЬоху^оЛегтия, ТИегтоапаегоЬас(ег и ПегтоЩа, которые, очевидно, обладают наиболее эффективными механизмами железоредукции в исследованном диапазоне температур. Вероятно, реализация той или иной стратегии железоредукции является специфическим свойством для вида или штамма, а не для всех представителей рода в целом.

2. Выделен в чистую культуру, таксономически охарактеризован и описан новый вид анаэробной термофильной бактерии МоогеНа кит'фпеа, ер. поу. Новый изолят способен сопрягать процессы восстановления нерастворимых оксидов Ре(Ш) с использованием гуминовых кислот в качестве акцептора и переносчика электронов.

3. Обнаружено, что компонентом термофильного железовосстанавливающего сообщества являюгся термофильные анаэробные бактерии, относящиеся к филогенетическому типу Р1апс1отусе1еБ. Впервые получен культивируемый представитель анаэробных термофильных планктомицетов, требующий для роста наличия в среде трёхвалентного железа и твёрдой фазы для прикрепления клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Непомнящая Я.Н., Слободкина Г.Б., Колганова Т.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Нетрусов А.И., Слободккин А.И. Филогенентический состав накопительных культур термофильных прокариот, восстанавливающих слабокристаллический оксид Fe(III) при наличии и отсутствии прямого контакта клеток с минералом // Микробиология. 2010. Т. 79, № 5. С. 672-681

2. Nepomnyashchaya Y.N., Slobodkina G.B., Baslerov R.V., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Netrusov A.I., Slobodkin A.I.. Moorella humiferrea, sp. nov., a novel thermophilic anaerobic, bacterium capable of growth via electron shuttling between humic acids and Fe(III) // Int J Syst Evol Microbiol. 2010. (submitted).

3. Непомнящая Я.Н. Филогенетический состав микробного сообщества термофильных анаэробных микроорганизмов диссимиляционно восстанавливающих нерастворимые формы трехвалентного железа / Тезисы международной молодежной конференции «Ломоносов 2009» 13-18 апреля. 2009. Москва. С. 14-15.

4. Nepomnyaschaya Y., Slobodkina G., Kolganova Т., Bonch-Osmolovskaya E., Netrusov A., Slobodkin A. Phylogenetic analysis of the thermophilic microbial enrichment cultures that reduce insoluble poorly crystalline Fe(III) oxide / Abstracts of the International Conference on Biology of Thermophiles, «Thermophiles 2009». August 16 - 21.2009. Beijing, China. P. 75.

5. Непомнящая Я.Н., Слободкина Г.Б., Колганова T.B., Бонч-Осмоловская Е.А., Нетрусов А.И., Слободккин А.И. 'Moorella quinolica' sp. nov.- новая термофильная анаэробная бактерия из наземных гидротерм Камчатки / Тезисы V Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» 26 — 27 октября.

2009. Москва. С. 42-43.

6. Непомнящая Я.Н. Обнаружение и культивирование термофильных анаэробных представителей филогенетического типа Planctomycetes / Тезисы международной молодежной конференции «Ломоносов 2010» 12 - 15 апреля.

2010. Москва. С. 178.

7. Slobodkin A.I., Nepomnyaschaya Y.N., Gavrilov S.N., Slobodkina G.B. Reduction of insoluble electron acceptors by thermophilic prokaryotes / Abstracts of the 8th International Congress on Extremophiles, «Extremophiles 2010». September 12-16.2010. Ponta Delgada, Portugal. P. 310.

Подписано в печать:

19.10.2010

Заказ № 4326 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Непомнящая, Яна Николаевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Научная новизна работы.

1.4. Практическое значение.

1.5. Апробация работы.

1.6. Публикации.

1.7. Структура и объем работы.

1.8. Место проведения работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Восстановление железа микроорганизмами.

2.1.1. Типы микробной железоредукции.

2.1.2. Физиологические стратегии железоредукции.

2.1.3. Биохимические механизмы железоредукции.

2.2. Термофильные железовосстанавливающие микроорганизмы.

2.3. Филогенетическое разнообразие термофильных железоредукторов

2.4. Характеристика представителей филогенетического типа Р1апс1отусе1еБ.

2.4.1. Филогенетическое разнообразие.

2.4.2. Термофильные планктомицеты.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Отбор проб.

3.2. Состав среды и условия культивирования.

3.3. Приготовление слабокристаллического оксида железа трехвалентного (ферригидрита).

3.4. Приготовление гранул альгината.

3.5. Получение накопительных культур.

3.6. Выделение чистой культуры.

3.7. Микроскопические методы исследования.

3.8. Методы контроля чистоты культур.

3.9. Определение параметров роста микроорганизмов.

3.10. Изучение физиолого-биохимических свойств.

3.11. Аналитические методы.

3.12. Молекулярно-биологические методы.

3.13. Филогенетический анализ.

3.14. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH).

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Получение и микробиологический анализ накопительных культур термофильных железовосстанавливающих микроорганизмов.

4.1.1. Получение железовосстанавливающих накопительных культур.

4.1.2. Микробиологический анализ накопительных культур, полученных из наземных гидротерм Камчатки.

4.2. Филогенетический анализ накопительных культур термофильных железовосстанавливающих микрорганизмов.

4.2.1. Общая характеристика филогенетического состава накопительных культур.

4.2.2. Различия филогенетического состава при наличии и отсутствии контакта клеток с минералом.

4.2.3. Различия филогенетического состава в зависимости от донора электронов.

4.2.4. Различия филогенетического состава в зависимости от температуры культивирования.

4.3. Новые анаэробные термофильные бактерии, полученные из термофильных железовосстанавливающих микробных сообществ.

