Перенос электрона и конформационные превращения в гемсодержащих белках

Постникова, Галина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Перенос электрона и конформационные превращения в гемсодержащих белках
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Перенос электрона и конформационные превращения в гемсодержащих белках"

- Ну, 1-' . - •

РОССИЙСКАЯ' АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

На правах рукописи УДК-577.336 + 577.355

Постникова Галина Борисовна

ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА И КОНФОРМАШОННЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ В ГЕМСОДЕРЖАЩЙХ БЕЛКА!

. 03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Пушино - 1992

Работа выполнена в Институте биофизики РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,чл.-корр.РАН В.А.Шувалов доктор физико-математических наук К.В.Шайтан доктор физико-математических наук Ю.А.Лазарев

Ведущая организация:

Институт химической физики им.Н.Н.Семёнова РАН (Московская область, Черноголовка)

Защита состоится декабря 1992 года в Л часов на заседании Специализированного совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: г.Цущино, Московская область, 142292

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН.

Диссертация разослана у' /У ноября 1992 года

Учёны! секретарь Специализированного совета/ кандидат биологических наук £г__^Л>'Т.И.Смолихина

Актуальность проблемы. Перенос электрона гемсодержащими белками и обратимое связывание лигандов леаит в основе таких важнейших биохимических процессов как дыхание, микросомальное окисление и фотосинтез. Изучение физических механизмов функционирования мономерных и олигомерных глобинов, являющихся переносчика-ма Og» а такне цитохрома С позволяет подойти к пониманию общих сакономерностей протекания большого числа биохимических реакций и способов их регуляция на микроскопическом уровне, что составляет одну Я8 главных проблем молекулярной биофизики.

Белок-белковый перенос электрона в митохондриальяых и микро-сомальных цепях электронного транспорта отличается по своей природе от хорошо изученных в химии редокс-реакций металлокомплек-сов в растворе [Маркус P.A., Сутин Н., 1985]. Во-первых, в случае белков донор и акцептор, как правило, погружены в белковую матрицу я разделены на больше ( г > I нм) расстояния, так что пепосредственшй контакт мезду шшп невозможен (дистанционный перенос электрона). Кроме того, анизотропные редокс-центрн типа гем-групш достаточно лесгхо фиксированы в белее я поэтому, в отличие от раствора, скорость переноса заряда долзна зависеть от взаимной ориентация донора л акцептора. Наконец, полппептндная цепь балка, которая, с одной стороны, является макролпгандом лона металла, п то :is здект. образует специфическую гетерогенную среду с уникальными релаксационными характеристика^!, которая сильно влияет как на окислительно-восстановительные свойства металла, Tai; я' на скорость переноса электрона.

Очевидно, что существенный прогресс в изучении механизма столь сложного явления мояет быть достигнут только в случае, если структурные а физико-химические свойства обоих участников реакции очень хорошо изучены. Окислительно-восстановительная реакция мез-ду МЬ я Cyt С, пространственные структуры которых раньше других белков были получены с атомарным разрешением [кендрю Дк.С.,19о4; Дшскерсон P.E., I97l], стала первой такой белок-белковой редокс--системой [i]. В настоящее время изучается такяе перенос электрона в реакциях Cyt С с Cyt с -иероксядазой, сульфит-оксидаз ой,суt , азурином и др. белка?,®, структуры которых расшифрованы [Нг с. и др., 1977; Смит М.С., Миллетт Ф., 1980; Уэбб М. и др., I960; Розен Р. и др., 1981]. Резко возросший за последние 10 лет интерес к изучению биологического переноса электрона объясняется также тем, что балл развиты новые экспериментальные и теоретические подхода [де Волг Д., 1980; Петров Э.Г., 1984; Маркус P.A. Сутин Н., 1985; Жихтенптейн Г.И., 1987; Грэй Аш.В., 1989]. Он

связан, очевидно, и с потребностями в сверхсовременной технике и технологии и появлением нового направления в науке - микроэлектроники, в том числе биомолекулярной моноэлектроники.

Функционирование белковых молекул, как с несомненностью доказано, ' тесно сопряжено с изменением их конформации. В соответствии с представлениями о белке как механо-химической молекулярной конструкции [Чернавский Д.С. и др., 1987] наиболее актуальным является изучение того, какие конкретно перестройки в пространственной организации его структурных элементов - спиралей, межспиральных участков, £-структуры и т.д. - происходят при том или ином функциональном воздействии, имеется ли выделенное направление распространения конформационной волны от "активного центра" к периферии молекулы и каков механизм гомо-"и гегеротроп-ных эффектов регуляции. Следует отметить, что несмотря на то, что более 100 белковых структур получены в настоящее время с высоким разрешением и много исследований посвящены конформационным изменениям в белках, проблема в такой постановке изучена явно недостаточно. Наиболее детально исследованы структурно-функциональные отношения в тетрамерном глобине - гемоглобине [Перутц М.Ф., 1970; Перутц М.Ф., 1979].

В данной работе с помощью спиновых меток и флуоресценция изучали конформационные изменения в мономерных глобинах - миогло-бине, леггемоглобине и родственных структурах - апомаоглобине и комплексе апо-МЬ с протопорфярином IX, а также цигохроме С, которые происходят при изменении редо'кс- и лигандного состояния гемового комплекса и рН среды.

Итак, важность исследований по теме диссертации обусловлена:

1. Необходимостью развития фундаментальных знаний о механизме биологического переноса электрона и структурно-функциональных отношений в гемсодержащих белках.

2. Возможностью использовать полученные результаты, продукты и найденные подходы для белковой инженерии и в разных практических целях.

Пели и задачи работы. Цель работы состояла в изучении механизма переноса электрона в системе МЬ-Су1 С с помощью спектро-фотометрической кинетики, а также конформационных изменений в . этих и родственных белках методами спиновых меток и флуоресценции. Для этого следовало:

I. Изучить кинетики восстановления феррм-Суь С разными ли-гандннми производными ферро-МЬ, проанализировать кинетические

схемы процесса и найти элементарные константы скорости для разных форм ферро-МЬ.

2. Исследовать зависимость скорости реакции от рН для разных интактных и модифицированных производных МЬ и СуЪ С. Индентифици-ровать ионогенные группы, вдиявдие на перенос электрона в-системе.

3. Изучить зависимость скорости реакции от ионной силы и роль общих и локальных зарядов МЬ и Су1; С в реализации эффективного переноса электрона.

4. Определить пространственную структуру "активных мест" на поверхности молекул и возмодную структуру электрон-переносящего комплекса.

5. Исследовать роль "специфических" зарядов .стерических факторов и ароматических групп белка в механизме реакции.

6. Методом спин-метки изучить конформационные изменения в Cyt с, индуцированные изменение рН среды, редокс- и лигандного состояния гема.

7. Методом ЭПР исследовать рН- и лиганд-индуцированнне фон-формационные изменения в 1Ь из корневых клубеньков желтого люпина.

8. С помощью грипгофановой и порфяриновой флуоресценция изучить рН- и лиганд-шадуцированные изменения конформации ферри- и ферропроизводных ииоглобянов, апомиоглобяна и комплекса апо-МЬ с протопорфиряном II.

9. Исследовать роль порфаринового макроцикла л же гета в формирования нативной конформация МЬ-подобной структуры,обеспечения ее кооперативных свойств.л стабильности.

Научное значение и новизна. Определены элементарные константы скорости окислительно-восстаноздтельной реакции мезду Cyt С и разными лиганднымп формата ферро-МЬ. Проведено систематическое изучение влияния рН, ионной силы я химической модификации отдельных аминокислотных остатков на перенос электрона в системе МЬ02~СУ£ С. Идентифицированы участки молекул, контактирующие_в ходе реакции,.и определена их ван-дер-ваальсова и зарядовая структура. Показано, что "локальные" электростатические взаимодействия, но не,общие заряды МЬ и Суй С играют решаксщю роль в эффективном переносе электрона. Выявлено значение остатков гистидина, расположенных между донорным и акцепторным центрами» и стерических взаимодействий в механизме реакции. Найдено, что в электрон-перенося-вдем комплексе гемовые группы МЬ и Су£ С ориентированы копланарно, и расстояние между ними составляет 2,9 нм.

Получены один-меченые по Мет 65, Тир 74 и Лиз 72/73 цито-хромы С. Найдено, что при замене 6-го лиганда тема. Мет 80, внешним лигандом, циашдом, конформация Су* С изменяется, а при восстановлении тема заметных изменений не происходит. В интервале рН 5-13 зарегистрированы два конформационных перехода, предшествующа щелочной денатурации: меньший по масштабу (рК 9,3), известный ранее из спектральных данных, и новый более масштабный переход (рК 11.1), отсутствующий в классической схеме Теорелла [диккерсон Р.В., Тимкович Р., 1975]. Показано, что оба перехода вызваны заменой Мет 80 другим белковым лигандом, соответственно, депротонированным Лиз 79 и ионизованным Тир 67.

Получен спин-меченый по Тир 72 леггемоглобин. Обнаружены рН- и лиганд-индуцированные изменения конформации в дистальной части структуры. Показано, что характер изменений определяется, в основном, химической природой лиганда и его взаимодействиями с группами белка в геыовой полости, а не спиновым состоянием Ге тема.

По флуоресценции инвариантных остатков Трп 7 и 14 изучено информационное поведение Н-концевой области структуры в разных лигандоых производных ферри- и ферромиоглобина, апомиоглобине и комплексе апо-МЬ с ППП при изменении рН среды, а по флуоресценции встроенного в геыовую полость ППГХ - конформационные свойства "активного центра". Найдено, что изменение электронного и лн-гандного состояния гемовсго комплекса сопровождается достоверным изменением конформации на п-конце структуры. С другой стороны, нарушение ионной стабилизации гг-концевой области приводит к изменению ориентации групп с "дистальной" стороны гема. Предполагается, что структурной основой дистанционных эффектов такого рода могло бы быть синхронное смещение комплекса спиралей АВ как целого относительно спирального комплекса 6Н. Найденная корреляция медцу ионформацияма гемовой полости и н-концевой области маоглобнновой структуры обнаруживается также в апо-МЬ и комплексе апо-МЬ с ПП1Х, что наряду со сходством их структур с холобелком обусловлено* очевидно, общим типом укладки полипепгидной цепи.

Определены структурные и динамические различия между МЬ, апо-МЬ и ШЦХ-апо-МЬ. Показано, что главное значение для формирования уникальной МЬ-подобной структуры и ее стабильности имеют взаимодействия мезду апобелком и ПП1Х, а не связь Ре с проксимальным Гис ЕВ. Последняя, однако, очень ваяна, так как дополнительно стабилизирует структуру, обеспечивает ее более кооперативное по-

ведение, а также возможность функционирования и регуляции.

Научно-практическая значимость. Результаты работы имеют фундаментальное значение для понимания механизма функционировании гемсодеряацих белков и регуляции функции, а такяе факторов, обеспечивающих стабильность белковой структуры и ее кооперативные свойства. Полученные новые данные по биофизике белковых мак-ромолзкул могут стать составной частью учебных программ по биофизике в ВУЗ'ах. Они могут быть использованы и в экспериментальных исследованиях для направленного изменения свойств и стабильности белков методоми белковой инженерии. Применение в практических и исследовательских целях ¡.гагу? найти тажхе простые и эффективные способы получения гомогенных препаратов МЬ и Су-ь С и их химически модифицированных производных, в том числа спин--кеченых белков.

Апробация работы и публикации. Мгтермиш работы докладывались на IX конференции 4ЕЕ0 (Венгрия, Будапешт, 1974), XI Менделеевском съезде по общей ч прикладной химии (Алма-Ата, 1975), 3-ей и 6-ой Всесоюзных конференциях по кокформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1975, 1985), 3-ей, 4-ой, 6-ой и 7-ой Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1977, 1984, 1988, 1991), Всесоюзной конференции по химии и геохимии порфаринов (Душанбе, 1977), ГУ Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Минск, 1977), 1У Всесоюзной биофизической конфзренции "Механизмы регуляции в системе крови" (Красноярск, 1978), XI Международном симпозиуме ЮПАК по химии природных проектов (Болгария, Варна, 1978), XX Международном Амперовскс.м конгресса (Таллин, 1978), У Всесоюзном симпозиуме по химии и физике белков и пептидов (Баку, 1980), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), 1-ой Всесоюзной конференции по переносу электрона з биосистемах (Вильнюс, 1985), Международном симпозиуме по физико-химии биополимеров в растворах и клетках (Пущино, 1985), Всесоязных совещаниях по механизму переноса электрона в белковых системах и их моделях (Киев, 1987; Казань,Г989), II Международном симпозиуме по молекулярной электронике и биокомпьютерам (Москва, 1989) и X Международном биофизическом конгрессе (Канада, Ванкувер, 1950).

Основные результаты работы изложены в 56 публикациях,' из которых: 22 - статьи и обзоры в отечественных журналах и 12 -в зарубежных журналах и сборниках.

МАТЕРИАЛЫ И ЬЕТОДЫ

Получение интактных и химически модифицированных белков.

Миоглобин кашалота (в мет-форме) выделяли из скелетных ыьшц экстракцией и фракционированием сульфатом аммония [Антонина Е., Брунори М., I97IJ. Индивидуальную фракцию 1У получали 2-кратным фракционированием суммарного препарата ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлшозе и КМ-сефадексе С-25 [22]. Свиной и бычий мет-МЬ выделяли аналогичным образом [50,55]. Леггемоглобин из корневых клубеньков желтого люпина (фракция ЬЫ) получали по описанному методу [Кудрявцева Н.Н. и др., 1978]. Цитохром С лошади и свиньи выделяли из сердечных мышц, а также использовали препараты фирмы "Реанал" (Венгрия) и "Биомекс" (Польша). Последние дополнительно хроматографировали на ДЕАЕ-целлюлозе и КМ-ссфадексе С-25 [22]. Гомогенность выделенных препаратов МЬ, ЬЬ и Суь С контролировали хроматографически и с помощью диск-электрофореза ■ в полиакрилашдном геле.

Апомиоглобин получали из мет-МЬ осаждением кислым ацетоном при охлаждении [Росси-Фанолли А. и др., 1958].

Комплекс протопорфирина с апо-МЬ (ГШХ-апо-МЬ) получали ассоциацией ПП1Х с апо-МЬ кашалота в 0,1 М фосфатном буфоро, рН 8,3 [ Бреслоу Е., Келер Р., 1965], а затем очищали хроматографией на сефадексэ 6-25 и №4-25 [З?]. Все операции проводили в темноте пли при слабом рассеянном свете, так как комплекс очень светочувствителен.

Алкилирование остатков Гис в мет-МЬ иодацетамидом и бром-ацетатом проводили по описанному ые*ору [Хартцаль Ц.Р. и др., 1967; Ниген A.M., 1^рдФ-Р.Н., 1973]. Реакционную смесь дополнительно фракционировали на КМ-сефадексе С-25, выделяя карбокси-амидированный и карбоксиметилированный МЬ (КА-мет-МЬ и КМ-мет-МЬ) [5,22]. Ацилирование №концевой с£-амино группы мет-МЬ осуществляли метилизотиоцианатом (МИТЦ) и флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) при рН 6,5-7 [5,17]. После разделения на КМ-сефадексе С-25 выход МИТЦ-мет-МЬ и ФИТЦ-мет-МЬ составляет, соответственно, 4С% и 10% от исходного белка. По результатам анализа на автоматическом сек-венаторе "Бекман 890 С" (10 циклов отщепления с U-конца) степень модификации ^-концевого Вал составляла 95±5% [17].

Химическую модификацию Cyt С бромацетатом IT а проводили при

рН 7 [Штельваген Е., 1968]. Алкилированный по Гис 33 и Мет 65

продукт (KM-Cyt С) выделяли ионообменной хроматографией на КМ--сефадексе С-25 £26].

Модификацию Mb, ХЬ и Cyt С спиновыми метками — 2,2,6,6-тетра-метил-4-бромац0токсипнперидйк-1-оксилом ( SI^ ) я N-(2,2',5,5* --тетраметил-З-карбоксипирролин-1-оксил-имидазолом (SLg) проводили в контролируемых условиях f5,12,22,25,30]. Парамагннтныэ реагенты синтезировали, как описано ранее [Баррат М.Д. и др., 1969; Артюк Р.И. и др., 1972; Постникова Г.Б. и др., 1978]. Брочацетат-ная спин-метка SLI специфически реагирует с Мет, а в его отсутствие (в миоглобинэ) с остатками Гис. Имидазолидная метка sl2 специфична к тирозину, но способна ацилировать тагае лизины, имеющие аномально низкое значение рК. Спин-меченые произэодныэ белков - э^СГис АГ0)-МЬ, зьЛМет 65)-Cyt С, SL2(Tmp Е16)-Гь, SL2-(Тир 74)- Cyt С visl2(JIh3 72/73)-Cyt С ввделяли с помощью ионообменной хроматографии и; идентифицировали полокзкиа метки химическими и спектральными методами [5,8,12,15,31].

Апомиоглобин, модифицированный по остатку Трп 7 реагентом Кошланда-2-гидроокси-5-нитробензилброшдом (HNB) и о-штрофонил хлоридом (I7F3), получали, как описано ранее [Атасси М.З., 1968; Каваухи Аш. и др., 1973]. Препараты ШВ-апо-МЬ и irRs-ало-МЬ очищали гельфильтрацией через сефадекс Г-25 [45,4б]. Модифицированные по Гис и аминогруппе иодацетамидом, бромацетатом и мети-лизотиоцианатом-КА-апо-МЬ, КМ-апо-МЬ и ШГЦ-апо-МЬ- получали удалением гема из соответствующих модифицированных, производных ме?-МЬ аналогично интактноцу апо-МЬ [49"].

