Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Миоглобин как восстановительный реагент в биологических системах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Моисеева, Светлана Анатольевна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Окислительно-восстановительные реакции гемсодержащих белков с ионами и комплексами металлов 2.1.1. Редокс-реакции гемсодержащих белков с комплексами железа а) Цитохром С б) Белки - переносчики кислорода 15 2.1.2. Окисление гемсодержащих белков ионами и комплексами двухвалентной меди а) Цитохром С б) Белки - переносчики кислорода 25 2.2. Белок-белковый перенос электрона-в реакциях миоглобина и гемоглобина с другими гемсодёрж^щимй белками

2.2.1. Взаимодействие гемоглобина с цитохромом С

2.2.2. Взаимодействие миоглобина с цитохромом С

2.2.3. Взаимодействие миоглобина и гемоглобина с цитохромом Ь

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Получение интактных и химически модифицированных белков

3.2. Кинетические измерения

3.3. Выделение и инкубация митохондрий

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Окисление оксимиоглобина кашалота, катализируемое ионами 47 ферроцианида

4.2. Механизм окисления оксимиоглобина ионами меди: сравнение 58 миоглобинов кашалота, лошади и свиньи

4.3. Каталитический эффект феррицианида на скорость переноса 68 электрона между миоглобином и цитохромом С

4.4. Влияние митохондрий на окисление миоглобина цитохромом С

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Миоглобин как восстановительный реагент в биологических системах"

Миоглобин - один из белков-переносчиков кислорода семейства глобинов, осуществляющий снабжение кислородом мышечных клеток и обеспечивающий таким образом возможность протекания в них окислительных процессов. Широкая распространенность Mb, доступные методы выделения и возможность получения в больших количествах, а также определение пространственной структуры сделали его популярным объектом для изучения и демонстрации молекулярных механизмов функционирования гемсодержащих белков. В настоящее время накоплен огромный материал о структуре, физико-химических и функциональных свойствах этого белка.

Поддержание восстановленного состояния гемового комплекса в Mb и НЬ очень важно для их функционирования, так как окисленные формы белков не способны связывать кислород. Кроме того, окисление Fe гема является первой стадией денатурации Mb и НЬ, так как сродство глобина к окисленному ферригему существенно меньше, чем к восстановленному. В то же время известно, что в аэробной среде окси-Mb и окси-Hb способны самопроизвольно окисляться, особенно быстро при кислых рН (автоокисление), образуя физиологически неактивные ферри-формы этих белков - мет-Mb и мет-Hb [Brantley и др., 1993]. Ферро- и феррипроизводные Mb и НЬ легко вступают также в окислительно-восстановительные реакции с солями и комплексами различных металлов. Наибольший интерес представляют редокс-реакции Mb с соединениями железа и меди, так как эти металлы участвуют во многих метаболических процессах в организме. Железо входит в состав простетических гемовых групп, которые содержатся в целом ряде важнейших ферментов - каталазе и пероксидазе, цитохроме Р-450, цитохромоксидазе, митохондриальных белках - переносчиках электронов, цитохроме С и других цитохромах. Кроме того, железо является составной частью железо-серных кластеров ферментов, участвующих в процессах дыхания, азотфиксации и фотосинтеза в клетках животных, растений и бактерий. Медь также активно участвует в метаболизме, входя в состав активных центров таких ферментов как азурины, пластоцианины и различные оксидазы - о-дифенол-оксидаза, аскорбат-оксидаза, цитохромоксидаза и др. В целом ряде работ продемонстрирована существенная роль меди и железа в механизмах окислительного стресса.

Возможная роль Mb и Hb как восстановительных реагентов в биологических системах привлекает пристальное внимание исследователей [Hegetschweiler и др., 1987]. Показано, что в аэробных условиях эти белки способны активно восстанавливать комплекс Fe3+ с АТФ, и что трансмембранный транспорт ионов двухвалентного железа коррелирует с восстановлением Fe3+ гемоглобином в эритроцитах и ретикулоцитах [Eguchi и Saltman, 1984; Egyed и др., 1980].