4.3.1. Общая характеристика штамма новой термофильной ацетогенной бактерии.

4.3.1.1. Выделение.

4.3.1.2. Морфология клеток.

4.3.1.3. Параметры роста изолята.

4.3.1.4. Использование субстратов в качестве доноров электронов

4.3.1.5. Использование акцепторов электронов.

4.3.1.6. Восстановление ферригидрита штаммом 64FGQ с использованием экзогенных медиаторов железоредукции.

4.3.1.7. Продукты метаболизма.

4.3.1.8. Нуклеотидный состав ДНК.

4.3.1.9. Филогенетический анализ.

4.3.2. Общая характеристика новых представителей филогенетического типа Planctomycetes.

4.3.2.1. Флуоресцентная in situ гибридизация.

4.3.2.2. Морфология клеток.

4.3.2.3. Параметры роста.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в термофильных железовосстанавливающих сообществах"

1.1. Актуальность проблемы

Железо - четвертый по распространенности химический элемент земной коры. Микробное восстановление Fe(III) является основным путем окисления органического вещества в некоторых пресноводных, морских и почвенных природных экосистемах (Lovley, 1991, Canfleld, 1993, Thamdrup, 2000). Термофильные железовосстанавливающие микроорганизмы являются компонентом микробных сообществ термальных экосистем, которые представляют большой интерес для исследования и рассматриваются как аналоги древнейшей биосферы. Процессы, протекающие в них, могут моделировать древнейшие биоценозы (Заварзин, 2001; Stetter, 2006). Термофильные прокариоты, способные восстанавливать Fe(III), могли играть существенную роль в ранней биосфере Земли, вероятно, характеризовавшейся повышенными температурами и высоким содержанием соединений железа (Lovley et al., 2004, Слободкин, 2005), восстановление Fe(III) микроорганизмами, вероятно, служило первым и основным окислителем органического углерода (Walker, 1987) и могло быть первым возникшим типом метаболизма (Lovley, 2005). Микробная железоредукция оказывает влияние на хозяйственную деятельность человека, участвуя в процессах биокоррозии металлов, оглеение почв, удаление органических загрязнителей, восстановлении токсичных и радиоактивных химических элементов [As(V), Cr(VI), V(V), Tc(VII), U(VI)] с образованием малорастворимых соединений, что может быть использовано при разработке технологий биоремедиации. Минералы, формирующиеся при микробном восстановлении металлов, могут найти применение в современных нанотехнологиях, а также как носители в высокочувствительных методах анализа (Fredrickson et al., 2000, Lee and Newman, 2003; Lovley et al., 2004, Chernyh et al., 2007, Liu et al., 2009).

Процессы биогенного восстановления Fe(III) включают в себя энзиматические и биотически опосредованные реакции, и осуществляется микроорганизмами из разных филогенетических групп прокариотных доменов: Bacteria и Archaea. Термофильные железоредукторы не представляют собой единой филогенетической группы и к настоящему времени включают в себя представителей более двадцати родов бактерий и шести родов архей (Слободкин, 2005). Для восстановления нерастворимых оксидов Fe(III) в нейтральных средах обитания железоредукторы используют разные физиологические стратегии и биохимические механизмы (Stams et al., 2006, Gralnick and Newman, 2007, Lovley, 2008). Исследования структуры термофильных микробных сообществ, восстанавливающих нерастворимые оксиды Fe(III) в условиях свободного и ограниченного контакта клеток с минералом, важно для расширения знаний о таксономическом и физиологическом разнообразии железоредукторов, понимания взаимодействия клеток и акцептора в природных экосистемах и характеристики таксономических групп прокариот в конкретных физиологических условиях. Детальное исследование физиологических возможностей восстановления оксидов Fe(III) проводилось на представителях мезофильных бактерий родов Shewanella и Geobacter (Reguera et al., 2005, Gorby et al., 2006). Сведения о стратегиях восстановления оксидов Fe(III) у термофильных микроорганизмов ограничены исследованиями гипертермофильных архей рода Pyrobaculum (Feinberg et al., 2008). Информация о физиологических механизмах восстановления нерастворимых соединений трёхвалентного железа у термофильных бактерий отсутствует. Большинство предыдущих исследований термофильных железовосстанавливающих прокариот базировалось на таксономическом описании отдельных видов бактерий и архей. Изучение филогенетического состава термофильных микробных сообществ, восстанавливающих оксид Fe(III) в условиях свободного и ограниченного контакта клеток с минералом до представленного исследования не проводили.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Непомнящая, Яна Николаевна

6. выводы

1. Железовосстанавливающие накопительные культуры термофильных микроорганизмов, полученные при наличии или отсутствии прямого контакта клеток с минералом Ре(1П), имеют различный филогенетический состав, однако, во всех культурах количественно преобладают филотипы, относящиеся к филогенетическому типу Пптси1еь\ Наиболее часто в накопительных культурах как при наличии, так и в отсутствие прямого контакта клеток с фсрригидритом, выявляются представители родов СагЬохуйоМегтш, ТИегтоапаегоЬас/ег и Thermotoga, которые, очевидно, обладают наиболее эффективными механизмами железоредукции в исследованном диапазоне температур. Вероятно, реализация той или иной стратегии железоредукции является специфическим свойством для вида или штамма, а не для всех представителей рода в целом.

2. Выделен в чистую культуру, таксоиомически охарактеризован и описан новый вид анаэробной термофильной бактерии МоогеИа китг/еггеа, эр. поу. Новый изолят способен сопрягать процессы восстановления нерастворимых оксидов Ре(Ш) с использованием гуминовых кислот в качестве акцептора и переносчика электронов.

3. Обнаружено, что компонентом термофильного железовосстанавливающего сообщества являются термофильные анаэробные бактерии, относящиеся к филогенетическому типу Р1апсШтусе1ез. Впервые получен культивируемый представитель анаэробных термофильных планктомицетов, требующий для роста наличия в среде трёхвалентного железа и твёрдой фазы для прикрепления клеток.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного анализа определен филогенетический состав термофильных железовосстанавливающих микробных сообществ из наземных гидротерм Камчатки развивающихся при наличии и отсутствии прямого контакта клеток прокариот со слабокристаллическим оксидом Ре(Ш). Установлены таксономические группы прокариот, культивируемые представители которых могут принимать участие в восстановлении нерастворимых соединений трёхвалентного железа при повышенных температурах. Железовосстанавливающие накопительные культуры, полученные в разных условиях, различаются по филогенетическому составу, однако, во всех культурах количественно преобладают филотипы, относящиеся к филогенетическому типу Рктшйех. Специфических филогенетических групп микроорганизмов, которые преобладают либо в условиях свободного, либо ограниченного доступа клеток к ферригидриту, в присутствии и отсутствии экзогенного переносчика электронов не выявлено. Наиболее часто в накопительных культурах, как при свободном, так и при ограниченном доступе к ферригидриту детектируются представители родов СагЬохуйо^егтт и 1ЪегтоапаегоЬас1ег, которые, очевидно, обладают наиболее эффективными механизмами железоредукции в исследованном диапазоне температур. Вероятно, реализация той или иной стратегии железоредукции является специфическим свойством для вида или штамма, а не для всех представителей рода в целом, и играет физиологическую роль в конкретных местах обитания и может оказаться значимой при смене экологических условий. Установлено, что филогенетическое разнообразие микроорганизмов выше в присутствии в среде культивирования ацетата в качестве потенциального донора железоредукции, чем лактата. При повышенных температурах культивирования значительно уменьшается количество и филогенетическое разнообразие прокариот. Представители гипертермофильных архей филогенетического типа

Crenarchaeola детектируются при температуре инкубации 80°С. Показано, что в присутствии в среде гранул альгината в накопительных культурах детектируются микроорганизмы, ближайшими родственниками которых являются некультивируемые организмы.

Из термофильной накопительной культуры железовосствнавливающих микробных сообществ, полученной из Долины Гейзеров, в чистую культуру выделен анаэробный термофильный штамм 64FGQT. Выявленные морфологические, физиологические и филогенетические различия нового изолята с близкородственными микроорганизмами позволяют отнести его к новому виду рода Moorella - Moorella humiferrea sp. nov. Новый штамм 64FGQ способен восстанавливать ферригидрит в присутствии незначительного количества в среде гуминовых кислот, такое абиотическое восстановление Fe(III) обеспечивает клетку энергией для поддержания роста. В наземных гидротермах с обильными отложениями окисных соединений железа трехвалентного и отсутствии других используемых для роста соединений, новый изолят, возможно, получает энергию для роста и жизнедеятельности в результате регенерации веществ переносчиков, которая обеспечивается восстановлением Fe(III). Такими веществами в данных гидротермах могут выступать гуминовые кислоты, способные к многократному восстановлению и окислению и, следовательно, даже их незначительные количества играют важную роль в восстановлении Fe(III). Восстановление минералов Fe(III) гуминовыми веществами рассматривается как часть электроп-транспортных цепей, широко распространенных в природных экосистемах и протекающих даже в присутствие в среде кислорода воздуха (Bauer and Kappler, 2009). Согласно концепции «внеклеточного электронного переноса» (Hernandez and Newman, 2001, Slams et al., 2006, Lovley, 2008) экзогенный медиатор железоредукции биотически восстанавливается (энзиматическое восстановление), получая электроны от клетки бактерии, который, в свою очередь, передает электроны к минералам Fe(III), химически восстанавливая последний (неэнзиматическое восстановление).

Несмотря на то, что конкретные механизмы, приводящие к уменьшению степени окисления металла, могут быть различными, как прямая энзиматическая, так и биотически опосредованная неэнзиматическая железоредукция сопровождаются переносом электронов, генерируемых в реакциях микробного метаболизма. Полученные результаты расширяют наши возможности в понимание экологической роли нового изолята в микробных железовосстанавливающих сообществах в природных экосистемах.

Обнаружено, что в присутствии гранул альгината и 1;е(Ш), в устойчивых накопительных культурах детектируются микроорганизмы филогенетического типа Р1апМотусе1ез, имеющие лишь отдалённое родство с известными культивируемыми видами. Впервые получены устойчивые накопительные культуры термофильных анаэробных планктомицетов. Накопительные культуры восстанавливают ферригидрит и цитрат Ре(Ш) в присутствие в среде гранул альгината. Представители типа ¡ЧапсютусМея не развиваются в условиях замещения гранул альгина жидким субстратом, по-видимому, в данных условиях культивирования, клетки не способны развиваться в жидкой среде и требуют прикрепления к твердому субстрату. Проведенное исследование расширяет наши знания в понимание биологии представителей типа Р1апс№тусе1е5 и может оказаться полезным в разработке методов для выделения чистых культур относящихся к новым таксонам, принципиально отличающихся от других микроорганизмов и обладающих, возможно, неизвестными интересными и функционально значимыми свойствами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Непомнящая, Яна Николаевна, Москва

1. Балашова В.В., Заварзин Г.А. Анаэробное восстановление железа гидрогенными бактериями // Микробиология. 1979. Т. 48. №5. С.773-778.

2. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии / Москва: Мир. 1984. 264 с.

