Каталитическое окисление миоглобина солями и комплексами меди и железа: кинетика и механизм

Шеховцова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Каталитическое окисление миоглобина солями и комплексами меди и железа: кинетика и механизм
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Каталитическое окисление миоглобина солями и комплексами меди и железа: кинетика и механизм"

На правах рукописи

Шеховцова Екатерина Александровна

КАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ МИОГЛОБИНА СОЛЯМИ И КОМПЛЕКСАМИ МЕДИ И ЖЕЛЕЗА: КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ

03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Пущине 2005

Работа выполнена в Путинском государственном университете на базе Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Постникова Г.Б.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Сабурова Е.А.

Кандидат биологических наук Масулис И.С.

Ведущая организация:

Институт фундаментальных проблем биологин РАН, г. Пущнно Зашита состоится " 9 " Ц К**^ 2005 г. в

час.

на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущине, ИБК РАН

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущине

Автореферат разослан _2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поддержание восстановленного состояния гемового комплекса в " МЬОг очень важно для его функционирования, так как окисленная мет-форма этого дыхательного белка не способна связывать кислород. Кроме того, окисление атома Fe гема является первой стадией денатурации миоглобина, так как сродство окисленного ферригема к глобину существенно меньше, чем восстановленного. В то же время в аэробной среде МЬОг способен самопроизвольно окисляться, особенно быстро при кислых рН, образуя мет-Mb (автоокисление). Показано также, что миоглобин легко вступает в окислительно-восстановительные реакции с солями и комплексами различных металлов, из которых наибольший интерес для биологии представляют соединения железа и меди. Увеличивающееся загрязнение окружающей среды ведет в настоящее время к росту концентрации тяжелыми металлов во всех живых организмах и становится реальной угрозой их существования. Функционирование миоглобина как восстановительного реагента в биологических системах привлекает пристальное внимание исследователей, так как может быть важным в связи с выявлением роли клеточных белков в поддержании редокс-потенциала клетки и преодолении окислительного стресса. Известно, что в аэробных условиях in vitro соединения переходных металлов, в особенности Си2+ и Fe3*, в присутствии восстановителей способны претерпевать циклические редокс-превращения и служить центрами продукции активных форм кислорода, 0{, НОг и перекиси водорода Н2О2 как конечного продукта их диспропорционирования. В настоящее время этой реакции уделяется большое внимание, так как весьма вероятно она игра&г существенную роль в повреждении миокарда при ишемии и последующей реперфузии. Таким образом, наряду со своей основной функцией - обратимым связыванием О2, миоглобин способен вступать в редокс-реакдии с различными мегаллокомплексами, выступая в большинстве случаев в качестве восстановительного реагента. Эта его способность может играть существенную роль в функционировании организма, однако работы, посвященные выяснению механизмов редокс-реакций миоглобина с различными металлореагентами, весьма немногочисленны, а их выводы противоречивы.

Особый интерес для биологии представляет процесс окисления дыхательных белков, катализируемый небольшими количествами ионов и комплексов металла. Следует отметить, что до последнего времени было известно только окисление НЪОг и МЮ2, катализируемое соединениями Cui+ с невысоким редокс-потенциалом (медный катализ). Соединения же других металлов с аналогичными потенциалами способны окислять белки только в избытке реагента. Считалось также, что эффективными катализаторами не могут

быть сильные окислители, так как восстановленные формЬ реагента должны

•j" ЧХА

^ С 1 . KfiyfT

яад-рк

реокисляться кислородом по термодинамическим соображениям, что необходимо для замыкания каталитического цикла. Ранее нами проведено сравнительное изучение кинетики катализируемого ионами Си2+ окисления изопотенциальных и структурно гомологичных МЬОг кашалота, лошади и свиньи, различающихся по количеству способных связывать медь остатков ги ста дина. Показано, что механизм реакции зависит от того, с какими гистидинами связывается катализатор и какова прочность комплекса. Кроме того, впервые обнаружено, что эффективным катализатором окисления МЪ02 кашалота является комплекс железа и сильный окислитель - феррицианид калия. Механизм катализа включает специфическое связывание аниона ферроцианида с миоглобином в районе Hisl 19, и связанный [Fe(CN)6]4' в отличие от аниона в растворе приобретает способность быстро реокисляться кислородом, что необходимо для катализа.

Цели и задачи работы. В данной работе продолжено исследование молекулярного механизма редокс-реакций миоглобина, катализируемых металлами. С этой целью в широком диапазоне условий изучено окисление в присутствии Сиг+, Cu(Gly)+ и Cu(Gly>2 нативного МЬСЪ кашалота и его химически модифицированных производных, алкилированных по всем доступным гистидинам бромацетатом натрия (СМ-МЬ02) и иодацетамидом (СА-МЬОг). Изучено также катализируемое ферроцианидом окисление нативных МЬ02 кашалота, лошади и свиньи, карбоксиметилированного СМ-МЬ02 кашалота и мутантного Mb02(His 119->Asp). Были поставлены следующие задачи:

1. Спектрофотометрически исследовать кинетику окисления нативного МЬСЪ, СМ-МЮ2 и СА-МЬ02 кашалота в зависимости от концентрации Cu2+, Cu(Gly)+ и Cu(GIyb, рН и ионной силы среды, а также влияние на скорость реакции редокс-неактивных ионов Za2+, конкурирующих с медью за связывание с гистидинами.

2. Методом ЯМР высокого разрешения проанализировать локализацию Cu(Gly)2 в нативном мет-Mb кашалота, мет-Mb лошади и СМ-мет-МЬ.

3. Изучить кинетику катализируемого ферроцианидом окисления нативных МЮ2

кашалота лошади и свиньи, СМ-МЬ02 и [Mb02(His 119-»Asp)] кашалота в широком диапазоне условий рН и ионной силы среды, концентрации катализатора, а также при комплексировании МЬ02 с конкурентным редокс-неактивным ионом цинка.

4. Проанализировать распределение электростатического потенциала на поверхности

нативных МЬ02 кашалота лошади и свиньи, а также [MbCh(His 119-»Asp)].

5. Расчитать и локализовать возможные впадины и полости на поверхности исследуемых белков на возможность комплексирования с ионом ферроцианида.

Научная новизна. Изучение окисления ионами и комплексами двухвалентной меди разных нативных и модифицированных оксимиоглобинов показало, что превращение ч МЬОг в окисленную мег-форму протекает по сайт-специфическому механизму, но комплексирование меди с остатками гистидина, локализованными на поверхности белка и имеющими наибольшее сродство к меди, вопреки тому, что считали ранее, вносит лишь незначительный вклад в суммарную скорость процесса. Основной вклад в скорость изучаемой реакции вносит комплексирование меди с «внутренними» гистидинами, His97(FG4) и дистальным His64(E7) гемовой полости, сродство которых к меди существенно меньше и которые недоступны для модификации.

При изучении механизма ферроцианидного катализа впервые показано, что для эффективного катализа необходимо, с одной стороны, специфическое связывание ферроцианида в районе Hisll9(GHl), где имеются большой локальный положительный электростатический потенциал и полость подходящего размера для встраивания аниона, а с другой, локализация поблизости остатков гистидина, протонирование которых способствует быстрому окислению связанного [Fe(CN)í]4" растворенным кислородом. Важную роль в образовании комплекса с реагентом играют электростатические и стерические взаимодействия, а также оптимальная динамика групп белка. Научно- практическая значимость. Полученные данные имеют фундаментальное значение для понимания механизма функционирования гемсодержащих белков и переноса электрона в белках. Результаты выполненной работы могут быть использованы в курсах по молекулярной биологии и биофизике для студентов ВУЗов. Они могут также найти применение в области физиологии и медицины для решения проблем гипоксии при высоких мышечных нагрузках, ишемии и реперфузии миокарда. Апробадия работы. Основные результаты диссертационной работы неоднократно докладывались на 5ой Путинской конфереции молодых ученых Биология- наука 21го века (Пущино, 2001), конференции От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям (Пущино,2001), 7™ интернациональном симпозиуме Metal ions in biology and medicine (Санкт-Петербург, 2002), на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004).

Публикации. Результаты работы, представленной к защите, опубликованы в 3 статьях в рецензируемых научных изданиях и материалах 4 конференций. Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 глав: Введение; Список сокращений; Обзор литературы; Материалы и методы; Результаты и их обсуждение; Выводы; Список цитируемой литературы. Работа изложена на 85 страницах, содержит 24 рисунка и 9 таблиц.

Результаты и их обсуждение

1. Механизм окисления оксимиоглобина ионами и комплексами меди: карбоксиметилированный и карбоксиамидированный по остаткам гистидина миоглобины

Свойства модифицированных производных миоглобина кашалота

По данным аминокислотного анализа все доступные растворителю гистидины Mb кашалота алкилируются бромацетатом и иодацетамидом, при этом Hisl2, Hisll3, Hisl 16 и His81 образуют дизамещенные, a His 48 и His 119 - моноалкилированные производные [Botelho and Gurd, 1978; Постникова и др., 1982; Brantley и др., 1993]. Первые не способны протонироваться в интервале рН 5-8, тогда как вторые могут присоединять протон с рК, мало отличающимся от немодифицированного гистидина. И те, и другие алкилированные производные His не должны комплексировать ионы и комплексы меди, либо связывать их гораздо хуже немодифицированного остатка. «Внутренние» остатки гистидина, His24, His36, His64 (дистальный), His82, His93 (проксимальный) и His97, слабо или совсем недоступные растворителю, не алкилируются этими реагентами.

Спектры поглощения в УФ и видимой области, дисперсия оптического вращения при 233 nm и температурная стабильность СМ-МЬ и СА-МЪ в пределах погрешности эксперимента совпадают с характерными для интактного белка. По результатам изофокусирования в 5%-ом полиакриламидном геле изменение общего заряда миоглобина при карбоксиамидировании весьма незначительно: для СА-Mb найдено значение pi 8.2, а для интактного белка pi 8.3. В случае СМ-МЪ наблюдается одна широкая полоса с pi 5.2, то есть СМ-МЬ в интервале рН 5-8 заряжен в основном отрицательно, а интактный Mb и СА-МЪ - положительно.

Кинетика окисления нативного миоглобина кашалота и его модифицированных производных в присутствии соединений двухвалентной меди.

На Рис.1 показано, как меняется скорость окисления нативного МЬСЬ, СМ-МЬОг и СА-МЬОг в зависимости от концентрации Cu2+(aq) и глицинового комплекса меди при соотношениях [реагент]: [белок] от 0.2 до 10 (при рН 7.5). Видно, что в исследованном диапазоне концентраций скорость реакции СМ-МЬОг и СА-МЬОг увеличивается пропорционально концентрации реагента (Рис. 1, кривые 2 и 3). При этом значения скоростей в обоих случаях близки, различия находятся в пределах экспериментальной погрешности. Для реакции обоих модифицированных белков с глициновыми комплексами

меди, Си(С1у)+ и Си(01у)2, линейный характер концентрационной зависимости сохраняется, хотя скорости уменьшаются в несколько раз (Рис.1, кривая 4).

Более сложный характер концентрационной зависимости наблюдается для нативного МЬОг (Рис.1, кривая 1). В соответствии с тем, что нами было показано ранее, скорость реакции медленно увеличивается до соотношения [Си2+]:[МЬОг], равного 3:1, затем наблюдается насыщение (плато) до соотношении 5:1, а затем скорость реакции резко растет. При этом значения скорости окисления интактного и модифицированных белков как при малых концентрациях реагента, до [Сиг+]: [МЬОг] около 2, так и при 10-кратном избытке, одинаковы с точностью ошибки эксперимента (Рис.1, Табл. 1).

МЬОг + СиС12

Е г

ч/

X >

Концентрация меди (М х 10")

Рис. 1. Зависимость скорости окисления нативного МЬСЬ кашалота (кривая 1), СМ-МЬОг (кривая 2) и СА-МЬОг (кривая 3) от концентрации ионов меди при соотношениях [Си24] : [белок] от 0.2 до 10, а также скорости окисления нативного МЬОг кашалота (кривая 4)от концентрации комплекса Си(01у)'4 , при тех же соотношениях. Концентрация белка 2^25 10 5 М, 0.01 М Трис-малатный буфер, рН 7.5,20°С.

При увеличении соотношения [Си2+]: [МЬОг] до 20 скорость реакции составляет 7.4x10"6 Ммин'1, а при еще больших концентрациях меди становится настолько быстрой, что в стационарных условиях ее не удается зарегистрировать. Поэтому концентрационные кривые для МЬОг и СМ-МЬОг при 10-50 - кратном избытке реагента изучали с Си(01у)г (Рис. 2). Скорость окисления модифицированного СМ-МЬ02 при больших избытках Си(ау)2 в 2-3 раза ниже, чем нативного белка. В обоих случаях наблюдается насыщение, что может указывать на связывание реагента с белками. В Табл. 1 приведены начальные скорости окисления всех трех исследуемых МЬОг ионами Си(аф2+ и заряженным и нейтральным глициновыми комплексами, Си(С1у)+ и Си(01у)г, в условиях десятикратного молярного избытка реагента. Скорость окисления МЬОг, СМ-МЬОг и СА-МЬОг в присутствии Си(01у)+ уменьшается по сравнению с СиСЬ в среднем в 2 раза для всех трех белков, а в присутствии с Си(01у)г - в 4 раза.

На Рис.3,а,б показана рН-зависимость в интервале рН 5-8 скорости окисления МЬОг, СМ-МЬОг и СА-МЬОг в присутствии одного эквивалента СиСЬ. Видно, что в этих условиях кривые рН-зависимости нативного и модифицированных МЬОг различаются. Выраженный сигмоидный характер рН-зависимости в случае интактного МЬОг с рКэфф

6.5-6.7 (Рис.3, кривая 1) указывает на то, что на скорость процесса влияет ионизация гистидинов. Просхольку интервал перехода составляет всего 2 ед.рН, таких остатков должно быть по крайней мере два (для одной группы переход занимает 3.5 - 4 ед.рН).

1 ■ мьо.

I |

т—

>°

О,а 0,2 0,4 О,в 0,8 1,0 1,2 1,4

[Си(С1у)2](тМ)

Рис.2. Зависимость скорости окисления нативного МЬО? кашалота (кривая!) и СМ-МЪ02 (кривая 2) от концентрации Си(Оу)2 при соотношениях [Си(01у>2]: [МЬО,] от 10 до 50. Концентрация белка 2.25-10"5 М, 0.01 М Трис-малатный буфер, рН 7.5,20°С.

Скорость окисления модифицированных СМ-МЪСЬ и СА-МЬОз возрастает с уменьшением рН, не достигая плато, она одинакова в обоих случаях и при рН < 6 в ~1.5 раза больше, чем скорость окисления интактного МЪОг (Рис. 3,а, кривые 2 и 3). Кривые рН-зависимости для СМ-МЪОг и СА-МЬОа по форме представляют собой нечто среднее между сигмоидной и монотонной зависимостями, рКэфф < 6.

В присутствие десятикратного избытка СиСЬ различия между рН-зависимостями МЬ02, СМ-МЬОг и С А-МЪОг выражены очень слабо как по форме кривых, так и по значениям скоростей (Рис. 3,6, кривые 1-3). Для модифицированных миоплобинов характер рН-зависимости сохраняется таким же, как и с одним эквивалентом Си2+, хотя скорости реакции выше в -20 раз.

201 2,3

16 Яо

I 12

"о 8

4 0

мьо2 см-мьо2

СА-МЬО,

5,0 5,5 в,0 6,5 РН

7,0 7,5 8,0

В 2 "Ь

3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

1 •

2 х

мьо, см-мьо2

СА-МЬО,

4,5 5,0 5,5 6.0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 РН

Рис 3. Зависимость от рН скорости окисления нативного МЬОг кашалота (кривая 1), СМ-МЬСЬ (кривая 2) и СА-МЪОг (кривая 3): (а) - в присутствии эквимолярной концентрации ионов меди и (б)-в условиях десятикратного молярного избытка Си2*.Концентрация белка 2.2510"5 М, 0.01 М Трис-малатный буфер, рН 7.5,20°.

Добавление в реакционную среду ионов цинка в соотношениях [Zn2+]: [МЪСЪ] до 5: 1 не оказывает заметного влияния на скорость реакции (Табл. 2). Ранее нами показано, .что при таких концентрациях [Zn2+] насыщается только одно место в структуре МЬОг кашалота (константа связывания составляет которое по данным

рентгеноструктурного анализа находится в районе His 119.

Таблица 1. Зависимость начальной скорости окисления интактного и модифицированных МЮ2 кашалота в присутствии различных комплексов меди (У0хЮ7, М"'мин"'). Соотношения меди к белку 10:1.10 мМ Трис-НС1 буфер, рН 7.5,20°С.

Образец Соединения меди

СиС12 Cu(Gly) Cu(Gly)2

МЬОг 28.0 ±3.0 6.4 ± 0.6 4.0 ± 0.4

см-мьсъ 25.0 ±2.5 5.8 ±0.6 4.6 ±0.5

са-мьо2 20.0 ±2.0 10.0 ±1 4.2 ±0.4

Изучение мест связывания меди с метмиоглобином методом ЯМР

Добавление небольшого количества Си(01у)2 к мет-МЪ кашалота при рН 7.1 приводит к уширению С®Н и СЕН резонансов семи гистидинов в спектре ЯМР (Рис.4, а-с). Это может свидетельствовать как о связывании меди всеми этими гистидинами или о ситуации, когда медь комплексируег только с одним из двух близко расположенных

Таблица 2. Влияние ионов цинка на скорость окисления МЪОг кашалота (УохЮ5, Ммин'1) при разных соотношения меди к белку. 10тМ Трис-НС1 -буфер, рН 6.5,20°С.

[Си2+]: [МЬОг] [Zn2+] : [МЬОг]

Без цинка 5:1

1.25 0.11 ±0.01 0.09 ±0.01

5 0.30 ±0.03 0.32 ± 0.03

10 0.59 ± 0.06 0.58 ± 0.06

остатков. Используя отнесения Соссо МХ и др. [Соссо и др., 1992], найдено, что наиболее уширены резонансы четырех поверхностных гистидинов, больше всего ШбПЗ (С®Н7.6, С8Н 6.6) и несколько меньше Шв! 16 (С®Н 7.7, С'Н 7.25), Шз48 (С®Н 7.12; СеН 6.9) и Ивв!

(С*Н 7.0; СеН 7.9). Гораздо меньше уширены резонансы Hisl 19 (С'ТН 6.7; СЕН 7.8) и связанного с ним водородной связью «внутреннего» His24 (С°Н 6.2, СЕН 7.65). Поскольку расстояние между Hisl 13 и Hisl 16, общими для Mb кашалота и лошади, составляет всего 0.62 нм, не исключено, что уширение резонансов обоих гистидинов и в этом случае обусловлено связыванием меди лишь с одним из них.

При рН 5.2 в присутствии Cu(Gly)2 наиболее уширены сигналы Hisl 16 (С*Н 8.55, СеН 7.47) и лишь немного меньше His48 (С®Н 7.14, СеН 8.03), Hisl2 (С8Н 7.35, С'Н 8.55) и His81 (С®Н 7.17, С'Н 8.6) (Рис.5, а-с). Резонансы Hisl 13 (С*Н 7.8, С'Н 7.0), которые больше всех уширены при рН 7.1, уширяются очень слабо, а сигналы Hisl 19(С*Н 6.83, СЕП 8.65) и Н-связанного с ним His24 совсем не уширяются. Напротив, наблюдается заметное уширение сигналов «внутренних» His36 (С*Н 8.3, СеН 8.5) и His82 (С®Н 6.75, СЕН 8.3), что несомненно указывает на конформационные изменения в белке.

В мет-МЬ лошади (Рис. 6, а-с) при 7.5 в соответствии с отнесениями, сделанными в работе Соссо M.J. и др. [Соссо и др., 1992], в большей степени уширяются резонансы трех гистадинов, Hisl 13 (CSH 7.65, СеН 6.7), Hisl 16 (С8Н 7.22, С8Н 7.8) и His48 (С^Н 6.9, ССН 7.85). Сильно уширен также гистидиновый резонанс с ррш 6.93 и немного меньше с ррт около 7.15, для которых отнесение отсутствует. Эти резонансы наиболее вероятно принадлежат His81 и Hisl 19, которые в этих условиях также уширяются в Mb кашалота. При рН 5.5 наблюдается преимущественное уширение С*Н и С'Н резонансов тех же гистидинов, что и при рН 7.5, т.е. конформация белка не изменяется (рисунок не приведен). При добавлении Cu(Gly)2 к карбоксиметилированному мет-МЬ кашалота (рН 5.2) никакого уширения резонансов гистидинов в спектре ЯМР не наблюдается. (Рис.4.9, а-с), что свидетельствует о том, что связывания реагента с модифицированными гистидинами не происходит [Carver и Bredbury, 1984].

Обсуждение результатов

Процессы, происходящие при каталитическом окислении МЬОг соединениями двухвалентной меди, описываются уравнениями 6-10

МЬ02 + Cu(2)Ln < ^ > МЬОгСи(2)Ц.т + mL (6)

MbOrCu(2)Ln.m Mb(2)-Cu(2)U.m + 02 (7)

кг

Mb(2)-Cu(2)LIwll —Mb(3)-Cu(l)L„.m (8)

Mb(3)-Cu(1)I^ + 02 + Ы *4 > Mb(3)H20 + Cu(2)L„ + H02 (9) МЬ(3)-Си(2)Ь,,.т + mL < > Mb(3)H20 + Cu(2)L„. (Ю)

—I—'—'—1—'—i—■—1—1—1—i—■ 1 1 ■—I—1—■—1—■—r 6.5« 8.88 7.5« 7.88

РРИ

Рис. 4. Область 1D 400 MHz спектра 'Н-ЯМР мет-Mb кашалота: (a) без добавок медного комплекса, (Ь)с добавлением 30% по отношению к белку Cu(Gly)2 и (с) дифференциальный спектр ЯМР. Концентрация миоглобина 0.3 мМ в 0.01 M Трис-HCl буфере, рН 7.1,298°К.

-1-■-1-----1-«-■-.-■-1---«-■-'-1-

8,5 8.0 7.5 7.0

ppm

Рис.5. Область 1D 400 MHz спектра 'Н-ЯМР мет-Mb кашалота: (а) без добавок медного комплекса, (Ь)с добавлением 8% по

отношению к белку Cu(Gly)2 и (с) дифференциальный спектр ЯМР. Концентрация миоглобина 0.3 мМ в 0.01 M Трис-НС1 буфере, рН 5.2,298°К.

IJ 1S 7.1 ш

Рис.6. Область 1D 400 MHz спектра 'Н-ЯМР мет-Mb лошади: (а) без добавок медного комплекса, (Ь)с добавлением 30% по отношению к белку Cu(Gly)2 и (с) дифференциальный спектр ЯМР. Концентрация миоглобина 0.3 мМ в 0.01 M Трис-НС1 буфере, рН 7.5,298°К.

I 1 ""j ' "l"........"Г" I ■ | " 1 ........1 .....Г ■ « •' •■■ j"...... Ч..... I I 1 I.....j I 1 Г "I" "I "|

8.5 8.0 7.5 7,0 6.5

pprn

Рис.7. Область 1D 400 MHz спектра 'Н-ЯМР карбоксиметилированного СМ-мет-МЬ кашалота: (а) без добавок медного комплекса, (Ь)с добавлением 8% по отношению к белку Cu(Gly)2 и (с) дифференциальный спектр ЯМР. Концентрация миоглобина 0.3 мМ в 0.01 M Трис-HCl буфере, рН 5.2,298°К.

Комплексирование рагента с белком, как отмечалось, происходит в местах локализации поверхностных остатков гистидина как имеющих высокое сродство к меди (Рис. 8).

Полученные в данной работе результаты изучения кинетики окисления нативного и модифицированных МЬ02 кашалота в присутствии ионов и комплексов Си2+ вместе с теми, что были получены ранее для МЬОг кашалота, лошади и свиньи [Моисеева и Постникова, 2001 ,а], свидетельствуют о том, что из доступных растворителю и способных связывать медь шести гистидиновых остатков НЫ2(А10) вообще не участвует в реакции, а связывание меди с Шб48(С06), Ш881(ЕР4), Шз! 13(014), Н1б1 16(017) и Шз119(ОН1) вносит лишь незначительный вклад в суммарную скорость процесса. Все эти гистидины расположены на поверхности МЬ далеко от гема, на расстоянии 1.8-2.7 нм (Рис. 8). Действительно, в условиях 10-кратного избытка ионов Си2+, когда по данным равновесного диализа все поверхностные гистидины должны комплексировать реагент, насыщение на концентрационных кривых для нативного МЬ02 отсутствует (Рис. 2).

Кроме того, скорости окисления СМ-МЬ02 и СА-МЬ02, модифицированных по всем этим гистидинам, практически не отличаются в этих условиях от нативного белка, а при меньших концентрациях реагента даже несколько выше (Рис. 1). В данной работе и ранее показано [Моисеева и Постникова, 2001 ,а], что редокс-неактивные ионы 2п2+ в соотношениях от 1 до 20 по отношению к белку также не оказывают заметного влияния на скорость окисления МЬОг при разных концентрациях меди (Табл. 2).

Рис. 8. Пространственная структура МЬ кашалота в проекции ХУ и локализация в ней остатков гистидина. Не закрашены доступные растворителю титруемые гистидины.

Отсутствие эффекта ингибирования реакции ионами Zn2+ в условиях, когда они могут конкурировать с медью за связывание с поверхностными гистидинами, также указывает на незначительный вклад последних в суммарную скорость процесса.

Вклад остатков Hisl 13, Hisl 16 и His48, имеющих по данным ЯМР наибольшее сродство к меди, можно оценить из данных по восстановлению Cu(Gly)2 мутантными МЬ02 кашалота [Van Dyke и др., 1992]. Наибольший эффект на константу скорости (37%) оказывает замена His48 на Ala, в то время как замена Hisl 16 на Asp уменьшает ее всего на 16% , а замена Hisl 13 на Ala практически не влияет. То есть Hisl 13, наиболее сильно комплексирующий реагент, в транспорте электрона, по-видимому, не участвует. Похожая ситуация наблюдалась ранее в случае НЪ человека, в котором остаток His2 ß-цепи, с наибольшим сродством связывающий медь, не участвует в редокс-превращениях [Rifkind и др., 1976].

Очевидно, что основной вклад в скорость изучаемой реакции, особенно при больших концентрациях реагентов, должны вносить «внутренние» гистидины, которые недоступны для модификации, в первую очередь, локализованные вблизи гема. На участие гистидинов гемовой полости косвенно указывает характер зависимости скорости окисления всех белков от pH в случае 10-кратного избытка регента (Рис.3,б), а также модифицированных СМ-МЬОг и СА-МЬ02 в присутствии эквимолярного количества меди (Рис 3,а), который аналогичен pH-зависимости процесса автоокисления Mb02 [Shikama, 1998]. Правда, скорости реакции в присутствии меди гораздо выше. Важнейшую роль в механизме автоокисления играет разрыв Н-связи лигандно-связанного 02 с имидазолом дистального His64(E7), а отсутствие этой связи увеличивает скорость автоокисления в сотни раз [Brantley и др., 1993]. Показано также, что окисление Lb02 сои в присутствии ионов и комплексов меди происходит через комплексирование реагента с дистальным His61 [Bakan и др., 1991]. В легтемоглобине имеются всего два гистидина, проксимальный и дистальный, но в отличие от МЬ02 и а- и ß-цепей НЮ2 дистальный His61 не образует водородной связи с лигандом, а ориентирован в растворитель, и растительный Lb02 имеет самую высокую из всех глобинов скорость автоокисления.

На то, что механизм окисления МЬОг изучаемыми реагентами включает их связывание с белком, указывает насыщение на концентрационных кривых [Данная работа, Hegetschweiler и др., 1987; Van Dyke и др, 1992]. Простой внешнесферный перенос электрона посредством прямого взаимодействия реагента в изучаемых реакциях с гемом маловероятен, так как в миоглобине в отличие от цитохрома С гемовый макроцикл мало доступен растворителю и, кроме того, соединения меди имеют высокое сродство к гистидину. Против переноса электрона по простому внешнесферному механизму

свидетельствует также тот факт, что альфа-цепи НЬ (Ео равен +110 мВ) в отличие от подобных миоглобину р-цепей не окисляются этими реагентами, хотя термодинамика , позволяет [Rifkind, 1974; Rffltind и др, 1976]. В пользу связывания реагента с белком свидетельствует и то, что в интервале 1 = 0-0.1 скорость окисления МЬСЪ кашалота и лошади в присутствии Си2+ практически не зависит от ионной силы, хотя оба реагента, и белок и ионы меди, заряжены.

Кроме дистального His64, в миоглобинах недалеко от проксимального His93(F8) на расстоянии 0.66 нм от Fe гема имеется также остаток His97(FG3) на расстоянии 0.66 нм от Fe гема, который образует Н-связь с СОО"-группой гемового пропионата в положении 7 и играет важную роль в стабилизации положения гемовой группы [Rousseaux и др., 1976, Brantley и др., 1993]. Этот гистидин присутствует во всех животных миоглобинах, а также в р-цепях НЬ, которые окисляются изучаемыми реагентами. Но His97 отсутствует в а-цепях, что может быть причиной того, что они резистентны к окислению при малых концентрациях меди. Из полученных данных следует, что основной вклад в скорость реакции, по крайней мере, до соотношения [реагент] / [белок], равного 8-10, на нервом участке концентрационной зависимости (Рис. 1) должно вносить комплексированяе ионов и комплексов меди именно с His97. Его сродство к Си2+ существенно меньше, чем His48 (рК 5.5), Hisl 13 (рК 5.6) и Hisl 16 (рК 6.5) на поверхности, поэтому преимущественное связывание с этими остатками до ~5-кратного избытка меди, должно уменьшать суммарную скорость реакции, что действительно наблюдается (Рис.1, кривая 1).

Следует отметить, что комплексирование His97 (рК 5.6) с Си2+ может приводить к изменениям локальной конформации гемовой полости, увеличению подвижности гема и доступности для меди дистального His64 (рК 5.5). Значительное увеличение скорости реакции при более высоких концентрациях реагента, больше 10-кратного молярного избытка меди (Рис. 2), по-видимому, объясняется тем, что в этих условиях оба этих гистидина могут участвовать в ее комплексировании и переносе электрона от гема. С этим согласуются и изменения в характере рН-зависимости (Рис. 3,6, кривая 1) по сравнению с кривой, наблюдаемой при эквимолярной концентрации катализатора (Рис 3,а, кривая 1), а именно, менее выраженный сигмоидный вид кривой и сдвиг рКэфф в более кислую область рН. В пользу участия в реакции дистального His64 при большом избытке меди указывает также тот факт, что в этих условиях окисляются и альфа-цепи НЬ [Eguchi, Saltman, 1987].

Как отмечалось, остатки His97 и His64 ограниченно доступны растворителю и не алкилируются бромацетатом и иодацетамидом [Nigen и Gurd, 1973; Hartzell и др., 1967; Botelho, Gurd, 1978]. Ионы Zn2+ в исследованных концентрациях, очевидно, не способны конкурировать с медью за связывание с His97 и His64 и влиять на скорость реакции, но

при очень большом избытке Zn2+ и Ni2+ (240-275-кратном) ингибирование наблюдается [Hegetschweiler и др., 1987; Van Dyke и др., 1992]. В ЯМР-спектрах мет-Mb и СМ-мет-МЬ сигналы протонов обоих гистидинов не видны, так как они сильно уширены из-за близкого расположения к парамагнитному гемовому центру.

При малых концентрациях реагента (до 5-кратного избытка) в реакции окисления нативного МЬОг, очевидно, принимают участие и поверхностные гистидины, на что указывает сишоидная кривая рН-зависимости с рК перехода 6.5 при эквимолярной концентрации Си2+ (Рис 3,а, кривая 1). Такая же рН-зависимость наблюдалась ранее и для МЬ02 лошади (с рК перехода 6.7) и был сделан вывод, что на скорость окисления МЬ02, катализируемого Си2+, влияет ионизация Hisl 16 (рК 6.5 - 6.7). При комплексировании Си2+ с Hisl 13, который по данным ЯМР имеет наибольшее сродство, в результате ионизации локализованного поблизости Hisl 16 вероятность туннелирования электрона от Fe гема в данный участок белка должна увеличиваться за счет создания здесь более высокого локального положительного потенциала. Кроме того, очень вероятно, что протонирование Hisl 16 приводит к значительному увеличению скорости реокисления связанной с Hisl 13 восстановленной меди, протекающего с участием протонов (Реакция 9), обеспечивая оптимальное расположение всех реагентов, как это происходит в ферментах. Ранее аналогичный эффект обнаружен нами в реакции окисления МЬ02 кашалота, катализируемой ферроцианидом, когда ионизация His 119 в месте связывания катализатора сильно увеличивает скорость процесса

4.2. Окисление оксимиоглобина, катализируемое ферроцианидом: нативные оксимиоглобины кашалота, лошади и свиньи, карбоксиметилированный по остаткам гистидина и мутантный (Hisl 19->Asp) оксимиоглобины кашалота.

Сравнительная характеристика исследованных миогпобинов

По сравнению с Mb кашалота, в Mb лошади отсутствует доступный растворителю остаток Hisl2(A10), который замещен на Gin, а в Mb свиньи три остатка, Hisl2(A10), Hisl 13(G14) и Hisl 16(G17), также замещены на Gin. Во всех трех белках амияохислотные остатки, образующие гемовую полость, строго инвариантны. Помимо гистидинов, в Mb лошади и свиньи по сравнению с Mb кашалота имеются аминокислотные замены еще в 19 позициях [Rousseaux и др., 1976; Carver и Bradbury, 1984], однако все замены строго одинаковы или гомологичны по характеру, кроме замены положительно заряженного Lys87(F2) в Mb кашалота и лошади на неполярный Thr87 в Mb свиньи далеко от места связывания катализатора. В отличие от Mb кашалота (р! 8.3), который в исследуемом

интервале рН все время заряжен положительно, общий заряд МЬ лошади (р17.4) и МЬ свиньи (р17.2) изменяется от положительного до отрицательного.

Свойства модифицированного по доступным гистидинам СМ-МЬ (р1 5.2) подробно описаны выше. Сохранение основных физико-химических параметров СМ-МЬ свидетельствует о том, что модификация не влияет на конформацию гемовой полости и миоглобиновой молекулы в целом.

Как можно было ожидать, одиночная замена №з119 на Азр в мутантном МЬ кашалота также не изменяет структуры гемовой полости и общей конформации молекулы. Как видно из Табл. 3, отличия в спектрах поглощения нативного и мутантного белков в УФ и видимой области, значениях рК мет-гидрокси-перехода и стабильности в интервале рН 6 - 12.5 находятся в пределах аппаратной погрешности. Несущественно меняется и общий заряд молекулы белка (по данным изофокусирования в полиакриламидном геле значение р! мутантного мет-МЬ равно 8.2).

Таблица 3. Спектральные характеристики, значения рК перехода мет-гидрокси и рН

щелочной денатурации мет-МЬ кашалота и мутантного мет-МЬ(№з119->А5р)

Образец ^Соре, ИМ 1соре / Ьо5 1соре ! ¡280 1280 / 1505 рКмет-гидрокси рН денатурации

Интакгаый МЬ 409.5 16.5 5.03 3.3 8.9 11.5

МЬ(1Ш19->Азр) 409.6 16.6 4.96 3.4 .8.9 11.4

Кинетика окисления в присутствии ферроцианида нативных оксимиоглобинов кашалота, лошади и свиньи, модифицированного и мутантного оксимиоглобина кашалота

На Рис. 9,а приведены зависимости скорости окисления МЬ02 кашалота, лошади и свиньи, СМ-МЬОг и МЬ02(Н1з119-»Авр) от концентрации ферроцианида в условиях, когда катализатора много меньше, чем белка (до 20% от его концентрации). Во всех случаях наблюдается линейная зависимость скорости окисления исследованных белков от концентрации |Те(СК)б]4", при этом с наименьшими скоростями окисляются МЬ02 свиньи и СМ-МЬОг (Рис. 9, кривыеЗ и 4).

При больших концентрациях катализатора, от эквимолярной до 50-кратной по отношению к белку, скорости окисления нативных МЬОз кашалота и лошади примерно одинаковы и достигают насыщения при соотношениях [Ре(ОГ)б]4" / [МЬОг] более 30:1 (Рис. 9,6, кривые 1 и 2 ). Скорость же окисления МЬ02 свиньи и СМ-МЬОг кашалота практически одинакова и существенно меньше, чем МЬ02 кашалота и лошади.Она

линейно увеличивается с концентрацией р^ОЗД4" и не достигает насыщения в исследованном диапазоне концентраций катализатора (Рис. 9,6, кривые 3 и 4). При 50-кратном избытке Р?е(СК)б]4" скорость окисления МЬОг свиньи и СМ-МЬ в -5 раз меньше скорости окисления нативного МЬОг кашалота. Скорость окисления МЪОг^в 119->Азр) также меньше, чем нативного белка (в 2-3 раза), но гораздо больше растет с увеличением концентрации катализатора, чем СМ-МЬОг и МЬОг свиньи (Рис. 9,6, кривая 5).

1 ^ мь кашалота -

а А

Рис. 9. Зависимость скорости окисления нативного МЬ02 кашалота (кривая 1), МЬОг МЬОг лошади (кривая 2) и МЬОг свиньи (кривая 3), а также СМ-МЬО? (кривая 4) и (Hisl 19-+Asp) кашалота (кривая 5) от концентрации [Fe(CN)6]4" в условиях, а- когда концентрация катализатора меньше концентрации белка, б- в условиях избытка катализатора по отношению к белку .0.01 М трис-малатный буфер, рН 5.2,20°С. Концентрация белка 2.25-10"5 М/л.

На Рис. 10,а показано влияние рН в интервале 5-8 на скорость окисления МЬОг кашалота, лошади и свиньи, а на Рис. 10,6 - модифицированного СМ-МЬОг и мутантного Mb02(Hisll9->Asp) в присутствии 5% от концентрации белка ферроцианида калия.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 [ферроцианид] (мМ)

0 1 2 3 4 5 [ферроцианид] (мкМ)

4 Л

"х 0,8 s

3. о,в ъ

х 0.4 >°

0,2

РН

4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 рН

Рис. 10. Зависимость от рН скорости окисления в присутствии 5% от концетрации белка ферроцианида калия:

(а) - МЬ02 кашалота (кривая 1), лошади (кривая 2) и свиньи (кривая 3),

(б) - МЬ02 кашалота (кривая 1), СМ-МЬ02 (кривая 2) и МЪ02(Шз119->Азр) (кривая 3). 0.01 М Трис-малатный буфер, 20°С. Концентрация белка 2.25-10'5 М.

-Г ' й1

1 a Mb кашалота

2 □ Mb лошади

3 х СМ-МЬ кашалота

4 Д Mb(His119-Asp) кашалота

Рис.11. Влияние ионной силы на скорость окисления нативного МЮ2 кашалота (кривая 1), лошади (кривая 2), СМ-МЬ02 (кривая 3) и Mb02(Hisl 19—»-Asp) (кривая 4) в присутствии 5% ферроцианида калия. 0.01 М Трис-малатный буфер, KCl, pH 5.1,20°С. Концентрация белка 2.25-10*SM.

ОН-■-г~

0,0 0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

В отличие от этих белков, скорость реакции МЬОг свиньи во всем исследованном интервале рН очень мала и не зависит от рН (Рис. 10, а, кривая 3). Скорость окисления СМ-МЬОг также очень мала и слабо зависит от рН, несколько возрастая при рН < 5.5 (Рис.10 б, кривая 2). В случае же мутантного белка (Рис.10, б, кривая 3) увеличение скорости реакции при рН < 5.5 более значительно,чем для МЪ02 свиньи и СМ-МЬСЬ, и аналогично тому, что характерно для процесса автоокисления [БЫката К., 1998].

Увеличение ионной силы в интервале от 0 до 0.55 сильно ингибйрует окисление МЬОг кашалота и лошади, катализируемое ¡Те(С>})б]4", особенно в интервале I от 0 до 0.1 (Рис. 11, кривые 1 и 2), указывая на важную роль электростатических взаимодействий в механизме реакции. При высокой ионной силе, I > 0.1, скорость реакции в присутствии МЬС>2 кашалота и лошади мала при всех значениях рН в интервале 5-8. Скорость окисления МЬОг свиньи в присутствии 5% ферроцианида очень мала и не зависит от ионной силы (на Рис. 11, не приведена). Низкая скорость окисления СМ-МЬОг слабо зависит от ионной силы (Рис. 11, кривая 3). Незначительное увеличение скорости окисления СМ-МЬ02 при высоких I может объясняться тем, что в этом случае и реагент, и белок заряжены отрицательно, а экранирование зарядов облегчает их взаимодействие. Скорость окисления мутантного МЬС^ЗЫ 19-»Азр) в области низких ионных сил, КОЛ, уменьшается с увеличением ионной силы, но зависимость существенно менее выражена, чем в случае нативного белка (Рис. И, кривая 4).

Добавление в реакционную среду ионов цинка в соотношениях [ Ъв?] / [МЬ] =2:1, когда насыщается только одно место в структуре МЬ в районе Шз119, сильно ингибирует

окисление МЬОг кашалота и лошади даже при большом избытке катализатора (вплоть до 50-кратного избытка) и не оказывает существенного влияния на скорость реакции МЬОз свиньи, СМ-МЬ02 и мутантного МЬ02 (Табл. 4). Высокое сродство цинка к этой области структуры объясняется тем, что в хелатировании иона металла наряду с Щб119 дополнительно участвуют функциональные группы Ьу816(А14) и Азр122(СН4). Ранее было показано, что связывание редокс-неактивного иона цинка с МЬОг кашалота (Е,, пары Ъг?*!7л\ равен -763 тУ) никак не влияет на общую конформацию белка и скорость его автоокисления по сравнению с нативным МЬОг без цинка.

Расчет распределения электростатического потенциала (ЭП) вокруг молекулы МЬ.

В анионе р?е(04)б]4" внутренняя лигандная сфера атома Ре полностью насыщена сильными лигандами ОТ, которые не могут вытесняться группами белка, так что он может связываться с белком только за счет электростатических и стерических взаимодействий. Об электростатических взаимодействиях свидетельствует сильная зависимость скорости реакции окисления МЬОг кашалота и лошади от ионной силы (Рис.11). Так как электростатические взаимодействия играют важную роль в механизме реакции, проанализированы распределения электростатического потенциала вокруг молекулы МЬ в сайте связывания [Те(СМ)6]4" при разных значениях рН в интервале 5-8.

На рис. 12, А приведены распределения электростатического потенциала вокруг молекулы МЬ кашалота в экспериментально найденном сайте связывания [Ре(СЫ)6]4" для двух значений рН 5.2 и рН 7.5. Расчитанное распределение ЭП в этом сайте МЬ лошади практически идентично найденному для МЬ кашалота, лишь незначительно отличаясь при рН 5.2 в области Шз12(А10), который замещен на Ип. Видно, что при рН 5.2 участок связывания [Те(СМ)б]4" на поверхности МЬОг кашалота и лошади находится в области большого положительного потенциала, а при рН 7.5 становится нейтральным. Изменение ЭП в интервале рН 5 - 8 в МЬ кашалота и лошади происходит из-за изменения состояния ионизации локализованных здесь Ш$113, Н1е1 1 б и НЫ19 (состояние ионизации других заряженных групп не меняется) и согласуется с резким уменьшением скорости окисления МЬ02 кашалота и лошади в присутствии ферроцианида при рН > 7 (Рис.10, а).

В МЬ свиньи (Рис.12, В) при рН 5.2 участок связывания Р?е(СЫ)б]4"также находится в области положительного потенциала, хотя и несколько меньшего, чем в случае МЬ кашалота и лошади, так как №113 иШяПб замещены на Ип. ПрирН 7.5 электростатический потенциал этого места, как и в случае миоглобинов кашалота и лошади, становится нейтрально-отрицательным, так как Н1в119 депротонируется.

Таблица 4. Влияние ионов цинка на скорость окисления МЬСЬ кашалота, лошади, свиньи карбоксиметилированного СМ-МЬОг и мугантного МЬО^Ш! 19->А5р) (ио-107, М мин ') при разных соотношениях [[Ре(СЫ)«]4"] / [МЬОД. 0.01 М Трис-малатный буфер, рН 6.4, 20-С.

[[?е(СК)6]4-] / [МЮ2] = 5:1 [[РеССМ)«]4-] / [МЪОг] = 10: 1 [[Ре(СЫ)6]4-] / [МЬОг] = 50:1

Образец [гп2+]:[МЬ02] [2п2+]:[МЬОг] [2п2+]:[МЬОг]

- 2:1 Ингибиров ание - 2:1 Ингибиров ание - 2:1 Ингибиров ание

МЬ кашалота 15.0 2.5 в 6 раз 27.5 2.8 10 раз 58.2 2.3 25 раз

МЪ лошади 34.8 3.3-3.9- 10 раз 34.8 3.3-3.9- 10 раз 64.0 2.6 25 раз

МЬ свиньи 1.5-2.0 1.0 1.5-2 раза 1.5-2.0 1.0 1.5-2 раза 12.1 1.5 8 раз

СМ-МЬ 2.03 2.3 Нет 2.55-3.36 3.23-3.3 нет - - -

МЬ(Н1в 119->Азр) 7.20 4.6 В 1.55 раза 10.7 6.2 в 1.5 раза - -

Рис 12, А. Распределение электростатического потенциала вокруг молекулы МЬ кашалота в экспериментально найденном сайте связывания [Ре(СМ)б]4" в районе №119 для двух значений рН - 5.2 и 7 5 Красный цвет - область положительного потенциала (кТ/е > +0,3), синий - область отрицательного потенциала (кТ/е < -0,3) и зеленый - область потенциала, близкого к нейтральному (кТ/е от -0,3 до +0,3).

Рис.12, В. Распределение электростатического потенциала вокруг молекулы МЬ свиньи в экспериментально найденном сайте связывания [Те(СМ)б]4" в районе Шз119 для двух значений рН - 5.2 и 7.5. Красный цвет - область положительного потенциала (кТ/е > +0,3), синий - область отрицательного потенциала (кТ/е < -0,3) и зеленый - область потенциала, близкого к нейтральному (1сТ/е от -0,3 до +0,3).

Рис 12, С Распределение электростатического потенциала вокруг молекулы мутантного МЬ(ТПз119—>Азр) (В) в экспериментально найденном сайте связывания [Те(СМ)б]4" в районе Шз119 для двух значений рН - 5.2 и 7 5 Красный цвет -область положительного потенциала (кТ/е > +0,3), синий - область отрицательного потенциала (кТ/е < -0,3) и зеленый - область потенциала, близкого к нейтральному (кТ/е от -0,3 до +0,3)

В мутантном MbÛ2(Hisl 19-+Asp) в результате замены Hisl 19 на анионный остаток Asp большой положительный электростатический потенциал в месте связывания [FefOOe]4", характерный для интактного белка в кислой области рН, становится отрицательным (Рис. 12, С, рН 5.2). Положительный потенциал при рН 5.2 сохраняется лишь в районе локализации остатков Hisl 13 и Hisl 16. При увеличении рН в интервале 5-8 электростатический потенциал этого места становится отрицательным.

Тот факт, что комплексирование Zn2+ в районе His 119 с сохранением положительного потенциала в данном участке Mb все же сильно ингибирует ферроцианидный катализ, указывает на важное значение не только электростатические, но и стерических взаимодействий и оптимальной динамики групп белка в образовании специфического комплекса с [Fe(CN)6]4'-

Расчет впадин и полостей в молекуле миоглобина

При расчете впадин и полостей молекулы Mb с помощью программы CastP в кристаллической структуре Mb кашалота найдено 10 полостей, находящихся внутри молекулы, и 14 «карманов», имеющих выход на поверхность. Из них только три полости, кроме гемового кармана, имеют линейные размеры 20-24 Â и объем 12-94 А3, которые достаточны для хотя бы частичной адаптации аниона ферроцианида (0 9 A, V-165 А3). Два из них находятся в области остатков Vall, Leul37, Lys 140, Leu2, Trp7, Gly80 на N-конце структуры, a третий, самый большой (V~94 А3) локализован в области С-конца и включает остатки Lys87, А1а90, Gln91, Lysl45, GIul48 и Leul49. Ни один из карманов не имеет в своем составе гистидинов, играющих согласно экспериментальным данным важную роль в катализе. В районе Hisl 19 также кармана не обнаруживается, так как этот остаток ориентирован внутрь молекулы, образуя водородную связь с внутренним His24. После оптимизации кристаллической структуры Mb методами молекулярной механики, для того чтобы промоделировать ситуацию в растворе, оказалось, что эта Н-связь разрывается, и Hisl 19 изменяет свою конформацию таким образом, что становится возможным доступ в карман, образованный остатками Argl 18, А1а19, Asp20, Lysl6 и His24 (Рис.13, a). Образующие карман аминокислоты консервативны для 66 различных миоглобинов, в том числе для миоглобинов лошади и свиньи. Если Hisl 19 у входа в карман находится в «открытой» конформации, туда легко встраивается анион [Fe(CN)6]*" (Рис. 13,6). Этот карман в отличие от трех других находится в области положительного ЭП. В Mb свином [Fe(CN)6]4' также способен встраиваться в этот карман, так как все образующие его аминокислоты, кроме Argl 18, инвариантны, а гомологичная замена Argl 18 на Lys не изменяет положительного заряда участка.

Из-за замены Hisl 19 на Asp "карман" в этом участке находится постоянно в "открытом" положении, что позволяет ионам [Fe(CN)«]4" свободно встраиваться, хотя энергия связывания оказывается примерно на 4 ккал меньше, чем в нативном белке [Гораев и др., 2002] При комплексировании Hisl 19 с Zn2+ с образованием хелатного комплекса (участвуют также функциональные группы Lysl6 и Asp 122 [Banaszak и др , 1965] остаток Hisl 19 теряет способность переходить в «открытую» конформацию, и карман становится недоступен для ферроцианида

Рис 13 Полость на поверхности молекулы МЪ кашалота, образованная остатками А^118, А1а19, А8р20, Ьув16 и ¿¡824 (а) Встраивание [Те(СМ)б]4" в «карман» вблизи НЫ19, если последний находится в «открытой» конформации (б)

Обсуждение результатов

На основании полученных ранее данных схема реакции катализируемого ферроцианидом окисления оксимиоглобина может быть представлена следующим образом [Моисеева и др., 2001]:

МЬ02 + [Ре(СК)б]4--^МЬ02[Ре(СМ)б]4' (1)

МЬОгР^ООД4- + Ог + Н* -> МЮ2'[Ре(Ш)6]3" + Н02 (2)

МЬОг-^ООб]3- -> МЬ(3)Н20 + [Ре(С>06]4" + 02 (3)

Она включает связывание катализатора с белком (Реакция 1), окисление связанного [Ре(СК)б]4" растворенным кислородом (Реакция 2) и образование конечных продуктов (Реакция 3) Последняя реакция содержит различные стадии, так что к5 является некоторой эффективной константой, включающей несколько индивидуальных констант,

кинетических и равновесных. Все эти реакции являются быстрыми и не лимитируют скорости процесса. В Табл. 5 приведены значения равновесной и кинетической констант, кз и <4, найденные из экспериментальных данных. В условиях, когда ^(СИ)«]4"] »[МЬОг], обе константы можно определить независимо из графика [(Ре(СМ)б]*"]о / 1)о против [[Ре(СК)б]41о для двух значений рН, 6.4 и 7.3 [Моисеева и др., 2001]. Для кислых значений рН это не удается сделать из-за быстрого окисления МЬ02 в этих условиях. Когда же МЬ02 находится в избытке, можно определить лишь к* [02] / Как. Полагая, что кинетическая константа кл не зависит (или слабо зависит) от рН и концентрация 02 в наших условиях постоянна (0.32 мМ), можно найти АГдас и для кислых рН, для чего использовали значение Ь, для рН 6.4, так как ошибка в определении констант при рН 7.3 велика из-за низкой скорости реакции.

Связывание [Те(СМ)б]4" с миоглобином реализуется в основном за счет электростатических взаимодействий, о чем свидетельствует наличие в найденном экспериментально участке связывания [Ре(СМ)б]*" большого локального положительного потенциала (Рис. 12, А) и сильная зависимость сродство [Ре(СЫ)б]4" к миоглобину (К^с) от рН в интервале рН 5 - 8, которое в кислой области увеличивается почти на порядок (Табл. 5). Для образования здесь эффективного каталитического комплекса важно, по-видимому, протоиирование не только Ш8119, но и локализованных поблизостиз Шз113 и ШэПб. Остаток же ЬЙ812(А10), очевидно, не участвует в связывании, так как его отсутствие в МЪ лошади не влияет на Кщад. Изменение электростатического потенциала в интервале рН 5-8 от сильно положительного до нейтрально-отрицательного в связи с депротонированием локализованных здесь гистидинов хорошо объясняет уменьшение К дне ферро цианида и скорости окисления МЬ кашалота и лошади. Следует отметить, что изменение сродства [Ре(СМ)б]4" к белку связано изменением с рН электростатического потенциала в месте связывания, но не общего заряда белка, так как при одном и том же рН величина Кдас одинакова для МЬ02 кашалота (р18.3) и лошади (р17.4).

Избирательность комплексирования Р^ООД4" в районе №119 очевидно обусловлена не только большим локальным электростатическим потенциалом в этом участке поверхности миоглобина, но и наличием здесь полости подходящего размера для встраивания аниона. Невозможность встраивания [Те(СЫ)б]4~ в эту полость при комплексирования с №в1 19 иона (с сохранением положительного потенциала в данном участке МЬ) указывает на важную роль стерических взаимодействий и оптимальной динамики групп белка как в образовании «активного» комплекса с реагентом. Так как сродство Хт?+ к этой области МЬ в -100 раз выше, чем [Т^ООб]4",

(Кдис в интервале рН 5 - 8 составляет 2,3-10"* М), неудивительно, что Zn2+ практически полностью ингибируют катализ даже при 50-кратном избытке катализатора (Табл.4).

Тот факт, что связывание с белком играет решающую роль в катализируемом [Fe(CN)6]4" окислении МЬ02, подтверждается тем, что скорость реакции минимальна в случае СМ-МЬОг, карбоксиметилированного по гистидинам. Прочное связывание катализатора с СМ-МЬОг невозможно из-за того, что анион [Fe(CN)6]4" должен контактировать с отрицательно заряженными -СНгСОО'-группами на поверхности белка, попадая в область отрицательного потенциала. Из-за резкого уменьшения сродства к миоглобину (Табл. 5) скорость окисления СМ-МЬОг даже в избытке катализатора много меньше, чем интактного МЬ02 кашалота.

Сродство мутантного Mb02(Hisl 19->Asp) к [Fe(CN)6]4" при рН 5.2 и 6.4 уменьшается по сравнению с нативным МЮ2 примерно в 2 раза (Табл. 5). Причина, очевидно, заключается в отрицательном локальном электростатическом потенциале в районе связывания (Рис. 12, С). Однако «карман» в мутантом Mb находится постоянно в «открытом» положении, что позволяет ионам ферроцианида встраиваться, хотя и с меньшей энергией связывания. Поэтому с ростом концентрации катализатора скорость окисления мутантного МЬ02 увеличивается, хотя и гораздо медленнее, чем нативного МЬОг (Рис. 9,6). Отсутствие же ингибирующего эффекта Zn2+ на окисление Mb02(Hisl 19-»Asp), как и СМ-МЬ02) легко объясняется тем, что Hisl 19, связывающий j цинк, либо отсутствует, либо модифицирован химическим реагентом (Табл. 4).

В МЬОг свиньи сохраняется положительный электростатический потенциал в участке связывания при рН<7 (Рис. 12, В ), как и остается неизменным "карман" для адаптации [FeiCN)«]4" (Рис. 13). Соответственно, и величина Кдис для ферроцианида примерно такая Же, как в Mb кашалота и лошади (Табл. 5), что должно обеспечить его связывание в районе Hisl 19. Однако данные кинетики свидетельствуют о том, что реакция j практически не идет даже при больших концентрациях катализатора. Ионы Zn2+ также не ! влияют, хотя Hisl 19 и аминокислотные остатки Lysl6 и Aspl22, участвующие в хелатировании цинка не изменены. Очевидно, что связывание [Fe(CN)6]4" - необходимое, но недостаточное условие для эффективного катализа. Практически полное отсутствие реакции в случае свиного МЪ02 вероятнее всего объясняется тем, что из-за отсутствия Hisl 13 и Hisl 16 не происходит быстрого окисления связанного [Fe(CN)6]4" (Реакция 2). Известно, что ферроцианид калия и другие соли двухвалентного железа в растворе плохо окисляются кислородом, реакция очень медленная даже в растворе кислоты [Cher, Davidson, 1955; Stadtman, Oliver, 1991]. Причина заключается в том, что образование

Таблица 5. Равновесные и кинетические параметры реакции окисления оксимиоглобина, катализируемого ионами ферроцианида

Условия Миоглобин РН [Н+] Кдас104 кюгг к« гед-ю"6

Эксперимента (УтЛъ)

М М Мин1 М"'-мин"1

[Ре(О0б]4]»[МЪСУ кашалота 6.4 4-10"7 4.6 0.4 1.03

7.3 5-10"* 12.5 0.07 1.4

лошади 6.4 4- 1<Г7 3.2 0.37 0.95

свиньи 6.4 4-10'7 4.2 0.041 0.1

см-мьо2 6.4 410"7 12.0 0.107 0.27

МЬОг(Шз 119-> Аэр) 6.4 410'7 7.8 0.21 0.533

[Ре(СМ)6]^ «[МЪОД кашалота 5.2 7.95-10"6 1.5-1.8** - -

5.5 5-Ю"6 2.58** - -

6.4 4-10"7 5.70** - 1.05*

лошади 5.2 7.95-10"4 2.14** - -

свиньи 5.2 7.95 10"6 1.5-6.1** - -

СМ-МЬОг . 5.2 7.95-Ю"* 5.4** - -

МЬ02(Н15119->Аяр) 5.2 7.95-10"6 3.3** - -

* Значение вычислено с использованием Кде при рН 6.4 в условиях избытка ферроцианида. *'Значения вычислены с использованием к4 [Ог] = 1.03-10'М"1 -мин'1 в условиях избытка ферроцианида

,4 Ч * * , 4 .

супероксидного аниона и даже НОг (с участием протонов) термодинамически невыгодно,так как для систем 02/ 02" и Оз + ЬГ/ Н02 стандартные редокс-потенциалы составляют, соответственно, -330 и -37 тУ [Пап и др., 1976,а]. Напротив, выгодна обратная реакция восстановления феррицианида активными формами кислорода, в том числе перекисью водорода, конечным продуктом их диспропорционирования:

^ООб^ + Ог + ^-греСОО^' + НА (6)

Связанный же с нативными МЬСЬ кашалота и лошади ферроцианид, как видно из Табл. 5, быстро окисляется в мягких условиях. Чтобы окисление происходило, то есть имел место катализ, должен либо значительно изменяться восстановительный потенциал Р?е(СМ)б]4" в результате образования комплекса с белком, либо каким-то образом ускоряться процесс передачи электрона на кислород, либо иметь место и то, и другое. Поскольку в ферроцианидном ионе внутренняя лигандная сфера Ре полностью насыщена сильными лигандами ОГ, которые не могут вытесняться белковыми группами, снижение его стандартного Ео может иметь место из-за встраивания [Ре(СМ)б]4' в «карман» вблизи №«119, образованный остатками Ьуз16, А1а19, Авр20, Шя24 и Агд118. Хотя в основном это заряженные остатки, но они имеют длинные гидрофобные цепи, так что диэлектрическая проницаемость внутри «кармана» должна быть существенно ниже, чем в растворе (не выше 40), что должно благоприятствовать снижению заряда иона, то есть его окислению.

Однако этого эффекта, по-видимому, недостаточно для катализа, так как МЬОг свиньи в присутствии ферроцианида практически не окисляется. Очевидно, что должно иметь место и кинетическое же ускорение окисления связанного [Ре(СМ)б]4* растворенным Ог (Реакция 2) за счет, например, локализации обоих реагентов и протона в оптимальном положении по аналогии с тем, как это реализуется в активном центре фермента. Полученные данные свидетельствуют о том, что такую роль выполняет протонирование одного из локализованных здесь Шз113 или Шв116, скорее всего последнего, ближайшего кШзИ9. Ранее было нами показано, что 16 очевидно играет такую же роль в окислении МЬ02, катализируемом ионами меди, когда Си2+ связывается с №з113.

Насколько этот процесс важен для катализа, видно из сравнения концентрационых зависимостей для МЬОг свиньи, СМ-МЬОг и МЬО^й'я! 19-»Азр) кашалота на Рис. 9,6 Первые два белка ведут себя одинаково, хотя со свиным МЬ02 ферроцианид связывается, а с СМ-МЬ02 ферроцианид не связывается и, кроме того, карбоксиметилированные Н^я! 13 и Ив! 16 не способны протонироваться. В случае же мутантного миоглобина Н1я113 и

НЫ16 сохраняют эту способность и, несмотря на более слабое сродство к ферроцианиду, чем у свиного МЬ02, скорости окисления существенно выше.

Таким образом, для эффективного катализа необходимо, с одной стороны, специфическое связывание ферроцианидного аниона с белком в районе Н1з119{СТ11), а с другой, локализация поблизости остатков гистидина, протонирование которых способствует быстрому окислению связанного [Ре(СЫ)6]4" растворенным кислородом. Ионизация №113 и Н18116 способствовует лучшему связыванию [Ре(СЫ)6]4", увеличивая локальный положительный электростатический потенциал, но главное, обеспечивает быстрое окисление связанного катализатора за счет локализации необходимого для этого протона в оптимальном для реакции положении.

5.ВЫВОДЫ.

1. Изучение спектрофотометрической кинетики окисления ионами и глициновыми комплексами двухвалентной меди разных оксимиоглобинов, нативного МЬОг кашалота и его производных, алкилированных по доступным растворителю гистидинам бромацетатом натрия и иодацетамидом, а также изучение локализации в них Си(01у)2 методом ЯМР высокого разрешения показало, что процесс превращеия МЬ02 в окисленную мет-форму протекает по сайт-специфическому механизму переноса электрона через предварительное связывание реагента с гистидинами.

2. Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что комплексирование меди с остатками Шз12,48, 81,113,116 и 119, локализованными на поверхности белка (все шесть расположены на расстоянии 1.8-2.7 нм от гема), вносит лишь незначительный вклад в суммарную скорость процесса, не более 35%, в особенности в условиях большого, более 8-10 - кратного, избытка реагента, Заметный вклад остатков Ш«113, №116 и Н5з48, и имеющих по данным ЯМР наибольшее сродство к меди, проявляется лишь при малых концентрациях реагента, до ~ 5-кратного избытка по отношению к белку, на что указывает сигмоидная кривая рН-зависимости с рК перехода 6.5-6.7.

3. Основной вклад в скорость изучаемой реакции должно вносить комплексирование

меди с «внутренними» гистидинами, Ш897 (0.66 нм от гема), образующим Н-связь

с СОО'-группой гемового пропионата, и дистальным №64, сродство которых к

меди существенно меньше, чем «поверхностных» гистидинов, и которые

недоступны для модификации химическими р й^^ИШИ:'—^¡7л"г*Й—

Б' ' < / ГЕКА С

90» РК

4. Сравнительное изучение скорости катализируемого ферроцианидом окисления нативных МЬОг кашалота, лошади и свиньи, имеющих одинаковые редокс-потенциалы и гомологичные пространственные структуры, но отличающихся по количеству локализованных на поверхности остатков гистидина, а также карбоксиметилированного и мутантного МЬОг кашалота с заменой Hisl 19 на Asp показало, что для эффективного катализа необходимо специфическое связывание ферроцианидного аниона с белком в районе Hisl 19(GH1).

5. Избирательность комплексирования [FeiCN^]4" в районе Hisl 19 обусловлена большим локальным электростатическим потенциалом в этом участке поверхности миоглобина, а также наличием здесь полости подходящего размера для встраивания ферроцианидного аниона. Важную роль в образовании «активного» комплекса с реагентом играют не только электростатические, но и стерические взаимодействия, а также оптимальная динамика групп белка.

6. Показано, что связывание [Fe(CN)e]4 - необходимое, но недостаточное условие для эффективного катализа. Важнейшую роль играет также протонирование локализованных поблизости остатков Hisl 13 и Hisl 16, что, с одной стороны, способствует лучшему электростатическому связыванию анионного катализатора, а с другой, кинетически ускоряет реокисление связанного аниона [FefCN)^]4" растворенным кислородом за счет локализации обоих реагентов необходимого для этого протона в оптимальном для реакции положении.

7. В рамках общего сайт-специфического внешнесферного механизма переноса электрона молекулярные механизмы окисления оксимиоглобина в присутствии ионов меди и ферроцианида совершенно различны как по типу образующихся каталитических комплексов, так и по их локализации в структуре белка. Эффективность ферроцианидного катализа в кислой области рН (рН 5) в несколько раз выше (в среднем в 3-5 раз), чем медного; в нейтральной области, рН 6, она примерно одинакова (различается в 1.5-2 раза), а в щелочной области рН, напротив, катализ медью на порядок более эффективен, так как в этих условиях (T^CN)^4" практически не связывается.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шеховцова Е.А. Механизм окисления оксимиоглобина кашалота, катализируемого ионами меди. Биология- наука 21го века. 5м Пущинская конференция молодых ученых. 16-20 апреля 2001 г., стр. 70.

2. Шеховцова Е.А., Моисеева С.А., Постникова Г.Б. Окисление дыхательного белка-оксимиоглобина, катализируемое ионами и комплексами металлов: кинетика и механизм редокс-реакции в присутствии ферри- и ферроцианида калия. От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям. Труды конференции: Научные исследования в Наукоградах Московской области. 24-26 октября 2001 г., стр. 112.

3. Goraev E.V., Postnikova G.B., Moiseeva S.A., Shekhovtzova E.A. Oxidation of respiratory proteins by metals. Catalitic oxidation of oxymyoglobin by copper ions: kinetics and mechanism. Metal ions in biology and medicine, vol. 7. Eds. L. Khassanova, Ph. Collery, I. Maymard, Z. Khassanova, J.C. Etienne. John Libbey Eurotext, Paris, 2002, pp. 68-72.

4. Постникова Г.Б., Моисеева C.A., Шеховцова E.A., Сивожелезов B.C., Целикова С.В. Каталитический эффект ферри- и ферроцианида на перенос электрона в гемсодержащих белках: кинетика и механизм. III Съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж, т.1, стр 87.

5. Постникова Г.Б., Шеховцова Е.А., Моисеева С.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C. Каталитическое окисление оксимиоглобинов ионами меди. III съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж, т.1, стр. 88.

6. Шеховцова Е.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. Окисление оксимиоглобинов кашалота, лошади и свиньи, катализивуемое ионами ферроцианида: кинетика и механизм. Биофизика, 2005, т.50, № 1, с.39-48.

7. Шеховцова Е.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. Механизм катализируемого ионами ферроцианида окисления оксимиоглобина: химически модифицированный и мутантный миоглобины кашалота. Биофизика, 2005, т.50, 000 (в печати).

8. Шеховцова Е.А., Постникова Г.Б. Механизм окисления оксимиоглобина ионами меди: карбоксиметилированный и карбоксиамидированный по остаткам гистидина миоглобины. Биохимия, 2005, т.70, 000 (в печати).

Tf.

•ßT

Принято к исполнению 05/05/2005 Исполнено 06/05/2005

Заказ N» 841 Тираж' 75 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www autoreferat.ru

РНБ Русский ф0 2007-4

5703

19 ИЮН 200S.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шеховцова, Екатерина Александровна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Окислительно-восстановительные реакции гемсодержащих белков с ионами и комплексами металлов

2.1.1. Редокс-реакции гемсодержащих белков с комплексами железа а) Цитохром С б) Цитохром Ь в) Белки - переносчики кислорода: гемоглобин, миоглобин г) Леггемоглобин

2.1.2. Окисление гемсодержащих белков ионами и комплексами меди а) Цитохром С б) Цитохром Ь в) Белки - переносчики кислорода: гемоглобин, миоглобин г) Леггемоглобин

3. МАТЕРИАЛЫ Й МЕТОДЫ

3.1. Получение интактных, химически модифицированных и мутантных белков

3.2. Изоэлектрофокусирование

3.3. Спектрофотометрическое титрование

3.4. Кинетические измерения

3.5. Изучение локализации меди методом ЯМР высокого разрешения

3.6. Расчет распределения электростатического потенциала и впадин и полостей в миоглобиновой молекуле

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Механизм окисления МЬОг ионами и комплексами меди: миоглобины, карбоксиметилированный и карбоксиамидированный по гистидину

4.2. Окисление оксимиоглобина, катализируемое ферроцианидом: нативные оксимиоглобины кашалота, лошади и свиньи, карбоксиметилированный по остаткам гистидина и мутантный (Н1б1 19->Азр) оксимиоглобины кашалота

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Каталитическое окисление миоглобина солями и комплексами меди и железа: кинетика и механизм"

Миоглобин - мономерный гемсодержащий белок глобинового семейства переносчиков кислорода. В отличие от тетрамерного гемоглобина крови он отвечает за хранение внутриклеточного кислорода в мышцах и транспорт его от плазматической мембраны к клеточным митохондриям. Поддержание восстановленного состояния гемового комплекса в НЬОг и МЮ2 очень важно для их функционирования, так как окисленные мет-формы этих дыхательных белков не способны связывать кислород. Кроме того, окисление атома Fe гема является первой стадией денатурации гем-белков, так как сродство окисленного ферригема к глобину существенно меньше, чем восстановленного. В то же время в аэробной среде НЬОг и МЬОг могут самопроизвольно окисляться, особенно быстро при кислых рН, образуя мет-Mb и мет-Hb (автоокисление) [Shikama 1998; Brantley и др., 1993]. Показано также, что миоглобин и гемоглобин легко вступают в окислительно-восстановительные реакции с солями и комплексами различных металлов, из которых наибольший интерес для биологии представляют соединения железа и меди. Эти металлы участвуют во многих метаболических процессах в организме, а нарушение ионного гомеостаза может приводить к серьезным заболеваниям и даже смерти.

Железо в клетках животных, растений и бактерий является составной частью железо-серных кластеров и простетических гемовых групп важнейших ферментов, участвующих в процессах клеточного дыхания, азотфиксации и фотосинтеза, таких как каталазы, пероксидазы, и митохондриальные и микросомальные цитохромы -переносчики электрона. Медь также активно участвует в метаболизме в составе активных центров таких ферментов как азурины, пластоцианины, цитохром С-оксидаза и другие оксидазы. Механизм работы многих железо- и медьсодержащих ферментов, напрямую реагирующих с молекулярным кислородом, например, цитохром С-оксидазы митохондрий и цитохрома Р-450 микросом приводит к образованию активных форм кислорода, токсичных для биологических систем. В ряде работ продемонстрирована важная роль железа и меди в механизмах окислительного стресса.

Увеличивающееся загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами ведет в настоящее время к росту их концентрации во всех живых организмах и становится реальной угрозой их существования, включая человека [Hura и др., 2002]. Известно, что в аэробных условиях in vitro соединения переходных металлов, Си2+, Со3+ и Fe3+, в присутствии низкомолекулярных восстановителей способны претерпевать циклические редокс-превращения и служить центрами продукции активных форм кислорода, анион-радикала супероксида, О2", и НОг, а также перекиси водорода Н2О2 как конечного продукта их диспропордионирования [McCord и др., 1971]. Поскольку НЬОг и МЬОг, присутствующие в клетках в очень больших количествах, являются хорошими восстановителями соединений этих металлов, они могут непосредственно участвовать в таких процессах, что было показано на ряде модельных систем [Van Dyke и Saltman, 1996; Clopton и Saltman, 1997]. Например, эти белки способны активно восстанавливать комплекс Fe3+ с АТФ, а трансмембранный транспорт ионов Fe2+ в эритроцитах и ретикулоцитах коррелирует с восстановлением Fe3+ гемоглобином [Eguchi и Saltman, 1984; Egyed и др., 1980]. Важно отметить, что в редокс-реакциях металлокомплексов с участием НЬОг и МЬОг в отличие от таких реакций в присутствии низкомолекулярных восстановителей не обнаруживается активных форм кислорода, по-видимому, вследствие того, что мет-форма белка обладает высокой пероксидазной активностью.

Функционирование гемоглобина и миоглобина как восстановительных реагентов в биологических системах привлекает пристальное внимание исследователей, так как может быть важным в связи с выявлением роли клеточных белков в поддержании редокс-потенциала клетки и преодолении окислительного стресса [Hegetschweiler и др., 1987; Stadtman и Oliver, 1991]. Окисленные мет-Mb и мет-Hb могут быть снова восстановлены при помощи низкоспецифичных низкомолекулярных клеточных восстановителей, диафораз, и специализированных NADH-зависимых ферментов -мет-НЬ-редуктазы эритроцитов (NADH-Cyt Ь5-редуктазы) и мышечной мет-Mb -редуктазы. Компонентами мет-МЬ-редуктазной системы являются как Cyt bs мембран саркоплазматического ретикулума, так и близко родственный ему Cyt b внешней мембраны митохондрий [Arihara и др., 1995].

Особый интерес для биологии представляет процесс окисления НЬОг и МЬОг, катализируемый небольшими количествами ионов и комплексов двухвалентной меди [Rifkind, 1974; Rifkind и др.,1976; Христова и др., 1980 а,б]. В настоящее время этой реакции уделяется большое внимание, так как весьма вероятно, что она играет существенную роль в повреждении миокарда при ишемии и последующей реперфузии [Gunther и др., 1999]. Вследствие ацидоза в ишемированной ткани депонированная и связанная с белками Си2+ освобождается и может вступать в реакцию с миоглобином, в результате чего образуется мет-Mb и восстановленная медь [Berenshtein и др., 1997]. Реокисление же Си1+ кислородом приводит к образованию активных форм кислорода, которые оказывают повреждающее воздействие на ткань.

Катализируемый медью процесс окисления, как показано, протекает через • образование специфического комплекса реагента с белком, в котором участвуют остатки гистидина. Несмотря на то, что эти редокс-реакции изучаются уже более 30 лет, отсутствует представление о детальном, на молекулярном уровне, физическом механизме процесса. Остается неясной локализация гистидиновых остатков, связывающих медь с наибольшим сродством, эффективность различных комплексов в реакции переноса электрона от Fe тема, а также вклады этих комплексов в суммарную скорость окисления белка. Одной из причин, вероятно,является то, что объектом исследования был только Mb кашалота, в котором имеется 12 остатков гистидина, половина из которых локализованы на поверхности белка и способны с высоким сродством комплексировать медь.

Следует отметить, что до последнего времени было известно только окисление НЬОг и МЬОг, катализируемое соединениями Си с невысоким, порядка 100-150 mV, редокс-потенциалом (медный катализ). Было показано, что соединения других металлов, Ag, Mg, Mn, Со, Zn, Fe, Cr и т.д., с аналогичными редокс-потенциалами не катализируют процесс, но окисляют белки в присутствии избытка реагента. Считалось также, что эффективными катализаторами не могут быть сильные окислители, потенциал которых больше 400 mV, так как их восстановленные формы должны плохо реокисляться кислородом по термодинамическим соображениям.

Таким образом, наряду со своей основной функцией - обратимым связыванием Ог, миоглобин способен вступать в редокс-реакции с различными металлокомплексами, выступая в большинстве случаев в качестве восстановительного реагента. Эта его способность может играть существенную роль в функционировании организма, однако работы, посвященные выяснению механизмов редокс-реакций миоглобина с различными реагентами, весьма немногочисленны. К тому же анализ этих работ обнаруживает противоречивые утверждения разных авторов о механизме одних и тех же реакций и требует дополнительных исследований. В связи с этим актуальна задача детального изучения молекулярного механизма(ов) редокс-реакций оксимиоглобина с соединениями металлов, роли отдельных групп и структурных элементов белка в переносе заряда. Наиболее подходящими объектами для решения проблемы являются мономерные миоглобины.

Ранее нами было проведено сравнительное изучение кинетики катализируемого ионами Си2+ окисления МЬОг кашалота, лошади и свиньи [Моисеева, Постникова, 2001]. Эти белки имеют одинаковые редокс-потенциалы и гомологичны по пространственной структуре, но имеют разное количество остатков His, локализованных на поверхности и способных связывать медь («внутренние» гистидины у них инвариантны). Оказалось, что в одинаковых условиях, в присутствии эквимолярной концентрации Си2+, реакция в этих белках протекает по-разному. В случае МЮ2 свиньи наблюдается быстрое (за 2-3 мин) окисление только 10-15% от общего количества белка (быстрая фаза), которое н< е ощц споЪги-СЬэьи , сопровождается дальнейшим превращением в мет-МЬ остального белка. В случае же не сопровождается дальнейшим превращением в мет-МЬ ЬстальногЬ белка. В случае U МЬОг кашалота и лошади наблюдается гораздо более медленное окисление всего белка (катализ). То есть, механизм реакции зависит от того, с какими остатками His, локализованными на поверхности белка или же в гемовой полости, связывается катализатор.

Кроме того, нами впервые было обнаружено, что комплекс железа и сильный , ц а и окислитель - феррицианид калия является эффективным катализатором окисления МЬОг кашалота [Моисеева С.А. и др., 2001, а,б]. Показано, что механизм катализа включает специфическое связывание аниона ферроцианида" на поверхности белка в районе Hisl 19 „ ~ rc„/-r\n т4-. 1 и только связанный [Fe(CN)6] * в отличие от аниона в растворе приобретает способность быстро реокисляться кислородом, что необходимо для каталитического цикла. При ^ ■ g М ? , малых концентрациях феррицианида (5- 20% от концентрации белка) одновременно происходят два разных процесса - простой перенос электрона между реагентом и гемом и более медленное превращение МЬОг в мет-МЬ по каталитическому пути. О 2 ^ Проанализирована кинетическая схема реакции и определены^еравновесные и ^ кинетические параметры. • ^ ^^CscfiC iU

Гч & г\ Цели и задачи работы. В данной работе продолжено исследование молекулярного v механизма редокс- реакций миоглобина, катализируемых металлами. С этой целью г^ изучено окисление нативного МЬОг кашалота, его химически модифицированных производных, алкилированных по всем доступным гистидинам бромацетатом натрия 2+ + X) (СМ-МЬОг) и иодацетамидом (СА-МЬОг), в присутствии Си , Cu(GIy) и Cu(Gly)2. Кроме того, изучено катализируемое ферроцианидом окисление нативных МЬОг кашалота лошади и свиньи, СМ-МЬОг и мутантного МЬОг кашалота (His 119—>Asp). Бьши поставлены следующие задачи:

1. Спектрофотометрически исследовать кинетику окисления нативного МЬОг, карбоксиметилированного СМ-МЬОг и карбоксиамидированного СА-МЬОг кашалота в зависимости от концентрации Си2+, Си(С1у)+ и Си(01у)г, рН и ионной 2+ ^ силы среды, а также влияние на скорость реакции редокс-неактивных ионов Ъх\ ,

2. Методом ЯМР высокого разрешения проанализировать локализацию Си(01у)г в

Л' pi г> Ч конкурирующих с медью за связывание с гистидинами. Методом ЯМР высокого разрешения проанализировать нативном мет-МЬ кашалота, мет-МЬ лошади и СМ-мет-МЬ.

3. Изучить кинетику катализируемого ферроцианидом окисления нативных МЬОг кашалота лошади и свиньи, СМ-МЬОг и [МЬС^Шэ 119—>Азр)] кашалота в широком диапазоне условий рН и ионной силы среды, концентрации катализатора, а также при комплексировании МЬОг с конкурентным редокс-неактивным ионом цинка.

4. Проанализировать распределение электростатического потенциала на поверхности нативных МЬОг кашалота лошади и свиньи, а также [МЬОг(Н1з

119-»Азр)] при разных значениях рН в интервале рН 5 -8 на расстоянии 0.55 нм отбелка.

5. Расчитать и локализовать возможные впадины и полости на поверхности исследуемых миоглобинов, способные адаптировать анион ферроцианида.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шеховцова, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ

1. Изучение спектрофотометрической кинетики окисления ионами и глициновыми комплексами двухвалентной меди разных оксимиоглобинов, нативного МЮ2 кашалота и его производных, алкилированных по доступным растворителю гистидинам бромацетатом натрия и иодацетамидом, а также изучение локализации в них Cu(Gly)2 методом ЯМР высокого разрешения показало, что процесс превращеия МЬОг в окисленную мет-форму протекает по сайт-специфическому механизму переноса электрона через предварительное связывание реагента с гистидинами.

2. Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что комплексирование меди с остатками His 12, His48, His81, Hisl 13, Hisl 16 и His 119, локализованными на поверхности белка (все шесть расположены на расстоянии 1.8-2.7 нм от гема), вносит лишь незначительный вклад в суммарную скорость процесса, не более 35%, в особенности в условиях большого, более 8-10 - кратного, избытка реагента. Заметный вклад остатков Hisl 13, Hisl 16 и His48, имеющих по данным ЯМР наибольшее сродство к меди, проявляется лишь при малых концентрациях реагента, до ~ 5-кратного молярного избытка по отношению к белку, на что указывает сигмоидная кривая рН-зависимости с рК перехода 6.5-6.7.

3. Основной вклад в скорость изучаемой реакции должно вносить комплексирование меди с «внутренними» гистидинами, His97 (0.66 нм от гема), образующим Н-связь с СОО'-группой гемового пропионата, и дистальным His64, сродство которых к меди существенно меньше, чем «поверхностных» гистидинов, и которые недоступны для модификации химическими реагентами.

Избирательность комплексирования [Fe(CN)6]4* в районе Hisl 19 обусловлена большим локальным электростатическим потенциалом в этом участке поверхности миоглобина, а также наличием здесь полости подходящего размера для встраивания ферроцианидного аниона. Важную роль в образовании «активного» комплекса с реагентом играют не только электростатические, но и стерические взаимодействия, а также оптимальная динамика групп белка.

Показано, что связывание [Fe(CN)6]4* необходимое, но недостаточное условие для эффективного катализа. Важнейшую роль играет также протонирование локализованных поблизости остатков Hisl 13 и Hisl 16, что, с одной стороны, способствует лучшему электростатическому связыванию анионного катализатора, а с другой, кинетически ускоряет реокисление связанного аниона [Fe(CN)6]4* растворенным кислородом за счет локализации обоих реагентов необходимого для этого протона в оптимальном для реакции положении.

В рамках общего сайт-специфического внешнесферного механизма переноса электрона молекулярные механизмы окисления оксимиоглобина в присутствии ионов' меди и ферроцианида совершенно различны как по типу образующихся каталитических комплексов, так и по их локализации в структуре белка. Эффективность ферроцианидного катализа в кислой области рН (рН 5) в несколько раз выше (в среднем в 3-5 раз), чем медного; в нейтральной области, рН 6, она примерно одинакова (различается в 1.5-2 раза), а в щелочной области рН, напротив, катализ медью на порядок более эффективен, так как в этих условиях [Fe(CN)6]4* практически не связывается.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шеховцова, Екатерина Александровна, Пущино

1. Арутюнян Э.Г., Сафонова Т.Н., Обмолова Г.В., Тепляков А.В., Попов А.Н., Русаков А.А., Рубинский С.В., Куранова И.П., Вайнштейн Б.К. Кристаллическая структура оксилеггемоглобина при разрешении 1.7 А. Биоорган. Химия., 1990,16,293- 302.

2. Комаров Ю.Е., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. Применимость моделейэлектростатического взаимодействия молекул к описанию зависимости скорости реакции между миоглобином и цитохромом С от ионной силы. Биофизика, 1998, 43,16-25.

3. Моисеева С.А., Постникова Г.Б., Сивожелезов B.C. Окисление оксимиоглобина кашалота, ~ —катализируемое ионами ферроцианида: кинетика и механизм.-Биофизика, 2000,45,10191028.

4. Моисеева С.А., Постникова Г.Б. Механизм окисления оксимиоглобина ионами меди: сравнение миоглобинов кашалота, лошади и свиньи. Биохимия, 2001 а, 66(7), 959- 967.

5. Моисеева С.А., Постникова Г.Б., Сивожелезов B.C. Кинетика и механизм окисленияоксимиоглобина, катализируемого ферроцианидом калия. Биофизическая химия, 2001 б, 75(8), 1504- 1510.

6. Постникова Г.Б., Целикова С.В. Изучение переноса электрона.в гемопротеинах. IX. Влияние ионов цинка на скорость окисления окси-Mb феррицитохромом С. Молекуляр. биология, 1987,21,1040-1049.

7. Постникова Г.Б., Целикова С.В., Сивожелезов B.C. Изучение переноса электрона вгемопротеинах. X. Влияние рН, ионной силы и ионов цинка на скорость восстановления феррицитохрома С оксимиоглобином из сердца свиньи; Молекуляр. биология, 1992,26, 880-890.

8. Христова П.К., Деведжиев Я Д., Атанасов Б П., Волькенштейн М.В. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. IV. Катализируемое ионами меди окисление оксимиоглобина кашалота. Молекуляр. биология, 1980 а, 14,1088-1097.

9. Христова П.К., Атанасов Б П. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. III. Физико-химическая характеристика автоокисления оксимиоглобина кашалота. Молекуляр. биология, 1980 б, 14, 86-93.

10. Ahmed A. J., Millett F. Use of specific lysine modifications to identify the site of reaction between cytochrome С and ferricyanide. J. Biol. Chem., 1981,256,1611-1615.

11. Antonini E., Brunori M., Wyman J. Studies on the oxidation-reduction potentials of heme proteins. IV. The kinetics of oxidation of hemoglobin and myoglobin by ferricyanide. Biochemistry, 1965,4,545-551.

12. Antonini E., Brunori M. Hemoglobin and myoglobin in their reactions with ligands. AmsterdamLondon: Front Biol., 1971.

13. Arihara K., Cassens R.G., Greaser M.L., Luchansky J.B., Mozdziak P.E. Localization of metmyoglobin-reducing enzyme (NADH-cytochrome bs reductase) system components in bovine skeletal muscle. Meat Science, 1995,39,205-213.

14. Arnesano F., Banci L., Bertini I., Felli I.C.The solution structure of oxidized rat microsomal cytochrome bs. Biochemistry, 1998,37(1), 173-184.

15. Augustin M.A., Yandell J.K. Oxidation of heme proteins by copper(ll) complexes. Rates and mechanism of the copper catalysed autoxidation of cytochrome C, myoglobin and hemoglobin. Inorg. Chim. Acta, \919,37,11-18.

16. Bashford D., Case D.A., Dalvit C., Tennant L., Wright P.E. Electrostatic calculations of side- chain pK values in myoglobin and comparison with NMR data for histidines. Biochemistry, 1993,32, 8045-8056.

17. Bakan D.A., Saltman P., Theriault Y., Wright P.E. Kinetics and mechanisms of reduction of Cu(2) and Fe(3) complexes by soybean leghemoglobin a. Biochimica et Biophysica Acta, 1991,1079, 182-196.

18. Banaszak L.J, Watson H.C., Kendrew J.C. The binding of cupric and zinc ions to crystalline sperm whale myoglobin. J. Mot Biol., 1965,12,130-137.

19. Berenshtein E., Mayer B., Goldberg C., Kitrossky N., Chevion M. Patterns of mobilization of copper and iron following myocardial ischemia: possible predictive criteria for tissue injury. J. Mol. Cell. Cardiol., 1997,29,3025-3034.

20. Botelho L.H., Gurd F.R.N. Proton nuclear magnetic resonanse study of histidine ionization in myoglobins of various species. Specific assignment of individual resonances. Biochemistry, 1978, 17,5188-5196.

21. Brandt K.G., Parks P.C., Czerlinski G.H., Hess G.P. On the elucidation of the pH dependence of the oxidation-reduction potential of cytochrome C at alkaline pH. J. Biol. Chem., 1966,241,41804185.

22. Brantley R.E., Smerdon S.J., Wilkinson A.J., Singleton E.W., Olson J.S. The mechanism of autooxidation of myoglobin. J. Biol. Chem., 1993,268, 6995-7010.

23. Brunori M., Saggese U., Rotilio G.C., Antonini E., Wyman J. Redox equilibrium of sperm-whale myoglobin, Aplysia myoglobin, and Chironomus thummi hemoglobin. Biochemistry, 1971,10, 1604-1609.

24. Breslow E., Gurd F.R.N. Interaction of cupric and zinc ions with sperm whale metmyoglobin. J. Biol. Chem., 1963,238,1332-1342.

25. Buckingham D.A., Sargeson A.M. In: Chelating agents and metal chelated. Dwyer F.P., Mellor D.P., Eds.; Academic: New York, 1964,237-282.

26. Butler J., Davies D.M., Sykes A.G., Koppenol W.H., Osheroff N., Margoliash E. Use of singly modified cytochrome C derivatives to determine the site for electron transfer in reactions with inorganic complexes. J. Am. Chem. Soc., 1981 a, 103,469-471.

27. Butler J., Davies D.M., Sykes A.G. Kinetic data for redox reactions of cytochrome C with Fe(CN)sX complexes and the question of association prior to electron transfer. J. Inorg. Biochem., 1981 6,15,41-53.

28. Butler J., Chapman S.K., Davies D.M., Sykes A.G., Speck S.H., Osheroff N., Margoliash E. Preferred sites for electron transfer between cytochrome C and iron and cobalt complexes. J. Biol. Chem., 1983,258, 6400-6404.

29. Carver J.A., Bradbury J.H. Assignment of *H NMR resonances of histidine and other aromatic residues in met-, cyano-, oxy- and (carbon monoxy)myoglobins. Biochemistry, 1984,23,48904905.

30. Cassatt J.C., Marini C.P. The kinetics of oxidation of reduced cytochrome C by ferricyanide derivatives. Biochemistry, 1974,13, 5323-5328.

31. Cassatt J.C., Marini C.P., Bender J.W. The reversible reduction of horse metmyoglobin by the iron(II) complex of 1,2-diaminocyclohexane-iV,A'',N'//'-tetraacetate. Biochemistry, 1975, 14, 5470-5475.

32. Chang A.M., Austin R.H. Electron tunneling in cytochrome C. J. Chem. Phys., 1982, 77,52725283.

33. Bioorganic Chemistry (van Tamelen E.E., ed.), New York: Academic Press, 1978,4,117-146. Davison A.J. Kinetics of the copper-histidine catalysis of ferrocytochrome С oxidation. J. Biol.

34. Chem., 1968,243,6064-6067. Davison A. J., Hamilton R.T. Stimulation of cytochrome С oxidation by a copper citrate complex.

35. Arch. Biochem. Biophys., 1968,126,228-231. Dickerson R.E., Timkovich R. In: The enzymes (Boyer P.D., ed.), London: Academic Press, 1975, 11,397-547.

36. Dunn C.J., Rohlfs R.J., Fee J.A., Saltman P. Oxidation of deoxymyoglobin by Fe(CN)6.3*. J. Inorg.

37. Biochem., 1999,75,241-244 Eguchi L.A., Saltman P. The aerobic reduction of Fe(III) complexes by hemoglobin and myoglobin.

38. Garvan F.L. In: Chelating agents and metal chelates. Dwyer F.P., Mellor D.P., Eds.; Academic: New York, 1964,283-333.

39. Goucher C.R., Taylor J.F. Compounds of ferric iron with adenosine triphosphate and other nucleoside phosphates. J. Biol. Chem., 1964,239(7), 2251-2255.

40. Guex N., Diemand A., Peitsch M.C. Protein modelling for all. Trends Biochem. Sci. 1999,24(9), 364-367.

41. Gunther M.R., Sampath V., Caughey W.S. Potential roles of myoglobin autoxidation in myocardial ischemia-reperfusion injury. Free Radic. Biol. Med., 1999,26 (11/12), 1388-1395.

42. Harrington J.P., Hicks R.L. Spectral analysis of Fe (III) complex reduction by hemoglobin: possible mechanisms of interaction. Int. J. Biochem., 1994,26(9), 1111-1117.

43. Hartzell C.R., Hardman K.D., Gillspie J.M., Gurd F.R.N. Reversible disruption by cupric ions of myoglobin and its carboxamidomethyl derivative. J. Biol. Chem., 1967,242,47-53.

44. Hegetschweiler K., Saltman P., Dalvit C., and Wright P.E. Kinetics and mechanisms of the oxidation of myoglobin by Fe(III) and Cu(II) complexes. Biochim. Biophys. Acta, 1987,912, 384-397.

45. Hodges H.L., Holwerda R.A., Gray H.B. Kinetic studies of the reduction ferricytochrome C by Fe(EDTA)2". J. Amer. Chem. Soc., 1974,96,3132-3137.

46. Hughes M.N. In: The inorganic chemistry of biological processes. Wiley: New York, 1981, 125187.

47. Jameson R.F. Coordination chemistry of copper with regard to biological systems. In: Metal ions in biological systems (Sigel H., ed.), New York: Marcel Dekker, 1981,1-30.

48. Keyes S.R., Cinti D.L. Biochemical properties of cytochrome bs- dependent microsomal fatty acid elongation and identification of products. J. Biol. Chem., 1980,255,11357-11364.

49. Kihara H., Nakatani H., Hiromi K., Hon-Nami K., Oshima T. Kinetic studies on redox reactions of hemoproteins I. Reduction of thermoresistant cytochrome C-552 and horse heart cytochrome C by ferrocyanide. Biochim. Biophys. Acta, 1977,460,480-489.

50. Kihara H. Comparison of the redox reactions of various types of cytochrome C with iron hexacyanides. Biochim. Biophys. Acta, 1981,634, 93-104.

51. Koradi R., Billeter M., Wuthrich K.J. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J. Mol. Graphics, 1996,14, 51-55.

52. Kozutsumi Y., Kawano T., Yamakawa T., Suruki A. Participation of cytochrome b5 in CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylation in mouse liver cytosol. J. Biochem. 1990,108,704-706.

53. Marcus R.A., Sutin N. Electron transfers in chemistry and biology. Biochim. Biophys. Acta, 1985, 811,265-322.

54. Mauk A.G., Scott R.A., Gray H.B. Distances of electron transfer to and from metalloprotein redox sites in reactions with inorganic complexes. J. Am. Chem. Soc., 1979,102,4360-4363.

55. Margalit R., Pecht I., Gray H.B. Oxidation-reduction catalytic activity of a pentaammineruthenium (III) derivative of sperm whale myoglobin. J. Amer. Chem. Soc., 1983,105,301-302.

56. Matheus F.S., Levine M., Argos P. Three-dimensional fourier synthesis of calf liver cytochrome bs at 2.8 a resolution. J. Biol. Chem., 1972, 64,449-464.

57. McCray J. A., Kihara T. Rates of reduced cytochrome C-ferricyanide binding and electron transfer. Biochim. Biophys. Acta, 1979,548,417-426.

58. McCord J.M., Keele B.B., Fridovich I. An enzime- based theory of obligate anaerobiosis: the physiological function of superoxide dismutase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1971,68(5), 1024-1027.

59. Margalit R., Pecht I., Gray H.B. Oxidation-reduction catalytic activity of a pentaammineruthenium (III) derivative of sperm whale myoglobin. J. Amer. Chem. Soc., 1983,105,301-302.

60. Martell A.E. In: Critical stability constants. Plenum: New York, 1982,1-5.

61. Martell A.E. In: Development of iron chelators for clinical use. (Martell A.E., Anderson W.F., Badman D.G., eds.), Elsevier / North Holland, New York, 1981, 67-104.

62. McArdle J. V., Gray H.B., Creutz C., Sutin N. Kinetic studies of the oxidation of ferrocytochrome C from horse heart and Candida krusei by tris(l,10-phenanthroline)cobalt(III). J. Am. Chem. Soc., 1974,96,5737-5741.

63. Miller W.G., Cusanovich M.A. Electron transport by C-type cytochromes. I. The reaction of horse heart cytochrome C with anionic reductants. Biophys. Struct. Mech., 1975,1,97-111.

64. Morton R.A., Overnell J., Harbury H.A. Electron transfer between cytochromes C from horse and Pseudomonas. J. Biol. Chem.,1970,245,4653-4657.

65. Mauk A.G., Scott R.A., Gray H.B. Distances of electron transfer to and from metalloprotein redox sites in reactions with inorganic complexes. J. Am. Chem. Soc., 1980,102,4360-4363.

66. Muskett F.W., Kelly G.P., Whitford D.The solution structure of bovine ferricytochrome bs determined using heteronuclear NMR methods. J. Mol. Biol, 1996,258,172-189.

67. Nigen A.M., Gurd F.R.N. Comparison of carboxymethylation patterns of harbor seal and sperm whale myoglobins. J. Biol. Chem.,1973,248,3708-3715.

68. Oaekley B.R., Kirsch D.R., Morris N.R. A simplifed ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrilamide gels. Anal. Biochem., 1980,105,361-366.

69. Ohno N., Cusanovich M.A. Reaction of C-type cytochromes with the iron hexacyanides. Biophys. J., 1981,36,589-605.

70. Peterman B.F., Morton R.A. The oxidation of ferrocytochrome C in nonbinding buffer. Can. J. Biochem., 1977,55,796-803.

71. Polozov R.V., Dzhelyadin T.R., Sorokin A.A., Ivanova N.N., Sivozhelezov V.S., Kamzolova S.G. Electrostatic potentials of DNA. Comparative analysis of promoter and nonpromoter nucleotide sequences. J. Biomol. Struct., Dyn. 1999,16,1135- 1143.

72. Postnikova G.B., Komarov Yu.E., Yumakova E.M. Fluorescence study of the conformational properties of myoglobin structure. II. pH- and ligand-induced conformational changes in ferric and ferrous myoglobins. Eur. J. Biochem., 1991,198,233-239.

73. Poulos T.L. Mauk A.G. Models for complexes formed between cytochrome bs and subunits of methemoglobin. J. Biol Chem., 1983,258,7369-7373.

74. Reid L.S., Mauk A.G. Kinetic analysis of cytochrome bs reduction by Fe(EDTA)2". J. Am. Chem. Soc., 1982,104, 841-845.

75. Reid L.S., Gray H.B., Dalvit C., Wright P.E., Saltman P. Electron transfer from cytochrome bs to iron and copper complexes. Biochemistry, 1987,26, 7102-7107.

76. Ragg E., Moore G.R. Association constants for metal hexacyanide binding to cytochrome C.

77. J. Inorg. Biochem., 1984,21,253-261.

78. Rifkind J.M. Copper and the autoxidation of hemoglobin. Biochemistry, 1974,13(12), 2475-2481.

79. Rifkind J.M., Lauer L.D., Chiang S.C., Li N.C. Copper and the oxidation of hemoglobin: acomparison of horse and human hemoglobins. Biochemistry, 1976,15(24), 5337-5343.

80. Rifkind J.M. Oxidation of (horse) hemoglobin by copper: an intermediate detected by electron spin resonance. Biochemistry, 1979,18,3860-3865.

81. Rifkind J.M. Copper and the oxidation of hemoglobin. In: Metal ions in biological systems (Sigel H., ed.), New York: Marcel Dekker, 1981,12, 192-232.

82. Rousseaux J., Dautrevaux M., Han K. Comparison of the amino acid sequence of pig heart myoglobin with other ungulate myoglobins. Biochim. Biophys. Acta, 1976,439,55-62.

83. Shikama K. The molecular mechanism of autoxidation for myoglobin and hemoglobin: a venerablepuzzle. Chem. -Rev., 1998,98,1357- 1373.

84. Sivozhelezov V.S. Modelling electrostatic interactions in proteins. Abstr of Int Conf. CSAM-93, St.-Petersburg, 1993, p.131.

85. Springer B.A., Sligar S.G. High-level expression of sperm whale myoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987,84, 8961- 8965.

86. Stadtman E.R., Oliver C.N. Metal-catalyzed oxidation of proteins. J. Biol. Chem., 1991,266,20052008.

87. Stellwagen E., Shulman R.G. Nuclear magnetic resonance study of the rate of electron transfer between cytochrome C and iron hexacyanides. JMol. Biol., 1973,80, 559-573.

88. Stellwagen E., Cass R.D. Complexation of iron hexacyanides by cytochrome C. Evidence for electron exchange at the exposed heme edge. J. Biol. Chem., 1975,250,2095-2098.

89. Sutin N., Christman D.R. The rate of oxidation of cytochrome C by ferricyanide ions. J. Am. Chem. Soc., 1961, 83,1773-1774.

90. Wei J.-F., Ryan M.D. The reduction of cytochrome C by iron EDTA-like complexes: implications on charge effect corrections to mediator-protein rate constants. J. Inorg. Biochem., 1982,17, 237-246.

91. Wherland S., Gray H.B. Metalloprotein electron transfer reactions: analysis of reactivity of horse heart cytochrome C with inorganic complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976,73,29502954.

92. Williams G., Eley C.G.S., Moore G.R., Robinson M.N., Williams R.J.P. The reaction of cytochrome C with Fe (EDTA)(H20).". FEBS Letters, 1982,150,293-299.

93. Williams G., Moore G.R. Reactions of mitochondrial cytochrome C with iron-polyaminocarboxylate complexes. J. Inorg. Biochem., 1984,22, 1-10.

94. Winterbourn C.C., Carrell R.W. Oxidation of human haemoglobin by copper. Mechanism and suggested role of the thiol group of residue 0-93. Biochem. J., 1977,165,141-148.

95. Yamada T., Marini C.P., Cassatt J.C. Oxidation-reduction reactions of hemoglobin A, hemoglobin M Iwate, and hemoglobin M Hyde Park. Biochemistry, 1978,17,231-236.

96. Yamazaki I., Yokota K., Shikama K. Preparation of cristalline oxymyoglobin from horse heart. J. Biol Chem., 1964,239,4151-4153.

97. Zabinski R.M., Tatti K., Czerlinski G.H. On the electron transfer reaction between ferricytochrome C and ferrohexacyanide in the pH range 5 to 7. J. Biol. Chem., 1974,249,6125-6129.

98. Zhang B.-J., Andrew C.R., Tomkinson N.P., Sykes A.G. Reactivity patterns for redox reactions of monomer forms of myoglobin, hemocyanin and hemerythrin. Biochim. Biophys. Acta, 1992 a, 1102,245-252.

99. Zhang B.-J., Smerdon S.J., Wilkinson A.J., Sykes A.G. Oxidation of residue 45 mutant forms of pig deoxymyoglobin with Fe(CN)6.3". J. Inorg. Biochem., 1992 6,48,79-84.

100. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

101. Шеховцова Е.А. Механизм окисления оксимиоглобина кашалота, катализируемого ионами меди. Биология- наука 21го века. 5м Путинская конференция молодых ученых. 16-20 апреля 2001 г., стр. 70.

102. Постникова Г.Б., Шеховцова Е.А., Моисеева С.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C. Каталитическое окисление оксимиоглобинов ионами меди. III съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж, стр. 88, Т.1.

103. Шеховцова Е.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. Окисление оксимиоглобинов кашалота, лошади и свиньи, катализивуемое ионами ферроцианида: кинетика и механизм. Биофизика, 2005, т.50, № 1, с.39-48.

104. Шеховцова Е.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. Механизм катализируемого ионами ферроцианида окисления оксимиоглобина: химически модифицированный и мутантный миоглобины кашалота. Биофизика, 2005, т.50,000 (в печати).

105. Шеховцова Е.А., Постникова Г.Б. Механизм окисления оксимиоглобина ионами меди: карбоксиметилированный и карбоксиамидированный по остаткам гистидина миоглобины. Биохимия, 2005, т.70, 000 (в печати).861. БЛАГОДАРНОСТИ

106. Данная работа проведена в лаборатории структуры и функции редокс-белков Института биофизики клетки РАН.

107. Хочу выразить глубокую признательность моим коллегам и друзьям за помощь в работе и моральную поддержку.

Информация о работе

Шеховцова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Каталитическое окисление миоглобина солями и комплексами меди и железа: кинетика и механизм - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы