Перспективы применения синтетических аминоацильных комплексов для восполнения дефицита кальция

Ваганова, Людмила Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Перспективы применения синтетических аминоацильных комплексов для восполнения дефицита кальция
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Перспективы применения синтетических аминоацильных комплексов для восполнения дефицита кальция"

005549031

На правах рукописи

е^/

Ваганова Людмила Анатольевна

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ АМИНОАЦИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ВОСПОЛНЕНИЯ ДЕФИЦИТА

КАЛЬЦИЯ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 ПАЙ 2014

Казань 2014

005549031

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г. А. Илизарова» Министерства здравоохранения Российской

Федерации.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Лунева Светлана Николаевна

Официальные оппоненты:

• Маянская Наиля Назибовна - д.м.н., профессор, ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», кафедра биохимии, профессор кафедры.

• Кадочникова Галина Дементьевна - д.б.н., профессор, ФГБОУ ВПО «Тюменский государственный нефтегазовый университет, Технологический институт, кафедра товароведения и технологии продуктов питания, профессор кафедры.

Ведущая организация:

• Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «29» мая 2014 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008 г. Казань, ул. Кремлевская, д.18, ауд.211. Телефон: 7(843)23-37-842

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д.35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» www.kpfu.ru

Автореферат разослан «_» апреля 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность исследования. В настоящее время увеличение продолжительности жизни в большинстве стран мира привело современное общество к стремительному старению и возникновению ряда новых проблем, одна из которых - лавинообразный рост числа тяжелейших переломов (Bürge R et al., 2007; Норой Л., 2010; Arakaki Н. et al., 2011), наблюдаемых на фоне остеопороза (ОП) (Рожинская Л.Я., 2000; Беневоленская Л.И., 2003; Максимов М.Л., 2013). По данным ВОЗ, ОП занимает четвертое место среди неинфекционных заболеваний (Доскина Е.В., 2011). В настоящее время остается актуальным вопрос поиска новых эффективных и экономически более выгодных лекарственных средств, направленных на фармакологическую коррекцию данного заболевания. Особый интерес, как перспективные препараты для направленной транспортировки кальция в костную ткань (KT), вызывают комплексные соединения кальция с аминокислотами (АК). Повышенное внимание к этому классу препаратов обусловлено, прежде всего, тем, что данные соединения обеспечивают лучшую ассимиляцию металла, чем при введении его в рацион в неорганической или какой-либо другой форме (Леменовский Д.А., 1997; Johansson А., 2008), тем самым обеспечивая повышение эффективности всасывания препаратов в желудочно-кишечном тракте и снижение вводимых доз вещества, к тому же для их усвоения не требуется витамин D3 (Метельский С Т 2007; Ребров В.Г., Громова O.A., 2008; Громова O.A. и др., 2013). В настоящее время хелатные аминоацильные комплексы кальция (аакСа) входят в состав некоторых биологически активных препаратов. Между тем, научных исследований, направленных на изучение их химической структуры и связанной с ней биологической активности на процессы ремоделирования KT и общее состояние организма, в отечественной литературе практически не встречается (Лунева С.Н., 2003), а единичных зарубежных исследований, носящих разрозненный характер (Xiao-hong Z. et al„ 2006; Chaturvedi Р. et al., 2008; Heaney R.P. et al., 2011), недостаточно для однозначных выводов о биологическом действии на организм данных комплексных соединений.

Таким образом, из-за широкого распространения ОП в популяции и его постоянного омоложения, коррекция метаболических нарушений KT приобретает все большее значение. В настоящее время нет препарата для восполнения минеральной плотности KT полностью отвечающего всем современным требованиям. Для создания такого препарата необходимо сочетание в его составе не только минеральной компоненты, но и органической составляющей KT, так как без наличия органической матрицы невозможно протекание процессов ее минерализации. К тому же весьма перспективным является математическое моделирование новых химических соединений и, уже на основе этих данных, разработка препарата и его экспериментальная и клиническая апробация. Таким образом, исследования и разработка новых действенных препаратов в направлении от моделирования к применению являются актуальными и

перспективными, необходимость их внедрения в практику не вызывает сомнения. Исходя из вышеизложенного, были определены цель и задачи исследования.

Цель исследования - оценка эффективности перорального введения синтезированных химическим путем аминоацильных комплексов кальция на биохимические показатели костного метаболизма в условиях антиортостатической гипокинезии и в процессе заживления перелома болыпеберцовой кости у экспериментальных животных.

Задачи исследования:

1. Исследовать биохимические изменения в сыворотке крови и костной ткани при антиортостатической гипокинезии у мышей и в процессе заживления перелома болыпеберцовой кости у крыс в условиях пищевого дефицита белка и кальция;

2. Получить аминокислотные комплексы кальция путем синтеза из неорганической соли и соответствующих аминокислот и изучить физико-химические свойства полученных соединений;

3. Сравнить эффективность перорального введения неорганической и органической форм кальция на биохимические показатели сыворотки крови и костной ткани мышей в условиях антиортостатической гипокинезии и крыс с переломом болыпеберцовой кости при обедненной белками и кальцием диете;

4. Оценить биологическую эквивалентность комплексных соединений кальция с различными аминокислотами и их дозозависимый эффект в эксперименте на крысах с переломом болыпеберцовой кости в условиях пищевого дефицита белка и кальция;

5. Изучить влияние перорального введения наиболее перспективной аминоацильной соли кальция на скорость остеосинтетических процессов в посттравматическом периоде у крыс с переломом болыпеберцовой кости при обедненной белками и кальцием диете.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Дефицит минеральных и белковых компонентов при антиортостатической гипокинезии и скелетной травме вызывает нарушения минерального и органического состава костной ткани и приводит к развитию остеомаляции и остеопороза.

2) Пероральное введение синтетических аминоацильных комплексов кальция ускоряет биохимические процессы репарации костной ткани при переломах, предотвращает развитие деструктивных процессов при иммобилизации и способствует накоплению кальция в костях.

Объекты исследования. Сыворотка крови и костная ткань интактных крыс и крыс с переломом большеберцовой кости, а также интактных мышей и мышей после гравитационной разгрузки задних конечностей, синтетические аминокислотные комплексы кальция.

Научная новизна. С помощью модельных квантово-химических расчетов впервые получены основные данные о структуре комплексных соединений кальция с аминокислотами и основные термодинамические характеристики исследуемых веществ. Впервые на основе ИК-спектроскопии установлены особенности комплексообразования кальция с аминокислотами. Впервые изучена возможность создания биологически активной добавки к пшце путем химического синтеза комплексных соединений из аминокислот и неорганических солей кальция, рассмотрены перспективы использования данных комплексов для восполнения недостатка кальция в организме. Впервые экспериментально доказано, что исследуемые аминоацильные комплексы кальция активируют процессы остеогенеза при пероральном способе введения, способствуя достоверному накоплению кальция в скелете. Определены количественные и качественные особенности изменения биохимических показателей крови и костной ткани при введении аминоацильных комплексов кальция в процессе заживления переломов большеберцовой кости и при иммобилизационной антиортостатической гипокинезии.

Теоретическая и практическая значимость работы. Показано, что экспериментальные данные об условиях образования, составе и основных термодинамических характеристиках комплексных соединений кальция с аминокислотами, а также о характере координации органических лигандов с атомом биогенного металла являются основой для разработки новых биологически активных веществ. Полученные в ходе исследования данные демонстрируют, что пероральное введение глицината и лизината кальция, смеси аминокислотных комплексов кальция активизирует биохимические процессы восстановления костной ткани при переломах большеберцовой кости, способствуя более быстрому созреванию костного матрикса и накоплению кальция в костях в посттравматическом периоде. Дополнительная добавка к ежедневному рациону в виде глицината кальция в условиях обедненной белками и кальцием диеты способствует увеличению минеральной плотности скелета, предотвращая развитие остеопении. С целью профилактики и превентивных мер, направленных на предотвращение падения минеральной плотности костной ткани целесообразно включать в ежедневный рацион аминоацильные комплексы кальция. Полученные данные имеют существенное значение для экспериментальной биологии, практической медицины и после клинических

исследований могут быть внедрены в практику. Результаты исследований рекомендуется использовать в дальнейших научных разработках при изучении влияния аминоацильных комплексов кальция на процессы метаболизма костной ткани в норме и при патологии. Полученные в ходе исследования данные и предложенные экспериментальные модели могут быть использованы при проведении научно-исследовательских работ.

Апробация работы. Основные положения доложены на научно-практической конференции молодых ученых «Аспирантские чтения. Современные проблемы послевузовского образования» (Курган, 2011); Российской конференции с международным участием «Илизаровские чтения» (Курган, 2012), на 8-ом съезде травматологов и ортопедов УРФО «Чаклинские чтения-2012» (Екатеринбург, 2012); на заседании научного общества ортопедов-травматологов (Курган, 2012), на VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013), на II Международном форуме «Инновации в медицине: основные проблемы и пути их решения. Высокотехнологичная медицина как элемент инновационной экономики» (Новосибирск, 2013). Работа стала дипломантом молодежного инновационного конкурса «У.М.Н.И.К. - 2012» по Курганской области.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 — в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в проводимом эксперименте и динамическом наблюдении за животными. Проведенные квантово-химические расчеты, а также материал, предоставленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах без списка литературы, включая 30 таблиц, 20 рисунков. Состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы из 269 источников, среди которых 195 - отечественные, 74 - зарубежные. Диссертационная работа выполнена по плану НИР ФГБУ РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова № 035/5-14.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 67 мышах-самцах линии СВА массой тела 25-30 г и 78 крысах линии Wistar массой тела 300±50 г. Осуществлен синтез восьми и изучение структуры и строения пяти аминокислотных комплексов кальция.

Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных; «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755); требованиями инструкции №12/313 Министерства

здравоохранения РСФСР «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06.01.1973 г.

Эксперимент был выполнен в два этапа. На первом этапе синтезировали и изучили физико-химические свойства аакСа. При построении молекулярных моделей АК и аакСа использовали графический редактор программного комплекса HyperChem (Соловьев М.Е., 2005), геометрию молекулярных моделей комплексов оптимизировали полуэмпирическим методом РМ-3 (Schmidt M.W. et al., 1993; Кобычев В.Б., 2006; Новоковская Ю.В., 2010). Исходными реактивами для синтеза служили глицин и а-АК L-ряда: лейцин, изолейцин, лизин, метионин, аргинин, пролин, фенилаланин марки ч.д.а. (Sigma-Aldrich, США) и безводный хлорид кальция марки ч.д.а. (Реактив, Россия). АакСа получали смешиванием растворов соответствующей АК и хлорида кальция (Накоскин А.Н. и др., 2012). Для качественного исследования состава полученных комплексов и полноты протекания химической реакции проводили прямое титрование раствора хлорида кальция глицином и наоборот. После установления состава анализируемого соединения смешивали растворы из расчета 1 моль хлорида кальция на 2 моль АК. Раствор замораживали и подвергали низкотемпературной вакуумной сушке на приборе LioLab 3000 (Heto-Holten, Дания) при -56±2°С и давлении 0,4 Па. Исследование структуры синтезированных аакСа проводили на ИК-Фурье спектрометре Nikolet 6700 (INTERTECH Corporation, США).

На втором этапе исследуемые комплексные соединения были протестированы на биологическую активность.

В первой серии экспериментов исследовали общие закономерности видового состава здоровой КТ и сыворотку крови (СК) на интактных мышах (13 животных) и крысах (7 животных).

Во второй серии экспериментов исследовали эффективность применения аакСа для регуляции метаболизма КТ, в условиях обедненной белками и кальцием диеты (ОБКД) на модели антиортостатической гипокинезии путем гравитационной разгрузки задних конечностей (ГРЗК) у мышей (Ломоносова Ю.Н. и др., 2009) и у крыс с переломом большеберцовой кости (ПББК) (Ирьянов Ю.М. и др., 2010).

Эффективность перорального потребления глицината кальция изучали на взрослых половозрелых мышах-самцах линии СБА. Животные были разделены на 3 экспериментальные группы, каждая из которых содержалась на ОБКД (хлеб из муки второго сорта и дистиллированная вода).

Первая (контрольная) группа (п=18) мышей служила группой сравнения. Во второй группе (п=18) мышам дополнительно ежесуточно перорально вводился раствор глицината кальция, содержащий 1 мг Са2+ на животное в сутки. Третьей группе (п=18) дополнительно ежесуточно перорально вводился раствор хлорида кальция, содержащий 1 мг Са2+ на животное в сутки.

В условиях заживления экспериментального ПББК изучали изменения костного метаболизма при пероральном потреблении аакСа у половозрелых крыс обоего пола линии Wistar. Крыс, согласно экспериментальным условиям,

разделили на 9 групп. Все животные после операции по моделированию ПББК содержались на ОБКД. В первую (контрольную) группу входили 9 крыс. Вторую группу составили 9 крыс, которые дополнительно имели свободный доступ к раствору Са(гли)2 в концентрации 10 мг/крысу в сутки в пересчете на Са2+. В третьей группе 9 крыс дополнительно получали по 10 мг Са2+ на животное в составе раствора соли хлорида кальция. Четвертая группа животных (п=9) ежесуточно получала добавку к питанию в виде раствора глицина в количестве 37,5 мг на каждое животное. Пятую группу составили 9 крыс, которые дополнительно имели свободный доступ к раствору Са(мет)2 в концентрации 50 мг/крысу в . сутки в пересчете на Са2+. В шестой группе 12 крыс дополнительно получали по 50 мг Са2+ на животное в составе раствора смеси комплексных соединений Ca(mix)2, содержащей в равных молярных соотношениях аминокислоты глицин, лизин, метионин, фенилаланин, аргинин, лейцин, изолейцин и пролин. Седьмая группа животных (п=4) ежесуточно получала добавку к питанию в виде раствора Са(лиз)2 в количестве 50 мг элементарного кальция на крысу. Восьмую (контрольную) группу составили 5 самок крыс в одинаковой стадии экстрального цикла. Девятую группу составили 5 самок в одинаковой стадии экстрального цикла, которые имели свободный доступ к раствору Са(лиз)2 в пересчете на 50 мг элементарного кальция на животное.

Из эксперимента мышей и крыс 1-6 групп выводили декапитацией после предварительного наркотизирования на 7, 14 и 28 сутки, крыс 7-9 групп - на 28-е сутки. Все манипуляции на мышах проводили под ингаляционным эфирным наркозом, на крысах — под общим наркозом путем внутримышечной инъекции по 0,2 мл каждого из препаратов Рометар и Золетил. после их разведения физиологическим раствором в 5 раз.

Для оценки интенсивности костного метаболизма у экспериментальных мышей в СК определяли общее содержание кальция, неорганического фосфата, магния, активность щелочной (ЩФ) и тартрат-резистентной кислой (трКФ) фосфатаз. У крыс в СК определяли содержание общего и ионизированного кальция, неорганического фосфата, общего магния, активность ЩФ и трКФ (кислой фосфатазы - для 8 и 9 группы крыс), общий белок биуретовым методом, концентрацию сиаловых кислот набором реагентов «СиалоТест 100» (Россия, СПб). В бедренных костях животных изучали содержание кальция, фосфата и коллагена (Col).

Для исследования активности ЩФ (К.Ф. 3.1.3.1.) и трКФ (К.Ф. 3.1.3.2.), а также количественного содержания электролитов использовали наборы фирмы «Vital Diagnostics Spb» (Россия), автоматические биохимические анализаторы «Stat Fax® 1904 Plus» (США) и Hitachi 902 (Швейцария).

Для оценки преобладания процессов костеобразования над процессами резорбции КТ был рассчитан индекс фосфатаз = ЩФ/трКФ (КФ - для 8 и 9 групп) (Десятниченко К.С., 1999). Концентрацию ионизированного кальция рассчитывали из содержания общего кальция по белку сыворотки (Данилова JI.A. и др., 2003).

Для анализа KT экспериментальных и контрольных групп животных выделяли большеберцовую кость (ББК) обеих конечностей. После вакуумной сушки в гомогенате KT определяли количество Col по оксипролину (Шараев П.Н. и др., 1990) и содержание минеральных компонентов - кальция и фосфатов наборами реагентов фирмы «Vital Diagnostics Spb» (Россия).

Для статистической обработки данных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (Гланц С., 1999). Достоверными считали различия при р<0,05. При статистической обработке результатов исследования был использован интеграторный модуль Attestat 1.0, разработанный в лаборатории информационно-вычислительного центра РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова И.П. Гайдышевым (Гайдышев И.П., 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оценка костного метаболизма при антиортостатической гипокинезии и переломе большеберцовой кости голени.

Проведенные исследования выявили, что 28-суточное вывешивание мышей за хвостовую складку под углом 45° при содержании животных на ОБКД оказывало существенное влияние на все исследуемые биохимические показатели костного обмена (рис. 1). Происходило достоверное повышение содержания уровня сывороточного кальция, регистрировалась выраженная тенденция снижения содержания Са2+ в КТ обездвиженных задних конечностей на 14-е и 28-е сутки эксперимента соответственно до 14,98 (р<0,05) и 14,30 (р<0,05) мг/100 мг кости при нормальном уровне костного кальция 16,20 мг/100 мг. На фоне снижения уровня кальция наблюдали относительный рост содержания в КТ Col на 35,9 (р<0,01) и 54,8% (р<0,001) к 14-м и 28-м суткам вывешивания.

В начальный

сыворотка

период иммобилизации наблюдалось резкое возрастание содержания магния в СК на 44,4% (р<0,001). Как правило, концентрационный сдвиг содержания магния в положительную сторону стимулирует процессы активизации функции остеокластов (Поворознюк В.В.,

Григорьева Н.В., 2011), что подтверждалось в эксперименте значительным возрастанием активности трКФ в СК к концу эксперимента с 3,3 до 15,4 Ед/л (р<0,001); на этом же сроке отмечалось снижение функциональной активности ЩФ на 87% (р<0,001). У подопытных животных

Продолжительность эксперимента, сут

Рис. 1. Динамика биохимических показателей СК и КТ мышей, содержащихся на ОБКД в условиях ГРЗК. Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001-достоверные различия при сравнении интактной группы с контрольной._

регистрировался рост уровня сывороточного фосфат-иона с 1,98 ммоль/л до 2 52 (р<0,01) и 2,73 (р<0,01) ммоль/л на 7-е и 14-е сутки эксперимента. Происходившее к концу эксперимента падение уровня неорганического фосфора в КТ на 17,5% с 28,76 мг/100 мг у интактных животных до 24,47 (р<0,01) мг/100 мг также указывало на преобладание катаболических процессов в КТ мышей в период ГРЗК.

Костный обмен крыс в посттравматическом периоде характеризовался временным повышением на 7-е и 14-е сутки эксперимента уровня общего кальция (рис. 2). На начальных сроках заживления перелома (7-е и 14-е сутки) наблюдали достоверный спад активности ЩФ с 169,9 Ед/л у интактной группы соответственно до 118,8 (р<0,05) и 99,3 (р<0,05) Ед/л, нормализация синтетической активности остеобластов и, следовательно, увеличение концентрации продукта их деятельности происходила к 28-ым суткам после операции. Установили, что на 28-е сутки после операции соотношение индекса фосфатаз значительно превышало дооперационные значения.

Зарегистрированный на 14-е послеоперационные сутки рост содержания сиаловых кислот в СК свидетельствовал об обострении на этом сроке воспалительных и резорбтивных процессов. В частности, в ответ на травму на 7-е сутки после операции регистрировалось снижение уровня общего белка, обусловленное, в первую очередь, преобладанием катаболических процессов в начальный посттравматический период и недостаточным поступлением белка с

Перераспределение ионов Са2+ в КТ после травмы сопровождалось лизисом кальция из нетравмированных частей скелета и постепенным накоплением его в месте перелома (рис. 3). Катаболические процессы с выбросом в кровоток кальция на начальном сроке фиксации (падение

содержания кальция в травмированной и

контрлатеральной (КЛ) конечностях на 16,5 (р>0,05) и 25,4% (р<0,01)) сменялись к 14-м суткам периодом накопления основного минерала в обеих конечностях. Однако в условиях ОБКД к 28-м суткам фиксации не происходило полного восстановления содержания остеотропного элемента в месте консолидации костных отломков.

пищеи.

Продолжительной* жспазимвита, су

Рис. 2. Динамика биохимических показателей СК крыс с ПББК, содержащихся на ОБКД.

ОБ - общий белок; Сиал - сиаловые кислоты; Р -

неорганический фосфат.

Примечание.см. рис. 1. _

В течение всего периода фиксации в условиях ОБКД прослеживалась четкая тенденция потери Col, как в здоровой, так и в травмированной конечности соответственно на 29,34% (р<0,05) и на 37,44% (р<0,05) к концу срока фиксации при нормальном уровне метаболита 17,76 мг/100 мг кости.

Таким образом, в условиях 28-суточной ГРЗК на фоне ОБКД у мышей регистрируется снижение содержания кальция и фосфата в КТ, в СК наблюдается повышение активности трКФ и концентрации кальция, снижение активности

В условиях ПББК на фоне ОБКД в КТ крыс регистрируется на начальном этапе

эксперимента падение уровня кальция и Col, в СК снижение

концентрации фосфат-иона, активности ЩФ, гипопротеинемия и гипомагниемия, рост содержания кальция. ОБКД усугубляет глубину протекающих в КТ деструктивных процессов, тормозит процессы репаративного остеосинтеза, отодвигая активацию анаболических процессов в посттравматическом периоде на более поздние сроки.

Разработка средства на основе синтетических аминоацильных комплексов кальция, направленного на профилактику и восполнение потерь минеральной плотности костной ткани.

Квантово-химическое моделирование структуры аминоацильных комплексов кальция. Нами были построены молекулярные модели для аминокислотных комплексов кальция с глицином, аланином, лейцином, лизином и аргинином с геометрией, оптимизированной полуэмпирическим методом РМ-3 (Сигал Дж., 1980; Кобзев Г.И., 2004; Блатов В.А. и др., 2005), рассчитаны геометрические характеристики связи кальций-глицин и термодинамические функции исследуемых молекул. Выявлено, что при образовании комплекса с кальцием в молекулах глицина происходят изменения, касающиеся только ближайших к атому кальция связей. Связь кальция с атомами кислорода носит ионный характер, азот аминогруппы АК не принимает участие в образовании связи.

Таким образом, модельными расчетами подтверждена возможность образования устойчивых комплексных соединений кальция с АК глицин, аланин, лейцин, лизин, аргинин состава Са(АК)2.

ЩФ.

_Продолжительность эксперимента, сут_

Рис. 3. Динамика биохимических показателей костной ткани крыс с ПББК в условиях ОБКД. П - перелом; Кл - контрлатеральная конечность. Примечание.см. рис. 1._

Синтез аминоацильных комплексов кальция. После установления расчетными и экспериментальными методами оптимального состава аакСа нами были синтезированы комплексы кальция с АК: гли, лиз, мет, лей, иле, фен, про, арг. Полученные соединения представляют собой белый кристаллический порошок, очень хорошо растворимы в воде.

Исследование структуры синтетических аминоацильных комплексов кальция методом ИК-спектроскопии. С целью получения данных о наличии связи металл-лиганд при образовании комплекса кальция с АК были сняты ИК-спектры поглощения исходных АК и их бинарных комплексов с кальцием (рис. 4).

120 100 80

; 60 40 20 о

400

ГЛИЦИН

1400

V, см1

2400

3400

400

140\см-1 2400

3400

100 80 ^60 •"'до

20 0

400

1400у см"1 2400

3400

V, СМ"1

г*

120 1С» 80 60 40 20 О

-Са(арг)2 -аргинин

400

1400

V, СМ"

, 2400

Рис. 4. Спектры АК и аакСа, снятые на ИК-спектрометре методом прессования таблеток с КВг.

| Т - коэффициент пропускания, %; у - частота колебаний, см"1_

Наибольшие различия при рассмотрении ИК-спектров регистрировали в областях валентных колебаний аминогрупп: происходило общее смещение «аммонийной полосы» в высокочастотную область, исчезновение или падение интенсивности

пика NH3+ группы и появление максимумов поглощения свободных NH2 групп. При взаимодействии кальция с цвиттер-ионами аминокислот не наблюдалось появление пиков координированной аминогруппы, регистрировалось повышение частот валентных колебаний vas (NH2) и vs (NH2). Валентные симметричное vs и асимметричное va колебания -СОО" группы не претерпевали существенных изменений, что может указывать на ионный характер связи в исследуемых комплексах.

Таким образом, нами выявлено, что образование связи между АК и кальцием происходит за счет взаимодействия карбоксильного кислорода АК с ионом кальция. К тому же, так как полосы валентных колебаний СОО"-групп не испытывают заметного смещения относительно полос исходных цвитгер-ионов лигандов, можно судить об ионном типе связи Са-О.

Сравнение эффективности применения органической и неорганической соли кальция для профилактики снижения минеральной плотности костной ткани.

Нами было проведено изучение в сравнительном аспекте влияния перорального введения неорганической (СаС12) и органической (Са(гли)2) соли кальция на биохимические показатели СК и КТ мышей в условиях ГРЗК и крыс в процессе сращения ПББК при ОБКД.

Наиболее чувствительной к иммобилизации в условиях ОБКД оказалась ферментативная активность СК. Введение в пищевой рацион неорганической соли не предотвратило резкое снижение активности ЩФ. К 7-ым суткам активность анализируемого фермента снизилась на 84% (р<0,001), к концу эксперимента понижение достигло 90% (р<0,001) (рис. 5а)._

—«—норма -«-контроль -и-НСа * ♦ ft ' O Са

О 7 14 21 28

Продолжительность эксперимента, сут.

о г м ai г®

П^родшашйнмиииосич» «у*.

Рис. 5. Динамика активности ЩФ (а) и трКФ (б) в СК мышей в условиях ГРЗК с применением солей кальция. НСа - неорганическая Примечание.см. рис. 1.

солей кальция.

НСа - неорганическая соль кальция; ОСа - органическая соль кальция. Примечание.см. цис. 1.

Уровень ЩФ в СК животных с дополнительным введением в рацион органической формы кальция снижался менее интенсивно: максимальное падение на 60% (р<0,001) было зафиксировано на 7-е сутки после ГРЗК, в дальнейшем активность фермента немного возросла. Пероральное введение солей кальция препятствовало значительному росту активности маркера деструкции клеток КТ - трКФ (рис. 56). Нами зарегистрировано достоверное повышение содержания

уровня сывороточного кальция во всех подопытных группах (рис. 6а). Для установления источника поступления кальция в кровоток контролировали уровень костного и сывороточного иона (Lemann J.I., 1993; Peacock М., 2010). Деструктивных процессов в KT мышей с дополнительным поступлением в пищевой рацион неорганической соли кальция на исследуемых сроках эксперимента выявлено не было.

Наблюдаемое в группе животных с дополнительным введением органической соли постепенное накопление кальция в KT на фоне повышения его концентрации в CK свидетельствовало о том, что электролит поступал в кровь не за счет процессов резорбции кости, а из желудочно-кишечного тракта в составе органического соединения. При анализе включения в состав KT кальция в условиях ОБКД к концу эксперимента отметили достоверный рост содержания данного минерала в KT мышей при его введении в органической форме на 16,99% (р<0,05) относительно группы мышей, в рацион которых данный элемент поступал в виде неорганической соли.

2_ Для более полного анализа качества KT рассчитывали коэффициент Ca /Col, позволяющий оценить сдвиги в соотношении минеральной и органической компоненты. Восполнение кальциевой недостаточности за счёт обогащения пищевого рациона органической солью кальция сопровождалось сохранением соотношения Са/Со1 в пределах нормы (рис. 66). В группе мышей с пероральным введением неорганической формы кальция данное соотношение было достоверно ниже нормы за счет повышения уровня Col в KT._

Рис. 6. Концентрация общего кальция в СК (а) и соотношение минеральной (Са2+) и органической (Col) компоненты в КТ мышей (б) в условиях ГРЗК и ОБКД с применением солей кальция. ОСа- органическая соль кальция; НСа - неорганическая соль кальция. Примечание см. рис. 1._

Применение в качестве дополнительного источника кальция его неорганической соли у крыс с ПББК при ОБКД приводило к восстановлению уровня остеотропного элемента на 28-е сутки до дооперационных показателей (рис. 7). При введении кальция в органической форме на 28-е сутки при сравнении с дооперационными показателями выявили в KJI кости достоверный рост содержания кальция на 11,5% при р<0,05. Дополнительное введение экзогенной АК в период срастания костных отломков не предотвратило потерю

органической компоненты кости, однако препятствовало снижению содержания кальция в обеих конечностях. Следует отметить тот факт, что, когда применялась органическая соль кальция, к концу эксперимента отмечался рост содержания Col в КТ до уровня дооперационных показателей, в то время как в группе с введением неорганической соли данное явление было выражено слабее.

1-контроль

2-глицин

3-неорганическая соль __кальция__

4-органическая соль _ кальция

Рис. 7. Содержание кальция, фосфата и Col (мг/100 мг ткани) в ББК у крыс экспериментальных групп при ОБКД с применением солей кальция.

Примечание: И - интактные животные; 7-П, ) 4-П, 28-П - сутки эксперимента, перелом; 7-Кл, 14-Кл, 28-Кл - сутки эксперимента, контрлатеральная конечность.

* - значимые отличия по сравнению с интактной группой при р<0,05._

Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что пероральное введение неорганической формы кальция в условиях 28-суточной ГРЗК на фоне ОБКД предотвращало развитие деструктивных процессов в обездвиженных конечностях, способствовало восполнению минерального состава КТ в 28-суточный период после травмы ББК. Стимуляция костного обмена за счет дополнительного введения экзогенного кальция в органической форме приводила к повышению содержания кальция в костях мышей при 28-суточной иммобилизации, ускоряла сроки минерализации костных отломков в процессе сращения ПББК у крыс, приводя к достоверному накоплению кальция в костях. Сравнение биодоступности органической и неорганической форм кальция для КТ выявило, что введение в рацион животных органической формы остеотропного элемента являлось более эффективным, так как наблюдалось не только нивелирование отрицательных последствий в результате иммобилизации и при нарушении целостности кости, но и происходило достоверное накопление минерального компонента в скелете экспериментальных животных относительно аналогичных показателей группы интактных животных.

Определение биологической эквивалентности различных аминокислотных комплексов кальция и их дозозависимый эффект.

Для установления оптимального состава входящих в комплексное соединение АК нами был проведен мониторинг эффективности усвоения смеси аакСа, метионата кальция и лизината кальция. При определении дозозависимого эффекта сравнивали влияние разных концентраций вводимого препарата на биохимический состав СК и КТ крыс с ПББК.

Сравнительный анализ количественного состава костей крыс, в рацион которых, в первом случае входила смесь аакСа, а во втором - лизинат кальция не выявил существенных различий в содержании кальция, фосфата и Col к концу эксперимента (рис. 8)._

80 -|МСУ ■POi* ИСо||-----------------------

- д . ............-—f—'о ■ | |psu......_ ---A i 1.

60------s-— - - 60 1 ¿ ? Z -

50 '-Si r f i II^

Jïff|M

H m 12Я ít-7 H4 11-28 01-2« IV-7 IV-14ÍV2« И 1-1« H» 11-7 И-14 U-2J Ц|-2в IV-7 ÍV-MÍV 7I

перелом контрлатеральная конечность_

Рис. 8. Содержание кальция, фосфата и Col (мг/100 мг) в ББК у крыс в месте перелома и в КЛ конечности при пероральном введении аакСа в условиях ОБКД. I-глицинат кальция, П-метионат кальция, III-лизинат кальция, IV-смесь аакСа; 7,14, 28 - сутки эксперимента;

И Са, И Р, И Col - содержание кальция, фосфата и Col в ББК интактных животных. Примечание: см. рис. 1._

Исследование показало, что пятикратное повышение дозы вводимого кальция в составе аминокислотных комплексов значительно сокращало сроки наступления анаболической фазы, характеризующейся накоплением основных минеральных компонентов в скелете, с 28-ми до 7-ми суток. Однако к концу эксперимента достоверных различий в содержании кальция в ББК обеих конечностей между I, III и IV группами выявлено не было.

Наличие отталкивающих органолептических свойств раствора содержащего метионат кальция, привело к отказу от его потребления экспериментальными животными, и, как следствие, к обезвоживанию организма, усиливающего процессы костной деминерализации. В течение всего срока эксперимента наблюдалось постепенное снижение содержания кальция с 22,17 до 14,29 мг/100 мг в месте перелома и до 15,74 мг/100 мг в нетравмированной ББК. В процентном соотношении достоверная убыль в месте перелома на 7-е, 14-е и 28-е сутки после получения травмы составила соответственно 30,7 (р<0,01), 33,6 (р<0,01), 35,5% (р<0,01) и в здоровой ББК - 17,2 (р<0,01), 25,8 (р<0,01), 29,0% (р<0,01).

Таким образом, в силу того, что метионат кальция в высокой концентрации обладает отталкивающими для животных органолептическими показателями (запах), изучить его включение в рацион крыс не предоставляется возможным. Повышение дозы вводимого препарата аакСа сокращает с 28-ми до 7-ми суток сроки активации остеосинтетических процессов в КТ. На 28-е сутки не выявляется достоверных различий в содержании кальция и фосфата в ББК

крыс с дополнительным пероральным поступлением в рацион 10 и 50 мг элементарного кальция в составе аминокислотных комплексов кальция.

Экспериментальная апробация препарата аминокислотной соли кальция для восполнения недостатка кальция при переломе большеберцовой кости.

При заживлении ПББК у самок крыс, находящихся в пострепродуктивном периоде на фоне ОБКД, наблюдалось повышение активности кислой фосфатазы более чем в 5 раз (р<0,01), активность ЩФ была достоверно ниже, чем в группе животных с дополнительным поступлением в организм Са(лиз)2 (табл. 5). Повышенные значения индекса фосфатаз при 28-суточном поступлении в организм животных аакСа указывали на остеосинтетические процессы, активно протекающие на фоне снижения в СК уровня магния на 9,8% (р<0,01), общего и ионизированного кальция соответственно на 36,3 (р<0,01) и 39,5% (р<0,01).

Высокие показатели уровня кальция в крови крыс контрольной группы, вероятнее всего, свидетельствовали о протекании ярко выраженных деструктивных процессов в скелете. В СК крыс опытной группы отмечалось значимое повышение содержания неорганического фосфата, низкая концентрация сиаловых кислот в посттравматическом периоде свидетельствовала о более ранней нормализации процессов распада органического компонента костного матрикса, характеризующего высокую интенсивность восстановительных процессов. Содержание общего белка в условиях ОБКД при дополнительном введении препарата кальция было значительно выше, чем в группе контроля, что также являлось благоприятным фактором репаративных процессов в КТ.

Таблица 1

Основные биохимические показатели СК самок крыс с ПББК в условиях ОБКД1

Показатель, ед. изм.

Кислая фосфатаза, Ед/л

Щелочная фосфатаза, Ед/л

Контрольная(п=5)

Группа животных

9,6 (8,7;10,1)

111,4 (86,3;118,6)

Опытная(п=5)

1,8**(1,7;2,5)

133,3 *( 124,4; 150,9)

Индекс фосфатаз

12,4 (8,5;14,7)

66,2**(57,7;69,1)

Общий белок, ммоль/л

Сиаловые кислоты, моль/л

49,9 (48,9;52,5)

57,4**(56,1;57,9)

4,65 (4,43;4,78)

4,17**(4,02;4,27)

Са , ммоль/л

Са

2,89 (2,82;2,90)

ммоль/л

1,84* *(" 1,84; 1,89)

, ммоль/л

1,52 (1,50;!,55)

0,92**(0,91;0,92)

—5"

Р04ммоль/л

0,82 (0,81 ;0,84)

0,74**(0,74;0,76)

1,62(1,60;!,66)

1,74*(1,68;1,81)

- в таблице представлены медианы значений и интерквартильный размах признака М (25%; 75%). Примечание: * -р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001- достоверные различия при сравнении контрольной группы с опытной.

Качественные изменения состава КТ крыс через 28 суток после перелома при пероральном введении лизината кальция затрагивали как минеральную составляющую скелета, так и органическую (рис. 9).

Изучение биохимических показателей КТ животных после приема лизината кальция показало, что в месте перелома и в KJI конечности прирост

содержания кальция

соответственно составил 44,0 (р<0,01) и 43,4% (р<0,01), фосфата - 9,7

(р>0,05) и 17,2% (р<0,01), Col - 11,2 (р<0,05) и 7,5% (р<0,05). Отношение Са/Р, характеризующее

качественный состав минеральной фазы матрикса в 1,13 (р<0,01) и 1,23 (р<0,01) раза превышал значения аналогичного показателя контрольной группы крыс соответственно в месте перелома и в KJT конечности.

Таким образом, применение лизината кальция в качестве препарата для восполнения дефицита кальция на фоне обедненного белками и кальцием рациона приводит к снижению активности кислой фосфатазы, повышению функциональной активности остеобластов, вырабатывающих ЩФ, снижению уровня кальция и магния, повышению содержания неорганического фосфата и ОБ, падению концентрации СК; в КТ наблюдается увеличение содержания кальция, фосфата и Col, рост коэффициента Са/Р по сравнению с аналогичными показателями КТ контрольной группы.

контрлатеральвав ______коненв ость

Рис. 9. Содержание кальция, фосфата и Col (мг/100 мг ткани) в ББК у крыс контрольной (К) и экспериментальной (Э) групп с ПББК на 28-е сутки после травмы. Примечание, см. табл. 5._

ВЫВОДЫ

1 ■ В условиях иммобилизационной гипокинезии на фоне обедненной белками и кальцием диеты у мышей происходит развитие остеомаляции, выражающееся в снижении содержания кальция и фосфата в костной ткани, повышении активности тартратрезистнетной кислой фосфатазы и концентрации кальция, снижении активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови.

2. При переломе болыпеберцовой кости на фоне недостатка белка и кальция в костной ткани крыс наблюдается падение уровня кальция и коллагена, в сыворотке крови - снижение концентрации неорганического фосфата, магния' общего белка, активности щелочной фосфатазы, что в целом соответствует картине остеопороза.

3. Термодинамическими расчетами подтверждено образование устойчивых комплексных соединений кальция с аминокислотами состава Са(АК)2. Методом ИК-спектроскопии установлено: спектры синтезированных соединений кальция с аминокислотами принципиально отличаются от спектров исходных аминокислот; отмечено отсутствие взаимодействия азота аминогруппы

с атомом металла; связь кальция с кислородом карбоксильной группы аминокислоты носит ионный характер.

4. Аминокислотный состав комплексов кальция не является определяющим фактором при адресной доставке остеотропного элемента в кость; повышение дозы вводимого препарата значительно сокращает сроки активации анаболических процессов.

5. Пероральное введение аминоацильных комплексов кальция позволяет не только предотвратить развитие деструктивных процессов в костной ткани у экспериментальных животных, но и способствует достоверному накоплению в ней кальция.

6. Введение в рацион животных с выраженными старческими изменениями синтетических аминоацильных комплексов кальция приводит к нормализации основных биохимических показателей сыворотки крови и к улучшению качественного состава костной ткани.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1) Ваганова Л.А. Квантово-химическое моделирование аминоацильных комплексов кальция и оценка возможности их применения для восполнения дефицита кальция [Электронный ресурс] / А.Н. Накоскин, Б.С. Воронцов, С.Н. Лунева, Л.А. Ваганова // Современные проблемы науки и образования. — 2012. — № 3. - Режим доступа: 1гир:/Лу\^.5Ыепсе-education.ru/103-6224 (Список ВАК, РИНЦ-0,204; авт. 0,38п.л.).

2) Ваганова Л.А. Синтез глицината кальция и влияние его перорального введения на биохимические показатели костного метаболизма мышей и крыс / С.Н. Лунева, А.Н. Накоскин, Л.А. Ваганова // Химико-фармацевтический журнал. - 2013.— Т.47. — №3.- С. 70-74. (Список ВАК, РИНЦ-0,390; авт. 0,26 пл.).

3) Ваганова Л.А. Влияние глицината кальция на биохимические показатели состава костной ткани мышей при гипокинезии / Л.А. Ваганова, А.Н. Накоскин // Вестник РГМУ. Периодическое медицинское издание. - М.: ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России. -2013, Специальный выпуск №1. - С. 175-176. (Список ВАК, РИНЦ-0,081; авт. 0,05 пл.).

4) Ваганова Л.А. Методические аспекты квантовохимического моделирования аминокислотных комплексов кальция / А.Н. Накоскин, Б.С. Воронцов, Л.А. Ваганова // Вестник Курганского государственного университета. - 2011.- №2(21).- С. 120-123.

5) Ваганова Л.А. Метаболизм костной ткани крыс при пероральном введении аминокислотных комплексов кальция / С. Н. Лунева, А. Н. Накоскин, Л. А. Ваганова // Зауральский научный вестник. - 2012. - № 2. - С. 78-82.

6) Ваганова Л.А. Биохимические показатели сыворотки крови собак при заживлении внутрисуставных переломов вертлужной впадины / С.Н. Лунева, И.В. Шипицина, А.Н. Накоскин, Л.А. Ваганова, С.А. Мельников // Вестник Курганского государственного университета. - 2012 - №4 - С 104-107.

7) Ваганова Л.А. Влияние глицината кальция на биохимические показатели сыворотки крови при сращении перелома голени у крыс / С. Н. Лунева, А. Н. Накоскин, Л. А. Ваганова // тез. конф. «Аспирантские чтения. Современные проблемы послевузовского образования»- Курган - 2011 - С. 93-95.

8) Ваганова Л.А. Влияние глицината кальция на биохимические показатели костного метаболизма / С. Н. Лунева, А. Н. Накоскин, Л. А. Ваганова // тез.конф. «Илизаровские чтения».- Курган. - 2012.-С. 170-171.

9) Ваганова Л.А. Перспективы применения аминокислотных комплексов кальция для восполнения кальциевой недостаточности у крыс в посттравматическом периоде / С. Н. Лунева, А. Н. Накоскин, Л. А. Ваганова // Инновации в медицине: основные проблемы и пути их решения. Высокотехнологичная медицина как элемент инновационной экономики: мат. II Междунар. Форума. - Новосибирск. - 2013. - С. 7-11.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

аакСа - аминоацильные комплексы кальция;

АК - аминокислоты;

ББК - большеберцовая кость;

ГРЗК - гравитационная разгрузка задних конечностей; KJI - контрлатеральная; КТ - костная ткань;

ОБКД - обедненная белками и кальцием диета; ОП - остеопороз;

ПББК - перелом большеберцовой кости;

Ca(mix)2 - смесь аминокислотных комплексов кальция;

СК - сыворотка крови;

Col - коллаген;

трКФ - тартратрезистентная кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2); ЩФ-щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1).

Тираж 100 экземпляров. Заказ № 3609. Отпечатано в типографии «Печатный двор». 640000, г. Курган, ул. Гоголя, 16

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ваганова, Людмила Анатольевна, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР «ВОССТАНОВИТЕЛЬНАЯ ТРАВМАТОЛОГИЯ И ОРТОПЕДИЯ» ИМЕНИ АКАДЕМИКА Г.А. ИЛИЗАРОВА» МИНЗДРАВА РОССИИ

0420145

77-ти

на правах рукописи

Ваганова Людмила Анатольевна

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ АМИНОАЦИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ВОСПОЛНЕНИЯ ДЕФИЦИТА

КАЛЬЦИЯ

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. Лунева С.Н.

Казань-2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Состав костной ткани...................................................................10

1.2. Наиболее распространенные заболевания скелета, связанные с потерей минеральной плотности костной ткани.............................................13

1.3. Современные препараты и биологически активные добавки для коррекции минеральной плотности костной ткани..............................................17

1.4. Хелатные комплексы в клинической практике.....................................24

1.5. Методы исследования структуры молекул.........................................26

1.5.1. Квантово-химическое моделирование.......................................26

1.5.2. ИК-спектроскопия................................................................28

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы и структура исследования..................................................31

2.1.1. Описание моделей................................................................32

2.1.2. Схема эксперимента..............................................................33

2.2. Методы исследования.....................................................................35

2.2.1. Квантово-химическое моделирование, синтез и исследование структуры комплексных соединений кальция с аминокислотами..............35

2.2.2. Биохимические методы исследования.......................................37

2.2.3. Статистические методы.........................................................40

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оценка костного метаболизма при антиортостатической гипокинезии и переломе большеберцовой кости голени...................................................41

3.2. Разработка средства на основе синтетических аминоацильных комплексов кальция, направленного на профилактику и предотвращение потерь минеральной плотности костной ткани......................................................................49

3.2.1. Получение и изучение препарата на основе аминоацильных комплексов кальция......................................................................50

3.2.2. Сравнение эффективности применения органической и неорганической соли кальция для профилактики и предотвращения потерь минеральной плотности костной ткани...................................................72

3.2.3. Определение биологической эквивалентности различных аминокислотных комплексов кальция и их дозозависимый эффект...........98

3.3 Экспериментальная апробация препарата аминокислотной соли кальция для восполнения кальциевой недостаточности при переломе большеберцовой кости...............................................................................................109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................116

ВЫВОДЫ........................................................................................123

Список часто употребляемых аббревиатур...............................................125

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................126

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Прогресс медицинской науки и начавшийся во второй половине XX века экономический подъем, привели к увеличению продолжительности жизни людей (Верткин A.JI. и др., 2008; Лазарев А.Ф. и др., 2010; Ардатов C.B. и др., 2012). Современное общество стало стремительно стареть и столкнулось с новыми проблемами, одна из которых - лавинообразный рост числа тяжелейших переломов (Bürge R. et al., 2007; Норой Л., 2010; Arakaki H. et al., 2011). Помимо этого в развитых странах началась «эпидемия» остеопороза (ОП), одной из болезней цивилизации, обусловленной, как это ни парадоксально, улучшением качества жизни (Lips Р., 1997; Беневоленскаг Л.И., 2003; Максимов М.Л., 2013). По данным ВОЗ, ОП среди неинфекционных заболеваний занимает четвертое место после сердечно-сосудистых, онкологических заболеваний и сахарного диабета (Доскина Е.В., 2011). В настоящее время остается актуальным вопрос поиска новых более эффективных и экономически более выгодных лекарственных средств, направленных на фармакологическую коррекцию данного заболевания. Особый интерес, как перспективные препараты для направленной транспортировки кальция в костную ткань (KT), вызывают комплексные соединения кальция с аминокислотами. Повышенное внимание к этому классу препаратов обусловлено, прежде всего, тем, что данные соединения обеспечивают лучшую ассимиляцию металла, чем при введении его в рацион в неорганической или какой-либо другой форме (Heaney R.P. et al., 1990; Леменовский Д.А., 1997; Johansson А., 2008), тем самым обеспечивая повышение эффективности всасывания препаратов в желудочно-кишечном тракте и снижение вводимых доз вещества, к тому же для их усвоения не требуется витамин D3 (Метельский С.Т., 2007; Ребров В.Г., Громова O.A.,

2008). В настоящее время хелатные аминоацильные комплексы кальция (аакСа) входят в состав некоторых биологически активных препаратов. Между тем, научных исследований направленных на изучение химической структуры и связанной с ней биологической активности аакСа на процессы ремоделирования КТ и общее состояние организма в отечественной литературе практически не встречается (Лунева С.Н., 2003; Курочкин В.Ю. и др., 2011), а единичных зарубежных исследований, носящих разрозненный характер (Неапеу Я.Р. е1 а1., 1990;Х1ао-Ьоп§ Ъ. е1 а1., 2006; СЬаШгуесП Р. е1 а1., 2008), недостаточно. К тому же известно, что для химических элементов второй группы главной подгруппы периодической системы не характерно образование комплексных соединений, но, однако, полностью не исключается (Кукушкин Ю.Н., 1985; Болотин С.Н. и др., 2008; Курочкин В.Ю. и др., 2011). Открытым остается также вопрос о возможности получения данных соединений не только биологически, путем выделения из животных тканей, но и с помощью химического синтеза. Проведенный анализ литературных данных не позволяет дать определенный ответ на вопрос - является ли перспективным использование синтетических аминоацильных комплексов кальция в комплексной терапии заболеваний опорно-двигательной системы, вызванных недостатком данного макроэлемента, так как сообщения на эту тему носят весьма фрагментарный характер.

Таким образом, хочется отметить, что, благодаря широкому распространению ОП в популяции и его постоянному омоложению, коррекция метаболических нарушений КТ приобретает все большее значение. В настоящее время нет препарата для восполнения минеральной плотности костной ткани (МПКТ) полностью отвечающего всем современным требованиям. Для создания такого препарата необходимо сочетание в его составе не только минеральной компоненты, но и органической составляющей КТ, так как без наличия органической матрицы невозможно протекание процессов ее минерализации. В настоящее время весьма перспективным является математическое моделирование новых химических соединений и, уже на основе этих данных, разработка препарата и его экспериментальная и клиническая апробация. Таким образом,

исследования от моделирования к применению являются актуальными и перспективными, необходимость их внедрения в практическую медицину не вызывает сомнения. Исходя из вышеизложенного, были определены цель и задачи исследования.

Цель исследования - оценка эффективности перорального введения синтезированных химическим путем аминоацильных комплексов кальция на биохимические показатели костного метаболизма в условиях антиортостатической гипокинезии и в процессе заживления перелома большеберцовой кости у экспериментальных животных.

Задачи исследования:

1. Исследовать биохимические изменения в сыворотке крови и костной ткани при антиортостатической гипокинезии у мышей и в процессе заживления перелома большеберцовой кости у крыс в условиях пищевого дефицита белка и кальция;

3. Сравнить эффективность перорального введения неорганической и органической форм кальция на биохимические показатели сыворотки крови и костной ткани мышей в условиях антиортостатической гипокинезии и крыс с переломом большеберцовой кости при обедненной белками и кальцием диете;

4. Оценить биологическую эквивалентность комплексных соединений кальция с различными аминокислотами и их дозозависимый эффект в эксперименте на крысах с переломом большеберцовой кости в условиях пищевого дефицита белка и кальция;

5. Изучить влияние перорального введения наиболее перспективной аминоацильной соли кальция на скорость остеосинтетических процессов в посттравматическом периоде у крыс с переломом большеберцовой кости при обедненной белками и кальцием диете.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Дефицит минеральных и белковых компонентов при антиортостатической гипокинезии и скелетной травме вызывает нарушения минерального и органического состава костной ткани и приводит к развитию остеомаляции и остеопороза.

2. Пероральное введение синтетических аминоацильных комплексов кальция ускоряет биохимические процессы репарации костной ткани при переломах, предотвращает развитие деструктивных процессов при иммобилизации и способствует накоплению кальция в костях.

Объекты исследования. Сыворотка крови и костная ткань крыс с переломом большеберцовой кости и мышей после гравитационной разгрузки задних конечностей, синтетические аминокислотные комплексы кальция.

Научная новизна. С помощью модельных квантово-химических расчетов впервые получены основные данные о структуре комплексных соединений кальция с аминокислотами и основные термодинамические характеристики исследуемых веществ. Впервые на основе ИК-спектроскопии установлены особенности комплексообразования кальция с аминокислотами. Впервые изучена возможность создания биологически активной добавки к пище путем химического синтеза комплексных соединений из аминокислот и неорганических солей кальция, рассмотрены перспективы использования данных комплексов для восполнения недостатка кальция в организме. Впервые экспериментально доказано, что исследуемые аминоацильные комплексы кальция активизируют процессы остеогенеза при пероральном способе введения, способствуя достоверному накоплению кальция в скелете. Определены количественные и качественные особенности изменения биохимических показателей крови и

костной ткани при пероральном введении аминоацильных комплексов кальция в процессе заживлении переломов болыиеберцовой кости и при экспериментальном остеопорозе. Проведенные исследования расширяют представления о биологическом действии на сыворотку крови и костную ткань, химическом строении и структуре аминокислотных комплексов кальция.

Теоретическая и практическая значимость работы. Показано, что экспериментальные данные об условиях образования, составе и основных термодинамических характеристиках комплексных соединений кальция с аминокислотами глицин, лейцин, аланин, лизин, метионин, аргинин, а также о характере координации органических лигандов с атомом биогенного металла являются основой для разработки новых биологически активных веществ. Полученные в ходе исследования данные демонстрируют, что пероральное введение глицината и лизината кальция, смеси аминокислотных комплексов кальция активизирует биохимические процессы восстановления костной ткани при переломах болыиеберцовой кости, способствуя более быстрому созреванию костного матрикса и накоплению кальция в костях в посттравматическом периоде. Дополнительная добавка к ежедневному рациону в виде глицината кальция в условиях обедненной белками и кальцием диеты способствует увеличению минеральной плотности скелета, предотвращая развитие остепении. С целью профилактики и превентивных мер, направленных на предотвращение падения минеральной плотности костной ткани целесообразно включать в ежедневный рацион аминоацильные комплексы кальция. Полученные данные имеют существенное значение для экспериментальной биологии, практической медицины и после клинических исследований могут быть внедрены в практику. Результаты исследований рекомендуется использовать в дальнейших научных разработках при изучении влияния аминоацильных комплексов кальция на процессы метаболизма костной ткани в норме и при патологии. Полученные в ходе исследования данные и предложенные экспериментальные модели могут быть использованы при проведении научно-исследовательских работ, а также в спецкурсах и спецпрактикумах по координационной химии в ВУЗах.

Апробация работы. Основные положения доложены на научно-практической конференции молодых ученых «Аспирантские чтения. Современные проблемы послевузовского образования» (Курган, 2011); Российской конференции с международным участием «Илизаровские чтения» (Курган, 2012), на 8-ом съезде травматологов и ортопедов УРФО «Чаклинские чтения-2012» (Екатеринбург, 2012); на заседании научного общества ортопедов-травматологов (Курган, 2012), на VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013), на II Международном форуме «Инновации в медицине: основные проблемы и пути их решения. Высокотехнологичная медицина как элемент инновационной экономики» (Новосибирск, 2013). Работа стала дипломантом областного молодежного инновационного конкурса «У.М.Н.И.К. - 2012».

Публикации: по теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 - в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ.

Структура и объем диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы.

Полный объем диссертации - 151 страница печатного текста, без списка литературы - 125 страниц; иллюстрирована 20 рисунками, 30 таблицами. Указатель литературы содержит 269 публикаций, из них 74 зарубежных. Диссертационная работа выполнена по плану НИР ФГБУ РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова № 035/5-14.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Состав костной ткани

КТ - одна из разновидностей специализированной соединительной ткани, которая вместе с хрящевой тканью составляет скелетную систему. Масса КТ без костного мозга у взрослого человека составляет 10% от массы тела. Главные функции, осуществляемые КТ - механическая, защитная и метаболическая (Русаков А.В., 1959; Торбенко В.П., Касавина Б.С., 1977; Чиркин А.А., Данченко Е.0.,2010).

Общеизвестно, что основными компонентами КТ являются клетки и внеклеточный матрикс (Касавина Б.С., Торбенко В.П., 1979; Серов В.В., Шехтер

A.Б., 1981; Bonucci Е., 2007; Фигурска М., 2007). Межклеточное вещество содержит органические и большое количество минеральных компонентов, главным образом солей кальция, обеспечивающих основные отличительные особенности кости - твердость, упругость и механическую прочность (Торбенко

B.П., Касавина Б.С., 1977; Браунвальд Е. и др., 1997; Bonucci Е., 2007). Межклеточный органический матрикс компактной кости составляет около 20%, неорганические вещества - 70% и вода - 10% (Касавина Б.С., Торбенко В.П., 1979; Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Vashishth D., 2007). В таблице 1 представлен химический состав ББК человека по данным Л.И. Слуцкого (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998).

Органический матрикс костной ткани. Органическая основа КТ построена из белковых веществ, входящих главным образом в структуру оссеина. Состав оссеина (в %): влага - 70, белковые вещества - 25-28, минеральные вещества - 3, жиры - 0,2. Основной белок КТ - Col - составляет 90-93% всех белков ткани (Торбенко В.П., Касавина Б.С. , 1977; Чиркин А.А., Данченко Е.О.,

2010). Вместе с минеральными компонентами Col является главным фактором, определяющим механические свойства кости (Зайдес А.Л., 1960; Nyman J.S. et al., 2006; Vashishth D., 2007; Sroga G.E. et al., 2011). Коллагеновые фибриллы костного матрикса образованы Col типа I. Известно, что данный тип Col входит также в состав сухожилий и кожи, однако Col КТ обладает некоторыми особенностями. Для костного Col характерно большое содержание свободных s-аминогрупп лизиновых и оксилизиновых остатков (Vashishth D., 2007). Еще одна особенность костного Col - повышенное по сравнению с Col других тканей содержание фосфата. Большая часть этого фосфата связана с остатками серина.

Таблица 1 - Химический состав ББК человека (в г на 100 г сухой обезжиренной кости)_

Компоненты Компактное вещество Губчатое вещество

Кальций 26,4 ± 0,4 21,4 ±2,6

Общий белок 5,3 ± 0,4 5,68 ±0,54

Оксипролин 2,77 ±0,15 -

Коллаген 15,2 ±0,2 19,6 ±4,6

Неколлаген�

Информация о работе