3. Заварзин Г.А. Становление биосферы // Вестник РАН. 2001. Т. 71. №11. С. 9881001.

4. Куличевская И. С., Панкратов Т.А., Дедыш С.Н. Выявление представителей planctomycetes в сфагновых болотах с использованием молекулярных и культуральных подходов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 3. С. 389-396.

5. Панкратов Т.А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия прокариотных микроорганизмов в сфагновых болотах с использованием метода FISH // Микробиология. 2005. Т. 74. №6. С. 831-837.

6. Пиневич А.В. Микробиология железа и марганца. 2005. Санкт-Петербург: Издательство Санкт-Петербургского университета. 373 с.

7. Резников А.А., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. Методы анализа природных вод. 1970. Москва: Недра.

8. Слободкин А.И., Ерощев-Шак В.А., Кострикина Н.А., Лаврушин В.Ю., Дайняк Л.Г., Заварзин Г.А. Образование магнетита термофильными анаэробными микроорганизмами // Доклады Академии Наук. 1995. Т. 345. №5. С.694-697.

9. Слободкин А. И. Термофильная микробная металлоредукция // Микробиология. 2005. Т. 74. С. 581-595.

10. Тихонов В.В., Якушев А.В., Завгородняя Ю.А., Вызов Б.А., Демин В.В. Действие гуминовых кислот на рост бактерий // Почвоведение. 2010. Т. 3. С. 333-341.

11. Чудаев О.В., Чудаева В.А., Карпов Г.А., Эдмунде У.М., Шанд П. Геохимия вод основных геотермальных районов Камчатки. 2000. Владивосток. Дальнаука. 200 с.

12. Aguiar P., Beveridge Т. J. Reysenbach A.-L. Sulfurihydrogenibium azórense sp. nov., a thermophilic hydrogen-oxidizing microaerophile from terrestrial hot springs in the Azores // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 33-39.

13. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 403-410.

14. Balk M., Weijma J., Stams A.J.M. Thermotoga lettingae sp. nov., a novel thermophilic, methanol-degrading bacterium isolated from a thermophilic anaerobic reactor // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 1361-1368.

15. Balk M., Weijma J., Friedrich M.W. Stams A.J.M. "Methanol utilization by a novel thermophilic homoacetogenic bacterium, Moorella midderi sp. nov., isolated from a bioreactor."// Arch. Microbiol. 2003. V. 179. P. 315-320.

16. Balk M., van Gelder T., Weelink S.A., Stams A J. "(Per)chlorate reduction by the theiTnophilic bacterium, Moorella perchloratireducens sp. nov., isolated from an underground gas storage." // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 403-409.

17. Balkwill D.L., Kieft T.L., Tsukuda T., Kostandarithes H.M., Onstott T.C., Macnaughton S., Bownas J., Fredrickson J.K. Identification of iron-reducing Thermus strain as Thermus scotoductus II Extremophiles. 2004. V. 8. P. 37-44.

18. Bauer I., Kappler A. Rates and Extent of Reduction of Fe(III) Compounds and 02 by llumic Substances // Environ. Sci. Technol. 2009. V. 43. P. 4902-4908.

19. Baumgartner LK, D. C., Bucklcy DH, Spear JR, Pace NR, Visscher PT. Microbial species richness and metabolic activities in hypcrsaline microbial mats: insight into biosignaturc formation through lithification//Astrobiology. 2009. V. 9. P. 861-874.

20. Beliacv A. S., Saffarini D.A. Shewanella putrefaciens mtrB encodes an outer membrane protein required for Fe(III) and Mn(IV) reduction // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 6292-6297.

21. Boomer S.M., Noll K.L., Geesey G.G., Dutton B.E. Formation of Multilayered Photosynthetic Biofilms in an Alkaline Thermal Spring in Yellowstone National Park, Wyoming // Appl Environ Microbiol. 2009. V. 75 (8). P. 2464-2475.

22. Boone D.R., Liu Y„ Zhao Z.J., Balkwill D.L., Drake G.R., Stevens T.O., Aldrich H.C. "Bacillus infemus sp. nov., an Fe(III)- and Mn(IV)-reducing anaerobe from the deep terrestrial subsurface." // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 441-448.

23. Bosch J., Heister K., Hofmann T., Meckenstock R.U. Nanosized iron oxide colloids strongly enhance microbial iron reduction // Appl Environ Microbiol. 2010. V. 76 (1). P. 184189.

24. Bretschger O., Obraztsova, A., Sturm, C.A., Chang, I.S., Gorby, Y.A., Reed, S.B., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants // Appl Environ Microbiol. 2007. V. 73: 7003-7012.

25. Bridge T.A.M, Johnson D.B. Reduction of soluble iron and reductive dissolution of ferric iron-containing minerals by moderately thermophilic iron-oxidizing bacteria // Appl Environ Microbiol. 1998. V. 64 (6). P. 2181-2186.

26. Brummer I.H.M., Felske A.D.M., Wagner-Dobler I. Diversity and Seasonal Changes of Uncultured Planctomyceiales in River Biofilms // Appl Environ Microbiol. 2004. V. 70 (9). P. 5094-5101.

27. Buckley D.H., Huangyutitham V., Nelson T.A., Rumberger A., Thies J.E. Diversity of Planctomycetes in Soil in Relation to Soil History and Environmental Heterogeneity // Appl Environ Microbiol. 2006. V. 72 (7). P. 4522-4531.

28. Butler J.I., Young N.D., Lovley D.R. Evolution of electron transfer out of the cell: comparative genomics of six Geobacter genomes II BMC Genomics. 2010. V. 11 (40). P.1-12.