Разные лигандныз производные ферри- и ферроииоглобина, лег-гемогяобина и цитохрома С, где лигандами являются цианид, азид, ацетат, шкотинат, 0g, СО и др., получали, как описано ранее [ Антонини Е., Брунори М., 1971; Диккерсон Р,Е,, Тимкович Р., 19752. Образование соответствующей лигандной формы контролировали по спектру поглощения [5,31,39,47].

Влияние химической модификации на. общую и локальную конфор-мацию белка, его стабильность и редокс-свойства анализировали с помощью оптической, флуоресцентной и ЯМР-спектроскопии, а также кругового дихроизма в диапазоне 200-500 нм [5,8,12,17,19,30,37, 40]. Показано, что во всех случаях модификация имеет локальный эффект, а конформация молекулы белка в целом и структура гемово-го окружения сохраняются такими же, как в интактном белке.

Методы.Окислительно-восстановительные потенциалы (Eq 5)

шоглобина и Су * С определяли спектрофотометрическим титрованием ферри-проязводных восстановленным метилвиодогеном; измерения проводились в специальной электрохимической ячейке в атмосфере аргона [зэ]. Изоэлектрофонусированае белков (дая определения р1) проводили в подиакриламздном геле, содержащем набор амфолинов с рН 3-10. С этой кз целью использовали метод ионообменной хроматографии на КМ-сефадексе С-25 в градиенте рН [2б\.

Спектры поглощения в УФ- и видимой области регистрировали на спектрофотометре "Спекорд УВ ВИЗ" (Германия), а разностные спектры - на спектрофотометре "Хитачи ЕРС-ЗТ" (Япония). Круговой дихроизм измеряли на спектрополяриметре Дки-20 и Дки-500 А фирмы "Джаско" (Япония). В УФ-обласги расчитывали специфическую эллиптичность пептидного хромофора для среднего молекулярного веса остатка, а блшкней Уф- и видимой области - молярную эллиптичность белка. Спектры флуоресценции, скорректированные и нескорректированные, регистрировали на спектрофлуориметре МПФ-44 фирмы "Перкин Элмер" (США.) с вычитанием рамановской полосы буферного раствора. Триптофановую люминесценцию возбуэдаяи светом с длиной ваши 286 или 295 нм, а протопорфириновую люминесценцию - 408 нм; в последнем случае ширина спектральной цела на возбуждение устанавливалась не более I нм, чтобы избегать диссоциации ПП1Х. Спектры ЯМР (протонные) регистрировала прл комнатной температуре с помощью спектрометра ЯМР (50 МГц) фирмы "Брукер-£изик" (Германия) с преобразователем Фурье [81. Спектры ЗПР спиновых меток регистрировали на отечественном спектрометре Зсм-ого диапазона, снабкенного многоканальным накопителем Ш1-4050 (Финляндия). Времена врадательной коррекции меток (¡-с), связанных с белком, рассчитывали по формуле 6>65йН+1 (пД^ТТ^ - 1>х10-10сек. справедливой для слабо иммобилизованных радикалов [Кузнецов А.Н. и др., 1971] ; здесь I А и - высота низко- и высоко-

польной компоненты спектра, ЛН +£ - ширина низкопольной линии в градусах.

Кинетические измерения. Кинетику восстановления Суь С ферро-миоглобшами регистрировали на длине волны 542 нм, в изобести-ческой точке ферри- и ферро-Суъ С, при 20°С. МЬ02 получади гель-фидьтрациеи мет-МЬ, восстановленного дитионитом я а, через колонку с сефадексом С-25 непосредственно перед экспериментом. В измерительной кювете смешивали равше объемы МЬ и Cyt С с концентрацией 4,5«10-5м/л в трис-фосфатном или трис-малатном, 1:1, буферах с определенным значением рН в интервале 5-8. Последний

буфер использовали в экспериментах с ионами цинка, чтобы избежать образования нерастворимых солей. Ионную силу ( I ) от О до 0,03 варьировали изменением концентрации соответствующего буфера, а далее; до 1=1, добавлением KCI. Значения рН в пробах регистрировали до и после эксперимента с точностью +0,05 ед. рН. Конец реакции определяй добавлением в реакционную смесь ферри-цианвда калия. Бимолекулярную константу скорости реакции (кэксп) рассчитывали из кинетических кривых, как описано далее в тексте [5].

I. ДИСТАНЦИОННЫЙ ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА В СИСТЕМЕ МИОГЛОБИН--ЦИТОХРОМ С. РОЛЬ ГИСТВДИНОВЫХ ОСТАТКОВ, ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ, СТЕРИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ И ВЗАИМНОЙ ОРИЕНТАЦИИ ГЕМОВ В ПЕРЕНОСЕ ЗАРЯДА

Введение, обнаруженная in. vitro редокс-реакция между МЬ02 и CytC Ймазаки И. и др., 1964], как было показано [By Ч.-Ш. и др., 1972], является необратимой и протекает через непосредственный контакт гемопротеянов без участия шзкомолекулярных или ионных переносчиков. Полученные к тому времени высокоразрешенные пространственные структуры обоих белков свидетельствовали о том, что прямой контакт меаду темами МЬ и Cyt С невозможен, что позволяло предполагать участие белковых групп в механизме переноса заряда. Реакция, по-видимому, протекает через образование коротко-живущего электронпереносящего комплекса, так как стабильного комплекса между МЬ и Су С обнаружить не удается [l,4.8,2l]:

> кт 1 к0

Mb02-+Cyt С (3) Mb02'Cyt Cj—^Mb(3)H20+Cyt С(2)+02 ( I )

Здесь Kj и k_j - би- и мономолекулярные константы образования и диссоциации комплекса, а к^ - мономолекулярная константа скорости переноса электрона.

В данной работе исследованы факторы, влияющие, главным образом, на образование эффективного элекгрон-переносящего комплекса, и возможная структура последнего без детального рассмотрения стадии внутрибелкового переноса заряда.

I. Определение констант скорости восстановления феррицито-хрома С разными ферромиоглобинами

В атмосфере 02 в растворе присутствуют две формы восстановленного № - лигавдированный №02 и безлигандный МЬ (2), равновесие между которыми сильно смещено в сторону лигандной формы [Антонини Е...Брунори М., 1971]. Чтобы разделить вклады разных ферромиоглобинов в константу скорости, исследовали кинетику реакции при разных соотношениях лигандной и безлигандной форм, которое- удобно менять, когда лиганяом (Ь) является окись углерода. При освещении МЬСО диссоциируеч^.&О и МЗ^)и количество последнего прямопропорционально интенсивности действующего света.

Оказалось [4] , что в атмосфере СО скорость восстановления Суъ С определяется относительной концентрацией МЬ (2) и в отсутствие света равна 0, указывая на неспособность МЬСО донировать электрон,В аэробных условиях, при том же соотношении МЬ02 и МЬ(2) ' в реакционной смеси скорость реакции в -5 раз-вше, чем в атмосфере СО, указывая на прямое участие окси-МЬ в восстановлении Суъ С. Общая схема превращений, таким образом, может быть представлена в следуыцем виде: к1

" МЬ (2) + Ъ ~гг— МЬ (2) Ь

к3

МЬ (2) + Сп (3) + Н20 -МЬ (3) 'Н20 + cyt (2)

МЬ (2) ь + Суъ (3) + Н20 К4'. МЬ (3) Н20 + СУЪ (2)

где - константа равновесия дезокси-МЬ с лигандаыи, СО

или 02, а Кд и к4 - бимолекулярные константы скоростей соответствующих реакций.

Обозначив концентрацию МЬ (2) и МЬ (2)1 в момент времени Ь через х и у, а разность общих концентраций МЬ и СуЬ С через Е (в наших экспериментах Е=0), получим систему кинетических уравнений:

х = - к1 [ь] х + к^г - к3х (Е + х + у ) я у = кг [х] х - к2у - к4У (Е + х + у)

Равновесие МЬ (2) с лигандами устанавливается намного быстрее, чем происходит его реакция с С;уЬ С. Поэтому общая относвтель-

пая концентрация ферромиоглобянов,д = (х + у)/С, где С-полная концентрация МЬ в растворе, является медленной переменной, поведение которой можно, используя метод кваэистационаршх концентраций, записать в виде:

4 „ (ъ + Ч -^Е-). ( I )

^И+Ъ, 4 Ц [ъ]+к2 /

Видно, что уравнение (I) описывает гиперболический характер зави-сивости концентрации № от времени, что согласуется с экспериментальными данннш (Рис. I,а).Определяемый из эксперимента параметр гиперболы оС (рис.1,6) в соответствии с уравнением (I) может быть выражен как

= С ( • М + ( 2 *

так как » к^ уже при концентрации лиганда 0,I мМ.

Рис.2,а - Изменение концентрации МЫЬ в ходе реакции с ферри-Су С. 0,03 М трис-фосфатный буфер, 1:1, рН 7, 20°С

б - Зависимость от времени величины А (ъ ) = - I . (см.текст) и определение Ы. . •>

С помощью выражения (2) фш определены элементарные константы скорости для всех исследованных форм ферро-МЪ (в 0,03 М трис--фосфатном буфере, 1:1, рН 7, при 20°С). Они составили,соответственно, 2,2x10^, к4 Ш2 = 31±1,5 и Ч ЫК:0 = О (М""-* сек"-*-}. Поскольку эксперимент проводились далее в аэробных

условиях, важно отметить, что несмотря на то, что МЬ (2) реагирует с Су С гораздо быстрее, чем МЫ^» скорость реакции в присутствии 02 определяется в основном окси-формой. Из-за высокого сродства к лигаэду концентрация безлигандного 1ЛЬ (2) б реакционной смеси очень гл&ла и его вклад в

410 кэксп. = К4

кэксп не пРевышает 15^, так

125

100

эксп

(М^С"1)

2. Влияние рН на скорость реакции МЬОо кзмалота и свиньи с феррицигохромом С. Локализация участков белковой поверхности. участвующих в образовании электрон-перекосящего комплекса

Как видно из рис.2, рН-зависимость скорости реакции для системы МЬ02 кашалота - Cyt С имеет острый максимум вблизи рН 6 (кривая I), указывая на то, что по крайней мере два гистидиновых

остатка могут участвовать во взаимодействии. Цри этом ионизация одного Гис должна ускорять, а другого, наоборот, замедлять реакцию. Анкетирование титруемых Гис в МЬ кашалота бромацетатом иа или иодацетамидом [б] приводит к исчезновению зависимости скорости от рН (рис.2, кривая 2), свидетельствуя о том, что за рН-за-висимость, действительно, ответственны остатки Гис и что они 'принадлежат миоглобину. Модификация теш же реагентами

Мет и Гис в СуЬ С не влияет на скорость реакции и характер зависимости ее от рН [2б]. Значения Ео ^ миоглобина и Суь С в интервале рН 5-8 практически не меняются и сохраняются неизмененными в результате химической модафи-

рН

Рис.2. рН-завясимость скорости окисления интактного МЬСЬ кашалота (кривая I). КА-МЬ0Р и КМ-МШ2 (кривая 2) феррицй-тохромом С. 0.03 М трис-фос-фаг, 1:1,20°С

кации.

В МЬ кашалота имеется 7 титруемых Гис (рис.3), из которых 1

4 пары Гис локализованы на расстоянии не более радиуса молекулы Cyt С один от другого и могут одновременно с ним взаимодействовать:

Die 12 (AIO) - Гис 119 (GHI) Гис 113 (GI4) - Гис 116 (SI7) Гис 12 (AIO) - Гис 116 (GI7) Гис 116 (GI7) - Гис 119 (SHI)

( г - 0,85 нм )

( г - 0,95 нм )

( г - 1,5 нм )

Рис.3 Пространственная структура Mb кашалота в проекции ХУ и локализация в ней остатков Гис [Диккерсон P.E., 1971]. Заштрихованы "внутренние" остатки, недоступные титрованию. В раглке - контактирующий с Cyt с участок молекулы

В результате избирательного алкилирования Гис AI0 спин-меткой SL^ кривая рН-зависимосгя становится сигмоидной (рис.4), указывая на то, что теперь не два, а только один Гис (рК^6,1) влияет на скорость реакции. Следовательно, Гис AIO должен быть локализован в области контакта и только 2 пары с его участием (первая и третья) могут рассматриваться в качестве претендентов на взаимодействие с Cyt С. Первая пара, более предпочтительна, так как рК ионизация Гис AIO и Гис SHI по данным яМР-тптрования, 6,3ifl,I и 5,6±0,1, близки к рН 6 (для Гис GI7 рК равно 6,8±0,2) [Карвер Дж.А., Брэдбери Дж.Аш., 1984] .

Изучение реакции свиного МЬ02 с Cyt С позволяет окончательно локализовать реактивное место МЬ-ой структуры. Из обсуждаемых выше Гис в свином МЬ присутствует только Гис SHI, а остальные Гис замещены на Гля и ^Асн [Руссо Дж. и др., 197б]. Кривая рН-за-висимости в этом случае (рис.5) имеет сигмоидный характер (рКЭфф = 5,7), аналогичный наблвдаемому для si^ (гис АЮ)-4ЛЬ02

кэксп хЮ-^с-Ъ

рис.4 Влияние рН на скорость реакции БЬх (Гис А10)-МЬ02 кашалота с СП С. 0.03 трис--фосфаг, 1:1

Рис.5 Зависимость от рН окисления свиного МЫ>2 ферри-цитохром С. Условия те же, "что на рис. 2,3 и 5.

кашалота (рис.4), за который в обоих случаях, очевидно, ответственна ионизация Гис Ш1. Значение рК этого Гис по данным ЯМР-тигрования свиного МЬ [карвер Да.А*, Брэдбери Дж.Аш., 1984] совпадает с найденным из кинетических данных.

Таким образом, МЬ контактирует с СуЪ С в области А-€Н (рис.3), где в МЬ кашалота локализованы Гис А10 и.Гис 6Н1,а в свином МЬ - только последний. Протонирование Гис 6Н1 способствует переносу электрона от МЬ к положительно заряженное Суъ'С (р1 =10), а ионизация Гис АЮ, наоборот, ухудшает это взаимодействие (рис.6). Скорее всего Гис А10 контактирует с Cyt С в районе, где локализовали Лиз 86-88 [34]. Заметим, что найденные из кинетических данных рК ионизации Гис АЮ и Гис еН1 в МЬ кашалота, составляющие, соответственно, 5,9±0,1 и 6,1±0,1, заметно отличаются от приведенных выше данных яМР-титрования.

Участок поверхности СуЪ С, контактирующий с МЬ в процессе переноса электрона, был также идентифицирован с помощью химической модификации [12,14,26]. Показано, что ацшшрование Тир 74

x402(h"c

эксп

сек^

N / \ /

\ \

''к

8 рН

Рис.6 Разложение на составляющие кривой рН-зави-симости для реакции МЫЪ кашалота с Cyt С

или одного из Лиз 72/73 спин-меткой SL ,2 сильно ингибирувт перенос электрона в системе, в го время как алкшшрование Гис 33 и Мет 65 бромацетатом, либо только Мет 65 - бромацетатной спин-меткой SL-j. не влияет на скорость реакции и зависимость ее от рН в интервале^ рН 5-8 (Табл.1).

Показано также, что модификация Лиз 86 в Cyt, С пиридоксальфос-фагом [христова П. К., 1980] и связывание фосфатных ионов в районе Лиз 87, 88 и Apr 91 \2б[ влияют на его взаимодействие с МЬ.

Таблица■!

Константы скорости восстановления интактного и модифицированных феррицитохромов С оксимиоглобином (ИГ^сек-^) 1:1, рН 6. Тряс-фосфагный буфер, 1:1 ,

Образец

0,01 М буфер

0,03 М буфер

Cyt С' ингактный 1,2 ±0,1 х Ю3 . 124 ± 8 КМ (Гис 33,Мет 65)-Cyt С 1,15'Ю3 126 ± 6

SL т (Мет 65)-Cyt С 1,2 ±0,1 "10э 130+6

SL 2 (Тир 74)-Cyt С 5 ±0~8 4,5 + 1

Sb 2 Лиз (72/73)-Cyt С- 3,3+0,6 3 ± I

Реактивное место в молекуле Суй С, таким образом, локализовано слева от тема (рис.7). Из Лиз, окружающих гемовую полость и вовлеченных в реакцию Cyt С с "физиологическими" партнерами, Cyt С-оксидазой и редуктазой (на вставке), только часть принимает участие в редокс-реакции с миоглобином. Сильное ингибирование переноса электрона при ацшшровании Тир 74 может указывать как на взаимодействие фенольной ОН-группы с МЬ * активном комплексе ,так и на участие в этих взаимодействиях Глу 66, связанного с Тир 74 водородной связью [такано Т., и др., 1977].