В аэробных условиях переходные металлы, Си2+, Со3+ и Fe3+, в присутствии восстановителей способны претерпевать циклические редокс-превращения и служить центрами продукции активных форм кислорода. Поскольку Hb и Mb, присутствующие в клетках в очень больших количествах, являются хорошими восстановителями соединений этих металлов, они могут также принимать непосредственное участие в таких процессах, что было продемонстрировано на ряде модельных систем [Van Dyke и Saltman, 1996; Clopton и Saltman, 1997]. Функционирование Hb и Mb в качестве восстановителей может быть важным в связи с выявлением роли клеточных белков в поддержании редокс-потенциала клетки и преодолении окислительного стресса [Stadtman и Oliver, 1991].

Особый интерес для биологии представляет процесс превращения окси-Mb в окисленную мет-форму, катализируемый небольшими количествами ионов или комплексов двухвалентной меди [Христова, 1980 б; Rifkind, 1981]. В настоящее время этой реакции уделяется большое внимание, так как предполагается, что она играет существенную роль в повреждении миокарда при ишемии и последующей реперфузии [Gunther и др., 1999]. Вследствие ацидоза в ишемированной ткани депонированная и связанная с белками Си2+ освобождается [Berenshtein и др., 1997] и может вступать в реакцию с миоглобином, в результате чего образуется мет-Mb и восстановленная медь. Реокисление Си(1) кислородом приводит к образованию анион-радикала супероксида Ог" и перекиси водорода, которые оказывают повреждающее действие на ткань. Каталитическое окисление Mb медью, как полагают, является основным источником активных форм кислорода при ишемии и реперфузии миокарда.

Образующиеся окисленные мет-Mb и мет-Hb могут быть затем восстановлены с помощью низкомолекулярных клеточных восстановителей, диафораз, и специализированных NADH-зависимых ферментов - мет-НЬ-редуктазы эритроцитов (NADH-Cyt Ь5-редуктазы) и мышечной мет-МЬ-редуктазы. Компонентами мет-МЬ-редуктазной системы являются как Cyt bs, локализованный в мембранах саркоплазматического ретикулума, так и близко родственный ему Cyt b внешней мембраны митохондрий (ОМ cyt b) [Arihara и др., 1995].

In vitro окси- и дезокси-Mb способны окисляться митохондриальным ферри-Cyt С [Постникова, 1986; Postnikova и др., 1995]. Механизм этой реакции как модельной системы белок-белкового переноса электрона интенсивно изучался, поскольку структуры и физико-химические свойства этих белков наиболее хорошо исследованы [Takano, 1977; Takano и др., 1977]. Локализация Mb в клетке соответствует локализации митохондрий [Mitsui и др., 1993, 1994; Kunishige и др., 1996]. С помощью высокоспецифичных антител к Mb, конъюгированных с пероксидазой хрена, показано, что среди клеточных структур наиболее интенсивно окрашиваются внешние мембраны митохондрий и саркоплазматического ретикулума, и авторы не исключают непосредственной сорбции Mb на соответствующих мембранах [Kawai и др., 1987]. В норме Mb и Cyt С разделены внешней митохондриальной мембраной, непроницаемой для белков, однако не исключено, что при действии различных повреждающих факторов (гипоксия, яды и др.) целостность мембраны может нарушаться. При этом будут создаваться условия для окисления Mb митохондриальным Cyt С.

Таким образом, наряду со своей основной функцией - обратимым связыванием кислорода, миоглобин способен вступать в различные редокс-реакции в клетке, выступая большинстве случаев в качестве восстановительного реагента. Эта способность Mb может играть существенную роль в функционировании организма, однако работы, посвященные выяснению механизмов реакций Mb с различными редокс-реагентами, весьма немногочисленны, а содержащиеся в них выводы крайне противоречивы. В связи с этим актуальна задача изучения механизмов окислительно-восстановительных реакций Mb с соединениями металлов и различными клеточными белками, роли отдельных групп и структурных элементов белка в переносе заряда.