29. Canfield D.E. Pathways of organic carbon oxidation in three continentasl margin sediments // Mar. Geol. 1993. V. 113. P. 27-40.

30. Canstein H., Ogawa J., Shimizu S., Lloyd J.R. Secretion of Flavins by Shewanella Species and Their Role in Extracellular Electron Transfer // Appl Environ Microbiol. 2008. V. 74 (3). P. 615-623.

31. Cervantes F., Dijksma W., Duong-Dac T., Ivanova A., Lettinga G., Field J.A. Anaerobic mineralization of toluene by enriched sediments with quinones and humus as terminal electron acceptors // Appl Environ Microbiol. 2001. V. 67 (10). P. 4471-4478.

32. Cervantes F., Vu-Thi-Thu L., Lettinga G., Field J.A. Quinone-respiration improves dechlorination of carbon tetrachloride by anaerobic sludge // Appl Microbiol Biotechnol. 2004. V. 64 (5). P. 702-711.

33. Chen C., Macarie H., Ramirez I., Olmos A., Ong S.L., Monroy O., Liu W. Microbial community structure in a thermophilic anaerobic hybrid reactor degrading terephthalate // Microbiology. 2004. V. 150. P. 3429-3440.

34. Childers S.I., Lovley D. R. Differences in Fe(IlI) reduction in the hyperthermophilic archaeon, Pyrobaculum islandicum, versus mesophilic Fe(III)-reducing bacteria // FEMS Microbiology Letters. 2001. V. 195 (2). P. 253-258.

35. Childers S.E., Ciufo S., Lovley D.R. Geobacter metallireducens accesses insoluble Fe(III) oxide by chemotaxis //Nature. 2002. V. 416. P. 767-769.

36. Chouari R., Le Paslier D., Daegelen P., Ginestet P., Weissenbach J., Sghir, A. Molecular evidence for novel planctomycele diversity in a municipal wastewater treatment plant // Appl Environ Microbiol. 2003. V. 69. P. 7354-7363.

37. Coursolle D., Gralnick J.A. Modularity of the Mtr respiratory pathway of Shewanella oneidensis strain MR-1 // Molecular Microbiology. 2010. V. 77 (4). P. 995-1008.

38. Dedysh S.N., Belova S.E., Kulichevskaya I.S., Liesack W. Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog // Appl Environ Microbiol. 2006. V. 72 (3). P. 2110-2117.

39. Earhart C.F. Iron metabolism. In Encyclopedia of microbiology. Academic Press. 2000. V. 2. P.860-868.

40. Feinberg L.F., Holden J.F. Characterization of dissimilatory Fe(III) versus NO3 -reduction in the hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum aerophilum II J. Bacteriol. 2006. V. 188. P. 525-531.

41. Feinberg L.F., S. R., Vachet R.W., Holden J.F. Constrains of anaerobic respiration in the hyperthermophilic archaea Pyrobaculum islandicum and Pyrobaculum aerophilum II Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 396-402.

42. Fontaine F.E., Peterson W.H., McCoy E., Johnson M.J., Ritter G.J. A new type of glucose fermentation by Clostridium thermoaceticum IIJ Bacteriol. 1942. V. 43. P. 701-706.

43. Franzmann P.D., Skerman V.B.D. Gemmata obscuriglobus, a new genus and species of the budding bacteria // Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol. 1984. V. 50. P. 261-268.

44. Fredrickson J., Kostandarithes H.M, Li S.W, Plymale A.E, Daly M.J. Reduction of Fe(III), Cr(VI), U(VI), and Tc(VII) by Deinococcus radiodurans R1 // Appl Environ Microbiol. 2000. V. 66 (5). P. 2006-2011.

45. Fredrickson J.K., Zachara J.M. Electron transfer at the microbe-mineral interface: a grand challenge in biogeochemistry// Geobiology. 2008. V. 6. P. 245-253.

46. Fuerst J. Intracellular compartmentation in planctomycetes // Annu Rev Microbiol. 2005. V. 59. P. 299-328.

47. Giovannoni S.J., Schabtach E., Castenholz R.W. Isosphaera pallida, gen. and comb, nov., a gliding, budding eubacterium from hot springs // Arch Microbiol. 1987. V. 147. P. 276284.

48. Glasauer S.L.S., Beveridge T.J. Intracellular iron minerals in a dissimilatory iron-reducing bacterium // Science. 2002. V. 4 (295). P. 117-119.

49. Glasauer S.L.S., Boyanov M., Lai B., Kemner K., Beveridge T.J. Mixed-valence cytoplasmic iron granules are linked to anacrobic respiration // Appl Environ Microbiol. 2007. V. 73 (3). P. 993-996.

50. Gralnick J.A., Newman D.K. Extracellular respiration // Mol Microbiol. 2007. V. 65 (1).P. 1-11.

51. Greene A.C, Patel B.K.C, Sheehy A. Deferribacter thermophilus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic manganese- and iron-reducing bacterium isolated from a petroleum reservoir // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 505-509.

52. Hernandez M.E., Newman D.K. Extracellular electron transfer // Cell Mol. Life Sci. 2001. V. 58. P. 1562-1571.

53. Hernandez M., Kappler A., Newman D.K. Phenazines and other rcdox-active antibiotics promote microbial mineral reduction // Appl Environ Microbiol. 2004. V. 70 (2). P. 921-928.

54. Hugenholtz P., Pitulle C, Hershberger K.L., Pace N.R. Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring // J Bacteriol. 1998. V. 180 (2). P. 366-376.

55. Hungate R.T. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. 1969. New York, Academic. Press. 1969.

56. Janssen P. Identifying the dominant soil bacterial taxa in libraries of 16S rRNA and 16S rRNA genes // Appl Environ Microbiol. 2006. V. 72 (3). P. 1719-1728.

