Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Первичная лекарственная резистентность вируса гепатита В

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Первичная лекарственная резистентность вируса гепатита В"

Кг

V/ /

(7^

Кожаиовя Татьяна Викторовна

Первичная лекарственная резистентность вируса гепатита В 03.02.02. - вирусология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 ЗЛЕН 7070

1 * 1 ¿0

Москва - 2010

004618730

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Шахгильдян Иосиф Васильевич

доктор биологических наук, доцент Карганова Галина Григорьевна

Ведущая организация

Федеральное государственное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-

исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора

Михайлов Михаил Иванович Кюрегян Карен Каренович

Защита диссертации состоится 010 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН (142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН

Автореферат разослан Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук O.A. Медведкина

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Вирусный гепатит В (ГВ) является глобальной медицинской и социальной проблемой. Это обусловлено его повсеместным распространением среди различных групп населения, многообразием клинических форм и исходов (включая цирроз печени (ЦП) и первичный рак печени), стабильно-высокими показателями заболеваемости (И.В. Шахгильдян, М.И. Михайлов, Г.Г. Онищенко, 2003).

В терапии хронического гепатита В (ХГВ) применяются интерфероны-а (стандартные, пегилированные) и аналоги нуклеоз(т)идов - ингибиторы обратной транскриптазы (ИОТ).

Длительная терапия аналогами нуклеоз(т)идов ассоциирована с риском формирования лекарственной устойчивости ВГВ, и вследствие, этого с прогрессированием течения заболевания (Р. "Й^Ьйпап; 2004, Т. УатагЬап, 2007).

Продолжительная псрсистспция генома вируса гепатита В (ВГВ) в инфицированных гепатоцитах и высокая частота возникновения спонтанных мутаций в вирусном геноме являются основой для селекции мутантных вариантов ВГВ, ассоциированных с формированием лекарственной устойчивости к ИОТ. Показано, что мутации в гене полимеразы ВГВ, связанные с лекарственной резистентностью, могут возникать до начала проведения противовирусной терапии (ПВТ) ИОТ, и инфицирование такими вариантами вируса может приводить к формированию первичной лекарственной устойчивости (Я. Со1оппо, 2006; М. СЬапу, 2007).

Выявление вариантов ВГВ с мутациями в гене полимеразы (Р-ген), ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости до начала проведения лечения, является клинически важным аспектом при ведении пациентов, нуждающихся в терапии аналогами нуклеоз(т)идов. Анализ мутантных вариантов ВГВ, связанных с лекарственной резистентностью, позволит предупредить обострение заболевания у тагах пациентов, связанное с неэффективностью противовирусных препаратов. При высоком риске прогрессирования вирусного ГВ, особенно у пациентов с коинфекцией ВГВ/ВИЧ, ранее выявление устойчивых к терапии вариантов ВГВ является наиболее значимым. Используемый для детекции мутантных вариантов ВГВ метод должен быть достаточно чувствительным, чтобы применяться как до начала терапии нуклеоз(т)идными аналогами, так и в процессе лечения, когда уровень виремии может

быть очень низким и/или когда мутантные варианты ВГВ присутствуют в общей вирусной популяции в меньшей доле (.). Нео, 2008; С. Озю\уу, 2006).

Данные о частоте первичной лекарственной резистентности ВГВ среди пациентов с острым и хроническим ГВ ограничены, поэтому в настоящее время все больше внимания уделяется изучению распространенности мутантных вариантов ВГВ среди ВГВ-инфицироваиных пациентов, не получающих терапию ИОТ.

Эпидемиологические и вирусологические аспекты первичной лекарственной устойчивости ВГВ к терапии аналогами нуклеоз(т)идов среди ВГВ-инфицированных пациентов в Российской Федерации (РФ) ранее не изучались. Отсутствуют сведения о спектре мутаций, приводящих к развитию лекарственной устойчивости ВГВ, об их распространенности в регионах РФ с различной интенсивностью циркуляции ВГВ.

В связи с этим актуальным является определение эпидемиологических и вирусологических характеристик вариантов ВГВ, устойчивых к терапии аналогами нуклеоз(т)идов, среди пациентов, ранее не получавших ПВТ. Вышеизложенное определило цели и задачи исследования.

Цель исследования

Изучить распространенность вариантов ВГВ с наличием мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью, среди инфицированных ВГВ лиц, ранее не получавших противовирусную терапию аналогами нуклеоз(т)идов, в регионах Российской Федерации с различной степенью интенсивности циркуляции ВГВ.

Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:

1. определить частоту выявления мутаций в Р-гене ВГВ, связанных с лекарственной устойчивостью среди пациентов с ВГВ-моноинфекцией и ВГВ/ВИЧ-коинфекцией, ранее не получавших терапию аналогами нуклеоз(т)идов;

2. охарактеризовать аминокислотные замены в Р-гене ВГВ;

3. сравнить вирусологические и клинико-биохимические показатели у лиц с наличием и отсутствием первичной лекарственной устойчивости ВГВ;

4. выбрать метод скрининга мутаций в Р-гене ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости к аналогам нуклеоз(т)идов;

5. разработать алгоритм выявления лекарственной устойчивости ВГВ для оптимизации выбора противовирусного препарата.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Частота выявления первичной лекарственной устойчивости ВГВ к аналогам нуклеоз(т)идов в группе пациентов с ВГВ-моноинфекцией составила 6,2% (17/273), с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией - 10,0% (3/30). Анализ распространенности мутантных вариантов ВГВ в изучаемых регионах Российской Федерации показал, что наибольшее число случаев первичной лекарственной резистентности ВГВ регистрируется среди ВГВ-инфицированных пациентов Московский области (15%; 9/60, р<0,01) в сравнении с другими регионами, что, по-видимому, связано с внедрением в данном регионе в программу противовирусной терапии ХГВ аналогов нуклеоз(т)идов.

2. При анализе нуклеотидных последовательностей гена полимеразы ВГВ определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены (М2041, АШЭ, Т1841, Ь199\У, А194Т) и потенциально значимые мутации -Т184Р, Ы798, Б213Р, М204Ь, Ь82Р, 8213У, Ы798, У214У) - замены в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в научной литературе.

3. При выборе метода скрининга мутаций в гене полимеразы ВГВ установлена более высокая информативность прямого секвенирования, тогда как коммерческий тест Г№Ю-1лРА БЯ \2 более чувствителен, поскольку выявляет мутантные варианты ВГВ, присутствующие в общей вирусной популяции в минорном количестве (около 5%). Однако тест ГЫМО-ПРА БЯ \2 имеет ограниченный спектр выявляемых мутаций.

Научная новизна работы

Впервые в регионах Российской Федерации, различающихся по интенсивности циркуляции ВГВ, определена частота выявления вариантов ВГВ с наличием мутаций, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью к аналогам нуклеоз(т)идов, среди ВГВ-инфицированных и ВГВ/ВИЧ-коинфицированных пациентов, не получавших противовирусной терапии.

Впервые при анализе аминокислотных последовательностей домена обратной транскриптазы изолятов ВГВ, выделенных на территории Российской Федерации, определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены (М2041, А181Б, Т1841, L199W, А194Т) и замены, в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в научной литературе (Т184Р, Ы798, 8213Р, М204Ь, Ь82Р, 8213У,

L179S, V214Y). Данные мутации рассматриваются как потенциально значимые, поскольку находятся в позициях гена полимеразы, имеющих решающие значение для диагностики лекарственной устойчивости ВГВ.

Впервые при выборе метода скрининга с целью обнаружения мутаций в гене полимеразы ВГВ установлена более высокая информативность прямого секвенирования и высокая чувствительность коммерческого теста INNO-LiPA DR v2.

Впервые на основании проведенного исследования разработаны два алгоритма выявления мутаций в гене полимеразы ВГВ среди пациентов с ВГВ-инфекцией:

- для проведения научных скрининговых исследований;

- для оптимизации выбора аналога нуклеоз(т)идов в клинической практике с целью уменьшения прогрессирование ХГВ и предупреждения развитие тяжелых осложнений.

Практическая значимость и внедрение результатов работы

Результаты, полученные в процессе работы, позволили разработать и рекомендовать в клиническую практику алгоритм выявления мутаций в Р-гене ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости, который позволит оптимизировать выбор противовирусного препарата (аналога нуклеоз(т)идов) у пациентов с ВГВ-инфекцией.

Данпый алгоритм внедрен и активно используется в научно-исследовательской работе отдела вирусных гепатитов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.

Проблема и методы диагностики лекарственной резистентности ВГВ к аналогам нуклеоз(т)идов среди ВГВ-инфицированных пациентов изложены в проекте методических рекомендаций Министерства здравоохранения и социального развития РФ «Выявление мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью вируса гепатита В среди пациентов с коинфекцией вируса иммунодефицита человека и вируса гепатита В».

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на международном конгрессе по вирусным гепатитам (13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (март 2009 г., Вашингтон), на конференции молодых ученых Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (апрель 2009 г., Москва), на Российской научно-практической конференции с международным участием ((Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (май 2009

г., Москва), на научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии» (ноябрь 2009 г., Москва).

Апробация диссертации состоялась 30 июля 2010 г. на заседании Ученого совета Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (протокол №1 от 30 июля 2010 г.).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 статьи - в реферируемых журналах ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 121 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 7 отечественных и 123 зарубежных источников. Диссертационная работа иллюстрирована 30 таблицами, 13 рисунками.

Собственные исследования 1. Материалы исследования

Были исследованы образцы сывороток крови, полученных or 459 пациентов с ВГВ-моноинфекцией (острый гепатит В (ОГВ) и ХГВ) из регионов РФ, различающихся уровнями заболеваемости ГВ, т.е. с разной степенью интенсивности циркуляции ВГВ среди населения (Московская обл., Саратовская обл., Тамбовская обл., Республика Саха (Якутия), Республика Тыва).

При проведении сбора образцов сывороток крови на каждого пациента заполнялась разработанная нами анкета, в которой были отражены основные демографические и клинические данные (возраст, пол, диагноз и дата его установления, показатели функционального состояния печени - аланинаминотрансфераза (AJIT), аспартатаминотрансфераза (ACT), а так же наличие/отсутствие ПВТ). Всеми пациентами было подписано информированное согласие.

Основные данные, полученные при анализе анкет (предполагаемая длительность заболевания, среднее значения уровней активности AJIT и ACT), представлены в

таблице 1. Ни один из пациентов не получал ПВТ нуклеоз(т)идными аналогами, направленную против ВГВ.

Таблица 1. Характеристика обследованных больных с ВГВ-моноипфекцией, N=459

(М±8П)

м/ж Средний возраст, годы Предполагаемая длительность заболевания, годы АЛТ, Е/л (N=20-40 Е/л) АСТ, Е/л (N=20-40 Е/л)

1,2:1 40,2±14,8 8,5±4,2 209,1±51,6 139,5±41,2

В качестве второй анализируемой группы были исследованы образцы сывороток крови, полученные от 590 ВИЧ-инфицированных пациентов, как группы больных с высоким риском инфицирования ВГВ, проживающих в Московской обл., Свердловской обл., Саратовской обл., Республики Тыва и Вологодской обл.. Среди обследованных пациентов было 70,2% (414/590) мужчин и 29,8% (176/590) женщин. Соотношение мужчин и женщин в исследуемой когорте пациентов - 2,4:1. Средний возраст исследуемых составил 37,7±7,0 лет. Ни один из пациентов в данной группе не получал ПВТ нуклеоз(т)идными аналогами, направленную против ВГВ и против ВИЧ.

Также нами были исследованы образцы сывороток крови (N=644), полученные от «условно» здорового населения Республики Тыва - региона, характеризующегося высоким уровнем заболеваемости ГВ, т.е. с высокой степенью интенсивности циркуляции ВГВ среди населения. В исследование были включены лица следующих возрастных групп: 15-29 лет, 30-39 лет, 40-49 лет, 50-59 лет и старше 60 лет. Среди обследованных лиц соотношение мужчин и женщины составило 1:3 (25,8%, 166/644 и 74,2%, 478/644 соответственно).

2. Методы исследования Серологические маркеры инфицирования ВГВ (HBsAg, анти-НВс и НВеА§) определяли с использованием следующих иммуноферментных тест-систем в соответствии с инструкцией производителя: «ДС-ИФА-НВзА§-0,01», НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород; «ДC-ИФA-HBsAg-0,01-подтверждающая», НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород, для подтверждения в реакции нейтрализации позитивных результатов выявления HBsAg; «ДС-анти-НВс», НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород; «ДС-ИФА-HBeAg», НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород.

Во всех образцах сывороток крови, полученных от пациентов с ВГВ-инфекцией, положительных по анти-НВс и ИВзу^, определяли ДНК ВГВ в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами к консервативному участку перекрывающихся генов Б и Р, кодирующих поверхностный белок и ДНК-полимеразу ВГВ (табл. 2).

Таблица 2. Олигонуклеотиды, используемые для детекции ДНК ВГВ и амплификации домена обратной трапскриптазы полимеразы ВГВ

Участок генома ВГВ Последовательности Положение Направление

S/P-ген 5' - cct get ggt ggc tcc agt tc - 3' Внешний Прямой

S/P-ген 5' - cca caa ttc ktt gac ata ctt tcca — 3' (k=g/t) Внешний Обратный

S/P-ген 5' - gca cac gga att ccc gag gac tgg gga ccctg-3' Внутренний Прямой

S/P-ген 5' - gac acc aag ctt ggt tag ggt tta aat gta tacc-3' Внутренний Обратный

Выделение нуклеиновых кислот из образцов сывороток крови проводили методом экстракции фенол-хлороформом с помощью набора для выделения ДНКУРНК (ООО НПФ «ЛИТЕХ») и методом сорбции нуклеиновых кислот на мембране - QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) в соответствии с инструкцией производителя. Чувствительность выявления ДНК ВГВ в данной реакции составляла не менее 100 копий/мл по результатам тестирования серии предельных разведений образцов с известной концентрацией ДНК ВГВ.

Условия для обоих раундов ПЦР были следующими: 94°С - 2 мин., затем 35 циклов: денатурация при 94°С - 45 сек., отжиг при 55°С - 45 сек. и удлинение цепи при 72°С - 1 мин. 30 сек. Полученный в ходе ПЦР продукт величиной 713 п.н. определяли в электрофорезе в агарозном геле (1,5%) в TBE.

Дяя полученных в ПЦР амгошконов определяли нуклеотидную последовательность с целью выявления возможных мутаций в этом участке, связанных с развитием лекарственной устойчивости ВГВ.

Секвенирование данного участка генома ВГВ позволило также достоверно определить генотип ВГВ. Продукт амплификации с праймерами к S-гену величиной 713 п.н. вырезали из геля и выделяли из агарозы с помощью набора QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN). Секвенирование проводили с использованием набора GenomeLab Methods

Development kit (Beckman Coulter) в анализаторе CEQ 8800 (Beckman Coulter). Полученные последовательности сравнивали с референсными последовательностями, депонированными в базе данных GenBank, соответствующими «дикому типу» ВГВ и мутантным формам с подтвержденной лекарственной устойчивостью к пяти нуклеоз(т)идным аналогам, применяемым в настоящее время для терапии ВГВ-инфекции: ламивудину, адефовиру, энтекавиру, телбивудину, тенофовиру. Филогенетический анализ последовательностей ВГВ проводили с помощью программы Mega 4.0.

В соответствии с задачами исследования осуществляли сравнительное испытание двух методов определения генотипа ВГВ и мутаций в гене полимеразы ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости к аналогам нуклеоз(т)идов -INNO-LiPA HBV DR v2, INNO-LiPA HBV geriotyping (INNOGENETICS) и метода прямого секвенирования с использованием набора GenomeLab Methods Development kit (Beckman Coulter) в анализаторе CEQ 8800 (Beckman Coulter).

Постановку с наборами INNO-LiPA HBV DR v2 и INNO-LiPA HBV genotyping проводили в соответствии с инструкцией производителя на автоматической системе AutoBlot 3000Н (MedTec).

Сопоставление результатов, полученных в тестах INNO-LiPA HBV DR v2, INNO-LiPA HBV genotyping и методом прямого секвенирования участка перекрывающихся генов S и Р ВГВ, проводили для образцов сывороток крови от пациентов с диагностированным ХГВ, как получавших аналоги нуклеоз(т)идов (п=1), так и не получавших ПВТ (п=38). Все образцы сывороток крови, полученные от данных пациентов, тестировали однократно, параллельно в тестах INNO-LiPA HBV DR v2, INNO-LiPA HBV genotyping и методом прямого секвенирования.

Методы статического анализа результатов исследований

Полученные в работе результаты подвергали статистической обработке по общепринятым методикам с использованием вариационной статистики с помощью стандартной программы EXCEL 2003 и программы статистической обработки данных GraphPadPism 4. Статистическая обработка данных включала: определение средних величин показателей (М), вычисление значений квадратичного отклонения (SD), выявление достоверности различий средних значений показателей в сравниваемых группах с использованием t-критерия Стьюдента, критерия Фишера и х2-квадрата с

поправкой Йетса (различия оценивались как достоверные при вероятности 95% - р <0,05).

Результаты и их обсуждение Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ в регионах Российской Федерации среди ВГВ - моноипфицированных пациентов

С целью выявления мутантных вариантов ВГВ, устойчивых к терапии аналогами нуклеоз(т)идов, в исследование были включены пациенты с ВГВ-моноинфекцией из регионов РФ, различающихся уровнями заболеваемости ГВ, т.е. с разной интенсивностью циркуляции ВГВ (табл. 3.). На основании данных о заболеваемости ОГВ и ХГВ, предоставленных ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора, в качестве регионов с низкой интенсивностью циркуляции ВГВ была выбрана Московская обл., со средней - Саратовская обл. и Тамбовская обл., и с высокой - Республика Тыва и Республика Саха (Якутия).

Таблица 3. Характеристика пациентов с ВГВ-инфекцией (N=459)

Регионы РФ п Возраст, годы М:Ж АЛТ, Е/л (N=20-40 Е/л) АСТ, Е/л (N=20-40 Е/л) ДНК ВГВ, п(%)

Московская область 100 41,б±17,5 2,6:1 и.д. н.д. 60 (60%)

Тамбовская область 115 40,2±15,4 2:1 166±24,3 132±19,7 79 (68,7%)

Саратовская область 49 40,2±15,1 1,8:1 93,41:26 87,4±29,4 43 (87,8%)

Республика Саха (Якутия) 58 37,3±13,3 1,2:1 94,3±25,3 84,5±21,2 19 (32,6%)

Республика Тыва 137 37±13,6 1:1 208,5±40. н.д 40 (29,2%)

и. д. - нет данных

При обследовании 459 пациентов с ВГВ-моноинфекцией HBsAg был выявлен в 95,2% (437/459) случаях, положительный результат по определению анти-НВс был получен в 100% случаях. ДНК ВГВ выявлена у 24 Г пациента, имевших анти-НВс и HBsAg с ВГВ-моноинфекцией. Полученные результаты позволили сформировать окончательную группу пациентов с репликацией ВГВ для изучения распространенности первичной лекарственной устойчивости ВГВ - 241 пациент с моноинфекцией ВГВ, ранее не получавших терапии аналогами нуклеоз(т)идов.

Прямое секвенирование фрагмента генома ВГВ величиной 713 п.н., соответствующего перекрывающимся участкам генов Б и Р ВГВ, позволило определить генотип ВГВ и аминокислотную последовательность домена обратной транскриптазы полимеразы ВГВ для всех изолятов вируса, выделенных от пациентов с ВГВ-моноинфекцией. Распределение генотипов ВГВ среди ВГВ-моноинфицированных пациентов было следующим: генотип Б был выявлен у 89,6% (216/241) пациентов, генотип А - у 8,3% (20/241) и генотип С - у 2,1% (5/241).

Таким образом преобладающим в исследуемой группе был генотип Б ВГВ, а генотипы А и С - минорными.

При анализе аминокислотных последовательностей гена полимераза ВГВ были выявлены 2 группы мутаций: значимые аминокислотные замены (мутации, описанные в литературе как обуславливающие развитие лекарственной устойчивости к терапии нуклеоз(т)идными аналогами) и замены в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в литературе. Данные мутации рассматриваются как потенциально значимые, поскольку находятся в позициях Р-гена, имеющих решающие значение для диагностики лекарственной устойчивости.

У 7 (2,9%) из 241 обследованных пациентов с ВГВ-моноинфекцией в геноме вируса были выявлены значимые аминокислотные замены и у 8 (3,3%) - потенциально значимые (табл. 4,5). Общая частота выявления мутаций ВГВ, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью в данной когорте пациентов составила 6,2% (15/241).

Таблица 4. Значимые аминокислотные замены в гене полимеразы ВГВ (N=241)

Результаты выявления мутаций в гене полимеразы ВГВ Аналоги нуклеоз(т)идов

Аминокислотные замены п(%)

АШБ 2(0,8%) адефовир

Т1841 4 (1,7%) энтекавир

И9Ш 1 (0,4%) телбивудил

Среди обследованных пациентов с моноинфекцией ВГВ в одном случае (1/241; 0,4%) была обнаружена замена треонина на пролин в положении 184 (Т184Р). По данным литературы, в этом положении в Р-геие ВГВ описаны замены треонина на изолейцин, лейцин, аденин и серии, которые обуславливают формирование резистентности к терапии энтекавиром. У 3/241 (1,2%) пациентов с ВГВ-моноинфекцией в геноме ВГВ

была выявлена замены метиошша на лейцин в позиции 204, локализованная в УМОО-

мотиве гена полимеразы, который является определяющим в развитии лекарственной

устойчивости к терапии пуклеоз(т)идными аналогами. В литературе описаны другие

замены в положении 204 (М2041/У/8), связанные с развитием невосприимчивости к

ламивудину, эптекавиру, телбивудипу и тенофивиру (табл.5).

Таблица 3. Результаты выявления потенциально значимых аминокислотных замен в гене полимеразы ВГВ (N=241)

Определенные потенциально значимые аминокислотные замены Аминокислотные замены, описанные в литературе Аналоги пуклеоз(т)идов

Т184Р 1/241 (0,4%) T184S/A/I энтекавир

L179S 1/241 (0,4%) L179P ламивудин

S213F 1/241 (0,4%) S213T ламивудин

M204L 3/241 (1,2 %) M204I/V/S ламивудин, энтекавир, телбивудин, тенофовир

L82P 1/241 (0,4%) L82M ламивудин

S213 Y 1/241 (0,4%) S213T ламивудин

В rene полимеразы ВГВ были выявлены еще 3 потенциально значимых аминокислотных замены: в 1 (0,4%, 1/241) случае - замена серина на фенилаланин в положении 213 (S213F), у 1 (0,4%, 1/241) пациента - замена лейцина на серии в положении 179 (L179S) и в 1 (0,4%, 1/241) случае - замена лейцина на пролин в положении 82 (L82P).

Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ в регионах Российской Федерации среди ВГВ/ВИЧ-коинфнцированных пациентов

На первом этапе в образцах сывороток крови ВИЧ-ипфицированных пациентов были определены маркеры инфицирования ВГВ. При обследовании 590 пациентов с ВИЧ-инфекцией HBsAg был определен в 21,5% (127/590) образцах, анти-НВс - в 47,1% (278/590). ДНК ВГВ выявлена у 30 пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Полученные результаты позволили сформировать группу пациентов с репликацией ВГВ для изучения распространенности первичной лекарственной устойчивости ВГВ -

30 пациентов с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией, ранее не получавших терапии аналогами нуклеоз(т)идов.

Прямое секвенирование фрагмента генома ВГВ величиной 713 пл., соответствующего перекрывающимся участкам генов S и Р ВГВ, позволило определить генотип ВГВ и аминокислотную последовательность домена обратной транскригггазы полимеразы ВГВ для всех изолятов вируса, выделенных от пациентов с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией.

У ВГВ/ВИЧ-инфицированных пациентов были выявлены следующие генотипы ВГВ: генотип D - являлся доминирующим (96,7%; 29/30), генотип А - минорным (3%; 1/30).

Среди обследованных 30 пациентов с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией в 3,3% (1/30) случаев в гене полимеразы ВГВ была выявлена значимая аминокислотная замена и в 6,7% (2/30) -потенциально значимая. Общая частота выявления мутаций, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью ВГВ в данной группе пациентов составила 10% (3/30). Выявленная нами клинически значимая аминокислотная замена представлена мутацией в YMDD-мотиве гена полимеразы ВГВ - M204I и связана с устойчивостью к нескольким противовирусным препаратам - ламивудину, энтекавиру, телбивудину и тенофивиру.

В 1 (3,3%; 1/30) случае наблюдалась замена лейцина на серин в положении 179 (L179S). M.W. Li с соавт., 2007 описали в положении 179 замену лейцина на пролин (L179P), ассоциированную с развитием лекарственной устойчивости ВГВ при терапии ламивудином. У одного пациента с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией в гене полимеразы ВГВ была выявлена замена валина на тирозин в положении 214 (V214Y). В этом положении гена полимеразы ВГВ V. Soriano, 2007 описана замена валина на аланин (V214A), связанная с развитием лекарственной устойчивости к адефовиру. На основании этого выявленные нами замены в позициях 179 и 214 отнесены к потенциально значимым.

Частота выявления маркеров инфицирования ВГВ и распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ среди «условно» здорового населения гиперэндемичного региона (Республика Тыва)

Были исследованы образцы сывороток крови, полученные от 644 жителей Республики Тыва. HBsAg был выявлен в 9% (58/644) образцов, анти-НВс - 70% (451/644) и ДНК ВГВ - в 5% (32/644). Необходимо отметить, что в одном случае был определен также маркер репликации ВГВ - HBeAg (0,2%; 1/644).

Филогенетический анализ последовательностей ВГВ показал преобладание циркуляции генотипа Б, субтипов ау\у2, ауив ВГВ на территории Республики Тыва -31/32 (96,9%). В 1 случае был определен генотип А ВГВ (3,1%; 1/32).

Полученные результаты свидетельствуют о высоком уровне инфицирования ВГВ среди «условно» здорового населения Республики Тыва.

Прямое секвенирование фрагмента генома ВГВ величиной 713 пл., соответствующего перекрывающимся участкам генов Б и Р ВГВ, позволило определить аминокислотную последовательность гена полимеразы ВГВ для всех 32 изолятов вируса, выделенных от лиц с ВГВ-инфекцией из Тывы.

Среди обследованных 32 лиц с ВГВ-инфекцией в гене полимеразы ВГВ в 2 (6,3%) случаях обнаружены значимые аминокислотные замены, ассоциированные с формированием лекарственной устойчивости ВГВ при терапии аналогами нуклеоз(т)идов (табл. 6).

Таблица 6. Значимые аминокислотные замены в гене полимеразы ВГВ, ассоциированные с лекарственной устойчивостью к ИОТ (N=32)

Результаты выявления мутаций в гене полимеразы ВГВ Аналоги нуклеоз(т)идов

Аминокислотная замена п(%)

М2041 1/32 (3,1%) ламивудин, энтекавир, телбивудин, тенофовир

- А194Т 1/32 (3,1%) тенофовир

В одном случае (1/32; 3,1%) определена классическая замена метионина на изолейцин в позиции 204, локализованная в каталитическом С-сайте обратной транскриптазы ВГВ, в активном его участке - УМЕЮ-мотиве, который является определяющим в развитии лекарственной устойчивости ВГВ к терапии нуклеоз(т)идными аналогами (ламивудину, энтекавиру, телбивудину и тенофивиру). У 1 (3,1%) пациента в гене полимеразы ВГВ была определена еще одна аминокислотная замена, которая также описана в литературе и ассоциирована с развитием устойчивости к тенофовиру.

Эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-биохимичсская характеристика пациентов с наличием и отсутствием первичной лекарственной резистентности ВГВ в регионах Российской Федерации

Частота выявления мутаций, связанных с первичной лекарственной устойчивостью ВГВ, учитывая все выявленные в данном исследовании как значимые, так и потенциально значимые замены в гене полимеразы ВГВ, в группе пациентов с ВГВ-моноинфекцией составила 6,2%, с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией - 10,0% (табл.7). При этом статистически достоверные отличия между двумя обследованными группами пациентов отсутствовали (р>0,05).

Таблица 7. Частота выявления мутаций, связанных с первичной лекарственной резистентностью ВГВ в Российской Федерации

Группы пациентов N Значимые аа* замены, п(%) Потенциально значимые аа замены, п(%) Общая частота выявления мутаций, п(%)

ВГВ-моноинфекция 273 9 (3,3%) 8 (2,9%) 17(6,2%)

ВГВ/ВИЧ-коинфекция 30 1 (3,3%) 2 (6,7%) 3 (10,0%)

*аа - аминокислотные замены

Анализ распространенности мутантных вариантов ВГВ в исследованных регионах

РФ показал, что наибольшее число случаев выявления мутаций ВГВ, связанных с

первичной лекарственной резистентностью ВГВ, регистрируются среди пациентов

Московский обл. (9/60; 15%) в сравнении с другими регионами (р<0,01) (табл. 8).

Таблица 8. Частота выявления мутаций, связанных с первичной лекарственной резистентностью ВГВ в изучаемых регионах Российской Федерации

Регионы РФ ДНК ВГВ, п Частота выявления мутаций в Р-гене ВГВ, п(%)

Московская область 60 9/60(15%)

Тамбовская область 79 2/79 (2,5%)*

Саратовская область 43 4/43 (9,3%)

Республика Саха (Якутия) 19 0/19 (0%)

Республика Тыва 40 2/40 (5%)*

*р<0,01

По-видимому, это связано с более длительным периодом применения препаратов НОТ в Московской обл. Очевидно, что в результате длительного применения противовирусных препаратов в регионе могут более интенсивно циркулировать мутантные варианты ВГВ, отобранные под селективным действием терапии, что в свою очередь, повышает вероятность инфицирования такими мутантными вариантами ВГВ.

Все случаи выявления лекарственно-устойчивых вариантов ВГВ были ассоциированы с генотипом Б, наиболее распространенным генотипом ВГВ, циркулирующим на территории РФ.

Для определения возможного влияния первичной лекарственной устойчивости на клиническое течение ХГВ анализировали длительность заболевания, активность печеночных трансаминаз, наличие цирроза печени у пациентов с выявленными мутациями, ассоциированными с лекарственной резистентностью, и у пациентов, не имеющих первичной лекарственной устойчивости ВГВ (табл. 9).

Выявлено отсутствие статистически значимых различий показателей у пациентов с наличием и отсутствием мутаций, связанных с первичной лекарственной устойчивостью ВГВ. Однако все пациенты, инфицированные лекарственно-устойчивым вариантом ВГВ, имели ХГВ минимальной степени активности (АЛТ до 2 норм).

Таблица 9. Клинико-биохимическая характеристика пациентов с ВГВ-мопоинфекцией с наличием (группа А) п отсутствием первичной лекарственной устойчивости ВГВ (группа В), N=137

Показатели Группа А, п=13 Группа В, п=124

Средняя длительность Заболевания (ХГВ), годы 4,5 4

АЛТ, Е/л (N=20-40 Е/л) 74+31,9 87,75±36,8

ACT, Е/л (N=20-40 Е/л) 39±10,6 36,35±16,4

ХГВ минимальной степени активности (АЛТ до 2 норм) 13 (100%)* 93 (75%)*

ХГВ средней степени активности (АЛТ от 2 до 5 норм) 0 27(21,8%)

ХГВ высокой степени активности (АЛТ более 5 норм) 0 3 (2,4%)

Цирроз печени 0 1 (0,8%)

*р>0,01

Сравнительная характеристика двух диагностических тестов (INNO-LiPA HBV DR v2, INNO-LiPA HBV genotyping) и метода прямого секвенироваипп, предназначенных для определения генотипа ВГВ и мутаций в гене полпмеразы ВГВ

Сопоставление результатов, полученных в тестах INNO-LiPA HBV DR v2, INNO-LiPA HBV genotyping и методом прямого секвенирования, проводили для образцов сывороток крови, полученных от пациентов с диагностированным ХГВ, как получавших терапию аналогами иуклеоз(т)идов (п=1), так и не получавших ПВТ (п=38).

На первом этапе испытаний коммерческой тест-системы было проведено определение генотипа ВГВ методом INNO-LiPA HBV genotyping и прямым секвенированием S-гена ВГВ. Среди 39 образцов, полученных от пациентов с подтвержденной ВГВ-инфекцией, дискордантные, результаты при тестировании были получены для 2/39 (5,1%) образцов. Присутствие двух случаев с дискордантными результатами можно объяснить использованием для амплификации в ПЦР разных участков ДНК ВГВ (INNO-LiPA HBV genotyping - домен A-F гена полимеразы, прямое секвенирование - перекрывающийся участок генов S/P). Таким образом, метод гибридизации INNO-LiPA HBV genotyping позволил правильно определить генотип ВГВ в 3 7(95%) из 3 9 случаев.

Вторым этапом исследования стала оценка клинической чувствительности и специфичности набора INNO-LiPA HBV DR v2c для определения аминокислотных замен в гене полимеразы ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной резистентности ВГВ, и сравнение полученных результатов с результатами прямого секвенирования перекрывающегося S/P участка ДНК ВГВ. Дискордантные результаты были получены для 7 образцов (табл.10).

В образце № 7, полученном от пациента с ВГВ-ассоциированным ЦП, получавшего телбивудин, как методом прямого секвенирования, так и в тесте INNO-LiPA HBV DR v2 были определены мутации в Р-гене, ассоциированные с применением данного препарата (L180M, L80V). Однако методом INNO-LiPA HBV DR v2 в этом же образце были выявлены еще 3 дополнительные мутации, ассоциированные с применением как телбивудина, так и ламивудина (L80I, M204V, M204I).

В образце № 6, полученного от пациента с ХГВ, ранее не получавшего терапии аналогами нуклеоз(т)идов, методом INNO-LiPA HBV DR была определена мутация в Р-

гене, ассоциированная с развитием устойчивости к адефовиру. Так как методом прямого секвенирования данную аминокислотную замену идентифицировать не удалось. Возможно, на долю мутантаого варианта ВГВ в общей вирусной популяции приходится менее 5%, а по данным С. Оэюл'у с соавт., 2006, чувствительность данного теста при выявлении минорных вариантов ВГВ составляет 5% от общей вирусной популяции.

В то же время, метод секвенирования участка вирусного генома, кодирующего домен обратной транскриптазы ВГВ, позволил выявить в 5 образцах аминокислотные замены, не включенные в список мишеней теста ШЖ)-ЫРА НВУ ч2, однако, по литературным данным, связанные с развитием лекарственной устойчивости ВГВ (образцы 1-5).

Таким образом, метод прямого секвенирования участка генома ВГВ, кодирующего домен обратной транскриптазы вирусной полимеразы, продемонстрировал большую информативность при поиске мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью. Однако тест 1№Ю-1ЛРА НВУ \'2 показал более высокую чувствительность при выявлении минорных мутантных вариантов ВГВ.

Таблица 10. Дискордантные результаты, полученные при выявлении мутаций в геноме ВГВ, связанных с лекарственной устойчивостью, методом прямого секвенирования и в тесте ПЧ1ЧО-1лРА НВУ 1Ж \2

№ п/п Аминокислотные замены в Р-гене ВГВ

Секвснирование ШЖМЛРА НВУ 01* \2

1 Ы798, Т1841 «дикий» тип

2 Т1841 неспецифика

3 Т1841 «дикий» тип

4 М204Ь «дикий» тип

5 Ь80У «дикий» тип

6 «дикий» тип АШБ

7 1Л80М, Ь80У Ь80У, 11801, Ы80М, М204У, М2041

На основании проведенного исследования разработаны два алгоритма выявления мутаций в гене полимеразы ВГВ: 1) для проведения научных скринииговых исследований с целью изучения распространенности мутантных вариантов ВГВ в разных популяциях; 2) для обследования пациентов с ВГВ-инфекцией в киииической практике, позволяющий оптимизировать выбор противовирусного препарата и избежать прогрессирования заболевания и предупредить развитие тяжелых осложнений (рис. 1,2).

Данные алгоритмы включают следующие этапы исследования образцов сывороток крови:

1

IV. Анализ последовательности ВГВ, направленный на выявление мутаций в гене

полимеразы ВГВ

Рис. 1. Алгоритм выявления мутаций в Р-гене ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости к ингибиторам обратной транскриптазы (для научных скришшговых исследовании!!)

I. Первичный лабораторный скрининг

HBsAg + (чувствительность 0,01 нг/мл)

HBsAg ■

7"

ВГВ-инфекция

шгга-НВс -

анти-НВс+

Отсутствие ВГВ-инфекции (образцы сывороток крови исключаются из исследования)

Образцы сывороток крови исключаются из исследования

III. Коммерческий тест 1ШО-1лРА НВУ1Ж \2

Рис. 2. Алгоритм выявления мутаций в Р-гене ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости к ингибиторам обратной транскриптазы (для клинической практики)

Выводы

1. Частота выявления первичной лекарственной резистентности ВГВ к аналогам нуклеоз(т)идов у пациентов с ВГВ-моноинфекцией составила 6,2% (17/273), с В ГВ/ВИЧ-коинфекцией -10,0% (3/30).

2. Анализ распространенности мутантных вариантов ВГВ в обследованных регионах Российской Федерации показал, что наибольшее число случаев первичной

лекарственной резистентности ВГВ регистрируется среди ВГВ-инфицированных пациентов Московский обл. (15%; 9/60) в сравнении с другими регионами, что, по-видимому, связано с внедрением в данном регионе в программу противовирусной терапии ХГВ аналогов нуклеоз(т)идов.

3. При анализе нуклеотидных последовательностей гена полимеразы ВГВ определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены (М2041, А181Б, Т1841, Ы99М, А194Т) и потенциально-значимые мутации - Т184Р, Ы798, 82Ш, М204Ь, Ь82Р, 521 ЗУ, Ы798, У214У - замены в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в научной литературе.

4. При выборе метода скрининга мутаций в гене полимеразы ВГВ установлена более высокая информативность прямого секвенирования, тогда как коммерческий тест ШЫО-1ЛРА ОII \2 оказался более чувствителен при выявлении минорных вариантов в вирусной популяции.

5. На основании проведенного исследования разработаны два алгоритма выявления мутаций в гене полимеразы ВГВ среди пациентов с ВГВ-инфекцией:

- для проведения научных скрининговых исследований;

- для оптимизации выбора аналога нуклеоз(т)идов в клинической практике.

Практические рекомендации

1. С целью оптимизации выбора ИОТ для лечения ХГВ рекомендуется применение

более чувствительных и специфичных методов ранней диагностики лекарственной резистентности ВГВ (ШЖМЛРА ИВУ, прямое секвенирование фрагментов генома ВГВ).

2. Включение в стандартную схему диагностики ГВ (НВбА§, анти-НВс, ДНК ВГВ)

определения генотипа вируса и аминокислотных замен в Р-гене позволит оценить

распространенность мутантных вариантов ВГВ в регионах РФ, оптимизировать выбор

ИОТ, что будет способствовать замедлению прогрессирования заболевания печени и

развития его осложнений, а также улучшению прогноза ВГВ-инфекции.

Публикации, содержащие основные научные результаты диссертации

1. Кожанова Т.В., Ильченко Л.Ю. Лекарственная резистентность вируса гепаггита В у коинфицированных ВИЧ/ВГВ и методы ее выявления // Мир вирусных гепатитов -2008.-№5.-С. 3-11.

2. Кожанова T.B, Гордейчук Й.В, Малиниикова Е.Ю, Кюрегян К.К. Коинфекция ВГВ/ВИЧ: распространенность, течение, лечение / Сборник трудов ИПВЭ им М.П. Чумакова РАМН «Медицинская вирусология» - М., 2008. - Т. XXV. - С. 187-199.

3. Кожанова Т.В. Клиническое значение лекарственной резистентности у ВГВ/ВИЧ-инфицированных больных / Сборник трудов ИПВЭ им М.П. Чумакова РАМН «Медицинская вирусология» - М., 2008. - Т. XXV. - С. 175-186.

4. Кожанова Т.В., Ильченко Л.Ю, Исаева О.В. Проблема лекарственной резистентности у ВГВ/ВИЧ-инфицированных пациентов // Клинические перспективы гастроэнтерологии - 2009. - № 5. - С. 23-28.

5. Кожанова Т.В., Исаева О.В., Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Результаты испытания тест-систем для генотипирования (INNO-LiPA HBV GENOT YPING)и определения лекарственной устойчивости вируса гепатита B(INNO-LiPA HBV DR v2 / Материалы Восьмого международного симпозиума гепатологов Беларуси «Актуальные вопросы гепатологии» г. Минск, 29-31 мая 2009 г. - Минск, 2009. - С. 59-60.

6. Кожанова Т.В., Исаева О.В., Клушкина В.В, Ооржак Н.Д., Саян P.M., Алексеева

М.Н., Миронова Н.И., Громова Н.И., Знойко О.О., Цыкина М.Н., Ильченко Л.Ю.,

Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Распространенность первичной лекарственной

резистентности вируса гепатита В к аналогам нуклеозидов и нуклеотидов у

инфицированных вирусом пациентов в различных регионах России II

Эпидемиология и вакципопрофилактика - 2010. - № 6. - С. 10-14.

Считаю своим приятным долгом выразить огромную благодарность своим научным руководителям: д.м.н., проф. М.И. Михайлову, к.б.н. К.К. Кюрегяну за постоянное внимание, всестороннюю помощь и полученные знания. Моя искренняя признательность всем сотрудникам лаборатории эпидемиологии вирусных гепатитов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. Особую благодарность за помощь в выполнении исследования автор выражает ведущему научному сотруднику лаборатории эпидемиологии гепатитов О.В. Исаевой, руководителю клиническим отделом вирусных гепатитов, д.м.н., профессору Л.Ю. Ильченко. Глубокую благодарность за сотрудничество выражаю главным врачам Областных центров по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями М.Н. Цыкинон (г. Тамбов), Л.П. Потеминой (г. Саратов); главным инфекциопистам МЗ Саратовской обл. Н.И. Мироновой и Республики Тыва A.A. Сарыглар, врачу-инфекционисту МЦ УДП РФ Н.И. Громовой. Также я признательна ученому секретарю института к.б.н. O.A. Медведкнной за поддержку и помощь в оформлении диссертации.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Кожанова, Татьяна Викторовна

Список сокращений

Содержание

Введение

Глава 1. Определение, методы выявления, распространенность лекарственной резистентности вируса гепатита В обзор литературы)

1.1. Вирусный гепатит В — возбудитель, патогенез, клиника (краткая характеристика)

1.2. Противовирусные препараты в терапии ХГВ

1.3. Механизм действия аналогов нуклеозидов/нуклеотидов - ИОТ

1.4. Определение лекарственной резистентности и механизм ее формирования

1.5. Разнообразие мутаций в гене полимеразы ВГВ, 28 ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости

1.6. Взаимное влияние гена полимеразы и поверхностного гена ВГВ

1.7. Методы определения лекарственной устойчивости ВГВ

1.8. Распространенность первичной лекарственной устойчивости

Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы исследования

1. Материалы исследования

1.1. Характеристика пациентов с ВГВ - моноинфекцией

1.2. Характеристика пациентов с коинфекцией ВИЧ/ВГВ

2. Методы исследования

2.1. Серологические маркеры ВГВ-инфекции

2.2. Молекулярные маркеры ВГВ-инфекции

2.3. Сравнительная оценка методов определения генотипа ВГВ и 57 мутаций в гене полимеразы ВГВ (1№Ю-1лРА НВУ БЯ у2,

ШЖ)-1лРА НВУ genotypmg и метода прямого секвенирования)

2.4. Методы статического анализа результатов исследований Результаты исследований

Глава 3. Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ в регионах Российской Федерации

3.1. Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ в регионах Российской Федерации среди ВГВ-моноинфицированных пациентов

3.2. Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ в регионах Российской Федерации среди ВГВ/ВИЧ -коинфицированных пациентов

3.3. Частота выявления маркеров инфицирования ВГВ и распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ среди «условно здорового» населения гиперэндемичного по ГВ региона (Республика Тыва)

Глава 4. Анализ аминокислотных замен перекрывающегося участка Р-гена и Б-гена

Глава 5. Эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-биохимическая характеристика пациентов с наличием и отсутствием первичной лекарственной резистентности ВГВ

Глава 6. Сравнительная характеристика двух диагностических тестов (ШМ)-1ЛРА НВУ БЯ у2, ШШ-ПРА НВУ genotyping и метода прямого секвенирования), предназначенных для определения генотипа ВГВ и мутаций в гене полимеразы ВГВ Обсуждение полученных результатов Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Первичная лекарственная резистентность вируса гепатита В"

Вирусный гепатит В (ГВ) является глобальной медицинской и социальной проблемой. Это обусловлено его повсеместным распространением среди различных групп населения, многообразием клинических форм и исходов (включая цирроз печени (ЦП) и первичный рак печени), стабильно-высокими показателями заболеваемости [7].

В терапии хронического гепатита В (ХГВ) применяются интерфероны-а (стандартные, пегилированные) и аналоги нуклеоз(т)идов - ингибиторы обратной транскриптазы (ИОТ).

В настоящее время эффективность терапии ХГВ невысока. Основные проблемы противовирусной терапии (ПВТ) связаны с неопределенностью сроков прекращения лечения HBeAg-нeгaтивнoгo гепатита и невысокой продолжительностью сохранения результата после лечения из-за вероятности рецидива. При отсутствии лечения ХГВ может с большой вероятностью приводить к развитию ЦП, печеночной недостаточности (ПН), гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК) и смерти.

Длительная терапия аналогами нуклеоз(т)идов ассоциирована с риском формирования лекарственной устойчивости и, вследствие этого, с прогрессированием течения заболевания [117,120].

Продолжительная персистенция генома вируса гепатита В (ВГВ) в инфицированных гепатоцитах и высокая частота возникновения спонтанных мутаций являются основой для селекции мутантных вариантов ВГВ, ассоциированных с формированием лекарственной устойчивости к ИОТ. Показано, что некоторые спонтанно возникающие мутации ВГВ могут длительное время персистировать, а мутации ВГВ, связанные с лекарственной резистентностью, возникать до начала проведения ПВТ ИОТ [21,28].

Выявление до начала проведения терапии вариантов ВГВ с мутациями в гене полимеразы (Р-ген), ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости, является клинически важным аспектом при ведении пациентов, нуждающихся в терапии аналогами нуклеоз(т)идов. Анализ мутантных вариантов ВГВ, связанных с лекарственной резистентностью, позволит предупредить обострение заболевания у таких пациентов, связанное с неэффективностью противовирусных препаратов. При высоком риске прогрессировать вирусного ГВ, особенно у пациентов с коинфекцией ВГВ/ВИЧ, ранее выявление устойчивых к терапии вариантов ВГВ является наиболее значимым. Используемый для детекции мутантных вариантов ВГВ метод должен быть достаточно чувствительным, чтобы применяться как до начала терапии нуклеоз(т)идными аналогами, так и в процессе лечения, когда уровень виремии может быть очень низким и/или мутантные варианты ВГВ присутствуют в общей вирусной популяции в меньшей доле [31,82].

Резистентность ВГВ к аналогам нуклеоз(т)идов часто развивается на фоне длительного приема препаратов. Однако мутации в гене полимеразы ВГВ, связанные с лекарственной резистентностью, могут возникать до начала проведения ПВТ ИОТ, и инфицирование такими вариантами вируса могут приводить к формированию первичной лекарственной устойчивости. Данные о частоте первичной лекарственной резистентности ВГВ среди пациентов с острым и хроническим ГВ ограничены, поэтому в настоящее время все больше внимания уделяется изучению распространенности мутантных вариантов ВГВ среди ВГВ-инфицированных пациентов, не получающих терапию ИОТ.

Эпидемиологические и вирусологические аспекты первичной лекарственной устойчивости ВГВ к терапии аналогами нуклеоз(т)идов среди ВГВ-инфицированных пациентов в Российской Федерации (РФ) ранее не изучались. Отсутствуют сведения о спектре мутаций, приводящих к развитию лекарственной устойчивости ВГВ, об их распространенности в регионах РФ с различной интенсивностью циркуляции ВГВ.

В связи с этим актуальным является определение эпидемиологических и вирусологических характеристик вариантов ВГВ, устойчивых к терапии аналогами нуклеоз(т)идов, среди пациентов, ранее не получавших ПВТ. Вышеизложенное определило цели и задачи исследования.

Цель исследования

Изучить распространенность вариантов ВГВ с наличием мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью, среди лиц, инфицированных ВГВ, ранее не получавших противовирусную терапию аналогами нуклеоз(т)идов, в регионах Российской Федерации с различной степенью интенсивности циркуляции ВГВ.

Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:

1. определить частоту выявления мутаций в Р-гене ВГВ, связанных с лекарственной устойчивостью среди пациентов с ВГВ-моноинфекцией и ВГВ/ВИЧ-коинфекцией, ранее не получавших терапию аналогами нуклеоз(т)идов;

2. охарактеризовать аминокислотные замены в Р-гене ВГВ;

3. сравнить вирусологические и клинико-биохимические показатели у лиц с наличием и отсутствием первичной лекарственной устойчивости ВГВ;

4. выбрать метод скрининга мутаций в Р-гене ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости к аналогам нуклеоз(т)идов;

5. разработать алгоритм выявления лекарственной устойчивости ВГВ для оптимизации выбора противовирусного препарата.

Научная новизна работы

Впервые в регионах Российской Федерации, различающихся по интенсивности циркуляции ВГВ, определена частота выявления вариантов ВГВ с наличием мутаций, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью к аналогам нуклеоз(т)идов, среди ВГВ-инфицированных и ВГВ/ВИЧ-коинфицированных пациентов, не получавших противовирусной терапии,.

Впервые при анализе аминокислотных последовательностей домена обратной транскриптазы изолятов ВГВ, выделенных на территории

Российской Федерации, определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены (М2041, А1818, Т1841, Ь199\¥, А194Т) и замены, в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в научной литературе (Т184Р, 1Л798, 8213Р, М204Ь, Ь82Р, Ъ2\ЗУ, 1Л798, У214У). Данные мутации рассматриваются как потенциально значимые, поскольку находятся в позициях гена полимеразы ВГВ, имеющих решающие значение для диагностики лекарственной устойчивости ВГВ.

Впервые при выборе метода скрининга с целью обнаружения мутаций в гене полимеразы ВГВ установлена более высокая информативность прямого секвенирования и высокая чувствительность коммерческого теста 1№чГО-ЫРА БЯ у2.

Впервые на основании проведенного исследования разработаны два алгоритма выявления мутаций в гене полимеразы ВГВ среди пациентов с ВГВ-инфекцией:

- для проведения научных скрининговых исследований;

- для оптимизации выбора аналога нуклеоз(т)идов в клинической практике с целью уменьшения прогрессирование ХГВ и предупреждения развитие тяжелых осложнений.

Практическая значимость и внедрение результатов работы

Результаты, полученные в процессе работы, позволили разработать и рекомендовать для использования в клинической практике алгоритм выявления мутаций в Р-гене ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости, который позволит оптимизировать выбор противовирусного препарата (аналога нуклеоз(т)идов) у пациентов с ВГВ-инфекцией.

Данный алгоритм внедрен и применяется в научно-исследовательской работе отдела вирусных гепатитов ИГТВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.

Проблема и методы диагностики лекарственной резистентности ВГВ к аналогам нуклеоз(т)идов среди ВГВ-инфицированных пациентов изложены в проекте методических рекомендаций Министерства здравоохранения и социального развития РФ «Выявление мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью вируса гепатита В среди пациентов с коинфекцией вируса иммунодефицита человека и вируса гепатита В».

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на международном конгрессе по вирусным гепатитам (13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (март 2009 г., Вашингтон), на конференции молодых ученых Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (апрель 2009 г., Москва), на Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (май 2009 г., Москва), на научно-практической конференции

Актуальные проблемы медицинской вирусологии» (ноябрь 2009 г., Москва). i

Апробация диссертации состоялась 30 июля 2010 г. на заседании Ученого совета Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (протокол №1 от 30 июля 2010 г.).

Научные положения, выносимые на защиту

1. Частота выявления первичной лекарственной устойчивости ВГВ к налогам нуклеоз(т)идов в группе пациентов с ВГВ-моноинфекцией составила 6,2% (17/273), с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией - 10,0% (3/30). Анализ распространенности мутантных вариантов ВГВ в изучаемых регионах Российской Федерации показал, что наибольшее число случаев первичной лекарственной резистентности ВГВ регистрируется среди ВГВ-инфицированных пациентов Московский области (15%; 9/60, р<0,01) в сравнении с другими регионами что, по-видимому, связано с внедрением в данном регионе в программу противовирусной терапии ХГВ аналогов нуклеоз(т)идов.

2. При анализе нуклеотидных последовательностей гена полимеразы ВГВ определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены (M204I, A181S, T184I, L199W, А194Т) и потенциально значимые мутации - Т184Р, L179S, S213F, M204L, L82P, S213Y, L179S, V214Y - замены в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в научной литературе. 3. При выборе метода скрининга мутаций в гене полимеразы ВГВ установлена более высокая информативность прямого секвенирования, тогда как коммерческий тест INNO-LiPA DR v2 более чувствителен, поскольку выявляет мутантные варианты ВГВ, присутствующие в общей вирусной популяции в минорном количестве (около 5%). Однако тест INNO-LiPA DR v2 имеет ограниченный спектр выявляемых мутаций.

Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 статьи - в реферируемых журналах ВАК.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 121 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 7 отечественных и 123 зарубежных источников. Диссертационная работа иллюстрирована 30 таблицами, 13 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кожанова, Татьяна Викторовна

106 ВЫВОДЫ

1. Частота выявления первичной лекарственной резистентности ВГВ к аналогам нуклеоз(т)идов у пациентов с ВГВ-моноинфекцией составила 6,2% (17/273), с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией - 10,0% (3/30).

2. Анализ распространенности мутантных вариантов ВГВ в обследованных регионах Российской Федерации показал, что наибольшее число случаев первичной лекарственной резистентности ВГВ регистрируется среди ВГВ-инфицированных пациентов Московской области (15%; 9/60) в сравнении с другими регионами, что, по-видимому, связано с внедрением в данном регионе в программу противовирусной терапии ХГВ аналогов нуклеоз(т)идов.

3. При анализе нуклеотидных последовательностей гена полимеразы ВГВ определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены (М2041, А1818, Т1841, Ь199\¥, А194Т) и потенциально-значимые мутации - Т184Р, Ы798, 8213Р, М204Ь, Ь82Р, 8213У, Ы798, У214У -замены в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в научной литературе.

4. При выборе метода скрининга мутаций в гене полимеразы ВГВ установлена более высокая информативность прямого секвенирования, тогда как коммерческий тест ШКЮ-1лРА БЯ у2 оказался более чувствителен при выявлении минорных вариантов в вирусной популяции.

5. На основании проведенного исследования разработаны два алгоритма выявления мутаций в гене полимеразы ВГВ среди пациентов с ВГВ-инфекцией:

- для проведения научных скрининговых исследований;

- для оптимизации выбора аналога нуклеоз(т)идов в клинической практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью оптимизации выбора ИОТ для лечения ХГВ рекомендуется применение более чувствительных и специфичных методов ранней диагностики лекарственной резистентности ВГВ (1№ГО-1лРА НВУ, прямое секвенирования генома ВГВ).

2. Включение в стандартную схему диагностики ГВ (HBsAg, анти-НВс, ДНК ВГВ) определения генотипа вируса и аминокислотных замен в Р-гене позволит оценить распространенность мутантных вариантов ВГВ в регионах РФ, оптимизировать выбор ИОТ, что будет способствовать замедлению прогрессирования заболевания печени и развития его осложнений, а также улучшению прогноза ВГВ-инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Кожанова, Татьяна Викторовна, Москва

1. Галимова С.Ф., Маевская М.В., Ивашкин В.Т. Новый аналог нуклеозидов телбивудин в лечении хронического гепатита В // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. 2007. - № 5. - С. 55-60.

2. Де Клерк Э. Перспективы лечения вирусного гепатита В // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2000. - № 3. - С. 4-18.

3. Жданов К.В. в. Новые рекомендации по лечению хронического вирусного гепатита В: прогнозируем эффективность терапии, следуя «дорожной карте»? // Клин, гастроэнтерол. гепатол. — 2008. № 1. — С. 48-49.

4. Ильченко Л.Ю. Проблемы резистентности терапии хронического гепатита В // Мир вирусных гепатитов. 2007. - №. 2. - С. 2-9.

5. Сологуб Т.В., Романцов М.Г., Кремень Н.В. Терапия больных хроническим вирусным гепатитом В, резистентных к ламивудину // Современные проблемы науки и образования. — 2007. № 6. - С. 9-13.

6. Рудакова A.B., Лобзин Ю.В., Хвещук П.Ф. Противовирусная терапия хрониченского гепатита В: анализ эффективности затрат // Клин, микроб, антимикроб, химиотер. 2002. - № 1. — С. 49-59.

7. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). М.: ФГОУ «ВУНМЦ Роздрава», 2003. - С. 22-27.

8. Aggarwal R., Ranjan P. Preventing and treating hepatitis В infection // BMJ. -2004. Vol. 329. - P. 1080-1086.

9. Alvarado-Esquivel C., Carrera-Gracia M., Conde-Gonza ' lez С. Genotypic resistance to lamivudine among hepatitis В virus isolates in Mexico // J. Antimicrob. Chemother. 2006. - Vol. 57. - P. 221-223.

10. Amini-Bavil-Olyaee S., Hosseini S.Y., Sabahi F. Hepatitis В virus (HBV) genotype and YMDD motif mutation profile among patients infected with HBV and untreated with lamivudine // J. Infect. Dis. 2008. - Vol. 12. - P. 83-87.

11. Arauz-Ruiz P., Norder H., Robertson B.H. et al. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America // J. Gen. Virol. 2002. - Vol. 83. - P. 2059-2073.

12. Bang L., Scot L. Emtricitabine // Drugs 2003. - Vol. 63. - P. 2413-2424.

13. Bartholomeusz A., Locarnini S.A. Antiviral drug resistance: clinical consequences and molecular aspect // Semin Liver Dis. 2006. - Vol. 26. -P. 162-170.

14. Bottecchia M., Souto F., Kycia M. et al. Hepatitis B virus genotypes and resistance mutations in patients under long term lamivudine therapy: characterization of genotype G in Brazil // BMC Microbiol. 2008. - Vol. 8. -P. 11.

15. Bozdayi- A., Uzunalimog Ô., TürkyHmaz A.R. et al. YSDD: a novel mutation in HBV DNA polymerase confers clinical resistance to lamivudine // J. Viral Hepat. 2003. - Vol. 10. - P. 256-265.

16. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus // J. Viral Hepat. 1997. - N. 4. - P. 11-20.

17. Chaudhuri V., Tayal R., Nayak B. et al. Occult hepatitis B virus infection in chronic liver disease: full-length genome and analysis of mutant surface promoter//Gastroenterol.-2004.-Vol. 127.-P. 1356-1371.

18. Colonno R., Rose R., Baldick C. Entecavir Resistance Is Rare in Nucleoside Naiive Patients With Hepatitis B // Hepatol. 2006. - Vol. 44. - P. 1656-1665.

19. Dan Y., Wai C., Lee Y. Outcome of lamivudine-resistant hepatitis B virus is generally benign except in cirrhotics // World J. Gastroenterol. 2005. - Vol. 11.-P. 4344-4350.

20. Durantel D., Brunelle M., Gros E. et al. Resistance of human hepatitis B virus to reverse transcriptase inhibitors: from genotyping to phenotyping testing // J. Clin. Virol. 2005. - Vol. 34. - P. 34-43.

21. Fung S.K., Chae H.B., Fontana R.J. et al. Virologic response and resistance to adefovir in patients with chronic hepatitis B // J. Hepatol. 2006. - Vol. 44. -P. 283-290.

22. Fung S.K., Lok A.S. Management of hepatitis B patients with antiviral resistance // Antivir. Ther. 2004. - Vol. 9. - P. 1013-1026.

23. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis B virus infection-natural history and clinical consequences // N. Engl. J. Med. 2004. - Vol. 350. - P. 1118-1122.

24. Gerolami R., Bourliere M., Colson P. Unusual selection of rtA181V HBV mutants cross-resistant to adefovir following prolonged lamivudinen monotherapy: report of two cases // Antivir. Ther. 2008. - Vol. 11. - P. 1103-1106.

25. Ghany M., Liang T.J. Drug targets and molecular mechanisms of drug resistance in chronic hepatitis B // Gastroenterol. 2007. - Vol. 132. - P. 1574-1585.

26. Guenther S., Fischer L., Pult I. et al. Naturally occurring variants of hepatitis B virus // Adv. Virus Res. 1999. - Vol. 52. - P. 25-37.

27. Guenther S., Mark N., Thomas L. et al. Combination of tenofovir and lamivudine versus tenofovir after lamivudine failure for therapy of hepatitis B in HIV-coinfection // AIDS 2006. - Vol. 20. - P. 1951-1954.

28. Heo J., Cho M., Kim H.H. Detection of YMDD Motif Mutants by Oligonucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection // J. Korean Med. Sci. 2004. - Vol. 19. - P. 541546.

29. Hie-Won H., Dixon J. A review of the one-year incidence of resistance to lamivudine in the treatment of chronic hepatitis B // Hepatol. Int. 2008. -Vol. 2.-P. 440-456.

30. Honkoop P., Niesters H.G, Osterhaus A.D. Lamivudine resistance in immunocompetent chronic hepatitis B. Incidence and patterns // J. Hepatol. -1998.-Vol. 28.-P. 169.

31. Hsieh C.C., Tzonou A., Zavitsanos X. et al. Age at first establishment of chronic hepatitis B virus infection and hepatocellular carcinoma risk. A birth order study // Am. J. Epidemiol. 1992. - Vol. 136. - P. 1115-1121.

32. Hua R., Tanaka Y., Fukai K. Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using TaqMan-minor groove binder probes // Clin. Chimie. 2008. -Vol. 6.-P. 4560-4571.

33. Huang Z.M., Huang Q.W., Qin Y.Q. YMDD mutations in patients with chronic hepatitis B untreated with antiviral medicines // World J. Gastroenterol. 2005. - Vol. 11. - P. 867-870.

34. Hussain M., Fung S., Libbrecht E. Sensitive Line Probe Assay That Simultaneously Detects Mutations Conveying Resistance to Lamivudine and Adefovir // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 1094-1097.

35. Iacomi F., Vincenti D., Vairo F. et al. Effect of HIV co-infection on mutation patterns of HBV in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B // J. Med. Virol.-2009.-Vol. 81.-P. 1151-1156.

36. Jang H., Cho M., Heo J. et al. Oligonucleotide Chip for Detection of Lamivudine-Resistant Hepatitis B Virus // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. - P. 4181-4188.

37. Jardi R., Buti M., Rodríguez-Frías F. et al. Rapid detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus polymerase gene variants // J. Virol. Methods — 1999.-Vol. 83.-P. 181-187.

38. Jardi R., Rodriguez-Frias F., Schaper M. et al. Hepatitis B Virus Polymerase Variants With Entecavir Drug Resistance: Results // J. Viral. Hepat. 2007. -Vol. 14.-P. 835-840.

39. Jones R., Nelson M. Novel anti-hepatitis B agents: a focus on telbivudine // Int. J. Clin. Pract. 2006. - Vol. 60. - P. 1295-1299.

40. Kang J.A., Park J.C. Identification of Lamivudine-resistant Hepatitis B Virus by Oligonucleotide Microarray // J. Biochip 2007. - Vol. 1. - P. 273-280.

41. Kao J.H., Wu N.H., Chen P.J. et al. Hepatitis B genotypes and the response to interferon therapy // J. Hepatol. 2000. - Vol. 33. - P. 998-1002.

42. Kazim S., Sarin S., Sharma B. et al. Characterization of Naturally Occurring and Lamivudine-Induced Surface Gene Mutants of Hepatitis B Virus in Patients with Chronic Hepatitis B in India // Intervirol. 2006. - Vol. 49. -P.152-160.

43. Kobayashi S., Ide T., Sata M. Detection of YMDD motif mutations in some lamivudine-untreated asymptomatic hepatitis B virus carriers // J. Hepatol. -2001.-Vol. 34.-P. 584-586.

44. Ladner S., Miller T., King R. et al. The M539V Polymerase Variant of Human Hepatitis B Virus Demonstrates Resistance to 29-Deoxy-39-Thiacytidine and a Reduced Ability to Synthesize Viral DNA // Antimicrob. Agents Chem. 1998. - Vol. 42. - P. 2128-2131.

45. Ladner S.K., Miller T.J., Otto M.J. The hepatitis B virus M539V polymerase variation responsible for 3TC resistance also confers cross-resistance to other nucleoside analogues // Antivir. Chem. Chemother. 1998. - Vol. 9. - P. 6572.

46. Laoi B., Herra C., Norris S. et al. Hepatitis B virus resistance to adefovir in a nucleotide naive patient with chronic hepatitis B virus infection // J Antimicrob. Chemother. 2007. - Vol. 59. - P. 807-809.

47. Laoi B., Herra C., Norris S. First report of genotypic resistance to adefovir in chronic HBV in the Republic of Ireland // J. Antimicrob. Chemother. 2006. -Vol. 57.-P. 1009-1010.

48. Lau D., Bleibel W. Current status of antiviral therapy for hepatitis B // Therap. Advan. Gastroenterol. 2008. - Vol. 1. - P. 61-75.

49. Lee S., Choi M. Overlapping Gene Mutations of Hepatitis B Virus in a Chronic Hepatitis B Patient with Hepatitis B Surface Antigen Loss during Lamivudine Therapy // J. Korean Med. Sci. 2005. - Vol. 20. - P. 433-437.

50. Lee K.O., Lee H.J., Byun J.Y. Detection of Lamivudine-Resistant Mutations of HBV DNA Polymerase Gene Using PCR-Direct Sequencin // J. Virol. Methods 2006. - Vol. 3. - P. 89-94.

51. Lee C.Z., Lee H.S., Huang G.T. Detection of YMDD mutation using mutant-specific primers in chronic hepatitis B patients before and after lamivudine treatment // World J. Gastroenterol. 2006. - Vol. 12. - P. 5301-5305.

52. Lee Y.S., Lim Y.S. Increased risk of adefovir resistance in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B after 48 weeks of adefovir dipivoxil monotherapy // Hepatol. 2006. - Vol. 43. - P. 1385-1391.

53. Leemans W., Janssen H., de Man R. Future prospectives for the management of chronic hepatitis B // World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13. - P. 25542567.

54. León P., Pozo F., Echevarría J. Detection of hepatitis B virus variants resistant to lamivudine and famciclovir among randomly selected chronic carriers from Spain // Enferm. Infec. Microbiol. Clin. 2004. - Vol. 2. - P. 133-137.

55. Li M.W., How W., Liu K.Z. Character of HBV (hepatitis B virus) polymerase gene rtM204V/I and rtL180M mutation in patients with lamivudine resistance // J. Zhejiang Univ. Sci. 2007. - Vol. 6. - P. 664-667.

56. León P., Pozo F., Echevarría J. Detection of hepatitis B virus variants resistant to lamivudine and famciclovir among randomly selected chronic carriers from Spain // Enferm. Infec. Microbiol. Clin. 2004. - Vol. 22. - P. 133-137.

57. Lindh M., Uhnoo I., Blackberg J. Treatment of chronic hepatitis B infection: An update of Swedish recommendations // Scand. J. Infect. Dis. 2008. -Vol. 40.-P. 436-450.

58. Lindstrom A., Odeberg J. Pyrosequencing for Detection of Lamivudine-Resistant Hepatitis B Virus // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 42. - P. 47884795.

59. Ling R., Ahmed M. Selection of mutation in hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine // J. Hepatol. 2006. -Vol. 24.-P. 711-713.

60. Ling R., Mutimer D., Ahmed M. et al. Selection of mutations in the hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine // Hepatol. 1996. - Vol. 24. - P. 711-713.

61. Liu K., Hou W., Ni Q. Clinical features of chronic hepatitis B patients with YMDD mutation after lamivudine therapy // J. Zhejiang Univ. Sci. 2005. -Vol. 6.-P. 1182-1187.

62. Locarnini S. Primary resistance, multidrug resistance, and cross-resistance pathways in HBV as a consequence of treatment failure // Hepatol. Int. -2008.-Vol. 2.-P. 147-151.

63. Locarnini S., Mason W.S. Cellular and virological mechanisms of HBV drug resistance // J. Hepatol. 2006. - Vol. 44. - P. 422-431.

64. Locarnini S., Warner N. Major causes of antiviral drug resistance and implications for treatment of hepatitis B virus monoinfection and coinfection with HIV // Antivir. Ther. 2007. - Vol. 12. - P. 15-23.

65. Lok A., Brian J., McMahon L. Chronic Hepatitis B // Hepatol. 2007. - Vol. 45.-P. 1225-1241.

66. Lu H., Zeng Z., Xu X. et al. Mutations in surface and polymerase gene of chronic hepatitis B patients with coexisting HBsAg and anti-HBs // World J. Gastroenterol. 2006. - Vol. 12. - P. 4219-4223.

67. McMahon B.J., Alward W.L., Hall D.B. et al. Acute hepatitis B virus infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state // J. Infect Dis. 1985. - Vol. 151. - P. 599602.

68. Malmstrôm S., Hannoun C., Lindh M. Mutation analysis of lamivudine resistant hepatitis B virus strains by TaqMan PCR // J. Virol. Methods 2007. -Vol. 143.-P. 147-152.

69. Masaadeh H., Hayajneh W., Alqudah E. Hepatitis B virus genotypes and lamivudine resistance mutations in Jordan // World J. Gastroenterol. 2008. -Vol. 14.-P. 7231-7234.

70. Moriconi F., Colombatto P., Coco B. Emergence of hepatitis B virus quasispecies with lower susceptibility to nucleos(t)ide analogues during lamivudine treatment // J. Antimicrob. Chemother. 2007. - Vol. 60. - P. 341-349.

71. Motta J.S., Mello F.C., Lago B.V. Occult hepatitis B virus infection and lamivudine-resistant mutations in isolates from renal patients undergoing hemodialysis // J. Gastroenterol. Hepatol. 2010. - Vol. 25. - P. 101-106.

72. Nagasaki F., Nitsuna H. The high of the emergene of entecavir-resistance mutants among patients infected with lamivudine-resistance hepatitis virus // J. Exp.Med. 2007. - Vol. 213. - P. 181-186.

73. Nelson M., Portsmouth S., Stebbing J. An open-label study of tenofovir in HIV-1 and hepatitis B virus coinfected individuals // AIDS 2003. - Vol. 17. -P. 7-10.

74. Norder H., Courouce A.M., Magnius L.O. Complete genomes, phylogenetic relatedness, and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus, four of which represent two new genotypes // J. Virol. — 1994. Vol. 198. - P. 489-503.

75. Ogura Y., Kurosaki M., Asahina Y. Prevalence and Significance of Naturally Occurring Mutations in the Surface and Polymerase Genes of Hepatitis B Virus //J. Infect. Dis.- 1999.-Vol. 180.-P. 1444-1451.

76. Ono S., Shiratori Y. The polymerase L528M mutation cooperates with nucleotide binding-site mutations, increasing hepatitis B virus replication and drug resistance // J. Clin. Invest. 2001. - Vol. 107. - P. 449-455.«

77. Park H., Woo H., Kim B. et al. Evaluation of dual priming oligonucleotide-based multiplex PCR for detection of HBV YMDD mutants // Arch. Virol. -2008.-Vol. 153.-P. 2019-2025.

78. Pas S.D., Fries E., Robert A. Development of a Quantitative Real-Time ' Detection Assay for Hepatitis B Virus DNA and Comparison with Two Commercial Assays // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 2897-2901.

79. Pastor R., Habersetzer F., Faf-Kremer S. Hepatitis B virus mutations potentially conferring adefovir/tenofovir resistance in treatment-naive patients // World J. Gastroenterol. 2009. - Vol. 15. - P. 753-755.

80. Pisarev V., Lee S., Connelly M. Intracellular Metabolism and Action of Acyclic Nucleoside Phosphonates on DNA Replication // Mol. Pharmacol. -1997. Vol. 52. - P. 63-68.

81. Quarleri J., Morett F., Bouzas B. Hepatitis B Virus Genotype Distribution and Its Lamivudine-Resistant Mutants in HIV-Coinfected Patients with Chronic and Occult Hepatitis B // AIDS 2007. - Vol. 23. - P. 525-531.

82. Reddy C.M., Martin P. Preventing HBV antiviral drug resistance to the oral antivirals and appropriate management when resistance occurs is crucial in the treatment of hepatitis B // Drs. Reddy and Martin review the issues — 2008.-Vol. 9.-P. 67-78.

83. Rossana M., Ulisses B., Rodriguez A. et al. Hepatitis B Virus Mutants // Intervirol. 1999. - Vol. 42. - P. 69-80.

84. Sayan M., Akhan S., Meric M. Naturally occurring amino-acid substitutions to nucleos(t)ide analogues in treatment naive Turkish with chronic hepatitis B // J. Viral. Hepat. 2010. - Vol. 17. - P. 23-27.

85. Schaefer S. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes // World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13. - P. 14-21.

86. Schildgen O., Sirma H., Funk A. Variant of Hepatitis B Virus with Primary Resistance to Adefovir //N. Engl. J. Med. 2006. - Vol. 354. - P. 1807-1812.

87. Shaw T., Bartholomeusz A., Locarnini S. HBV drug resistance: Mechanisms, detection and interpretation // J. Hepatol. 2006. - Vol. 44. - P. 593-606.

88. Sheldon J., Rodes B., Bartholomeusz A. Selection of hepatitis B virus polymerase mutations in HIV-coinfected patients treated with tenofovir // Antivir. Ther. 2005. - Vol. 10. - P. 727-734.

89. Sheldon J., Soriano V. Hepatitis B virus escape mutants induced by antiviral therapy // J. Antimicrob. Chemotherap 2007. - Vol. 24. - P. 1-3.

90. Shin H.J., Rho H.M. Release of the hepatitis B virus-associated DNA polymerase from the viral particle by the proteolytic cleavage // J. Biol. Chem. 1995. -Vol. 270.-P. 11047-11050.

91. Soriano V., Sheldon J., Ramos B. Confronting chronic hepatitis B virus infection in HIV: new diagnostic tools and more weapons // AIDS. 2006. -Vol. 20.-P. 451-453.

92. Stuyver L., De Gendt S., Van Geyt C. et al. A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness // J. Gen. Virol. 2000. -Vol. 81.-P.67-74.

93. Stuyver L., Van Geyt C., De Gendt S. Line Probe Assay for Monitoring Drug Resistance in Hepatitis B Virus-Infected Patients during Antiviral Therapy // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 702-707.

94. Tillmann H.L. Antiviral therapy and resistance with hepatitis B virus infection // World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13. - P. 125-140.

95. Thompson A., Ayres A., Yuen L. et al. Lamivudine resistance in patients with chronic hepatitis B: Role of clinical and virological factors // J. Gastroenterol. Hepatol. 2007. - Vol. 22. - P. 1078-1085.

96. Torresi J. Hepatits B antiviral resistance and vaccine escape: two sides of the same coin // Antiviral. Therapy 2008. - Vol. 13. - P. 337-340.

97. Torresi J. The virological and clinical significance of mutations in the overlapping envelope and polymerase genes of hepatitis B virus // J. Clin. Virol. 2002. - Vol. 25. - P. 97-106.

98. Tsuda F., Sakugawa H., Sastrosoewignjo R. et al. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes // J. Gen. Virol. 1988. - Vol. 69. - P. 2575-2583.

99. Tuncblek S., Kose F., Elaldi A. Lamivudine resistance in untreated chronic hepatitis B patients in Turkey // Turk J. Gastroenterol. 2008. - Vol. 19.- P. 99-103.

100. Vairo F., Iacomi F., et al. Analysis of HBV lamivudine-resistance mutations in a cohort of HBV infected subjects with or without HIV+ co-infection // 4th International HIV and Hepatitis Co-infection workshop 2008. - Vol. 2. - P. 45-56.

101. Vernet G., Tran N. The DNA-Chip technology as a new molecular tool for the detdctiin of HBV mutants // J. Clin. Virol. 2005. - Vol. 34. - P.49-53.

102. Villeneuve J., Durantel D., Durantel S. et al. Selection of a hepatitis B virus strain resistant to adefovir in a liver transplantation patient // J. Hepatol. -2003. Vol. 39.-P. 1085-1089.

103. Wai C.T., Chu C.J., Hussain M. HBV genotype B is associated with better response to interferon therapy in HBeAg(+) chronic hepatitis than genotype C //Hepatol. -2002. Vol. 36. - P. 1425-1430.

104. Wang Y.Z., Wu G.X. Oligonucleotide chip, real-time PCR and sequencing for genotyping of hepatitis B virus // World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13. -P. 4260-4263.

105. Wang Y., Yan Y., Jiang J. et al. RtL164V, a mutation possibly associated with lamivudine resistant HBV // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi 2008. -Vol. 16.-P. 490-493.

106. Wen H., Li Q. Real-time PCR detection of multiple lamivudine-resistant mutations with displacing probes in a single tube // J. Clin. Virol. 2007. -Vol. 38. - P. 334-340.

107. Wong V., Chan H. Molecular Virology and Drug Resistance in Antiviral Therapy of Chronic Hepatitis B // Current Hepatitis Reports 2005. - Vol. 4. -P. 27-33.

108. Xu X-W., Chen Y-G. Current therapy with nucleoside/nucleotide analogs for patients with chronic hepatitis B // Hepatobil. Pancreat. Dis. Int. 2006. - Vol. 5.-P. 350-359.

109. Yamazhan T., Sertoz R., Pulluk?u H. A case of chronic hepatitis B with primary adefovir resistance // Mikrobiyol. Bui. 2007. - Vol. 41. - P. 297301.

110. Yoshida S., Hige S., Yoshida M. et al. Quantification of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by type-specific TaqMan minor groove binder probe assay in patients with chronic hepatitis B // Ann Clin. Biochem. 2008. -Vol. 45.-P. 59-64.

111. Younger M., Bathgate A. Review article: nucleoside analogues for the treatment of chronic hepatitis B // Aliment. Pharmacol. Ther. 2004. - Vol. 20.-P. 1211-1230.

112. Zaaijer H., Hemert F. Independent evolution of overlapping polymerase and surface protein genes of hepatitis B virus // J. Gen. Virol. 2007. - Vol. 88. -P. 2137-2143.

113. Zhao J., Bai Y., Zhang Q. et al. Detection of YMDD mutants using universal template real-time PCR // World J. Gastroenterol. 2006. - Vol. 12. - P. 1308-1311.

114. Zhao J.R., Bai Y.J., Zhang Q. Detection of hepatitis B virus DNA by realtime PCR using TaqMan- MGB probe technology // World J. Gastroenterol. -2005.-Vol. 11.-P. 508-510.

115. Zhi-ying O., Zhou R., HE Y. YVDD Mutation of Hepatitis B Virus, a Dominant Lamivudine-Resistant Type in Guangzhou, South China // Virol. Sinica. 2008. - Vol. 23. - P. 218-225.

116. Zhou T., Saputelli J., Aldrich C.E. et al. Emergence of drug-resistant populations of woodchuck hepatitis virus in woodchucks treated with the antiviral nucleoside lamivudine // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. -Vol. 43.-P. 1947-1954.

117. Zöllner B., Petersen J., Puchhammer-Stock E. Viral features of lamivudine resistant hepatitis B genotypes A and D // Hepatol. 2004. - Vol. 39. - P. 4250.

118. Zoulim F., Buti M., Lok A. Antiviral-resistant hepatitis B virus: can we prevent this monster from growing? // J. Vir. Hepat. 2007. - Vol. 14. - P. 29-36.

119. Zoulim F., Degos F., Slama A. A prospective study of the evolution of lamivudine resistance mutations in patients with chronic hepatitis B treated with lamivudine // J. Viral. Hepat. 2006. - Vol. 13. - P. 278-288.