Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перекисное окисление липидов и биосинтез тестотерона в семенниках крыс при острой и хронической алкогольной интоксикации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Перекисное окисление липидов и биосинтез тестотерона в семенниках крыс при острой и хронической алкогольной интоксикации"

Смоленский государственный медицинский институт

На правах рукописи

КАЖО Маргарита Феликсовна

Перекисное окисление лшшдов и биосинтез тестостерона в семенниках крыс при острой и хронической алкогольной интоксикации

СВ.00.04 - Биошмия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически! наук

СМОЛЕНСК - 1994

Рпботя выполнена в Институте биохимии АН Беларуси

Научшй руководитель: кандидат медицинских наук,

ст.н.с. A.M. Хоха

01ициапьин9 оппоненты: Доктор биологических наук

ТреОухина P.D.

Кандидат меллштнских наук Мелосов О.Г.

Водущая организация: Институт питания АМНР

Зашла состоится 1ЭЭ4 г. В £i£^4RCOB

нв заседании специализированного'Оорчта к OP4.34.OI по присуг-денто ученой стопяни канлицта Айологическкх ипук в Смэлрнгком государственном медицинском пппиш«, ГФ, г. Счояши'и, ул. Крупской, Р,8.

О дассиртицией коюю ознакомиться п (5»1*лиотеке Рм>.у!яж;крп> Г0(:ули)»'ТН01Ш0|ч' уиглчингкого института.

Аиторефорпт рарослпн " .................ТР94 г.

XWIMR fnKptT4pt,

опчцимк:-.*щюр£>!П!огс) .Сойота

lipC'ItHICOp

5«г(1?|;цук Н.Ф,

Актуальность темы. Введение этанола в организм животных и человека сопровождается нарушением гормонообразующей функции семенников (Badr F.И. et al.1977; Eriksson С.J.P. et al.. 1983). Если при однократном введении это состояние носит транзиторный характер, то в заключительных стадиях хронической интоксикации развивается алкогольный гипогонадизм со всеми характерными проявлениями - атрофией гонад, нарушением сперматогенеза, бесплодием, феминизацией, импотенцией (Van Thlel D.H.,1975). Злоупотребление алкоголем, принимащее все Солее широкомасштабный характер, обусловливает необходимость изучения Механизмов гонадоток-сичности этанола и поиска эффективных средств ее профилактики и коррекции.

В какой-то мере, действие этилового спирта обусловлено его нейрохимическими и нейроэндокринными эффектами, приводящий к сникению тропной стимуляции клеток Лейдига (Cicero Г.J. et al.,1977; Cicero T.J. et al.,1979). Показано, однако, что индуцируемое этанолом угнетение биосинтеза тестостерона отмечается, таккэ, в системах 1л rltro - в препаратах микросом, культуре клеток Лейдига, в модели перфузируемОГо органа (Cobb С.F. et al., 1980; Gordon G.G. "et аГ.,.1900); Это доказывает наличие собственной активности у данного соединения 1л situ. В качестве возможных механизмов обсуждается роль изменения окислительно-восстановительного потенциала клеток семенников (Cicero T.J. et al.,19Ô3), прямого • говреадаицего действия этанола и продукта его метаболизма - ацетальдегида - на ферменты стероидогенеза (Àndersaon S.H.G., 1986).

В то же время, известно, что введение этанола усиливает образование свободных радикалов и процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени и ряде других органов (Ta&lno T. et al., 1988; líujdot U. et al., 1986). Считается ,что эффект обусловлен не этанолом, который проявляет антиоксид'антные свойства, а продуктами его окисления, один из механизмов образования которых состоит в функционировании мякросомальюй этанолокисляицей системы. Недавно, наличие последней было показано в клетках ЛейДига (Нигопо В.F. et al., 1987). Входящий в ее состав циroiром P^gg чрезвычайно эффективен в индукции НАДФ-зависим'ого ЮЛ (Ceorglon M. et al.,1987). Это означает, что образование свободно-радикальных продуктов моют интенсифицироваться в клеточном компартменге, где осущиспаяются конечные этапы биосинтеза тес-

тостерона. Известно, что эти продукты могут угнетать биосинтез гормона (Tyopponen J.Г.,1987). В то и время, свободно-радикалыше продукты вовлечены в нормальный каталитический акт и регуляцию активности ряда ферментов стероидогенеза (Georgion И. et al.,1987). Поэтому, логично допустить, что всякое изменение скорости этих процессов, может приводить к нарушению образования стероидов.

Таким образом, изучение взаимоотношений процессов биосинтеза тестостерона и переписного окисления липидов при алкогольной интоксикации перспективны в плане поиска механизма повреждения этанолом гормонообразупцей функции семенников.

Цель работы. Целью настоящего исследования являлся анализ состояния ПОЛ при алкогольной интоксикации в семенниках и оценка его роли, как возможного фактора, опосредующего угнетение биосинтеза тестостерона этанолом.

Основными задачами работа были:

- иэучеиие влияния острой и хронической алкогольной интоксикации ва функциональную активность семенников и процессы ПОЛ;

- исследование влияния индукции перекисного окисления липидов на биосинтев стероидных гормонов в организме крыс;

- изучение взаимоотношений процесоов биосинтеза тестостерона и перекисного окисления липидов в модельных системах In vitro;

- изучение влияния витаминов А и Е, обладающих онтиокси-дантными свойствами, на показатели функциональной активности семенников при алкогольной интоксикации.

. *

Научная новизна. 6 работе впервые проведено комплексное изучение особенностей биосинтеза тестостерона при алкогольной интоксикации. Установлено, что наиболее чувствительным к действию этанола этапом является превращение Зр-ОН-Б-ен- стероидов в З-оксо-4-ен-староида, катализируемое ЭР- гидроксиствроиддчгидро-г^назойЧизсмеразой (К.Ф. 5.3.3.1.). Продемонстрировано, что этот феномен обусловлен скорее изменением структуры фермента, или его лилидного окружения,чем смещением при окксл-знии этчиоля осютпо-иенмн НАД'Н/Л'И.

Впервые охарактеризованы особенности перекисного окисления липидов при острой и хронической алкогольной интоксикации. Спектр формирующихся нарушений сопоставлен со сдвигаул в реакциях стероидагенеза. Выявленные закономерности проверены в модельных ситуациях Ln vitro. Это позволило впервые сформулировать тезис о том, что индукция ПОЛ при алкогольной интоксикации является одним из факторов, обусловливающих угнетение биосинтеза тестостерона.

Практическая значимость. Получены новые сведения, расан-ряпцие существующие представления о состоянии регуляции биосинтеза тестостерона в организме вквотшх н механизме гонадотокси-ческого действия этанола.

Выяснение роли перекисного окисления липидов в механизме ингибирущего действия этанола на стероидогенеа позволяет целенаправленно подойти к поиску способов профилактики и коррекция алкогольного гипогонадизма. В основу могут лечь .полученные сведения об особенностях действия на фона алкогольной интоксикации природных антиоксидантов - витаминов А и Е.

Разработана эффективная хроматографяческая система разделения интермедиатов стероидогенеза, что ногот быть использовано в практике биохимических исследований для изучения отдельных стадий этого процесса в семенниках.

Основные положения, Еыносшше на защиту.

1. Острая и хроническая алкогольная интоксикация у крыс приводит к нарушении биосинтеза тестостерона.

2. Наиболее чувствительным к действии этанола ышш является превращение 3(з-0Н-5-ен-стероидов и З-оксо-4-ен-стероиды, катализируемое Зэ- гид рок ся ст ерсвдде гидрог е и а зой/ изомеразой.

3. Введете этанола в opiанизм крас усиливает переписное окисление липидов в семенниках.

4. Индукция ПОЛ при алкогольной интоксикации является одним нз факторов в механизме угнетения биосинтеза тестостерона.

Апробация работа. Материалы диссертации били представлены Я обсуждены на 7-ой Гродненской областной конференции молоди! ученых И специалисток "Молодежь и научно-технический прогресс"

(Гродно, 1990), Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991). Международной конференции, посвященной 35-летию Гродненского медицинского института (Гродно, 1993), совместных заседаниях лабораторий Института биохимии АН Беларуси и кафедры биохимии Гродненского государственного медицинского института (1992, 1993).

Публикации. По томе диссертации опубликовано 6 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, списка литературы (216 источников) Работа изложена на 232 страницах текста, иллюстрирована 23 р> сунками, содержит 8 таблиц.

Матервалы и методы доследования.

Все экспериментальные исследования выполнены на беспородных белых крысах самцах массой 150 - 2Б0 г., содержавшихся (ва исключением опыта с хронической алкогольной интоксикацией) на обычном рационе вивария. Для того, чтобы исключить влияние циркадных ритмов на исследуемые показатели эвтаназия животных осуществлялась в одно и то же время суток - в 9-10 часов утра в осенне-зимний период.

Основные ЁКапермантаиш НОДЭЛИ. Острую алкогольную интоксикацию вызывали внутрибршинным введением 20* (в/о) этанола в дозе 3,5 г/кг массы тела (Островский D.H., 1968). Для устранения влияния высших уровней эндокринной регуляции часть воздействий проводилась на фоне блокирования рецепторов лютеинизирупцэго гормона хорноннческим гонадотропином человека (ХГЧ). Последний вводился подкокно в дозе 400 ИЕ/кг массы одномоментно с основным еф1юктором. В ряде экспериментов острая алкогольная интоксикация про-водалась на фоне предварительного введения витаминов А нл»: Б.

Введете витамина Е осуществляли в двух режимах. В первом животные в течение 10 дней один раз в сутки получали через рот 30* раствор токоферол ацетата в дозе 100 мг/кг массы. Во второй модели группе к рис под легким афиршм наркозом вводили г один из семошгиков 3 мкл ЭС» токоферол ацетате, в другой- г мкл оливкового масла.

Витетжн А вводили через рот по схомо - мг/кг масон t

сутки в пэрвнэ три дня и 6 нг/кг - в после дупгае четыре.

Хроническую алкоголизацию осушествляли с помощью жидкой диеты ( Гриневич В.П.,1969). Потребление этанола крысами составило 12-16 г/кг массы тела в сутки.

Моделирование активации ПОЛ в организме крыс осуществляли с помощью введения СС14 и г-облучения. СС14 вводили внутибрю-иинно в дозе 0,5 мл/кг мэссы в гаде 25% раствора в оливковом масле на 3 часа. Общее г-облученпе изотопом Со проводили на установке АГАТ, мощность дозы 411*10® А/кг.

Для моделирования активации ПОЛ In vitro к суспензии интактных микросом добавлялся этанол ( конечная концентрация -БО, 200 и 1000 мМ) или система индукции ПОЛ (líalorino М. et al., 1989). Определяли активность ферментов старо ядогенеза и уровень малонового да альдегида.

Интерстициялышэ клетки инкубировали в концентрации I06 шт/мл в среде Игла в присутствии различных концентраций этанола и системы индукции ПОЛ. После инкубации клетки осэпяали центрифугированием. В супернатанте измеряли уровень тостосте-рона, в осадке - малонового диальдегида (МДА).

Методы исследования. Микросомы из семенников крыс получали методом дифференциального центрифугирования . Инторстотальные клетки выделяли с помощью коллагеназа из Clostridium hystolíticura. Их гизнеспособность оценивали по исключению красителя - тркпанового синего. Доли клеток Лейдига в обией популяции выясняли окрашивая нх на активность Эр- гидроксисте-роидаегидрогеназы с прегненолоном в качестве субстрата (Dufau W.L.,I979).

Концентрацию тестостерона в плазме крови, семенниках и кудьтуральной жидкости определяли радиоиммунологически, корти-костерояа в плазма и надпочечниках - методом КЖ (Хоха A.M., I9G9). Содержание диеновых конъюгатов (ДК) в тканях измеряли модиГициропптшм нами методом Стальной и соавторов (Стальная И.Л.. 1977). Малоновий диальдегид определяли колориметрически по р<> акции с тиобарбитуророЯ кислотой (Стальная И.Д. и др., 1977). Уровень Флуоресшфугвдх продуктов ПОЛ*(ОТ) измеряли п<"> м«тоту Флетчер и соавторов (Fletcher B.L.et al. 1973). Хеултг-мит,,'::]'.'нг!Ш'> параметры югф^сом ипучата kik enverno Г'^тглигА Т.М. ¡i др.. I Уровень р»1«яминн К каморяля кя Ri.M., П"'?). iv-ííiv.üm л - по ре^чч.» с дямч-гс.

фенилгидравиноы (Соколовский B.B. и др., 1974). Восстановленный глутатион определяли с реактивом Эллмана (Торчинский D.M., 1977). Активность 3«i- гидроксистероиддегедрогеназы изучали по наработке прогестерона из С14-прегненолона цреддоженным нами методом тонкослойной хроматографии. Активность 17- гидроксила-зы (К.Ф.1.14.99.9.), С17_20-лиазы К.Ф.4.1.2.30.), н 17-двгидогеназы (К.Ф.1.1.1.63.), стероидов определяли по наработке 17-гидроксипрогестерона, андростендиона, и тестостерона, соответственно, разработанным наш методом ВЭЯХ. Белок измеряли по Лоурз (Lcvry D.H.et al., 1951) или Брэдфорду (Bradford U.M.. 1976). Радиоактивность определяли в диоксановом сцинтил-ляторе (Bray С.А..1950) на жидкостно-сцинтилляционном счетчике Ыагк-2 (США}.

Статистическую обработку данных проводили на коштъшоре IBM PCVAT с помощью пакета программ BMDP для бионе дадаиста исследований Калифорнийского университета (1933).

Результаты исследования и их обсуждение.

I. px.i знн^ етенола цд перекисное окисление липидов ь нокнза-гели Дункну'ня.иной активности семенникоь.

иодель с строй алкогольной интоксикации наиболее Ддоньагна для изучения собственного специ1мческого действия этанола.

9 7 б

3

I -Ь 4

36 (Ti, 1Ш

23 i. 20 '

I*

À"

4'

«

_L_

I 2t, час 4

Pile. I. Концентрация тестостерона в плазме крови крыс в динамик*-? острой алкогольной интоксикации, о — о и

• -—-« - введение 0,85% NaCl или ьгянола еоитьиг-

стьашю; л —л и а---а - то же на фоне дийствия

ХГЧ (иоавая икала по осп ординат). * - Р < 0,05.

*

л

При однократном Еведенш уровень тестостерона в плазме опытных животных был достоверно снижен по отношению к контрольным уже через час после воздействия (рис. I).

Эффект наблюдается и на фоне введения ХГЧ. Это подтверждает тезис о том, что в механизме действия этанола важное значение имеет его локальная активность в семенниках.

Изменение уровней продуктов ПОЛ показано в табл.Г. На срок 2 и 4 часа поело введения этанола найдено достоверное превышение количества диеновых коньюгатов в опытной группе. Достоверных различия в наработке более поздних продуктов - МВД и оснований Шкффа - не обнаружено.

Таблица I

Содержание витамина С я показатели, характеризующие перекисное окисление липидов в семенниках, в динамике острой алкогольной интоксикации.

В числителе - контрольные значения, в знаменателя - на фоне этанола. * - Р < 0,05.

Показатель Время после инъекции (мин)

0 60 Г20 240

I. ДК, мкмолъ/г 17,1-4,2

?.. ЦПА, нмалъ/Г 43^7 П. ЯТ, упл.ед. 92,4-2,4

4. Аскорбиновая

ки^пота, мкг/г 1ВЙ--12

Е0,5±10,б 39.7-4,3* 29,0-3,4

21,2-5,3 59,6^10,4 73,9-15,6

114-7 47±8 43±7

126-14 33-5 34-4

94,9-6,7 91,2-2,9 92,7^1,7

102,8-6,6 93,7-2,0 95,0-1,7

168-13* 145-10 173-12

135-4 Т4Б-? Ш-13

Бюи допустггь, что ингиСировэни-» синтйаа ■г-5отс,ст"рон« в с^'/л ННИКИ* ОПОСРЕДУЕТСЯ »«р. •;|»ч.Ч,РЧП ПОЛ, ТО Те.>!Тчи"Ч(.,1

мишенью будут являться фермента стероидогенеза. В образовании аддрогенов участвуют четыре ензима - 3»з- гидроксистеровддегид-рогеназа, 17-гидроксилаза, С17_20лиаза и 17- дегидрогеназа. Оценка их активности путем измерения концентрации промежуточных продуктов биосинтеза тестостерона мккросоыальной фракцией из семенников крыс шявила достоверные изменения в функционировании только одного фермента - 3(1- гидрокеистероидцегидрогв-назы (рис.2). Отсутствие сдвигов в активности других стероидо-генных энзиыоа указывает на то, что этот процесс при однократном введении этанола не приводит к выраженным повреждениям мембранных структур клеток Лейдига. Тем не менее, увеличение концентрации ДК в семенниках, совпадающее по времени с максимальным угнетением биосинтеза тестостерона и уменьшение активности 30- гидроксистероиддегидрогеназы можно расценивать, как проявление индукции ПОЛ при острой алкогольной интоксикации.

[ Р 1, пмоль/мг 4000

2000

гЬ

гИ

Ил

-ь

гЬ

I час

2 часа

4 часа

Рис.2. Активность 3 - р - гидроксисюроаддегидрогенази в микросомах семенников крыс, в динамике острой алкогольной интоксикации. 1,2 - введение 0,852 ЫаС1 или этанола, соответственно; 3,4 - то Ее на фоне действия ХГЧ. * - Р < 0,05.

Модель хронической алкогольной интоксикации представляла больший интерес в связи с поставленной целью. Во-первых, хроническая алкоголизация наиболее »фиктивна в индукции свободно-радикальных реакций и процессов нерикиаюго окисления лили-

дов. Во вторых, повреждения, вызываемые данным воздействием, аналогичны патологическим изменениям, возникающим у ладей вследствие злоупотребления алкоголем.

Действительно, в модели хронической алкоголизации процессы ПОЛ были выражены в болыаей степени (рисунок 3). Причем, наибольшие изменения наблюдались в уровне фдуоресцирущих продуктов. Последние образуются в результате модификации белков альдегидами - продуктами ПОЛ. То есть, если в результате липопероксидации повреждаются ферменты стероидогенеза, то это будет отражаться именно на этом показателе.

( ДК ], нмоль/мг [ ВДА 1, пмоль/мг [ ФП ], усл. ед.

100

50

0,50

0,25

О

&

г-Н

5,0

2,5

1+

0

Ряс. 3. Изменение уровня продуктов ПОЛ в семенниках крыс

при хронической алкогольной интоксикации: I - контрольные, 2 - парнокормленше, 3 - потреблявшие этанол

КЙЮТНЫ8 .

В модели Оило воспроизведэно и токсическое влияние этанола на тестикулнрную функцию. Уровень тестостерона у опытных животных достоверно снижался по сравнению с контрольной группой, но не парнскормлошюй. Не исключено, что пагогшитнеским фактором может наняться уменьшение поступления питательных веществ. Кроме того, мы предположили, что гругта парнокормлен-ных животных, ограниченная в корю насильственно, а ш доброт вольно, как этанолпотрибляидая, по-видимому, находилась в состоянии стресса, что и привело к снижении уровня тестостерона у этой группы. Вполне вероятно, что для данного исследования более коррэктним является сравнение ипытной группы животных с контрольной, а ни иарюкормленний.

Определение активности Ферментов в микросомах из семенников крыс при хронической алкогольной интоксикации показало, что у этанолпотреблятих животных достоверно снижен биосинтез прогестерона, катализируемый 30- гидроксистероиддегидрогеназой и синтез тестостерона, катализируемый 17-дегкдрогеназой (рис.4). Существует предположение, что пониженная наработка прогестерона происходит из-за уменьшения соотношения НАД/НАД'Н и, следовательно, понижения активности НАД-эависимой 30- гид-роксистероиддегидрогенвзы (Cicero T.J. et al.,1983; Gordon O.G. et al., 1980). В наших условиях концентрация НАД, добавляемая в среду инкубации, была достаточно высока, чтобы считать соотношение НАД/НАД'Н постоянным в течение всего времени реакции. Более корректным представляется вывод о том, что алкоголь оказывает прямое повреждающее действие на активность втого фермнта.

[Р),нмоль/мг [I7-0H-P1, ГА],нмоль/мг (Т1, нмль/мг нмоль/иг

10 r|j f\ 10 Г 10 Г 10г

6 0 - 1 I 2 • +i Б 3J 0 Б [lüft о ■ J- 12 3 0

А Б В Г

Рис. 4, Концентрация прогестерона (А), 17-ОН-прогвстерона (Б), андростендиона (В) и тестостерона (Г) в среде через 80 минут инкубации иикросом хронически алкоголизировпнны* крнс: I - контрольные. 2 - пэрнокормленнне, 3 - потреблявшие втанол животные.

Таким образом, хроническая алкогольная интоксикация вызывает сивконио концентрации тестостерона и угнетение активности Лермонтов стероидогеноза. Параллельная зночителмти активация процессов ПОЛ при данном воздействии пияв.:»-пч!»т иоетммигь .вопрос - е клада море а^иясироынпшо сдвиги в ш.'М'.'ИЛ'.г'.чх

вызваны прямым действием этанола, а в какой - опосредованы липоггароксидацией. Для его выяснения бил изучен характер нарушения стероидогенеза при индукции ПОЛ in vivo в организме крыс.

Si Влияние шшшш перекисного окисления лищдов иа биосинтез стероидшгх гормонов а организме дад*

В качестве стимуляторов перекисного окисления были использованы r-облучение и CCl^.

Факт индукции ПОЛ в организме животных после г-облучения был подтвержден данными измерения в пэчена и селезенке уровня диеновых коньюгатов. Однако, в семенниках достоверных изменений концентрации продуктов перекисного окисления обнаружено не было. Не зафиксировано, такте, достоверна изменений в содержании тестостерона в плазме крови и семенниках, что, следовательно, не противоречит гипотезе о причинно-следственных взаимоотношениях между скоростью стероидогенеза и интенсивностью ПОЛ. В то же время, активность Зр- гидроксистероиддегидрогена-зы в микросомах семенников снижалась через сутки после воздействия. Возможно, этот фермент может служить чувствительным маркером для выявления прооксидантного действия различных эффекторов. Он единственный отреагировал снижением своей активности на однократное введение этанола, достоверно изменялся при хронической алкогольной интоксикации.

Введение СС14 на короткий срок позволяет зафиксировать его кратковременные эффекты, важнейшим из которых является активация перекисного окисления лгатидов и минимизировать поздние токсические проявления. Острая интоксиквция вызвала ожидаемые разнонаправленные сдвиги в уровне тестостерона л гидроперекисей липидов в семенниках. Однако, действие СС14 лишь частично опосредовано липопероксидвцией, так как эффект уменьшается иа фоне активэ!ши стероидогенеза ХГЧ. Здесь следует отметить, что результаты экспериментов о использованием гонадотрй-пинп следует трактовать с осторожностью. С одной стороны, блокируя рецепторы лютоинизирущего гормона па клетках Лейди-ni, он нивелирует действие высших эндокринных, центров рогуля-пик, но с другое, стгаулируя стерсилогенвз, он перегодит функ-u«'-«m<|vip.nw0 гггтемч р по»>нй режим, где ваэ^.'оотногчния »»зжгог

WyV-'MKVM IlJV.'IW'.in» МОГ.УТ Н'Ч-.ИТЬ СОВ,?Г"-М"'0 ЧЧмЯ .t*44Kfop.

Од.ч;:П и:> д:)ри:тсрг>1Х особ-?«йК>етеП CCI , =-m--i<iv:i

модификация .мембранных стуктур и потеря ими специфических белковых компонентов (Recklшgel И.О. а1.,1989). Это отражается на функционировании ассоциированых с мембраной энзимов, в рассматриваемом случав - стероидогенных. Наш выявлено снижение активности всех микросоыалышх ферментов, участвующих в образовании тестостерона, как на интактном фоне, так и на фоне действия ХГЧ Однако, статистически значимыми оказались лииь сдвиги в скорости реакций, катализируемых 17-дегидрогеназой и 30- гидроксистеровддегидрогеназой.

Аналогичные изменения в активности ферментов, как было . показано выше, обнаружены при острой и хроничской алкогольной интоксикации, что подтвервдает тезис об участии свободно-радикальных механизмов в их генезо.

Влияние витаминов. обладнщцх антаоксидантным действием. Щ" взаимоотношения щюцессов ¡Ш и биосинтеза тестостерона.

Важнейшим химическим свойством витаминов А и Е, иыеюдиы большое значение для их биологичской активности, является способность легко вступать во взаимодействие с пероксильными радикалами липидов, инакгишруя последние и тормозя, таким образом, ПОЛ. Поэтому, .ш предприняли попытку использовать ■предварительное введение этих витаминов, как модель для изучения взаимоотношений процессов стероидогенеза и ПОЛ в условиях алкогольной интоксикации.

Предварительное введение токоферола ацетата не приьело к существенным изменениям скорости ПОЛ и биосинтеза стероидов. Однако, протектиЕная роль витамина Е была обнаружена при инт-ратестккулярном введении виташша и эквивалентного объема оливкового масла в разные сем&ншжи одного и того ыз животного. Это позволило оценить влияние токо^рола ацетата на скорость биосинтеза тестостерона в условиях одинакового рогуля-торного фона. Использование в качестве контроля контрлатерального органа действительно позволило снизить разброс данных и за1иксировать достоверный эффект от введения токофюрола. Концентрация тестостерона в семеннике, куда был введен витамин, была в 1,44 раза выше по отношению к контролю.

Введение витамина А привело к специфическому усилению биосинтеза тестостерона. В комбинации с этанолом витамин нормализовал содержание гормонов, а в сочетании с внутрибршинннм

введением 0,851 ИаС1 уровень тестостерона превысил контрольный (интактные животные)- почти вдвое (табл. 2).

Таблица 2.

Содержание тестостерона в плазме крови крыс при введении этанола и ретинола ацетата. Цифровым индексом обозначены группы животных, по отношению к которым данный показатель достоверно (Р< 0,05) отличается.

а

Группы

Тестостерон, пмоль/мл

1. Интактные животные 0,99 - 0,44

2. Оливковое масло + 0,85S НаС1 0,59 - 0,22

3. Оливковое пасло + этанол 0,09 - 0,04 2

4. Витамин А + 0,85$ NaCl 1,74 £ 0,59 1

5. Витамин А +■ этанол 0,59 - 0,43 4

Данные по влиянию ретинола ацетата на процессы ПОЛ менее однозначны. Некоторое увеличение концентрации флуоресцирующих продуктов ПОЛ и диеновых коньюгатов под действием этанола согласуется с ранее полученными результатами, где. эти изменения носят более выраженный характер. Однако, создается впечатление, что уровень продуктов ПОЛ повышается как под действием этанола, так и витамина А.

В литературе высказывалось мнение о возможном патогенетическом значении недостатка витамина А в развитии алкогольного гштогонадазма (Van Thiel D.H. et al., 1974; Me ClaLn C.J. et al., 1979). Однако, попыток коррекции нарушения образования половых гормонов ретинолом в доступной литературе мы не обнаружит. Получешше дашше об увеличении концентрации тестостерона' на фоне введения ретинола делают весьма перспективным выяснение данного вопроса.

Взаимоотношение процессов биосинтеза тестостерона ц ререкисного" окисл^щцд дщщдйВ Í1 ЫйДМЫШ систе.м;1Х la v1 tro.

СлоМ1ийиие механизмы регуляции сгзроидогинеаа о животном организме, включащие несколько уровней,' затрудняю! ¡шализ взаимоотношений процессов биосинтеза тестостерона и iwpuiutCHo-го окиоленил лштдоь in vivo. Поэтому, нами были проведены эксперименты ь различных модельных ситуациях Iii vitro, где ь контролируиммх условиях оказывалось воздейстьио на тот иди

иной параметр. Этанол угнетал стероидогенез. При атом снижалось активность Зр- гщюксистероиддегилрогеназы и Ср7_пд-.ткз:'н. Использование различных концентраций эффектора выярило доэозввисимнй характер его влияния. Таким образом, настоящее исследование устанавливает два возможных места инги-бировшгая биосинтезе тестостерона в микросомах - превращение Зр-гидрокси-5-ен-стероидов в З-оксо-4-ен-стероидн и образование андростендиона из 17-0Н-прогестерона.

Ицдукция в этой системе липопероксидэции сопровождалась выраженным ингибированием всех исследуемых стероидогенных ¡Герментов (рис.5).

Эксперимент на клетках Лойдига продемонстрировал, что этанол проявляет 6 них выраженную прооксилвнтную активность (табл.2). Он увеличивал наработку ИДА и потенцировал действие системы индукции ПОЛ. Увеличение накопления продуктов перекис-ного окисления липидов практически полностью устранялось избирательным удалением из раствора ионов железа с помощью хелати-руючего огентй - дефррроксамина. В то же время, диметилсульф-оксид - скявенджер свободных радпквлов, ингибировал в йнтгатвльно меньшей степени.

!Г) ,пмоль./мг г 2000 о

-о

\

[17-0Н-Г1, пшль/мг

г 1000

о/

/

<о го зо ^кин

16

*

9

(Т),пмоль/мг Г 400

48 X ,к;ин

*,мин

А

Рис. 5. Динамики накопления прогестерона (А), 17-ОН-прогестерона (Б) я тестостерона (В) в ходе инкубяюп иитпктлых микросм: I - контрольная среда инкубпши 2 - среда, содиржгадчя систему индукини ггарктгоп окисления липидоп.

Способность клеток К биосинтезу тостостпронм ОТЧеЯ'ЯИП увеличивалась при.добоелннии системы иплукир* ПОЛ (таб/1. 2)

Таблица 2.

Содержание малонового диальдегида и биосинтез тестостерона в интерстициальнш- клетках семенников при добавлении в среду различных эффекторов. Цифровые индексы обозначают номер группы, по отношению к которой данный показатель достоверно (р< 0,05) отличается.

& Наименование Содержание ЦЦА Биосинтез

группы воздействия (нмоль/Ю клеток) тестостерона (в 1 к контр.)

1.

2.

3.

4.

5.

8.

9.

10. И.

I?.

Контроль 98+2

Система индукции I

ПОЛ 477 + 3

Система индукции 2

ПОЛ + деферроксамин 133 + 9 (I мМ)

Деферроксамин (I мМ)

Система инукции ПОД 2

+ диметилсульфоксид 338 + 7 (I МЫ)

Этанол (50 мШ

Система индукции ПОЛ + этанол (БО мМ)

№> (2 Ш) Te (IOOMKIJ) Al» (2 мМ) Аденин (2 tói) УЮ- (2 кМ)

I

152 + 16

611 + 12 I6I_+ 31

I

493 i- 93

1.5

100+4 160 + БЗ 232 + 75

103 + 26

242 ± 60 I

БЗ + 3

73

1.2

151 + 12 117 + 9

258_+ ет II2_t 2U 125 t- 21

I

I

Однако, оказались, чти этот феномен не имеет отношении к изменению скорости „т.шонер-ксидашш. При последовательном добавлении в культурному ю <:[^ду компонентов системы ьилоишмсь, что ciMMy;..ip>x¿JM деП'. гь/еМ обладает АДГ. Если ьмосте с системой щцукнии ПОД в cpe.fiу i-.нести деф.<рроксамин. что, как <">нло цика-2-;.HO. I,- -КО riÍ,1 КП^МЩН ПнриКИСНОТО ОКИ'.-ЛОПИЯ ЛШ1ИДОВ,

I

I

I

6

стимуляция стероидогенеза возрастает. Причем, сам деферрокс-ямин скорости биосинтеза тестостерона не изменяет. Аналогичное действие оказывает другой ингибитор свободно-радикальных процессов - димотилсульфоксид. Это подтверждает тезис о том, что перокисное окисление липидов угнетает стероидогенез. На это же указывает эффект этанола. Добавление этого агента в инкубационную среду снижает скорость биосинтеза тестостерона. Комбинация его с системой индукции ПОЛ, вызывающая наибольшее накопление в клетках ИДА, резко снижает ее способность стимулировать стероидогенез.

Действие этанола и системы индукции перекисного окисления липидов было изучено в среде с различной концентрацией ХГЧ, чтобы выяснить, в какой мере их эффекты обусловлены изменениями внутриклеточных метаболических процесоов, а в какой - нарушением рецепции тролных гормонов. Биосинтез тестостерона в присутствии этанола был всегда ниже, а в присутствии системы индукции ПОЛ - всёгда выше контроля. Это подтверждает предположение о том, что в спектре действия обоих эффекторов преобладает метаболический компонент.

Таким образом, проведенные исследования покавали, что процессы порекисного окисления липидов и биосинтеза тестостерона связаны между собой. Этанол оказывает в семенниках 1л тКо г в культуре клеток Лейдига прооксмантное действие, одлш из проявлений которого является подвапениэ биосинтеза тестостерона. Молекулярный механизм этого аффекта заключается, по всей вороятности, в повреждении свободнорадикальннми продуктами структуры или липидного окружения мембранных фергентов стероидогенеза, наиболее чувствительным из которых является Эр- гидроксиотеродддчгидрогеназа.

ВЫВОДЫ.

I. Острая и хроническая алкогольная интоксикация сопровождала активацией перекисного окисления липидов и угнетением Оиосштаа тестостерона в свшштках крыс,

?.. Осноышм молекулярным дофоктом в Фупкцдэтцчмпшии

СТ'Зр<.-ИД0ПЗШ1ОГО КОМПЛеК'.Ч) ^Ч)М')Н!1ИК':Н 1!; И пдачГОЛтоЛ ИЦТОКСИ--

К'нгиц ньянет:"« онинктин шиисчпчг'.ч» Го-

геназы.

3. Этанол индуцирует перекисноэ окисление литгилов и потенцирует действие прооксидантов в культуре клеток Лейдига .

4. В угнетение биосинтеза тестостерона в семенниках крыс при алкогольной интоксикации значительный вклад вносит индукция пэре кисного окисления липидов.

5. Витамин А увеличивает концентрацию тестостерона в семенниках крыс как на кнтактном фоне, так и при влкогольной интоксикации,в то время как витамин Б проявляет мвньпую активность.

6. Актиеность микросомальных ферментов стероидогенеза и, в первую очередь , ЭР- гидроксистероиддегвдрогеназн может служить чувствительным маркером прооксидантного действия различных эффекторов.

Список основных публикаций по нате риалau диссертация.

1. Кашко М.®., Xoia A.M. Этанол и процесса перг» кислого окисления лгатадов влиятт на стероидогенез в семенниках. // 6-fla Гродненская конференция молодых ученых и специалистов: Тез. -Гродно, 1990.- С.6.

2. Xoia A.M., Анцуловпч С.Н., Воронов П.П., Дорошкевич H.A., Ка'лко М.Ф. Влияние витамина Б яв метаболические изменения в семенниках, вызванные этанолом. // Втесстнчч коррекция по клинической витаминологии: Тез.- Москве, 1991.-€.33?.

3. Хоха A.M., Воронов П.П., Дороштевич H.A., Кешко М.Ф., Ачцулевпч с.Н. Влпятше витамина Е на м<?таСкУпг«скив сдвиги в сомдттках, выгонные этанолом. М.,1991.- 7с,- Доп. в ВШШТИ, 1МТПГ<-В.

4. Хсха A.M., Кя'вко М.Ф., Воронов ПЛ., Дсроппгег.кч H.A., AHIVV.11B114 С.Н. Влияние острой члкогодмгоЯ интоксикации па ПроИ'.Ч'ГН ПР^КИНКМ4:' ОМ'СТ'ЧГ.'П ЛИПТ'ДОВ в и п!'дп:т''"1!гиклх нр:!';1.' Вопроси тгтчия,- 1993.- »I.

П. Kawo v.i., »xn A.U., Лсро:п? точ H.A., Лниуг.-тлп С.Н., Р"!>чгл П.И. Timimuw РТПМОЛЯ И г1

переписного окисления липидов на стероидогенную активность семенников.// Украинский биохимический журнал.- 1993.-T.65.JS2.- С.89-94.

'6. Кашко Ы.Ф., Воронов П.П., Хоха А.Ы. Перекиснов окисление липидов опосредует эффекты этанола в культуре клеток Лейдига.//Международная научная конференция: Тез.- Гродно, 19ЭЗ.- С.324-325.