57. Johnson D.B., Okibe N., Roberto F.F. Novel thermo-acidophilic bacteria isolated from geothermal sites in Yellowstone National Park: physiological and phylogenetic characteristics // Arch. Microbiol. 2003. V. 180. P. 60-68.

58. Kanokratana P., Chanapan S., Pootanakit K., Eurwilaichitr L. Diversity and abundance of Bacteria and Archaea in the Bor Khlueng Hot Spring in Thailand // J Basic Microbiol. 2004. V. 44 (6). P. 430-444.

59. Kappler A., Benz M., Shink B., Brune A. Electron shuttling via humic acids in microbial iron(ill) reduction in a freshwater sediment // FEMS Microbiology Ecology. 2004. V. 47. P. 85-92.

60. Kashefi K, Lovley D.R. Extending the upper temperature limit for life // Science. 2003. V. 301. P. 934.

61. Kashefi K., Lovley D. R. Reduction of Fe(lII), Mn(IV), and toxic metals at 100°C by Pyrobaculum islandicum //Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 1050-1056.

62. Kerisit S., Rosso k.M., Dupuis M., Valiev M. Molecular computational investigation of electron-transfer kinetics across cytochrome-iron oxide interfaces // J. Phys. Chem. 2007. V. 111. P. 11363-11375.

63. Kirkpatrick J., Oakley B., Fuchsman C., Srinivasan S., Staley J.T., Murray J.W. Diversity and distribution of Planctomycetes and related bacteria in the suboxic zone of the Black Sea// Appl Environ Microbiol. 2006. V. 72 (4). P. 3079-3083.

64. Kohler T., Stingl U., Meuser K., Brune A. Novel lineages of Planctomycetes densely colonize the alkaline gut of soil-feeding termites (Cubitermes spp.) // Environmental Microbiology. 2008. V. 10 (5). P. 1260-1270.

65. Korenevsky A.A., Vinogradov E., Gorby Y., Beveridge T.J. Characterization of lipopolysacharides and capsules of Shewanella spp // Appl Environ Microbiol. 2002. V. 68. P. 4653-4657.

66. Lai R. Carbon sequestration impacts on global climate change and food security // Scicnce. 2004. V. 304. P. 1623-1627.

67. Lane D. J. 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. 1991. New York, Wiley.

68. Leang C., Coppi M.V., Lovley D.R. OmcB, a c-type polyheme cytochrome, involved in Fe(III) reduction in Geobacter sulfurreducens IIJ Bactcriol. 2003. V. 185 (7). P. 2096-2103.

69. Leang C., Lovley D.R. Regulation of two highly similar genes, omcB and omcC, in a 10 kb chromosomal duplication in Geobacter sulfurreducens II Microbiology. 2005. V. 151 (6). P. 1761-1767.

70. Ledyard K.M., Butler A. Structure of putrebactin, a new dihydroamate siderophore produced by Shewanella putrefaciens II. J Biol Inorg Chem. 1997. V. 2. P. 93-97.

71. Lee A.K., Newman D.K. Microbial iron respiration: impacts on corrosion processes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 62. P. 134-139.

72. Lee K., Webb R.I., Fuerst J.A. The cell cycle of the planctomycete Gemmata obscuriglobus with respect to cell compartmentalization // BMC Cell Biology. 2009. V. 10 (4). P. 1-12.

73. Liu C., Zachara J.M, Zhong L., Heald S.M., Wang Z., Jcon B.H., Fredrickson J.K. Microbial reduction of intragrain U(VI) in contaminated sediment // Environ Sci Technol. 2009. V. 43 (13). P. 4928-4933.

74. Lovley D.R. Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction // Microbiol.Rcv. 1991.V. 55. P. 259-287.

75. Lovley D.R. Microbial reduction of iron, marganese, and other metals // Adv. Agron. 1995. V. 54. P. 175-231.

76. Lovley, D.R., Coates, J.D., Blunt-Harris E.L., Phillips E.J.P., Woodward J.C. Humic substances as electron acceptors for microbial respiration // Nature. 1996. V. 382. P. 445-448.

77. Lovley D.R., Fraga J.L., Blunt-Harris I.L., Hayes P., Coates J.D. Humic substances as a mediator for microbially catalyzed metal reduction // Acta hydrochim. hydrobiol. 1998. V. 26 (3). P. 152-157.

78. Lovley D.R., Holmes D.E., Nevin K.P. Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction // Advances in Microbial Physiology. 2004. V. 49. P. 219-286.

79. Lovley D.R. Potential role of dissimilatory iron reduction in the early evolution of microbial respiration. Origins, Evolution and Biodiversity of Microbial Life. J. Seckbach, (ed). 2005. Kluwer. Netherlands. 301-313.

80. Lovley D.R. Extracelular electron transfer: wires, capacitors, iron lungs, and more // Geobiology. 2008. V. 6. P. 225-231.

81. Lower B.H., Shi L., Yongsunthon R„ Droubay T.C., McCready D.I., Lower S.K. Specific bonds between an iron oxide surface and outer membrane cytochromes MtrC and OmcA from Shewanella oneidensis MR-1 // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 4944-4952.

82. Marsiii E., Baron D.B., Shikhare I.D., Coursolle D., Gralnick J.A., Bond D.R. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer // Proc Natl Acad Sei U S A. 2008. V. 105 (10). P. 3968-3973.

83. McKnight D., Aiken G.R. Sources and ages of aquatic humus. 1998. Berlin,Springer.

84. Mehta T., Coppi M.V., Childers S.E., Lovley D.R. Outer Membrane c-Type Cytochromes Required for Fe(III) and Mn(IV) Oxide Reduction in Geobacter sulfurreducens Appl Environ Microbiol. 2005. V. 71 (12). P. 8634-8641.

85. Myers C., Myers J.M. MtrB is required for proper incorporation of the cytochromes OmcA and OmcB into the outer membrane of Shewanella putrefaciens MR-1 11 Appl Environ Microbiol. 2002. V. 68 (11). P. 5585-5594.

86. Neef A., Araann R., Schlesner H., Schleifer K. Monitoring a widespread bacterial group: in situ detection ofplanctomycetes with 16s rRNA-targeted probes // Microbiology. 1998. V. 144. P. 3257-3266.

87. Nevin K., Lovley D. Potential for Nonenzymatic Reduction of Fe(III) via electron Shuttling in Subsurface Sediments // Environ. Sci. Technol. 2000a. 34: 2472-2478.

88. Nevin K.P., Lovley D. R. Lack of production of electron-shuttling compounds or solubilization of Fe(III) during reduction of insoluble Fe(III) oxide by Geobacter metallireducens // Appl Environ Microbiol. 2000b. V. 66. P. 2248-2251.

89. Nevin K.P., Lovley D.R. Mechanisms for accessing insoluble Fe(III) oxide during dissimilatory Fe(III) reduction by Geothrix fermentans II Appl Environ Microbiol. 2002 V. 68 (5). P. 2294-2299.

90. Niu L., Song L., Liu X., Dong X. Tepidimicrobium xylanilyticum sp. nov., an anaerobic xylanolytic bacterium, and emended description of the genus Tepidimicrobium II Int J Syst Evol Microbiol. 2009. V. 59. P. 2698-2701.

91. Niftrik L.A., Fuerst J.A., Sinninghe Damste J.S., Kuenen J.G., Jetten M.S., Strous M. The anammoxosome: an intracytoplasmic compartment in anammox bacteria // FEMS Microbiol Lett. 2004. V. 233 (1). P. 7-13.

92. Norris T.B., Wraith J.M., Castenholz R.W., McDermott T.R. Soil Microbial Community Structure across a Thermal Gradient following a Geothermal Heating Event // Appl Environ Microbiol. 2002. V. 68 (12). P. 6300-6309.

93. Nosanchuk J.D., Casadevall A. The contribution of melanin to microbial pathogenesis // Cell Microbiol. 2003. V. 5 (4). P. 203-223.

94. Ogg CD, Patel BK. Fervidicola ferrireducens gen. nov., sp. nov., a thermophilic anacrobic bactcrium from geothermal waters of the Great Artesian Basin, Australia // Int J Syst Evol Microbiol. 2009. V. 59. P. 1100-1107.

95. Ogg C. D. and Patel B.K. C. Fervidicella metallireducens gen. nov., sp. nov., a thermophilic, anaerobic bacterium from geothermal waters // Int J Syst Evol Microbiol. 2010. V. 60. P. 1394-1400.

96. Pierson L.S., Pierson E.A. Metabolism and function of phenazines in bacteria: impacts on the behavior of bacteria in the environment and biotechnological processes // Appl Microbiol Biotechnol. 2010. V. 86 (6). P. 1659-1670.

97. Pfennig N. Z. Bacteriol. Hyg. I. Abt. Suppl. 1965. 1: 179.

98. Powell G.E. Interpretation of gas kinetics of batch cultures // Biotech. Lett. 1983. V. 5 (7). P. 473-440.

99. Reguera G., McCarthy K.D., Mehta T., Nicoll J.S., Tuominen M.T., Lovley D.R. Extracellular electron transfer via microbial nanowires //Nature. 2005. V. 435. P. 1098-1101.

100. Reynolds E. The use of leadcitrate at high pH as an electron opague stain in electron microscopy// J. Cell. Biol. 1963. V. 17. P. 208-212.

101. Reysenbach AL, Liu Y, Banta AB, Beveridge TJ, Kirshtein JD, Schouten S, Tivey MK, Von Damm KL, Voytek MA. A ubiquitous thermoacidophilic archaeon from deep-sea hydrothermal vents. Nature. 2006. 27:444-447.

102. Romine M.F., Carlson T.S., Norbeck A.D., McCue L.A., Lipton M.S. Identification of mobile elements and pseudogenes in the Shewanella oneidensis MR-1 genome // Appl Environ Microbiol. 2008. V. 74. P. 3257-3265.

103. Schlesner H. Planctomyces brasiliensis sp. nov., a halotolerant bacterium from a salt pit // Syst Appl Microbiol. 1989. V. 12. P. 159-161.

104. Schuetz B., Schicklberger M., Kuermann J., Spormann A.M., Gescher J. Periplasmic electron transfer via the c-type cytochromes MtrA and FccA of Shewanella oneidensis MR-1 // Appl Environ Microbiol. 2009. V. 75 (24). P. 7789-7796.

105. Scott D.T., McKnight D.M., Blunt-IIarris E.L., Kolesar S.E., Lovley D.R. Quinone moieties act as electron acceptors in the reduction of humic substances by humics-reducing microorganisms // Environ Sci Technol. 1998. V. 32. P. 2984-2989.

106. Shi L., Squier T.C., Zachara J.M., Fredrickson J.K. Respiration of metal (hydr)oxides by Shewanella and Geobacter: a key role for multihaem c-type cytochromes // Mol Microbiol. 2007. V. 65 (1). P. 12-20.

107. Slobodkin A.I., Wiegel J. Fe(III) as an electron acceptor for H2 oxidation in thermophilic anaerobic enrichment cultures from geothcrmal areas // Extremophiles. 1997. V.l. P. 106-109.

108. Slobodkin A., Reysenbach A.L., Mayer F., Wiegel J. "Isolation and characterization of the homoacetogenic thermophilic bacterium Moorella glycerini sp. nov." // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997b. V. 47. P. 969-974.

109. Slobodkina G.B., Kolganova T.V., Querellou J., Bonch-Osmolovskaya E.A., Slobodkin A.I. Geoglobus acetivorans sp. nov., an iron(III)-reducing archaeon from a deep-sea hydrothermal vent // Int J Syst Evol Microbiol. 2009a. V. 59. P. 2880-2883.

110. Soo R., Wood S.A., Grzymski J.J., McDonald I.R., Cary S.C. Microbial biodiversity of thermophilic communities in hot mineral soils of Tramway Ridge, Mount Erebus, Antarctica // Environ Microbiol. 2009. V. 11 (3). P. 715-728.

111. Stackebrandt E., Ludwig W., Schubert W., Klink F., Schlesner H., Roggentin T., Hirsch P. Molecular genetic evidence for early evolutionary origin of budding peptidoglycan-less eubacteria// Nature. 1984. V. 307. P. 735-737.

112. Stackebrandt E., Hirsch P. Rejection of the genus name Pirella for pear-shaped budding bacteria and proposal to create the genus Pirellula gen. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. P. 441.

113. Stahl D., Amann R. Development and application of nucleic acid probes / In: E. Stackebrandt and M. Goodfellow (Eds.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. 1991. John Wiley and Sons, New York, NY. P. 205-248.

114. Stams A.J.M., Plügge C.M., van Eekert M.H.A., Dolfmg J., Schraa G., Exocellular electron transfer in anaerobic microbial communities // Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 371382.

115. Stetter K.O. Hyperthermophiles in the history of life // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sei. 2006 V. 361. (1474). P. 1837-1842.

116. Steven B., Le veille R., Pollard W., Whyte L. Microbial ecology and biodiversity in permafrost // Extremophiles. 2006. V. 10. P. 259-267.

117. Strous M., Fuerst J.A., Kramer E.H., Logemann S., Muyzer G., van de Pas-Schoonen K.T., Webb R., Kuenen J.G., Jetten M.S. Missing lithotroph identified as new planctomycete //Nature. 1999. V. 400. P. 446-449.

118. Takai K., Kobayashi H., Nealson K.H., Horikoshi K. Sulfurihydrogenibium subterraneum gen. nov., sp. nov., from a subsurface hot aquifer // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003a. V. 53. P.823-827.

119. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution. 2007. V. 24. P. 1596-1599.

120. Thamdrup B. Bacterial manganese and iron reduction in aquatic sediments // Adv. Microb. Ecol. 2000. V. 16. P. 41-84.

121. Thauer R.K., Jungermann K., Decker K. Energy Conservation in Chemotrophic Anaerobic Bacteria// Bacteriological Reviews. 1977. V. 41 (1). P. 100-180.

122. Tor J.M., Kashefi K., Lovley D. R. Acetate oxidation coupled to Fe(III) reduction in hyperthermophilic microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 1363-1365.

123. Tor J., Lovley D.R. Anaerobic degradation of aromatic compounds coupled to Fe(III) by Ferroglobusplacidus II Environ. Microbiol. 2001. V. 3. P. 281-287.

124. Turick C., Tisa L.S., Caccavo F.J. Melanin production and use as a soluble electron shuttle for Fe(III) oxide reduction and as a terminal electron acceptor by Shewanella algae BrY // Appl Environ Microbiol. 2002. V. 68 (5). P. 2436-2244.

125. Vargas M., Kashefi K., Blunt-Harris E.L., Lovley D.R. Microbiological evidence for Fe(III) reduction on early Earth // Nature. 1998. V. 395. P. 65-67.

126. Walker J.C.G. Was the Archaean biosphere upside down? // Nature. 1987. V. 329. P. 710-712.

127. Wangt Y, Newman D.K. Redox reactions of phenazine antibiotics with ferric (hydr)oxides and molecular oxygen // Environ Sci Technol. 2008. V. 42 (7). P. 2380-2386.

128. Wiegel J., Brawn M., Gottschalk G. Clostridium thermoautotrophicum species novum, a thermophile producing acetate from molecular hydrogen and carbon dioxide // Curr Microbiol. 1981. V. 5. P. 255-260

129. Winkelmann N., Jaekel U., Meyer K., Serrano W., Rachel R., Rossello-Mora R., Harder J. Determination of the Diversity of Rhodopirellula Isolates from European Seas by Multilocus Sequence Analysis // Appl Environ Microbiol. 2010. V. 76 (3).P. 776-785.

130. Woese C. R. Bacterial evolution // Microbiol Rev. 1987. V. 51. P. 221-271.

131. Wolff-Boenisch D., Traina S.J. The effect of desferrioxamine B, enterobactin, oxalic acid, and Na-alginate on the dissolution of uranyl-treated goetite at pH 6 and 25°C // Chemical Geology. 2007. V. 243. P. 357-368.

132. Wolin E.A., Wolin M. J., Wolfe R.S. Farmation of methane by bacterial extracts // J.Biol.Chem. 1963. V. 238. P. 2882-2886.

133. Zhang, G., Dong IT, Xu Z, Zhao D, Zhang C. Microbial Diversity in Ultra-High-Pressure Rocks and Fluids from the Chinese Continental Scientific Drilling Project in China // Appl Environ Microbiol. 2005. V. 71 (6). P. 3213-3227.

Информация о работе

Непомнящая, Яна Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в термофильных железовосстанавливающих сообществах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы