Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пикосекундная спектроскопия процессов деления и рекомбинации зарядов в РЦ пурпурной бактерии Rps. sphaeroides и ФС I высших растений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Аврамов, Лъчезар Аспарухов

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЖТЕРАТУРЫ

§1. Фотосинтетические реакционные центры пурпурных бактерий

1.1 Структура и состав реакционных центров

1.2 Последовательность фотохимических процессов переноса электрона в РЦ.

1.3 Рекомбинация зарядов в радикальной паре реакциг ': онного центра

§2. Реакционные центры фотосистемы I

Глава 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОБРАЗЦОВ

§1. Лазерный стенд для получения перестраеваемых по частоте пикосекундных импульсов света

1.1 Генератор пикосекундных импульсов света

1.2 Выделение одиночного импульса и его усиление

1.3 Получение перестраеваемых по частоте импульсов света с помощью ПГС и генерация континуума

§2. Автоматизированная система регистрации и управления абсорбционным спектрометром

2.1 Оптическая схема регистрирующей части и фотоприемники

2.2 Апаратурное обеспечение системы регистрации и управления спектрометром

2.3 Програмное обеспечение

2.4 Исследование статистических характеристик пи-косекундной лазерной установки

§3. Методика спектрально-кинетических измерений и обработки результатов

§4. Методика приготовления образцов

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

§1. Математическая обработка результатов

§2. Кинетика первичного разделения зарядов в реакционных центрах бактерии

§3. Исследование рекомбинации зарядов в РЦ.

§4. Исследование переноса энергии и электрона в

ПБК фотосистемы I

§5. Рекомбинация зарядов в ЕЦ фотосистемы I

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пикосекундная спектроскопия процессов деления и рекомбинации зарядов в РЦ пурпурной бактерии Rps. sphaeroides и ФС I высших растений"

Фотосинтез - это, пожалуй,самый важный процесс на Земле, ибо благодаря ему возникла и поддерживается в настоящее время жизнь на планете. Суть процесса заключается в его наименовании: за счет энергии света в результате многоступенчатых биохимических реакций синтезируются органические соединения. Кроме того, зеленые растения и водоросли в процессе фотосинтеза разлагают воду и выделяют свободный молекулярный кислород - активнейший природный окислитель.

Исследованием фотосинтеза занимаются люди самых различных специальностей - как представители фундаментальной науки: физики, химики, биологи, так и ученые прикладного профиля - технологи, конструкторы электронных устройств, ученые - агрономы и другие. И несмотря на то, что сегодня мы знаем довольно много о механизмах отдельных стадий фотосинтеза, цельного и полного представления об этом природном процессе у нас нет. Соответственно, человек пока еще не может влиять на протекание процесса в целом или эффективность тех или иных его частных реакций и, тем самым, использовать этот уникальный природный механизм или его детали в своей деятельности. Именно стремление разобраться во всех тонкостях фотосинтетического процесса и привлечь основополагающие принципы его организации для решения практических задач и определяет неизменный и глубокий интерес ученых разных специальностей к его изучению.

Как известно, из всей совокупности фотосинтетических реакций условно выделяют первичные. К ним относятся: поглощение света молекулами-светосборщиками, миграция энергии в светособираю-щих пигмент-белковых комплексах, захват возбуждения фотоактивнымимолекулами реакционных центров /РЦ/, деление зарядов и перенос электрона в пределах РЦ. При этом, квантовый выход первичного фотоокисления донора электрона РЦ близок к I /I/, а величина запасенной в РЦ энергии составляет 33% от энергии света, поглощенной фотоактивным пигментом РЦ /2/. Очевидно, использование явления фотосинтетического преобразования световой энергии в электрическую в искусственных фотопреобразователях сулит человечеству огромную выгоду, ибо в такой "электростанции" используются возобновляющиеся компоненты.

Традиционными экспериментальными подходами к изучению первичных процессов фотосинтеза являются импульсная флуорометрия и абсорбционная спектроскопия. Каждый из этих методов имеет определеннее преимущества и присущие только ему недостатки. Поэтому, информация, получаемая в независимых опытах с использованием флуоресцентной и абсорбционной техники, не всегда согласуется. К сожалению, до настоящего времени ни одна Лаборатория не выполнила одновременного исследования совокупности первичных процессов фотосинтеза методами флуоресцентной и абсорбционной спек-троскопий. Однако только совмещение этих методов в одном эксперименте в определенных случаях может дать достоверную информацию об исследуемых процессах. Например, комплекс РЦ фотосистемы I высших растений в чистом виде не изолируется, поэтому каждый выделенный комплекс содержит несколько десятков светособирающегохлорофилла на один РД. Поэтому ни с помощью абсорбционной, ни флуоресцентной спектроскопий нельзя получить точную количественную информацию о скорости деления зарядов в РЦ, тогда как измерение кинетик флуоресценции и изменений поглощения в соответствующих областях спектра позволяет решить эту пробшему.

Кроме того, несмотря на относительно длительное />10 лет/ время применения пикосекундной техники в фотобиологических' исследованиях, не все проблемы методического характера, включающие особенности получения экспериментальных кривых и их математической обработки решены. Например, пока не реализована методик® отбора импульсов света по длительности, нет единой методики обсчета кривых. Следовательно, совершенствование экспериментальных методов и математических подходов к извлечению содержащихся в экспериментальных зависимостях результатов имеет большое значение как для истолкования полученных данных, так и для развития пикосекундной спектроскопии вообще.

Наконец, в литературе имеется недостаточно данных по нано-секундной рекомбинации радикальной пары, возникшей в РЦ в результате разделения зарядов. Вместе с тем, получение полной информации по флуоресцентной и абсорбционной методикам может дать исключительно шжную информацию о состояниях, через которые про-ходитРЦ в процессе деления зарядов и переноса электрона.

В результате работы над диссертацией собран автоматизированный пикосекундный абсорбционный спектрометр, имеющий временное разрешение +3 пс. Разработана методика контроля и отбора импульсов возбуждающего и зондирующего света по длительности. Предложена методика обработки экспериментальных данных, позволяющая достигнуть разрешения + 3 пс при точности измерения кинетик -ЯЗ'Ю единиц оптической плотности.

В одновременном эксперименте на пикосекундном импульсном флуорометре, работающем в режиме накопления и тлеющем временное разрешение 1,5 - 2,0 пс, и абсорбционном спектрометре исследованы кинетики разделения зарядов в РЦ вра, . Установлено, что реакция деления зарядов в РЦ осуществляется за 6-7 пс, причем кинетика деления зарядов - моноэкспоненциальна.

Исследована кинетика рекомбинации зарядов в РЦ Крз. $,риаеуо1си$ в восстановительных условиях /ОС-^ в темноте/ а также в образцах, лишенных хинонвдх акцепторов. Обнаружены два рекомбинационных компонента с временами не и10 не, начальные амплитуды этих компонентов примерно одинаковы. Установлено, что магнитное поле не влияет на кинетику рекомбинации зарядов каротиноид-содержа-щих РЦ. Предложена модельная схема состояний РЦ, удовлетворяющая экспериментальным результатам.

Изучены миграция энергии, деление зарядов и перенос электрона на первичный акцептор /железо-серный белок/ в комплексе РЦ фотосистемы I. Составлена математическая модель, описывающая совокупность перечисленных процессов. Определены константы исследованных реакций.

Измерена скорость рекомбинации зарядов в РЦ фотосистемы I в условиях, когда первичный акцептор /Ребелок/ восстановлен в темноте или удален при выделении препарата. В пределах точности измерения магнитное поле не оказывает влияния на кинетикунаносекундной рекомбинации радикальной пары в РЦ фотосистемы I.

Полученные результаты расширяют и углубляют наши представления о последовательности и скоростях первичных реакций в РЦ пурпурных бактерий- и фотосистемы I высших растений. Они могут быть использованы для дальнейшего изучения первичных реакций фотосинтеза, а также иметь прикладное значение для создания искусственных :фотопреобразователей. Методические достижения данной работы могут оказаться полезными для дальнейшего совершенствования метода пикосекундной абсорбционной спектроскопии.обзор штератуш§ I. Фотосинтетические реакционные центры пурпурных бактерий.I.I. Структура и состав реакционных центров.

Реакционные центры /РЦ/ входят в состав фотосинтетических мембран бактерий и представляют собой пигмент-белковые комплексы, в которых происходит первичное разделение и стабилизация разделенных зарядов. Разработка методики препаративного выделения чистых РД, свободных от пигментов антенны и других компонентов фотосинтетического аппарата /11-13/, способствовала успехам в изучении первичных процессов фотосинтеза. К настоящему времени чистые РЦ выделены из многих видов фотосинтезирутощих бактерий /14/, но наибольшей простотой выделения и устойнивостью обладают РЦ, выделенные из бескаротиноидного штамма бактерий Rhodop-seudomonas sptaem'cUs и поэтому наиболее изучены.

Препараты реакционных центров, выделенных из хроматофоров, представляют собой пигмент-белковые комплексы с молекулярнойомассой 80*10 /15/. По данным электрофореза в полиакриламид-ном геле с додецилсульфатом натрия, в состав отдельного комплекса РЦ входят три гидрофобных белковых субъединицы - Н,М и L с молекулярной массой 28*10^, 24'10^ и 21-10^. Частицы М и L включают в себя 4 молекулы бактериофилла /Е*я/ и 2 молекулы бак-териофеофитина /Бф/, а также 1-2 молекулы убихинона и один атюм железа /13,16/,По данным электронной спектроскопии, комплексы реакционных центров Rips, s.pkaerotole'b при удалении детергента представляют собой палочковидные структуры размером 80 1 х 200 £ /13/.

Исследования с помощью поляризованного света показали, что РЦ имеют удлиненную форму и расположены в мембране примерно перпендикулярно плоскости мембраны /17/. В состав РЦ входят четыре молекулы Бхл, две из которых образуют димер - специальную пару, обозначаемую Р870 и тлеющую полосы поглощения при 870 нм /СЦ -переход/ и 605 нм /Qx -переход/. Две другие /Р800/ имеют полосы поглощения в полосах 760 нм и 535 нм /18,19/.

Данные по круговому дихроизму дают основание предполагать, что порфириновые кольца молекул пигментов входящих в состав РЦ, фиксированы параллельно друг другу или близки к этой ориентации /20/. Наличие в спектре кругового дихроизма РЦ двух полос противоположного знака- при 715 и 810 нм и положительной полосы с максимумом при 860 нм указывает на то, что молекулы пигментов находятся в сильном взаимодействии. Фотоокисление Р870 приводит к нарушению экситонного взаимодействия пигментов, что приводит к сильному изменению спектра кругового дихроизма /21/. В работе /20/ были предприняты попытки нахождения детальной конфигурации относительного расположения пигментов. Основываясь наспектрально-кинетических данных были рассчитаны расстояния межоду Р700 и Бф 6 А и Бф и первичным акцептором хинонной природы/q jA 7 а.

В последнее время был выполнен рентгеноструктурный анализ мембранных белковых комплексов РЦ из vriücüs и дана трехмерная модель РЦ /22/. В целом результаты /22/ подтверждают основные выводы о структуре и составе РЦ, полученные другими методами.

1.2. Последовательность фотохимических процессов переноса электрона в реакционном"центре.

Согласно современным представлениям в РЦ происходит преобразование энергии электронного возбуждения, возникшего в результате поглощения кванта света в энергию разделенных зарядов. Этот процесс осуществляется путем переноса электрона от фотовозбужденного бактериохлорофильного дилера Р870 на первичный стабильный акцептор ^ /первичный хинон/. Электрон от затем переносится на вторичный хинон ф £» а восстанавливается цито-хромом типа с.

Разработка лазерных спектрометров и спектрофлуориметров с пикосекундным временным разрешением позволила исследовать кинетику процесса фотовыцветания Р870 и последующего переноса электрона на р Оказалось, что перенос электрона происходит через ряд промежуточных состояний /19,23/. Кроме коротких времен, особенностью функционирования РЦ является независимость от температуры квантового выхода фотоокисления Р870, который достигает 100% и остается неизменным вплоть до I К/ 5/.

Первичный донор электрона. Существует ряд фактов, которые указывают на то, что Р870 является первичным донором электронов в РЦ. Окисление Р870 приводит к потере фотохимической активности РЦ /25/. После этого происходит окисление цитохрома, который отдает свой электрон на Р870+ /26/.

Освещение РЦ или химическое окисление приводит к выцветанию полос поглощения 870 нм и 600 нм, сдвигу полосы при 370 нм и появлению новых полос при 425 нм и 1245 нм /18/, наблюдается также сдвиг полосы 800 нм в коротковолновую сторону. Окислителнно-восстановительное титрование показало, что Р870 является одно-электронным переносчиком с окислительно-восстановительным потенциалом 4-50 мВ /27/.

Однеэлектронное окисление Р сопровождается появлением сигнала ЭПР с £-фактором 2,0026 /28/, имеющего гауссову форму, причем кинетика появления и затухания сигнала ЗПР совпадает с таковой, измеренной по оптическим абсорбционным изменениям /29/. Сигнал ЭПР катион-радикала Бхл ¿н \ritw имеет такой же ^-фактор, но ширина его линии/приблизительно в (2 больше, чем ширина сигнала ЭПР Р870+. Приведенные факты свидетельствуют о делокализациинеспаренного электрона по двум молекулам Бхл в Р870. Дополнительным подтверждением этому являются данные, полученные с помощью измерения спектров двойного электронно-ядерного резонанса. Было найдено, что величина сверхтонких расщеплений в спектре Р870+ в 2 раза меньше соответствующих величин для катион-радикала Бхл in viiro /30/.

Бремя жизни синглетного возбужденного сосояния Р870, рассчитанное из измерений квантового выхода флуоресценции изолирован-ныхРЦ согласно данным работы /31/, оказалось равным 7 пс. Близкие значения были получены путем прямого измерения времени жизни флуоресценции PIJ, с помощью пикосекундного флуорометра. Кинетика затухания флуоресценции препаратов с активным РЦ при комнатной температуре имеет две компоненты. Быстрый компонент тлеет длительность 5 + 2 пс и исчезает при окислении Р870 и характеризует время жизни Р870. Медленный - длительностью I - 2 не связан либо с флуоресценцией солюбилизированного бактериохлорофилла, либо с рекомбинационным свечением /4/.

Первичный акцептор электрона. Основным доказательством существования промежуточных акцепторов электрона послужил тот факт, что разделение зарядов происходит в том случае, когда акцептор электрона хинонной природы химически восстановлен. Действительно, с развитием лазерной пикосекундной техники в работах /32-35/,при возбуждении образца пикосекундным импульсом с длиной волныр530 нм было обнаружено новое состояние /Р /, которое включает в себя выцветание полос Бф при 545 нм и 760 нм и полис Бхл при 600 нм, 800 нм и 870 нм.

Нужно отметить, что возможность существования промежуточ-ныхакцепторов была предсказана в работе /36/ на основании анализа флуоресцентных данных по миграции энергии электронного возбуждения от Бхл антенны к реакционному центру. Было показано, что для обеспечения высокого квантового выхода разделения зарядови достаточно1 медленной их стабилизации, необходимо существование короткоживущих промежуточных стадий.

Последующие исследования с помощью пикосекундных абсорбционных спектрометров дали информацию о кинетике образования и дезактивации состояния РР в условиях, когда акцептор электрона О, £ не восстановлен. Как показано в работах / 32,37/, разделение зарядов в порфириновом комплексе РЦ происходит за время меньшее 10 пс, а образующееся в результате состояние Р живет в течение 150-240 пс и его исчезновение сопровождается переносом электрона на акцептор ^ /32,35,38,39/. При этом увеличение поглощения в полосе 1250 нм, возникающее вследствие окисления первичногордонора Р870, возникает одновременно с образованием состояния Р и затем сохраняется в течение десятков миллисекунд/34/.

Изучение природы промежуточного акцептора /I / проводилось с помощью анализа спектральных изменений как в пикосекундном диапазоне времен, так и¡стационарных услових. Последнее возможно благодаря тому, что длительное освещение реакционных центров ряда пурпурных бактерий в условиях низкого редокс. потенциала среды приводит к накоплению промежуточного акцептора I в восстановительном состоянии /40-42/.Если РЦ освещать в восстановительных условиях в присутствии донора электрона /низкопотенциальных цитохромов/, то перенос электрона может конкурировать с внутренними процессами, протекающими в РЦ. Поскольку состояние Р870 стабильно в течение многих минут, то происходит постепенное накопление такого состоянияРЩГ-» р*Г(Гр-» > Р{ еГЦит —» Цит+Индуцируемое светом накопление РЦ с восстановленным: промежуточным акцептором было получено впоследствие и для^>5. ^1лдеге(<1е*> при добавлении цитохрома с в сочетании с дитиони-том натрия /43/. Дифференциальный спектр фотовосстановления I характеризуется, переходными изменениями полосы Бхл при 800 нм и выцветанием полос Бф при 543 нм и 760 нм /41/. Эти данные, а также результаты работы /44/, в которой показано соответствиеРдифференциального спектра поглощения состояния Р и спектра образования ион-радикальной пары Р870+Бф"" показывают, что промежуточным акцептором электрона I является бактериофеофитин.

Результаты пикосекундной флуорометрии /55/, а также пикосе-кундной спектроскопии РЦ в состоянии Р870 1также не внесли ясность в представления о промежуточных переносчиках электрона. В условиях, когда Бф был заранее восстановлен, разделение зарядов с образованием -^[Р870+В] у бактерий. уппсЦб при возбуждении пикосекундннм импульсом света в работе /56/ не обнаружено. У К. \nvicUs в этих, условиях было зарегистрировано возбужденное состояние первичного донора с временем жизни 20 пс /57/, а у зарегестрировано не идентифицированное состояниеРЦ с временем жизни 340 пс /58/.

Акцепторы хинонной природы 6Ц и Си. В случае, когда не восстановлен, электрон с Бф за время 200 пс переходит на акцептор непорфириновой природы представляющий собой комплекс хинонаи железа, /19,59/. Изменения поглощения отражающие переход (^г—сопровождаются выцветанием полосы при 290 нм и появлением структурированной полосы в области 300-450 нм. Эти изменения сходны с абсорбционными изменениями при образовании анион-радикала хинона т \riiro /7/. Процесс восстановления сопровождается также сдвигами полос Бф, что указывает на пространственную.близость бактериофеофитина и первичного хинона /60/. В работе /61/ сделано предположение, что эти изменения отражают электрохромный сд&иг полос поглощения Бф в ответ на образование локального электрического поля при восстановлении хинона.

При низких температурах освещение РЦ приводит к появлению как узкого сигнала ЭПР Р870+, так и широкого сигнала 600 гаусс/ с ^ =1,82, которые имеют идентичные кинетики /62/. Так как появление широких сигналов ЭПР обычно связано с ионами металлов, естественно было приписать сигнал^ = 1,82 атому железа, присутствующему в РЦ. Однако, было обнаружено, что атш железа может быть замещен атомом марганца путем выращивания бактерий в среде, обогащенной марганцем. В этом случае кинетики ЭПР сигнала примерно одинаковы как для полосы Ре так и Мп; что указывает на функциональное замещение железа марганцем /63/.

В препаратах, лишенных железа, фотохимическая активность сохраняется, при этом регистрируется сигнал ЭПР убисемихинона с ^"-фактором 2,005 и дН = 8 Гс /64/. Была применена мессбауэров-ская спектроскопия для решения вопроса о валентности железа в исходном и восстановленном состоянии РЦ. С этой целью были выделены РЦ из бактерий, выращенных на среде с Было найдено, что при восстановлении РЦ дитионитом появляется сигналЭПР с ^ = 1,82, однако изомерный сдвиг и квадрупольное расщепление оставалисьмало измененными. Эти данные показали, что железо в реакционном центре сохраняет валентность независимо от того окислен | или восстановлен /65/.

Полная экст|*1кция убихинона приводит к потере фотохимической активности Щи к исчезновению ЭПР сигнала с £ -фактором 1,82. При добавлении убихинона происходит восстановление фотохимической активности РЦ и появление сигнала ЗПР /66/. Кроме того, удаление убихинона приводит к исчезновению, а добавление его к появлению быстрой кинетики с 200 пс переноса электрона от Бф* на ^/64/, Таким образом, из приведенных выше данных следует, что главная роль в акцептировании электрона в Щ бактерий принадлежит молекуле уби- или менахинона. Спектр ЭПР акцептора (^изменяется в результате магнитного, а не электронного взаимодействия с атомом железа /9/.

В изолированных РЦ величина для пары составляет- 50 мВ и не зависит от рН в диапазоне 6-9 /69/. Это указывает на то, что в изолированных препаратах РЦ Н+ не тлеет доступа к(з^ в масштабе времен равновесного титрования. Причины такого отличия препаратов РД от хроматофоров пока не ясны.

Если реакционные центры освещать в восстановительных условиях в присутствии донора электронов /цитохрома С/, то возможно двух-электронное восстановление При этом перенос электрона с Бф на происходит медленнее и составляет 10 мс. По всей видимости это вызвано влиянием электростатического поля, образуемого. Замедляется также скорость восстановления Бф в присутствии 70/. Температурная зависимость переноса электрона между Бф и имеет вид кривой, которая с понижением температуры вначале возрастает в 2-3 раза, а затем уменьшается в диапазоне температур 70 £ 4 К /71/.

Как известно, в бактериях окисленный Р870+ в течение 1-4 мкс восстанавливается мембранно-связанным цитохромом С. Было найдено /72/, что первая короткая вспышка света вызывает окисление Р870, а через короткий промежуток времени вторая вспышка света уже не вызывает окисления Р870. Происходит увеличение квантового выхода флуоресценции в 4 раза, т.е. так же как при восстановлении Было предложено, что это связано с тем, что после первой вспышки С^ восстанавливается до вызывая прекращение фотохимической реакции. Оказалось, что приувеличении временного промежутка между первой и второй вспышками, фотохимическая активность Р870 на вторую вспышку восстанавливается с ^^60 мкс в С. и-'члоъчщ'с.

Эта реакция температурно-зависимая с энергией активации 6,89 кДж/ моль /73/.

В хроматофорах Ц. ит^с^ кинетика восстановления фотохимической активности имеет ^у = б мкс /74/. Было предположено, что эта кинетика отражает перенос электрона на вторичный акцептор.

После экстракции убихинонов из хроматофоров с помощью петролейного эфира хроматофоры оказываются полностью неспособными к фотохимии на вторую вспышку света /75/. Однако, при добавлении чистого убихинона или витамина Kj, активность на вторую вспышку света восстанавливается. Другие искусственные хиноны, такие как манадиан или другие акцепторы электрона также способны восстанавливать активность на вторую вспышку света, при этом, время переноса электрона получается значительно больше.

Таким образом, было показано, что убихинон является вторичным акцептором электрона /QgA Перенос электрона с Qj на Qg ин-гибируется при добавлении о-фенантролина, нигерицина А и ряда хинолин-хинолинов с алкальными боковыми цепями /74,75/. Действиео-фенантролина может быть связано с образованием хелатного ком2+ га+плекса Fe однако измерение спектров эффекта Мессбауэра для гепоказало, что квадрупольное расщепление и сдвиг центра мало зависит как от состояния хинонов, так и присутствия о-фенантролина,что говорит о том, что хиноны и о-фенантролин не входят в первую•2+координационную сферу высокоспинового состояния Fe /65/.

В работе /64/ авторам удалось показать, что при удалениижелеза, переноса электрона от QT на Q? не происходит. Добавление 2+Fe приводит к восстановлению реакции переноса, что указывает на участие ге в переносе электрона между хинонами. Однако воз-„ действие, использованное для удаления железа, вызывает также диссоциацию белковых субъединиц РД /76/, что затрудняет интерпретацию роли иона железа в электронном транспорте.Qg так же как и Qj, в спектре ЭПР дает широкий сигнал с jf-фактором 1,82, свидетельствующий о взаимодействии с атомом железа. Для Qg этот сигнал более широкий, с большей температурной зависимостью и меньшей насыщаемостью /77/. Можно предполагать что атом ге расположен между Qj и Qg при большем сближении с С^шзывающем большее обменное взаимодействие между Fe и Qgчем 07 /78/.

Измерение статической магнитной восприимчивости ге в РЦ ^к&эдчкЛеь с окисленными и восстановленными хинонами показало /79/, Что магнитный момент Ре" во всех образцах составляет 5,35 ± 0Д5 магнетонов Бора и не зависит от восстановленности хинонов. Это означает, что ге не меняет свою валентность, что согласуетсяс результатами, полученными ранее.

2+Таким образом, атом ге находится в слабом магнитном обменном взаимодействии с и С^, что является причиной возникновения сигнала ЭПР с = 1,82, в. также способствует переносу электрона от на (^2» разделенных достаточно большим расстоянием, увеличивая перекрытие орбиталей (^7 и (¡б. Недавние исследования показали /80/, что при замене атома Ре на Ми в РЦ Rjps.sjtamicl.eis /при выращивании хроматофоров в среде, обогащенной Мп происходит замещение 58% атомов Ре на Мк /, не происходит каких-либо заметных изменений в кинетике переноса электрона в на (¡}г). Не наблюдается также изменение энергии активации переноса электрона.гЭто указывает на то, что незаполненные орбитали ге не принимают участия в процессе переноса электрона между хинонами, т.к. потенциал ионизации Мп На 24500 см"** больше,чем у а такая большая разница должна была бы привести к изменениям в кинетике переноса электрона.

Окислительно-восстановительное титрование показывает, что зависит от рН (-60 мВ/рН )/81/. Это означает, что на один электрон происходит присоединение одного протона. Как показано в работе /82/, связывание протона может происходить с помощью групп белка, имеющих рК, который сдвигается при образовании С^Спектральные измерения показали, что изменения поглощения в области полосы Бф 750 нм отличаются для образования и /83/. В этом случае можно найти такую точку в дифференциальномспектре, при которой можно регистрировать образование и исчезновение (¡}р Были измерены Д А полос 450 нм и 750 нм у РД ^лрЬлегок^ на одиночные вспышки света. Первая вспышйай света дает образование Р870+ и Катион-радикал Р870+ быстро восстанавливается от вторичного донора, а передавал электрон на с образованиемв течение 300 мкс при рН=7. Скорость переноса незначительно зависит от рН.

Таким образом, в качестве вторичного акцептора электрона в бактериальных РЦ функционирует также молекула убихинона, перенос электрона на которую от первичного хинона происходит при участии атомов железа и происходит за время 50-350 мкс у различных пурпурных бактерий.

1.3. Рекомбинация зарядов в радикальной паре реакционного центра.

Б фотосинтетических РЦ окисление фотоакивного пигмента Р /Р870, Р700, Р680/ сопровождается быстрым переносом электрона от* 4Р к I, в результате чего возникает радикальная пара Р I. Следующий этап переноса электрона от промежуточного акцептора I к первичному акцептору нехлорофильной природы /хиноны, железо-серные белки/ происходит за времена, существенно большие времени деления зарядов в РЦ / 200 пс /32-35,38,39/, в результате в РЦ возникает относительно долгоиивущее состояние Р+ /^10"^с/ /7,19,58,59/.Дальнейшие прямые реакции в ЕЛ, более медленные исвязаны с переносом электрона по ансамблю вторичных акцепторов.

В данной работе будет исследована наносекундная рекомбинация зарядов в фотосинтетических РЦ пурпурной бактерии Rips. $|*Ьде voiles и комплекс РЦ фотосистемы I зеленых растений. Поэтому, обзор литературы будет посвящен, главным образом, процессу реком-бинационного распада первичной радикальной пары /Р4!"/ соответствующих РЦ.

Рекомбинация зарядов в первичной радикальной паре РЦ фото-синтезирующих бактерий. Наносекундная рекомбинация в РЦ пурпурных бактерий возникает в условиях, когда первичный железо-хинон-ный комплекс Qj восстановлен в темноте до состояния Qj или вовсе удален из РЦ. При этом образовавшаяся радикальная пара Р+1 распадается за счет нескольких типов обратных рекций за 10-20 не /89,87/. Одновременно с ростом времени жизни РЦ наблюдается также 2х -3х-кратный рост интенсивности флуоресценции РЦ /89,90-92/,оа также регистрируется образование триплетного состояния /Р / / 50,87,93,94/, которое имеефреня жизни 10-100 мке и которое, по-видимому является смесью триплетного состояния Р /%>/ и триплетного состояния с переносом зарядов 50/.

Очевидно, уже исходя из первых опытов по регистрации нано-секундной рекомбинации в РЦ пурпурных бактерий, можно отметить три пути распада радикальной пары Р+1"/31,50,87- 96/:а/ рекомбинация с образованием синглетного возбудценногосостояния Р+1" —> Р*1; б/ образование основного синглетного состояния РД: Р+1-* Р1; в/ образование триплетного состояния РД или триплетногосостояния с переносом заряда. Первым указанием на то, что в восстановительных условиях /состояние Р1(^ / возможен обратный перенос электрона на Р+ с образованием Р* явились данные по увеличению квантового выхода флуоресценции РЦ /89,90-92/. Действительно, несмотря на то, что в присутствии дитионита и стационарном освещении не наблюдаются изменения поглощения Р870 /97,98/, разделение зарядов в РЦ происходит и в этом случае с высокой эффективностью /99/. Для объяснения роста выхода флуоресцуенции при восстановлении было предположено, что увеличение ее интенсивности связано с репо-популяцией Р за счет рекомбинации зарядов между Р+ и 1/19,41, 100/. К аналогичному выводу пришли и авторы /89/ при исследовании флуоресценции клеток пурпурных бактерий при низких редокс-потенциалах.

Если принять, что рост флуоресценции РЦ, хроматофоров и клеток при восстановлении первичного хинонного акцептора связан с рекомбинацией первичной радикальной пары Р+17 то, очевидно, должна проявляться температурная зависимость интенсивности дополнительной флуоресценции. Действительно, как показано в ряде ра*бот, например /89,100/, переход Р+1—р I связан с преодолением энергетического барьера, и, поэтому, с понижением температуры интенсивность дополнительной флуоресценции должна падать.

Очевидно, если рекомбинационная флуоресценция является одним из каналов дезактивации • первичной радикальной пары Р+1, ее кинетика должна совпадать с кинетикой распада Р+1. Уже в ранних работах по измерению длительности рекомбинационной флуоресценции Шуваловым и Климовым /41/ было установлено, что кинетика флуоресценции препаратов РЦ из С, U4v\osum содержит компонент с длительностью 6 не, амплитуда которого уменьшалась спонижением температуры. Авторы /41/ сопоставили этот компонентурекомбинационной наносекундной флуоресценции и изремпературной1 ф. рзависимости определили энергетический зазор между Р и Р равный 0,12 эВ. Компонент длительностью 2,5 -2,9 не был зарегистрирован в работах Годик и Борисова /91,103/ методом фозовой флу-орометрии в хроматофорах ряда пурпурных бактерий. Более тонкий анализ кинетики флуоресценции, выполненный в последующих работах этих же авторов /91,104,105/ показал, что в восстановительных условиях значительную долю флуоресценции хроматофоров составляет рекомбинационное свечение длительностью 4-6 не. Наконец, недавно Ван Бохов и др. /109/ обнаружили, что перемешая флуоресценция хроматофоров содержит два компонента длительностями 5 и 12 не, начальные амплитуда которых примерно одинаковы.

Еще раз подчеркнем, что замедленное свечение наносекундной длительности возникает при химическом восстановлении при фотохимическом восстановлении за счет переноса электрона от экзогенного донора и блокирования реакции окисления в анаэробных или аэробных условиях при добавлении о-фенантролина /104, 107,108/, при избирательной экстракции хинонов из хроматофоров или РЦ /26,42,96,108/. Наиболее полно различные вопросы, связанные с рекомбинационной люминесценцией в РЦ пурпурных бактерий рассмотрены в недавем обзоре Борисовым и др. /110/.

Очевидно, в восстановительных условиях одним из путей распада радикальной пары Р+1 должен быть переход РЦ в триплетное состояние /50,87-89,93-94/. Поэтому, исследование влияния магнитного поля на различные каналы дезактивации первичной радикальной пары должно стать вес>ъма информативным средством изучения прямых и обратных реакций в РЦ.Д^Ьтвительно, в отсутствии магнитного поля все триплетные подуровни вырождены, и в реакции -—> должны заселяться все подуровни. Приложение магнитного поля должно вызвать расщепление триплетных подуровней по энергии, таким образом, что заселяться будет лишь один подуровень, способный смешиваться с синглетным уровнем /51,96, 112-116/. При этом уменьшается выход образования триплетной радикальной пары и увеличивается выход флуоресценции /102,117/.

Исследование влияния магнитного поля на квантовйивыход образования ^показали, что при наложении магнитного поля I кГс выход % монотонно падает вдвое /115,119/. При наложении интеносивного магнитного поля / 50 кГс / выход Р возрастает до величины, равной выходу ^Р в нулевом магнитном поле /120/. Как уже отмечалось влияние слабого /до I кГ/ магнитного поля связано с расщеплением уровней Т TQ, Т и снятием вырождения /115,119/. Рост выхода ^P в сильном магнитном поле может быть следствием увеличения энергии Зеемановского взаимодействия /120/ двух радикальных пар, вследствие чего уровни Б и Т0в сильном магнитном поле приходят в равновесие до рекомбинации.

Фотосинтетический аппарат содержит определенный набор функционально детерминированных пигмент-белковых комплексов /ПБК/, роль которых- состоит в поглощении и переносе энергии возбуждения к реакционным центрам /РЦ/, в которых осуществляется разделение электрических зарядов. Энергия разделенных зарядов используется затем в последовательной цепи окислительно-восстановительных реакций, в результате которых образуются стабильные продукты фотосинтеза.

Основным пигментом зеленых растений является хлорофилл Дл/, который включен во все ПБК и участвует в поглощении и переносе энергии и делении зарядов в РЦ. В настоящее время первичные процессы фотосинтеза рассматривают на основе трехчастной модели Батлера /124/. Согласно этой модели пигментный аппарат высших растений и зеленых бактерий можно представить в виде трех основ- ¡-ных комплексов: светособирающего пигмент-белкового комплекса /ШСР/, комплекса фотосистемы */ПБК1/ и комплекса фотосистемы II /ПШП/. Последние два содержат соответствующие РЦ и собственные антенные хлорофилл-содержащие белки. Экспериментальное и теоретическое рассмотрение модели Батлера дано в обзорах /125, 126/.

В данной диссертации выполнено исследование переноса энергии, деления зарядов, переноса электрона и рекомбинации зарядов в ПБК и РЦ фотосистемы I. Поэтому в этом разделе будут рассмотрены структура и первичные реакции в ПБК фотосистемы I. 2.1. Структура комплекса ФС1.

В литературе имеется большое количество статей, описывающих процедуру выделения очищенных комплексов реакционных центров фотосистемы I, среди которых мы отметим лишь некоторые / 127-141/.

По данным /142/ ПЕК ШС1 представляет собой эллипсоид вращения с большой осью, параллельной плоскости тилакоидной мембраны. В комплексе обнаруживается несколько форм Хл а, различающихся положением максимума поглощения в красной области спектра. Различные методы выделения ПЕК ФС1 позволяют получить комплексы с отличающимся содержанием белков /130,143/ и пигментов / 134,135,137,144/. При гель электрофорезе обработанных детергентом ПЕК ФС1 проявляются шесть полос /I -У1/ отличающихся элек-трофоретической подвижностью. Молекулярные веса этих шести белковых субъединиц, составляющих полный комплекс ПЕК ШС1, в порядке увеличения нумерации составляют 70, 25, 20, 18, 16 и 8 бД, рис.1Субъединица I с молекулярным весом полипептида 70 кД содержит в своем составе хлорофилл и проявляет светоиндуцированные изменения поглощения, что свидетельствует о присутствии в этой субъединице первичного донора электрона Р700 и первичного акцептора Aj. С другой стороны, по данным ЭПР-спектроскопии субъединица I лишена Fe-6 центров / 145/. Отсутствие Fe- S центров приводит к тому, что этот препарат не окисляет пластоцианин, и не восстанавливает НАДФ после введения в реакционную среду необходимых компонентов. Возможно, что первая субъединица является полипептидным димером /146/.

По данным /130/ наиболее близко к субъединице I расположены субъединицы II и III, которые, в свою очередь, слабо ассоциированы друг с другом. Как считают Бенджис и Нельсон /130/, вторая субъединица к структуре комплекса не имеет прямого отношения, роль ее в первичном фотосинтезе не ясна. Третья субъединица с молекулярным весом 20 кД оказывает влияние на способность комплекса окислять пластоцианин. Так, в отсутствие субъединицы III в комплексе I вообще не происходит окисления пластоцианина /147/,однако введение в среду катионов способствует переносу электрона между пластоцианином и Р700.

Очевидно, основная функция субъединицы III заключается в понижении активационного барьера для переноса электрона между пластоцианином и Р700 / 148/.

Оставшиеся субъединицы 1У-УГ определяют способность ПБК I восстанавливать НАДФ в присутствии пластоцианина или искусственных доноров электронов. Эти субъединицы не содержат доноров электронов и хлорофилл / 144/, возможно, они являются местом локализации Fe-В центров. Отметим, что по данным низкотемпературоной спектроскопии ЭПР железо-серные центры А и В расположены на одной из трех белковых субъединиц /149/.

Как уже отмечалось, содержание пигментов в ПЕК ФС1 сильно зависит от способа выделения комплекса. Имеющиеся в настоящее время сведения о содержании хлорофилла в ®С1 и.§СП довольно сильно отличаются. Так, по данным Андерсон / 133/ ФС1 включает в себя 120 молекул Хл а, ФСП - 110 молекул Хл в и 170 молекул Хл а. В более поздей работе Мелиса и Андерсон /141/ показано, что Фй содержит 210 молекул хлорофилла, причем отношение Хл аДл в=б. Из этих 210 молекул хлорофилла 40 молекул Хл а включено в ядро РЦ комплекса ФС1, 140 молекул Хл а и 30 молекул Хл в образуют светособирающий Хл а/в белковый, комплекс. По данным этой же работы /141/ на долю ШСИ приходится около 330 молекул хлорофилла, из которых - 230 относятся к iCII, 100 - ФС1.

Антенна Фй представлена несколькими спектральными формами хлорофилла. В зависимости от степени очистки получают ПБК ФС1 с разным содержанием хлорофилла. Так, из комплекса ФС1, описанного в /141/, последующей обработкой можно получить функционально активные ПБК ФС1 с все болшим отношением Р700Дл а. Например, в работе /134/ описана процедура получения и спектральные характериетики ПБК ФС1, в которых количество молекул, приходящихся на один Щ, составляет 110, 65 и 40. Наиболее обогащенные реакционными центрами фрагменты получаются при обработке диэтиловым эфиром выделенных с помощью дитионита пигмент-белковых комплексов. Такие комплексы содержат 5-9 молекул антенного хлорофилла на Щ /150,151/.

Первичные и вторичные акцепторы электрона. Первичные электронные акцепторы ФС1 обнаружены и охарактеризованы в экспериментах с использованием дифференциальной спектрофотометрии /157/ и ЭПР спектроскопии /170/. Они были идентифицированы как Fe-S белковые центры /А,В/. Было обнаружено, что под действием красного света возникают абсорбционные изменения в спиральной области 430 нм. Предположено, что это результат фотохимической реакции, при которой Р700 передает электрон пигменту Р430. В отсутствии внешних доноров и акцепторов электрона Р700+ и Р430" имеют одинаковую кинетику затухания с Ъ. л 40 мсек /171/. Были проведеныЯподробные исследования поведения пигментов при добавлении в среду доноров и акцепторов электрона. В присутствии аскорбата ускоряется восстановление Р700 и замедляется окисление Р430. Добавление внешнего акцептора, напротив, приводит к стабилизации Р700+ и резкому окислению Р430. В результате различных экспериментальных условий были осуществлены и исследоващ реакции циклического потока электронов через внешний медиатор, а также нециклический поток электрона от внешнего донора к внешнему акцептору. Было найдено, что в отсутствие внешних доноров и акцепторов электрона наблюдаются рекомбинация Р700+ и Р43СГ /10/.

В результате окислительно- восстановительного титрования Р430 было установлено значение которое не зависело от изменения рН среды в пределах. 8-9,5 / 172/ и составляло - 530 мВ /173/. Установлено также /174,175/, что если препараты ЗЮ1 освещаются в присутствии акцептора электрона и замораживаются на свету, в спектре ЭПР при низких температурах остается только сигнал Р700+. Напротив, если адаптированные к темноте препараты замораживаются, то на свету при температуре 77 К обнаруживается сигнал ЭПР Р700+ и сигнал Р430"*. В дальнейших работах при использовании селективного возбуждения $С1 /176/, а также благодаря совершенствованию препаративных методик обогащения препаратов / 177,178/были найдены дальнейшие подтверждения тому, что первичными и вторичными акцепторами электрона в фотосистеме I являются железо-серные белки. Отметим, что в препаратах, обогащенных реакционными центрами ФОН и свободных. от РЦ ФС1, не наблюдаются абсорбционные и ЭПР изменения в полосе 430 нм, т.е. Ре- 3 центры связаны только с функционированием ФС1 /179/.

В работе /176/ авторы рассмотрели вопрос о взаимодействии акцепторов А и В в цепи переноса электрона. Стехиометрия продуктов световой реакции Р700+ и восстановленные формы А и В составляет 1:1.

Характер изменений спектров ЭПР указывает на тесное взаимодействие. Если центр А восстановлен, восстановление центра В приводит не только к появлению спектра ЭПР, характерного для В, но и к изменению спектра А. На основе этих наблюдений был сделан вывод /184/, что А и В вместе представляют собой 8Ре, 8Б кластер, включающий два близко расположенных 4 Ре 43 центра. Была, однако, обнаружена температурная зависимость ^-фактора центра В. При температуре 150-200 К наблюдается восстановление на свету обоих: центров, а при 25 К преимущественно происходит восстановление центра А. Если восстановить химически центры А, то светоиндуцирован-ное восстановление центров В не достигает количества восстановленных центров А /185/.. Таким образом, по совокупности экспериментальных фактов можно предположить, что А и В функционируют параллельно. Было высказано. предположение, что А передает электроны на НАДФ+, а В участвует в циклическом транспорте электронов. Б отсутствии периферических акцепторов и при низких, температурах в восстановленном состоянии накапливается вначале центр А. При понижении Е^ среды или увеличении потока электронов восстанавливается и центр В.

В различных лабораториях предпринимались усилия для обнаружения более раннего по отношению к Ре-Б центрам А и В акцептора электрона в РЦ §СП. Было показано, что при химическом восстановлении первичных акцепторов электрона А и В при комнатной температуре кинетика окисления Р700 становится обратимой /185, 186/. В работах. /185-187/ был обнаружет сигнал ЭПР нового электронного акцептора Аг> с & = 1,78, 1,88, 2,(38. При подкислении препарата ФС1 наблюдается высвобождение 10-12 атомов серы на реакционный центр /186/. Это позволяет предположить,что тоже представляет собой Ре-Б центр. Можно считать установленным, что перенос электрона с Аг> на А, В происходит быстрее, чем за 20 мкс. Окислительно-восстановительный потенциал центра определен в работе /172/. Было обнаружено 50% уменьшение фотоокисления Р700 при очень низком окислительно-восстановительном потенциале - 730мВ что может быть связано с восстановлением центра А^ Поскольку при низких, температурах наблюдается необратимый перенос электрона от Р700+ на акцепторы А и В, с ^<0,1 мсек, а восстановление Аг> не вызывает изменения в спектре ЭПР радикала Р700+, произвели оценку расстояния меящу А^ и Р700 и установили, что оно больше 1,5нм /175/.

Самый близкий /по временной последовательности событий/ акцептор был обнаружен при исследовании обратимого окисления Р700 в восстановительных условиях, при которых Аг>, А, В и все более периферические акцепторы электрона восстановлены /184/.

Б этих условиях было обнаружено обратимое светоиндуцирован-ное окисление как при комнатной температуре, так и при 5 К, что указывает на наличие акцептора Ар Действие вспышки света, кроме характерных для Р700 изменений сигнала ЭПР и оптического поглощения вызывает возникновение нового сгнала ЭПР при^= 2,00. Кроме того, в дифференциальном спектре поглощения возникают изменения, соответствующие восстановлению Хл а /172,188/. Это позволяет предположить, что А^ представляет собой Хл а, расположенный' вблизи специальной пары Р700.

Дополнительнымидоказательствами являются данные, полученные в работах /189,190/, проведенные на пигмент-белковых комплексах §С1 обработанных йЪ5/без акцепторов А и В/ по ревосстановлению первичного донора электрона. Полученные кинетикидА интерпретировались как перенос электрона от А| и А^ на Р700+.

С привлечением методов пикосекундной спктроскопии было установлено, что А^ получает электроны от Р700 за время около 10 пс после световой вспышки /191/.

На основе данных об акцепторах фотосистемы I и результатах исследования белковых компонентов ФС1 /184/ предложена синтетическая модель структуры реакционного центра фотосистемы I. Эта модель представлена на рис Л.

Ряс.1Синтеиаческая модель структуры РЦ ФС I. I -VI белковые компоненты с молекулярными весами 70, 25, 20, 18, 16, 8 кило/далъюн соогвегсгвено, Р700-фогоакшавный пигменз? РЦ, А^, А2, А, В-акцепгоры электрона.

Глава 2. МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЙ И ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОБРАЗЦОВК основным особенностям импульсных лазерных абсорбционных спектрометров пикосекундного диапазона следует отнести: 1. Сложность упавления прибором; 2. Большие флуктуации энергии, длительности и пространственной формы импульсов света и 3. Сложную зависимость между регистрируемой в эксперименте информацией и интересующими исследователя параметрами. Поэтому эффективное применение такой аппаратуры для исследования фотобиологических и фотохимических реакций требует решения задачи оперативного, простого и гибкого управления установкой: предварительного отбора сигналов, удовлетворяющих определенным заранее требованиям накопления, статистической обработки, восстановления и последующего математического анализа информации с целью получения достоверных: количественных данных, характеризующих исследуемый процесс. Комплексное решение этих, вопросов возможно только в автоматизированных системах на основе органического сочетания в единое целое средств автоматизации, вычислительной техники и аппаратуры импульсной спектроскопии.'Функциональная схема установки приведена на рис.2. Основными блоками установки являются: задающий генератор пикосекундных импульсов, усилительные каскады, преобразователи частоты света несколько каналов регистрации, комплекс автоматизированного управления и обработки экспериментальных данных.§ I. Лазерный стенд для получения перестраиваемых по частоте пикосекундных. импульсов света.

1.1. Генератор пикосекундных импульсов.

В настоящее время при изучении быстропротекающих процессовшироко применяются лазерные пикосекундные источники света, вчастности, твердотельные. Основной особенностью генераторов сРис.2Схема лазерной части установким1-активные элементы из ,2-зеркала резонатора,3-стекл. пластинка, 4-кювета с красителем, 5-электро-оптический модулятор МЛ-102, 6-призмы Глана-Тейлора, 7-схема выделения одиночного импульса, 8-простран-ственые фильтры, 9-генератор второй гармоники, Ю-пикосекундный параметрический генератор света, П-кювета с Ь^О, 12-светофильтры.твердотельными элементами является высокая интенсивность выходных импульсов света, что позволяет применят их в качестве источников накачки преобразователей частоты света, для которых необходимо возбуждение мощными импульсами. Наибольшее распространение получили генераторы на кристалле иттрий-алюминиевого граната, активированного неодимом ДА& : М/205-206/, и генераторы на фосфатном стекле с МА с пассивной синхронизацией мод /207/.

Иттрий-алюминиевой гранат имеет более высокую теплопроводность по сравнению со стеклянной матрицей, что позволяет работать генераторам с более высокой частотой повторения. Кроме того, кристаллы УА6- : обеспечивают больший, чем в неодимовои стекле коэффициент усиления. Это дает возможность использовать меньшее число каскадов усиления для получения заданной энергии импульсов света. Спектральная ширина активного перехода ионовв матрице УА& ограничивает длительность импульсов генератора на уровне 20 - 25 пс, в то время как для фосфатного стекла -5 - 7 пс. Большая длительность импульсов генерации УА& : лазера с одной стороны уменьшает вероятность возникновения нелинейных эффектов в процессе генерации и усиления импульсов света, что в свою очередь, увеличивает стабильность и пространственную структуру импульсов, с другой - уменьшает временное разрешение пикосекундных спектров.

Таким образом, модно построить генератор на УАС : свысокой стабильностью параметров импульса, работающий с частотой повторения до 10 Гц, выдающий импульса света длительностью 25 пс. Такой генератор может обеспечить измерение малых изменений поглощения и дает возможность усреднения большого числа результатов измерений.

Можно отметить также, что в последние годы появились активные элементы из фосфатного стекла, в котором концентрация ионов (Й3"1" достигает болших значений /.197/. Лазера на таких элементах приближаются по своим параметрам /усиление, частота повторения/ к лазерам на УА& но имеют меныщпо длительность генерируемых импульсов света 2-3 пс. Однако, такие элементы пока еще мало доступны.

Для пикосекундного абсорбционного спектрометра был построен генератор на активном элементе УА& : МА^4", работающий в режиме самосинхронизации мод /.210/. Такой режим достигался путем помещения в резонатор нелинейного сомопросветляющегося красителя. В нашем генераторе применялись растворы красителя 3955 в изобути-ловом спирте или же краситель 3274у в этаноле. Повышение вероятности самосинхронизации мод может быть достигнуто путем осуществления двухпорогового режима генерации /198/. Такой режим получается при совмещении во времени моментов просветления красителя и насыщения активной среды. В этом случае вначале возникает свободная генерация, а черезмкс цуг пикосекундных импульсов. Таким образом, вероятность повышения синхронизации мод происходит за счет того, что дискриминация по амплитуде флуктуационных импульсов производится в течение100 проходов по резонатору до формирования цуга. Для реализации двухпорогового режима авторы /198/в резонатор между активным стержнем и кюветой с красителем помещали 2-х кратный телескоп. Однако оказывается /211/, что в генераторе на кристалле УА6 за счет высокого коэффициента усиления активной среды, может быть достигнут двухпороговый режим генерации путем экспериментального подбора геометрии резонатора, начального пропускания красителя и коэффициента отражения переднего зеркала. Так, в нашем случае перояяность полной синхронизации мод составляла примерно 95% для обоих красителей, однако ресурс работы генератора на красителе 3274у был в 3-5 разкбольше и составлял5•10й вспышек.

Резонатор лазера длиной 1,3 м образован двумя плоскими диэлектрическими зеркалами с коэффициентом отражения 99,8% и 10%, напыленные на клиновидную подложку. В контакте с "глухим" зеркалом находится кювета толщиной 0,3 мм, через которую при помощи насоса перистальтического типа прокачивается раствор самопросветляющегося кравителя со скоростью 8 см/с. В качестве активного3+ ■ элемента используется кристалл УА6 размером ф 5 х 60 мм. Для поляризации излучения лазера в определенном направлении в резонатор под углом Врюстера помещается клиновидная подложка. Для подавления высших поперечных мод используется диафрагма 0 Змм, Все элементы лазера крепятся на инваровых стержнях, что обеспечивает высокую стабильность характеристик излучения. Блок питания импульсной лампы ИСП-2500 и система охлаждения лазерной головки позволяет работать с частотой вспышек до 5 Гц.

Энергия излучения генератора определялась с помощью лазерного дозиметра ШЩ-2 и составляла на выходе 10 мДж. Выходное излучение представляет собой последовательность из 7-9 импульсов света длительностью 25-30 пс, интервал между которыми около 9 не. Временные параметры выходного излучения регистрировались с помощью фотохронографа "Агат-СФ" /199/.

1.2. Выделение одиночного импульса света и его усиление.

Для нормальной работы абсорбционного спектрометра требуются одиночные пикосекундные импульса, выделенные из цуга импульсов генератора. Как правило, такое выделение осуществляется с помощью электрооптического затвора на кристаллах КДР и ДКДР, работающего на основе эффекта Поккельсе /200/. К достоинствам такого затвора следует отнести отсутствие зависимости электрооптического эффекта от длины кристалла, малую электрическую емкость. К недостаткам - большую величину полуволнового напряжения^б кВ дляДКДР и20 кВ - для КДР, что налагает серьезные требования на генераторы управляющих: электрических импульсов с одной стороны, с другой - очень трудно преодолеть электромагнитные помехи генератора.

В нашей установке применен электрооптический затвор типа МЛ-102, работающий на основе поперечного эффекта Поккельса. В нем используются две пары кристаллов ДКДР /201/. Низкое значение полуволнового напряжения /380 В для волны 1064 нм/ явилось основной причиной выбора такого модулятора при построении системы выделения одиночного пикосекундного светового импульса.

Схема формирования электрического импульса, управляющего модулятором, приведена на рис. 3. Запускающий импульс с фотоэлемента ФЭК-19 подается на формирователь импульса, выполненного на транзисторе Т|, далее импульс подается на усилитель-ограничитель, выполненный на лампе со вторичной эмиссией Лр Импульс, длительностью 6 не и фронтом нарастания и спадал/1,5 не, подается через регулируемую линию задержки на вход модулятора и далее на согласованную нагрузку. Путем регулирования амплитуды импульса и его задержки можно добиться надежного выделения одиночного пикосекундного импульса с контрастом более 100.

1.3. Получение перестраиваемых по частоте импульсов света спомощью ПГС и генерации континуума.

Абсорбционный спектрометр должен иметь перестраиваемые в исследуемой части спектра источники возбуждения и зондирования, причем энергия возбуждающего импульса света должна быль достаточной для наведения регистрируемого изменения поглощения. Хорошими характеристиками обладает параметрический генератор света /ПГС/ бегущей волны, выполненный по двухкристалльной схеме /194, 202/. Такой генератор представляет собой два нелинейных кристалла, перестройка частоты достигается поворотом кристаллов на некоторый угол. В первом, излучением накачки с Т\ = 532 нм, возбуждается широкополосная параметрическая сверхлюминесценция, которая поступает на второй кристалл г параметрический усилитель, в котором осуществяется режим сильного энергообмена. В работе /203/ показано, что наиболее подходящими для такой схемы являются кристаллы КДР, обладающие высоким порогом оптического разрушения /в пикосекундном диапазоне 70-100 Гвт/см^/, отсутствием накопления разрушений, а так же малым сечением двухфотонного поглощения и вынужденного комбинационного рассеяния /ВКР/. В ПГС на кристаллах КДР может быть достигнута энергетическая эффективность более 50%.

Для достижения высокого коэффициента преобразования в двух-кристальной схеме необходимо правильно подобрать интенсивности накачки и сигнала на входе второго кристалла /усилителя/. Это достигается подбором расстояния между кристаллами и фокусом положительной линзы, расположенной перед первым кристаллом. Линза должна быть цилиндрической, что позволяет устранить диафрагменныйи алертурный эффекты: и осуществить параметрическое взаимодействие по всей длине кристалла. Такие генераторы дают на выходе энергию до 3 мДж, что достаточно для неведения необходимого для измерения поглощения образца.

Само изменение поглощения регистрируется по поглощению другого пикосекундного импульса, который должен иметь достаточно малую энер: ию, чтобы не производить существенных изменений оптической плотности в образце, но достаточную для регистрации фотоприемником.

Наиболее распространенный способ получения зондирующего импульса основан на явлении исключительно большого спктрального уширения интенсивных, импульсов - генерации пикосекундного континуума - в широком классе веществ, в том числе в тяжелой воде, спирте. Считается, что этот эффект связан с фазовой самомодуляцией лазерного импульса в нелинейной среде /204/, однако, существуют и другие предположения о механизме генерации пикосекундного континуума.

Для получения континуума необходимы импульсы длиной волны 1064 нм и имеющие энергию 5 мДж, для накачки параметрического генератора - импульсы второй гармоники 532 нм, энергией 15-30 мДж. К настоящему времени достигнут значительный пргресс в реализации высоких: коэффициентов преобразования основного излучения во вторую гармонику /205/, В описываемой установке удвоение частоты основного излучения производилось в кристалле КДР /длиной I см/, энергетический коэффициент преобразования во вторую гармонику достигает 50%.

2.1. Оптическая схема регистрирующей части и фотоприемники.

На рис. б представлена оптическая схема измерения светоин-дуцированных измерений поглощения в исследуемом образце.

В установке происходит сравнение интенсивности пробного импульса, прошедшего через невозмущенную облась образца и импульса сравнения прошедшего через образец в месте облучения возбуждающим светом. Для получения пробного импульса и импульса сравнения зондирующий импульс диаметром 0,7 мм делится светоделительным зеркалом на два примерно одинаковой, интенсивности, один из которых пересекает в образце толщиной I мм облазь действия возбуждающего пучка диаметром 2 мм.

В нашей установке, в ©тличие от описываемых в работах /195, 203,206/ в зондирующем канале используются две оптические линии задержки. Одна - для пикосекундных измерений, обеспечивающая временную задержку между возбуждающим и зондирующим импульсами до 2 не. Управление этой линией задержки производится с помощью шагового двигателя с точностью установки времени задержки + 0,5 пс. Вторая дает временную задержку до 15 не и используется при исследовании наносекундных процессов. Применение большой линии задержки налагает жесткие условия на качество юстировки. Кнтроль за юстировкой осуществлялся путем пропускания зондирующего пучка после линии задержки через две диафрагмы диаметром 1,5 мм и от стающие друг от друга на 0,5 м.

Зондирующее и опорное излучения после прохождения кюветы с исследуемым образцом подавалось на входную щель монохроматора.

В установке используется дифракционный монохроматор ВДР-4 с реошеткой 600 штрихов/мм, линейной дисперсией 26 А/мм, фокусным расстоянием 0,6 м и относительным отверстием 1:8. Управление моРис.б. Схема регистрации. ЛЗ I, ЛЗ 2 - линии задержки, К - кювета с образцом, МДР-4 - монохроматор, ФД МД 3 - фотодиоды,ИК- интерференционный клин.нохроматором осуществляется шаговым двигателем.

Излучение, выделенное монохроматором, регистрируется двумя фотоприемниками. В качестве фотоприемников были выбраны фотодиоды; они более линейны, имеют больший по сравнению с ФЭУ динамический диапазон и достаточно чувствительны для регистрации интенсивности зондирующего и опорного пучков.

Кремниевые фотодиоды типа ФД 24 КП или §Д 21 КП, чувствительные в области 450-1200 нм, использовались в паре с операционным усилителем /207/, принципиальная схема которого приведена на рис. 5. В этой схеме операционный усилитель представляет собой усилитель тока, который преобразует малый входной ток в напряжение. При измерении малых токов обычным способом, т.е. фотодиод нагружен на сопротивление, это сопротивление должно быть достаточно большим, что предполагает высокое сопротивление измерительной аппаратуры. А это, в свою очередь, увеличивает инерционность измерительной цепи и ограничивает нижний предел измеряемых токов, т.е. чувствительность.

В схеме усилителя тока на операционном усилителе сопротивление нагрузки для источника тока /фотодиода/ почти равно нулю, т.к. эквивалентное входное сопротивление представляет собой параллельное соединение сопротивлений ^ и К/к, где Я - сопротивление обратной связи, К - коэффициент усиления. В нашей схеме К^ + К/К*20 ом. Таким образом, использование низкоомной нагрузки позволяет увеличить быстродействие фотодиода, т.к. исключает влияние его емкости, повышается также линейность световой характеристики и его чувствительность.

2.2. Аппаратурное обеспечение системы регистрации и управления спектрометром.

Система регистрации и управления спектрометром предназначена для сбора информации с датчиков, управления работой шаговых двигателей, предварительной математической обработки данных ивыхода промежуточных результатов на графический и цифровой дисплей, накопления информации, расчета ошибки измерения. С ее помощью производится окончательная обработка результатов и выдача их на средства отображения и документирования, а также для постоянного контроля за параметрами излучения лазерного стенда.

Нами выбрана в качестве базовой микро-ЭВМ "Электроника-бОМ", которая имеет ряд преимуществ по сравнению с "Электроникой ДЗ-28", применявшейся в работе /206/. "Электроника-бОМ" имеет модульный, принцигг построения, т.е. все функциональные блоки ЭВМ выполнены в виде конструктивно законченных, устройств /модулей/, связь между которыми осуществляется через единый канал обмена информацией. Это дает возможность самому определить необходимую конфигурацию системы в зависимости от конкретных требований к ЭВМ, возникающих в процессе конструирования и отладки системы регистрации. Кроме того к каналу ЭВМ легко подключать различные периферийные устройства, в случае необходимости увеличить оперативную и постоянную память ЭВМ путем подключения соответствующих дополнительных модулей и т.д.

В нашей установке микро-ЭВМ сопряжена с набором модулей, выполненных в стандарте системы КАМАК. Этот стандарт широко распространен как в нашей стране, так и за рубежом. Он включает в себя широкий набор уже разработанных функциональных и управляющих различными приводными устройствами модулей / рис. 7 /.

Таким образом, автоматизированная система сбора информации и управления лазерным стендом включает в себя штатный комплекс ЭВМ с расширенной до 56 Кбайт оперативной памятью и снабженный накопителем на гибких: магнитных дисках PIX - 45, который подключен по каналу ЭШ с помощью специального контроллера. Через канал ЭВМ подключен также алфавитно-цифровой дисплей VDT-52I00 и цветной графический дисплей /на базе телевизионного приемникаЩ1 т ^ДЗ й>Д4 ФД5Рис.7Структурная схема автоматизированной системы сбора информации и управления лазерным стендом. ФД1-ФД5 - фотодиоды, ШД1-ШДЗ - шаговые двигатели."Электроника Ц-40Г'/. В качестве графопосителя использован двух-координатный самописец НЗОб /через модуль КАМАК 2ЦАП10/. Прием и преобразование информации с фотодатчиков ФД1-ЗЩ5 осуществляется посредством модулей "Каммутатор" и АЦП-712. Управление устройством выбора необходимого спектрального интервала зондирующего света и оптической линией задержки в зондирующем канале обеспечивается модулями МУИЗД1 - МУНЩЗ, включение и выключение шторки в канале возбуждения происходит с помощью "Релейного драйвера". С крейтом КАМАК ЭВМ соединена через крейт контроллер "Электроника 60". 2.3. Програмное обеспечение.

В основу развития програмного обеспечения положен модульный принцип. Функционально законченным режимам работы системы соответствуют программные модули, вызываемые к действию нажатием определенных клавиш на алфавитно-цифровом дисплее /рис.8/. Единая система для проведения конкретных экспериментов формируется с помощью организующей программы. Операционная система РАФОС, язык програмирования Фортран /при отладке работы установки также использовался язык (}1/А51С/ программные модули, обслуживающие КАМАК, оборудование написаны на Макроассемблере и имеют развитую систему приоритетов, связанную со спецификой конкретного вида эксперимента. При развитии прграммного обеспечения особое внимание уделено средствам диалога.

При включении системы автоматически с гибкого диска происходит загрузка в оперативную памятьЭВМ операционной системы РАФОС, вызов управляющей прграммы и отображение на экране алфавитно-цифрового дисплея таблицы режимов, включающей запись информации управления установкой, математический анализ данных, вывод информации на внешние устройства.

Математическое обеспечение включает базовый набор программ: цифровой фильтрации /сглаживание/ экспериментальных данных, предварительной оценки по определенным критериям значимости полученной информации, восстановления сигнала, интегрировния, дифференцирования^ анализа кинетики переходных процессов для случая, когда исследуемый процесс может быть представлен суммой экспонент, разложение спектра на сумму гауссовых компонент.

Процесс регистрации экспериментальных данных начинается с диалога эксперимента?с управляющей ЭВМ, Работа программы управления начинается с введения исходных показаний монохроматора, интерференционного клина и линии задержки, а также значений этих параметров определяемых, начальными условиями эксперимента.

Вследствие нестабильности генерации пикосекундных импульсов по энергии, временной и пространственной структуре, в установке осуществляется селективный отбор импульсов возбуждения и зондирования. Для определения обласи допустимого оптимального отклонения энергии возбуждающего и зондирующего импульсов от определенной средней величины в начале каждого эксперимента снимаются гистограммы их. распределения. Вследствие критичности генерации континуума к мощности и форме возбуждающего импульса, подобный, отбор позволяет уменьшить также вариации в спектре зондирующего импульса. Селекция возбуждающего импульса позволяет избежать ошибок, связанных, с тем, что наведенное поглощение может не линей.' но зависеть от интенсивности возбуждающего света. Однако даже такая селекция не позволяет полностью избежать статистической погрешности в определении оптической плотности /Л А/. Для исследования гистограммы выводятся на графический дисплей, а также при необходимости, на графопостроитель. С целью текущего контроля программой предусмотрена возможносте получения этих гистограмм и в ходе измерения. Кроме того, для экспериментатора предусмотрена возможность отказа от блока программ измерения гистограмм.

С учетом данных гистограмм экспериментатор вносит в качестве параметров нидный и верхный пределы используемой энергии возбуждающего импульса и импульса опорного сигнала канала зондирования,рис.8.

После этого устанавливается тип измеряемой величины: измерения оптической плотностидА, либо исследования спектра континуума. В первом случае оператор вводит с клавиатуры согласно блок-схемы переменную ЛV\/ = I, а во втором -3W-0, рис.8.

Далее устанавливается характер экспериментальных исследований -кинетики образования и распада наведенного поглощения на определеной длине волны, либо спектр наведенного поглощения при заданной величине оптической задержки. Для этого в первом случае оператор вводит параметр 1$S = 0, во втором -ISS= I. Введение параметра ISS = 0 сопровождается введением с клавиатуры шага приращения по оси времени в пикосекундах, а в случае ISS = I по оси длин волн в нанометрах. При этом следует также задать ориентировочные границы измерения этих величин для вывода на графический дисплей.

2.4. Исследование статистических характеристик пикосекундной лазерной установки.

Особенностью работы пикосекундных твердотельных лазерных систем являются значительные флуктуации параметров выходного излучения /энергии, длительность импульса, нееднородность профиля интенсивности поперечного сечения пучка/ /208/. Для исследования статистических характеристик различных параметров пикосекундных импульсов света была разработана программа, обеспечивающая получение гистограмм /статистическое распределение по энергии определенного числа импульсов света, т.е. амплитудный анализ/ одновременно от нескольких фотоприемников. На экран графического дисплея выдается гистограмма требуемого фотоприемника, причем одновременно выводятся числовые значения средней энергии Е, дисПерсии и коэффициента вариации А = ==-.£На рис.9 приведены графики статистического распределения по энергии 500 импульсов основного излучения с = 1064 нм после задающего генератора с энергией ^ I ьДж и после усиления с энергией ^ 30 мДж. Видно, что после усиления импульсов света относительная флуктуация практически не возрасла, что указывает на незначительный уровень нелинейных процессов во время усиления или их отсутствие. Третья гистограмма снята при плохой поперечной структуре пучка в отсутствии пространственных фильтров, в этом случае флуктуация энергии значительно увеличивается.

На рис.10 приведены графики статистического распределения энергии импульсов второй гармоники и пикосекундного континуума света. Как видно из рисунка, флуктуации энергии второй гармоники и континуума возросли по сравнению с флуктуациями генератора. По всей видимости это является следствием того, что указанные процессы преобразования спектра излучения накачки основаны на нелинейных оптических эффектах.

Таким образом, можно отметить, что разработанная методика накопления и обработки статистических данных с помощью амплитудного анализа позволяет получать и контролировать в процессе экспе римента значения флуктуацианных параметров. Это дает возможность эффективно использовать микро-ЭВМ в процессе настройки лазерного стенда, а также осуществлять постоянный контроль за параметрами используемых импульсов света в процессе эксплуатации установки. / рис.10а /.

ЭнергияРис. 9Статистическое распределение лазерных импульсов по энергии. А-задшощего генератора, Б-после усиления, В-в отсуствии пространственных фильтров.Н302010ОА.¡Узу1ккЭнергияРис.ЮСтатистическое распределение лазерных импульсов по энергии. А-второй гармоники, Б-пикосекундного континуумаЭнергияРис,10аСтатистическое распределение лазерных импульсов по энергий с предварительно заданными "ворога". А-вгорой гармоники, Б-пикосекундного континуума.§ 3. Методика спектрально-кинетических, измерений и обработки результатов.

Основным параметром, определяемым в процессе исследований на абсорбционном импульсном спектрометре, является изменение оптической плотности Д А изучаемого образца под воздействием возбуждающего излучения. В нашей схеме регистрации /рис.6/ измерялось изменение сигнала от зондирующего пучка Ц|. Поскольку интенсивность зондирующего пучка нестабильна от выстрела к выстрелу, удобно использовать опорный пучок. Отношение сигнала опорного пучка Ц2 к Ц.^ будет давать постоянную величину в пределах ошибки регистрации в отсутствие возбуждающего импульса. Для привязки к нулевому уровню используется схема регистрации от двух лазерных вспышек - с возбуждающим и без возбуждающего импульса.

Рассмотрим, какие параметры определяют временное разрешение и точность измерения при такой схеме регистрации. В нашем случае фотоприемниками являются фотодиоды типа ЩЦ24К, ФД21К и др., время отклика которых намного больше длительности световых импульсов. Следовательно, на выходе фотодиодов мы имеем электрический сигнал, пропорциональный энергии измеряемых импульсов света. Временная развертка в данном случае осуществляется изменением регулируемой оптической задержки между возбуждающим и зондирующим импульсами. Обычно время эксперимента часто ограничено, поэтому возникает вопрос, какой необходимо выбрать интервал между двумя последующими точками измерения д£ чтобы измерить зависимость и.1 С"^) с наиболее высокой точностью при заданном времени измерения.

Относительное изменение длительности светового импульса можно контролировать используя нелинейно-оптический эффект генерации второй гармоники. Если пренебречь обратной реакцией второй гармоники на накачку, интенсивность второй гармоники будет определяться следующим выражением /215/: д1с£/2/где, í - длина кристалла, ¿Кг-К^-Ях^ - фазовая расстройка.

Если величина л ¿о о. (л к £К! ( 2*1); си ¿?Ф ? ) I/7*сЗ— /3/не изменяется от вспышки к вспышке, то отношение всегда будет постоянно. Поэтому подставляя Е - сК1^)^ где Ь -длительность импульса света, а Ее0 - измеряемая фотоприемником величина, получим: 1/4/Из выражения /4/ видно, что относительное изменение длительности лазерного импульса Ь в серии вспышек, можно контролировать измеряя изменение величины Е^) > что легко осуществить.

Стабильность величины N в случае пикосекундных импульсов будет определяться, в основном, величиной флуктуаций распределения интенсивности в поперечном сечении пучка поскольку для различных компонент углового спектра пучка условия синхронизма различны. Эти флуктуации можно свести к минимуму для•одномодового пучка. Необходимо также, чтобы спектральная ширина пикосекундных: импульсов была меньше ширины фазового синхроизма генератора второй гармоники. Это условие выполняется для кристалла КДР.

Как показано в /215/гл 0,44 Ъ1 Когде о и - угловая ширина фазового синхроизма. Для кристалла КДР<>б-рад.ом, £и поскольку, оптимальная длина кристалла КДР для генерации второй гармоники мала I см/, то £9 достаточно широка.

Таким образом, вышеизложенная методика позволяет контролировать и вводить отбор по длительности возбуждающего импульса, что особенно эффективно приисследовании процессов, сравнимых по длительности с возбуждающим импульсом.

В общем случае измеряемая величина энергии зондирующего импульса будет определяться выражением:1 СПЫГ-тг /б/^ -<юРассмотрим случай быстрой релаксации наведенного изменения пропускания образца Т(Ч). В предельном случае можно представить, что фи) =8- функция Дирака, тогдаТ(*) будет определяться длительностью и формой возбуждающего импульса, и зависеть от внутренних параметров образца, а для регистрируемой энергии зондирующего импульса Цможно записать:Как показано в работе /209/ в этом случае ошибка, возникающая за счет дискретизации IX\ будет иметь вид:/8/где - среднеквадратичная интегральная ошибка, - временной интервал, определяемый последовательными отсчетами линии задержки; К - полуширина на полувысоте функции.

Показано также, что величина ошибки слабо зависит от формы импульса света, Определяющей параметр А. В случае же, когда функция отклика образца имеет конечную длительность, ошибка уменьшается.

1 ■ ■■■^ Г <Г / Mfr \Ч/12/опт mau,* \ tТаким образом, из /12/ можно подсчитать оптимальное число накоплений, величина А зависит от формы импульса, и для гауссова профиля равна 0,025. Расчеты показывают, что увеличение N свыше 70 не дает ощутимого увеличения точности, хотя существенно увеличивает время эксперимента.

Экспериментально определение А А проводилось при последовательном измерении значения оптической плотности в присутствии и отсутствии возбуждающего света. При этом изменения оптической плотности вычислялось по формуле:аДЛоА-С- /13/где U и U - средние показания фотодиодов за N вспышек в канале зондирующего /I/ и опорного /2/ сигналов в отсутствии возбуждающего импульса, а U2 и U^ - при наличии импульса возбуждения.

Данный блок программы работает до тех пор пока достигнутое значение ошибки не станет меньше заданной точности или число накоплений не превысит значения, равного 70. В случае превышения этого числа накоплений имеется возможность после вывода данной точки на графический дисплей произвести повторное измерение в этой точке.

По окончании измерения в данной точке полученное значение Л А выводится на графический дисплей, а показания счетчика числа экспериментальных точек увеличивается на единицу. При этом оптическая линия задержки сдвигается на один заданный интервал. Измерение экспериментальных точек производится до тех пор, пока значение счетчика числа экспериментальных точек - I не станет больше заданного числа точек .

Процедура измерения спектров изменения оптической плотности при фиксированной оптической задержке отличается от описанной выше процедуры снятия оптической кривой тем, что в этом случае не производится селекции опорного сигнала канала зондирования из-за спектральной неравномерности интенсивности континуума.

Кроме того, вместо изменения линии задержки, в данном случае при достижении необходимой точности на определенной длине волны по программе на необходимый интервал поворачивается решетка мо-нохроматора. Измерение интенсивности производится по формуле:с ^где г - интенсивность линии спектора континуума, и1 - среднее значение энергии спектральной линии континуума, й2 - среднее значение полной энергии по всему спектру континуума.

Следует отметить, что система отбирает приблизительно одну лазерную вспышку из трех, что создает возможность получать кинетическую или спектральную зависимость за время 10-15 минут при обычной частоте работы установки ^ 2 Гц.§ 4. Методика приготовления образцов.

В опитах исследовались реакционные центры Я|р<=>. ¿ркаегснЛез содержащие и не содержащие хинонные акцепторы, а также пигмент-белковые комплексы §С1 с различным обогащением антенным хлорофиллом. Кроме того, в отдельных, случаях использовали комплексы §С1, не содержащие железо-серных центров.

Реакционные центры пурпурных бактерий 1^$. -9.ркаегоСо(е$ были выделены ст.н.с. кафедры биофизики Захаровой Н.И.Х по следующей методике.

Для удаления хинонов образец РЦ переводился диализом в 10 МоТрис-НСЬ буфер, рН=8,0, к препарату добавляли 10 М о-фенантро-лина, содержащего 4% 1ДА0. После обработки в этой смеси: препарат РЦ наносился на колонку, которую промывали затем 0,1% раствора Тритона Х-100 в 0,01 М Трис-НСЬ рН=8,0 для удаления ЬДАО. Препарат РЦ снимался с колонки тем же буфером с добавлением I М МаС1, образец подвергался диализу против 0,01 М Трис-НСЬ буфера, рН=8,0 +0,1% Тритон Х-100 и затем сгущался на мембранном фильтре.

Для удаления минорных белковых субъединиц, содержащих вторичные акцепторы ФС1, ПБК1 обрабатывали 20 мин 07% додецилсуль-фота натрия. После центрифугирования в градиенте плотности сахарозы получали реакционные центры, содержащие одну белковую субъединицу 70 кД.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.§ I. Математическая обработка результатов.

Целью математической обработки является определение неизвестных; параметров исследуемой системы, например, констант скоростей перехода между различными состояниями. В эксперименте измеряются кинетики изменения поглощения на заданной длине волны. Ход изменения этих кинетик зависит как от параметров системы, так и от параметров возбуждающего и зондирующего импульсов света. Исследуемую систему можно описать набором состояний, при этом каждому состоянию соответствуют уровни энергий, имеющие сложную вибронную структуру. В исследуемых системах константа скорости колебательной релаксации значительно превышает константы скоростей переходов между состояниями, поэтому можно считать, что для каждого состояния быстро устанавливается Больцмановское распределение по колебательным степеням свободы, поэтому можно рассматривать суммарную населенность электронного состояния.

Из всех состояний выделим основное состояние, когда система не возбуждена. Обозначим населенность этого состояния У0. Если измерения происходят в образце толщиной £ то в общем случае при возбуждении образца импульсом с интенсивностью ¡К-к) /здесь - число фотонов, падающих на единичную площадку заединицу времени/ то У0 и Л являются функциями к и х, где х - рас-тояние от поверхности образца /0 /.

Уравнения для населенности основного состояния и интенсивности возбуждающего импульса <К"Ь,*-) в образце имеют вид /212 /:с начальным условием для У0Ц-<*>(*) = I и граничным условием для ¡ГВ уравнениях /45/0^ - сечение поглощения из основного состояния в возбужденное на данной длине волны,и - скорость прохождения импульса в образце, N - концентрация поглощающих центров.

Решение системы уравнений /35/совместно с начальными и граничными условиями известно / /.

Для определения констант скоростей перехода между исследуемыми состояниями необходимо составить систему уравнений для населенностей возбужденных состояний:-и ИЗдесь - константа скоростей перехода из состояния Ы> в состояние М - число возбужденных состояний системы. Эти населенности удовлетворяют следующим начальным условиям:шЧ =0Например, если рассматривается процесс переноса электрона от первичного донора Р в РЦ фотосинтезирующих бактерий при возбуждении импульсом второй гармоники, то учитываются следующие возбужденные состояния: |0=|Р, Бф Д)>, \2>Цр*,Бф, 13>=|рГБф-,а> 14>=|Р+,Бф, <Г>.

11) - состояние,в котором возбуждение Бф, (2) - состояние в котором возбуждение перешло на димер бактериохлорофилла РЦ, \ 3 > - состояние, при котором электрон перешел от первичного донора на бактериофеофитин, |4) - состояние, при котором электрон перешел на хинон.

В общем случае, когда в системе уравнений /19/возможно присутствие нелинейных членов, например, из-за аннигиляции возбуждений в антенне, для решения приходится применять численные методы.

В случае, если система уравнений линейна, то решение этой системы для источника, отличного от & функции, запишется в виде свертки:V-Ux) ЬCtЧ'(х) х) oli1' /21/i < МБудем считать, что форма импульса в канале зондирования незначительно отличается от формы возбуждающего импульса и она описывается функцией <D\t). Если обозначить энергию опорного импульса в коноле зондирования на длине волны Т) то сигнал фотоприемника опорного канала зондирования будет равен:Здесь А. - оптическая плотность на длине волны зондирования00 { Iв отсутствие возбуждения, ^ . Обозначим энергию зондирующего импульса, прошедшего через возбужденный участок образца с заданной задержкой ^ по отношению к возбужденному импульсу. Она вычисляется следующим образом:/22/. - сюгде \{il) - оптическая плотность образца для возбужденного участка в момент времени -¿" усредненная по толщине образца,Vg - скорость движения зондирующего импульса в образце на длине волны зондирования. При этом в схеме с направленными навстречу друг другу возбуждающим и зондирующим импульсами нулевой-задержки считается такая, при которой максимумы возбуждающего и зондирующего импульсов встречаются в середине /по толщине/ образца.

Для определения неизвестных параметров /констант скоростей перехода К,, и ¡С./ необходимо использовать итерационную проце<Ъ оЧдуру, минимизирующую по этим параметрам функционал средне-квадратичной ошибки.

Вычисления производятся до тех пор, пока функционал среднеквадратичной ошибки не станет меньше величины, характеризующей норму ошибок эксперимента.

Методика обработки результатов, полученных на импульсном флуорометре описана в /199/. Характеристическая функция флуоресценции моделируется в виде суммы экспонент:где Ак и - искомые параметры, П - число компонент.

Если Ш) аппаратная функция установки, то на выходе флуо-рометра будет регистрироваться сигнал, который можно представить в виде свертки функцийfWHKCt):соФ^мкиччччад' /28/.-fcoДальнейшая математическая обработка результатов проводится по вышеизложенной методике. Выражение для определения среднеквадратичной ошибки будет иметь следующий вид:где ¿г. ( - число экспериментальных точек.

Программы обработки реализованы на ЭВМ MC 80 01, результаты выводятся на графический дисплей, могут быть записаны на магнитный диск и воспроизведены с помощью графопостроителя.§ 2. Кинетика первичного разделения зарядов в реакционных центрах бактерий.

В настоящее время довольно хорошо изучены строение, состав и процессы, происходящие в реакционных центрах фотосинтезирую-щих бактерий. Высокая квантовая эффективность фотохимического акта при фотосинтезе указывает на то, что первичное разделение зарядов в РЦ должно происходить с исключительно высокой скоростью Количественные расчеты, выполненные на основании экспериментальных данных о величинах квантовых выходов первичного акта и длинноволновой флуоресценции РЦ позволили получить значение константы фотохимической реакции Ю10 - Ю11с"1 / 18,19,36,217 /.

Было установлено, что первичный донор электрона димер бак-териохлорофилла Р870 при получении энергии кванта света за время менее I пс переходит в синглетное возбужденное состояние.fДалее РЦ переходит в так называемое состояние Р. Некоторыеравторы считают, что состояние Р представляет собой смесь состояний | Р870+ Р800">и 1Р870+Бф)> / 50 /, где Р800 по-видимому,мономер бактериохлорофилла с максимумом поглощения в полосер800 нм. Другие полагают, что состояние Р включает в себя последовательный перенос электрона с Р800" на Бф. Характерное время жизни состояния PF составляет 4-7 пс /47,217,219,220/.

Большая часть данных о первичных этапах разделения зарядов в РЦ получена методом абсорбционной пикосекундной спетроскопии, тогда как данных и дезактивации состояния Р870 отражающих, в основном переход Р870—>Р870, существенно меньше.

Впервые кинетика быстрой пикосекундной флуоресценции была /217,219,221,222/ зарегистрирована в работах:/ /. Однако эксперименты были выполнены с недостаточно высоким временным разрешением ^8 пс на препаратах РЦ, отдельные молекулярные характеристики которых отличаются от нативных.

В последующих работах, выполненных в других лабораториях, было подтверждено наличие быстрого компонента в кинетике затухания флуоресценции РЦ, связанного с переходом Р870 в состояниесР и исследована зависимость квантового выхода этой флуоресценции от условий среды /рН, температура и др./. Однако временного разрешения используемой аппаратура оказалось недостаточно*для точного1 определения времени жизни Р870 /223/.

В настоящей работе было изучено фотохимическое разделение зарядов в РЦ, выделенных из хроматофоров Rf>s, ^Wcievoider штамм I760-I с применением детергента лаурилдиметиламиноксида. Молекулярные характеристики таких препаратов и кинетика переноса электрона в них практически идентичны таковым vriiro. Целью данного исследования являлось провести сравнительное исследование реакции образования состояния Р методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии в одном эксперименте на одном и том же препарате. По нашим сведениям такое сравнительное исследование с достаточно высоким временным разрешением выполнено впервые.

Флуоресценцию РЦ возбуждали одиночными импульсами света с 1\ = 530 нм, tUMv^= 2 пс, плотность энергии J = 10^ квант/см^, частота следования 0,5 Гц.

Кинетику затухания флуоресценции РЦ регистрировали с помощью электронно-оптического преобразователя, сопряженного с ви-диконом и анализатором импульсов N OKI R LP-4840. Временное разрешение флуорометра составляло 1,5 пс. Установка работала в режиме накопления, что вШ раз / N - число накоплений/ улучшает отношение сигнал/шум и увеличивает динамический диапазон системы регистрации. Обработку экспериментальных данных с учетом аппаратной характеристической фукции осуществяли по методу затухающих наименьших квадратов Левенберга на ЭВМ "Электроника НЦ-80".

Кинетику изменения поглощения, отражающую перенос электрона *Р870 —^ Р измеряли на автоматизированном пикосекундном обсорбци-онном спектрометре,описанном выше. Число накоплений в каждом измерении устанавливалось ЭВМ и определялось заданием точности измерения. В процессе измерения обуществлялся отбор импульсов света по длительности, что в совокупности с математическими методами обработки экспериментальных данных с учетом аппаратной функции импульсов возбуждения и зондирования позволило довести временное разрешение спектрометра до 3 пс.

Определение истинного времени затухания флуоресценции в моноэкспоненциальном приближении выполнено методом свертки аппаратной функции с экспонентой вида А ех|э — j. Расчеты показывают, что экспериментальные точки наилучшим образом аппроксимируются такой экспонентой с величиной £0= 6 пс. /теоретическая кривая проведена на рис.11 сплошной линией/. Таким образом можно заключить, что затухание флуоресценции при 926 нм описывается экспонентой с % = 6 пс. Вместе с тем,¿кинетике затухания флуоресценции РЦ /рис.11/ проявляется также наносекундный компонент свечения, вклад которого по отношению к быстому,незначителен.

Итак, флуоресценция с временем жизни %= б пс наблюдается в восстановленных. РЦ, исчезает в окисленных и является наиболее длинноволновым зарегистрированным свечением таких препаратов. Эти данные позволяют сделать вывод, что зарегестрированное свечение присуще собственно фотохимически активному пигменту Р870.

В наших экспериментах было исследовано влияние температуры на кинетику затухания флуоресценции Р870 и показано, что длительность флуоресценции практически не зависит от температуры в диапазонах 293-77 к /рис.12/. Аналогичные данные об отсутствии температурной зависимости для фотохимического разделения зарядов в РЦ впервые были получены в экспериментах, с прямой регистрацией кинетики процесса по флуоресценции /4,;222/ и независимо другими авторами /22С/ по абсорбционным индикаторам. Зти результаты указывают на безактивационный /возможно туннельный/ характерЪ »пс 1и86 4и751255?175225275 1>Рис.12Температурная зависимость длительности флуоресценции препаратов РЦ из крэ^рьаего1йез.переноса электронов между первичными реагентами в РЦ.

Для более глубокого понимания механизма первичных, процессов разделения зарядов в РЦ представляет несомненный интерес прямое сопоставление данных абсорбциооной и флуоресцентной пи-косекундной спетроскопии, полученных на одном и том же образце в идентичных условиях. Такое сопоставление позволяет определить кинетику дезактивации возбужденного состояния Р870 и установить природу состояния, в которое Р870 переходит в первичном акте.

На рис.13 показан дифференциальный спектр поглощения в РЦ при возбуждении импульсами света с длиной волны 1\ = 530 нм. Зондирование производилось с задержкой 30 пс. Дифференциальный спектр характеризуется выцветанием полос Р870 при 870 нм и 800 нм, полос Бф при 760 нм и 545 нм, а также появлением новой полосы поглощения при 680 нм, которая не наблюдается в дифференциальном спектре поглощения при постоянном освещении. Кроме того, в пикосекундном временном диапазоне наблюдается коротковолновый сдвиг полосы поглощения при 600 нм и длинноволновый сдвиг полосы поглощения бактериофеофитина при 760 нм. Таким образом, спектр, измеренный через 30 пс после возбуждения, не противоречит данным / 50/ о том, что в этом временном интервале регистрируется смесь состояний| Р870+ Р800" Бф>+ | Р870+ Р800 Бф>.

На рис. 14 представлены кинетика изменения поглощения в РЦ, зарегистрированная на длине волны 760 нм в таких же эксперимен-шальных условиях, как и при регистрации пикосекундной флуоресценции. Уменьшение поглощения при 760 нм, как известно, связано с образованием состояния Рр/47,50,220/. На этом же рисунке пока^ зана форма-.возбуждающего и зондирующего импульсов, снятая с помощью электронно-оптического преобразователя, исползуемого для регистрации кинетики датухания флуоресценции. В пределах точностидА, отн.ед.

Рис.13Спектр фотоиндуцированного изменения поглощения РЦ Rps. sphaeroides при задержке зондирования 30 пс.

Рис.14Кинетика абсорбционных изменений РЦ нр5гзр11аего1<аеа при 760 нм. 1-форма возбуждающего и зондирующего импульсов, 2/о /-экспериментальные точки, 2/—/-результат свертки аппаратной функции /I/ с расчетной кинетикой 3.регистрации / + 1,5 пс/ возбуждающий и зондирующий импульсы совпадают и имеют Гауссову форму со средней полушириной Д t = 24+1,5пс Очевидно, нахо®дение неискаженной влиянием лазерных импульсов кинетики выцветания полосы 760 нм возможно лишь с привлечением математической обработки экспериментальных кривых.

Обработка экспериментальной кривой 2 на рис. 14 по изложенной методике с учетом формы возбуждающего и зондирующего импульсов / кривая I, рис.14 / позволяет получить неискаженную действием лазерных импульсов кинетику выцветания полосы 760 нм, кривая 3, рис.14. Как следует из результатов, изложенных в данном разделе, выцветание полосы 760 нм происходит за время 7+3 пс. Свертка расчетной кривой 3, рис.14, имеющей характерное время 7+3 пс, с аппаратной функцией I рис. 14 дает теоретическую кривую 2 /-/, рис.14, которая в пределах точности измерения хорошо совпадает с экспериментальными результатами. Вариация времени выцветания 760 нм в пределах. + 3 пс не выводит теоретическую кривую за пределы экспериментальной ошибки.

Таким образом, в наших экспериментах установлено, что впределах: достигнутой точности измерений наблюдается хорошее кинетическое соответствие между процессами образования состоянияг *Р и затухания флуоресценции Р870. На основании этого можносделать вывод, что образование р^ являющегося смесью состояний 1 Р870+Б800"Бф > и |Р870+Б800 Бф"> происходит в одну стадию из возбужденного состояния специальной пары. При этом, с течение 6-7 пс электронная плотность практически полностью локализуется на Бф реакционного центра.ф 3. Исследование рекомбинация зарядов в РЦ.

Если химически в темноте до возбуждения препарата восстановить первичный хинонный акцептор до состояния ^ то перенос электрона по цепи РЦ будет блокирован, и реакция замкнется на следующем уровне:* +Р8701 -Р8701^ХВ этих условиях можно ожидать рекомбинации зарядов:Р8701 «м- Р8701Зр8701Р8701Очевидно, реакцию рекомбинации можно зарегистрировать по изменению кинетики флуоресценции С канал ( I ) дезактивации I) и восстановлению поглощения в основном состоянии специальной пары Р8г,д ( каналы (2) и (3) ).

Для того, чтобы сопоставить результаты флуоресцентных и абсорбционных измерений, было проведено исследование кинетики восстановления поглощения в полосе 870 нм РЦ, выделенных из дикого штамма бактерии Ry;. e^W^ev-ovoUc,На рис. 15 представлена кинетика изменения поглощения в присутствии дитионита натрия при Е 600 мВ и постоянной подсветке. Оптическая плотность образца на длине волны Tl=870 нм составляла 0,8 ед. Измерения проводились при комнатной температуре.

Наличие двух компонент в кинетике восстановления поглощения Р870 свидетельствует о том, что рекомбинация радикальной пары происходит по нескольким каналам. Принимая во внимание данные о кинетике флуоресценции восстановленных РЦ, можно сделать вывод, что компонента с временем жизни а/ i не отражает дезактивацию радикальной пары по каналу I, т.е. через синглетно-возбужт *денное состояние ХР g^Q с последующим высвечиванием кванта флуоресценции.

Необходимо отметить, что эксперименты проводились как на целых РЦ, восстановленных с помощью дамонига натрия, так я на РЦ, в которых хинонные акцепторы были удалены при приготовлении образца. В абсорбционных измерениях было замечено, что вклад компоненты с t = I не был меньше в бесхинонных РЦ, чем в обычных, и составлял примерно 10$. Соотношение компонент с t = I не и & =10 не варьировалось в пределах 30% в зависимости от партии хроматофоров, из которых выделялись РЦ.

Во флуоресцентных измерениях зарегистрировать долгоживущий компонент в бесхинонных РЦ не удалось вследствие малой веишчины сигнала. Таким образом, можно сделать предположение, что вклад быстрой компоненты в процесс рекомбинации радикальной пары P^qI"" зависит, видимо, от степени нагивности РЦ.

Таким образом, на основе анализа литературных данных и наших экспериментов можно предложить следующую схему рекомбинации зарядов радикальной пары по триплетному каналу с участием каротиноидов, показанную на рис. 17.

Результаты математической обработки экспериментальных кинегик приведены в таблицеА В Я/ Частицы 0.3 0,7 32 160 0,08 0,92"Ядро"ЛБК1 0,95 0,05 36 80 0,9 ОДВремя-»Рис.18Кинетика затухания флуоресценции препаратов фотосистемы I. 1-аппарагаая функция фпуоршегра, 2-кинегяка флуоресценции препарата с отношением Хл/Р70040, 3-кинетика флуоресценции препарата с отношением Хл/Р700120.

Таким образом, измерение кинетики затухания флуоресценции хлорофилла "ядра" комплекса РЦ ФС1, свободного от дополнительного светособирающего хлорофилла ( отношение Хл/Р700'ч/40) дает величину параметра Км в уравнениях (29.2), (29.3), (30.2)-( 30.5 ).

А А,отн.ед.

Абсорбционные изменения сопровождающие образование состояния P700"¡T, независимо от природы интермедиа та I, должны проявляться в области 800-850 нм, где формируется полоса поглощения анион-радикала молекулы Хл /145; 224/а также каионной радикальной формы хлорофилла /145,224/Поэтому, для того, чтобы описать совокупный процесс переноса энергии и электрона в ядре комплекса РЦ фотосистемы I, необходимы кинетическиеизмерения в облаем поглощения радикалов молекулы хлорофилла. Результаты таких измерений да двух препаратов ФС1, исследованных в данной работе, представлены на рис. 20 • Отметим сразу же, что в этой спектральной области не чувствуется разница в величине абсолютного изменения поглощения разных., по содержанию антенного Хл препаратов. С одной стороны, это свидетельствует об отсутствии окислительно-восстановительных процессов в антенном хлорофилле, с другой - о том, что исходная концентрация РЦ I в исследованных препаратах была одинакова. Кроме того, кинетики изменения поглощения двух образцов полностью совпадают во всем исследованном диапазоне времен. Это важное свидетельство адекватности выполненных экспериментов.

Передний фронт кинетики, приведенной на рис. 20 является суперпозицией двух процессов: реакции образования возбужденного состояния Р700, осуществляющейся со скоростью Км и процесса деления зарядов в РЦ с константой скорости. Переходный процесс в кинетике от максимального абсолютного значениядо остаточного значения л А820 осуществляется за-100 пс. Этот переходный процесс, в соответствии с исходной моделью выбранной для анализа, отражает переход РЦ из состояния в состояние Ар Таким образом, как следует из данных рис.20 оценочное значение величины К2 = 1/100 пс = Ю^сГ^. Тог факт, что изменения поглощения, сопровождающие реакцию восстановления-окисления интермедиата I, проявляются в области 820 нм, служат указанием на го, что в качестве интермедиата I мохлег выступать молекула хлорофилла. Это очевидное заключение не противоречит ( подтверждает) выводы авторов /20,50/.

В наших экспериментах получено три основных результата: кинетики затухания флуоресценции препаратов при ^^г- нм и кинетике выцветания д А^дг, и возникновения д поглощение- из препаратов в абсорбционных опытах. Метод анализа клнетик флуоресценции изложен нами достаточно полно. Дяя того, чтобы получить единую картину переноса энергии и электрона в ядре комплекса РД фотосистемы I, необходам математический анализ измененности населенноетей состояний, ответственных за поглощение в исследуемой области.

Как отмечалось ранее, выцветание полосы при 700 нм обусловлено следующими явлениями: переход молекул хлорофилла антенны в возбужденное состояние,( при этом соответствующее изменение поглощешзя зависит от количества молекул антенного хлорофилла); переход молекулы Р700 в возбужденное состояние; окисление Р700 и переход его в состояние Р700^. Следовательно, кинетика абсорбционных изменений при 700 нм моделируется следующим выражением:+7 4(V)+ак\и'И У,)аА^МЗ^'-О.Ю ои'с 32 )где дАанг и Д изменения поглощения в полосе 700 нм,вызванное вкладами антенны и РЦ, соответственно.

С учетом того, что ^о1, + ^н = Уравнение (32 )можно переписать в виде:( 33 )Выражения дляни)и получались из решения системы кинетических уравнений (29 ) и сворачивались с аппаратной характеристической функцией. Совпадение модельной кривой (33 ) с экспериментальной, рис. 19 достигалось вариацией параметров ъ* при известном параметре.; полученным из флуоресцентных измерений.

Аналогично, увеличение поглощения при 820 нм связано о образованием состояния Р*ЗГ» переход кинетики к стационарному уровню описывает перенос электрона к акцептору А, стационарный уровень поглощения при 820 нм дает населенность состояния Р*. В этой области моделирование кинетики проводили по формуле:л 4 Г А^Ш) ^ )- 00( 34 )варьируемыми параметрами являлась константа ^ Совместное моделирование выражений С 33 ) и (, 34 ) дало следующие результаты:

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Аврамов, Лъчезар Аспарухов

- 125 -ВЫВОДЫ

1. Собран автоматизированный пикосекундный двухлучевой абсорбционный спектрометр с перестраиваемой длиной зондирования. Основные характеристики спектрометра: временное разрешение 3 пс, точность измерения 3.I0""3 ед. опт. плотности. Частота следования импульсов ~3 Гц.

2. Разработаны метода обсчета экспериментальных кинетик, позволяющие реализовать временное разрешение ± 3 пс при измерении

Л ' -р кинетических кривых изменения поглощения дА >3.10 .

3. Впервые в одном эксперименте исследованы миграция энергии, деление зарядов и перенос электрона двумя методами - флуоресцентным и абсорбционной спектроскопии.

4. Установлено, что деление зарядов в РЦ Rps. sj>kaevoides происходит за 6-7 пс. В пределах временного разрешения (±1,5 пс во флуоресцентном и ± 3 пс в абсорбционном методах) кинетика деления зарядов моноэкспоненциальна.

5. Обнаружены два компонента в кинетике рекомбинации радикальной пары в РЦ Rp^. bpWaeroidaS : характерные времена этих компонентов I и 10 не.

6. Исследованы миграция энергии, деление зарядов и перенос электронов в комплексе РЦ фотосистемы I. Установлено, что константа миграции энергии от светособирающего Хл а комплекса РЦ ~ З.Ю^.с"-'-; деление зарядов осуществляется за 7 + 3 пс,

Л г перенос электрона от ближайшего к Р700 акцептора к первичному железо-серному центру осуществляется за ~ Ю0 пс.

7. Определено время рекомбинации зарядов первичной радикальной пары Р700"1т~ в РЦ фотосистемы I, которое составляет 3,5 не.

8. Составлены модельные схемы, описывающие первичные процессы в реакционных ценграх пурпурной бактерии Rips. s^Waevocoles ( дикий штамм) и фотосистемы I высших растений.

В заключение автор выражает искренную и глубокую благодарность ст.н.с. В.З.Пащенко за научное руководство работой в постоянное внимание к ней.

Автор благодарит ст.н.с. Б.Н.Корватовского, ст.н.с. НЛ. Захаровой, ст.н.с. Г. П. Ity карских, В.В.Горохова за плодотворное сотрудничество.

Автор признателен к.б.н. С.К.Чамаровскому, А.Я.Пикуленко, Т.М.Мельник, В.Б.Тусову и всем сотрудникам отдела биофогоники за доброжелательное отношение и помощь в работе.

Автор благодарит зав. отделом В.Н.Верхотурова и его сотрудников А.В.Комарова и А.А.Лазарева за помощь при автоматизации установки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе оплоан дифференциальный абсорбционный спектрометр, собранный при непосредственном участии автора диссертации, а также исследованы прямые и обратные реакции в РЦ пурпурной бактерии ^^е^сно^ е.5 > дикий штамм и ЦБК фотосистемы I - Методами абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии в одном эксперименте. Основными характеристиками спектрометра являются: временное разрешение ^ 3 пс, точность измерения изменения оптической плотности 3.10"*^. ед. Данные параметры достигаются благодаря методическим достижениям, таким, в частности, как селекция импульсов возбуждающего и зондирующего по энергии и длительности, а также автоматизация процессов управления установкой, сбора и обработки экспериментальных результатов.

При исследовании реакции деления зарядов в РЦ пурпурной бактерии <?|о1га€,\г снс!^, (флуоресцентным и абсорбционным методами установлено, что состояние Р870"5Бф~* возникает за 6-7 пс. Подчеркнем, что в описанных экспериментальных условиях и в пределах точности измерения кинетик С + 1,5 пс в флуоресцентном в ^ 3 пс в абсорбционном методах) кинетика обл ► разования состояния Р870^Бф" моноэкспоненциальна. Следовательно, эти результаты не подтверждают наличия быстрого компонента (< I пс) в мне тике деления зарядов, описывающего перенос электрона от Р870 на Б800, который был обнаружен в работе / 47 /. Возможно, использованные нами методы имели недостаточное временное разрешение.

Вместе с тем, в дифференциальных фотоиндуцированных спектрах поглощения препаратов нами, как и другими авторами, обнаружены полосы, связываемые с кагионной формой Б800, причем скорость возникновения этих изменений такова же что и скорость возникновения состояния Р870*. Поэтому полученные нами результаты, а также данные других авторов / 54 / по-видимому не мо уг служить основанием для исключения Б800 из реакций деления зарядов в РЦ. Отметим, что серьезнейшим аргументом в пользу участия Б800 в первичной реакции РЦ служа! данные по электронной микроскопия РЦ из бактерий Я. ^то^е / 22 /, где показано, что расстояние между Р870 и Б800 составляет ЗА и таким образом, с учетом взаимной ориентации дипольных моментов длинноволновых переходов,между этими молекулами должно существовать довольно значительное взаимодействие. Можно предположить, что Б800 осуществляет некую интермедиагорную роль в переносе электрона от Р870 к Бф, однако, вследствие оильного межмолекулярного взаимодействия, возбуждение осциллирует между Р870 и Б800 до тех пор, пока в течение 6 пс электонная плотность не локализуется полностью на Бф.

При темновом восстановлении первичного хинонного акцептора до состояния или при экстракции хинона первичная радикальная пара Р870^Бф~ рекомбинирует, причем в кинетике восстановления поглощения Р870 обнаруживаются два компонента* длительности которых составляют ^ I не и 10 не. В параллельных опытах на пикосекундном флуоромегре в условиях, когда с высоким выходом реализуется рекомбинация зарядов, в кинетике затухания флуоресценции также обнаруживается наносекундный компонент свечения. Следовательно, одним из каналов рекомбинации зарядов является переход Р870^ Бф Р870 Бф -> Р870 Бф, осуществляемый за л/1 не. Другой канал рекомбинации связан с переходом Р870* Бф~-> Р870 Бф непосредственно в основное состояние. РЦ за ^ 10 не. Отсутствие зависимости кинетики рекомбинации первичной радикальной пары от магнитного поля в РЦ, включающих в свой состав молекулы карогиноидов, свидетельствует, что в восстановиеельных условиях каротиноиды являются эффективным

1-1 ^ V тушителем состояния Р , причем магнитное поле, по всей видимости, увеличивает вероятность триплет-триплетного переноса р к. энергии к каротиноидам, тогда как эффективность перехода Р Р в магнитном поле уменьшается, см. схему на стр.99 . Проверкой высказанных в диссертации предположений могут служить опыты по измерению полевых зависимостей скоростей образования состояний Р и Сау , а также эксперименты на ГЦ бескаротиноидного мутанта бактерий с последующим встраиванием каротиноидов.

В опытах по исследованию переноса энергии и электрона в ПБК фотосистемы I, также выполненных в сравнительных экспериментах методами флуоромегрии и абсорбционной спектроскопии получены константы, характеризующие перенос энергии и электрона л» лит по состояниям ХлантР7001А £мХлантР7001А к, ХлантР^001"Ак4ХлР^001А-Установлено, что в дифференциальном спектре изменения поглощения при 700 нм основной вклад в переходные кинетики во временном диапазоне 0-200 пс- дает светособирающий хлорофилл антенны. В отличие от данных /48 /, в этой области нами не выделен компонент, отвечающий переходу р^01~А — •

Очевидно, суммарная эксгинкция светособирающего хлорофилла в полосе 700 нм значительно превосходит экстинкцию интермедиата I, в качестве которого, по данным / 48 / функционирует Хл Установлено также, что вклад перехода от светособирающего хлорофилла в изменения поглощения при 820 нм незначителен. Кроме того, время перехода Р^001~А ^ Р^ТА" (100 пс) оказалось вдвое короче измеренного ранее авторами /48 /. Такая значительная разница измеренных нами и в работе / 48 / вызвана по всей видимости следствием методических особенностей приготовления образца.

Была измерена также кинетика рекомбинации зарядов в первичной радикальной паре ПБК фотосистемы I на абсорбционном спектрометре и флуорометре. Одинаковы времена рекомбинации по двум исследованным каналам свидетельствуют, что зарегистрирован распад сметной радикальной пары ^ I"] . Совокупность литературных данных и результатов данной работы позволило составить функциональную схему первичных процессов в ЦБК фотосистемы I.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Аврамов, Лъчезар Аспарухов, Москва

1. С. A* Wraight and R.K.Clayton. The absolute quantum efficiency of bacteriochlorophyll photooxidation in reaction centers of Rhodopseudomonas sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta 1974» 333, 246-260.

2. H. Avata and W.W.Parson. Delayed fluorescence from Rhodopseu-domonas sphaeroides reaction centers. Enthalpy changes accom-paning electron transfer from P 870 to quinones. Biochim. Biophys. Acta, 1981, 638, 201-209.

3. Bensasson R., Sand R.S. Optical and kinetic properties of semireduced plastoquinone and ubiquinone electron acceptorsin photosynthesis.- Biochim. Biophys. Acta, 1973, 325, 175-181.

4. Halsey J.D., Parson W.W. Identification of ubiquinone as the secondary electron acceptor in the photosynthetic apparatus of C.viridis.- Biochim. Biophys. Acta, 1974, 347-404.

5. Dutton P.L., Prince R.C., Tiede P.M. The reaction center of photosynthetic bacteria. Photochem. Photobiol., 1978, 28, 939-949.

6. Ke B. The primary electron acceptor of photosystem I.-Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.301, p.1-33.11» Reed D.W., Clayton R.K. Isolation of a Reaction Center

7. Olson J.M., Thomber J.P. Photosynthetic reaction centers

8. Membrane Proteins in Energy Transduction (R.A.Capaldi ed.)

9. N.J.: Marcel De Ker, 1978, 279-340.15» Le Maire M.,Rivas E„ , Sise and shape of detergent-soulu-bilised photochemical reactions centers from two strainsof Rhodopseudomonas sphaeroides, Biochim. Biophys. Acta,1983, 722, 150-157.

10. Straley S.C., Parson W.W., Mauzerall D.C., Clayton R.K. Pigment content and molar extinction coefficient of photochemical reaction center from R.sphaeroides.- Biochim. Biophys. Acta., 1973, v.305, p.597-609.

11. Rafferty C.N., Clayton R.K. Properties of reaction centers of R.sphaeroides in dried gelatin films. Linear dichroism and low temperature spectra. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 502, p.51-60.

12. Clayton R.K. Primary processes in bacterial photosynthesis, 1973, Ann Rev. Biophys. Bioeng., 2, 131-156.19« Parson W.W», Cogdell R.J. The primary photochemocal reaction of bacterial photosynthesis.- Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 416, 105-149.

13. Deisenhofer J., Epp 0., Miki K., Huber R., Michel H. X-ray Structure Analysis of a Membrane Protein Complex. J. Mol. Biol, 1984, 180, 385-389.

14. Parson W.W», Monger T.G. Interrelationships among excited states in bacterial reaction centers. 1976, Brookhaven Symp. Biol., 28, 195-212.

15. Arnold W., Clayton R.K. The first step in photosynthesis. Evidence for the electronic nature.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1960, 46, 769.

16. Loach P.A. Primary oxidation-reduction changes during photosynthesis in R. rubrum.- Biochemistry, 1966, 5, 592.

17. Parson W.W. The role of P870 in bacterial photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1968, 153, 248-259.

18. Климов B.B., Крахмалева И.Н., Шувалов B.A., Карапегян Н.В., Красновский А.А. Изменение выхода флуоресценции бактеряохдо-рофилла при фотовосстановлении бактериофеофитина в хромато-форах пурпурных серных бактерий.-Биохимия, 1976, 46,1435-1440.

19. Мс Elroy J.D., Feher G., Mauserall D.C. Characterizationof primary reactions in bacterial photosynthesis. I. Comparisor of the light-induced EPR signal (g=2.0026) with that ofbacteriochlorophyll radical.- Biochim. Biophys. Acta, 1972, 267, 363-374.

20. Norris J.R., Scheer H., Druyan M.E., Katz J.J. An electron nuclear double resonance (ENDOR) study of the special pair model for photoreactive chlorophyll in photosynthesis.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4897-4900.

21. Zankel K.L., Reed D.W., Clayton R.K. Fluorescence and photo-synthetic reaction centers.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1968, 61, 1243.

22. Kaufmann K.J., Dutton P.L., Netzel T.L., Seigh iJ.S., Rentze-pis P.M. Picosecond kinetics of events leadinh to reaction center bacteriochlorophyll oxidation.- Science, 1975» 188, 1301-1304.

23. Rockley M.G., Windsor H.W., Cogdell R.J., Parson W.W. Picosecond detection of an intermediate in the photochemical reaction of bacterial photosynthesis.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, 72, 2251-2255.

24. Dutton P.L., Kaufmann K.J., Chance B., Rentzepis P.H. Picosecond kinetics of the 1250 nm band of the R.sphaeroides reaction center: the nature of the primary photochemical intermediary state.- EBBS Lett., 1975, 60, 275-280.

25. Moskovits E., Malley M.M. Energy transfer and photooxidation kinetics in reaction centers on the picosecond time scale.-Photochem. Photobiol., 1976, 27, 55-59.

26. Borisov A.Yu. Godik V.I., Exitation energy transfer in photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1973, 301, 227-248.

27. Shuvalov V.A., A.V.Klevanik. The study of the state

28. P870+ B800" in bacterial reaction centers by selectivepicosecond and low temperature spectroscopic. PEBS Lett. 1983, 160, 51-55.

29. Климов B.B., Шувалов В.А., Крахмалева И.Н., Клеваник A.B., Красновский A.A. Фоговоссгановление бактериофеофигина в первичной световой реакции хромагофоров Rhodopseudomonas viridis. Биохимия, 1977, 42, 519-530.

30. Shuvalov V.A., Klimov V.V., The primary photoreactions in the complex cytochrome P890 P760 ( bacteriopheophytin-760) of chromatium minutissum at low redox potentials.- Biochim. Biophys. Aota, 1976, 440, 587-599.

31. Van Grondelle R., Romiju J.C., Holmes H.G. Photoreductionof the long wavelenght bacteriopheophytin in reaction centers and Chromatophores of the photosynthetic bacterium. Chromatium vinosum. FEBS Lett., 1976, 72, 187-192.

32. Okamura М.У., Jsaacson R.A., Peher G. Spectroscopic and kinetic properties of the transient intermediate acceptor in reaction centers of R.sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta, 1979, 546, 394-417.

33. Pajer J., Brune D.C., Davis H.S., Forman A., Spaulding L.D. Primary charge separation in bacterial photosynthesiss oxidized chlorophyll and reduced pheophytin. Proc, Natl» Acad» Sci. USA , 1975, 72, 4956-4960»

34. Tiede D.H., Prince R.C., Dutton P.L. EPR and pptical spectroscopic properties of the electron carrier intermediate between the reaction center bacteriochlorophyll and the prima-zy acceptor in C. Vinosum. Biochim. Biophys. Acta, 1976, 449, 447-467.

35. Shuvalov V.A,, Parson W.W. Energetics and kinetics of radical pairs involving bacteriochlorophyll and bacteriopheophytin in bacterial reaction centers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, 957-961.

36. Schenck G.C., Blankenship R.E., Parson W.W. Radical pair decay kinetics triplet yields, and delayed fluorescence frombacterial reaction centers. Biochim. Biophys. Acta, 1982, 680, 44-59.

37. Netzel Th.L.,Elektron transfer Reactions in Reaction Centers of Photosinthetiic Bacteria and in Raection Center

38. Holten D., Windsor M.W., Parson W.W., Thornber J.P. Primary photochemical processes in isolated reaction centers of Rps. viridis. Biochim. Biophys. Acta, 1978, 112-126.58» Razjivin A.P., R.V.Danelius,R.A.Gadonas, A.Yu. Borisov, A.S.

39. Photochem. Photobiol., 1979, 30, 767-776.

40. Шувалов В.А., Климов В.В., Крахмалева И.Н., Москаленко А.А., Красновский А.А. Фогопревращения бакгердофеофииша в реакционных центрах R.rubrum ДC.minussimum ДАН СССР, 1976, 227, 984-987.

41. Clayton R.K., Straley S.C. Photochemical electron transport in photosynthetic reaction centers. IV Observation related to the reduced photoproducts. Biophys. J., 1972, 12, 12211234.

42. Mc Elroy J.D., Feher G., Mauzerall D. Observation of a second light induced EPR signal from reaction centers of photosynthetic bacteria. Biophys. Soc. Abstr., 1970, 10, 204.

43. Feher G., Isaacson R.A., Mc Elroy J.D., Ackerson L.C., Okamu-ra M.J. On the question of the primary acceptor in bacterial photosynthesis: Manganese substituting for iron in reaction centers of R. sphaeroides R-26. Biochim. Biophys. Acta, 1974 368, 135.

44. Okamura M.J., Isaacson R.A., Feher G. The primary acceptorin bacterial photosynthesis: The abligatory role of ubiquinone in photoactive reaction centers of R.sphaeroides.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975, 72, 3491-3495.

45. Okamura M.J., Isaacson R.A., Peher G. Spectroscopic and kinetic properties of the transient intermediate acceptor in reaction centers of R. sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta, 1979, 546, 394-417.

46. Schenck C.C., Parson W.W., Holten D., Windsor M.W., Sarai A. Temperature dependence of electron transfer between bacteriophi ophytin and ubiquinone in protonated and denterated reaction centers of R. sphaeroides. Biophys. J., 1981, 36, 478-489.

47. Parson W.W. The reaction between primary and secondary electron acceptors in bacterial photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1969, 189, 384.

48. Mancino L.J., David P.D., Blankenship R.E. Kinetic and thermodynamics of the P870+ Qa~ P870+Qg reaction in isolated reaction centers from the photosynthetic bacterium Rhodopseu-domonas sphaeroides. Biochim. Biophys. Acta, 1984, 764, 46-54.

49. Carithers R.P., Parson W.W. Delayed fluorescence from R.viridis following single flashes. Biochim. Biophys. Acta, 1975, 194-211.

50. Halsey J.D., Parson W.W. Identification of ubiquinone as thesecondary electron acceptor in the photosynthetic apparatus of C.viridis. Biochim. Biophys. Acta, 1974, 347, 404.

51. Debus R.J., Okamura M.J., Feher G., Diaaotition and reconstitution of the H subunit from RCs of Rps. sphaeroides R-26, Biophis g.,1981,33,19a.

52. Wraight C.A. Iron-quinone interaction in the electron acceptor region of bacterial photosynthetic reaction centers. -FEBS Lett., 1978, 93, 283-288.

53. Butler W.F., Calvo R., Fredkin D.R., Isaacson R.A., Okamura1. P.

54. M.J., Peher G. The electronic structure of Fe T reaction centers from rhodopseudomonas sphaeroides. IIIï EPR measurement of the reduced acceptor complex. Biophys. J., 1984, 45, 947-973.

55. Butler W.P., Sohuston D., Shore H.B., Predkin D.R., Okamura2+

56. M.J., Peher G» The electronic structure of Fe in reaction centers from R.sphaeroides. I. Static magnetization measurements. Biophys. J., 1980, 32, 697-992.

57. Ham H.K., Austin R.H., Dismukes G.C. On the role of Pe2+ in bacterial photosynthesis. The effect of biosynthetic substitution of Pe2+ by Mn2+ on the electron transfer step Q~ Q2 Q-jQg in reaction centers. Biochim, Biophys. Acta, 1984, 765, 301-308.

58. Case G.D., Parson W.W. Thermodynamics of the primary and secondary photochemical reactions in C.vinosum. Biochim. Biophys. Acta, 1971, 253, 187-202.

59. Нокс П.П., Кононенко А.А., Рубин А.Б. Функциональная активность фотосштетических реакционных центров из R. sphaeroides при фиксированной гидратации препаратов. Бяоорганич. химия, 1979, 5, 879-885.

60. Nikolaev G.M., Knox P.P., Kononenko A.A., Grishanova N.P., Rubin A.B. Photo-induced electron transport and water state in R. rubrum chromâtophores. Biochim. Biophys. Acta, 1980, 590, 194-201.

61. Kononenko A.A., Nikolaev G.M., Knox R.R., Sadchikov A.P., Grishanova II.P., Rubin A.B. Water state and functional activity in photosynthetic membranes and reaction center preparations of purple bacteria. Studia biophysica, 1981, 84, 57-58.

62. Parson W.W., R.K.Clayton, R.J.Cogdell. Excited states of photosynthetic reaction centers at low redox potentials. Biochim. Biophys. Acta, 1975, 387, 265-278.

63. Cogdell R.J., Brune D.C., Clayton R.K. Effects of extraction and replacement of ubiquinone upon the photochemical activity of reaction centers and chromâtophores from Rps. sphaeroides, EBBS Lett., 1974, 45, 344-347.

64. Slooten L. Reaction center preparations of Rhodopseudomonas sphaeroides: energy transfer and structure. Biochim. Biophys. Acta, 1972, 256, 452-466.

65. Godik V.I., Borisov A.Y. Short-lived delayed luminescence of photosynthetic organisms.I. Nanosecond afterglows in purple bacteria at low redox potentials. Biochim. Biophys.Acta, 1979, 548, 296-308.

66. Godik V.I., A.Y.Borisov. Short-lived delayed luminescence of photosynthetic organisms. Biochim. Biophys. Acta, 1980, 590, 182-193.

67. Cogdell H.J., T.G.Monger, W.W.Parson. Carotenoid triplet states in reaction center from Rhodopseudomonas sphaeroides and Rhodo-spirillum rubrum. Biochim. Biophys. Acta, 1975, 408, 189-199.

68. Chidsey C.E.D., C.Kirmaier, D.Holten, S.C.Boxer. Magnetic field dependence of radical pair decay kinetics and molecular triplet quantum yield in quinon-depleted reaction centers.-Biochim. Biophys. Acta, 1984, 766, 424-437«

69. Clayton R.K., R.Sistrom. An absorbtion band near 800 assotiated with P870 in photosynthetic bacteria. Photochem. Photobiol. 1966, 5, 661-668.

70. Biophys. Acta, 1975, 387, 265-278.

71. Holten N.G., R.Van Grondelle, A.J.Hoff, L.N.M.Duysens. Changes of in vivo bacteriochlorophyll fluorescence yield in Rhodopseudomonas sphaeroides at low temperatures and low redox potential.FEBS Lett. 1976, 70, 185-190.

72. Clayton R.K. In: Photоsynthetic Organelles: Structure and function (Ed. by Miyachi S., Katoh S., Fujita Y and Shibata K.) Spetial Issue of Plant Cell Physiol., 1977, 3, 87-96.

73. Rademaker H. , A.J.Hoff. The balance between primary forward and back reactions in bacterial photosynthesis. Biophys. J. 1981, 34, 325-344.

74. Godik V.I., A.Yu. Borisov. Excitation trapping by different states of photosynthetic reaction centers. ЖВЭ Lett. 1977» 82, 355-358.

75. Годик В.И., Е.А.Когова, А.Ю.Борисов. Наносекундная рекомби-нащюнная люминесценция пурпурных бактерий. ДАН СССР. 1979, 249, 990-993.

76. Godik V«I#, E.A*Kotova, A.Yu.Borisov, Nanosecond recombination luminescence of purple bacteria. The lifetime temperature dependence in Rhodospirilum rubrum chromâtophore,

77. Photochem, Photobiophys.,4, 219-226, 1982.

78. Blankenship R.E., T.J.Schaafsma, W.W.Parson. Magnetic field effects on radical pair intermediates in bacterial photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta. 1977, 461, 297-305.

79. Hoff A.J., H.Rademaker, R.Van Grondelle, L.N.M.Duysens. On the magnetic field dependence of the yield of the triplet state in reaction centers of photosynthetic bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1977, 460, 547-554.

80. Werner H.J., K.Schulten, A.Weller. Electron transfer and spin exchange contributing to the magnetic field dependence of the primary photochemical reaction of bacterial photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta. 1978, 502, 255-268.

81. Michel-Beyerle M.E*, H.Sheer ,A theoretical study on the time evolution on re combination yield anisotropy in photosinthetic reaction centers.

82. FEBS Letters, 100, 9-12, 1979.

83. Voznyak V.M., E.I.Elfimov, V.K.Sukovatitzina. Magnetic field effects of the fluorescence yield in reaction center preparations from Rhodopseudomonas sphaeroides R-26. Biochim. Biophys. Acta. 1980, 592, 235-239.

84. Hoff A.J. Magnetic field effects on photosynthetic reactions. Quart.Rev, Biophys. 1981, 14, 599-665.

85. Haberkorn R., M.E.Michel-Beyerle. On the mechanism of magnetic field effects in bacterial photosynthesis. Biophys. J. 1979, 26, 489-498.

86. Boxer S.C., C.E.D.Chidsey, M.C.Roelofs. » Dependence of the3

87. P yield formation of the value of magnetic field, Ann., Rev.yhis.Chem., 34,1983,389-417.

88. Haberkorn R., M.E.Michel-Beyerle, R.A.Marcus. On spin-exchange and electron-transfer rates in bacterial photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, 76, 4185-4188.

89. Akhmanov S.A., A.Yu. Borisov, R.V.Danielins, R.A.Gadonas,

90. U.S.Kozlowski, A.S.Piskarskas, A.P.Raz^ivin, V.A.Shuvalov. One-and two-photon picosecond processes of electron transfer among the porphyrin molecules in bacterial reaction centers. FEBS Lett. 1980, 114, 'N 1, 149-152.

91. Shuvalov V.A. , A.V.Klevanik. The study of state P870+ B800" in bacterial reaction center by selective picosecond and low-temperature spectroscopies. 1983, 160, 51-55.

92. Butler G. Kitajlma K. Energi transfer between photosystem 2 and photosystem 1 in chloroplasts, Biophim. Biophys. Acta, 396, 72-85, 1975.

93. Butler W.L. Biophysics of photosynthesis. Ann. Rev. Plant, Physiol. 1978, 20, 315-378.

94. Butler W.L., R.J.Strasser. Tripartite model for the photochemical apparatus of green plant photosynthesis. Proc. Natl.

95. Acad. Sci. USA. 1977, 74, 3382-3385.

96. Anderson J.M., N.R.Boardman, Fractionation of the photochemical systems of photosynthesis. I. Chlorophyll contents and photochemical activities of particles isolated from spinach chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta. 1966, 112, 403-421.

97. Bengis C., N.Nelson. Purification and properties of the photosystem I reaction center from chloroplasts. J.Biol. Chem. 1975, 250, 2783-2788.

98. Thornber J.P. Chlorophyll-proteins: light-harvesting and reaction centers of plantc. Am. Rev. Plant. Physiol. 1975, 26, 127-158.

99. Bengis C., N.Nelson. Subunit structure of chloroplast photosystem I reaction center. J. Biol. Chem. 1977, 252, 4564-4569.

100. Anderson J.M., J.C.Waldron, S.W.Thorne. Chlorophyll-protein complexes of spinach and barley thylakoids. Spectral characterization of six complezes resolved by an inproved electro-phoretic procedure. FEBS Lett. 1978, 92, 227-233.

101. Thornber J.P., J.P.Markweel, S.Reinman. Plant chlorophyllprotein complexes: recent advances. Photochem. Photo biol.1979, 29, 1205-1216.

102. Anderson J.M. Chlorophyll-protein complexes of higher plant thylakoids: distribution, stoichiometry and organization in the photosynthetic unit. EBBS Lett. 1980, 117, 327-331.

103. Mullet J.B., J.J.Burke, C.J.Arntzen. Chlorophyll-protein of photosystem I. Plant Physiol. 1980, 65, 814-822.

104. Mullet J.E., J.J.Burke, C.J.Arntzen. A developmental study of photosystem I peripheral chlorophyll proteins. Plant Physiol.1980, 65, 823-827.

105. Anderson В., J.M.Anderson. Lateral heterogeneity in the distribution of chlorophyll-protein complexes of the thylakoid membranes of spinach chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta. 1980, 593, 427-440.

106. Bose S. Chlorophyll fluorescence in green plants and transfer pathways in photosynthesis. Photochem. Photobiol. 1982, 36, 725-731.

107. Сулейманов С.Ю., А.А.Москаленко, Д.А.Алиев, Ю.Е.Ерохин. Состав и спектральные характеристики хлорофилл-белковых комплексов, выделенных из мембран хлоропластов пшеницы методом электрофореза. Физиология растений. 1983, 30, 557-562.

108. Kochubei S.M., T.M.Shachina, A.V.Ruban. Organization of pigment system of PSI particles from grana thylakoids. Photosyn-thetica. 1983, 17, 251-255.

109. Гуляев Б.А., В.Л.Тетенькин. Спектральная анизотропия хлоропластов, субхлоропластных частиц и пигмент-белковых комплексов. Биофизика Ш1$ I98X, 288-294.

110. Takabe Т., H.Ishikawa, S.Niwa, S.Itoh Electron transfer between plastocyanin and P700 in highly-purified photosystem I reaction center complex. Effect of pH, cations and subunit peptide composition. J.Biochem. 1983, 94, 1901-1911.

111. P. Клейтон, Фотосинтез, М.,Мир,1984, с.100.

112. Сох С.P., K.R.Muller. The organization of polypeptides in the photosystem I reaction center. Photosynthetica. 1983, 17, 422-425.

113. Haehnel W., A. Propper, H.Krause. Evidence for immediate electron donor of P700. Biochim. Biophys. Acta. 1979, 593, 384-399.

114. Bhardwaj R., K.O. Burkey, B.O.Tripathy, E.L. Gross. Effectof trypsin treatment of photosystem I, particles on the electron donation to P700. Plant. Physiol. 1982, 70, 424-429.

115. Aasa R., I.Bergstrom, T. Vanngard. On the interacteion and orientation of the iron-sulfer A and В centers in chloroplastsof higher plants. Biochim. Biophys. Acta. 1981, 637, 118-123.

116. Кренделева Т.Е., Н.И.Галашша, А.А.Кононенко, K.H.Тимофеев,

117. А.В.Кайрис, А.Б.Рубин. Фотоиндуцированный транспорт электронов и сопряженные процессы в обогащенных ФС1 дигитошшовых фрагментах хлоропластов гороха. Биохимвя, 1978, 43, I25I-I259.

118. Гуляев Б.А., Г.П.Кукарских, К.Н.Тимофеев, Т.Е.Кренделева, Фотохимические и спектральные свойства частиц, обогащенных реакционными центрами фотосистемы I. Биохимия. 1979, 44, 564-568.

119. Кок В. On the reversible absorbtion change at 705 nm in photo-synthetic organisms. Biochim. Biophys. Acta. 1956, 22, 399-401.

120. Кок B. Partial purification and determination of oxidation-reduction potential of the photоsynthetic chlorophyll complex absorbing at 700 nm. Biochim. Biophys. Acta. 1961, 48, 527-533.

121. Setif P., Mathis P. The oxidation-reduction potential of P700 in chloroplast lamellae and subchloroplast particles. Biochem. Biophys. 1980, v.204, 477-485,

122. Hijama T., Ke B. A new photosynthetic pigment "P430" its possible role as the primary electron acceptor of photosystem I. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1971, 68, 1010-1013.

123. Commoner B., Heise J.J., Townsend J. Light-induced paramagnetism in chloroplasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1956, 42, 710-718.

124. Warden J.T,, J.R.Bolton. Simultaneous optical and electron spin resonance detection of the primary photoproduct P700 in green plant photosynthesis, J. Amer. Chem. Soc, 1972, 94, 4351-4353.

125. Warden J.T., J.R, Bolton. Simultaneous quantitative comparison of the optical change at 700 nm (P700) and electron spin resonance siquals in system I of green plant photosynthesis. J. Amer. Chem. Soc. 1973, 95, 6435-6436.

126. Baker R.A., E.C.Weaver. A correlation of EPR spins with P700 in spinach subchloroplast particles. Photochem. Photobiol. 1973, 18, 237-244.

127. Norris J.R., H.Sheer, M.F, Druyan, J.J.Katz. An electron nuclear double resonance (END0R) study of the special pair model for photoreactive chlorophyll in photosynthesis, Proc. Natla Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4897,

128. Ke B., T. Ogawa» T.Hiyama, L.P.Vernon. Experimental determination of the molar differential extinction coefficient of P700. Biochim. Biophys. Acta. 1971, 226, 53-62.

129. Hiyama T., B.Ke. Difference spactra and extinction coefficient of P700. Biochim. Biophys. Acta. 1972, 267, 160-171»

130. Ke B. The rise time of photoreduction difference spectrum and oxidation-reduction potential of P430» Arch. Biochem. Biophys. 1972, 152, 70-77.

131. Shuvalov V.A., B.Ke, E.Dolan. Kinetic and spectral properties of the intermediary electron acceptor A^ in photoeystem Iî Subnanosecond spectroscopy. EBBS Lett. 1979, 100, 5-8.

132. Witt K., C.Wolff. Rise time of the absorbtion changes of chlorophyll a and carotenoides in photosynthesis. Z.Naturforcl1970, Teil B25, 387-388.

133. Malkin R., A.J.Bearden. Primary reactions of photosynthesis photoreduction of a bound chloroplast ferredoxin at low temperature as detected by RPR spectroscopy. Proc. Hatl. Acad. Sci. USA, 1971, 68, 16-19.

134. Hiyama T., B.Ke. A further study of P430: A possible primary electron acceptor of photosystem I. Arch. Biochim. Biophys.1971, 147, 99-108.

135. Lozier R.H., W.L.Butler. Redox titration of the primery electron acceptor of photosystem I in spinach chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta. 1974, 333, 460-464.

136. Ke B., H.Beinert. Evidence for the identy of P430 of photosystem I and chloroplast-bound iron-sulfur protein. Biochim.

137. Biophys. Acta. 1973, 305, 589-693. 176« Bearden A.J., Malkin R. The bound ferredoxin of chloroplasts A role as the primary electron acceptor of photosystem I. Biochim. Biophys. Res. Commun. 1972, 46, 1299-1305.

138. Malkin R. Photochemical properties of a photosystem I sub-chloroplast fragment. Arch. Biochem. Biophys. 1975, 169, 77-83.

139. Ke B., S.Salm, E.R.Shaw, H.Beinert. Further characterization of a photosystem II particle isolated from spinach chloroplasts by tryton treatment of the reaction center components. Biochim. Biophys. Acta. 1974, 347, 36-38.

140. Evans M.C.W., Tefler A., A.V.Lord. Evidence for the role ofa bound ferredoxin as the primary electron acceptor of photosystem I in spinach chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta. 1972, 267, 530-537.

141. Ke B., R.E.Hausen, H.Beinert. Oxidation-reduction potentials of bound iron-sulfur proteins of photosystem I. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1973, 70, 2941-2945.

142. Evans M.C.W., S.G. Reevs, R.Cammack. Determination of the oxidation-reduction potential acceptor complex of photosystem I in spinach chloroplasts. EEBS Lett. 1974, 49, 111-114.

143. Bearden A.J., Malkin R. Primary photochemical reactions in chloroplast photosynthesis. Q. Rev. Biophys. 1975, 7, 131-177.

144. Saner K., P.Mathis, S.Acker, J.A. van Best. Electron acceptors assosiated with P700 in Triton solubilized photosystem I partides form spinach chloroplasts. Biochim. Biophys* Acta. 503, 120-134.

145. Evans M.C.W., R.Cammack. The effect of the redox state on the bound iron-sulfur centers in spinach chloroplasts on the reversibility of P700 photooxidation at low temperatures. Biochim. Biophys. Res. Commun. 1975, 63, 187-193.

146. Mc Intoch A.C., Ghu M., J.R.Bolton. Plash photolysis electron spin resonance studies of the electron acceptor species at low temperatures in photosystem I of spinach subchloroplast particles. Biochim. Biophys. Acta. 1975, 376, 309-314.

147. Bolton J.R. Photosystem I photoreaotions In: Primary processes in Photosynthesis ( J.Barber, ed), Amsterdam: Elsevier, 1977, 187-202.

148. Захарова Н.И., Чибисов А.К. Перенос электрона в пигмент-белковом комплексе фотосистемы I. Докл. АН СССР, 1977, 237, 473-476.

149. Mathis Р., К.Saner, R.Remy. Rapidly reversible flash-inducted electron transfer in a P700 chlorophyll-protein complex isolated with SDS. FEBS Lett. 1978, 88, 275-278.

150. Wessels J.S.C., Spijkerboer F.W.J.M. Studies on P700 photo-oxidation and reduction in photosystem I subchloroplast particles. Biochim. Biophys. Acta. 1981, 638, 94-99.

151. Shuvalov V.A., E.Dolan, B.Ke. Spectral and kinetic evidence for two early electron acceptor in photosystem I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, 76, 770-773.

152. Frank H.A., J.Machnicki, P.Toppo. The orientation of the reaction center carotenoid triplet state of magnetic axis in chromatophores of Rhodopseudomonas sphaeroides with type. Photochem. and Photobiol. 1984, 39, 429-432.

153. Schenk С.C.f P.Mathis, M.Lutz. Triplet formation and triplet decay in reaction centers from the photosynthetic bacterium

154. Rhodopseudomonad sphaeroides. Photochem. and Photôbiol. 1984»39, 407-417.

155. ДанелюсЛ?., Динчюс Г., В.Кабелка, А. Пискарскас, А. Стабинис, Я. Ясевичюте." Параметрическое возбуждение света в пикосе-кундном диапазоне". Квантовая электроника, 4, 2379-2395, 1977.

156. Клеваник A.B., В.А.Шувалов, Ю.А.Матвеец, А.В.Шарков. Тшко-секундный двулучевой абсорбционный спектрометр". Квантовая электроника, 1983, 10, ¡Ь 3, 655-658.

157. Дикчгос Г., Э.Жилинскас, А.Пискарскас, В.Сируткайгис. "Статистические свойства и стабилизация пикосекувдного лазера на фосфатном стекле с частотой повторения 2 Гц". Квантовая электроника, 1979, 6, Jê 8, I6I0-I6I9.

158. Денкер Б.И., И.И.Ильичев, А.А.Малютин, П.П.Пашинин, Ю.И. Сер-доченко, Н.Я.Щелев. Генерация трехпикосекундных импульсов излучения в лазере на концентрированном неодим-фосфатном стекле". Квантовая электроника, 1982, 9, if 9, I840-I84I.

159. Жеряхйн А.Н., В.А.Коваленко, Г.Г.Крюков, Ю.А.Матвеец, С. Че-калин, О.Б.Шатберашвили. "Процесс формирования ультракоротких импульсов на иттрий-алюминиевом гранате с неодимом". Квантовая электроника, 1974, I, J5 2, 377.

160. Корваговский Б.Н., В.З.Пащенко, В.Б.Тусов, JI.Б.Рубин. "Автоматизированный импульсный флуоромегр высокого временного разрешения и чувствительности". Биологические науки, 1982,1. Jê II, I05-II2.

161. Вакуленко А.Н., П.Г.Крюков, Ю.А.Матвеец, В.И.Пантелеев,

162. Ю.В. Сенатский, А.И.Федосимов, В.Т.Юров. "Скоростной элекгро-оптический затвор на основе кристалла Д1ЩР". Квантовая электроника, 1974, I, В I, I38-I4I.

163. Демидов А.А., Г.М.Есаян, Я.Л.Калайдзидис. "Низковольтная система выделения одиночного светового импульса яз цуга пикосекундных импульсов". ПТЭ.

164. Кабелка В., А. Кутка, А. Пискарскас, В.Сшильгявичюс, Я.Се-вичуте. "Параметрическая генерация пикосекундных импульсов света с преобразованием энергии свыше 50%". Квантовая электроника, 1979, 6, В 8, 1735-1739.

165. Данелюс Р., А.Пискарскас, В.Спруткайгис. "Пикосекундные параметрические генераторы света и их применение в абсорбционной спектроскопии быотропротекающих процессов". Квантовая электроника, 1982, 9, В 12, 2491-2501.

166. Alfano R.R., L.L.Hopr, S.L.Shapiro. Electronic mechanism for production of self-phase modulation. Phys. Rev. 1972, 6, U 1, 433-436.

167. Матвеец Ю.А., Д.Н.Никогосян, B.ÏÏ.Кабелка, А.G.Пискарскас. "Эффективная генерация второй гармоники в кристалле КДР при накачке пикосекундными импульсами лазера на с частотой повторения 0,5 Гц". Квантовая электроника, 1978, 5, 13 3, 664-666.

168. Гадонас Р., Р.Данелюс, А.Пискарскас. "Абсорбционный спектрометр пикосекундного разрешения на базе парамегрических генераторов света и микро-ЭВМ." Квантовая электроника, I98I,8*Jfc 3, 669-671.

169. Вендленд П. "Свегочувстгительный датчик в виде пары кремниевый фотодиод-операционный усилитель". Электроника, JS II, 57-58,1971.

170. Бирмонтас А., Кучугис Р., А.Пискарскас, В.Стильгявичус,

171. А. Стабинис. "Флуктуации энергии и длительности моноимпульсного пикосекундного лазера на AviP' f/ot Квантовая электроника. 1978, 5, № 12, 2622-2624.

172. Ларионцев Е.Г., В.Н.Серкин. "Влияние длины резонатора на динамику генерации ультракоротких импульсов света". Квантовая электроника. 1974, I, 2166-2170.

173. Аллен Л., Дк. Эберли. "Оптический резонанс и двухуровневые атомы". М., Мир, 1978.

174. Ханин И. "Динамика квантовых генераторов". М., Сов. радио, 1975.

175. Porter G., Tredwell C.J., G.P.W. Searle., Picosecond time-resolved energi transfer in porphiridium cruentum, Bio-chim. Biophys. Acta, 1978, v.501, p.232.