Цели и задачи работы Цель работы состояла в изучении механизма каталитического эффекта ферри- и ферроцианида калия и ионов меди на скорость окисления оксимиоглобина кашалота; в исследовании механизма каталитического эффекта феррицианида калия и митохондрий на перенос электрона между ферропроизводными миоглобина и феррицитохромом С. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние pH, ионной силы среды, концентрации [Fe(CN)6]4" и химической модификации остатков гистидина на скорость катализируемого 7 феррродианидом окисления окси-МЬ кашалота. Проанализировать кинетическую схему реакции, определить ее равновесные и кинетические параметры.

2. Исследовать влияние концентрации Си , рН и ионной силы среды, а также редокс-неактивных ионов

2п2+ на скорость окисления оксимиоглобинов кашалота, лошади и свиньи, отличающихся по количеству локализованных на поверхности остатков гистидина. Определить вклад разных гистидинов в связывание меди и в скорость реакции.

3. Изучить влияние на скорость переноса электрона в системе ферро-МЬ -феррицитохром С (в аэробных и анаэробных условиях) низкомолекулярного акцептора электрона - феррицианида калия. Исследовать зависимость скорости реакции между МЬ и С)! С в присутствии феррицианида от рН и ионной силы для интактных и химически модифицированных МЬ и Суг С. Локализовать место связывания аниона [Те(СК)б]3" в С}4 С и МЬ, определить структуру электрон-переносящего комплекса.

4. Исследовать влияние митохондрий на редокс-реакцию между окси-МЬ и ферри-Су1 С. Изучить действие детергентов, гипотонии и разобщителей дыхания на скорость реакции в присутствии митохондрий.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Моисеева, Светлана Анатольевна

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что высокопотенциальный комплекс железа -[Fe(CN)6]3~ / [Fe(CN)6]4" - может реагировать с окси-Mb одновременно по двум различным механизмам, простому внешнесферному через гемовую группу и посредством образования специфического комплекса [Fe(CN)6]4" с белком, катализируя его окисление. Проанализирована кинетическая схема реакции каталитического окисления и определены ее равновесные и кинетические параметры.

2. Показано, что основной вклад в образование специфического комплекса аниона ферроцианида с белком вносят электростатические взаимодействия. Комплексирование [Fe(CN)6]4" с миоглобином ускоряет реокисление данного аниона кислородом, чему способствует протонирование близко расположенного остатка Hisl 19.

3. Показано, что окисление окси-Mb, катализируемое Си2+, может происходить различными путями в зависимости от того, с какими остатками гистидина комплексирует реагент и какова прочность комплекса. Идентифицированы гистидины миоглобина, ответственные за быструю и медленную (каталитическую) фазу реакции. Ключевая роль в механизме катализа принадлежит протонированию Hisl 16, которое способствует реокислению восстановленной Си+, связанной с соседним Hisl 13.

4. Обнаружен каталитический эффект феррицианида на скорость белок-белкового переноса электрона в системе Mb - Cyt С. Показано, что связывание низкомолекулярного редокс-активного соединения в контактном участке Cyt С улучшает электростатические взаимодействия в тройном электрон-переносящем комплексе Mb-[Fe(CN)6]3"-Cyt С и, кроме того, почти вдвое уменьшает расстояние для туннелирования электрона между темами, что увеличивает скорость процесса.

5. Показано, что митохондрии ускоряют окисление оксимиоглобина феррицитохромом С. Реакция в присутствии митохондрий протекает при их непосредственном участии и скорость ее зависит от состояния внешней митохондриальной мембраны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Моисеева, Светлана Анатольевна, Пущино

1. Агуреев А.П., Мохова E.H. Окисление НАДН в митохондриях животных. В кн.: Реакции живых систем и состояние энергетического обмена. Пущино, 1979, 2751

2. Агуреев А.П., Алтухов Н.Д., Мохова E.H., Савельев И. А. Активация внешнего пути окисления NADH в митохондриях при снижении pH. Биохимия, 1981, 46, 19451956

3. Арутюнян Э.Г., Сафонова Т.Н., Обмолова Г.В., Тепляков A.B., Попов А.Н., Русаков A.A., Рубинский С.В., Куранова И.П., Вайнштейн Б.К. Кристаллическая структура оксилеггемоглобина при разрешении 1,7 Á. Биоорган, химия, 1990,16, 293-302

4. Атанасов Б.П., Постникова Г.Б., Садыков Ю.Х., Волькенштейн М.В. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. II. Зависимость скорости восстановления феррицитохрома С оксимиоглобином отрН. Молекуляр. биология, 1977,11, 537544

5. Атанасов Б.П., Косекова Г.П., Митовска М.И., Христова П.К., Данчева К.И.

6. Модифицированные пиридоксальфосфатом производные цитохрома С. Моно- и дизамещенные производные: характеристика и влияние на перенос электронов в обедненных цитохромом С митохондриях. Молекуляр. биология, 1980,14, 307315

7. Князева Т.А., Малюгин Э.Ф., Заринская С.А., Арчаков A.M. Солюбилизация цитохрома С в ишемированной печени. Вопр. мед. химии, 1975, 21, 481-484

8. Комаров Ю.Е., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. Применимость моделейэлектростатического взаимодействия молекул к описанию зависимости скорости реакции между миоглобином и цитохромом С от ионной силы. Биофизика, 1998, 43,16-25

9. Маринов Б.С. Фотовосстановление гемоглобина в эритроцитах. Молекуляр. биология, 1979,13, 111-117

10. Миронова Г.Д. Гистохимия миоглобина и цитохромоксидазы в филогенезе позвоночных при экспериментальном инфаркте миокарда и миокардите. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Алма-Ата, 1971

11. Панченков Г.М., Лебедев В.П. Химическая кинетика и катализ. М.: Химия, 1974, 345-351

12. Постникова Г.Б., Горбунова Н.П., Атанасов Б.П. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. VIII. Влияние химической модификации цитохрома С на скорость восстановления его оксимиоглобином. Молекуляр. биология, 1984,18, 234-243

13. Постникова Г.Б. Изучение механизма переноса электрона междуферропроизводными миоглобина и феррицитохромом С. Биофизика, 1986, 31, 163-185

14. Cusanovich M.A. Mechanisms of electron transfer by high-potential C-type cytochromes. In: Bioorganic Chemistry (van Tamelen E.E., ed.), New York: Academic Press, 1978, 4,117-146

15. Davison A.J. Kinetics of the copper-histidine catalysis of ferrocytochrome С oxidation. J. Biol. Chem., 1968, 243, 6064-6067

16. Davison A. J., Hamilton R.T. Stimulation of cytochrome C oxidation by a copper citratecomplex. Arch. Biochem. Biophys., 1968,126, 228-231 Dickerson R.E., Timkovich R. In: The enzymes (Boyer P.D., ed.), London: Academic

17. Press, 1975,11, 397-547 Dunn C.J., Rohlfs R.J., Fee J.A., Saltman P. Oxidation of deoxymyoglobin by Fe(CN)6.3".

18. Hodges H.L., Holwerda R.A., Gray H.B. Kinetic studies of the reduction ferricytochrome

19. Jameson R.F. Coordination chemistry of copper with regard to biological systems. In:

20. Mauk M.R., Mauk A.G. Interaction between cytochrome bs and human methemoglobin.

21. Mitsui T., Kawai H., Naruo T., Nishino H., Saito S. In situ hybridization of myoglobin mRNA: results on the skeletal muscles of normal subjects and patients with neuromuscular diseases. Acta Neuropathol., 1993, 86, 313-318

22. Can. J. Biochem., 1977, 55, 796-803 Polozov R.V., Dzhelyadin T.R., Sorokin A.A., Ivanova N.N., Sivozhelezov V.S.,

23. Chem. Soc., 1982,104, 841-845 Reid L.S., Gray H.B., Dalvit C., Wright P.E., Saltman P. Electron transfer from cytochrome bs to iron and copper complexes. Biochemistry, 1987, 26, 7102-7107

24. Rifkind J.M. Copper and the autoxidation of hemoglobin. Biochemistry, 1974,13, 24752481

25. CSAM-93, St. Petersburg, 1993,131 Stadtman E.R., Oliver C.N. Metal-catalyzed oxidation of proteins. J. Biol. Chem., 1991, 266, 2005-2008

26. Tomoda A., Tsuji A., Yoneyama Y. Mechanism of hemoglobin oxidation byferricytochrome C under aerobic and anaerobic conditions. J. Biol. Chem., 1980, 255, 7978-7983

27. Wu Ch.-Sh.C., Duffy P., Brown W.D. Interaction of myoglobin and cytochrome C.

28. Zabinski R.M., Tatti K., Czerlinski G.H. On the electron transfer reaction betweenferricytochrome C and ferrohexacyanide in the pH range 5 to 7. J. Biol. Chem., 1974, 249, 6125-6129

29. Zhang B.-J., Andrew C.R., Tomkinson N.P., Sykes A.G. Reactivity patterns for redox reactions of monomer forms of myoglobin, hemocyanin and hemerythrin. Biochim. Biophys. Acta, 1992 a, 1102, 245-252

30. Zhang B.-J., Smerdon S.J., Wilkinson A.J., Sykes A.G. Oxidation of residue 45 mutant forms of pig deoxymyoglobin with Fe(CN)6.3". J. Inorg. Biochem., 1992 6, 48, 79-84

31. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ1. ДИССЕРТАЦИИ

32. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

33. НЬ гемоглобин Mb - миоглобин Lb - леггемоглобин Дезокси-Hb - дезоксигемоглобин Дезокси-Mb - дезоксимиоглобин Мет-Hb - метгемоглобин Мет-МЬ - метмиоглобин НЬ02, окси-НЬ - оксигемоглобин МЬ02, окси-МЬ - оксимиоглобин Lb02, окси-Lb - оксилеггемоглобин

34. СМ-МЬ карбоксиметилированный по гистидинам миоглобин СА-МЬ - карбоксиамидированный по гистидинам миоглобин Cyt С - цитохром С

35. EDTA этилсндиамин-Ы,М,Ы\1Ч'-тетрауксусиая кислота

36. EGTA (этилендиокси)диэтилендинитрило-К,К,К',Н'-тетрауксусная кислота NTA - нитрилотриуксусная кислота

37. DTPA диэтилентриамин-Ы,Ы^\Ы^"Ы"-пентауксусная кислота

38. CDTA trans- 1,2-диаминоциклогексан-К,М,.ЧГ,]Ч'-тетрауксусная кислота1. TFA трифторадетил

39. TFC (трифторметил)фенилкарбамил1. TNP тринитрофенил1. CDNP карбоксидинитрофенилbipy 4,4'-бипиридинphen 1,10-фенантролинdmphen 2,9-диметил-1,10-фенантролин1. MITC метилизотиоцианат

40. FITC флуоресцеинизотиоцианат

41. NADH восстановленный никотинамидаденин-динуклеотид DNP - 2,4-динитрофенол

42. FCCP карбонилдицианид-п-трифторометоксифенилгидразон MOPS - 3 -(N-морфолиIio)npoi iaiгсул ьфоновая кислота