Рис.7 Пространственная структура Су-еС лошади (выделен участок,контактирующий с МЪ). На вставке с провой стороны -остатки Лиз, окружающие гемовую щель

3. Влияние ионной силы на скорость реакции. Электростатические взаимодействия в системе МЬСЬ-(^ С и их роль в механизме переноса электрона

На рис.8 приведены рН-зависимости дал реакции МЬС>2 кашалота , Gyt С при ионных силах от 0,005 до I [20]. Видно, что экранирование белковых зарядов в интервале I- 0-0,1 яротивоионами сильно уменьшает вероятность переноса электрона (кривые 1-5). Скорость реакции в максимуме рН-зависимости падает при этом в -- 1000 раз, а сам максимум уменьшается и при 1=0,1 совершенно исчезает. Дри высокой ионной силе, I > 0,1 , скорость процесса мала, не зависит от рН и лишь немного уменьшается с изменением I от 0,1 до 1. Последнее связано,-по-видимому, с влиянием ионной силы на Е0 5 цитохрома С [Гопал Д. и др., 1988],

На рис.9 зависимости от ионной силы представлены в координатах 1в к - функция от "уТ в соответствии с уравнением Бренстеда-Дебая-Хжкеля:

*в Ьиссп ко + 2 й^г^УГ / (1 . ( 3 )

Рис.8 Влияние ионной силы на скорость реакции в системе МЬ02 кашалота-cyt С при pH 5-8.Кривее 1-5 соответствуют 0,005; 0,01; 0,02; 0,03 и 0.06М раствора, кривые 6 и 7 - 0,23 и 0,43 Ы

0.4 i*/о*1*,

Рис.9 Зависимость от ионной силы в координатах дебая--Хжкеля дал системы №0? кашалота-Су^ С при рН 6 (кривая I), РН 7,5 (кривая 2) и рН 5,3 (кривая 3)

Это уравнение, как показано [коппенол В.Аш., и др., 1978], при I < 0,1 хоропо описывает экспериментальные зависимости от I для реакций гемопротежнов (к н0 - константы скорости при произвольной и нулевой I, г1 и г 2 - эффективные заряды реагиругацих частиц, ©С-константа, 0,509 в Н20 при 25°). Принимая во внимание, что при рН 5-8 оба белка, 0уъ С и МЬ (р1 расч =8,3 ), заряжены положительно, отрицательный наклон зависимостей даже качественно не согласуется с влиянием общих зарядов белков на кинетику реакции, но указывает на решанцую рать локальных электростатических взаимодействий для переноса электрона. Экранирование ионами именно "локальных зарядов", противоположных по знаку, резко уменьшает вероятность образования продуктивного комплекса. Наклон зависимостей от I примерно одинаков при рН 5,3 и 6 и заметно меньше -при рН 7,5.

В более широком интервале ионных сил, до 1=0_,3, можно использовать выражение, предложенное на основе уравнений теории Маркуса для редокс-реакций в растворах [велвнд С., Грэй Ад.В., 197б]:

Ш к = Ш к - ехР(-гК2)). { 4 )

И + ЭШ2 1 + Ж,, / К1+И2

где к^ - константа скорости при I = , к^ и радиусы реагирувдих частиц, а ге = 0,329 УТ . Как видно из рис.10, экспериментальные данные хорошо описываются уравнением (4), если подставлять в него значения й и ъ , соответствующие локальным участкам № и Суъ С, а не целым молекулам.

О специфике взаимодействия № и Су.-Ъ С свидетельствует также сравнение кэксд (при 1=0) с величиной, рассчитанной по теории активных соударений для диффузионно-контролируемых реакций [Алберти Р.А., Хаммес Г.Г., 1958]. Показано [20],'что при рН 6, кэксп = 1,9 х 1С)4, а красч= 4х1°8 СЧ"1 сек-1). Это означает, что эффективно не каждое соударение молекул, а только то, при котором они имеют "правильную" ориентацию. Учет фактора ориентации позволяет оценить размер контактной площадки,составляющей от общей поверхности бежа, —50 А2. При рН 7,5 число соударений в соответствии с изменением зарядов белков увеличивается в 50 раз (Красч = 2x10^%""^ сек"-'-), а скорость переноса электрона, наоборот уменьшается (кэксп=1,4хЮ М--1- сек"-1). С тем же фактором ориентации она соответствует только I эффективному соударению из 750 соударений "активных мест". Таким образом, решащее значение для переноса электрона имеет зарядовая структура активного места, то-есть, состояние ионизации локализованных здесь белковых групп, и в первую •

очередь остатков Гис. Предполагая, что

" Z2= 2

то-есгь, имеют место комп-

(м'сеЛ

лементарше взаимодействия заряженных групп МЬ и Cyt с в активном комплексе, находим (из рис.9 и 10), что Z = 4 (5) при рН 6 и z = 3 (4) при рН 7,5. Поскольку Z отвечает скорее числу комплементарных зарядовых взаимодействий, нежели суммарному заряду активного

места [стоунхуэрнер Дж. и др., 1979] , уменьшение Z на I соответствует исчезновению при рН 7,5 одной комплементарной пары. Для MbOg свиньи зависимости от ионной силы (рис.11) аналогичны MbOg кашалота (рис. 9), хотя их рН-зависимости различаются (рис.2 и 5). Различие в наклонах кривых I и 2 (рис.11) ташке соответствует уменьшению z на 1рто свидетельствует о том, что в обоих случаях, это связано с депротонированйем Гис CHI, так как только этот Гис локализован в "активном месте" свиного МЬ. При наличии электростатического комплекса между белками отсутствие заряда Гис GHI, но не Гис АЮ, снижает эффективность переноса электрона в 10-30 раз (при 1=0,03). Согласно оценкам Z, в образовании комплекса, помимо Гис, должны участвовать еще по 3+1 заряженные группы, заряд которых в интервале рН 5-8 сохраняется (Лиз, Apr, Глу, Асп).

Аналогичные зависимости от ионной силы для реакции модифицированного по Гис AI0 миоглобина кашалота с Cyt с принципиально не отличаются от уже описанных [22}, за исключением того, скорость реакции заметно меньше, чем интактного МЬ02, по-видимому, из-за стерического влияния реагента (при рН 6,z = 2 , а при рН 7,5 - I) Совершенно иной характер имеет зависимость от для реакций модифицированных по Гис производных МЬ02 кашалота (рис.12 ). В диапа-

М 0.5 "Vf/l'tf

Ряс.II Влияние ионной силы на скорость реакции свиного МЬ0? с Cyt С при рН 6 (кривая I) и ^рН

(кривая 2)

7,5

зоне I от 0 до I скорость переноса электрона не зависит от рН, мало меняется с увеличением I (наклон меньше I) и одинакова для КА- и КМ-МЬ02» °бщие ' заряды которых существенно различаются (р! составляют, соответственно, 6,4 и 5,2). Как показывает анализ [21,34], эффект об-ясняется модификацией Гис €Н" гли.хй гышшиае лишиш ьимп ш в "активном месте"МЬ.Следует

Cyt С при рН 6 (светлые значки) ионной силе скорость реакции ' и рН 7,5 - темные значки в 4_5 раз вшле> чеы ^ ш_

тактного МЬ02 кашалота (Табл.2).

Влияние ионов цинка на перенос электрона в системе МЬ-Су* С

Остаток Гис 6Н1, который в отличие от Гис А10 не удается избирательно модифицировать химическим реагентом может бить комплек-сирован с ионом £п Известно, что МЬ связывает до 6 ионов цинка, но одно место в структуре молекулы обладает гораздо большим сродством к Ъп. чем остальные, и при концентрациях цинка от эк-вимолярной до 10-кратной насыщается только это место [Бреслоу е., Гурд Ф.Р.Н., 1963]. По данным рентгеноструктурного анализа [ Еаназак Л.Д. и др., 1965], цинк связывается с Ж-азотным атомом имидазольного кольца Гис СН1 и дополнительно координирует яН^-группу Лиз 16 (А14) и СОО-групцу Асп 122 (6Н4) (рис.13). ■ Очевидно, что стерическая возможность образования хелагного комплекса и является причиной высокого сродства этого места в МЬ к цинку.

С помощью равновесного диализа было изучено связывание с МЬ кашалота и СуЬ С и исследованы окислительно-восстановитель-ше и спектральные свойства обоих белков при соотношениях ап лок от Г до 20 [27,35,40]. Показано, что цинк не связывается с Суь С и присутствие его в растворе в указанных соотношениях не влияет на редокс-потенциал, спектры поглощения и кругового дихроизма су-ь с.

В аналогичных условиях с мег-мь связывается не более I

моля что соответствует приведённым выше литературным данным

По нашим оценкам константа связывания составляет 4,что

на 3 порядка выше, чем для свободного имидазола в раство-

ре (К^З.б.Ю^Г1) [Колтун В.Л. и др., 1958] . Спектры поглощения мет-МЬ в'УЗ-г,-' Соре и видимой области не испытыают изменений вплоть до 10-кратного избытка цинка. При больших концентрациях наблкщдются

изменения в полосе Соре, которые при 1000 кратном избытке

и более свидетельствуют о денатурации миоглобина.

Рис.13.-Фрагмент структуры МЬ кашалота со связанным ионом цинка ^Баназак Е. и др.,I965J

Спектры Щ в полосе поглощения пептидных связей не претерпе-

вают изменений.при соотношениях

цинк/МЬ от I до 20, однако в ближней УФ-области (250-320 нм) изменения регистрируются уже при зквимолярной концентрации Они связаны с комплексированием цинка с Гис GHI и локальным изменением конформации в A-GH-областя (рис.14), в том'числе в окружении Трп 14(А12), так как эллиптичность в полосе с максимумом при 295 нм уменьшается [40]. Такой спектр сохраняется при 2- и 5-кратной концентрации ионов цинка, а при Ю- и 20-кратном избытке наблвдаются дальнейшие изменения, которые вызваны, очевидно, изменением конформации гемовой полости, так как одновременно изменяется спектр КД в области Соре (350-480 нм). При меньших концентрациях Zn2+ последний идентичен спектру мет-МЬ без цинка. Показано также, что 5-кратный избыток не влияет на Е ^ ^

миоглобина и скорость автоокисления Mb02 при рН 6 и 7,5 [40]I

На рис. 14 приведена'рН-зависимосгь реакции цинкового комплекса МЬ02 кашалота с Cyt С при 1=0,01. Она сильно отличается от рН-зависимосгей, характерных как для ингакйюго МЬ02 (рис.2 , кривая I), гак и Э1Ц (Гис А10)-МЬ02 (рис.4) тем, что процесс сильно ингибируется и не зависит от рН. Подобное характерно для КА- и M-MbOg при низкой ионной силе (рис.2, кривая 2), а также для интактных белков при высокой ионной силе (рис.3, кривые 6,7)к Варьирование концентрация цинка в реакционной смеси показывает (рис.15), что максимальный эффект достигается при связывании I моля цинка (при соотношении цинк/МЬ — 1,5). Дальнейшее увеличе-

(м сек1)

рН

Рис.14 Реакция МЬ02 кашалота с СуЬ С в присутствии 2-кратной молярной концентрации гпС12. 0,01 М трис-малатный буфер (-о-) 0,4 М буфер (-«-).

ние концентрации до 20-кратного избытка практически не оказывает влияния на скорость реакции. Видно, что при тех же соотношениях цинк/МЬ, реакция при рН 7,5 ингибируется несколько больше, чем при рН 5»3 и 6, что объясняется конкуренцией протонов за связывание с имидазолом при кислых рН [40].

Такой же эффект оказывают ионы цинка на реакцию свиного МЬО£ с СуЬ с [42,55]. Цинковые ■ комплексы МЬ02 свиньи и кашалота одинаково плохо донируют электрон СуЬ С, хотя скорости реакции интактных белков сильно различаются СТабл.2) и по--разно1Ду зависят от рН (рис.2 и 5). Заметим, что скорость реакции гп-МЬОз с СуЬ С не зависит от ионной силы раствора.

Ингибирунций эффект 2п не связан с экралировочными эффектами, как при действии высокой ионной силы, так как он на-блвдается в 0,01М буфере и при концентрациях цинка в растворе на 3-4 порядка более низких, чем концентрация буфера. Он не может быть объяснен также изменением термодинамических параметров редокс-реакции, так как последние, как показано выше, сохраняются такими же, как для интактных белков. Единственной причиной является, очевидно, комплекси-рование гп2+ с Гис 6Н I в "активном" месте МЬ, указывая на весьма важную, особую роль этого Тис (в отличие от Гис А10) в механизме реакции. Следует отметить, что структура Ъп-связывающего места в животных МЬ-ах сохраняется строго инвариантной [Антонини Е., Брунори М., 1971] , так что есть все основания по-

ггм>

Рис.15 Зависимость скорости переноса электрона между МЬОо и СуЬ С от концентрации цинка: I - при рН 5,3, 2 - при рН 6 и 3 - при рН 7,5. 0,01 М трис--малатныи буфер

Таблица 2

Бимолекулярные константы скорости окисления оксимиогло-бинпв кашалота и свиньи и их цинковых комплексов ферри-цитохромом С (М-1 сек-1-). Трис-фосфатный, 1:1, и трис--малатный,. 1:1, буфер, КС1, 20°С

Образец 0,01 М буфер 0,03 М буфер 0,, 43^ М(буфер

рН 5 рН 6 рН 7,5 рН 5 рН 6 рН7,5 рН5 рН6 рН7,5

МК>2 кашалота 220 1100 160

S4rnc АЮ)-

-МЫ)2 - 215 35

КА-МЬ02 - 70 65

КМ-МЬ02 - 78 60

Zn-Mb02 40+5 — о 35+5 30+5

МЫ>2 свиньи 12x10е5 3700 450

Zn-Mb02 40±5. 35 30

25+5 125 30+5 II 10 12

175 107 25+5 10 8 9

45 42 40 50 46 40

52 45 50 - 47 45

2900 850 103 •45 40 42

35 30 32 35 31 30

латать, что свиной МЬ образует такой же хелатный комплекс с цинком, как МЬ кашалота.

Пространственная структура контактных участков МЬ и Cvt 0« Возможная структура электрон-переносящего комплекса

На основании полученных данных можно идентифицировать участки МЬ и Cyt С, контактирующие в процессе переноса электрона. На рис. 16, а. представлена зарядовая структура реактивного места МЬ кашалота, дая построения которой использованы координаты мет-МЬ

С с разрешением 0,2 нм) из Банка белковых, данных. В соответствии с оцененными размерами контактного участка изображены все заряженные группы в радиусе г I нм от Гис 6HI и Гис' AI0. ■Помимо гистидинов, здесь локализованы катионные группы Лиз 16 (AI4) и Apr 118 (GI9), а также анионныегрушш Глу 18 (£16) и Асп 20 (BI), 27 (В8), 122 (GH4) и 126 (НЗ). Инвариантные дая глобинов Асп SH4 и Лиз АГ4 образуют ионную пару и, вероятно, не участвуют в зарядовых взаимодействиях с группами Cyt С, а Гис AI0, как отмечалось, попадает в область положительных зарядов СуЬ С. Число комплементарных взаимодействий в активном комплексе может, таким образом, составить 5+1 при рН 6 и на I меньше - при рН 7,5, что совпадает с оценками Z из зависимостей от ионной силы, Суммарный

же заряд "активного места", как легко видеть, близок к 0.

(-V)

МШЩ

HisKM ,

eu №¡/11$

«;el№H{

(0)

(-ад) Л© M

(НЯ Ai»J7 C0.8)

AlffiSOï)

A»

а» В

n>«M

И0

HiiM(6»Î

(0)

L^ttiSfi)

H«

M ■© ИЯ

Mj27(M) ©

Рис.16 Локализация заряженных групп в контактном участке МЬ кашалота (а; и МЬ свиньи (б) в проекции ХУ. Цифрами указаны расстояния по оси г . За начало отсчета принято положение Гис вН! (Х=у= г=0)

Зарядовая структура контактного участка свиного МЬ (рис. 16,6) отличается тем, что в ней отсутствует Гис AI0 (замещен на Глн) и вместо Арг SI9 и Асп В8 присутствуют Лиз GI9 и Гду В8. Поскольку пространственная структура МЬ свиньи не решена, для построения рисунка использовали координаты расчетной структуры, полученной на основе структуры мет-МЬ кашалота по принципу "минимального" возмущения: координаты идентичных аминокислот и двугранные углы, образуемые атомами, совпадающими в отличающихся остатках, взяты из имеющейся структуры, а прочие двугранные углы выставлялись таким образом, чтобы полученная конформация реализовалась в известных миоглобинах и не приводила к "наталкиваниям"® моделируемой структуре. Полученная структура близка недавно разрешенной^ разрешением 0,28 нм) структуре мет-МЬ лошади [Эванс C.B., Брайер Г., 1988], координаты которой любезно предоставлены нам авторами.

Дня характеристики стерических свойств контактного участка рассчитывали доступность растворителю локализованных здесь групп белка [ли Б., Ричарде Ф.М., I97l]. Изображенные поверхности (Рис.17) аналогичны соответствующим ван-дер-ваальсовым поверхностям и отвечают углу зрения на "активное место", перпендикулярному, плоскости гема. Они представляют собой геометрическое место положений центра шара, моделирующего растворитель, который "катается" .по белку, описывая искомую поверхность (радиус шара для воды 0,14 нм).

Помимо заряженных групп, показанных на рис.16, видна локали-

Рис.17 Расчетная доступность групп ГЛЬ кашалота (а) я свинья (б) в участке поверхности, контактирующем с Cyt С.

лизал,щ неионогенных групп, из которых наибольший интерес представляет Гис 24 (В5). Этот "внутренний" Гис образует Н-связь с Гис GHI (119), и его доступность в МЬ свиньи в 3-4 раза больше, чем в МЬ кашалота в результате того, что Apr 118 замещен на Лиз. В то время как Apr взаимодействует с Асп 20 и 27, выполняя роль мостика между ними и заслоняя при этом большую часть Гис 24, Лиз 118взаимодействует только с Глу 27, и его боковая цепь "уходит" в сторону от Гис 24. Интерес представляют также Гис ИЗ и 116 в МЬ кашалота, которые по кинетическим данным не участвуют во взаимодействии с Cyt С, но расположены в непосредственной близости к контактному участву (рис.17,а); в свином МЬ оба эти Гис замещены на Глн (рис.17,б).

На рис. 18 приведена зарядовая структура контактного участка Cyt С, построенная в соответствии с кинетическими данными, а на рис.19 - ван-дер-ваальсова структура его же в терминах доступное- • ти локализованных вдесь остатков растворителю. Для построения рисунков использованы координаты Cyt С тунца (с разрешением 0,18нм) из Банка белковых данных. Видно, что положительно заряженные Лиз 55, 72, 73, 86-88 и Apr 91 окружают анионные остатки Глу 62, 66 и 69 (а также тир 74), и картина противоположна тощ, что имеет место в миоглобине (рис.16,17). Локализованный в левой части рис.19 остаток Мет 65, по-видимому, не участвует в контактах с МЬ, так как его модификация не влияет на кинетику реакции (Табл.1).

Рис.18 Локализация заряженных , групп в "активном месте" Cyt С

в проекции ХУ (цифрами указаны Рис.19 Расчетная доступность расстояния по оси Z ). За на- растворителю групп в участке чало отчета приняты координа- Cyt С, контактирующем с МЬ в ты Асн 70 (Х=У= z=0) процессе переноса электрона

В известном механизме Винфилда-Диккер-

сона остатку Тир 74 приписывалась важная роль первичного акцептора электрона от внешнего донора. Вместе с "внутренними" Тир 67 и Трп 59 он образует так называемый гидрофобный канал, ведущий от гема к поверхности Cyt С [диккерёон, Тимкович, 1975]. Все эти остатки, как и большая часть групп, изображенных на рис.18, инварианты в Cyt С-эукариот.

Контактные участки МЬ и Cyt С, как мы видели, расположены в плоскости, параллельной плоскости гема; в МЬ расстояние между этими плоскостями составляет 1,7 нм, а в Cyt С - 1,2 нм [54]. Таким образом, в электрон-переносящем комплексе гемовые группы МЬ и Cyt С ориентированы компланарно и отстоят друг от друга на ~2,9 нм. Такая же ориентация гемов найдена в гипотетическом электрон-переносящем комплексе Cyt С с Cyt С-пероксидазой ( г= 2,5 нм) при компьютерном совмещении пространственных структур- этих белков [пулос Т.Д., Краут Дж., 1980] и гипотетическом комплексе Cyt C-Cyt Ь5 ( г= 1,65 нм) [салемм Ф.Р.Дж., 1976].

Бри взаимодействии МЬ с Cyt С, наиболее вероятно, реализуются следущие комплементарные взаимодействия:

Тис Ц9 - Глу 69 или Гис 119 - Глу 66

Дрг(Лиз)Ц8-Глу 66 . "Арг(Лиз)Н8 - Глу 69

Асп 20 - Apr 91 'Асп 20 - Лиз 73 (72)

Асп 122 - Лиз 72 Асп(Глу) 27 - Лиз 86

В обоих вариантах комплекса должны участвовать остатки Гис 119, Apr (Лиз)118, Асп 20 миоглобина и Глу 66, Глу 69 и Лиз 72 цито-хрома С. Вклад электростатической энергии в белок-белковое взаимодействие оценивали по форадле

UJ2 = 560 • q j • q j> .п. / <£ ' Ejg где п- число0комплементарных пар, н .^-расстояние между группами в паре в А, £ -диэлектрическая постоянная ( <§ = 40), а q -j-^-q g = Ie. Для оценки влияния электростатики на константу скорости использовали уравнение Аррениуса:

«/к* /И

где идфф = и - и J2 - энергия активации. В зависисимости от степени комплемент^рности зарядов контактирующих поверхностей, R 12 = 4 1010 3,5 П-Ри а= 3» UI2 состав_ ляет 10,5 - 12 кТ, а вклад в константу скорости, соответственно, 3,Ю4 - 1'Ю5 отн.ед., что может полностью объяснить уменьшение кэксп в ~ iq4 -Раз ПРИ высокой ионной силе. При п= 2, Uj2= = 7-8 кТ, и вклад в константу скорости составляет Г'дЯ-З'Ю^ отн.ед., что также отвечает уменьшению кэксп в ~40 раз при де-протонировании Гио GHI (при 1=0).

Роль остатков гиогидина и стердческих взаимодействий в механизме переноса заряда

Характер влияния рН, ионной силы и ионов цинка на перенос электрона в системе МЬ - Cyt С свидетельствует о том, что Гис 119 (SHI), по-видимому, участвует в самом акте переноса заряда. Сильное влияние протонирования этого Гис на эффективность процесса может служить указанием на то, что преимущественным "путем" электрона от гема к поверхности МБ могла бы служить цепь Н-связы-ваниых групп, - включающая пептвдные связи участков В- и С-спира- -лей, конечным звеном которой являются Гис 24(В5) и Гис II9(6HI) (Рис.20). Протонированный Гис 119 может, как мы видели, взаимодействовать далее с. Глубб или 69 в активном комплексе.

Комплексирование Гис 6HI с Zn должно повлиять как на Н-связь его с Гис В5, гак и на взаимодействие с Cyt С из-за нарушения конформации и нативной динамики груш в контактной области [40,48]» Образование элекгрон-переносящего комплекса между белками представляет собой высоко динамичный процесс [Конклин К.Т., МакЛендон Г., 1978], который должен обеспечить, вероятно, образование "сильных" солевых связей, наилучший гидрофобный контакт

и максимальное исключение воды. В случае реакции

г11-МЬ02 последнее может ' быть затруднено из-за того, что с йп2+ прочно координирована молекула Н20 [40]. Отсутствие зависимости от ионной силы и низкая скорость реакции указывает на то, что несмотря на сохранение заряда при Гис СН1, электростатический комплекс между аа--МБОи и Су* С либо не образуется, либо является малопродуктивным.

Тот факт, что свиной МЬ02 гораздо эффективнее, чем.МЬ02 кашалота, восстанавливает СуЪ С (свиньи или лошади), хотя редокс--потенциалы этих МЬ одинаковы, представляет интерес с точки зрения специфики биологического переноса электрона. Для его объяснения были проанализированы различия в электростатических свойствах двух МЬ и сгерические особенности их контактных участков.

Из 21 аминокислоты, которыми эти белки различаются, 16 замен полностью гомологичны, а остальные 5 состоят в замене катионных груш МЬ кадалога (Лиз 87 и 140,.Гис 12, ИЗ и 116) на нейтральные остатки, в результате чего МЬ свиньи является более электроотрицательным. Однако различие общих зарядов не может быть причиной их разной реакционноспособности по отношению к Суь С, так как показано, что не общие, а локальные заряды влияют на скорость переноса электрона. Этому противоречит также то, что при рН 7,5, когда Гис депротошрованы, различия в скорости окисления обоих миоглобинов одинаковы при низкой и высокой ионной силе (Табл.2).

Ееяее высокая скорость реакции свиного МЬ02 при рН 7 в значительной степени связана с заменой Гис А10 в "активном месте" на Асн, Ч5р объясняется характером влияния этого Гис на кинетику процесса (рис.6). Однако в случае зц (Гис АЮ)-МЬ02 и МЬ02 кашалота (фракция III) Христова П.К., 1980 , где заряд Гис АЮ отсутствует, скорость реакции с Су С увеличивается при рН 5, по сравнению с рН 7,5, только в 5-10 раз, а не в -'30 раз, как для МЬ02 свиньи. Некоторый дополнительный эффект оказывает, возможно,

Рис.20 Возможная цепь переноса электрона в МЬ кашалота [Ташкова М.Г. и др., 1985] .

отсутствие в ГЛЬ свиньи Гис ИЗ и 116, локализованных в МБ.кашалота вблизи конгатного : места (рис.17).

С помощью различий в локальной электростатике не удается, однако, объяснить в 3-4 раза более высокую скорость окисления МЬ 02 свиньи при высокой ионной силе и при.рН > 7,5 в условиях низкой I, когда Гис непротонированн. "Неэлектростатическое" увеличение скорости процесса может быть достигнуто за счет умень-иения свободной энергии образования элекгрон-переносящегокомшгек-са, а также уменьшения расстояния между 'донором и' акцептором при лучшем стерическом соответствии контактирующих поверхностей • и увеличении доступности групп, участвующих в переносе электрона.

Основываясь на разных значениях рК Ионизации "активных" Гис МЬ'кашалота, найденных из ЯМР и кинетических данных, можно думать, что в комплексе его со свиным СуЪ С имеет 'место большая реарганизация белковых групп,, чем для сястеш свиной МЬ-СуЬ С • свиньи. С друтой стороны, доступность Гис 24 (В5), возможно, участвующего в переносе электрона, в № свиньи в 3-4 раза больше, чем в МЬ кашалота (рис.20). Доступность Гис В5 в МЬ кашалота, по-видимому, возрастает при алкилировашш.Гис (ЗН1 .вследствие разрыва Н-связи между ниш и при комплексировашш Гис еН1 с цинком [22,40] , что также приводит к увеличению-не зависящей от ионной-силы скорости реакции КА-МЬ02. КМЧГЬО,, и -МЬ02 с СуЪ С (Табл.2).

Изменение скорости переноса электрона между белками в зависимости от происхождения одного из участников реакции ранее обнаруживали на комплексах Суь С с цинк-замещенной Сук С-перокси-дазой [липскомб В., 1980]. В том случае, когда оба белка были из . дрожжей, скорость переноса электрона бцла.в раз больше, чем в комплексе дрожжевой'лероксвдазы с СуЪ С лошади. Для этих белков, являющихся "физиологическими" партнерами, наличие специфики в структуре контактирующих областей может служить регулятором скорости биологического процесса. Возможно, что присутствие подобного эффекта в системе МЪ-СУ^ С указывает на некую неизвестную в настоящее время биологическую значимость этой редокс-реакции.

П. СТРУКТУРНО^ШЩЙОНАЛЬНШ ОТНОШЕНИЯ В ЦИТОХРОШ с и МОНОЖРШХ ГЛОБИНАХ. ВЛИЯНИЕ рН СРЕДЫ, ЭЛЕКТРОННОГО И ЛИГАНДНОГО СОСТОЯНИЯ ГЕМА НА. КОНФОРМАЦИЮ БЕЛКА. РОЛЬ ПОРФИРИНОВОГО МАКРОЦИКЛА Й АТОМА. Ге В ФОРМИРОВАНИИ НАТИВНОЙ МЬ-ПОДОЕН(Й СТРУКТУРЫ, ОБЕСПЕЧЕНИЙ ЕЕ СТАБИЛЬНОСТИ И КООШРАТИШЫХ СВОЙСТВ

I. Изучение кокформационных изменений цитохрома С методом спиновых меток

Несмотря на то, что свойства Cyt С давно и весьма детально исследуются разнообразными метода!®, многие вопросы, касающиеся конформационных превращений Cyt С, остаются нерешенными. Это в первую очередь конфорыационше различия между форрд- и ферро-.-Cyt с, мезду спектрально равлнчишш формами белка в интервале РН 2-13, а также между разными лигандшши производными Cyt С, в которых.6-ой лиганд Fe тема, Мет 80, замещается другим лпган-дом, белковым шеи внешним.

Спектры ЭПР яшнок сильных радикалов - спин-меток, присоединенных к белку, очень чувствительны к окружению и позволяют получать информацию о конфорыационном поведении выделанного участка структуры при различных воздейстшях. Такое "зондирование" структуры Cyt С со стороны Мет 80 (слева от гема на рис.7), где локализовано "активное место" в реакции с шоглоблном, проводили, изучая подвижность меток sl^ и si^ в сшн-ыеченцх цито-хромах - siu, (Мег 65)-Cyt С, Sl^ (Тир 74)-Cyt С и SI^-ЧЛиз 72/73)-Cyt С. Приведенные на рис.22 спектры ЭПР указанных производных свидетельствуют о слабой иммобилизации ишноксильных радикалов. Согласно расчитанным из спектров ЭПР временам вращательной корреляции свободной и связанных с белком меток, в наибольшей степени, в ~ 25 раз, затормежено вращение спин-метки, связанной с Тир 74 (Табл.3).

Ферри-сЬерро-переход. Как показано многочисленными исследованиями, окисленный и восстановленный Cyt С в растворе по разному взаимодействуют с одними и теми see химическими реагентами, антителами и партнерами по дыхательной цепи, а также отличаются ионообменными свойствами и стабильностью, иа чего делался вывод о том, что их структуры должны заметно различаться [Дтакероон Р.В., Тимкович Р., 1975]. Однако рентгеноструктурннй анализ крио-таллов ферри- и ферро-Cyt с тунца, выполненный с разрешением 0,18 и 0,15 нм [Такано Т., Днккероон Р.В.-, 1980], выявил лишь

^-(CHg)^-]

ИШ-

II 0

CH, CH,

T-k 5

н i Н

Рис.21 Спин-мечепые фрагменты остатков Мет, Тир и Лиз л спектры ЭПР свободного иминокислотного радикала в-растворе (а) л сшт-мзчешх по ?!ет 65, Тир 74 и Лиз 72/73 производных фэрри-Cyt С (б-г)

незначительные, менее 0,01 им, различия мещду двумя структурами в нижней части гемовой полости, а именно, в положении атомов Асн 52, Тир 67, Тре 78 и связанной здесь молекулы воды. Методом ЯМР обнаружены также различия в динамических свойствам ферро- и ферри-Cyt С з растворе вблизи Ил» 57, где локализован основной антигенный участок Cyt С [моор Г.Р., Вильяме Р.Дж.П., 1980].

Таблица 3

Вращательная подвижность спиновых меток в спин-меченых производных ферри-Cyt с, ферро-Cyt С и цианферри-Cyt С. 0,1 М фосфат, pH 7.

Образец % • Ю10 сек

cyt С (3) Cyt С (2) оя-cyt C(3)

si^(мет 65)-Cyt С 5,1±0,3 4,8±p,3 0,7^0,05

SL 2 (Тир 74)-Cyt С 7,1^р,4 6,9^0,4 0,5iP,04

sl2 (Лиз 72/73)-Cyt С G,4iP,3 6,5i0,3 0,5iP,05

Спин-метка в р-ре 0,3JD,03 0,3±0,03 0,3 ¿0,03

Как видно из табл.3, ни одна из спин-меток, в том числе связанная с Тир 74, который расположен на расстоянии 0,4 ни от Иле 57, не испытывают достоверного изменения подвижности при ферри-ферро-переходе. Это свидетельствует в пользу того, что в растворе, как и в кристалле, редовс-завпсикые изменения конфор-мации Суъ С очень малы, что хорошо согласуется с его функцией переносчика электрона. Длагодаря тому» что Cyt С является одним из наиболее плотно упакованных белков с сильно ограниченной подвижностью внутренних остатков [вильдас Р.Дж.П., 1979], энергия реорганизации при присоединении и отщеплении электрона от Ре гема должно быть минимальной. Что касается данных литературы о различиях физических, химических и иммсгнохиыическшс свойств фер-ри- и ферро-Суь С, то они, возможно, обусловлены разными динаш-ческими свойствами отдельных участков структуры.

рН и лигадд-индуцированные кокйормационнне изменения. Согласно данным оптической спектроскопии, кругового дихроизма и ЯМР в области тема [теорвлл Аш., Акесон А., 1941; Диккерсон Р.Е., Тимкович Р., 1975; Смитг Аш.Т., Миллет Ф., 1980] в интервале рН 0-13 имеется 5 спектрально различимых состояний ферры-<^ С, переход мезду которыми соответствует диссоциации одного протона (цифры под стрелками указывают рК перехода):

Н+ Н+ Н+ Н+

I __~ II __ III -- 1У -£-- У

0,4 2,5 9,3 12,8

Нативной области рН,4-12,5, отвечают два низкоспиновых сост-тояния, III и 1У, ферри- Сзъ С, переход мезду которыми происходит с рКэ,з и которые отличаются,наиболее вероятно, 6-ьш лиган-дом: Мет 80 замещается депротонированным остатком Лиз. В ферро--Суъ С, в отличие от ферри-формы, интерконверсии 6-го лиганда в нативном белке не происходит, что объясняется более прочной связью Мет 80 с феррогемом. Состояния 1,Ц и У соответствует денатурированным кислотой и, .соответственно, щелочью формам Cyt С: первые две - высокоспиновые, в которых один или оба лиганда гема, Гис 18 и Мег 80, замещены на Н20, а последняя - низкосшновый Cyt С с 0Н~-ионом в 6-ом лигандном положении. Согласно литературным данным [диккерсон Р.Е., Тимкович Р., 1975}координация Мет 80 с гемом не играет существенной роли в поддержании нативной кон-формации гемовой полости и молекулы белка в целом. Цря замещения Мет 80 внешними лиганда!,ш, такими как цианид, азид для имидазол, оС -спиральноеть, вязкость и тепловая стабильность Су* с суще-

ственно не изменяются, как и флуоресценция контактирующего с ге-Трп 59 [Майер И.П., 1968]. Еще меньший - эффект на структуру Су-ь С должна, как полагают, ошзывать замена Мет 80 другим б ежовым ллгандом при переходе с рК 9,3.

На рис.22,а-в показано изменение с рН параметра, пропорционального спин-меток в модификацированных СуЬ. Несмотря на то, ■что все исследуемые спин-меченые Суъ С по спектрам поглощения при 695 ни и спектрам Я1.ЕР претерпевают переход с рК 9,3 [8] , только сшн-метка в полонешш.Мет 65 регистрирует при этом изменение локальной конформации белка (рис.22,а). Две другие метки при Тир 74 и Лиз 72/73, "не чувствуют'1 этого перехода, но регистрируют изменение белковой конформации с рК 11,1, предшествующее щелочной денатурации СуЬ С (Рис.22 б,в). Как показал анализ 25 , этот новый переход, отсутствущий в приведенной Еыие классической схеме Теорелла, индуцирован ионизацией "внутреннего" Тир 67 (0,48 ни от гема), 0Н~-группа которого, вероятно, координирует с Те гена МоркшимаИ. я др., 1977; Хасука Аш., 1980 . Интервал перехода составляет 3-3,5 ед.рН и соответствует диссоциации одного протона. Схема превращений ферри-<^ С в щелочной области должна быть, таким образом, представлена как

Н+ Н+ , Н"1"

III _2_~ 17 _й__ 1У1 -—„ у

9,3 11,1 12,8

Изменение конформации Су-Ь С при переходе с рК 9,3 невелико по масштабу и затрагивает только окружение Мет 65, которое, очевидно, наиболее чувствительно к ориентации боковой цепи Мет 80. Поскольку подвижность меток при Тир 74 и Лиз 72/73 при этом не изменяется, остатком Лиз, который вытесняет Мзт 80 из координации с гемои, иохет быть только соседний с ним остаток Лиз 79. Значительно более масштабная изомеризация левой части структуры суъ С тлеет место при переходе с 11,1, сравнимая с тем, что наблюдается при замещении Мет 80 внешним лигаядом - цианидом (рис.22, табл.3). Значительное, в 7-15 раз, увеличение вращательной под-вияности всех трех меток в спин-меченых циан-СуЬ С свидетельствует о существенном изменении конформации сегмента полипептидной

цепи, примыкающего к Мет 80, и увеличении его динамики. Подтверждением может служить тот факт, что по данным микрокалориметрии и КД [18] температура плавления Суъ С в присутствии -0,1 м ксн уменьшается на — 3°С, а денатурирукщая концентрация мочевины - на I М (рН 7), что соответствует уменьшению конформационной стабильное-

т на ^2,5 ккал/моль. Таким образом, в отличие от ' интегральных методов исследования, с помощью спиновых меток удается достаточно детально списать конформацион-ные события в структуре Суъ С и их последовательность при действии рН и других функционально важных факторов. Показано, что локальная изомеризация Су С с рК 9,3 обеспечивает необходимые условия для иониза-«ции "внутреннего" Тир 67 и конформационного перехода с рК 11,1, а последний, деста-

Рис.22 Влияние рН на подвижность билизируя структуру, подго-

меток в спин-меченых йеприцитохро- тавливаег и облегчает в свою

мах С: а - вБ^ Шег 65)-Су*С, пцрпрпъ пппиеес ¡полочной б - в эМтдо 74;-СУъ С и в - в очередь процесс щолочнои

ЗМЛиз^72/,?3)-<^ С. 0.01 М денатурации белка,

трис-фосфат, 1:1, 0,1 М КС1. л - подвижность стт-иетш в циaн-Cyt С

2. Конформационное поведение мпоглобина к МЬ-подобннх структур при изменении рН. связывании лиганда и редокс-превращениях

Глобины - НЬ, МЬ, 1Ь и другие - представляют обширный класс глобулярных белков, функцией которых является обратимое связывание кислорода. В этих белках взаимосвязь между структурой и функцией изучена в настоящее время наиболее полно, главным образом, дая теграмерного НЬ [Перутц М.Ф., 1970; Балдвин Дж.М., 1975; Дкелин Б.Р. и др., 1983]. Перутцем предложен стереохишческий ме- • ханизм функционирования гемоглобина, который на молекулярном структурном уровне объясняет кооперативность связывания 0^ и регуляцию сродства к лиганду протонами (эффект Бора) и дифосфогли-цератом [Шаронов Ю.А., Шаронова Н.А., 1975].

Согласно Перугцу крупномасштабные различия в четвертичных структурах окси-НЬ и дезокси-НЬ (так называемый В.-Т-переход), обладающих, соответственно, высоким и низким сродством к 0£, индуцируются небольшими изменениями конформацш субъедшшц, "запускающими" изомеризацию гетрамера. При этом главную роль в механизме

"триггера" играет изменение спинового состояния Fe. гема и его положение относительно плоскости протопорфиринового кольца при связывании лиганда, которое в свою очередь приводит к изменению ориентации связанного с Те проксимального лиганда -Гис Г8 и конфор-мационным изменениям на С-конце субъединицы. Имеется и другая точка зрения на механизм триггера, по которой основную роль играют взаимодействия присоединяющегося внешнего лиганда с • "дисталь-ным" Гис Е7 и другими группами белка в "дистальной" части гемовой полости [Литтл Р.Г., Ибере Да.А., 1974; Эделынтайн С.Дк., Гибсон К.Аш., 1975]. Показано, кроме того, что не существует прямой корреляции между электронной структурой гема и сродством к лиганду при действии различных аллостерических эффекторов [пин С. и др., 1986 .

Следует сказать, что если изменения на уровне четвертичной структуры в НЪ установлены достаточно надежно [перутц М.Ф., 1970, 1979; Перутц М.Ф. и др., 1987], то изменения в третичной структуре оС- и Jb -субгединиц являются в значительной степени гипотетическими и требуют дополнительных исследований [Арнон А. и др., 1986; Лидингтен Р. и др., 1988; Луизи Б., Шибаяма Н., 1989]. Поскольку НЬ, не будучи ферментом, проявляет характерные дош большинства ферментов кооперативные и аллостерические свойства, выяснение механизма его функционирования имеет общее значение для молекулярной биофизики белков.

Мономерные глобины представляют уникальную модель для изучения лиганд- и рН-индущрованных конформационных изменений в белке на уровне третичной структуры. Правда, кооперативность по отношению к'связыванию лиганда ж Бор-эффект в них либо отсутствуют, либо существенно меньше, чем в гемоглобине [Антонини е., Брунори М., 1971; КраснобаеЕа H.H. и др., 1977; Друтюнян Э.Г., 1983; Ла Map Г.Н. и др., 1983; Герзонде К. и др. 1Э8б]. Особый интерес представляет МБ, структура которого наиболее близка структуре субъединиц НЬ, в особенности j3-цепей, связывание и отщепление лигандов которыми как раз и вызывает R-T-переход [конкони Ф. и др., 1980]. В наших исследованиях основное внимание уделялось, с одной стороны, конформационннм изменениям в гемовой полости, а с другой - в дистальной части и на IT-конце МЬ-подобной структуры. Последние, по сравнению с проксимальной и С-концевой областью, очень мало изучены.

2.1. Изучение апомиоглобина, комплекса апо-МЬ с протопор-фарином IX и разных лигавдных производных ферри- и феррошо-глобина методом Флуоресценции

Апомиоглобин. Влияние рН. В ы -концевой и примыкащей к N -концу области структуры миоглобины всех млекопитающих содержат два инвариантных остатка Трп, входящих в состав А-сдирали, Трп 7 (А5) и Трп 14 (А12). Первый локализован между Лей 2 (КА2) и Лиз 79 (ЕГ2), а второй ориентирован в пространство между спиралями А и Е и образует Н-связь с Лиз 77 (320). Несмотря на изменения, вызванные удалением тема,' апо-МЬ, как показано, сохраняет

основные особенности мио- ' глобиновой структуры, имеет развитое гидрофобное ядро и представляет собой единую кооперативную систему, не отличаясь в этом отношении от других глобулярных белков с уникальной пространственной организацией [Гершкович Т.Т., Солли Н.Дк., 1975; Грико Ю.В. и др., 1988] . рН-завнсимая флуоресценция апо-МЬ кашалота имеет сложный характер [кнрби Б.П., Штайнер Р.Ф., 1970]. Он обусловлен тем, что флуоресцентные свойства двух Трп различаются: "экспонированный" Трп характеризуется более длинноволновой, но менее интенсивной эмиссией, чем "спрятанный" , который имеет, по-видимому, бо^ее эффективную коротковолновую эмиссию [колоша Г. и др., 1978; йрасе Т. и др., 1981; Василевски 3. и др., 1988]. К тому же эмиссия обоих Трп, по-видимому, по разнощ- тушится группами белка при разных значениях рН.

Чтобы идентифицировать "экспонированный" и "спрятанный" Трп в структуре апо-МЬ и разделить их вклады в спектр его эмиссии в интервале рН 2-13, в данной работе изучали рН-зависимую флуоресценцию интактного апо-МЬ кашалота и модифицированных по Трп 7

Рис.23 Пространственная структура МЬ кашалота и положение остатков тщптофана [Шехтер А.Н., Эпштейн Ч.Дж.

----

X < в

и 14

« ов

ЕГ

о гг

о.

о 1 8

"В- 1 4

(Я

«3 10

•а

ое

о ta

о 1 4

ов

производных, HNB-ало-МЬ и hps -апо-МЬ, в которых флуоресцирует только Трп 14 (См. "Материалы и методы").

Показанная на рис.24,а кривая флуоресцентного титрования апо-МЬ включает три характерные области: нейтральную, рН 5,5-10,1, область нативного состояния апо-МЬ, где квантовый выход триптофа-новой флуоресценции увеличивается при рН 5,5-8,5 в W,5 раза, а положение максимума спектра остается постоянным; кислотную область, рН 5,5-2, где в интервале рН 5,5-4,3 одновременно изменяются

т , л 1___.что вызвано кислойй денатурацией апо-МЬ, и, нако-

шл ^мэкс

нец, щелочную область, рН 10,1, где также наблюдается изменение флуоресцентных параметров из-за щелочной денатурации.

Тушение флуоресценции апо-МЬ иодидом К, который, как известно, тушит экспонированные в раствор группы, свидетельствует о том,что "экспонированному" Трп в интактном апо-МЬ соответствует эмиссия с

Л-макс 333±г а танному" -326+1 нм (Табл.4). Расчет разностных спектров эмиссии апо-МЬ в нейтральной области рН (Табл.5) показывает,что при пони. жении рН от-8,5 до 5,5 .тушится эмиссия только

- "спрятанного" Трп (рК перехода 6,8) что согласуется с данными других исследователей. Кривые титрования моди-

- 'фнцированных апо-МЬ,

где флуоресцирует толь-

Рис.24. Зависимость от рН триптофаяовой ко трп AI2 (рис.24 б,в) флцоресценции апо-МКа^ннв-апо-МЬ© и- „mmTT„„m„CT ma„ „т„ „„ апо-МЬ кашалота(^Возбуждение при.285 нм, .отличаются тем, что из-

щели 5x2 нм, А280=0Д» 0,05 М трис-фос-, .менения в кислотной

фатный буфер и щел0чноЙ области малы

или совсем отсутствуют. Очевидно, что в апо-МЬ 'за них ответственна эмиссия Трп 7 (А5). Тог факт, что переход в интервале рН

: Ч/Ч/.

„у

8 1С

?Я

Таблица 4

Влияние К1 на флуоресценцию апо-МЬ. Возбуждение при 286 нм, щели 5x2 нм, 0.4 М К1; 0,01 М буфер, 0,15 М КС1, Д280 = 0,1 - 0,15

Образец рН % тушения Исходный спектр Л(ЭС 1з2б/1з5° Результирующий спектр Лм^с 1з25/1з50 Дифференциальный спектр

2,5 54,0 336 1,2 324 1,68 339+1 0,94

3,1 54,7 336 1,21 324 1,65 339+1 0,96

4,4 58,1 337 1,25 327 1,55 337±1 1,05

апо-МЬ 5,65 38,0 328 1.41 326 1,51 333±1 1,23

7,0 32,0 327 1,5 326 1.6 333±1 1,27

8,15 33,0 327 1,51 325 1,61 332±2 1.3

8,5 30,6 327 1,52 326 1,62 333±1 1,25

И»1 31,0 336 1,24 335 1,26 335±1 1,16

12,2 36,5 337 1,1 336 1,12 337±1 1,06

5,5-8,5 в обоих случаях сохраняется, свидетельствует о том, что он связан с изменением эмиссии Три 14 (AI2), Флуоресцентные параметры апо-МЬ, ffiffi-ало-МЬ и ups -апо-МЬ приведены в табл.6.

Таблица 5

Влияние pH на спектр флуоресценции апо-МЬ в интервале pH 5,5-9. Спектры скорректированные, щели на возбуждение и эмиссию 3x3 нм, 0,01-0,05 М буфер, 0,15 М KCl, Д280 = 0,1-0,13

_Максимум спектра (нм)_

Возбуждение при 286 нм Возбуждение при 295 нм

а б а б Дифференциальный спектр а - б а б Дифференциальный спектр а - б

8,0 5,9 327±1 328±2 326tI 328±1 329±2 327+1

8,15 5,65 326±1 327±2 325±1 327+2 328±1 326+1

8,6 5,9 327±1 328+1 327±1 327±1 328+2 3'26±1

8,7 5,5 327+1 329+1 325±1 328+2 330+2 327+1

Полученные данные позволяют идентифицировать Трп 7 (А5) как "экспонированный" и Трп 14 (А12) как недоступный' растворителю остаток в апо-МЬ. Кроме того, предполагая флуоресцентное поведение триптофанов независимым,, то есть, д шо_щ1 =(дурП 7 + + 1 Трп 14 У2, и полагая д Трп м = д й^а^и,, можно легко оценить вклада обоих Трп в спектр эмиссии апо-МЬ в интервале рН 2-13. Оказывается, что флуоресценция нативного апо-МЬ определяется, в основном, Трп А12, эмиссия которого вдвое превышает эмиссию Трп А5, сильно потушенную аминогруппой Лиз ЕГ2. При рН 5,5 вклады обоих Трп равны, а эмиссия денатурированного кислотой апо-МЬ (рН < 5,5) определяется, в основном, Трп А5, вклад которого возрастает в ^ 3 раза. Эмиссия же Трп А12, которая в результате тушения в интервале 8,5-5,5 уменьшается вдвое, при дальнейшем понижении рН вплоть до рН 3 остается постоянной. Изменения 1фд в щелочной области также обязаны Трп А5.

Чтобы выяснить механизм тушения флуоресценции апо-МЬ в на-тивной области рН и определить тушащую группу белка, исследовали

Таблица 6

Флуоресцентные характеристики интактного и модифицированных апомиоглобинов в нейтральной области pH. Возбуждение эмиссии при 286 нм, щели на возбуждение и эмиссию 5 и 2 нм, 0.01-0.05 М буфер, 0,15 М KCl, A?ftn = 0.1-0.13

Образец /макс (нм) q макс (pH 8-10) "V, нсек (РН 8-10) IS25/'I350 ^ макс^ (нм) Перехор при pH 5.5 8.5 q/q рК макс

апо-МЬ 327+1 0,068+0,002 2,7±0,3(по фазе) 3,5±0,3(по мод.) ' 1,5±0,03 50±1 0,3840,02 6,8^0,2

ШВ-ало-МЬ 326±1 . 0,086+0,002 2,5±р,2(по фазе) 3,5±р,3(по мод.) 1,5±0,03 . 51+2 0,54p,02 7,04^1,2

NES-апо-МЬ 326+1 0,IIäp,0I - 1,3±0,03 51±2 0,35±Р,02 6,84p,2

МИТЦ-апо-МЬ 326±1 0,06440,002 - 1,63+0,03 50+1 0,36+0,02 6,8±Q,I

КА-апо-МЬ 326±1 0,066i0,0I 2,6±0,1(по фазе) 3,3+р,2(по мод.) 1,6+0,03 50+1 отсутствует

КМ-апо-МЬ 330±3 0,1+0,1 3,0±0,2(до фазе) 4,5^0,1(по мод.) 1,35±0,05 53±1 0,23±0,05 7,IiO,2

изменение времени жизни флуоресценции ало-МЬ-МЬ в интервале рН--5-9 (рис.25) и изучили рН-зависимую флуоресценцию апомиоглоби-нов, модифицированных по остаткам Гис и N -концевой оС-амино-груше. В соответствии с найденными рК перехода (Табл.6) только ионизация этих остатков может быть причиной тушения эмиссии Трп AI2 [кирби Е.Р., Штайнер Р.Ф., 1970].

Как видно из рис.25 наблюдается изменение при рН 5-9 на 30$ для апо-МЬ и на 50% -для ННВ-апо-МЬ, что полностью соответствует изменению квантового выхода (Табл.6) и указывает на динамический механизм тушения. Предполагавшийся ранее статический механизм представляется менее вероятным, флуоресцентное титрование модифицированного по с*Г-аминогруппе МИТЦ-апо-МЬ и алкилированных по Гис производных, КА-апо-МЬ и КМ--апо-МЬ, показано на рис,26, а в табл.6 приведены флуоресцентные параметры указанных производных. Полученные данные для КА-апо-мь (рис.26,б), где переход при рН 5,5-8,5 отсутствует, позволяют заключить, что тушителем является ионизованный Гис, с наибольшей вероятностью Гис 119 (SHI). Обсуждаемый-переход, правда, с несколько измененными характеристиками, наблвдаегся в КМ-апо-МЬ (рис.26 в, табл.6), где Гис CHI, как и в КА-апо-МЬ, алкилирован. Поэтому нельзя исключить, что при определенных условиях тушителем может быть также "внутренний" Гис 24 (В5), который в апо~МЬ должен получить возможность протонироваться [49].

Поскольку максимумы эмиссии Трп А5 и AI2 различаются, параметр I325/L325' отражающий вклады в суммарный спектр "коротковолнового" и "длинноволнового" Трп, очень чувствителен к изменению их окружения, в том числе в нейтральной области рН, когда максимум флуоресценции апо-МЬ остается постоянным (параметр формы спектра). Изменение Гфд в интервале рН 5,5-8,5 в апо-МЬ и 1ШВ-

_DH

Рис.25. Зависимость ТТ^ от рН ' для нативного апо-МЬ (а? и Н В-апо-МЬ (б). Возбуждение при 286 нм, щели на возбуждение их . эмиссию 16x5 нм, частота модуля-

ции 30 МГц А,

280

= 0,2

2 4 6 8 10 рН Рис.26 Флуоресцентное титрование МИЩ-апо-МЬ (а), КА-апо-МЬ (б) и КМ-аро-МЬ (в)

/ / - а \

^ Б

; f — ■V

2 3456789 10 И 12

'Рис.27 Влияние рН на соотноше-ше 1325Л350 в спектРах Флуоресценции апо-МЬ (а), ННВ-апо--МЬ (б) и КА-апо-МЬ (в)

гапо-МЬ не сопровождается изменением формы спектра, то-есть, кон-формации апо-МЬ (рис.27, а,б). Выраженное же изменение этого параметра в КА-апо-МЬ при рН<7 (рис-.27,в) тоже никак не связано с переходом по который в КА-апо-МЬ отсутствует (рис.26,б). Скорее всего, оно отражает изменение конформации окружения Грд 45 на и-конце структуры, вызванное изменением общего заряда апо-МЬ при деионизации 9-10 из 12 остатков Гис [4б]. Резкое изменение соотношения в к^^0™0® и щелочной области является ре-

зультатом длинноволнового сдвига максимума спектра, которое имеет место как в апо-МЬ, так и НИВ - и иРэ -апо-МЬ.

Изучение триптофановой флуоресценции апо-МЬ позволяет сделай вывод, что при кислотной и щелочной денатурации разрушается уникальная пространственная организация белка, в то время как его вторичная отруктура и компактность в значительной степени сохраняются. В соответствии с тем, что в денатурированном белке эмиссия Трп А12 остается достаточно коротковолновой (особенно в кислой о( ласти) и недоступной внешнему тушителю, это относится в первую очередь к структуре комплекса спиралей А и Е, а также,вероятно,

спиралей б и Н. Эти минные спирали в структуре МЬ связаны попарно многочисленными контактами боковых групп-, обеспечиваицих стабильность их взаимного расположения (Рис.23). Оценка вклада комплексов АЕ и ен в оС-спиральность денатурированного белка прекрасно согласуется с данными КД, согласно которым в разных апо-МЬ при рН 4,3 сохраняется от 1/2 до 2/3 всех оС-сгшралей, а при рН 11,6 - около половины [кирби, Щтайнер, 1970; Колонна и др., 1978; Ирасе и др., 198Г] .

Следует отметить, что изменение конформации апо-МЬ при щелочной и кислотной денатурации происходит ло-разному. В первом случае при рН > 10 одновременно изменяется окружение обоих Трп и ге-мовой полости (последнее регистрируется по диссоциации красителя АНС [Кирби, Штайнер, 1970]. При кислотной же денатурации первоначально, рН 5,5-4,3, разрушаются нативные структуры гемовой полости и и-конца молекулы, что регистрируется по флуоресценции Трп А5, и лишь затем, рН <4,3, происходит изменения в окружении Трп Д12. Синхронность информационных изменений гемовой полости и удаленного от нее п-конца молекулы может обеспечиваться за счет участка ЕГ, контактирувдего с ^-концом. Динамика групп в районе Трп А12 в денатурированном апо-МЬ остается существенно меньшей, чем в окружении Трп А5, эмиссия которого при рН< 4 эффективно тушится,'вероятно, соседним остатком, ГлУ А'4, а при рН > 11,5 - гидроксильными ионами. Этот процесс особенно ярко выражен в модифицированных МИТЦ-апо-МЬ, КА.-апо-МЬ и КМ-апо-МЬ (рис.26), где динамика к-конца увеличена в результате модификации оС-аминогруппы.

Комплекс апо-МЬ с протопорфирином Д; рН-зависимые измене-нения триптосбановой и порфириновой флуоресценции. Встраивание в гемовую полость безмегального аналога гема - ПШХ, который в отличие от гема обладает интенсивной флуоресценцией в видимой области, позволяет одновременно следить за конформационными изменениями в "активном центре" и на "периферии" молекулы, индуцированными рН.

В нативной области, рН 5,5-10,8, спектры флуоресценции и поглощения *ПП1Х в комплексе с апо-МЬ остаются постоянными (Рис.28). Не изменяется и время .жизни флуоресценции ПП1Х, составляющее 18+2 нсек [37]. Изменения наблюдаются только при кислотной и щелочной' денатурации и вызваны диссоциацией ПШХ из комплекса [37,51].

Более разнообразен характер изменения триптофановой люминесценции ШНХ-апо-МЬ (рис.29). Изменения (а) полностью коррелируют с изменениями флуоресценции и поглощения 1Ш1Х. Резкое увеличение' при рН < 5,5 и менее значительное -в щелочной области объясняются исчезновением тушащего эффекта простетической группы ПП1Х, диссоциирующей в раствор. Отметим, что никакого изменения интенсивности трицтофановой флуоресценции в интервале рН 5,5 - 10,8 не наблщается, что отличает ПШХ-апо-МЬ от ало-МЬ. и доказывает, что регистрирует' ся действительно уф-лкминесцен< ция комплекса, а не примесного апобелка. Длинноволновый сдвиг максимума спектра в щелочной области невелик и наступает од новременно с . возгоранием флуоресценции, а гораздо боль-в кислой области регистрируется только прк рН <4,3 (рис.29,бТ.*~Соогношение 1325/1350 в 105области умещ шаегся одновременно с возгоранием флуоресценции, а в целочной -уже при рН 9,5, за /~1,5 ед. рН до щелочной денатурации.

Согласно полученным данным структура ПЩХ-апо-МЬ отличается от адо-МЬ взаимной ориентацией А-спирали и бн-фрагмента (АЕ- и еН-опиральных комплексов), так как контакт между,Три А12 и Тис В! не реализуется. По структуре и динамическим свойствам комплекс адо-МЬ с ШПХ более близок холо-МЬ (см.далее), хотя "дефектная" структура гемовой полости" приводит и к несколько измеренной ко» формации и повышенной динамике групп на н -конце молекулы [51] . Кислотная денатурация ПШХ-адо-МЬ, как и апобелка, протекает в дв стадии, затрагивая в первую очередь указанные более "слабые" области структуры. В обоих случаях этот процесс инициирует, очевидно, протонирование свободного проксимального Гис Г8. Цравда, из-

Рис.28 Влияние рН на флуоресценцию (а) и поглощение (о,в) ПИ1Х--ало-МЬ в видимой области. Возбуждение при 408 нм, щели на возбуждение я ешссию I и 2 нм,

¿cope = °'24

шее изменение

■^макс

мененш в конформации Я-кон-ца менее выражены, чем в ало--МЬ и регистрируются только по изменению формы флуоресцентного спектра, а основные кон-формационные события в районе гргагаофанов происходят при рН <4,3.

Обнаруженное при рН >9,5 изменение формы флуоресцентного спектра (рис.29,в) отражает изменение локальной конформащш 1ШХ-апо-МЬ, предшествующее щелочной денатурации. Оно отсутствует в апо-МЬ, но характерно для всех холомиогло-бинов, исследованных ката, и его природа подробно али-е в ю • V зируется в следующем разделе. Рис.29 Влияние рН на интенсивность триптофановой флуоресценции (а),положение максимума спектра (б) и соотношение 1325/1325 комплекса апо-МЬ с ШЕХ

Конформационные изменения в ферри- и ферромиогло'бинах, _индуцированные рН среды и лигандами. В интервале рН 2-13 изучена триптофановая флуоресценция высоко- и низкоспиновых лиганд-ных производных ферри-МЬ кашалота: мет-МБ, гаси и МШд, а также ферро-МЬ: МЬ(2), МЬ02 и МЬСО. Кроме того, исследованы МИТЦ-мет--МЬ кашалота и мет-МЬ быка. В табл.7 приведены данные по рН--зависимой флуоресценции всех этих белков, а также, для сравнения, апо-МЬ и ГШ1Х-апо-МЬ. Типичные кривые флуоресцентного титрования холо-МЬ показаны на рис.30 и 31 дом циан-МЬ (3) и окси--МЪ(2). Они аналогичны, соответствующим кривым дая ППЫ-апо-МЬ. Резкое увеличение квантового выхода в кислотной области (в 3 раза больше, чем для ПП1Х-апо-МЪ) и под действием щелочи вызваны элиминированием тушащего эффекта гема из-за диссоциации его в раствор и позволяет очень точно детектировать начало денату-рационного процесса. Во всех МЬ-ах наблюдается предшествунцее щелочной денатурации изменение формы эмиссионного спектра при

том, что 1фд и Л-макс осгаются постоянными.

Таблица 7

рН-зависимая триптофановая флуоресценция ферри- и ферромиоглобинов кашалота и быка, а также апо-МЬ кашалота и его комплекса с протопорфирцном IX.

Нативная область Кислотная денатурация Щелочная денатурация Предденатурацион-

Образец ный переход

_(£)_(£)_(%)

мет-МЬ 325+1 1.8±0.05 49±1 4.4±0.1 6±1 25+2 II.5+0.I 5-6 22±1 9.5 10.75+p.I I8+I мет-МЬ( бы- ш

ка) 325±I I.85¿0.05 48¿I - И. 5*0.1 6±I 2I¿I 9.5 10.8^,1 I7+I

МЙТЦ-мет-

-МЬ 324±I I.85±0,05 48+1 4.4±0.I 11-12 42+1 II.5±0.I 5-6 '28+1 9,5 I0.75±0.I 25±I

МЬСЯ 326+1 I.75±0.05 5I+I 4.3+0.1 6¿I 24+1 II.7J0.I 5-6 2I+I 10.5 II.4+0.1 I3+I

МШ3 326+1 I.75iO.I 50±I 4.2J0.I 6¿I 22+1 11.6+p.I 6+1 20+1 10.5 II.5+0.1 12+2

Mb(2) 330+1 • I.4±0,I 5I±I 4.3¿0.I - - II.8±0.I 6±I 29±I 9.8 10.9+0.1 26+1

Mb02 326±I I.75±Ü05 49±I 4.2+0.1 10-11 4I±I I2.0±0.I 5-6 20+1 10.5 II.5¿O.I I5±I

MbCO 326±I 1.8*0.05 49±I 4.2*0.1 10-11 4I±I 11.9*0.1 5-6 I9±I 10.5 11.5*0.1 I6+I

апо-МЬ 327+1 1.5+0.02 50+1 5.5+0.1 IO+I 27+1 IO.I+O.I 9±I 27±I отсутствует

ШПХ-апо- 327+1 1.6*0.02 50+1 5.5*0.1 I4+I 43+1 10.8*0.1 IO+I 26+1 9.5 10.8*0.1 20±I

S i*

А * ^ о о у

-<0-0, —о- Ь о-о-о-о' о-О—0-Q— о ^

„о-д-а-л- / а / \

Отличия холо-МЬ от ППГХ-апо--МЬ заключаются в большей ста-| бильности к денатурации и в j большей кооперативности конфор-нацконного перехода в кислот- ной области.-Структуры гемовой

• щели и дистальной области структуры в МЬ нарушаются од-

I новременно, что рёгистрируется

• по синхронному изменению всех 1 флуоресцентных параметров Трп ..и поглощения тема [47]. ' Изменение формы эмиссионного i спектра з нагивной области pH, ; как специально, показано [47, : 50], не связано с возможным

вкладом тирозинатной флуоресценции ( Ац^дс 350 нм) от Тир 151(НСЗ), который ионизуется ; ри рН>9. Наряду с тем, что интенсивность флуоресценции Тиро", по сравнению с трип-тофановой пренебрежимо мала [хирш P.E., Пейзах Дж., 198б] , указанное изменение формы спектра наблюдается и в мет-МЬ быка (Табл.7), где Тир 151 замещен на фен.

Анализ структуры МЬ показывает, что флуоресценция Трп отражает, по-видимому, локальное изменение конформации в районе A-GH, которое происходит при депротонировании Лиз, участвующих в образовании важных солевых связей, стабилизирующих эту область структуры. В районе Трп А5 имеются два "солевых мостика", Глу А2-Лиз ЕГ2 и Глу А4-Лиз Н20, которые "прикрепляют к-конец A-спирали к EF-участку и спирали Н, а вблизи Трп AI2 - еще два, Глу А16-Лиз Е20 и Лиз А14-Асп GH4, стабилизиругацие локализацию A-спирали относительно SH и спирали Е (рис.23). Все эти "мостики" инвариантны в МЬ млекопигавдих, а второй и четвертый, игращие, по-видимому, особенно важную роль в поддержании нативной конформации этой области, инварианты для всех животных глобинов [Гурд Ф.Р.Н. и др., 1980] . Таким образом конформационное изменение МЬ, предшествующее щелочной денатурации, может состоять в небольшом из-, менении взаимной ориентации АЕ- и GH-спиральных комплексов.

Рис.30 рН-зашсимая флуоресценция цианлдного комплекса ферри--МЬ. Обозначения и условия те же, что на рис.29

« 20

Л'

С*—-•-|.И-**Г

^о—о^о-о-о—о0—о-о—— с

"■ч

Рис.31 Флуоресцентное титрование оксимиоглобина, обозначения и условия эксперимента те же, что на рис.29

Данные табл.7 указывают на то, что электронное и лигандное состояние гемового комплекса мало влияют на флуоресцентные параметры, то-есть, окружение Трп, и на стабильность МЬ к денатурации. Последняя несколько больше для ферро-,чем для ферримиоглобинов. Тем не менее видно, что рК щелочного предденатурационного перехода для низко- и высокоспиновых производных различаются и составляют, соответственно, 10,8± ¿0,1 и 11,5. В соответствии с тем, что переход вероятнее всего, индуцирован разрывом указанных выше "солевых мостиков", увеличение рК перехода в ниэкослиновых комплексах на 0,7-0,8 ед.рН означает, что

окружение инвариантных Лиз, в первую очередь Лиз А14 и Н20, становится более электроотрицательным (дом Лиз в воде рК 10,4). Таким образом, изменение конформации при присоединении к гелу шз-коспиновых лигандов, СГ-, 02 и СО, затрагивает ту же область контактов между АЕ- и бН-спиральными комплексами, что и при изменении рН, но масштаб этих изменений существенно меньше. Рентге-ноструктурный анализ разных лигандных МЬ дает различия в координатах атомов, не превышащие 0,1 нм (Банк белковых данных).

Несмотря на то, что имеется корреляция между спиновым состоянием Ге и рК конфорыационного перехода в дастальной области,кон-фор'.ация МЬ здесь все-таки неодинакова для разных лигандов. Так, по масштабу изменения флуоресцентных параметров низкоспиновые МЬ0? и МЬСО больше похожи на внсокосшновые МИТЦ-мет-МЬ и МЬ(2), чем на низкоспиновые МЬСН и МЬя3, а безлигандный МЬ(2) лучше соответствует в этом отношении МИТЦ-мет-МЬ, содержащему в качестве 6-го лиганда молекулу Н20, а не интактному мет-МЬ (Табл.7). Поскольку Я-конец в ШТЦ-МЬ ацилирован, речь может идти с разной конформации н-концевой области структуры. Последняя, по-видимому, определяется не только спиновым состоянием гемового комшгек-

са, но и теш взаимодействиями, в которые вступают разные по химической природе лиганды с группами белка в гемовой полости.

Сравнение МЬ-подобных структур. Роль протопорфиринового макроцикла и атома Те в формировании нативной конформации миотлобина

Изучение рН-завлсямой флуоресценции апо-МЬ, ШЦХ-апо-МЬ и холо-МЬ обнаруживает как сходство между ними, обусловленное общим типом укладки полипептидной цепи, гак и различия, возникающие благодаря влиянию простатической группы. Особенно сходно флуоресцентное поведение МЬ и его безметального аналога, ПШХ-апо-МЬ, которое заметно отличается от поведения апо-МЬ, означая, что ключевую роль в формировании МЬ-подобной структуры играют взаимодействия мевду белком и протопорфиряном, а не связь Ге с проксимальным Гис Г8.

Известно, что при удалении гема интегральные характеристики МЬ, такие как о^-спиральное содержание, вязкость, скорость водородного обмена и другие, изменяются на 10-20%, а тепловая стабильность уменьшается в раза [гершкович Т.Т., Солли Н.Дя. ,1975; Грико Ю.В. и др., 1988]. Флуоресцентные данные свидетельствуют о том, что при переходе от МЬ к апо-МЬ основные изменения должны происходить в области контактов гема с группами белка в СД и Г6-межспиральных областях, а также в к-концевой области, то-есть между АЕ (АВСДЕ) и GH (РбН) спиральны!® комплексами. Внутренняя структура самих этих спиральных доменов в ало-МЬ в основном сохраняется, о чем, свидетельствуют данные по денатурации апо-МЬ кислотой или .щелочью. Некоторое "расплетание" концов длинных спиралей в указанных вше "слабых" участках, а также деспирализация короткой Д-спирали (<-2 витка), которая во многих глобинах отсутствует, может обеспечить то уменьшение оС-спиральности на ~7 витков, которое наблюдается по данным КД.

Увеличенная динамика N -конца ало-МЬ, позволяющая Трп А5 контактировать с внешним тушителем,и возможность динамического контакта между Трп AI2 и Гис SHI свидетельствуют о том, что "солевые мостики", по крайней мере, важнейшие, стабилизирущие расположение А-спирали относительно спирали Н и участка GH (см.выше), разрушены. Таким образом, низкая стабильность апо-МЬ к денатурации объясняется не только тем, что он имеет гораздо меньшее гидрофобное ядро и больше неполярных остатков, экопонированных на воду, но также и тем, что вклад электростатических взаимодействий в поддержание белковой конформации.у него существенно меньше, чем вхолобелке. Об этом же свидетельствует отсутствие в ало-МЬ конформационного перехода при рН > 9,5.

Комллексирование апо-МЬ с протопорфирином практически полностью восстанавливает оС-спиральность, характерную для МЬ [Бреслоу Е., Келер Р., 1965], и стабилизирующие структуру ионные связи [5l]. Однако по динамическим свойствам гемовой полости и N-конца молекулы эти структуры-различаются. Включение Ге в ШПХ и дополнительная связь его с Гис Г8 в холо-МЬ не только существенно стабилизируют структуру (в том числе к свету), но и обеспечивает большую кооперативность конформационных переходов.

Выявленная на уровне третичной структуры корреляция между конформациями гемовой полости л N -концевой области очень важна, так как сС-аминогруппы оС. и jb -цепей в НЬ принимают активное участие в механизмах регуляции сродства к лиганду [Шаронов Ю.А., Шаронова H.A., 1975]. То, что эта связь обнаруживается во всех исследованных структурах, является, по-видимому, следствием общего для глобинов "миоглобинового" типа пространственной организации полипептидной цепи.

3. Лиганд- и рН-индуцированные изменения в леггемоглобине

люпина. Изучение методом спин-метки

С помощью спиновых меток ранее были изучены рН-индуцирован-ные конформационные изменения в аквамет и цианидных производных ферри-МЬ кашалота и мономерного НЬ хиронощгса (НЬ СТТ) [Артих

Р.И., Канд.дисс., 197б], Спин-метка в зь-,(Гис АЮ)-МЬ, SL, (Гис Е5)-НЬ СТТ и Slj (Гис GI9)-Hb СТТ все в- "дистальной области испытывала изменение подвижности при рН>9 аналогично тому, что наблюдается по флуоресценции Трп, и значения рК перехода также отличались для высокоспинового мет и низкоспинового цианидного комплекса. Напротив, подвижность спин-метки в "проксимальной" области и на С-конце структуры в sl2 (Тир G4)-Mb и sb2(Tnp НСЗ)-МЬ в интервале pH 6-12 оставалось постоянной [Артюк Р.И. и др., 1979].'

Мономерный леггемоглобин (легоглобин) встречается вюрне-вых клубеньках бобовых растений и является наиболее древним представителем глобинового семейства. Функцией его является обеспечение анаэробных условий для процесса азотфиксации. Видимо, поэтому он имеет самое высокое среди глобинов сродство к о^ и, кроме того, обладает уникальной способностью связывать алифатические, кислоты от уксусной до валериановой и никотиновую кислоту [элфолк Н., I96l]. Структура ЬЬ люпина определена с разрешением 0,2 нм [арутюкян Э.Г., 1983]. Она гомологична структуре МЬ, но

имеются и отличия, состоящие прежде всего в больших размерах гемовой полости. Этот глобин представляет особый интерес для проверки правильности григгерного механизма Перутца, так как , в отличие от НЬ и МЬ, при связывании низкоспиновых лигандов, цианида, азида и нлкотината, атом Ре остается в плоскости тема (либо немкого смещается в дистальную сторону) и ориентация проксимального Гис относительно этой плоскости не изменяется [Арутюнян Э.Г. и др., 1980; Куранова И.П. и др., 1982].

Имидазолидная спин-метка 31 2 бшга избирально присоединена к одному из двух тиро-зинов, тир 72 (Е16), 0Н--группа которого ориентирована в направлении остатков А9--А13 спирали А (рис.32). Кольцо этого Тир взаимодействует с ароматической системой Трп 15 (А12). Второй тирозин 1Ь люпина, Тир 132 (Н 12) локализован в гемовой полости и недоступен химическим реагентам [зо].

Спектры ЭПР аквамет, ацетатного, цианидного, азидного и никотинового комплексов эь (тир Е16)-ферри-1Ь аналогичны приведенным выше спектрам ЭПР цитохрома С (ряс.21), указывая на слабую иммобилизацию спин-метки. В табл.8 приведены рассчитанные из спектров ЭПР значения метки в указанных производных и значения рК конформа-ционного перехода, регистрируемого го изменению подвижности метки в интервале рН 6-13.

Типичные кривые ЭПР-титрования высокоспинового мет-1Ь и низкоспинового циан-ьь приведены на рис.33. Во всех случаях интервал перехода соответствует 3-3,5 ед.рН, что отвечает ионизации одной группы. Регистрируемое меткой изменение локальной #он~ формации в 1Ь предшествует его щелочной денатурации, которая в мет-1Ь наступает при рН > 11,6, а в остальных производных -при рН > 12 [31,39}. Изменение конформации в "дистальной" части ЪЪ аналогично тому, что наблвдали в МЬ с помощью триптофановой флуоресценции, а также в МЬ и НЬ хирономуса с помощью спиновых

Рис.32 Пространственная структура 1Ь желтого люпина с разрешением 0,2 нм и локализация Тир 72 (EI6) и Тир 132 (HI2)

Таблица 8

Подвижность спин-метки в лигандннх производных спин-меченого ферри-1Ь (0,1 М KCl, трис-фосфат, 1:1, pH 7,5) и значения рК перехода

Лйганд ТсСнс) рК перехода

Н20 1,03*0,07 10,5

ацетат 1,20*0,07 11,0

цианид 1,32*0,07 10,5

азид 1,30*0,07 11,0

никотинат I,35*0,07 10,5

Рис.33 Влияние рН на подвижность спин-ыегки в спин-меченом мет-£Ъ (а) и циан-1Ь (б). 0,12 М КС1--трис-фосфат

меток [.?],

"Солевые мостики" на к--конце 1Ь отсутствуют, но сохраняется инвариантная ионная связь Глу А14 - Лиз СИЗ, аналогичная Лиз А14-Асн СН4, стабилизируицая конформацию А-СН-область (в 1Ъ положительно и отрицательно заряженные остатки меняются местами). Переход вызван, наиболее вероятно, депротониро-ваниеиЛиз СНЗ и разрывом указанного "солевого мостика", что приводит к реориентации А-спирали относительно участка 6Н или АЕ- и СН-спиральных комплексов относительно друг друга. По данным Щ, изменения оС-спирального содержа-

ния ЕЬ в интервале рН 9-12 не происходит [Атанасов Б.П., 1иэ-невская Г.Я., 1975]. Поскольку из 12 остатков Лиз шесть образуют подобные солевые связи, разрыв этих "слепок" при рН>9 должнц способствовать частичной дестабилизации 1Ъ и облегчать последующую денатурацию и деспирализацию молекулы.

В низкоспиновых комплексах ХЬ спиновая метка заторможена в 1,3 раза сильнее, чем в мег-Н>, а высокоспиновый ацегат-1Ь

занимает по f промежуточное положение (Табл.8). Значения рК предденатурационного перехода дои разных лигандных 1Ь различаются, но никакой корреляции со спиновым состоянием Ре в комплексах не наблюдается. Значение специфических взаимодействий' между 6-ым лигандом и группами белка в гемовой полости для кон-формации "дистальной" области структуры в ЕЬ выражено более отчетливо, чём в МЬ. Из полученных.данных следует, что лиганд-ин-дуцированное изменение конформации 1Ь должно происходить в той же области контактов между АЕ и GH-спиральными комплексами, что в МЬ и НЬ СТТ.

4. Изучение спинового равновесия и анизотропии гемового окружения в модифицированном по с^-аминогруппе мет-МЬ кашалота

Изменения электронного и лигандного состояния гемового комплекса, таким образом, сопровождается определенным изменением конформации "дистальной" области и IT-конца МЬ-ой структуры, в поддержании которой, как отмечалось, большую роль играют электростатические взаимодействия. В этих взаимодействиях,'по-видимому, принимают участие и заряд ^-концевой о^-аминогруппы (рК 7,2-7,8). Ее положение в пространственной структуре № не удается точно фиксировать [такано Т-., 1977], однако, тот эффект, который оказывает ацилироваше этой группы на флуоресценцию № и апоЧЛ), а также на подвижность спин-метки, присоединенной к Гис-AI0 [дртнх Р.И. и др., 1977-, 1979] , свидетельствует в пользу такого заключения. Чтобы выяснить, влияет ли в свою очередь нарушение ионных взаимодействий на ¡т-«онце МЬ на гемовое окружение, изучали поглощение и круговой дихроизм МИТЦ-мет-МЬ и §ИТЦ--иет-МЬ в спектральном диапазоне 200-700 нм [l7,I9j.

Спектрофотометрическое титрование в полосе Соре (рис.34) свидетельствует о том, что равновесие 'высоко- и низкоспинового изомеров аквакомплекса сдвигается в результате модификации в сторону низкоспинового изомера (дая <ШТЦ-мет-МЪ на -—10/»), так что значения рК перехода мет-гидрокси (указаны стрелками) в модифицированных белках на 0,4-0,6 ед.рН ниже, чем в интактном мет-МЬ. Это проявляется и в спектрах поглощения в видимой области при 580 нм, указывая на такое изменение конформации или (и) динамики гемовой полости, при котором ионизация лигандно-связан-ной молекулы HgO облегчается. Следует отметить, что для дезокси--производных спектры интактного и модифицированных МЬ при pH 6-II полностью совпадают.

Круговой дихроизм МЬ, МИТЦ-МЬ и ФИТЦ-МЬ в дальней и ближ-

Рис.34 Изменение с рН поглощения в полосе Соре нативного мет-МЬ (кривая I), ФИТЦ-мет-МЬ (кривая 2) и ШТЦ-мег-МЬ (кривая 0.01 М фосфат-трис-НС1, 1:1; У-относитель-ное изменение оптической плотности

ней Уф-области совпадает; сС-спиральность во всех производных составляет 77 ±1% Iii]. Спектры КД в области Соре показаны на рис.35. Видно, что для мег-форм эллиптичность модифицированных белков в максимуме эффекта на ^ 20$ меньше, чем интактного МЬ, а для де-зоксипроизводных спектры КД совпадают (кривые 4-6). Индуцированный эффект Коттона в полосе Соре возникает из-за асимметрии белкового окружения гемовой группы и обусловлен, главным образом, взаимодействием между электронными переходами гема (В--переходы) и разрешенными зт-переходаш ближайших ароматических остатков [хсу М.-С Буди Р.В., 1971]. Вклады последних сильно зависят от расстояния и ориентации отнс сительно плоскости гема, гак что спектр КД очень чувстви-

Шен к изменению конформащ ювого окружения. Уменьшение эллиптичности npi:

405 нм в случае МИТЦ-мет-МЬ и ФИТЦ-мет-МЬ, как показано £17], обязано, скорее всего, измененной ориентации дис-тального Гис Е7 и Фен СД1, СД4 и BI4, входящих в состаЕ гидрофобного кластера на "дистальной" стороне гема. Таким образом, нарушение ионных взаимодействий и конформации на

н -конце структуры приводит к изменению конформации гемового окружения. Поскольку эффект регистрируете я трлько в кетМЬ^де лигащ носвязанная молекула Н^О образует с Гис Е7 водородную связь, и о:

[eldO-Siasknl

aecimote

к(пт)

Рис.35 Спектры КД в области Соре нативного мет-МЬ (кривая I), МИТЦ-мет-МЬ и ФИТЦ-мет-МЬ (кривые 2 и 3); 4-6 - спектры соотвегст-вугадих дезоксипроизводных

сутствует в безлигантном МЬ(2), сопряжение между "активным центром" и n -концом структуры реализуется, по-видимому, через взаимодействие 6-го лиганда с "дистальной" частью гемовой полости.

Структурной основой прямой и обратной связи между гемовой полостью и н -концом структуры могло бы быть уже обсуждавшееся синхронное смещение спирального комплекса АЕ как целого относительно 6Н, которое в одном случае индуцируется изменением позиции дистального Гис Е7 и соседних с ним остатков Е-спирали при связывании лиганда, а в другом - нарушением ионных взаимодействий на к-конце и смещением А-спирали. Рентгеносгруктурные и ЯМР--данные не противоречат такой интерпретации лиганд- и рН-индуци-рованных конформационных изменений в глобинах [Бретчер Р.А., Такано Т., 1977; Филлипс С.Е., 1980}. Более того, компьютерный анализ высокоразрешенных структур схГ-спиральных белков - НЬ, инсулина и цитрат-синтетазы [чотия С., Леек A.M.,. 1985] позволяет идентифицировать относительные перемещения плотно упакованных оС -спиралей как новый тип конформационных движений в белках, позволяющий передавать локальный конформацдонный эффект на большие расстояния.

5. Функционирование гемоглобина. Роль дистальных эффектов.

Четвертичная структура НЬ(2) стабилизировала, по сравнению со структурой НЬ02, шестью дополнительными межцепными солевыми

мостиками, четыре из которых образованы С- и N-концевыми группами оС- цепей, в образовании еще двух участвуют с-концы ^-цепей, а их н-концы сближены и формируют участок для связывания аллостерического регулятора - ДФГ. Решающим условием для разрыва этих мостиков при -Т-К-переходе является изменение ориентации "пенулярного" Тир НС2, аналогично Тир НСЗ в МЬ (рис.23), что согласно Перутцу обеспечивает сопряжение между конформационными изменениями на уровне третичной и четвертичной структур. В мономерном миоглобине по данным рентгеноструктурного анализа этого не происходит. Как отмечалось, спин-метки также не регистрируют в С-концевой области каких-либо рН- и лиганд-индуцированных конформационных изменений. Как показывают квангово-химические расчеты [Джелин Б.Р. и др., 1983], изменений в проксимальной области субъединицы НЬ, индуцированных лигандом, также недостаточно, чтобы вытеснить Тир НС2 из пространства между спиралями Р и Н. В то же время исследованные в данной работе конформационные изменения в N-концевой области мономерных глобинов должны иметь место и в субъединицах НЬ, так как структура и локализованные

здесь солевые мостики в них строго инвариантны.

Можно поэтому уверенно полагать, что разрыв межсубъединичных ионных связей и изменение четвертичной структуры НЪ при Т-Е-пере-ходе должны быть результатом согласованных изменений в третичной структуре субъединиц как в проксимальной, так и в дистальной области, на С- и, в особенности, на к-концах. Масштаб конформа-ционных изменений в мономере мал, и смещения атомов не превышают, как правило, 0,1 нм. Благодаря особой конструкции НЬ, где к-конец одной цепи субъединицы контактирует с с-концом другой (в ~ взаим°Дейс:гвия)» тетрамер выполняет роль усилителя слабого конформационного сигнала. В результате, смещения атомов в НЬ021 по сравнению с НЬ(2), достигают 0,6-0,8 нм, субъеданицы сдвигаются относительно друг друта на ~ 0,2 нм и поворачиваются на ~ 13,5° (в области о^ у32 контактов). Изменение сродства к лиханду (кооперативность НЬ) реализуется только на уровне тет-рамера, тогда как изменений на уровне третичной структуры в изолированном мономере для этого, очевидно, недостаточно.

5*7

ВЫВОДЫ

1. Проведено систематическое изучение влияния рН и ионной силы на скорость окпслитольно-восстаковятельнсй реакция между ферропроязнодными киоглсбика (донор электрона) и феррицито-хромог< с^кцептор) для интактных л химически модифицированных белков.

2. Показано, что перенос электрона реализуется не при любом соударении МЬ и СуЬ с, но при контакте определенных участков поверхности, "активных мест", которые идентифицированы и определена их пространственная структура.

3. Найдено, что решазещую роль б образовании электрсн-переносяще-го кс:ртлекса играет комплементарные электростатические взаимодействуя ме;:-;чу зарякешшкп группам! !П> л Суъ С, локализованные в контактных участках, но не общие (суммарные) заряды молекул. Зкразшровапяе локальных зарядов протявояонаг/д и нарушение зарядоЕой структуры "активного места" сильно снижают скорость переноса злзктрона.

4. Исследована роль экспонированных л внутренних остатков гисти-дика гглоглоСина в механизме реакция. С помощью сравнительного изучения шоглобина кашалота л свинья, отличающихся аминокислотным 'составом п структурой контактной поверхности, показана роль стерпчесдих факторов в иеханизмз переноса электрона.

5. Определена зозкоглая структура электрон-переносящего комплекса в системе МЬ- Cyt С. Найдено, что гемовые группы обоих белков в комплексе ориентированы кошганарно я отстоят друг от друга на расстояние ^2,9 нм (дистанционный перенос электрона).

6» Методом спин-штке изучены кснфорыациояше изменения з суъ С л растительном глобине- леггеыоглобкне, индуцированные изменением электронного и лпгавдного состояния гека и рН среды. Показано, что феррл- ферро-переход не приводит к заметному изменению информации белка, тогда как замена аксиального ля-ганда сопровоадается изменением конформации соответствующей области структуры. В натявной области рН обнаружен новый кон-

формер ферри- Суъ С.

7. С помощью тряптофадовой и порфириновой флуоресценции изучены лиганд- и рН-индуцированные конформационнне изменения в апо-МЬ,

комплексе апо-МЬ с иропорфирином IX и в ферри- и ферромиогло-бинах.

8. Показано сходство между этими молекулами, обусловленное общим типом укладки полипептидной цепи, и определены в структурных и динамических терминах различия между ними. Показана роль пор-фиринового макроцикла и атома Ге тема в формировании нативной МЬ-подобкой структуры, обеспечении ее стабильности и кооперативных свойств.

9.. Во всех МЪ-подобных структурах обнаружена связь между конфор-мационным состоянием гемовой полости и N-концевой области молекулы, которая по-видимому, является характерным свойством пространственной структуры глобинового типа и имеет важное значение для регуляции функции.

10.Показано важное значение специфических электростатических взаимодействий, "солевых связей", для стабилизации нативной. структуры глобинового типа, в разных ллгандных производных ферри- и ферромиоглобина и легг емоглобкна, а также в безметальном аналоге МЬ-комплексе апо-МЬ с ГШХ - обнаружено изменение конформации при разрыве важных солевых связей в щелочной области рН, предшествущее денатурации. Найдено, что как при щелочной, гак и кислотной денатурации апо-МЬ, ПП1Х-апо-МЬ и холо-МЬ разрушается уникальная пространственная организация белковой молекулы, а вторичная структура входящих в ее состав спиралей и спиральных комплексов в значительной степени сохраняется.

11.В миоглобине и леггеноглобине обнаружены лиганд-индуцирован-ные конфориациошше изменения в и-концевой и примыкающей к

.И-концу области структуры, которые определяются, главным образом, химической природой лиганда и взаимодействиями его с группами белка в дастальной области, а не спиновым состоянием Ре гема.

12. Развита модель лиганд- и рН-индуцированных конформационных изменений в мономерных глобинах, согласующаяся0представлениями о белке как механо-хншческой конструкции. В развитие гипотезы Перутца предложена модель структурно-функциональных отношений в тетрамерном НЬ,связнвакщая изменения на.уровне третичной структуры с перестройской тетрамера при присоединении и отщеплении лигандов.

ОСНОВШЕ ПУБЛИКАЦИИ

1. Atanasov В.P., Ataullakhanov F.I., Pootnikova G.B. On the mechanism of the electron transfer from myoglobin to cytochrome С and it3 biochemical significance // Abstracts of IX FS5S Meeting. Budapest. - 1974. - P.491-492.

2. Постникова Г.Б., Атанасов Б.П., Краснопольская С.А., Сады-кое Ю.Х. Перенос электрона в системе Mb-Cyt С. Применение метода химической модификации для изучения механизма реакции // Тезисы докл. XI Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Алма-Ата. - 1975. -- С.73.

3" Постникова Г.Б., Артях Р.И., Атанасов Б.П., Волькенштейн М.В. Изучение конформационных свойств миоглобина кашалота, модифицированного спин-меткой, и его взаимодействия с цитохро-мом С // Тезисы III Всесоюзной конференции по конформашон-ным изменениям биополимеров в растворах. - Тбилиси. - 1975. -С.130.

4> Ataullakhanov P.I., Atanasov В.P., Postnikova G.B., Sadykov Yu.Kh. Study of electron transfer in haeir.oproteins. I. Determination of the rate constants of ferri-cyt С reduction by ferro-tlb derivatives // Studia biophysica. - 1976. - B.54, h.1. - 2.41-51.

5. Атанасов Б.П., Постникова Г.Б., Садыков Ю.Х., Волькенштейн M.B. Изучение переноса олоктрона в гемопротеинах.П. Зависимость скорости восстановления феррицитохрома С оксимиогло-бином от рЬГЦ Молекулярная биология. - 1977. - Т.II, №3. -С.537-544.

6. Давыдов P.M., Куприн С.П., Фель Н.С., Постникова Г.Б., Блго-менфельд Л.А. Исследование реакционной способности конформа-ционнэ-неравновесных состояний ¡¿еталлопротеинов методом импульсного радиолиза // ДАН СССР, сер. биофизика. - 1977. -Т.235, М. - С.950-952.

7. Волькенштейн М.В., Атанасов Б.П., Постникова Г.Б., Артюх Р.И. Изучение электронных и конформационных свойств гемеодержа-щих белков // В сб."Молекулярная и клеточная биофизика1'.

М.: Изд-во "Наука". - 1977. - С.21-30.

8. Табагуа И.И., Сибельдина Л.А., Постникова Г.Б., Горбунова Н.П., Атанасов Б.П. Исследование транспорта электронов в цитохроме С методом ИМР-спектроскопии //Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Магнитны:; резонанс в биологии и медицине". Москва. - 1977. - С.51-52.

9. Постникова Г.Б., Атанасов Б.П., Волькенштейн М.В. Влияние ионной силы на скорость переноса электрона в системе окси-миоглобин - феррвдитохром С // Тезисы докл. 3-ей Всесоюзной конференции по сшстроскопии биополимеров. Харьков. - 1977. -

10. Ливанова Г.И., Постникова Г.Б., Атанасов Б.П. Восстановление леггемоглобина из корневых клубеньков келтого люпина цито-хромом С // Тезисы докл. Всесоюзной конференции по химии и геохимии порфиринов. Душанбе. - 1977. - С.30-31.

11. Постникова Г.Б., Юыакова Е.М., Артюх Р.И. Химическая кодификация миоглобина иэотиоци&натнши реагентами // Тезисы докл. 1У Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидов. Минск.

- 1977. - С.23.

12. Постникова Г.Б., Горбунова Н.П., Сухоыудренко А.Г. Химическая модификация феррицитохрома С спиновой меткой И -(2,2',5,5-тетраметил-3-карбоксипирролин-1-оксил)-1пашазолом // Молекулярная биология. - 1978. - Т.12, №5. - С.1112-1121.

13. Постникова Г. Б, Применение метода хишчзской модификации для исследования структурных и функциональных: свойств геыбелког // Материалы ИГ Всесоюзной конференции "Механизмы регуляции в системе крови". Красноярск. - 1978. - С.122-123.

14* Postnikova U.B. , Gorbunova Ii.P. , Artyükh H.I. Spin-latelled derivatives of ferricytochrome C. Study of conformational properties and electron transfer in ths reaction with HbO„ // Proc. of SI Symp. IUPAC on chesiatry of natural products. Varaa (Bulgaria). - 1S78. - V.1. - P.87-91.

15« Postnikova G.B., Artyukh R.I., Gorbunova K.P., Volkenstein M.V. ESR studies of conforaationel changes in cytochrcno С // in "Magnetic Resonance' and Related Phenomena"• BerlinHex delberg-iiew-rorki ed. Springer-Verlag. - 1979.-P.522-523.

16- Долгих Д.А., Денесюк А.И., Федоров Б.А., Постникова Г.Б.

Сравнение структур различных форм миоглобина каталога в паст-воро с помощью большеуглового рентгеновского рассеяния Г/ Биофизика. - 1980. - Т.25, №2. - С.223-227.

17« PostnLkova G.2., Yunaicova Е.М.? Sukhonuareako A.G-., Vollcen-stein U.V., Atanasov B.P. Absorption spectroscopy and CD studies of IIb (SV/) chemically modified on the Il-terainal GC-IJH2-group // Biophys.Chem. - 1980. - V.11, N1. - P.29-37«

18. Постникова Г.Б., Горбунова H.H., Баркова T.B., Сухокудронко А.Г. Изучение конформациошой стабильности цитохрома С // . Тез. докл. У Всесоюзного симпозиума по химии и физика белков и пептидов. Баку. - I960. - С.IIb.

19. Артюх Р.И., Атанасов Б.П., Погорелоьа В.Н., Постникова Г.Б. * Изучение конформацнонной подвижности С-концевой области спин-меченого М каналота, модифицированного кегилизоикщианатом по W-концевой об-аыиногруппе // Там ке. С.43.

20. Постникова Г.Б., Шляпникова Е.А., Волькенитейн М.В.. Атанасов Б.П. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. У1. Зависимость скорости восстановления феррицитохроыа С окскшогяоби-ном от ионной силы раствора // Молекулярная биология. - 1981.

- Т. 15, №3. - С.526--537.

21. Котельникэв А.И., Фогель В.Р., Лихтенштейн Г.И., Шляпникова Е.А., Постникова Г.Б. Использование явления обменной дезактивации триплетных возбужденных состояний для исследования строения и электронной проводимости белков // Молекулярная биология. - 1981. - Т.15; №2. - С.281-289.

22. Постникова Г.Б., Шляпникова Е.А., Атанасов Б.П., Волькенштейн М.В. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. УН. Влияние ионной силы на скорость восстановления ферри-Су С химически модифицированными по остаткам гистидина производными оксимиоглобина // Молекулярная биология. -1982. -Т.16, » I. -C.I04-II5.

23. Постникова Г.Б., Атанасов Б.П., Волькенштейн М.В. Изучение механизма переноса электрона между оксишоглобином и ферри-цитох^оном С Материалы IВ сэсожзн. биофизического съезда.

24. Постникова Г.Б., Атанасов Б.П., Волькенштейн М.В. Конфоша-ционныэ переходы в мономерных глобинах // Там же. -С.30.

25. Postnikova G.В. , Gorïunova N. P. , Volkenstein M,V. Spin-label study of conformational changea in cytochrome С // Biophysical Chemiatxy. -1983. -V.17, N1. -P. 193-202.

26. Постникова Г.Б., Горбунова Н.П., Атанасов Б.П. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. УШ.Влияние химической модификации цятохроиа С на скорость восстановления его окишиогло бином Г/ Молекулярная биология. -1984. -T.I8, 1)1. -С.234-243.

27. Постникова Г.Б., Целикова С.Г., Сухомудренко А.Г. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. Влияние ионов цинка на скорость реакции в системе оксиыиоглобин - феррицитохром С // Тезисы У Всесоюзн. конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков. -1984. -€.182-183.

28. Постникова Г.Б,, Юмакова Е.М., Векшн Н.Л. Изучение рН-инду-цироБанных кокфортационных изменений в МЬ кашалота, ало-МЬ

и его комплексе с протопорфирином IX методом люминесценции // Там зе. -С.277-278.

29. Котельников А.И., Фогель В.Р., Лихтенштейн Г.И., Постникова Г.В. Об интерпретации эфректа релаксационного сдвига спектров люминесценции хромофоров в белках и модельных сис-ггмах^/^^рнал прикладной спектроскопии. -1984. -T.XI,

Ю. Постникова Г.З., Юмакова Е.М., Яковлева Е.С. Спин-меченый лзггемоглобин из корневых клубеньков келтого люпина. Получение и свойства //Молекулярная биология. -1985. -Т.19, В 5. -C.I278-I286.

Я. Poatnikova G.B., Yirnakova Е.М., Yakovleva S.S. Spin-label study of conformational changes induced by pH and Uganda in leghaemoglohin froia yellow lupine root nodules // European J. Biochemistry«-1985, - V.149. H 1. -P.53-58.

!2. Постникова Г.Б., Юмакова E.M., Яковлева Е.С. Конформационные изменения в лапина, индушроваиные изменением рН среда и лигаадного состояния гема // Материалы Международного симпозиума по физико-хныич.св-ваы биополимеров в растворах. Пущи-но. -1985: -С.73-74.

33. Постникова Г.Б., Юмакова Е.М., Яковлева Е.С. Изучение конфор мационвдх изменений люпина методом спиновых меток // Тезис: У1 Всесоюзн, конференции по конформационным изменениям биополимеров в растворах. Тбилиси. -1985. -С.54.

34. Постникова Г.Б. Изучение роли белковой структуры в переносе электрона между шюглобином и цитохромом С //Материалы 1-ой Всесоюзной конференции по переносу электрона в биосистемах. Вильнюс. -1985. -С.5.

35. Постникова Г.Б., Деликова C.B. Изучение кинетики переноса эл электрона от оксимиоглобина к феррицитохрому С в присутствии ионов цинка // Там же. -С.6.

36. Постникова Г.Б. Изучение механизма переноса электрона между ферропроизводными миоглобина и феррицитохромом С (обзор) /7 Биофизика. -1986. -T.3I, №1. -CTÏ5S-IS5.

37. Постникова Г.Б., Юмакова Е.М., Векшн Н.Л. рН-зависимые изме нения гриптофановой и порфириновой флуоресценции в комплексе апомиоглобина кашалота с протопорфирином IX и в мэтмиоглоби-не И Биохимия. -1986. -T.5I, »2.-С.313-320.

38. Гульбинас В., Кабелка В., Постникова Г.Б., Савицкене.Ж. Исследование пикосекундных процессов фотодиссоциации карбо-ксилеггемоглобина // ДАН СССР. Сер. биофизика. -1987.

-Т.297, №3. -С.721-724.

39. Постникова Г.Б., Юмакова Е.М., Яковлева Е.С. Изучение кон-формациоНных свойств леггемоглобина люпина методом спиновых меток // Биофизика. -1987. -Т.32, ÍÍ3. -С.388-393.

40. Постникова Г.Б., Цэликова C.B. Изучение переноса электрона i гешпротеинах. IX. Влияние ионов цинка на скорость окислена °Т°21 ^ ' ' ','оле10'ляРная биология. -1987.

41. Постникова Г.Б. Перенос электрона между гемсодеркащими белк! выми молекулами. Роль гистидинов в механизме переноса злеет рона от миоглобина к цитохрому С // Материалы Всесоюзн. сов щания "Мех-м электронного переноса в белковых системах и их моделях". Киев. -1987. -C.I.

42. Постникова Г.Б., Целикова C.B. Изучение роли Гистидина в ме те "активного контакта" миоглобина свиньи при переносе элек рона к цитохрому С // Тез. докл. УТ Всесоюзн. конференции п спектроскопии биополимеров, ларьков. -1988. -С.246-247.

43. Поогнинова Г.Б. Дистанционный перенос электрона в системе ыиоглобин-цитохром С // Материалы 2-го Всесоюзн. совещания "Мех-ы электронного переноса в белковых системах и их моделях". Казань. -1989. -С.2.

44. Postnikova G.B» The role of electrostatic interactions and histadine residues in the electron transfer

from myoglobin to cytochrome С // Abstr. of the 2nd Conference "Molecular electronics and Mocomputers". Moscow. -1989. -Ï.103.

45. Постникова Г.Б., Юмакова Е.М.', Комаров Ю.Е. Изучение рН-

индуцированных конформационных изменений апо-МЬ кашалота методом флуоресценции. Г. Хар-ка флуоресцентных свойств и рН-зависимого поведения калдого из двух остатков триптофана' // Молекулярная биология. -1990. -Т.24, №3. -С.757-767.

46. Постникова Г.Б., Комаров D.E. Изучение рН-индуциро ванных конформационных изменений в апо-МЬ кашалота методом Флуоресценции. II. Механизм тушения в нейтральной области рЯ, идентификация тушащих групп белка и конформационные св-ва ало-МЬ

// Молекулярная биология. -1990. -Т:24, №4. -С.940-952.

47. Постникова Г.Б., Комаров Ю.Е., ^макова Е.М. Изучение рН- и лиганд- индуцированных конформ. изменений в ферро- и ферри-производных МЬ методом флуоресценции // Молекулярная биология. -1990. -Т.24, fife. -G.I32I-I33I.

18. Postnikova G.B. Distant electron, transfer in proteins. The role of electrostatic interact-iona and histidines in the 'electron transfer from Hb to Cyt С // Abst. ¿>£ V Biophysical Congress, Vancouver (Canada) -1990.- F. 117?;

19. Postnikova g.b., Komarov yu«e., Yumaltova k.h. Fluorescence study of the conformational properties of myoglobin structure. I.pH-dependent changJa if Trp fluorescence

in intact and chemically modified apomyoglobins // Eur.J.Biochem. -1991. -V.198, 111. -P.223-232.

50. Postnikova G.B., Komarov Yu.E., Yumakova E.M. Fluorescence study of conf. properties of Mb structure. II. pH- and ligand- induced conformational changes in ferric and ferrous myoglobins // Ibid., P.233-239.

51. Postnikova G.B., Yumakova E.M. Fluorescence study of........

III. pH- dependent changes in porphyrin and tryptophan fluorescence of the Complex of apo-Mb with protoporphyrin IX; the role of porphyrin macrocycle and iron in formation of .the Mb structure // Ibid., £.241-246.

52. Постникова Г.Б., Целикова С.В. Изучение роли промежуточных групп белка в переносе электрона между МЬ и Cyt С // Тез. докл. УН Всесоюзн. конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков. -1991. -С.191-192.

53. Постникова Г.Б., Комаров Ю.Е. Разделение вкладов остатков Трп в рН-зависимую флуоресценцию апо-МЬ с помощью химической модификации // Там же, С.192-Г93.

54. Postnikova G0B. Distant electron transfer in the myoglobin -cytochrome С redox system // In: "Molecular electronics", Klrnier A.cade Publ„, iletherlands. Top. M61.0rean. Ещг,- Y.7, -1991. -P.87-93. /Обзор/.

55. Постникова Г.Б., Целикова С.В., Сивожелезов B.C. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. X. Влияние рН, ионной силы и ионов цинка на скорость восстановления феррицитохрома С оксимиоглобином из сердца свиньи // Молекулярная биология. -1992. - Т;2б," $4'.-С »880-880'.

Информация о работе

Постникова, Галина Борисовна
доктора биологических наук
Пущино, 1992
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Перенос электрона и конформационные превращения в гемсодержащих белках ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Перенос электрона и конформационные превращения в гемсодержащих белках"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Перенос электрона и конформационные превращения в гемсодержащих белках
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика