Физиологические и биохимические механизмы диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens (syn. Thermoterrabacterium ferrireducens)

Гаврилов, Сергей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиологические и биохимические механизмы диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens (syn. Thermoterrabacterium ferrireducens)
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологические и биохимические механизмы диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens (syn. Thermoterrabacterium ferrireducens)"

На правах рукописи

111111111111111111

ГАВРИЛОВ Сергей Николаевич О □ 3 О 6 3 О Э 3

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДИССИМИЛЯЦИОННОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ Ре(Ш) ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИЕЙ СагЬохуйоЛегтш /егпг&Лисет (эуп ТЪегто1еггаЬас1ег1ит/егпгес/исет)

Специальность 03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

Москва 2007

Работа выполнена в Институте микробиологии им С Н Виноградского РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук А.И. Слободки н

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

В.М. Горленко

доктор биологических наук М.Ю. Грабович

Ведущая организация:

Биологический факультет МГУ им М В Ломоносова, г Москва

Защита диссертации состоится 28 мая 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002 224 01 в Институте микробиологии им СН Виноградского РАН по адресу 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д7, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им С Н Виноградского РАН

Автореферат разослан ^-апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Хижняк Т В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Железо - четвертый по распространенности химический элемент земной коры - может использоваться прокариотами в качестве акцептора электронов в диссимиляционных процессах [Заварзин, 2004] Микробное восстановление Fe(III) является важным путем окисления органического вещества во многих экосистемах Биогеохимический цикл железа сопряжен с циклами углерода, кислорода и серы и оказывает значительное экологическое воздействие на современную окружающую среду [Lovley, 1991, Nealson, Saffarini, 1994, Thamdrup, 2000] Современные гидротермальные экосистемы рассматриваются как реликты древнейшей биосферы Земли, и процессы, протекающие в них, могут служить моделью для реконструкции древних биоценозов [Заварзин, 2001] Термофильные железовосстанавливающие прокариоты населяют практически все известные типы термальных систем [Слободкин, 2005] Согласно существующим гипотезам, диссимиляционное восстановление Fe(III) могло быть первым возникшим типом метаболизма и являться глобально значимым процессом окисления органического вещества в Архее и Протерозое [Walker, 1987, Lovley, 2005]

Изучение физиологических стратегий и биохимических механизмов диссимиляционного восстановления Fe(III) важно для понимания взаимодействий между микробными клетками и минералами в природных условиях, где при нейтральных значениях pH соединения трехвалентного железа существуют в виде нерастворимых оксидов Детальные исследования физиологии и биохимии диссимидяционной железоредукции до настоящего времени проводились лишь для представителей мезофильных родов Shewanella и Geobacter, имеющих грамотрицательный тип клеточной стенки В ходе этих работ были открыты фундаментальные механизмы передачи электронов на нерастворимый акцептор с помощью веществ-переносчиков или электропроводящих пилей, контактирующих с минералом железа [Lovley et al, 1998, Newman, Kolter, 2000, Gorby et al, 2006] К настоящему времени описано более 20 содержащих гем с белков, участвующих в транспорте электронов к Fe(III), однако не известно ни одного фермента, которому может быть приписана функция терминальной железоредуктазы т vivo Информация о физиологии и биохимии диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильными микроорганизмами ограничена единичными сообщениями [Vadas et al, 1999, Childers, Lovley, 2001, Femberg, Holden, 2006]

Многие железоредукторы способны восстанавливать токсичные металлы и радионуклиды (Cr(VI), Tc(VII), U(VI)) с образованием малорастворимых соединений, что может быть использовано при разработке технологий биоремедиации Минералы, формирующиеся при микробном восстановлении металлов, могут найти применение в современных нанотехнологиях, а также как носители в высокочувствительных методах анализа [Lloyd, 2003, Berensmeier, 2006]

В связи с вышеизложенным, исследования физиологических и биохимических механизмов восстановления Fe(III) термофильными прокариотами представляют научный и практический интерес

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являлось выяснение физиологии роста, а также стратегий и биохимических механизмов восстановления трехвалентного железа термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens Конкретные задачи исследования состояли в следующем

1 Исследовать способность С ferrlreducens к устойчивому литоавтотрофному росту с Ре(Ш) в качестве акцептора электронов и определить кинетические характеристики этого процесса

2 Выяснить функции восстановления Ре(Ш) в метаболизме С /егпгес!исет при органотрофном росте

3 Изучить физиологические стратегии восстановления нерастворимого оксида Ре(1П) и биохимические механизмы диссимиляционной железоредукции

4 Исследовать способность С fernreducens к восстановлению токсичных и радиоактивных металлов переменных валентностей

Научная новизна. Впервые охарактеризованы физиологичеале стратегии восстановления нерастворимых форм Ре(Ш) и мембраносвязанные железоредуктазные активности у микроорганизма с грамположительным типом клеточной стенки, диссимиляционно восстанавливающего железо Полученные результаты расширяют представления о возможных физиолого-биохимических механизмах восстановления Ре(Ш) у различных филогенетических групп диссимиляционных железоредукторов

Обнаружено, что экзогенный сидерофор может стимулировать диссимиляционное восстановление Ре(Ш) в отсутствие свободного доступа клеток к нерастворимому акцептору Механизм стимуляции заключается в многократном использовании сидерофора в качестве челночного медиатора, переносящего ион Ре3+ Подобный механизм диссимиляционной железоредукции ранее описан не был

Впервые продемонстрирована способность термофильных бактерий восстанавливать технеций(УН), а также использовать уран(У1) в качестве акцептора электронов для роста

Практическая значимость. Обнаружена способность С ftrnreducens к восстановлению токсичных и радиоактивных соединений хрома(У1), технеция(УП) и урана(У1) Образующиеся восстановленные формы Сг(Ш), Тс(1У) и и(1У) обладают значительно меньшей растворимостью и могут быть удалены из жидкой среды Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых технологий очистки горячих радиоактивных стоков, а также для биоремедиации подземных захоронений радиоактивных отходов, подверженных саморазогреванию, либо попавших в геотермально нагреваемые зоны

Полученные сведения о механизмах микробного восстановления нерастворимых форм Ре(Ш) могут способствовать разработке технологий получения биогенных минералов железа, обладающих особыми магнитными свойствами или характеристиками поверхности

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на следующих научных конференциях З'й международный конгресс по экстремофильным микроорганизмам "ЕхйешорМез 2000" (Гамбург, Германия), международная конференция по биологии и биотехнологии термофилов "ТЪегторМеБ 2001" (Нью Дели, Индия), международный конгресс "ЕхйгеторМез 2002" (Неаполь, Италия), 1'й конгресс европейских микробиологов РЕМБ (Любляна, Словения, 2003), международный конгресс "Ех^еторМеБ 2004" (Кеймбридж, Мэриленд, США), 2'й конгресс РЕМБ (Мадрид, Испания, 2006) На всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005) работа была отмечена как лучшее стендовое сообщение

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов, 1 статья сдана в печать

Место проведения работы Работа выполнялась в Лаборатории

гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им С H Виноградского РАН Очистка и характеристика железоредуктазной активности была выполнена во время стажировки в Лаборатории биотехнологии Технологического университета г Делфт (Нидерланды) под научным руководством проф д-ра С Де Вриса Работы с технецием(УИ) проводились в Лаборатории радиохимических исследований Института физической химии и электрохимии РАН в сотрудничестве с к х h К Э Германом Исследования способности С ferrireducens к восстановлению хрома(У1) и урана(У1) проводились совместно с сотрудниками Лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН д б н H H Медведевой-Ляликовой и к б н ТВ Хижняк

Определение валентного состояния урана выполнили сотрудники Института общей и ядерной физики Научного Центра «Курчатовский институт» H Г Яковлев и И Е Велешко Электронную микроскопию и рентгеновский микроанализ проводили совместно с H А Кострикиной и В В Сорокиным (ИНМИ РАН)

Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ 06-04-48684-а и 04-03-22000-CNRS, АФГИР (CRDF) RB-2-2379-MO-02C, ИНТАС 01-151, НАТО CLG-LST-978616, NSF (Grant МСВ02383387 to F TR), программ CNRS №2730, Молодежного научного сотрудничества FEMS («Восстановление железа термофильными прокариотами»), Президиума РАН («Молекулярная и клеточная биология»)

Автор приносит искреннюю благодарность всем упомянутым выше участникам работы, а также всем сотрудникам и аспирантам Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН и Лаборатории биотехнологии Т У г Делфт за поддержку и участие в этой работе Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к б н А И Слободкину и зав лаб Гипертермофильных микробных сообществ д б н Е А Бонч-Осмоловской за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов

Объём п структура диссертации Материалы диссертации изложены на 214 страницах машинописного текста и включают 32 рисунка и 12 таблиц Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Выводы» и «Список литературы», включающий в себя 289 наименований

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования была термофильная железовосстанавливающая бактерия Carboxydothermus ferrireducens с грамположительным типом клеточной стенки Данная бактерия была выделена и описана как Thermoterrabactermm ferrireducens А И Слободкиным с соавт в 1997 г [Slobodkin et al, 1997(a)] На момент окончания нашей работы организм был реклассифицирован как Carboxydothermus ferrireducens [Slobodkin et al, 2006(b)] В экспериментах по органотрофному росту рассматривался также термофильный грамположительный железоредукгор Thermoanaerobacter siderophihts Типовые штаммы обеих бактерий -JW/AS-Y7 -DSM 11255т и SR4T=DSM 12299т, соответственно, - были получены из Немецкой коллекции микроорганизмов (Deutsche Summlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Брауншвейг, Германия)

Состав сред и условия культивирования. Для поддержания культур Carboxydothermus ferrireducens и Thermoanaerobacter siderophüus использовали базовую анаэробную среду (I), описанную ранее [Slobodkin et al, 1997(a)] и содержащую 90 мМ Fe(III) в форме ферригидрита и 0,2 г/л дрожжевого экстракта в качестве фактора роста, с газовой фазой 100% С02 В качестве углеродного субстрата

и донора электронов для Thermoanaerobacter siderophilns использовали пептон (12,5 г/л), а для Carboxydothermus ferrireducens - глицерин (30 мМ) или пептон. Помимо среды I использовали также среды, содержащие вместо ферригидрита фумарат Na (20 мМ) (II), АХДС (9,10-антрахинондисульфонат - 20 мМ) (III), или цитрат Fe(III) (20 мМ) (IV) в качестве акцепторов электронов, среду «без акцепторов» (V) и восстановленную среду без акцепторов (VI), содержащую 0,7 г/л NajS 9Н20 При культивировании Carboxydothermus ferrireducens с фумаратом среду также предварительно восстанавливали сульфидом Для определения влияния Fe(II) на органотрофный рост С ferrireducens использовали среды VII и VIII без акцепторов электронов, содержащие, соответственно, 5 мМ FeS04 7Н20 и химически синтезированный магнетит (20 мМ Fe(II)) Эксперименты по литоавтотрофному росту с Н2 проводили на среде I, не содержащей органических веществ В процессе приготовления среды через неё пропускали газообразный С02 (ОСЧ, 99,995 об%), который в этом случае служил единственным источником углерода Газовую фазу заполняли 100% Н2, а при определении порога потребления Н2 - смесью 5,0 об % Н2 и 95,0 об % С02 В ростовых экспериментах с хромом и ураном использовали среду V, содержащую, соответственно, 156-1000 мкМ Cr(VI) в форме СЮ42" или Сг207 , либо 2,5 мМ UO2SO4 Во всех случаях культивирование вели при 65°С При этой температуре величина pH всех использованных сред составляла 6,5-6,8 В экспериментах по определению стратегии железоредукции использовали среду со свободным ферригидритом (I) и с ферригидритом, изолированным от прямого контакта с клетками в 1,4% геле агара (см рис I) Культивирование С ferrireducens при этом вели в жидкой части среды, с глицерином в качестве углеродного субстрата Среду готовили по методике, описанной ранее [Straub, Slunk, 2003], сидерофор ДФО (мезилат десферриоксамина В (Sigma)), как и АХДС, добавляли из отдельно стерилизованного концентрированного водного раствора, в отрицательные кошроли вместо инокулята добавляли препараты убитых клеток, либо фильтрат культуры С ferrireducens, выращенной на среде (I)

Все ростовые эксперименты проводили с использованием анаэробной техники Хангейта в пробирках с объемом жидкой фазы 10 мл и газовой - 7 мл Биомассу для получения клеточных суспензий наращивали в сывороточных бутылках с объемом жидкой фазы 250 мл и газовой - 200 мл При культивировании с изолированным ферригидритом инокулят добавляли в количестве 10 об %, в остальных случаях - 5 об%

Оценка роста. Количество клеток определяли прямым подсчетом с помощью световой фазово-контрастной микроскопии (микроскоп МИКМЕД, ЛОМО, Россия) Нерастворимые формы Fe растворяли в оксалатном буфере, как описано ранее [Гаврилов и др , 2003]

Получение клеточных суспензий. Для экспериментов с суспензиями целых отмытых клеток культуры собирали в поздней экспоненциальной фазе роста на микрофильтре (размер пор 0,2 мкм) в атмосфере 100% С02 Клетки смывали с поверхности микрофильтра и отмывали анаэробно (100% N2) 20 мМ МЭС-буфером с pH 6,5, затем анаэробно (С02) ресуспендировали в свежей ростовой среде V в отсутствие органических соединений, доноров и акцепторов электронов до конечной плотности порядка 1010 кл/мл При сборе клеток, выращенных с ферригидритом, железосодержащий осадок растворяли в оксалатном буфере Для растворения железосодержащих осадков, образующихся при росте С ferrireducens с цитратом железа, к выросшим культурам анаэробно добавляли 6 н HCl до pH 5,0 Все клеточные суспензии перед использованием хранили при +4°С не более 48 часов

Рис, I. Среды со свободным и изолированным феррнгидритом

Среда со свободным Среда с изолированным

феррнгидритом (90 мМ Fe(III)) фсрригидрнтом <32 мМ Fe{IlI))

пробирки. J. - культура в жидкой среде (5 ил);

2 - 1,4% гель агара с феррнгидритом (5 мл);

3 - увеличение плотности частиц ферри гидрита в агаре.

Определение железовосстанавливающей активности проводили по следующей методике: адиквоты свежих клеточных суспензий добавляли (до плогности 10Ч кл'мл) к 1 мл реакционной смеси, состоящей из анаэробной ростовой среды V (не содержащей микроэлементов и органических веществ), глицерина (30 мМ) или Hj в качестве донора электронов и Ре(1ИУЭДТА (10 мМ), цитрата Ре(Ш) (20 мМ), либо ферригадрита (90 мМ Fe(JII)) в качестве акцептора. Реакционную смесь инкубировали при 65°С и кинетику восстановления Fe(Iil) отслеживали с помощью определения концентрации Fe(II) с дипиридилом [Резников и др., 1970] в анаэробно отбираемых пробах (0,05 мл). В качестве отрицательных контролей использовали реакционные смеси без клеток, либо донора электронов. Эксперименты проводили в газ охромато графических пробирках объёмом 2 мл. Газовую фазу заполняли 100% СО, или N ; При исследовании влияния ингибиторов ¿иыхательной цепи и хелатора Fe(lII) на жслезовосстанавлнваюшую активность в реакционную смесь с феррнгидритом добавляли ротенон, 2-я-гептил-4-гидрокснхинолин-Ы-оксид (HQNOJ, карбонилцианид-л<-хлорофенш1гидразон (КЦХФ) из 1-100 мМ анаэробных (N2) растворов в 100% ДМСО, либо хелатор ДФО из 76 мМ анаэробного (N;) водного раствора. Еесклеточные экстракты добавляли в реакционную смесь до концентрации белка, соответствующей суспензии целых клеток С. ferrireducens плотностью 10 кл/мл.

Исследование восстановлении CriVD. TcfVID и UlVI) клеточными суспензиями. В экспериментах по восстановлению Cr(VI), U(VI) и Tc(Vir) использовали суспензии клеток, выращенных на средах V и VI, В случае Тс(УЩ и ЩЛЩ состав реакционной смеси и набор отрицательных контролей были аналогичны использовавшимся для определения железовосстанавливаюшей активности. В качестве донора электронов использовали Н3 (100% в газовой фазе). Вместо соединений Fe(III) добавляли раствор пертехнетата калия (КмТс04) до концентрации Тс 100 мкМ, либо уранилсульфата (UO2SO4) до конспирации 2,5 мМ. Реакционная

смесь с ураном не содержала фосфатов Свежие клеточные суспензии вносили в количестве 0,5 мл Кинетику удаления 1с из раствора определяли в отбираемых образцах (0,2 мл), измеряя их радиоактивность на ß-эмиссионном сцинтилляционном счетчике Концентрацию растворённого Тс рассчитывали по формуле Стс[М]=А/К, где А - радиоактивность 1 л супернатанта образца в СРМ (деления в минуту), К -удельная радиоактивность Тс (СРМ/моль/л) Концентрацию и валентное состояние урана определяли спектрофотометрически в пробах, отбираемых перед началом и по окончании инкубирования Реакционная смесь для определения СгГУТ)-восстанавливающей активности состояла из анаэробного (100% N2) МЭС-буфера с pH 6,5-6,8, содержащего 0,25-1 мМ Cr(VI) в форме хромата или бихромата калия, Н2 (100% в газовой фазе), либо 1 из следующих органических доноров электронов пептон (12,5 г/л), глицерин, сорбит, пируват, лактат, ацетат, сахароза (по 20 мМ), сукцинат (16 мМ). Эксперименты проводили в пробирках Хангейта с объемом жидкой фазы 5 мл и газовой - 12 мл Газовую фазу заполняли 100% N2 или Н2 Клеточные суспензии добавляли до конечной плотности порядка 4109 кл/мл Инкубирование вели при 65°С, кинетику восстановления Cr(VI) оценивали посредством определения его концентрации с дифенилкарбазидом [Сендел, 1964] в периодически отбираемых пробах (0,1 мл) В качестве отрицательных контролей использовали реакционные смеси без клеток, либо донора электронов

Методики определения железоредуктазной активности с НАД(Ф')Н в качестве доноров электронов, а также спектрофотометрического определения оксидоредуктазной активности приведены в публикации по материалам диссертации [Гаврилов и др , 2007]

Во всех экспериментах, связанных с определением железовосстанавливающей активности, ее выражали как количество нмоль Fe(III), восстановленное за 1 мин (mU) и отнесенное к общему содержанию белка (мг) или клеток (107 кл) в реакционной смеси

Экстракция белков поверхностного слоя клеточной стенки. Для экстракции белков, локализованных на внешней стороне клеточной стенки, без разрушения клеток, был использован модифицированный метод, описанный ранее [Tavares, Sellstedt, 2000] К аликвоте клеточной суспензии плотностью 1010 кл/мл добавляли неионный детергент тритон XI00 из насыщенного N2 раствора до 0,05 об% Экстракцию вели в газохроматографических пробирках объемом 2 мл анаэробно (100% N2) в течение 30 мин при 20°С и постоянном перемешивании После экстракции клетки анаэробно отделяли центрифугированием, отмывали МЭС-буфером (pH 6,8) и ресуспендировали в свежей ростовой среде V до плотности Ю10 кл/мл Целостность клеток контролировали микроскопически и посредством параллельного высева аликвот полученной суспензии и культуры микроорганизма, выращенной с ферригидритом, на среду I Инокулят в обоих случаях добавляли до одинаковой концентрации клеток Все манипуляции с клеточными суспензиями, предназначенными для последующего посева, проводили в стерильных условиях

Очистку РеШР-ЭДТА-редуктазных активностей производили посредством последовательной высокоэффективной жидкостной хроматографии с анионообменной смолой POROS HQ, гидроксиапатитом CHT и слабой анионообменной смолой ДЭАЭ-Сефарозой Во всех элюатах автоматически спектрофотометрически детектировали содержание белка и гема с Подробное описание метода очистки активностей приведено в публикации по материалам диссертационной работы [Гаврилов и др , 2007]

Электрофоретическую характеристику очищенных Fe(IIP-3flTA-редуктазных активностей проводили с применением стандартных методов нативного и денатурирующего (ДСН) ПААГ-электрофореза на установке Phast system (Amersham Biosciences), используя 12,5% гомогенные, а также 4-15% и 8-25% градиентные ПАА-гели Подробное описание указанных методов изложено в публикации по материалам диссертационной работы [Гаврилов и др , 2007]

Аналитические методы. Концентрацию летучих жирных кислот определяли по методикам, описанным ранее [Слободкин и др, 1995] Концентрацию глицерина, ацетата, фумарата, сукцината и цитрата в фильтратах соответствующих культур определяли хроматографически на жидкостном хроматографе, оборудованном колонкой со смолой Aminex НРЕХ-87Н (BioRad) и рефрактометрическим детектором В качестве элюэнта использовали 5 мМ H2SO4 Концентрацию молекулярного водорода определяли газохроматографически (хроматограф - Chrom 5 (Чехия), детектор - катарометер, газ-носитель - N2, неподвижная фаза - активированный уголь АГЗ, минимальный порог чувствительности по водороду - 2 10'5 об %)

Концентрацию Fe(II) в экспериментах с изолированным ферригидритом определяли с дипиридилом, отдельно для жидкой и агаризованной частей среды После окончания инкубирования жидкую часть среды полностью удаляли (анаэробно), а агаризованную плавили выдерживанием при 85°С около 15 мин Аликвоту расплавленного агара разводили в 2 раза 6 н HCl и выдерживали при комнатной температуре до полного растворения железосодержащего осадка (около 10 мин), затем разбавляли в 5 раз дистиллированной водой и определяли концентрацию Fe(II) с дипиридилом согласно [Резников и др, 1970] Валентное состояние Тс определяли с помощью тонкослойной бумажной хроматографии по методу, описанному ранее [Lloyd, Macaskie, 1996] Осаждённый Тс предварительно отделяли центрифугированием, суспендировали в 1 н HCl в атмосфере 100% N2 и экстрагировали в течение 16 ч Валентное состояние и концентрацию различных форм урана определяли по характерным пикам поглощения при 450 нм (для U(VI)) и 650 нм (для U(IV)) Растворимый уран отделяли центрифугированием, аэробно, нерастворимые формы перед определением экстрагировали аэробно в 6 М HCl в течение суток

Концентрацию белка в суспензиях целых клеток и в клеточных фракциях с нерастворимыми белками определяли модифицированным методом Лоури с предварительным щелочным гидролизом образца [Герхард, 1983], а во фракциях с растворимыми или солюбилизированными белками - с бицинхониновой кислотой согласно протоколу Procedure TPRO-562 (Sigma)

Количество восстановленного комплекса Ре(Ш)-ДФО определяли спектрофотометрически по снижению светопоглощения образца культуры при 430 нм (молярный коэффициент поглощения Ре(Ш)-ДФО - 2,64 [мМ" см' ])

Электронную микроскопию и рентгеновский микроанализ проводили на электронном микроскопе JEM-100CXII (JEOL, Япония), оборудованном сканирующим устройством EM-ASID4D и рентгеновским микроанализатором LINK-860 с детектором Е5423 (Lonk-System, Великобритания) Рабочее напряжение микроскопа составляло 60 кэВ (увеличение 20000) Рентгеновские спектры записывали в 3-5 повторностях для каждого образца

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Литоавтотрофный рост С. /егпгес1исеп5 с Ре(Ш) в качестве акцептора электронов

При первичном описании С ferr^reducens была продемонстрирована потенциальная способность этого организма к литотрофному росту в атмосфере Н2/С02, в присутствии ферригидрита и органических факторов роста [81оЬос1к1П е/ а1, 1997(а)] Однако возможность устойчивого роста С ferrlreducens в этих условиях в течение нескольких пересевов, зависимость роста от наличия витаминов и минимальная концентрация потребления Н2 исследованы не были В результате проведенных нами экспериментов был обнаружен устойчивый литоавтотрофный рост организма на среде, содержащей ферригидрит, молекулярный водород и С02, но не содержащей каких-либо органических веществ (рис 11) Увеличение числа клеток при этом согласовывалось с восстановлением железа(Ш) и потреблением Н2 В отсутствие водорода или СО2 роста и восстановления Ре(Ш) не наблюдалось Среднее стехиометрическое отношение образовавшегося Ре(11) к потребленному Н2 составляло 2,4, минимальный порог потребления Н2 - 3 10 об% (3 р р т V) Полученные данные позволяют утверждать, что рост С femreducens в атмосфере Н2/С02, сопряженный с восстановлением ферригидрита, вызван способностью микроорганизма к использованию Ре(Ш) как единственного акцептора электронов в катаболических процессах, то есть способностью организма к железному дыханию

Рис. 1.1. Литоавтотрофный рост ferrlreducens на среде с

5 о ферригидритом, Н2 и С02

О)

3 Т"-

1 - рост,

2 - потребление водорода,

3 - образование Бе(11)

100 120 140 160 180

2. Влияние Гс(Ш) на органотрофный рост С. /еггЬеЛисепй

При первичном описании С /егп^исет было обнаружено, что органотрофный рост этого организма, основанный на гомоацетатном окислении глицерина с СОг как основным акцептором электронов, стимулируется в присутствии Ре(1П) и сопровождается его восстановлением Возможными причинами этой стимуляции, кроме использования железа(1П) в качестве акцептора электронов, могут быть ассимиляция дополнительного количества железа из среды, либо снижение её окислительно-восстановительного потенциала вследствие образования Ре(П) Проведенный нами анализ выявил, что стимуляция органотрофного роста С/егп^исет на глицерине в присутствии Ре(1П) имеет диссимиляционный характер Об этом свидетельствуют максимумы концентрации клеток и скорости роста, наблюдавшиеся в присутствии ферригидрита (восстанавливаемого до

магнетита) и отсутствие подобных изменений характеристик роста при культивировании организма на средах, содержащих соединения Бе(П), либо средах без железа, восстановленных сульфидом и обладающих низким Еь (рис 2 1)

Железоредукдия стимулировала органотрофный рост С /етгес1исет и с пептоном, что выражалось в увеличении урожая клеток и в изменении состава смеси продуктов катаболизма, характеризующем более полное окисление углерода в присутствии ферригидрита (рис 2 2,А) Для сравнения, подобное влияние Ре(Ш) на потребление пептона наблюдалось и другого термофильного грамположительного железоредуктора - ПегтоапаегоЬаМег я1с1егорЫиз (рис 2 2,Б), обладающего бродильным типом метаболизма и оказавшегося неспособным к литоавтотрофному росту с Н2 и ферригидритом (данные не показаны) Ни у одного из указанных организмов в присутствии ферригидрита полного окисления пептона не происходило и, вероятно, получение ими энергии при росте с данным субстратом связано с процессами брожения, вне зависимости от наличия железа в среде

Учитывая это, а также данные по стимуляции роста СагЬоху^Легтт /етгеЛисет с глицерином в присутствии ферригидрита можно заключить, что данный организм способен не только к железному дыханию, но и к использованию Ре(Ш) в качестве дополнительного акцептора электронов при органотрофном росте, сопряженном с неполным окислением углеродного субстрата Для определения эффективности использования Ре(Ш) как дополнительного акцептора было произведено сравнение величины урожая клеток и интенсивности потребления глицерина при восстановлении разных акцепторов электронов Результаты показали, что органотрофный рост С /егпге&шет в данных условиях стимулируется не только различными формами железа(Ш), но и растворимыми акцепторами - фумаратом и АХДС Однако в любом случае, глицерин окисляется только до ацетата и величина стимуляции роста не коррелирует с изменением термодинамики окисления (табл 1) Тем не менее, из рассмотренных форм железа наиболее энергетически выгодным акцептором электронов оказался нерастворимый ферригидрит, обеспечивающий максимальный урожай клеток

Таблица 1. Эффективность использования различных акцепторов электронов при росте С ^етгеАисет на глицерине_

Условия культивирования Дополнительные акцепторы электронов, кроме С02

нет дои акцептора фумарат АХДС цитрат Ге(Ш) ферригидрит

Урожай, 107 клеток/мл 36 72 79 66 80

Потребленный глицерин, мМ 6,63 7,06 11,3 11,9 10,7

У, 107 кл/ммоль потребленного глицерина 5,43 10,2 7,01 5,55 7,46

АгО°а, кДж/моль глицерина -151,5 -193,0 -194,2 -248,3 -251,4

"Уравнения предполагаемых реакций окисления глицерина до ацетата без доп акцептора 4С3Н803 + 2НС03" -> 7С2Н302" + 5Н+ + 4Н20

с фумаратом 8С3Н803 + 2НС03 + 4С4Н2042 — 13С2Н302" + 11Н+ + 4НгО + 4С4Н4042' с АХДС 8С3Н803 + 2НС03" + 4АХДС 13С2Н302' + 11Н+ + 4Н20 + 4АХДСН2 с цитратом Ре(Ш) 8С3Н803 + 2НС03" + ЯРеС6Н507 -> 1ЗС2Н302" + 11Н+ + 4Н20 + 8Р'еС6Н607 с ферригидритом 8С3Н803 + 2НС03' + 24Ре(ОН)3 — 13С2Н302" + ИНГ + 44Н20 + 8Ре304

Исследование восстановления различных форм Ре(Ш) суспензиями целых клеток С /етгес1исепз показало, что данный организм обладает несколькими желез овосстанавливающими активностями с различной специфичностью к растворимым и нерастворимым формам Ре(Ш) На проявление той или иной железовосстанавливающей активности влияют условия, при которых культивировались клетки (рис 2 3), однако способность к восстановлению нерастворимого ферригидрита является конститутивной

Л•

Л'

Рис. 2.1. Влияние Ре(1П) на органотрофный рост С/етгес1исеп5 с глицерином и ССЬ

Он

1 - среда с ферригидритом, 2- среда с химически синтези-

О 20 40 60 80 100 120 140 160 180

рованным магнетитом,

3 - среда с добавлением Ре804, 4- среда без железа, восстано-

Й 49 -

вленная сульфидом Иа (ТЕ^О),

5 - невосстановленная среда без

к • - . 4

железа (Еь~0)

0 -,—-,--,-г-,-,--,

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Пептон Пептон + Fe(ll!) Пептон I Пептон + Fe(lll)

Рис. 2Д. Влияние Fe(Hl) на рост с пептоном и образование продуктов метаболизма у С. ferrireducens (А) я Т. siderophilus (Б)

* Максимальная концентрация клеток, наблюдавшаяся за 180 часов культивирования при подсчёте клеток каждые 24 часа.

Доноры £ для суспензий

Акиехггорь[ с кроме СО}, для культур

Рис. 2,3, Железовосстакавливающая активность суспензий целых клеток С.(еггтсЬ<сет, выращенных с глицерином и различными акцепторам« электронов

3. Физиологические стратегии восстановления нерастворимого Ге(П1) С./етгеЛисепя

В настоящее время считается, что для восстановления нерастворимого акцептора электронов, в частности минерального Ре(Ш), микроорганизмы применяют две принципиально различные стратегии прямой контакт клетки и поверхности минерала или использование растворимых веществ-переносчиков При изоляции клеток С/етгес1исет от прямого контакта с ферригидритом путем включения его в 1,4% гель агара, наблюдалось значительное снижение скорости роста, урожая клеток и количества образуемого культурой Ре(11) (рис 3 1) Этот эффект может быть вызван как отсутствием прямого контакта клетки с минералом, так потерями в результате диффузии продуцируемых организмом хелаторов или веществ-переносчиков электронов, значительно сокращающимися при нахождении клеток в непосредственной близости от нерастворимого акцептора Восстановление ферригидрита, изолированного от контакта с клетками, свидетельствует о том, что С /етгесЬкепя способен к продукции собственных веществ-переносчиков электронов или хелаторов Ре(П1) (рис 3 1,Б) Однако, эти вещества, вероятно, секретируются в достаточно низких концентрациях, т к добавление фильтрата выросшей культуры в среду с ферригидритом не приводит к стимуляции роста и восстановления Ре(Ш) (рис 3 1) При свободном доступе С femreducens к ферригидриту добавление в среду челночного переносчика электронов АХДС или хелатора Ре(ГО) ДФО не оказывало существенного влияния на рост организма (рис 3 1,А), однако, в условиях изоляции клеток от минерала добавление этих веществ значительно увеличивало скорость роста и урожай (рис 3 1,Б) Количество образовавшегося Ре(П) в случае свободного доступа к минералу значительно возрастало только при добавлении АХДС, а в условиях изоляции ферригидрита - при добавлении как АХДС, так и ДФО Таким образом, при пространственной близости клеток и минерала не происходит лимитации роста нерастворимым акцептором, - С /гтгейисет максимально реализует собственные механизмы железоредукции Перенос электронов на растворимый АХДС очевидно происходит с более высокой скоростью, чем на нерастворимый ферригидрит, однако энергетический выход восстановления АХДС меньше, чем восстановления Ре(Ш) Таким образом, восстановление ферригидрита за счет его химического взаимодействия с АХДСН2 не стимулирует рост. При ограничении доступа к ферригидриту рост С /етгейисет лимитируется концентрацией растворимых веществ-переносчиков электронов или растворимого Ре(Ш) и присутствие экзогенных медиаторов или хелаторов железа в этом случае стимулирует рост В условиях свободного доступа к ферригидриту, добавление АХДС повышает урожай и количество восстановленного железа в диапазоне концентраций 10'-10 мкМ, дальнейшее увеличение концентрации АХДС не влияет на рост и железоредукцию (рис 3 3) Следовательно, можно предположить, что концентрация веществ-переносчиков, продуцируемых С /егпгейисепз, лежит ниже этих значений Полученные результаты указывают на то, что организм не обладает эффективным механизмом продукции собственных веществ-переносчиков, при наличии которого железоредукция не должна зависеть от присутствия экзогенных медиаторов Вероятно, при свободном доступе С /егп^исепз к ферригидриту, основной стратегией восстановления Ре(Ш) является прямой контакт клеток с поверхностью минерала, а продукция веществ-переносчиков играет заметную роль при невозможности контакта

135

120 , + „ г - во

105

с;

I 75

■ь 60 $ / \ | I Ц| эо Рис- 3.1, Рост и образо-

' " 1 вание Ре(П) культурой

2о С./егпгеЛисепз при наличии (А) и отсутствии (Б) контакта

15 I 1 | | клеток с ферригидригтом,

ой---г—,-,—----------В Д_а_.1 ] о на средах;

О 20 40 ВО ВО 100 120 140 1В0

Время, ч. ре{м) в осадке 1 - С 200 мкМ АХДС;

2-с 200 мкМДФО;

3- с 50 об.% фильтрата культуры, выращенной со свободным ферригидритом;

4- без экзогенных медиаторов железоредукши.

1 20

5 15

'о

ь 10

О 20 40 ВО 80 100 120 140 160

Время, ч. Fe(ll) в агаре

Следует особо отмстить полученные данные, показывающие, что а отсутствие свободного доступа к нерастворимому акцептору рост и восстановление Fe(IIÏ) у C.ferrireducem стимулируются добавлением бактериального сидерофора ДФО (рис. 3,1,Б). При этом происходит образование комплекса Ре(1П)-ДФО (со сгехиометрией 1:1), который затем восстанавливается растущей культурой параллельно с образованием Fe(II). Количество Fc(II), дополнительно образующегося в присутствии ДФО, превышает количество добавленного лиганда в 12 раз (1 моль ДФО способен связывать I моль Fe{lll)), т.е. происходит многократное использование хелатора по циклическому механизму. На диссимиляционный характер этого процесса указывает внеклеточная локализация образующегося нерастворимого Fe(II) и его количество, значительно превышающее возможные биосинтетические потребности клетки (десятки мкМ Fe в среде [Andrews et al, 2003]). Ещё больший эффект ДФО оказывает на ферригидрит- восста н а в л ивающую активность клеточных суспензий C.ferrireducem (рис. 3.3), Пред по латается, что подобный циклический механизм работы сидсрофоров, имеющих высокое сродство к Fe(IIl) и низкое сродство к Fe(Il), реализуется при запасании м икроор ган из мами железа для ассимиляционных целей [Andrews étal., 2003]. О способности сидерофоров стимулировать диссимиляционную железоредукцию ранее не сообщалось. До настоящего времени считается, что при диссимияяционной желеторедукцни только вещества-переносчики электронов могут

работать по циклическому (челночному) механизму, наши данные показывают, что и хелаторы, образующие высокоустойчивые комплексы с Ре(П1) и неустойчивые комплексы с Ре(П), могут многократно использоваться для переноса иона Ре3+ (рис. 3.4} при его диссимилянионном восстановлении.

Концентрация АХДС: мкМ ] Образование Ре(!1), мМ £3 Урожай

Рис. 3.2. Влияние АХДС на восстановление Ре(ИГ) и урожай клеток при свободном доступе С. }егг1гес1исеп5 к ферригидриту

Рис. 3.3. Влияние ДФО на восстановление ферригид-рита клеточной суспензией С. /егпгес{исет

I - удельная железовос-ст анавл квающая активность суспензии;

2- количество нерастворимого Ре(П), образованное за 48 ч. инкубирования.

без ДФО

100 эо 80 70 60 | 50

40 "гг ш

30 20 10

+ 3,4 мМ ДФО+ 6,5 мМ ДФО

Рнс. 3.4. Предполагаемый механизм челночного использования сидерофора ДФО при диссимиляционном восстановлении ферригидрита С. /егпгес1исе№

4. Биохимические механизмы восстановления Ре(Ш) у С. /егпгейисет

Большинство описанных на сегодняшний день белков, участвующих в переносе электронов на Ре(Ш) у диссимиляционных железоредукторов, содержат гем с Наличие гемов этого типа было определено и у С /етгес1исеп5 Дифференциальное спектроскопирование бесклеточных экстрактов организма (окисленные препараты против восстановленных) выявило присутствие в них цитохромов с по характерным пикам светопоглощения при 420, 526 и 552 нм

Для проверки наличия у С /егпгес!исепз электронтранспортной цепи (в состав которой могут входить обнаруженные цитохромы с) и возможности ее участия в переносе электронов на Ре(Ш) был проведен ингибиторный анализ глицерин-зависимой ферригидрит-редуктазной активности клеточных суспензий (рис 4 1) Анализ показал практически полное ингибирование активности КЦХФ в концентрации 100 мкМ, что указывает на наличие электронтранспортной цепи у С/егпгейисет и ее участие в переносе электронов на ферригидрит Частичное ингибирование активности ротеноном и, в большей степени, HQNO указывает на участие в восстановлении ферригидрита таких элементов цепи, как НАДН-дегидрогеназа 1-го типа и цитохром-6с1-комплекс, соответственно

Таблица 2. Удельная железоредуктазная активность* целых и разрушенных клеток С {етгесЬсет__

Препарат Форма Ре(Ш) Донор электронов

Глицерин НАДН НАДФН

Неразрушенные клетки (Исходная суспензия) Ферригидрит 65 н д н д

Ре(Ш)-ЭДТА 1 0 0

Клетки, отмытые после обработки детергентом Ферригидрит 0 н д н д

Ре(Ш)-ЭДТА 1 42 41

Клетки, разрушенные лизоцимом (Бесклеточный экстракт) Ферригидрит 0 н д н д

Ре(Ш)-ЭДТА 3 33 52

* Удельная активность приведена в ти/мг белка Н д - активность не детектировалась

Разрушение клеток С [егпгейисет при получении бесклеточных экстрактов приводило к полной потере глицерин-зависимой ферригидрит-восстанавливающей активности При этом появлялась сравнительно высокая НАД(Ф)Н-зависимая Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазная активность Схожий с разрушением клеток эффект на железоредуктазную активность С ferrlreducens оказывала специфичная экстракция поверхностных мембранных белков неионным детергентом (табл 2) После такой обработки свыше 70% клеток оставались жизнеспособными и при пересеве на среду с ферригадритом формировали активно растущую культуру, восстанавливающую Ре(Ш) (табл 3) Однако в суспензии, жизнеспособные обработанные клетки, лишенные поверхностных мембранных белков, полностью теряли ферригидрит-восстанавливающую активность, что указывает на мембранную локализацию терминальных железоредуктазных систем, задействованных в восстановлении нерастворимого Ре(Ш) у С femreducens При этом, обнаружение НАД(Ф)Н-зависимой Ге(Ш)-ЭДТА-редуктазной активности у неразрушенных клеток, обработанных детергентом (табл 2), можно объяснить нарушением целостности мембран части клеток, приводящим к возможности взаимодействия НАДН или НАДФН в качестве доноров электронов с железоредуцирующими ферментными системами, локализованными в цитоплазме или на внутренней стороне мембраны Последняя локализация наиболее вероятна, так как при полном разрушении клеток в

ходе получения бесклеточных экстрактов около 80% НАД(Ф)Н-зависимой Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазной акгавности ассоциировалось с мембранной фракцией (табл 4), что указывает на возможное участие одних и тех же ферментных систем в восстановлении ферригидрита и комплекса Ре(Ш)-ЭДТА

Таблица 3. Влияние обработки клеток С /етгейисет детергентом на их рост с ферригидритом____

Инокулят Урожай, 10 кл/мл Восстановлено Ре(Ш), мМ Железовосстанавливающая активность культуры, ти/107клеток

Культура, выращенная с ферригидритом 81 26,3 113

Суспензия целых отмытых клеток 99 32,7 115

Целые клетки, отмытые после обработки детергентом 60 22,1 128

Таблица 4. Распределение Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазной активности по клеточным фракциям С /етгес1исепз __

Фракции Белок, мг НАДН-зависимая активность НАДФН-зависимая активность

Удельная, ти/мг белка Общая, тИ % Удельная, ти/мг белка Общая, ти %

Целые и разрушенные клетки

Целые клетки 4060 0,0 0 0 0,0 0 0

Разрушенные клетки 4172 32,92 137336 100 52,07 217205 100

Растворимая и мембранная фракции

Растворимая фракция 310 43,07 13361 21 27,27 8460 12

Мембранная фракция 1942 53,67 49734 79 71,18 64309 88

Растворимая и нерастворимая фракции лаурилмальтозидного экстракта мембран

Растворимая фракция экстракта 250 20,33 5079 100 19,93 4977 70

Нерастворимая фракция экстракта 100 0,0 0 0 21,8 2180 30

Локализованная в мембранах Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазная активность поддавалась практически полной солюбилизации и была очищена хроматографически

Основная часть собранных хроматографических фракций обладала как НАДН-, так и НАДФН-зависимой Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазными активностями, но в различных соотношениях Отдельные фракции, полученные после последней стадии хроматографии - с ДЭАЭ-Сефарозой, обладали только НАДН-, либо только НАДФН-зависимой активностью После ДЭАЭ-Сефарозы НАДН-зависимая активность была сконцентрирована в 8, а НАДФН-зависимая - в 11 раз, с выходом порядка 10 % для обеих активностей (табл 5)

Нативный электрофорез очищенных активных фракций выявил присутствие в них нескольких белков Определение активности в геле показало наличие одной

полосы НАДН-зависимой активности молекулярной массой порядка 115 кДа и двух полос НАДФН-зависимой активности массой порядка 70 и 115 кДа (рис 4 2,А,Б) При использовании цитрата Fe(III) в качестве акцептора электронов детектируемых значений железоредуктазной активности в геле зафиксировано не было Анализ высокомолекулярных (-115 кДа) активных полос нативного геля с помощью денатурирующего электрофореза выявил, что каждая из них представлена двумя полипептидами (рис 4 2,В)

Для проявления железоредуктазных активностей в нативном геле требовалось добавление ФМН и экзогенного цитохрома с Однако в очищенных интакгных препаратах железоредуктазные активности детектировались без добавления данных кофакторов, что указывает на их присутствие в железоредуцирующем ферментном комплексе в виде нековалентно связанных компонентов, диссоциирующих при электрофорезе. Спектрофотометрические исследования выявили присутствие цитохромов с-типа во всех интактных хроматографичссгсих фракциях с Бе(Ш)-ЭДТА-редукгазной активностью Добавление комплекса Ре(Ш)-ЭДТА или ферригидрита к исходным фракциям, восстановленным НАДН или НАДФН, приводило к окислению цитохромов в них С комплексом Ре(Ш)-ЭДТА наблюдалось полное окисление, а с ферригидритом цитохромы оставались восстановленными примерно на 30% (рис 4 3)

Температурный оптимум обеих, НАДН- и НАДФН-зависимой, очищенных железоредуктазных активностей составил приблизительно 70°С (рис 4 4) При температурах выше 85°С наблюдалась термическая инактивация, а ниже 40°С -сравнительно невысокая активность

Таблица 5. Распределение Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазной активности С ferrireducens по фракциям при ее хроматографической очистке_

Стадия выделения Белок, НАДН-зависимая НАДФН-зависимая

мг активность активность

Удельн а, mU/мг Общая, mU Выход, % Удельн а, mU/мг Общая, mU Выход, %

белка белка

Лаурилмальтозидный экстракт 148,3 20,5 3037,6 100 16,7 2468,9 100

POROS HQ 81,6 63,2 1923,7 63 36,7 1368,5 55

Гидроксиапатит CHT и ДЭАЭ-Сефароза 6 7,6 162,5 317,7 11 181,4 228,1 9

а Удельная активность дана для фракций с максимальными НАДН- или НАДФН-зависимыми активностями

6 Значения получены после последней хроматографической колонки, с ДЭАЭ-Сефарозой

Исходная + ДМСО + 100 мкМ + 10 мкМ + 100 мкМ + 10 мкМ активность* КЦХФ ротенока ротенонэ НОМО

Рис. 4.1, Влияние ингибиторов электронтранспортной цепи на глицерин-зависимую ферри ш дрит-в осстана вл и вающую активность клеточных суспензий С[чгг!геёисет

* Ингибиторы добавляли в реакционную смесь в виде растворов в ДМСО. за исходную принята удельная активность в отсутствие ДМСО и ингибиторов.

Рис. 4.2. Анализ очищенных Ре(111)-ЭДТА-редуктазных активностей с помощью гель-эл ектр офорез а

А, Е - Нативный ПААГ-электро-"119 форез очищенных активных .79 фракций.

А - Определение железоредукта-■ 46 зной активности с феррозином в гелях,

■31 Б - Окраска тех же гелей с .24 кумасси синим.

В - 12,5% ДСН-ПААГ-электро-19 форез активных полос нативного геля {массой около 115 кДа).

Для всех гелей; дорожка 1 - фракция с высокой НАДФН-зависимой и низкой 11АДН-за висим ой активностью; дорожка 2 - фракция с высокой НАДН-зависимой и низкой НАДФН-записимой активностью; дорожка 3 — маркеры молекулярной массы для нативного или денатурирующего ПААГ-электрофореза. Молекулярные массы даны в кДа.

Рис. 4.3. Спектрофотометрическая характеристика очищенной Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазной активности С ferrireducens

Показаны спектры одной из активных фракций мембран, полученной после хроматографии с POROS HQ

Ох - Спектр окисленной (исходной) фракции с НАДН-зависимой железоредуктазной активностью 63,2 mU/мг и НАДФН-зависимой -36,7 mU/мг,

НАДН - тот же образец, восстановленный добавлением НАДН,

мМ

Длина волны (нм)

Ее(Ш)ЭДТА - восстановленный образец после инкубирования с 0,1 Ре(Ш)ЭДТА,

Ферригидрит - другой восстановленный образец той же фракции, проинкубированный с ферригидритом, содержащим 0,09 мМ Ре(1П)

Идентичные результаты были получены и при использовании НАДФН вместо НАДН в качестве восстановителя

40 50

Температура,'

Рис. 4.4. Влияние температуры на очищенные мембраносвязан-ные Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазные активности С ferrlreducens

Приведены данные для препаратов, полученных после хроматографии с ДЭАЭ-Сефарозой

5. Восстановление токсичных и радиоактивных металлов С./егп^исет

Восстановление токсичных металлов растущими культурами и клеточными суспензиями С /ет^исет было исследовано на примере шестивалентных хрома и урана, а также семивалентного технеция Суспензии клеток С /егп^исет, выращенных органотрофно с глицерином восстанавливали Сг(У1), Тс(УЦ) и и(У1) с образованием малорастворимых соединений Сг(Ш), Тс(1У) и Щ1У), предположительно оксидов Растущие культуры С /ет^исет оказались способными лишь к восстановлению урана(У1) Роста в присутствии Сг(У1) или Тс(УП) не наблюдалось, как на средах с Ре(Ш), так и на средах, содержащих С02 в качестве единственного акцептора электронов

Восстановление хрома(У1) из хроматов или бихроматов калия или аммония в суспензиях наблюдалось с органическими донорами электронов - пептоном, сорбитом, пирувагом - и было наиболее эффект ивным с бихромагом калия в качестве акцептора и пептоном в качестве донора электронов (рис. 5.1). Было отмечено также сравнительно высокое неспецифическое восстановление Сг( VI), происходящее в отсутствие экзогенных доноров электронов. Восстановления Сг(У1) с ЬЬ в качестве донора электронов зафиксировано не было.

Напротив, восстановление Тс{ VII) из пертехнетата клеточными суспензиями С./егпгеЛисею наблюдалось с молекулярным водородом (рис. 5,2). Пертехнетат-редукция сопровождалась практически полным осаждением восстановленного технеция. Хроматограф И чес кий анализ выявил, что осаждённый технеций был представлен пяти- и четырёхвалентной формами. Электронная микроскопия показала, что большая часть осаждённого Тс локализована на поверхности клеток (рис, 5.3). Высокое содержание Р, К и Са в клетках, связанных с частицами технеция, показывает, что эти клетки не подвергались лизису (согласно [Мулюкин и др., 2002; 5огокт е(а!-, 2003]).

Восстановление и (VI) из у рани л сульфата клеточными суспензиями шло наиболее интенсивно с водородом в качестве донора электронов. Напротив, растущие культуры восстанавливали уранидсульфагг только с органическими донорами электронов. В обоих случаях биогенный восстановленный уран был представлен нерастворимой четырёхвалентной формой. Добавление и(У1) в невосстановленную среду, не содержащую каких-либо дополнительных акцепторов электронов, кроме СОг, приводило к стимуляции органотрофного роста организма (рис. 5.4), Подученные результаты свидетельствуют о том, что С. /етгес1исеп$. может получать дополнительную энергию для роста за счёт использования урзна(У1) в качестве акцептора электронов.

100 <

& Клетки + донор ■ Донор без меток □ Клетки без донора

.....Ее .Вал.

Рис.

Пептон Сорбит Пиру ват 5.1. Восстановление Сг(У1)

£ 80 ■

§ 1 Ш

о. со 40 ■

1 1* 20

О +■

—«—Клетки + водород - -¿г - Водоред клеток — Клетки бе? водорода

12 16 ч.

20 24 28

Рас. 5.2. Удаление 99Тс(УП) из клеточными суспензиями Сфгг1ге<1жею раствора в присутствии Н2 клеточными Исходная концентрация Сг(У1) - 250 мкМ. суспензиями С. /егпге^исепх

Рнс. 5.3. Локализация нерастворимого Тс, восстановленного клеточными суспензиями С./егпге^сет

1 - микрография клеток С^еггЪгейисет с Тс-содержащими част ицами на поверхности;

2 - микрография частиц химически синтезированного Тс02 при том же увеличении;

3 - рентгеновский спектр клетки, ассоциированной с Тс-с одержащи м и частицами (выделяется высокое содержание Р, К и Са);

4 - рентгеновский спектр частиц, ассоциированных с поверхностью клеток (выделяется высокое содержание Тс).

40 35 30

1 25

I л 5 20

151 гЬ

a. 1fl 5

Рис. 5,4, Восстановление 1Г(У1) культурами С. /егпге^исет, растущими с глицерином и С02

А - рост культуры без урана (1) и в присутствии и(\'"[) (2);

Б - содержание урана:

3 - общее содержание урана (1Г(У1) + и(1У» в осадке, образованном растущей культурой;

4 - и(1У) в том же осадке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссимиляционное восстановление Fe(III) является микробным процессом, широко распространённым во многих экосистемах, и представляет собой важное звено биогеохимического цикла железа, В настоящее время около трети описанных видов железоредуцирующих прокариот является термофилами. Однако, несмотря на интенсивные исследования процессов диссимиляционного восстановления Fe(III) прокариотами в последние десятилетия, информация о физиологии и биохимии железоредуцирующих термофилов остается ограниченной единичными сообщениями.

На момент начала нашей работы было известно лишь несколько видов термофильных железоредукторов, и только один из них - Carboxydothermus ferrireducens - был выделен с Fe(III) в качестве акцептора электронов Этот организм был выбран объектом наших исследований, в ходе которых была впервые продемонстрирована способность термофильной железовосстанавливающей бактерии к устойчивому литоавтотрофному росту с нерастворимым Fe(III) в качестве акцептора электронов Было также доказано участие железоредукции в энергетическом метаболизме С ferrireducens при его органотрофном росте, сопряжённом с процессами неполного окисления или сбраживания углеродных субстратов Эти результаты показывают, что способность к диссимиляционной железоредукции обусловливает высокую пластичность метаболизма данного микроорганизма, позволяя ему выполнять функцию, как первичного продуцента, так и деструктора органического вещества в термофильном микробном сообществе '

Результаты наших исследований восстановления ферригидрита С ferrireducens показывают, что в условиях свободного доступа к минералу Fe(III) организм может использовать прямой контакт клетки с поверхностью минерала как основную стратегию железоредукции Кроме того, С ferrireducens может секретировать внешние растворимые переносчики электронов или хелаторы Fe(IlI), но их использование становится наиболее значимым при невозможности контакта клеток с поверхностью минерала Fe(III) В отсутствие доступа к ферригидриту С ferrireducens может эффективно использовать и экзогенные переносчики электронов, в частности, аналог гуминовых кислот АХДС Выявленные нами механизмы железоредукции сходны с известными стратегиями восстановления нерастворимых форм Fe(III) грамотрицательными мезофилами родов Geobacter, Shewanella и Geothrtx [Lovley et al, 2004] Однако, y С ferrireducens в ходе наших исследований был обнаружен ранее не описанный механизм доступа к нерастворимым формам железа(Ш) при его диссимиляционном восстановлении, заключающийся в многократном использовании экзогенного сидерофора ДФО в качестве челночного переносчика иона Fe3+ от минерала к клеткам До настоящего времени использование таких сидерофоров, как ДФО, обладающих высоким сродством к Fe(III) и низким - к Fe(II), было показано лишь для процессов ассимиляции железа микроорганизмами из его минеральных форм или высокоустойчивых белковых комплексов [Boukhalfa, Crumbliss, 2002, Andrews et al, 2003] Таким образом, полученные нами данные расширяют представления о возможных физиологических механизмах диссимиляционной железоредукции

Описание мембраносвязанной железоредукгазной активности С ferrireducens выявило её сходство по основной функциональной группе (гему с) с мембраносвязанными Ре(Ш)-восстанавливающими активностями, ранее охарактеризованными для организмов родов Geobacter и Shewanella [Myers, Myers, 1998, Field et al, 2000, Gaspard et al, 1998, Magnuson et al, 2000] К настоящему моменту исследований мы не можем однозначно определить конкретную физиологическую роль описанной нами Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазной активности Так, например, в последнее время было выделено порядка 20 периплазматических и мембраносвязанных полигемных цитохромов с, участвующих в процессе переноса электронов на Fe(III) у грамотрицательных мезофилов, но ни для одного из этих ферментов не была показана функция терминальной железоредуктазы [Lovley et al, 2004] Более того, было обнаружено, что отдельные железовосстанавливающие цитохромы являются функционально взаимозаменяемыми [Leang et al, 2005], а их активность контролируется множеством факторов, характеризующих

физиологическое состояние клетки [Reyes-Ramirez et al, 2003, Lies et al, 2005, Methe et al, 2005, Mahadevan et al, 2006, Ding et al, 2006,] Результаты этих работ указывают на необходимость комплексного изучения физиологии диссимиляционных железоредукторов с применением методов функциональной геномики и протеомики для определения роли различных железовосстанавливающих ферментов в метаболизме того или иного организма Тем не менее, результаты наших исследований, выявившие возможность выделения и очистки мембраносвязанной железоредуктазной активности из термофильного организма с грамположительным типом клеточной стенки, а также показавшие зависимость железовосстанавливающих активностей данного организма от условий культивирования, могут способствовать дальнейшему пониманию разнообразия механизмов восстановления Fe(III) у диссимиляционных железоредукторов

Нами была обнаружена также способность С ferrireducem восстанавливать соединения хрома(У1), технеция(УЛ) и урана(У1) в их малорастворимые и менее токсичные формы Аналогично мезофильным железоредукторам С ferrireducem может использовать в качестве акцептора электронов для роста лишь U(VI) Восстановление Cr(VI) и Tc(VII) суспензиями клеток С ferrireducens выполняет, вероятно, функцию детоксификации Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых природоохранных биотехнологий

ВЫВОДЫ

1. Доказано, что термофильная бактерия Carboxydothermus ferrireducens способна к устойчивому литоавтотрофному росту со слабокристаллическим оксидом Fe(III) (ферригидритом) в качестве акцептора и молекулярным водородом в качестве донора электронов, при полном отсутствии органических веществ Минимальный порог потребления Н2 составляет 3 р р m v

¿.Показано, что стимуляция органотрофного роста С ferrireducens в присутствии Fe(III) вызвана использованием трехвалентного железа в качестве дополнительного акцептора электронов при окислении органических веществ и не связана с влиянием на метаболизм образующегося Fe(II) или изменения окислительно-восстановительного потенциала среды

3. Установлено, что ферригидрит-восстанавливающая активность С ferrireducens является конститутивной Наиболее эффективное восстановление нерастворимого оксида Fe(III) происходит в условиях пространственной близости клетки с поверхностью минерала Обнаружено, что экзогенный сидерофор может стимулировать диссимиляционное восстановление Fe(III) в отсутствие свободного доступа клеток к ферригидриту Механизм стимуляции заключается в многократном использовании сидерофора в качестве челночного медиатора, переносящего ион Fe3+

4. Впервые описана мембраносвязанная Ре(Ш)-восстанавливающая оксидоредуктазная активность у диссимиляционного железоредуктора с грамположительным типом клеточной стенки Показано, что более 80% НАД(Ф)Н-зависимой Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазной активности у С ferrireducens локализовано в мембраной фракции клеток В состав ферментного комплекса, восстанавливающего Ре(Ш)-ЭДТА, входят цитохромы с-типа и белок с молекулярной массой около 115 кДа, состоящий из двух полипептидов

5. Обнаружено, что С ferrireducens способен получать энергию для роста за счет использования урана(У1) в качестве акцептора электронов Суспензии клеток этого микроорганизма могут также восстанавливать соединения хрома(У1) и технсция(УП)

с образованием слаборастворимых и менее токсичных форм эгих металлов Способность термофильных бактерий восстанавливать Тс(УИ) продемонстрирована впервые

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Гаврилов С.Н., Бонч-Осмоловская Е А , Слободкин А И 2003 Физиология органотрофного и литотрофного роста термофильных железовосстанавливающих бактерий Thermoterrabacterium ferrireducens и Thermoanaerobacter siderophilus // Микробиология Т72 С 161-167

2 Гаврилов С.Н., Слободкин А И, Робб Ф Т , Де Врис С 2007 Характеристика мембраносвязанных Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазных активностей термофильной грамположительной железовосстанавливающей бактерии Thermoterrabacterium ferrireducens И Микробиочогия Т76 С 164-171

3 Chernyh N А, Gavrilov S.N., Sorokin V V., German К Е, Sergeant С , Simonoff М, Robb F , Slobodkin AI 2007 Characterization of Technetium(VII) Reduction by Cell Suspensions of Thermophilic Bacteria and Archaea // Appl Microbiol Biotechnol Submitted

4 Fedosov D V, Gavrilov S.N., Bonch-Osmolovskaya E A, Slobodkin AI Lithotrophic Growth and Metabolism of Dissimilatory Fe(III) reducing Thermophilic Anaerobic Bacteria / Abstracts of the 3d International Congress on Extremophiles, "Extremophiles 2000" September 3-7 2000 Hamburg Germany P 136

5 Slobodkin AI, Gavrilov S N., Zavarzina D G, Bonch-Osmolovskaya E A Distribution, Diversity, and Physiology of Thermophilic Iron(III)-reducmg Prokaryotes / Abstracts of the International Conference on Biology and Biotechnology of Thermophiles, "Thermophiles 2001" December 3-7 2001 New Delhi India P2

6 Gavrilov S.N., Bonch-Osmolovskaya E A, Slobodkin AI Cr(VI) Reduction by Anaerobic Thermophilic Bactena / Abstracts of the 4th International Congress on Extremophiles, "Extremophiles 2002" September 22-26 2002 Naples Italy P377

7 Gavrilov S N., Slobodkin A.I., Bonch-Osmolovskaya E A Reduction of Cr(VI) and U(VI) by Anaerobic Thermophilic Bactena / Abstracts of the 1st FEMS Congress of European Microbiologists June 29 - July 3 2003 Ljubljana Slovenia P 330

8 Gavrilov S N., Slobodkin AI, Bonch-Osmolovskaya E A, de Vnes S , Robb F Characterization of membrane-bound Fe(III) reductase activities from thermophilic gramtype positive dissimilatory iron-reducing bacterium Thermoterrabacterium ferrireducens / Abstracts of the 5th International Congress on Extremophiles "Extremophiles 2004" September 19-23 2004 Cambridge MD USA Pill

9 Гаврилов C.H., Слободкин А И, Робб Ф T, Де Врис С Характеристика железоредуктазной активности термофильной грамположительной бактерии Thermoterrabacterium ferrireducens, диссимиляционно восстанавливающей Fe(IlI) / Тезисы всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» 1-3 ноября 2005 Москва С 16

10 Gavrilov S.N., German КЕ, Bonch-Osmolovskaya ЕА, Slobodkin AI Reductive precipitation of technetium by a thermophilic gram-type positive dissimilatory Fe(III)-reducer Thermoterrabacterium ferrireducens / Abstracts of the 2nd FEMS Congress of European Microbiologists July 4-8 2006 Madrid Spain P 265

Подписано в печать 25 04 2007 г Исполнено 26 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 495 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаврилов, Сергей Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологические и биохимические механизмы диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens (syn. Thermoterrabacterium ferrireducens)"

Актуальность работы. Железо - четвёртый по распространённости химический элемент земной коры - может использоваться прокариотами в качестве акцептора электронов в диссимиляционных процессах [Заварзин, 2004]. Микробное восстановление Fe(III) является важным путём окисления органического вещества во многих экосистемах. Биогеохимический цикл железа сопряжён с циклами углерода, кислорода и серы и оказывает значительное экологическое воздействие на современную окружающую среду [Lovley, 1991; Nealson, Saffarini, 1994; Thamdrup, 2000]. Современные гидротермальные экосистемы рассматриваются как реликты древнейшей биосферы Земли, и процессы, протекающие в них, могут служить моделью для реконструкции древних биоценозов [Заварзин, 2001]. Термофильные железовосстанавливающие прокариоты населяют практически все известные типы термальных систем [Слободкин, 2005]. Согласно существующим гипотезам, диссимиляционное восстановление Fe(III) могло быть первым возникшим типом метаболизма и являться глобально значимым процессом окисления органического вещества в Архее и Протерозое [Walker, 1987; Lovley, 2005].

Newman, Kolter, 2000; Gorby et al., 2006]. К настоящему времени описано более 20 содержащих гем с белков, участвующих в транспорте электронов к Fe(III), однако не известно ни одного фермента, которому может быть приписана функция терминальной железоредуктазы in vivo. Информация о физиологии и биохимии диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильными микроорганизмами ограничена единичными сообщениями [Vadas et al., 1999; Childers, Lovley, 2001; Feinberg, Holden, 2006].

Многие железоредукторы способны восстанавливать токсичные металлы и радионуклиды (Cr(Vl), Tc(VII), U(VI)) с образованием малорастворимых соединений, что может быть использовано при разработке технологий биоремедиации. Минералы, формирующиеся при микробном восстановлении металлов, могут найти применение в современных нанотехнологиях, а также как носители в высокочувствительных методах анализа [Lloyd, 2003; Berensmeier, 2006].

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение физиологии роста, а также стратегий и биохимических механизмов восстановления трёхвалентного железа термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Исследовать способность С. ferrireducens к устойчивому литоавтотрофному росту с Fe(III) в качестве акцептора электронов и определить кинетические характеристики этого процесса.

2. Выяснить функции восстановления Fe(III) в метаболизме С. ferrireducens при органотрофном росте.

3. Изучить физиологические стратегии восстановления нерастворимого оксида Fe(III) и биохимические механизмы диссимиляционной железоредукции.

4. Исследовать способность С. /егпгес1исе№ к восстановлению токсичных и радиоактивных металлов переменных валентностей.

Научная новизна. Впервые охарактеризованы физиологические стратегии восстановления нерастворимых форм Ре(Ш) и мембраносвязанные железоредуктазные активности у микроорганизма с грамположительным типом клеточной стенки, диссимиляционно восстанавливающего железо. Полученные результаты расширяют представления о возможных физиолого-биохимических механизмах восстановления Ре(Ш) у различных филогенетических групп диссимиляционных железоредукторов.

Обнаружено, что экзогенный сидерофор может стимулировать диссимиляционное восстановление Ре(Ш) в отсутствие свободного доступа клеток к нерастворимому акцептору. Механизм стимуляции заключается в многократном использовании сидерофора в качестве челночного медиатора, переносящего ион Ре3+. Подобный механизм диссимиляционной железоредукции ранее описан не был.

Впервые продемонстрирована способность термофильных бактерий восстанавливать технеций(УП), а также использовать уран(У1) в качестве акцептора электронов для роста.

Практическая значимость. Обнаружена способность С. /етгес1исеп5 к восстановлению токсичных и радиоактивных соединений хрома(У1), технеция(УН) и урана(У1). Образующиеся восстановленные формы Сг(Ш), Тс(1У) и и(1У) обладают значительно меньшей растворимостью и могут быть удалены из жидкой среды. Полученные результаты можно использовать при разработке новых технологий очистки горячих радиоактивных стоков, а также биоремедиации подземных захоронений радиоактивных отходов, подверженных саморазогреванию, либо попавших в геотермально нагреваемые зоны.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих научных конференциях: 3"й международный конгресс по экстремофильным микроорганизмам "Extremophiles 2000" (Гамбург, Германия); международная конференция по биологии и биотехнологии термофилов "Thermophiles 2001" (Нью Дели, Индия); международный конгресс "Extremophiles 2002" (Неаполь, Италия); 1'й конгресс европейских микробиологов FEMS (Любляна, Словения, 2003); международный конгресс "Extremophiles 2004" (Кеймбридж, Мэриленд, США); 2"й конгресс FEMS (Мадрид, Испания, 2006). На всероссийской молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005) работа была отмечена как лучшее стендовое сообщение.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов, 1 статья принята к печати.

Место проведения работы. Работа выполнялась в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Очистка и характеристика железоредуктазной активности была выполнена во время стажировки в Лаборатории биотехнологии Технологического университета г. Делфт (Нидерланды) под научным руководством проф. д-ра С. Де Вриса. Работы с технецием(УИ) проводились в Лаборатории радиохимических исследований Института физической химии и электрохимии РАН в сотрудничестве с к.х.н. К.Э. Германом. Исследования способности С. ferrireducens к восстановлению хрома(У1) и урана(У1) проводились совместно с сотрудниками Лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН д.б.н. H.H. Медведевой-Ляликовой и к.б.н. Т.В. Хижняк.

Определение валентного состояния урана выполнили сотрудники Института общей и ядерной физики Научного Центра «Курчатовский институт» Н.Г. Яковлев и И.Е.

Велешко. Электронную микроскопию и рентгеновский микроанализ проводили совместно с Н.А. Кострикиной, Е.С. Бариновой и В.В. Сорокиным (ИНМИ РАН).

Работа была выполнена при поддержке грантов: РФФИ 06-04-48684-а и 04-03-22000-CNRS, АФГИР (CRDF) RB-2-2379-MO-02C, ИНТАС 01-151, НАТО CLG-LST-978616, NSF (Grant МСВ02383387 to F.T.R.); программ: CNRS №2730, Молодёжного научного сотрудничества FEMS («Восстановление железа термофильными прокариотами»), Президиума РАН («Молекулярная и клеточная биология»).

Благодарность. Автор приносит искреннюю благодарность всем упомянутым выше участникам работы, а также всем сотрудникам и аспирантам Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН и Лаборатории биотехнологии Т.У. г. Делфт за поддержку и участие в этой работе. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н. А.И. Слободкину и зав. лаб. Гипертермофильных микробных сообществ д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 214 страницах машинописного текста и включают 32 рисунка и 12 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Выводы» и «Список литературы», включающий в себя 289 наименований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гаврилов С.Н., Бонч-Осмоловская Е.А., Слободкин А.И. 2003. Физиология органотрофного и литотрофного роста термофильных железовосстанавливающих бактерий Thermoterrabacterium ferrireducens и Thermoanaerobacter siderophilus II Микробиология. 1.12. С. 161-167.

2. Гаврилов С.Н., Слободкин А.И., Робб Ф.Т., Де Врис С. 2007. Характеристика мембраносвязанных Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазных активностей термофильной грамположительной железовосстанавливающей бактерии Thermoterrabacterium ferrireducens И Микробиология. Т.76. С.164-171.

3. Chernyh N.A., Gavrilov S.N., Sorokin V.V., German K.E., Sergeant С., Simonoff M., Robb F., Slobodkin A.I. 2007. Characterization of Technetium(VII) Reduction by Cell Suspensions of Thermophilic Bacteria and Archaea // Appl. Microbiol. Biotechnol. Submitted.

4. Fedosov D.V., Gavrilov S.N., Bonch-Osmolovskaya E.A., Slobodkin A.I. Lithotrophic Growth and Metabolism of Dissimilatory Fe(III) reducing Thermophilic Anaerobic Bacteria / Abstracts of the 3d International Congress on Extremophiles, "Extremophiles 2000". September 3-7.2000. Hamburg. Germany. P. 136.

5. Slobodkin A.I., Gavrilov S.N., Zavarzina D.G., Bonch-Osmolovskaya E.A. Distribution, Diversity, and Physiology of Thermophilic Iron(III)-reducing Prokaryotes / Abstracts of the International Conference on Biology and Biotechnology of Thermophiles, "Thermophiles 2001". December 3-7.2001. New Delhi. India. P.2.

6. Gavrilov S.N., Bonch-Osmolovskaya E.A., Slobodkin A.I. Cr(VI) Reduction by Anaerobic Thermophilic Bacteria / Abstracts of the 4th International Congress on Extremophiles, "Extremophiles 2002". September 22-26.2002. Naples. Italy. P.377.

7. Gavrilov S.N., Slobodkin A.I., Bonch-Osmolovskaya E.A. Reduction of Cr(VI) and

U(VI) by Anaerobic Thermophilic Bacteria / Abstracts of the 1st FEMS Congress of European Microbiologists. June 29 - July 3.2003. Ljubljana. Slovenia. P.330.

8. Gavrilov S.N., Slobodkin A.I., Bonch-Osmolovskaya E.A., de Vries S., Robb F. Characterization of membrane-bound Fe(III) reductase activities from thermophilic gram-type positive dissimilatory iron-reducing bacterium Thermoterrabacterium ferrireducens / Abstracts of the 5th International Congress on Extremophiles "Extremophiles 2004". September 1923.2004. Cambridge. MD. USA. P.lll.

9. Гаврилов C.H., Слободкин А.И., Робб Ф.Т., Де Врис С. Характеристика железоредуктазной активности термофильной грамположительной бактерии Thermoterrabacterium ferrireducens, диссимиляционно восстанавливающей Fe(III) / Тезисы всероссийской молодёжной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». 1-3 ноября.2005. Москва. С. 16.

10. Gavrilov S.N., German К.Е., Bonch-Osmolovskaya Е.А., Slobodkin A.I. Reductive precipitation of technetium by a thermophilic gram-type positive dissimilatory Fe(III)-reducer Thermoterrabacterium ferrireducens / Abstracts of the 2nd FEMS Congress of European Microbiologists. July 4-8.2006. Madrid. Spain. P.265.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Накопленная к настоящему времени информация о микробных сообществах термальных местообитаний позволяет говорить о существовании специфических термофильных прокариотных экосистем, имеющих ряд принципиальных особенностей, отличающих их от микробных сообществ, развивающихся при умеренных температурах и господствующих на большей части земной поверхности. В частности, во многих термальных местообитаниях происхождение ряда доноров и акцепторов электронов, служащих источниками энергии для микроорганизмов, связано с вулканической деятельностью. Поэтому в микробных сообществах гидротерм и глубинной гидросферы возможна первичная хемосинтетическая продукция органического вещества, не связанная с процессом глобального фотосинтеза. Кроме того, микроорганизмы, восстанавливающие неорганические акцепторы электронов, могут осуществлять полную анаэробную деструкцию органического вещества и, следовательно, обеспечивать замкнутость анаэробного цикла углерода [Слободкин и др., 1999]. Одним из наиболее распространённых потенциальных акцепторов электронов является трёхвалентное железо. Эта валентная форма представляет собой основное стабильное состояние железа в породах, контактирующих с кислородом. В недрах Земли и в изверженных породах в отсутствии кислорода одинаково стабильно трёх- и двухвалентное железо. В земной коре железо существует, главным образом, в виде окисных и сульфидных минералов, таких как: гематит РегОз, гётит РеО(ОН), магнетит РеО-РегОз (или Рез04), пирит РеБг. В водных растворах Бе существует в виде аквакатиона [Ре(НгО)б] , медленно окисляющегося кислородом воздуха, но достаточно стабильного при рН ниже 7; Ре3+ - в виде [Те(Н20)б]3+, стабильного при низких значениях рН, в кислых условиях. При увеличении рН растворимость Ре(Ш) резко снижается, и оно осаждается в виде красно-коричневого аморфного оксида РегОз-пНгО [Пиневич, 2005]. Этот оксид является распространённым компонентом различных донных отложений и обозначается в литературе как слабокристаллический оксид Fe(III), оксигидроксид Fe(III), гидрированный оксид Fe(III), гидроксид Fe(III), аморфный гидроксид Fe(III) и ферригидрит, что может быть вызвано различиями в степени кристаллизации конкретных соединений, либо субъективными предпочтениями [Слободкин, 2005]. В термальных экосистемах трёхвалентное железо также представлено в основном нерастворимыми оксидами, образующимися при контакте Ре(11)-содержащей породы, либо гидротермального флюида с кислородом воздуха или оксигенированной водой [Lovley et al., 2004]. Несмотря на труднодоступность нерастворимого Fe(III) как акцептора, способность к железоредукции достаточно широко распространена среди термофильных прокариот различных термальных местообитаний, включая наземные и глубоководные гидротермы, геотермально нагреваемые водоносные горизонты, высокотемпературные нефтяные месторождения. Обнаружено также, что некоторые гипертермофильные микроорганизмы, способные восстанавливать, помимо Fe(III), ряд других неорганических акцепторов электронов, используют наиболее широкий спектр органических доноров электронов с трёхвалентным железом в качестве акцептора [Lovley et al., 2004; Tor et al., 2001]. Это может быть связано с высоким положительным окислительно-восстановительным потенциалом пары Fe3+/Fe2+ [Шинк, 2005]. Таким образом, при повышенных температурах и, следовательно, ограниченной растворимости кислорода микробное восстановление железа(Ш) может являться одним из основных процессов, обеспечивающих окисление органического вещества. Ещё большую роль микробное восстановление окисного железа могло играть в древнейшей биосфере, где Fe(III), вероятно, являлось первым и некоторое время основным окислителем органического углерода [Walker, 1987]. Большой интерес с этой точки зрения представляет микробная железоредукция, протекающая в современных гидротермальных экосистемах, так как они рассматриваются как реликты древнейшей биосферы Земли, и процессы, протекающие в них, могут служить моделью для реконструкции древних биоценозов [Заварзин, 2001], востребованной, в том числе и в астробиологии [Nealson, Сох, 2002]. Кроме того, микробное восстановление Fe(III) оказывает влияние на хозяйственную деятельность человека и имеет практическое значение. Достаточно упомянуть биокоррозию, образование магнетита с особыми физико-химическими свойствами в ходе биоминерализации, а также способность ряда железоредукторов, в том числе и гипертермофильных, к восстановлению и иммобилизации токсичных и радиоактивных металлов высоких валентностей [Lee, Newman, 2003; Lloyd et al., 2003(a)]. Железоредукторы, восстанавливающие нерастворимые формы Fe(IIl) в отсутствие растворимых переносчиков электронов и медиаторов, перспективны для использования в электрохимических и водородных генераторах, основанных на окислительно-восстановительных реакциях, осуществляемых микроорганизмами [Lovley et al., 2004; Stams et al., 2006]. В связи с вышесказанным, в последнее время большое внимание уделяется исследованию геохимической деятельности железоредукторов, а также физиологии и биохимии микробного восстановления Fe(III).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гаврилов, Сергей Николаевич

выводы

1. Доказано, что термофильная бактерия Carboxydothermus ferrireducens способна к устойчивому литоавтотрофному росту со слабокристаллическим оксидом Fe(III) (ферригидритом) в качестве акцептора и молекулярным водородом в качестве донора электронов, при полном отсутствии органических веществ. Минимальный порог потребления Н2 составляет 3 p.p.m.v.

2. Показано, что стимуляция органотрофного роста С. ferrireducens в присутствии Fe(III) вызвана использованием трёхвалентного железа в качестве дополнительного акцептора электронов при окислении органических веществ и не связана с влиянием на метаболизм образующегося Fe(II) или изменения окислительно-восстановительного потенциала среды.

3. Установлено, что ферригидрит-восстанавливающая активность С. ferrireducens является конститутивной. Наиболее эффективное восстановление нерастворимого оксида Fe(III) происходит в условиях пространственной близости клетки с поверхностью минерала. Обнаружено, что экзогенный сидерофор может стимулировать диссимиляционное восстановление Fe(III) при отсутствии свободного доступа клеток к ферригидриту. Механизм стимуляции заключается в многократном использовании сидерофора в качестве челночного медиатора, переносящего ион Fe3+.

4. Впервые описана мембраносвязанная Ре(Ш)-восстанавливающая оксидоредуктазная активность у диссимиляционного железоредуктора с грамположительным типом клеточной стенки. Показано, что более 80% НАД(Ф)Н-зависимой Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазной активности у С. ferrireducens локализовано в мембраной фракции клеток. В состав ферментного комплекса, восстанавливающего Ре(Ш)-ЭДТА, входят цитохромы с-типа и белок с молекулярной массой около 115 кДа, состоящий из двух полипептидов.

5. Обнаружено, что С. /етге<3исет способен получать энергию для роста за счёт использования урана(У1) в качестве акцептора электронов. Суспензии клеток этого микроорганизма могут также восстанавливать соединения хрома(У1) и технеция(УН) с образованием слаборастворимых и менее токсичных форм этих металлов. Способность термофильных бактерий восстанавливать Тс(УИ) продемонстрирована впервые.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссимиляционное восстановление Ее(Ш) является микробным процессом, широко распространённым во многих экосистемах, и представляет собой важное звено биогеохимического цикла железа. В настоящее время, около трети описанных видов железоредуцирующих прокариот является термофилами. Однако, несмотря на интенсивные исследования процессов диссимиляционного восстановления Ре(Ш) прокариотами в последние десятилетия, информация о физиологии и биохимии железоредуцирующих термофилов остаётся ограниченной единичными сообщениями.

На момент начала нашей работы было известно лишь несколько видов термофильных железоредукторов, и только один из них - СагЬохус^оМегтш /егпгес1исет - был выделен с Ее(Ш) в качестве акцептора электронов. Этот организм был выбран объектом наших исследований, в ходе которых была впервые продемонстрирована способность термофильной железовосстанавливающей бактерии к устойчивому литоавтотрофному росту с нерастворимым Ее(Ш) в качестве акцептора электронов. Было также доказано участие железоредукции в энергетическом метаболизме С. /егпгес/исем при его органотрофном росте, сопряжённом с процессами неполного окисления или сбраживания углеродных субстратов. Эти результаты показывают, что способность к диссимиляционной железоредукции обусловливает высокую пластичность метаболизма данного микроорганизма, позволяя ему выполнять функцию, как первичного продуцента, так и деструктора органического вещества в термофильном микробном сообществе.

Результаты наших исследований восстановления ферригидрита С. /етгес/исепя показывают, что в условиях свободного доступа к минералу Ее(Ш) организм использует прямой контакт клетки с поверхностью минерала как основную стратегию железоредукции. Кроме того, С. /етгесЬлсет может секретировать внешние растворимые переносчики электронов или хелаторы Ре(Ш), но их использование становится значимым лишь при невозможности контакта клеток с поверхностью минерала Fe(III). В отсутствие доступа к ферригидриту С. ferrireducens может эффективно использовать и экзогенные переносчики электронов, в частности, аналог гуминовых кислот АХДС. Выявленные нами механизмы железоредукции сходны с известными стратегиями восстановления нерастворимых форм Fe(III) грамотрицательными мезофилами родов Geobacter, Shewanella и Geothrix [Lovley et al., 2004]. Однако, y С. ferrireducens в ходе наших исследований был обнаружен ранее не описанный механизм доступа к нерастворимым формам железа(Ш) при его диссимиляционном восстановлении, заключающийся в многократном использовании экзогенного сидерофора ДФО в качестве челночного переносчика иона Fe3+ от минерала к клеткам. До настоящего времени использование таких сидсрофоров, как ДФО, обладающих высоким сродством к Fe(III) и низким - к Fe(II), было показано лишь для процессов ассимиляции железа микроорганизмами из его минеральных форм или высокоустойчивых белковых комплексов [Boukhalfa, Crumbliss, 2002; Andrews et al., 2003]. Таким образом, полученные нами данные расширяют представления о возможных физиологических механизмах диссимиляционной железоредукции.

Описание мембраносвязанной железоредуктазной активности С. ferrireducens выявило её сходство по основной функциональной группе (гему с) с мембраносвязанными Ре(Ш)-восстанавливающими активностями, ранее охарактеризованными для организмов родов Geobacter и Shewanella [Myers, Myers, 1998; Gaspard et al, 1998; Field et al., 2000; Magnuson et al., 2000]. К настоящему моменту исследований мы не можем однозначно определить конкретную физиологическую роль описанной нами Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазной активности. Так, например, в последнее время было выделено порядка 20 периплазматических и мембраносвязанных полигемных цитохромов с, участвующих в процессе переноса электронов на Fe(III) у грамотрицательных мезофилов, но ни для одного из этих ферментов не была показана функция терминальной железоредуктазы

Lovley et al., 2004]. Более того, было обнаружено, что активность железовосстанавливающих цитохромов контролируется множеством факторов, характеризующих физиологическое состояние клетки [Reyes-Ramirez et al., 2003; Lies et al., 2005; Methe et al., 2005; Mahadevan et al., 2006; Ding et al, 2006]. Результаты этих работ указывают на необходимость комплексного изучения физиологии диссимиляционных железоредукторов с применением методов функциональной геномики и протеомики для определения роли различных железовосстанавливающих ферментов в метаболизме того или иного организма. Тем не менее, результаты наших исследований, выявившие возможность выделения и очистки мембраносвязанной железоредуктазной активности из термофильного организма с грамположительным типом клеточной стенки, а также показавшие зависимость железовосстанавливающих активностей данного организма от условий культивирования, могут способствовать дальнейшему пониманию механизмов восстановления Fe(III) у диссимиляционных железоредукторов.

Нами была обнаружена также способность С. ferrireducens восстанавливать соединения хрома(У1), технеция(УН) и урана(У1) в их малорастворимые и менее токсичные формы. Аналогично мезофильным железоредукторам С. ferrireducens может использовать в качестве акцептора электронов для роста лишь U(VI). Восстановление Cr(VI) и Tc(VII) суспензиями клеток С. ferrireducens выполняет, вероятно, функцию детоксификации. Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых природоохранных биотехнологий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаврилов, Сергей Николаевич, Москва

1. Арискина Е.В., Вацурина A.B., Сузина Н.Е., Гавриш Е.Ю. 2004. Кобальт- и хромсодержащие включения в клетках бактерий // Микробиология. Т.73. С. 199-203.

2. Балашова В.В., Заварзин Г.А. 1979. Анаэробное восстановление окисного железа водородной бактерией // Микробиология. Т.48. С.773-778.

3. Буккель В. Анаэробный энергетический метаболизм // Современная микробиология: Прокариоты / Под ред. Ленгелера Й., Древса Г., Шлегеля Г. 2005. Т.1. М.:«Мир».

4. Герхард Ф. (ред.) 1983. Методы общей бактериологии // М.: Мир. Т. 2.

5. Дмитриенко Г.Н., Овчаров Л.Ф., Курдюк K.M., Гвоздяк П.И. 1997. Использование биотехнологии очистки сточных вод от ионов тяжёлых металлов // Химия и технология воды. Т. 19. С.544-548.

6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. 1991. Справочник биохимика // М.: Мир.

7. Заварзин Г.А. 2001. Становление биосферы // Вестник РАН. Т.71. С.988-1001.

8. Заварзин Г.А. 2004. Лекции по природоведческой микробиологии. // М.:«Наука».

9. Заварзина Д. Г. 2001. Биогеохимические факторы преобразования соединений железа в восстановительной обстановке // Диссертация на соискание учёной степени канд. геол.-мин. наук. Геологический факультет МГУ им. Ломоносова. Москва.

10. Лебедева Е.В., Ляликова H.H. 1979. Восстановление крокоита культурой Pseudomonas chromatophila sp. nov. // Микробиология. Т.48. С.517-522.

11. Ляликова H.H., Хижняк Т.В. 1996. Восстановление семивалентного технеция ацидофильными бактериями рода Thiobacillus II Микробиология. Т.65. С.533-539.

12. Мулюкин A.JI., Сорокин В.В., Лойко Н.Г., Сузина Н.Е., Дуда В.И., Воробьёва Е.А., Эль-Регистан Г.И. 2002. Сравнительное изучение элементного состава вегетативных и покоящихся клеток микроорганизмов // Микробиология. Т.71. С.37-48.

13. Перетрухин В.Ф., Хижняк Т.В., Ляликова H.H., Герман К.Э. 1996. Биосорбция технеция-99 и некоторых актинидов донными осадками, взятыми из оз. Белое Косино Московского региона // Радиохимия. Т.38. С.471-475.

14. Пиневич A.B. 2005. Микробиология железа и марганца //СПб.:Изд-воС-Пегерб.ун-та.

15. Резников A.A., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. 1970. Методы анализа природных вод // М.: Недра.

16. Розанова Е.П., Дубинина Г.А., Лебедева Е.В., Сунцова Л.А., Липовских В.М., Цветков H.H. 2003. Микроорганизмы в тепловых сетях и внутренняя коррозия стальных трубопроводов // Микробиология. Т.72. С.212-220.

17. Романенко В.И., Кореньков В.Н. 1977. Чистая культура бактерий, использующих хроматы и бихроматы в качестве акцептора водорода при развитии в анаэробных условиях//Микробиология. Т.46. С.414-417.

18. Рунов Е.В. 1926. Восстановление окисных соединений железа биологическим путём // Вестник бактериол.-агрон. станции. № 24. С.75-82.

19. Сендел Е. 1964. Колориметрические методы определения следов металлов // М.: Мир.

20. Слободкин А.И., Ерощев-Шак В.А., Кострикина H.A., Лаврушин В.Ю., Дайняк Л.Г., Заварзин Г. А. 1995. Образование магнетита термофильными анаэробными микроорганизмами//Докл. Акад. Наук. Т.345. С.694-697.

21. Слободкин А.И., Заварзина Д.Г., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская Е.А. 1999. Диссимиляционное восстановление неорганических акцепторов электронов термофильными анаэробными прокариотами // Микробиология. Т.65. С.600-622.

22. Слободкин А.И., Чистякова Н.И., Русаков B.C. 2004. Высокотемпературная микробная сульфатредукция может сопровождаться образованием магнетита // Микробиология. Т.73. С. 553-557.

23. Слободкин А.И. 2005. Термофильная микробная металлоредукция // Микробиология. Т.74. С. 581-595.

24. Слободкина Г.Б., Слободкин А.И., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Бонч-Осмоловская Е.А. 2004. Обнаружение культивируемой гипертермофильной археи рода Sulfophobococcus в метантенке, работающем в термофильном режиме // Микробиология. Т.73. С.716-720.

25. Слободкина Г.Б., Бонч-Осмоловская Е.А., Слободкин А.И. 2007. Восстановление хрома(УИ), селена(1У) и теллура(1У) и Fe(III) термофильной бактерией Bacillus thermoamylovorans SKC1 // Микробиология. Т.76. В печати.

26. Хижняк Т.В., Герман К.Э., Фирсова Е.В., Медведева-Ляликова Н.Н. 2001. Модельные исследования поглощения технеция-99 и нептуния-237 илами пресноводных озёр эвтрофного и дистрофного типа // Экологическая химия. Т. 10. С.233-237.

27. Чистякова Н.И., Заварзина Д.Г., Русаков B.C. 2003. Мёссбауэровские исследования кинетики и условий образования минералов железа термофильными железоредукторами // Изв. Акад. Наук. Серия физическая. Т.67. С. 1354-1358.

28. Шинк Б. Экофизиология и экологические ниши прокариот // Современная микробиология: Прокариоты / Под ред. Ленгелера Й., Древса Г., Шлегеля Г. 2005. Т.2. М.:«Мир».

29. Abdelouas A., Lu Y., Lutze W., Nuttall H. E. 1998. Reduction of U(VI) to U(IV) by indigenous bacteria in contaminated ground water // J. Contam. Hydrol. V.35. P.217-233.

30. Afkar E., Fukumori Y. 1999. Purification and characterization of triheme cytochrome с7 from the metal-reducing bacterium Geobacter metallireducens II FEMS Microbiol. Lett. V.175. P.205-210.

31. Aguiar P., Beveridge T. J. Reysenbach A.-L. 2004. Sulfurihydrogenibium azorense, sp. nov., a thermophilic hydrogen-oxidizing microaerophile from terrestrial hot springs in the Azores // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.54. P.33-39.

32. Anderson R.T., Lovley, D.R. 2002. Microbial redox interactions with uranium: an environmental perspective // Interaction of microorganisms with radionuclides / Eds. Keith-Roach M.J., Livens F.R. Elsevier Science. P.205-223.

33. Andrews S.C., Robinson A.K., Rodriguez-Quin'ones F. 2003. Bacterial iron homeostasis // FEMS Microbiol. Rev. V.27. P.215-237.

34. Archibald F.S. 1983. Lactobacillus plantarum, an organism not requiring iron // FEMS Microbiol. Lett. V.19. P.29-32.

35. Arnold R.G., Olson T.M., Hoffmann M.R. 1986(a). Kinetics and Mechanism of Dissimilative Fe(III) Reduction by Pseudomonas sp. 200 // Biotechnol. Bioeng. V.28. P. 16571671.

36. Arnold R.G., DiChristina T.J., Hoffmann M.R. 1986(b). Inhibitor Studies of Dissimilative Fe(III) Reduction by Pseudomonas sp. Strain 200 ("Pseudomonas ferrireductans") // Appl. Environ. Microbiol. V.52. P.281-289.

37. Balk M., Weijma J., Stams A.J.M. 2002. Thermotoga lettingae sp. nov., a novel thermophilic, methanol-degrading bacterium isolated from a thermophilic anaerobic reactor // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.52. P.1361-1368.

38. Barak Y., Ackerley D.F., Dodge C.J., Banwari L., Alex C., Francis A.J., Matin A. 2006. Analysis of novel soluble chromate and uranyl reductases and generation of an improved enzyme by directed evolution // Appl. Environ. Microbiol. V.72. P.7074-7082.

39. Beliaev A.S., Saffarini D.A. 1998. Shewanella putrefaciens mtrB encodes an outer membrane protein required for Fe(III) and MIl(IV) reduction // J. Bacterial. V.180. P.6292-6297.

40. Beliaev A.S., Saffarini D.A., McLaughlin J.L., Hunnicutt D. 2001. MtrC, an outer membrane decahaem c cytochrome required for metal reduction in Shewanella putrefaciens MR-1 // Mol. Microbiol. V.39. P.722-730.

41. Bencharit S., Ward M.J. 2005. Chemotactic Responses to Metals and Anaerobic Electron Acceptors in Shewanella oneidensis MR-1 //J. Bacteriol. V.187. P.5049-5053.

42. Berensmeier S. 2006. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids //Appl. Microbiol. Biotechnol. V.73. P.495-504.

43. Bilgin A.A., Silverstein JA., Jenkins J.D. 2004. Iron respiration by Acidiphilium cryptum at pH 5 // FEMS Microbiol. Ecol. V.49. P. 137-143.

44. Boone D. R., Liu Y., Zhao Z.J., Balkwill D.L., Drake G.R., Stevens T.O., Aldrich, H.C. 1995. Bacillus infernus sp. nov., an Fe(III)- and Mn(IV)-reducing anaerobe from the deep terrestrial subsurface // Int. J. Syst. Bacteriol. V.45. P.441-448.

45. Bopp L.W., Ehrlich H.L. 1988. Chromate resistance and reduction in Pseudomonas fluoresces strain LB300 // Arch. Microbiol. V.150. P.426-431.

46. Boukhalfa H., Crumbliss A.L. 2002. Chemical aspects of siderophore mediated iron transport//BioMetals. V.15. P.325-339.

47. Braun V., Hantke K., Koester W. Bacterial iron transport: mechanisms, genetics, and regulation // Metal ions in biological systems / Eds.: Sigel A., Sigel H. 1998. New York: Marcel Dekker, Inc.

48. Bridge T., Johnson D.B. 1998. Reduction of soluble iron and reductive dissolution of ferric iron-containing minerals by moderately thermophilic iron-oxidizing bacteria // Appl. Environ. Microbiol. V.64. P.2181-2186.

49. Brim H., Venkateswaran A., Kostandarithes H.M., Fredrickson J.K., Daly M.J. 2003. Engineering Deinococcus geothermalis for Bioremediation of High-Temperature Radioactive Waste Environments // Appl. Environ. Microbiol. V.69. P.4575^1582.

50. Brock T.D., Gustafson J. 1976. Ferric iron reduction by sulfur- and iron-oxidizing bacteria // Appl. Environ. Microbiol. V.32. P.567-571.

51. Butler J.E., Kaufmann F., Coppi M.V., Nun'ez C., Lovley D.R. 2004. MacA, a Diheme c-Type Cytochrome Involved in Fe(III) Reduction by Geobacter sulfurreducens II J. Bacteriol. V.186. P.4042-4045.

52. Cervantes C., Campos-Garcia J., Devars S., Gutierrez-Corona F., Loza-Tavera H., Torres-Guzman J.C., Moreno-Sanchez R. 2001. Interactions of chromium with microorganisms and plants // FEMS Microbiol. Rev. V.25. P.335-347.

53. Champine J.E., Underhill B., Johnston J.M., Lilly W.W., Goodwin S. 2000. Electron transfer in the dissimilatory iron-reducing bacterium Geobacter metallireducens II Anaerobe. V.6. P. 187-196.

54. Chardin B., Giudici-Orticoni M.T., De Luca G., Guigliarelli B., Bruschi M. 2003. Hydrogenases in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase // Appl. Microbiol. Biotechnol. V.63.P.315-321.

55. Chaudhuri S.K., Lovley D.R. 2003. Electricity from direct oxidation of glucose in mediator-less microbial fuel cells // Nature Biotechnol. V.21. P.1229-1232.

56. Childers S.E., Lovley D.R. 2001. Differences in Fe(III) reduction in the hyperthermophilic archaeon, Pyrobaculum islandicum, versus mesophilic Fe(III)-reducing bacteria // FEMS Microbiol. Lett. V.195. P.253-258.

57. Childers S.E., Ciufo S., Lovley D.R. 2002. Geobacter metallireducens accesses insoluble Fe(III) oxide by chemotaxis // Nature. V.416. P.767-769.

58. Chin K.-., Esteve-Nun'ez A., Lovley D.R. 2004. Direct correlation between rates of anaerobic respiratoin and levels of mRNA for key respiratory genes in Geobacter sulfurreducens II Appl. Environ. Microbiol. V.70. P. 5183-5189.

59. Chiu H.J., Johnson E., Schroeder I., Rees D.C. 2001. Crystal structures of a novel ferric reductase from the hyperthermophilic archaeon Archaeoglobus fulgidus and its complex with NADP(+) // Structure. V.9. P.311-319.

60. Clement J., Shrestha J., Ehrenfeld J., Jaffe P. 2005. Ammonium oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron under anaerobic conditions in wetland soils // Soil Biol. Biochem. V.37. P.2323-2328.

61. Coates J.D., Phillips E.J.P., Lonergan D.J., Jenter H., Lovley D.R. 1996. Isolation of Geobacter species from diverse sedimentary environments // Appl. Environ. Microbiol. V.62. P.1531-1536.

62. Coates J.D., Ellis D.J., Blunt-Harris E.L., Gaw C.V., Roden E.E., Lovley D.R. 1998. Recovery of humic-reducing bacteria from a diversity of environments // Appl. Environ. Microbiol. V.64. P. 1504-1509.

63. Coates J.D., Cole K.A., Michaelidou U., Patrick J., Mclnerney M.J., Achenbach L.A. 2005. Biological Control of Hog Waste Odor through Stimulated Microbial Fe(III) Reduction // Appl. Environ. Microbiol. V.71. P.4728-4735.

64. Coppi M.V., O'Neil R.O., Lovley D.R. 2004. Identification of an uptake hydrogenase required for hydrogen-dependent reduction of Fe(III) and other electron acceptors by Geobacter sulfurreducens II J. Bacteriol. V. 186. P.3022-3028.

65. Correia I.J., Paquete C.M., Louro R.O., Catarino T., Turner D.L., Xavier A.V. 2002. Thermodynamic and kinetic characterization of trihaem cytochrome c? from Desulfuromonas acetoxidans II Eur. J. Biochem. V.269. P.5722-5730.

66. De Luca G., de Philip P., Dermoun Z., Rousset M., Vermeglio A. 2001. Reduction of technetium(VII) by Desulfovibrio fructosovorans is mediated by the nickel-iron hydrogenase // Appl. Environ. Microbiol. V.67. P.4583-4587.

67. DiChristina T.J., Moore C.M., Haller C.A. 2002. Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) Reduction by Shewanella putrefaciens requires ferE, a homolog of the pulE (gspE) type II protein secretion gene//J. Bacteriol. V.184. P.142-151.

68. Dobbin P.S., Powell A.K., McEwan A.G., Richardson D.J. 1995. The influence of chelating agents upon the dissimilatory reduction of Fe(III) by Shewanella putrefaciens II BioMetals. V.8. P.163-173.

69. Dobbin P.S., Butt J.N., Powell A.K., Reid G.A., Richardson D.J. 1999(b). Characterization of a flavocytochrome that is induced during the anaerobic respiration of Fe3+ by Shewanella fridigimarina NCIMB400 // Biochem. J. V.342. P.439-448.

70. Dopson M., Baker-Austin C., Bond P. 2007. Towards determining details of anaerobic growth coupled to ferric iron reduction by the acidophilic archaeon 'Ferroplasma acidarmanus' Ferl //Extremophiles. V.ll. P.159-168.

71. Downer D.N., Davis W.B., Byers B.R. 1970. Repression of phenolic acid synthesizing enzymes and its relation to iron uptake in Bacillus subtilis II J. Bacteriol. V.101. P.181-187.

72. Drake H.L. Acetogenesis, acetogenic bacteria, and the acetyl-CoA "Wood/Ljungdahl" pathway: past and current perspectives // Acetogenesis / Ed. Drake H.L. 1994. Chapman and Hall.

73. Ehrlich H.L. 2002. Geomicrobiology // Marcel Dekker, Inc.

74. Eichler B., Schink B. 1984. Oxidation of primary aliphatic alcohols by Acetobacterium carbinolicum sp. nov., a homoacetogenic anaerobe // Arch. Microbiol. V.140. P.147-152.

75. Esteve-Nun'ez A., Nun'ez C., Lovley D.R. 2004. Preferential Reduction of Fe(III) over Fumarate by GeobactersulfurreducensIIS. Bacteriol. V.186. P.2897-2899.

76. Esteve-Nun'ez A. 2006. Geobacter: A fluorescent bug lighting up the dark subsurface // Oral presentation S12.3 / 2nd FEMS Congress of European Microbiologists. July 4-8. Madrid. Spain.

77. Fardeau M.-L., Cayol J.-L., Magot M., Ollivier B. 1994. Hydrogen oxidation abilities in the presence of thiosulfate as electron acceptor within the genus Thermoanaerobacter II Curr. Microbiol. V.29. P.269-272.

78. Faudon C., Fardeau M.-L., Heim J., Patel B., Magot M., Ollivier B. 1995. Peptide and amino acid oxidation in the presence of thiosulfate by members of the genus Thermoanaerobacter H Curr. Microbiol. V.31. P. 152-157.

79. Fein J.B., Fowle D.A., Cahill J., Kemner K., Boyanov M., Bunker B. 2002. Nonmetabolic Reduction of Cr(VI) by Bacterial Surfaces Under Nutrient-Absent Conditions // Geomicrobiol. J. V.19. P.369-382.

80. Feinberg L.F., Holden J.F. 2006. Characterization of Dissimilatory Fe(III) versus NO3" Reduction in the Hyperthermophilic Archaeon Pyrobaculum aerophilum II J. Bacterid. V.188. P.525-531.

81. Finneran K., Anderson R.T., Nevin K.P., Lovley, D.R. 2002. Bioremediation of uranium-contaminated aquifers with microbial U(VI) reduction // Soil and Sediment Contamination. V.ll. P.339-357.

82. Francis A.J., Dodge C.J., Meinken G.E. 2002. Biotransformation of pertechnetate by Clostridia II Radiochim. Acta. V.90. P.791-797.

83. Fredrickson J.K., Kostandarithes H.M., Li S.W., Plymale A.E., Daly M.J. 2000. Reduction of Fe(III), Cr(VI), U(VI) and Tc(VII) by Deinococcus radiodurans R1 // Appl. Environ. Microbiol. V.66. P.2006-2011.

84. Gaines C.G., Lodge J.S., Arceneaux J.E., Byers B.R. 1981. Ferrisiderophore reductase activity associated with an aromatic biosynthetic enzyme complex in Bacillus subtilis II J. Bacterid. V.148. P.527-533.

85. Garbisu C., Alkorta I., Llama M.J., Serra J.L. 1998. Aerobic chromate reduction by Bacillus subtilis II Biodégradation. V.9. P. 133-141.

86. Gaspard S., Vazquez F., Holliger C. 1998. Localization and solubilization of the iron(III) reductase of Geobacter sulfurreducens // Appl. Environ. Microbiol. V.64 P.3188-3194.

87. Ghosh D., Bal B., Kashyap V.K., Pal S. 2003. Molecular phylogenetic exploration of bacterial diversity in a Bakreshwar (India) hot spring and culture of Shewanella-rehtzd thermophiles // Appl. Environ. Microbiol. V.69. P.4332-4336.

88. Glasauer S., Langley S., Beveridge T.J. 2002. Intracellular iron minerals in a dissimilatory iron-reducing bacterium // Science. V.295. P. 117-119.

89. Glasauer S., Langley S., Beveridge J. 2004. Intracellular manganese granules formed by a subsurface bacterium // Environ. Microbiol. V.6. P.1042-1048.

90. Glasauer S., Langley S., Boyanov M., Lai B., Kemner K., Beveridge T.J. 2007. Mixed-Valence Cytoplasmic Iron Granules Are Linked to Anaerobic Respiration // Appl. Environ. Microbiol. V.73. P.993-996.

91. Gordon E.H., Pike A.D., Hill A.E., Cuthbertson P.M., Chapman S.K., Reid G.A. 2000. Isolation and characterization of a novel cytochrome cj from Shewanella frigidimarina that is involved in Fe (III) respiration // Biochem. J. V.349. P.153-158.

92. Greene A.C., Patel B.K.C., Sheehy A.J. 1997. Deferribacter thermophilus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic manganese- and iron-reducing bacterium isolated from a petroleum reservoir//Int. J. Syst. Bacterid. V.47. P.505-509.

93. Halle F., Meyer J.M. 1992. Iron release from ferrisiderophores a multi-step mechanism involving a NADH:FMN oxidoreductase and a chemical reduction by FMNH2 // Eur. J. Biochem. V.209. P.621-627.

94. Hansel C.M., Benner S.G., Nico P., Fendorf S. 2004. Structural constraints of ferric (hydr)oxides on dissimilatory iron reduction and the fate of Fe(II) // Geochim. Cosmochim. Acta. V.68. P.3217-3229.

95. Harold F.M. 1972. Conservation and Transformation of Energy by Bacterial Membranes // Bacterid. Rev. V.36. P. 172-230.

96. Haveman S.A., Holmes D.E., Ding Y.-H.R., Ward J.E., DiDonato R.J.Jr., Lovley D.R. 2006. c-Type Cytochromes in Pelobacter carbinolicus II Appl. Environ. Microbiol. V.72. P.6980-6985.

97. Henstra A.M., Stams A.J.M. 2004. Novel Physiological Features of Carboxydothermus hydrogenoformans and Thermoterrabacterium ferrireducens 11 Appl. Environ. Microbiol. V.70. P.7236-7240.

98. Hernandez M.E., Newman D.K. 2001. Extracellular electron transfer // Cell. Mol. Life Sci. V.58. P. 1562-1571.

99. Holden J.F., Adams M.W.W. 2003. Microbe-metal interactions in marine hydrothermal environments // Curr. Opin. Chem. Biol. V. 7. P.160-165.

100. Holmes D.E., Finneran K.T., Lovley D.R. 2002. Enrichment of Geobacteraceae associated with Stimulation of dissimilatory metal reduction in uranium-contaminated aquifer sediments // Appl. Environ. Microbiol. V.68. P.2300-2306.

101. Huber R., Huber H., Stetter K.O. 2000. Towards the ecology of hyperthermophiles: biotopes, new isolation strategies and novel metabolic properties // FEMS Microbiol. Rev. V.24. P.615-623.

102. Huber H., Stetter K.O. Genus I Sulfolobus II Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. V.l. / Eds.: Boone D.R., Castenholz R.W., Garrity G.M. 2001. New York: Springer-Verlag.

103. Ishibashi Y., Cervantes C., Silver S. 1990. Chromium reduction in Pseudomonas putida II Appl. Environ. Microbiol. V.56. P.2268-2270.

104. Istok J.D., Senko J.M., Krumholz L.R., Watson D., Bogle M.A., Peacock A., Chang Y.-J., White D.C. 2004. In situ bioreduction of technetium and uranium in a nitrate-contaminated aquifer// Environ. Sei. Technol. V.38. P.468-475.

105. Jahn M.K., Haderlein S.B., Meckenstock R.U. 2005. Anaerobic Degradation of Benzene, Toluene, Ethylbenzene, and o-Xylene in Sediment-Free Iron-Reducing Enrichment Cultures // Appl. Environ. Microbiol. V.71. P.3355-3358.

106. Jannasch H.W., Mottl M.J. 1985. Geomicrobiology of deep-sea hydrothermal vents // Science. V.229. P.717-726.

107. Jones J.G., Gardener S., Simon B.M. 1984. Reduction of ferric iron by heterotrophic bacteria in lake sediments // J. Gen. Microbiol. V. 130. P.45-51.

108. Kalinowski B.E., Liermann L.J., Givens S., Brantley S.L. 2000. Rates of bacteria-promoted solubilization of Fe from minerals: a review of problems and approaches // Chem. Geol. V.169. P.357-370.

109. Kappler A., Benz M., Schink B., Brune A. 2004. Electron shuttling via humic acids in microbial iron(III) reduction in a freshwater sediment // FEMS Microbiol. Ecol. V.47. P.85-92.

110. Kashefi K., Lovley D.R. 2000. Reduction of Fe(III), Mn(IV), and toxic metals at 100°C by Pyrobaculum islandicum II Appl. Environ. Microbiol. V.66. P. 1050-1056.

111. Kashefi K., Lovley D.R. 2003. Extending the upper temperature limit for life // Science. V.301. P.934.

112. Kaufmann F., Lovley D.R. 2001. Isolation and Characterization of a Soluble NADPH-Dependent Fe(III) Reductase from Geobacter sulfurreducens // J. Bacteriol. V.183. P.4468-4476.

113. Khijniak T.V., Medvedeva-Lyalikova N.N., Simonoff M. 2003. Reduction of pertechnetate by haloalkaliphilic strains of Halomonas II FEMS Microbiol. Ecol. V.44. P.109-115.

114. Klonowska A., Heulin T., Vermeglio A. 2005. Selenite and Tellurite Reduction by Shewanella oneidensis // Appl. Environ. Microbiol. V.71. P.5607-5609.

115. Kuesel K., Roth, U, Drake H.L. 2002. Microbial reduction of Fe(III) in the presence of oxygen under low pH conditions // Environ. Microbiol. V.4. P.414-421.

116. Kuesel K., Chabbi A., Trinkwalter T. 2003. Microbial Processes Associated with Roots of Bulbous Rush Coated with Iron Plaques // Microb. Ecol. V.46. P.302-311.

117. Kumaraswamy R., Kuenen J.G., Kleerebezem R., van Loosdrecht M.C.M., Muyzer G. 2006. Structure of microbial communities performing the simultaneous reduction of Fe(II)EDTA.N02" and Fe(III)EDTA"// Appl. Microbiol. Biotechnol. V.73. P.922-931.

118. Leang C., Coppi M.V., Lovley D.R. 2003. OmcB, a c-type polyheme cytochrome, involved in Fe(III) Reduction in Geobacter sulfurreducens // J. Bacteriol. V.185. P.2096-2103.

119. Leang C., Adams L.A., Chin K.-J., Nevin K.P., Methe B.A., Webster J., Sharma M.L., Lovley D.R. 2005. Adaptation to Disruption of the Electron Transfer Pathway for Fe(III) Reduction in Geobacter sulfurreducens II J. Bacteriol. V.187. P.5918-5926.

120. Lee A.K., Newman D.K. 2003. Microbial iron respiration: impacts on corrosion processes // Appl. Microbiol. Biotechnol. V.62. P.134-139.

121. Li S.V., Zhou J., Zhang C., Cole D.R., Gajdarziska-Josifovska M., Phelps, T.J. 1997. Thermophilic Fe(III)-reducing bacteria from the deep subsurface: the evolutionary implications // Science. V.277. P. 1106-1109.

122. Lin W.C., Coppi M.V., Lovley D.R. 2004. Geobacter sulfurreducens can grow with oxygen as a terminal electron acceptor // Appl. Environ. Microbiol. V.70. P.2525-2528.

123. Liu C., Gorby Y.A., Zachara J.M., Fredrickson J.K., Brown C.F. 2002. Reduction Kinetics of Fe(III), Co(III), U(VI), Cr(VI), and Tc(VII) in Cultures of Dissimilatory Metal-Reducing Bacteria//Biotech. Bioeng. V.80. P.637-649.

124. Lloyd J.R., Macaskie L.E. 1996. A novel Phosphorlmager based technique for monitoring the microbial reduction of technetium // Appl. Environ. Microbiol. V.62. P.578-582.

125. Lloyd J.R., Cole J.A., Macaskie L.E. 1997. Reduction and removal of heptavalent technetium from solution by Esherichia coli // J. Bacteriol. V. 179. P.2014-2021.

126. Lloyd J.R., Nolting H.-F., Sole V.A., Bosecker K., Macaskie L.E. 1998. Technetium reduction and precipitation by sulfate-reducing bacteria // Geomicrobiol. J. V.15. P.45-58.

127. Lloyd J.R., Sole V.A., van Praagh V.G., Lovley D.R. 2000. Direct and Fe(II)-mediated reduction of technetium by Fe(III)-reducing bacteria // Appl. Environ. Microbiol. V.66. P.3743-3749.

128. Lloyd J.R., Mabbett A.N., Williams D.R., Macaskie L.E. 2001. Metal reduction by sulphate-reducing bacteria: physiological diversity and metal specificity // Hydrometallurgy. V.59. P.327-337.

129. Lloyd J.R., Chesnes J., Glasauer S., Bunker D.J., Livens F.R., Lovley D.R. 2002. Reduction of actinides and fission products by Fe(III)-reducing bacteria // Geomicrobiol. J. V.19. P. 103120.

130. Lloyd J.R. 2003. Microbial reduction of metals and radionuclides // FEMS Microbiol. Rev. V.27. P.411-425.

131. Lloyd J.R., Lovley D.R., Macaskie L.E. 2003(a). Biotechnological applications of metal-reducing microorganisms // Adv. Appl. Microbiol. V.53. P.85-128.

132. Lovley D.R. 1987. Organic matter mineralization with the reduction of ferric iron: a review // Geomicrobiol. J. V.5. P.375-399.

133. Lovley D.R., Phillips E.J.P. 1987. Competitive mechanisms for inhibition of sulfate reduction and methane production in the zone of ferric iron reduction in sediments. // Appl. Environ. Microbiol. V. 53. p. 2636-2641.

134. Lovely D.R., Phillips E.J.P. 1989. Requirement for a microbial consortium to completely oxidize glucose in Fe(III)-reducing sediments // Appl. Environ. Microbiol. V.55. P.3234-3236.

135. Lovley D.R. 1991. Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction // Microbiol. Rev. V.55. P.259-287.

136. Lovley D.R., Phillips E.P., Gorby Y.A., Landa E.R. 1991. Microbial reduction of uranium // Nature. V.350. P.413-416.

137. Lovley D.R., Phillips E.J. 1992. Reduction of uranium by Desulfovibrio desulfuricans II Appl. Environ. Microbiol. V.58. P.850-856.

138. Lovley D.R., Roden E.E., Phillips E.J.P., Woodward J.C. 1993(a). Enzymatic iron and uranium reduction by sulfate-reducing bacteria // Mar. Geol. V.l 13. P.41-53.

139. Lovley D.R., Widman P.K., Woodward J.C., Phillips E.J.P. 1993(b). Reduction of uranium by cytochrome C3 of Desulfovibrio vulgaris II Appl. Environ. Microbiol. V.59. P.3572-3576.

140. Lovley D.R., Phillips E.J.P. 1994. Reduction of chromate by Desulfovibrio vulgaris and its c3 cytochrome // Appl. Environ. Microbiol. V.60. P.726-728.

141. Lovley D.R., Woodward J.C., Chapelle F.H. 1994. Stimulated anoxic biodégradation of aromatic hydrocarbons using Fe(III) ligands // Nature. V.370. P. 128-131.

142. Lovley D.R., Fraga J.L., Blunt-Harris E.L., Hayes L.A., Phillips E.J.P., Coates J.D. 1998. Humic substances as a mediator for microbially catalyzed metal reduction // Acta Hydrochim. Hydrobiol. V.26. P. 152-157.

143. Lovley D.R., Kashefi K., Vargas M., Tor J.M. Blunt-Harris E.L. 2000. Reduction of humic substances and Fe(III) by hyperthermophilic microorganisms // Chem. Geol. V. 169. P. 289298.

144. Lovley D.R. Reduction of Iron and Humics in Subsurface Environments // Subsurface Microbiology and Biogeochemistry / Eds.: Fredrickson J.K., Fletcher M. 2001. Wiley-Liss, Inc.

145. Lovley D.R., Holmes D.E., Nevin K.P. 2004. Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction // Adv. Microb. Physiol. V.49. P.219-286.

146. Lovley D.R. Potential role of dissimilatory iron reduction in the early evolution of microbial respiration // Origins, Evolution and Biodiversity of Microbial Life / Ed. Seckbach J. 2005. Kluwer. Netherlands. P.301-313.

147. Lower S.K., Hochella Jr.M.F., Beveridge T.J. 2001. Bacterial recognition of mineral surfaces: nanoscale interactions between Shewanella and alpha-FeOOH // Science. V.292. P.1360-1363.

148. Macaskie L.E. 1991. The application of biotechnology to the treatment of wastes produced from nuclear fuel cycle: biodégradation and bioaccumulation as a means of treating radionuclide-containing streams // Crit. Rev. Biotechnol. V.l 1. P.41-112.

149. Magnuson T.S., Hodges-Myerson A.L., Lovley D.R. 2000. Characterization of a membrane-bound NADH-dependent Fe3+ reductase from the dissimilatory Fe3+-reducing bacterium Geobacter sulfurreducens IIFEMS Microbiol. Lett. V.185. P.205-211.

150. Matshushita K., Otofuji A., Iwahashi M, Toyama H., Adachi 0. 2001. NADH dehydrogenase of Corynebacterium glutamicum. Purification of an NADH dehydrogenase II homolog able to oxidize NADPH // FEMS Microbiol. Lett. V.204. P.271-276.

151. McLean J., Beveridge T.J. 2001. Chromate reduction by a pseudomonad isolated from a site contaminated with chromated copper arsenate // Appl. Environ. Microbiol. V.67. P. 10761084.

152. Megharaj M., Avudainayagam S., Naidu R. 2003. Toxicity of hexavalent chromium and its reduction by bacteria isolated with tannery waste // Curr. Microbiol. V.47. P.51-54.

153. Mehta T., Coppi M.V., Childers S.E., Lovley D.R. 2005. Outer Membrane c-Type Cytochromes Required for Fe(III) and Mn(IV) Oxide Reduction in Geobacter sulfurreducens II Appl. Environ. Microbiol. V.71. P.8634-8641.

154. Merroun M.L., Raff J., Rossberg A., Hennig C., Reich T., Selenska-Pobell S. 2005. Complexation of Uranium by Cells and S-Layer Sheets of Bacillus sphaericus JG-A12 // Appl. Environ. Microbiol. V.71. P.5532-5543.

155. Methe B.A., Webster J., Nevin K., Butler J., Lovley D.R. 2005. DNA Microarray Analysis of Nitrogen Fixation and Fe(III) Reduction in Geobacter sulfurreducens II Appl. Environ. Microbiol. V.71. P.2530-2538.

156. Miramar M.D., Costantini P., Ravagnan L., Saraiva L.M., Haouzi D., Brothers G., Penninger J.M., Peleato M.L., Kroemer G., Susinc S.A. 2001. NADH Oxidase Activity of Mitochondrial Apoptosis-inducing Factor // J. Biol. Chem. V.276. P.16391-16398.

157. Moeller C., van Heerden E. 2006. Isolation of a soluble and membrane-associated Fe(III) reductase from the thermophile, Thermus scotoductus (SA-01) // FEMS Microbiol. Lett. V.265. P.237-243.

158. Moody M.G., Dailey H.A. 1983. Aerobic ferrisiderophore reductase assay and activity stain for native PAGE // Anal. Bioch. V.134. P.235-239.

159. Moreno-Vivian C., Ferguson S.J. 1998. Definition and distinction between assimilatory, dissimilatory and respiratory pathways // Molec. Microbiol. V.29. P.661-669.

160. Myers C.R., Myers J.M. 1993. Ferric reductase is associated with the membranes of anaerobically grown Shewanellaputrefaciens MR-1 // FEMS Microbiol. Lett. V. 108. P. 15-22.

161. Myers C.R., Myers J.M. 1997(a). Cloning and sequencing of cymA, a gene encoding a tetraheme cytochrome c required for reduction of iron(III), fumarate, and nitrate by Shewanella putrefaciens strain MR-1 // J. Bacteriol. V.179. P.l 143-1152.

162. Myers C.R., Myers J.M. 1997(b). Outer membrane cytochromes of Shewanella putrefaciens MR-1: spectral analysis, and purification of the 83-kDa c-type cytochromc // Biochim. Biophys. Acta. V.1326. P.307-318.

163. Myers J.M., Myers C.R. 2000. Role of the tetraheme cytochrome CymA in anaerobic electron transport in cells of Shewanella putrefaciens MR-1 with normal levels of menaquinone // J. Bacteriol. V.182. P.67-75.

164. Myers C.R., Carstens B.P., Antholine W.E., Myers J.M. 2000. Chromium (VI) reductase activity is associated with the cytoplasmic membrane of anaerobically grown Shewanella putrefaciens MR-1 //J. Appl. Microbiol. V.88. P.98-106.

165. Myers C.R., Myers J.M. 2002. MrtB is required for proper incorporation of the cytochromes OmcA and OmcB in the outer membrane of Shewanella putrefaciens MR-1 // Appl. Environ. Microbiol. V.68. P.5585-5594.

166. Myers C.R., Myers J.M. 2003(a). Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1 // Lett. Appl. Microbiol. V.37. P.254-258.

167. Myers J.M., Myers C.R. 2003(b). Overlapping role of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1 in the reduction of manganese(IV) oxide // Lett. Appl. Microbiol. V.37. P.21-25.

168. Neal A.L., Clough L.K., Perkins T.D., Little B.J., Magnuson T.S. 2004. In situ measurement of Fe(III) reduction activity of Geobacter pelophilus by simultaneous in situ RT-PCR and XPS analysis // FEMS Microbiol. Ecol. V.49. P. 163-169.

169. Nealson K.H., Saffarini D. 1994. Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation // Annu. Rev. Microbiol. V.48. P.311-343.

170. Nealson K.H., Cox B.L. 2002. Microbial metal-ion reduction and Mars: extraterrestrial expectations? // Curr. Opin. Microbiol. V.5. P.296-300.

171. Nealson K.H., Belz A., McKee B. 2002. Breathing metals as a way of life: geobiology in action // Ant. van Leeuwenhoek. V.81. P.215-222.

172. Nevin K.P., Lovley D.R. 2000. Lack of production of electron-shuttling compounds or solubilization of Fe(III) during reduction of insoluble Fe(III) oxide by Geobacter metallireducens II Appl. Environ. Microbiol. V.66. P.2248-2251.

173. Nevin K.P., Lovley D.R. 2002(a). Mechanisms for Fe(III) oxide reduction in sedimentary environments // Geomicrobiol. J. V.19. P.141-159.

174. Nevin K.P., Lovley D.R. 2002(b). Mechanisms of accessing insoluble Fe(III) oxide during dissimilatory Fe(III) reduction by Geothrix fermentans II Appl. Environ. Microbiol. V.68. P.2294-2299.

175. Newman D.K., Kolter R. 2000. A role of excreted quinines in extracellular electron transfer //Nature. V.405. P.94-97.

176. Noguchi Y., Fujiwara T., Yoshimatsu K., Fukumori Y. 1999. Iron reductase for magnetite synthesis in the magnetotactic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum // J. Bacteriol. V.181. P.2142-2147.

177. Ohmura N., Sasaki K., Matsumoto N., Saiki H. 2002. Anaerobic respiration using Fe3+, S°, and H2 in the chemolithoautotrophic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. V.184. P.2081-2087.

178. Ortiz-Bernad I., Anderson R.T., Vrionis H.A., Lovley D.R. 2004(a). Vanadium respiration by Geobacter metallireducens: novel strategy for in situ removal of vanadium from groundwater// Appl. Environ. Microbiol. V.70. P.3091-3095.

179. Ortiz-Bernad I., Anderson R.T., Vrionis H.A., Lovley D.R. 2004(b). Resistance of solidphase U(VI) to microbial reduction during in-situ bioremediation of uranium-contaminated groundwater // Appl. Environ. Microbiol. V.70. P.7558-7560.

180. Park C.H., Keyhan M., Wielinga B., Fendorf S., Matin A. 2000. Purification to homogeneity and characterization of a novel Pseudomonas putida chromate reductase // Appl. Environ. Microbiol. V.66. P. 1788-1795.

181. Payne R.B., Gentry D.M., Rapp-Giles B.J., Casalot L., Wall J.D. 2002. Uranium reduction by Desulfovibrio desulfuricans strain G20 and a cytochrome cj mutant // Appl. Environ. Microbiol. V.68. P.3129-3132.

182. Payne R.B., Casalot L., Rivere T., Terry J.H., Larsen L., Giles B., Wall J.D. 2004. interaction between uranium and cytochrome cj of Desulfovibrio desulfuricans strain G20 // Arch. Microbiol. V.181. P.398-406.

183. Pierre J.L., Fontecave M., Crichton R.R. 2002. Chemistry for an essential biological process: the reduction of ferric iron // BioMetals. V.15. P.341-346.

184. Pietzsch K., Babael W. 2003. A sulfate-reducing bacterium that can detoxify U(VI) and obtain energy via nitrate reduction // J. Basic Microbiol. V.4. P.348-361.

185. Pignolet L., Fonsny K., Capot F., Moureau Z. 1989. Role of various microorganisms on Tc behaviour in sediments // Health Phys. V.57. P.791-800.

186. Pitts K.E., Dobbin P.S., Reyes-Ramirez F., Thomson A.J., Richardson D.J., Seward H.E. 2003. Characterization of the Shewanella oneidensis MR-1 decaheme cytochrome MtrA // J. Biol. Chem. V.278. P.27758-27765.

187. Pollmann K., Raff J., Merroun M., Fahmy K., Selenska-Pobell S. 2006. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications // Biotech. Adv. V.24. P.58-68.

188. Puzon G.J., Petersen J.N., Roberts A.G., Kramer D.M., and Xun L.Y. 2002. A bacterial flavin reductase system reduces chromate to a soluble chromium(III)-NAD(+) complex // Biochem. Biophys. Res. Commun. V.294. P.76-81.

189. Reguera G., McCarthy K.D., Mehta T., Nicoll J.S., Tuominen M.T., Lovley D.R. 2005. Extracellular electron transfer via microbial nanowires // Nature. V.435. P.1098-1101.

190. Reimers C.E., Tender L.M., Fertig S., Wang, W. 2001. Harvesting energy from the marine sediment-water interface // Environ. Sci. Technol. V.35. P.192-195.

191. Roberts J.L. 1947. Reduction of ferric hydroxide by strains of Bacillus polymyxa II Soil Sci. V.63. P.135-140.

192. Roh Y., Liu S.V., Li G., Huang H., Phelps T.J., Zhou J. 2002. Isolation and characterization of metal-reducing Thermoanaerobacter strains from deep subsurface environments of the Piceance Basin, Colorado //Appl. Environ. Microbiol. V.68. P.6013-6020.

193. Ruebush S.S., Brantley S.L., Tien M. 2006(a). Reduction of Soluble and Insoluble Iron Forms by Membrane Fractions of Shewanella oneidensis Grown under Aerobic and Anaerobic Conditions//Appl. Environ. Microbiol. V.72. P.2925-2935.

194. Ruebush S.S., Icopini G.A., Brantley S.L., Tien M. 2006(b). In vitro enzymatic reduction kinetics of mineral oxides by membrane fractions from Shewanella oneidensis MR-1 // Geochim. Cosmochim. Acta. V.70. P.56-70.

195. Russ R., Rau J., Stolz A. 2000. The function of cytoplasmic flavin reductases in the reduction of azo dyes by bacteria // Appl. Environ. Microbiol. V.66. P. 1429-1434.

196. Sani R.K., Peyton B.M., Smith W.A., Apel W.A., Petersen J.N. 2002. Dissimilatoiy reduction of Cr(VI), Fe(III), and U(VI) by Cellulomonas isolates // Appl. Microbiol. Biotechnol. V.60. P.192-199.

197. Schroeder I., Johnson E., and de Vries S. 2003. Microbial ferric iron reductatses // FEMS Microbiol. Rev. V.27. P.427-447.

198. Schuler D., Frankel R.B. 1999. Bacterial magnetosomes: microbiology, biomineralization and biotechnological applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. V.52. P.464-473.

199. Slobodkin A.I., Wiegel J. 1997. Fe(III) as an electron acceptor for H2 oxidation in thermophilic anaerobic enrichment cultures from geothermal areas // Extremophiles. V.l. P.106-109.

200. Slobodkin A.I., Reysenbach A.-L., Mayer F., Wiegel J. 1997(b). Isolation and Characterization of the Homoacetogenic Thermophilic Bacterium Moorella glycerini sp. nov. // Int. J. Syst. Bacterid. V.47. P. 969-974.

201. Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Slobodkin A.I., Subbotina I.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Lebedinsky A.V. 2004. PCR-based identification of hyperthermophilic archaea of the family Thermococcaceae II Appl. Environ. Microbiol. V.70. P.5701-5703.

202. Stams A.J.M., de Bok F.A.M., Plugge C.M., van Eekert M.H.A., Dolfrng J., Schraa G. 2006. Exocellular electron transfer in anaerobic microbial communities // Environ. Microbiol. V.8. P.371-382.

203. Starkey R.L., Halvorson H.O. 1927. Studies on the transformations of iron in nature. II. Concerning the importance of microorganisms in the solution and precipitation of iron // Soil Sci. V.24. P.381-402.

204. Straub K.L., Schink B. 2003. Evaluation of electron-shuttling compounds in microbial ferric iron reduction // FEMS Microbiol. Lett. V.220. P.229-233.

205. Straub K.L., Schink B. 2004. Ferrihydrite reduction by Geobacter species is stimulated by secondary bacteria // Arch. Microbiol. V.l82. P.175-181.

206. Suzuki Y., Kelly S. D., Kemner K. M., Banfield J. F. 2002. Nanometer size products of uranium bioreduction // Nature. V.419. P. 134.

207. Suzuki Y., Kelly S.D., Kemner K.M., Banfield J.F. 2005. Direct Microbial Reduction and Subsequent Preservation of Uranium in Natural Near-Surface Sediment // Appl. Environ. Microbiol. V.71. P. 1790-1797.

208. Svetlichnyi V., Peschel C., Acker G., Meyer O. 2001. Two Membrane-Associated NiFeS-Carbon Monoxide Dehydrogenases from the Anaerobic Carbon-Monoxide-Utilizing Eubacterium Carboxydothermus hydrogenoformans II J. Bacteriol. V.183. P.5134-5144.

209. Takai K., Hirayama H., Sakihama Y., Inagaki Y., Horikoshi K. 2002. Isolation and metabolic characteristics of previously uncultured members of the order Aquificales in a subsurface gold mine //Appl. Environ. Microbiol. V.68. P.3046-3054.

210. Takai K., Kobayashi H., Nealson K.H., Horikoshi K. 2003. Suljurihydrogenibium subterraneum gen. nov., sp. nov., from a subsurface hot aquifer // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.53. P.823-827.

211. Tavares F., Sellstedt A. 2000. A simple, rapid and non-destructive procedure to extract cell wall-associated proteins from Frankia II J. Microbiol. Meth. V.39. P. 171-178.

212. Tebo B.M., Obraztsova A.Y. 1998. Sulfate-reducing bacterium grows with Cr(VI), U(VI), Mn(IV), and Fe(III) as electron acceptors // FEMS Microbiol. Lett. V.162. P.193-198.

213. Thamdrup B. 2000. Bacterial manganese and iron reduction in aquatic sediments // Adv. Microb. Ecol. V.16. P.41-84.

214. Thauer R.K., Jungermann K., Decker K. 1977. Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria // Bacteriol. Rev. V.41. P. 100-180.

215. Thomas P.E., Ryan D., Levin W. 1976. An improved staining procedure for the detection of the peroxidase activity of cytochrome P-450 on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels // Anal. Biochem. V.75. P. 168-76.

216. Toffin L., Bidault A., Pignet P., Tindall B.J., Slobodkin A., Kato C., Prieur D. 2004. Shewanella profunda sp. nov., isolated from deep marine sediment of the Nankai Trough // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.54. P. 1943-1949.

217. Tor J., Lovley D.R. 2001. Anaerobic degradation of aromatic compounds coupled to Fe(III) by Ferroglobusplacidus // Environ. Microbiol. 2001. V.3. P.281-287.

218. Tor J.M., Kashefi K., Lovley D.R. 2001. Acetate oxidation coupled to Fe(III) reduction in hyperthermophilic microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. V.67. P.1363-1365.

219. Tugel J.B., Hines M.E., Jones G.E. 1986. Microbial Iron Reduction by Enrichment Cultures Isolated from Estuarine Sedimentst // Appl. Environ. Microbiol. V.52. P. 1167-1172.

220. Turick C.E., Tisa L.S., Caccavo Jr.F. 2002. Melanin production and use as a soluble electron shuttle for Fe(III) oxide reduction and as a terminal electron acceptor by Shewanella algae BrY // Appl. Environ. Microbiol. V.68. P.2436-2444.

221. Turick C.E., Caccavo F.Jr., Tisa L.S. 2003. Electron transfer from Shewanella algae BrY to hydrous ferric oxide is mediated by cell-associated melanin // FEMS Microbiol. Lett. V.220. P.99-104,

222. Urrutia M.M., Roden E.E., Zachara J.M. 1999. Influence of Aqueous and Solid-Phase Fe(II) Complexants on Microbial Reduction of Crystalline Iron(III) Oxides // Environ. Sci. Technol. V.33. P.4022-4028.

223. Vadas A., Monbouquette H.G., Johnson E., Schroeder I. 1999. Identification and characterization of a novel ferric reductase from the hyperthermophilic archaeon Archaeoglobus fuldigus II J. Biol. Chem. V.274. P.36715-36721.

224. Vargas M., Kasheff K., Blunt-Harris E., Lovley D. 1998. Microbiological evidence for Fe(III) reduction on early Earth //Nature. V. 395. P. 65-67.

225. Vainshtein M., Suzina N., Kudryashova E., Ariskina E. 2002. New magnet-sensitive structures in bacterial and archaeal cells // Biol. Cell. V.94. P.29-35.

226. Van der Maas P., van de Sandt T., Klapwijk B., Lens P. 2003. Biological reduction of nitric oxide in aqueous Fe(II) EDTA solutions // Biotechnol. Prog. V.19. P.1323-1328.

227. Voelkl P., Huber R., Drobner E., Rachel R., Burggraf S., Trincone A., Stetter K.O. 1993. Pyrobaculum aerophilum sp. nov., a novel nitrate-reducing hyperthermophilic archaeum // Appl. Environ. Microbiol. V.59. P.2918-2926.

228. Wade Jr.R., DiChristina T.J. 2000. Isolation of U(VI) reduction-deficient mutants of Shewanella putrefaciens // FEMS Microbiol. Lett. V.184. P.143-148.

229. Walker J.C.G. 1987. Was the Archaean biosphere upside down? // Nature. V.329. P.710-712.

230. Wang Y.-T. Microbial reduction of Chromate // Environmental Microbe-Metal Interactions / Ed. Lovley D.R. 2000. Washington D.C.: ASM Press.

231. Weber K.A., Urrutia M.M., Churchill P.F., Kukkadapu R.K., Roden E.E. 2006. Anaerobic redox cycling of iron by freshwater sediment microorganisms // Environ. Microbiol. V.8. P.100-113.

232. Wildung R.E., McFadden K.M., Garland T.R. 1979. Technetium sources and behavior in the environment// J. Environ. Qua.l V.8. P.156-161.

233. Wildung R.E., Li S.W., Murray C.J., Krupka K.M., Xie Y., Hess N.J., Roden E.E. 2004. Technetium reduction in sediments of a shallow aquifer exhibiting dissimilatory iron reduction potential // FEMS Microbiol. Ecol. V.49. P.151-162.

234. Woz'nica A., Dzirba J., Man'ka D., Labuzhek S. 2003. Effects of electron transport inhibitors on iron reduction in Aeromonas hydrophila strain KB1 // Anaerobe. V.9. P. 125130.

235. Ye Q., Roh Y., Carroll S.L., Blair B., Zhou J., Zhang C.L., Fields M.W. 2004. Alkaline Anaerobic Respiration: Isolation and Characterization of a Novel Alkaliphilic and Metal-Reducing Bacterium // Appl. Environ. Microbiol. V.70. P.5595-5602.

236. Zhang C., Liu S., Logan J., Mazumder R., Phelps T.J. 1996. Enhancement of Fe(III), Co(III), and Cr(VI) reduction at elevated temperatures and by a thermophilic bacterium // Appl. Biochem. Biotechnol. V.57/58. P.923-932.

Информация о работе

Гаврилов, Сергей Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Физиологические и биохимические механизмы диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens (syn. Thermoterrabacterium ferrireducens) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы