Биохимические механизмы нарушения гормонпродуцирующей функции семенников при алкогольной интоксикации

Хоха, Александр Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические механизмы нарушения гормонпродуцирующей функции семенников при алкогольной интоксикации
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические механизмы нарушения гормонпродуцирующей функции семенников при алкогольной интоксикации"

Институт питания РАМН

На правах рукописи УДК612.617.018:577.175.624].014.46.[615.917:547.262].08

ХОХА Александр Михайлович

Биохимические механизмы нарушения гормонпродуцирующей функции семенников при алкогольной интоксикации

(биохимия - 03.00.04)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1998.

Работа выполнена:

в Институте биохимии АН Беларуси, г. Гродно

Научный консультант:

доктор биологических наук Буко В.Я.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор Березов Т.Т. доктор биологических наук, профессор Спиричев В.Б. доктор медицинских наук, профессор Терентьев A.A.

Ведущая организация:

НИИ наркологии МЗ РФ

Защита состоится 16 марта 1998 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.02.01 по присуждению ученой степени доктора медицинских наук при Институте питания РАМН (Москва, Устьинский пр., 2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН.

Автореферат разослан 15 февраля 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Жминченко В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Алкогольная интоксикация у животных и человека сопровождается морфологическим и функциональным повреждением гонад: угнетением сперматогенеза, атрофическими и дегенеративными нарушениями структуры герминативных и гормонпродуцирующих клеток. Следствием этого на организменном уровне является развитие импотенции, бесплодия, феминизации (Bannister, 1987). Злоупотребление алкоголем, принимающее в развитых странах все более широкомасштабный характер, обусловливает необходимость изучения механизмов гонадотоксичности этанола (Э) и поиска эффективных средств ее профилактики и коррекции.

Ключевым фактором, определяющим поддержание нормальной структуры и метаболизма клеток семенников, является внутриорганный уровень тестостерона (Т). Снижение последнего при остром и хроническом введении Э является главным патогенетическим механизмом развития алкогольного гипогонадизма (Van Thiel, 1982). Поэтому, выяснение биохимических путей угнетения гормонпродуцирующей функции семенников и поиск способов коррекции этого состояния представляется важной и актуальной задачей.

Большинство авторов главную роль в происхождении нарушений, обнаруженных в системе гипоталамус-гипофиз-гонады, отводят прямому повреждающему действию Э на семенники. Причем, считается, что гона-дотоксичностью обладает не сам спирт, а соединения, образующиеся в ходе его метаболизма - НАД-Н и (или) ацетальдегид (Cicero, 1982). Последний связывается с макромолекулами, в том числе с белками хроматина, приводя к изменению их физико-химических и иммунологических свойств, напрямую ингибирует ферменты стероидогенеза. Уксусный альдегид образуется преимущественно в печени и поступает в другие органы с кровью. Однако, если учесть, что в эндотелии семенников присутствуют мощные альдегиддегидрогеназные (АльДГ) системы, формирующие гема-тотестикулярный барьер (Anderson, 1985), то вопрос о скорости метаболизма Э внутри гонад приобретает большую актуальность.

Основная часть этилового спирта, поступающего в организм животных, окисляется алкогольдегидрогеназами (АДГ - алкоголь: NAD -оксидоредуктаза КФ 1.1.1.1.), которые делятся по физико-химическим, иммунологическим и кинетическим свойствам на шесть основных классов (Jornvall, 1995). По скорости каталитического превращения этилового спирта изоферменты сильно различаются. Например, АДГ III практически его не окисляет. Следовательно, выяснение кинетических параметров АДГ семенников является принципиально важным для оценки ее этанол-метаболизирующей активности. Изоферментный спектр АДГ видоспеци-фичен и наиболее сложно организован у человека. Это обусловило выбор объекта исследования.

Помимо АДГ, утилизация Э осуществляется комплексом микросо-мальных ферментов, получивших название - МЭОС (микросомальная эта-нолокисляющая система), и каталазой (перекись водорода: перекись водорода оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6.). Вклад каждого из этих метаболических путей в настоящее время известен только для печени и зависит от концентрации этилового спирта и метаболического состояния ткани. Особенности обмена Э в семенниках отражены в немногочисленных и фрагментарных исследованиях и практически отсутствуют для человека (Dafeldecker, 1986; Murono, 1986).

Известно, что введение Э усиливает процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени и ряде других органов (Nordmann, 1992). Считается, что этот эффект обусловлен не Э, который в некоторых системах проявляет даже антиоксидантные свойства, а образующимися в ходе его метаболизма свободнорадикальными продуктами. Одним из наиболее мощных источников их наработки является семейство цитохромов Р-450, в частности, изофермент - IIE1, участвующий в окислении Э в составе МЭОС (Albano, 1996). Это означает, что образование свободно-радикальных продуктов в семенниках может интенсифицироваться в клеточном компартменте, где осуществляются конечные этапы биосинтеза Т. Известно, что эти соединения могут угнетать биосинтез гормона. В то же время, свободно-радикальные продукты вовлечены в нормальный каталитический акт и регуляцию активности ряда ферментов стероидогенеза. Поэтому логично допустить, что всякое изменение скорости этих процессов может приводить к нарушению образования стероидов. Следовательно, изучение взаимоотношений процессов биосинтеза Т и ПОЛ при алкогольной интоксикации актуально и перспективно в плане поиска механизма повреждения Э гормонообразующей функции семенников.

При изучении механизма угнетения гормонопоэза в семенниках следует учитывать нейрохимические и нейроэндокринные эффекты Э, приводящие к снижению тройной стимуляции клеток Лейдига (Van Thiel, 1982). Непонятным, однако, остается как способ действия Э, так и удельный вес центрального компонента в общей массе патогенетических факторов. Принципиально новым и актуальным подходом к выяснению этого вопроса, позволяющим объяснить наличие в литературе гетерогенных и разнонаправленных данных, является изучение закономерностей взаимодействия при алкогольной интоксикации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и гонадной систем.

Таким образом, проведение данного исследования существенно расширит существующие представления о регуляции биосинтеза Т в животном организме в норме и при патологии, позволит выяснить механизмы его угнетения при алкогольной интоксикации и целенаправленно подойти к поиску способов коррекции алкогольного гипогонадизма.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования заключалась в выяснении биохимических механизмов угнетения биосинтеза Т при алкогольной интоксикации, разработке патогенетически обоснованного направления поиска и конкретных способов коррекции данного процесса с помошью природных биологически активных соединений.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить влияние острой и хронической алкогольной интоксикации на уровень Т и кортикостерона в крови, семенниках и надпочечниках, активность ферментов стероидогенеза в гонадах животных и человека. Исследовать влияние Э на биосинтез Т in vitro - в микросомах и изолированных клетках Лейдига.

2. Охарактеризовать этанолметаболизирующие системы семенников и их вклад в нарушение гормонопоэза. Для этого - выделить алкогольде-гидрогеназу из яичек человека до электрофоретически гомогенного состояния, изучить ее каталитические и физико-химические свойства, отнести к одному из известных изоферментных классов. Получить моноспецифическую антисыворотку к АДГ из семенников человека, с помощью которой методами иммуноферментного и иммуногистохимического анализа определить содержание и исследовать характер межклеточного распределения изучаемого фермента. Выяснить наличие и определить активность микросомальной этанолокисляющей системы и каталазы в семенниках человека. По состоянию системы НАД/НАДН, сдвигам в аминокислотном спектре оценить значение метаболического дисбаланса, развивающегося при окислении Э, в угнетении биосинтеза Т.

3. Исследовать влияние острой и хронической алкогольной интоксикации на процессы ПОЛ в семенниках крыс. Изучить значение индукции ПОЛ в угнетении биосинтеза стероидных гормонов. Охарактеризовать взаимоотношения процессов биосинтеза Т и ПОЛ в модельных системах in vitro. Выяснить возможность использования витаминов А и Е в качестве протекторов гормонпродуцирующей активности семенников при действии Э.

4. Изучить особенности биосинтеза Т при алкогольной интоксикации при различной функциональной активности надпочечников - на фоне иммобилизационного стресса, адреналэктомии, введении кортикостерои-дов.

Научная новизна.

В работе впервые проведено комплексное изучение особенностей биосинтеза Т при алкогольной интоксикации на организменном, клеточном и субклеточном уровне. Продемонстрировано, что острое и хроническое введение Э приводит к угнетению биосинтеза Т в семенниках, снижению его концентрации в плазме крови. Аналогичное действие этиловый спирт оказывает на изолированные клетки Лейдига. Установлено, что

наиболее чувствительным к действию Э этапом является превращение ЗР-ОН-5-ен-стероидов в ДЗ-оксо-4-ен-стероиды, катализируемое 3ß-OH-стероиддегидрогеназой/изомеразой (СДГ) (К.Ф.5.3.3.1.). Показано, что этот феномен обусловлен изменением структуры фермента или его ли-пидного окружения, так как воспроизводится in vitro - в культуре клеток Лейдига и микросомах.

В представленной работе впервые охарактеризован спектр и активность этанолметаболизирующих ферментов семенников человека и оценен их вклад в развитие биохимических нарушений, приводящих к угнетению биосинтеза Т. В частности, выделен до электрофоретически гомогенного состояния основной изофермент АДГ. Исследованы его физико-химические и каталитические свойства. Показано, что он является диме-ром, состоящим из двух идентичных субъединиц массой по 37 кд каждая. АДГ семенников обладает отрицательным зарядом при pH 8,3 - 8,6, что обусловливает ее поведение при электрофорезе и анионообменной хроматографии, нечувстительна к пиразолу, не насыщается Э, не окисляет метанол. Это позволило отнести ее к Ш классу изоферментного спектра. Каталитическая константа при pH 7,5 и концентрации Э 0,5 М составила всего 2 мин"1, что свидетельствует о незначительном ее вкладе в окисление Э в семенниках. Получена моноспецифическая антисыворотка к АДГ III и на ее основе сконструированы иммуноферментная и иммуногистохи-мическая тест-системы. С их помощью впервые определено содержание этого фермента в семенниках человека и изучено его межклеточное распределение. Наибольшая концентрация АДГ III зафиксирована в сперма-тоцитах и сперматогониях. Достаточно униформное распределение фермента противоречит представлениям о наличии у АДГ III специфических функций в обмене стероидов.

Показано, что активность МЭОС в семенниках не определяется. В то же время, каталазная реакция окисления Э протекает со скоростью 0,096 + 0,010 нмоль/мин/мг белка.

Впервые охарактеризован спектр ыетаболитных нарушений в гонадах в динамике острой алкогольной интоксикации. Продемонстрировано, что введение Э не приводит к изменению уровня НАД и отношения НАД/НАДН, содержания цАМФ, ß-эндорфина, лей-энкефалина в семенниках. Аминокислотный дисбаланс незначителен и качественно отличается от такового в печени при алкогольной интоксикации. Это позволило сформулировать тезис об отсутствии выраженного влияния обмена Э на метаболический статус клеток семенников и обеспеченность стероидоген-ных ансамблей окисленным НАД .

Впервые изучены особенности ПОЛ в семенниках при острой и хронической алкогольной интоксикации. Индукция ПОЛ при однократном введении Э проявлялась в увеличении количества диеновых коньюгатов (ДК), уменьшении содержания аскорбиновой кислоты, восстановленного глютатиона. При хронической интоксикации эффект был выражен в

большей степени и заключался в повышении уровня более поздних продуктов - малонового диальдегида (МДА) и флуоресцирующих продуктов (ФП). Аналогичные сдвиги, включая снижение активности СДГ и 17-дегидрогеназы, были обнаружены при индукции ПОЛ с помощью у-облучения и CCI4. Выявленные закономерности подтверждены в модельных системах in vitro. Э проявлял выраженную прооксидантную активность в культуре клеток Лейдига. Он увеличивал наработку МДА и потенцировал действие комплекса АДФ-Ре3+. Это позволило впервые обосновать положение о том, что индукция ПОЛ при алкогольной интоксикации является фактором, обусловливающим угнетение биосинтеза Т.

Исследована гормонпродуцирукицая функция семенников при различной функциональной активности надпочечников. Показано, что адре-налэктомия, иммобилизационный стресс, введение дексаметазона оказывают однотипное угнетающее действие на биосинтез Т. Причем, на этом фоне эффект Э был неаддитивным. В сочетании с полученными данными о стрессогенной активности спирта это позволило обосновать принципиально важный тезис о том, что в реализации повреждающей активности Э эксплуатируются общие механизмы взаимодействия двух нейроэндок-ринных осей : гипоталамо-гипофизарно-гонадной и надпочечниковой.

Впервые продемонстрировано, что витамин А нарушает реципрок-ность функционирования гипоталамо-гипофизарно-гонадной и надпочечниковой систем у крыс и оказывает выраженное стимулирующее действие на биосинтез Т как в норме, так и при алкогольной интоксикации. Обнаруженный эффект был подтвержден в исследовании с участием добровольцев. Аналогичное, хотя и менее выраженное действие ретинол продемонстрировал у больных хроническим алкоголизмом. В моделях in vitro было показано, что одной из вероятных точек приложения активности ретинола является СДГ, активность которой увеличивалась в присутствии физиологических концентраций данного витамина.

Теоретическая и практическая значимость.

Изучены биохимические механизмы угнетения Э биосинтеза Т на уровне целого организма, изолированных клеток Лейдига, субклеточных фракций. Показано, что основным молекулярным дефектом в процессе стероидогенеза является индуцируемое Э снижение активности СДГ.

Впервые проведено комплексное исследование спектра этанолмета-болизирующих ферментов семенников человека. Продемонстрировано, что основной изофермент АДГ относится к III классу и обладает низким сродством и каталитической активностью по отношению к Э. Иммунохи-мическими методами изучено межклеточное распределение фермента. Показано, что он присутствует во всех клетках, но наибольшее содержание отмечается в сперматоцитах и сперматогониях. Активность МЭОС в ткани семенников не выявляется, а скорость пероксидазного окисления этилового спирта в каталазной реакции составляет всего 0,096 нмоль/мин/мг белка. Сделано заключение о том, что ткань семенников

весьма инертна в окислении Э, что дополнительно подтверждается характером изменений концентрации НАД, отношения НАД/НАДН, спектра свободных аминокислот в семенниках при алкогольной интоксикации. Вывод о низкой скорости окисления Э в семенниках и незначительном влиянии этого процесса на окислительно - восстановительный статус клеток существенно суживает зону поиска способов профилактики и коррекции алкогольного гипогонадизма.

Продемонстрировано, что индукция ПОЛ в семенниках при алкогольной интоксикации играет важную роль в механизме ингибирующего действия Э на стероидогенез. Этот вывод позволяет целенаправленно подойти к поиску факторов, улучшающих гормонсинтезирующую функцию семенников, среди природных и синтетических соединений, обладающих антиоксидантной активностью.

Сформулирован и экспериментально подтвержден тезис об опосредовании части эффектов Э в семенниках элементами гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, что открывает новые возможности в изучении механизмов гонадотоксичности Э и разработке способов профилактики и коррекции данной патологии, основанных на использовании антистрессорных и адаптогенных мероприятий.

Продемонстрировано наличие кортикостерона и 11Р-гидроксилазы стероидов в семенниках крыс. Характер изменения концентрации данного кортикостероида при различной функциональной активности надпочечников и алкогольной интоксикации свидетельствует о том, что его биосинтез осуществляется in situ и, возможно, регулируется гонадотропинами. Это расширяет существующие представления о регуляции стероидогенеза в гонадах и будет способствовать изучению механизмов взаимодействия гипоталамо-гипофизарно-гонадной и надпочечниковой осей, а также влияния Э на биосинтез стероидов.

Впервые показано, что витамин А является фактором, нарушающим реципрокность функционирования гипоталамо-гипофизарно-гонадной и надпочечниковой систем и оказывающим мощное стимулирующее действие на биосинтез Т в организме крыс и здоровых людей. Это открывает широкие перспективы в изучении молекулярных механизмов его активности и разработке способов профилактики и коррекции повреждения гонад при алкоголизме.

Одним из практических достижений работы является разработка способа выделения электрофоретически-гомогенного препарата АДГ из семенников человека, что в последующем позволило получить моноспецифическую антисыворотку и создать на ее основе иммунохимические тест-системы для оценки межклеточного распределения и проведения количественного анализа АДГ III. Такого рода тест-системы могут быть применены в практике научных исследований для изучения распределения и биологической функции ферментов обмена Э в других органах и тканях человеческого организма.

Разработан способ определения концентрации кортикостерона методом адсорбционной микро-ВЭЖХ, нашедший широкое применение в биохимических исследованиях.

Разработан эффективный микрометод высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения динитрофенилгидразонов альдегидов, позволивший оптимизировать способы определения активности МЭОС и пероксидазного окисления Э.

Разработана эффективная хроматографическая система разделения интермедиатов стероидогенеза, что может быть использовано в практике биохимических исследований для изучения отдельных стадий этого процесса в семенниках.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Острая и хроническая алкогольная интоксикация у крыс приводит к угнетению биосинтеза Т в семенниках. Основным молекулярным дефектом в функционировании стероидогенного комплекса семенников при действии Э является нарушение превращения Зр-ОН-5-ен-стероидов в З-оксо-4-ен-стероиды, катализируемое СДГ.

2. АДГ семенников человека относится к III классу изоферментного спектра и имеет низкое сродство и каталитическую активность по отношению к Э. Она содержится во всех клетках семенников, причем наибольшая концентрация отмечается в сперматоцитах и сперматогониях. Этанолметаболизирующие ферменты семенников обладают малой мощностью и не приводят при алкогольной интоксикации к снижению уровня НАД, либо отношения НАД/НАДН.

3. Острая и хроническая алкогольная интоксикация у крыс сопровождается усилением ПОЛ в семенниках. Э в культуре клеток Лейдига оказывает прооксидантное действие. Индукция ПОЛ при алкогольной интоксикации является одним из факторов в механизме угнетения биосинтеза Т.

4. Алкогольная интоксикация увеличивает концентрацию кортикостерона в надпочечниках и плазме крови крыс. Изменение функциональной активности надпочечников, сопровождающееся увеличением либо уменьшением концентрации кортикостероидов в различных экспериментальных ситуациях, предотвращает угнетение биосинтеза Т этанолом.

5. Ретинола ацетат увеличивает концентрацию Т в семенниках и плазме крови крыс, в плазме крови людей добровольцев как на интактном фоне, так и при алкогольной интоксикации и повышает активность СДГ in vitro.

Апробация результатов диссертации.

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на 9 Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Москва, 1987), 4, 5 и 7-ой Гродненской областной конференции молодых ученых и специалистов "Молодежь и научно-технический прогресс" (Гродно, 1987, 1988, 1990), 3 Всесоюзной конференции "Перспективные методы плани-

рования и анализа при исследовании случайных полей и процессов" (Гродно, 1988), Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991), Международной конференции, посвященной 35-летию Гродненского медицинского института (Гродно, 1993), международном симпозиуме ЕБВИА (Стокгольм, 1997), совместных заседаниях лабораторий Института биохимии АН Беларуси и кафедры биохимии Гродненского государственного медицинского института (1990 - 1997).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 32 печатных работы. Из них 3 -за рубежом, 18 статей и 11 тезисов - в отечественных изданиях. По материалам работы защищено две диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских и биологических наук.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, методической части, 7 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 266 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 таблицей, 60 рисунками, занимающими объем в 30 страниц, и 3 фотографиями. Библиографический указатель включает 592 источника, из них отечественных авторов - 57 и зарубежных - 535.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Источники и характеристика экспериментального материала.

Основной объем исследований, связанный с выделением АДГ, выполнен на семенниках человека, полученных во время судебно-медицинских вскрытий не позднее 12 часов от момента смерти. Изучение этанолметаболизирующих ферментов (АДГ, каталаза, МЭОС) проводили на семенниках, полученных во время операций орхидэктомии по поводу новообразований предстательной железы. Остальные исследования выполнены на белых беспородных крысах-самцах массой 150-250 г. Забой производился методом декапитации в 9 - 10 часов утра.

Основные экспериментальные модели.

Острая алкогольная интоксикация у крыс моделировалась введением 20% (в/о) этилового спирта в растворе 0,85% хлорида натрия однократно, внутрибрюшинно в дозе 3,5 г/кг массы тела. Контрольные животные получали инъекцию 0,85% раствора №С1. Животных декапитиро-вали через определенные интервалы времени после воздействия.

Острая алкогольная интоксикация у здоровых добровольцев проводилась путем приема ими через рот 30% раствора этилового спирта из расчета 0,8 г Э на 1 кг массы тела. У всех обследуемых брали венозную кровь вечером через 4 часа после очередного приема пищи (с 19 ч до 20 ч). Сразу после этого обследуемые опытной группы выпивали раствор Э и через 1 час у них повторно брали кровь. Утром следующего дня (с 9 до 10 ч) брали кровь в третий раз у обследуемых опытной и второй - у обследуемых контрольной группы.

Острая алкогольная интоксикация у крыс в ряде моделей сочеталась с действием других эффекторов. Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) на фоне острой алкогольной интоксикации вводился подкожно, одномоментно с основным эффектором в дозе 400 ИЕ/кг массы, ни-котинамид - в дозе 200 мг/кг, этаноламин - 100 мг/кг.

Предварительное введение витамина Е осуществляли в двух режимах. В первой модели животных разделили на 4 группы. Первая и вторая группы в течение 10 дней один раз в сутки получали через рот 30% раствор токоферол ацетата в дозе 100 мг/кг массы. Третья и четвертая - эквивалентный объем оливкового масла. Затем, животным инъецировали внутрибрюшинно 20% Э в дозе 3,5 г/кг (1 и 3 группы), либо 0,85% хлористый натрий (2 и 4 группы) и декапитировали через различные интервалы времени (1,2,4 и 8 часов).

Во второй модели, группе крыс под легким эфирным наркозом вводили в один из семенников 3 мкл 30% токоферол ацетата, во второй - 3 мкл оливкового масла. Через 2 часа животным вводили внутрибрюшинно Э в дозе 3,5 г/кг массы (опытная группа ) или 0,85% №С1 (контрольная группа) и еще через 8 часов декапитировали.

Острая алкогольная интоксикация на фоне предварительного введения витамина А проводилась с использованием двух дозировок последнего. В первом эксперименте опытная группа животных получала через рот масляный раствор ретинол ацетата в дозе 62,5 мг/кг массы в сутки в первые три дня и 6 мг/кг в сутки - в последующие четыре, контрольная -эквивалентный объем оливкового масла. Далее, у части животных каждой группы моделировали острую алкогольную интоксикацию введением Э в виде 20% раствора в дозе 3,5 г/кг массы на срок 4 часа. В опыте с низкой дозой витамина А крыс самцов разделили на три группы. Первая -контрольная - содержалась на рационе вивария и не подвергалась никаким воздействиям. Вторая получала через рот один раз в день в течение двух недель 3,44% масляный раствор ретинол ацетата в дозе 5000 ед/кг массы. Третья - эквивалентный объем (5 мкл) оливкового масла. В последний день эксперимента животные второй и третьей групп делились надвое и каждой половине вводился внутрибрюшинно Э в дозе 3,5 г/кг массы на срок 4 часа. По истечении этого времени крысы декапитирова-лись.

Влияние витамина А на уровень Т в плазме крови мужчин изучали с участием практически здоровых добровольцев в возрасте 30-35 лет. Предварительно у каждого была взята кровь из вены для определения исходных гормональных показателей. Витамин А в виде капсул масляного раствора ретинола ацетата в дозе 33000 МЕ принимался испытуемыми ежедневно на протяжении 10 дней. После этого повторно бралась кровь на анализ. На протяжении эксперимента добровольцы вели обычный образ жизни, но полностью исключали из пищевого рациона алкогольные напитки.

Эффект дополнительного введения ретинол ацетата изучался, также, у группы больных хроническим алкоголизмом. В эксперименте участвовало 18 мужчин в возрасте от 32 до 56 лет, находившихся на стационарном лечении по поводу хронического алкоголизма в Гродненском областном психоневрологическом диспансере. После купирования абстинентного синдрома у больных брали кровь для определения Т. Далее всех испытуемых делили на две группы, одна из которых получала рег об масляный раствор ретинола ацетата в дозе 33000 МЕ в сутки. По истечении 10 дней повторно брали кровь на анализ.

Модулирование функциональной активности надпочечников на фоне острой алкогольной интоксикации проводилось следующим образом. За неделю до эксперимента формировали 5 групп животных. 1-ая - контрольная, далее условно называемая "интактной". У крыс второй группы моделировали стрессорное состояние иммобилизацией за конечности с помощью мягких марлевых лигатур, которая производилась за 2 часа до момента введения Э и продолжалась до момента забоя. Третьей группе за 2 часа до инъекции Э подкожно вводили суспензию дексаметазона в 0,5% агарозе в дозе 1 мг/ кг. Адреналэктомию (4-ая группа) осуществляли под эфирным наркозом за 4 суток до эксперимента. 5-ой группе животных за 4 часа до введения Э подкожно инъецировали 400 ед/кг ХГЧ. Затем все группы были разделены надвое. Одной половине был введен Э в дозе 3,5 г/кг внутрибрюшинно в виде 20% раствора, другой - эквивалентный объем 0,85% раствора №С1. Через 4 часа животных декапити-ровали.

Хроническая алкогольная интоксикация моделировалась кормлением животных полусинтетическим жидким кормом (1 ккал/мл), соотношение основных компонентов в котором (в процентах от общего калора-жа) составило: 18% белка, 35% жира, 47% углеводов в контрольной и 11% углеводов в диете, содержащей 36% Э. Э включали в диету постепенно: 12% в первые 3 дня, 24% в следующие 2 дня и 36%, начиная с пятого дня и до конца эксперимента. Животные были разделены на три группы: опытную, контрольную и парнокормленную. Последняя съедала количество корма, равное съеденному опытной группой за предыдущие сутки. Контрольная группа потребляла жидкий корм без ограничений. Через 24 дня животных забивали декапитацией.

ПОЛ индуцировали с помощью внутрибрюшинного введения на срок 3 часа четыреххлористого углерода (0,5 мл/кг массы ССЦ в виде 25% (о/о) раствора в оливковом масле) и у-облучения. В последнем случае животные были разделены на три группы. Первые две были подвергнуты однократному общему у-облучению квантами Со60 на установке АГАТ- РМ, РИП 75 см, мощность дозы 411-Ю'6 А/кг, экспозиционная доза - 187 мКи/кг. Третья служила контролем. Животные контрольной и одной из опытных групп были забиты через сутки, а вторая, опытная -через 5 суток после воздействия.

В ряде экспериментов процессы стероидогенеза моделировались in vitro в суспензии микросом. В среду добавлялся Э (конечная концентрация - 50 мМ, 200 мМ, 1М) или система индукции ПОЛ. В состав последней входили: FeCb (2 мМ), АДФ (2мМ), аскорбиновая кислота (0,2 мМ), NaCl (0,15 М).

Влияние Э и системы индукции ПОЛ изучалось также в культуре интерстициальных клеток.

Методы исследования.

Интерстициальные клетки семенников выделяли с помощью колла-геназы. Жизнеспособность клеток оценивали микроскопически после добавления к суспензии 0,5% раствора трипанового синего в 0,85% NaCl. Долю клеток Лейдига в общей популяции оценивали окрашивая их на активность Зр-ОН-стероиддегидрогеназы (Widenius, 1987).

Методом дифференциального центрифугирования выделяли ядра семенников (Blobel, Potter, 1966), микросомы (Kato, 1988). Чистоту ядер контролировали электронной микроскопией по методу Фусточенко, Хоха, Никитин (1981).

Выделение АДГ из семенников человека проводили разработанным нами методом (Воронов, Хоха, 1990). Гомогенность фермента определяли методом электрофореза в ПААГ (Laemmli, 1970), двойной радиальной им-мунодиффузией в агаре с моноспецифической антисывороткой. Электро-фореграммы окрашивали серебром по методу Morrissey (1981). Окраску геля на алкогольдегидрогеназную активность осуществляли по методу Ламека и соавт. (1985). Молекулярную массу нативного фермента определяли методом гель-фильтрации через сорбент TSK-HW-55, молекулярную массу субъединиц фермента - путем электрофореза в ПААГ в присутствии 0,1% ДСН (Weber, Osborn, 1969). Аминокислотный состав АДГ семенников определяли с помощью автоматического аминокислотного анализатора Т-339 "Microtechna" (Чехословакия). Кинетические исследования алкогольдегидрогеназной реакции проводили с использованием методов стационарной кинетики.

Антисыворотку к АДГ III получали путем иммунизации кроликов ферментом, дополнительно очищенным методом препаративного электрофореза. Антитела выделяли по Anaokar et. al. (1979). Титр антител определяли методом ИФА (Clare, 1981), специфичность - методами иммуно-блоттинга (Stott, 1989) и двойной радиальной иммунодиффузии. Коньюга-ты антител к АДГ III класса с пероксидазой хрена получали с помощью метода перийодатного окисления Nakane и Kawaoi (1974). Иммуногисто-химическое исследование локализации АДГ III класса в семенниках человека проводили с помощью стандартного набора для непрямого иммуно-гистохимического анализа Zymed streptavidin-biotin system (Zymed Laboratories Inc., США).

Активность СДГ измеряли по скорости превращения С14-прегненолона в прогестерон (Кашко, Хоха, 1993). Радиоактивность изме-

ряли на счетчике Марк 2 (США) в диоксановом сцинтилляторе (Bray, 1960).

Определение активности 17-гидроксилазы, С^о-лиазы, 17-дегидрогеназы осуществляли по скорости превращения прогестерона в Т через 17-гидроксипрогестерон и андростендион методом ВЭЖХ на микроколоночном хроматографе Милихром (Хоха и др., 1995). Активность АДГ измеряли по Dafeldecker (1986), лактатдегидрогеназы - как описано у Прохоровой (1982), изоферментов альдегиддегидрогеназы - по Величко

(1984). Активность МЭОС определяли с использованием [1,2- 14С]-Э, либо по образованию динитрофенилгидразона ацетальдегида, регистрируемого методом ВЭЖХ (Хоха, Воронов, 1990). Активность каталазы в гомо-генатах печени и семенниках измеряли по убыли перекиси водорода (Королюк, 1988). Пероксидазное окисление Э регистрировали по образованию [1,2- 14С]- ацетальдегида, либо - динитрофенилгидразона ацетальдегида (Хоха, Воронов, 1990). Определение активности поли-АДФР синте-тазы проводили с использованием аденил-[ 14С)-НАД по методу Corominas

(1985).

Концентрацию кортикостерона в плазме крови измеряли разработанным нами методом адсорбционной микро-ВЭЖХ (Хоха, 1989). Уровень данного гормона в семенниках определяли с помощью комбинации методов ВЭЖХ и РИА (Хоха и др., 1992). Определение Т в плазме крови, семенниках и среде инкубации интерстициальных клеток проводили радиоиммунным методом с помощью наборов Стерон Т 1251 (ИБОХ АНБ). Ад-ренокортикотропный (АКТГ), лютеинизирующий (ЛГ), фолликулостиму-лирующий (ФСГ), соматотропный (СТГ) и тиреотропный (ТТГ) гормоны в плазме крови определяли радиоиммунным методом с помощью наборов фирмы ORIS (Франция). Прогестерон, 11-дезоксикортизол, кортизол, кор-тикостерон (в плазме крови человека), эстрадиол, трийодтиронин (ТЗ), инсулин измеряли методом РИА наборами ИБОХ АНБ.

МДА в семенниках и интерстициальных клетках и ДК в семенниках и надпочечниках определяли по методу Стальной (1977). Флуоресцирующие продукты ПОЛ измеряли как описано у Fletcher (1973 ). Хеми-люминисцентные параметры микросом изучали на приборе ХЛМИЦ - 01, работающем в режиме счета фотонов (Зиматкина и др., 1989).

Определение цАМФ, Р-эндорфина и лей-энкефалина в семенниках крыс осуществляли методом РИА (INC, Англия) с предварительной хро-матографической очисткой образцов (Хоха и др., 1989). Уровень молочной, пировиноградной кислоты и НАД измеряли энзиматически, как описано у Туз, Прентис (1987). Определение ДНК проводили по методу Burton (1956). Белок измеряли по методу Lowry et. al. (1951), Bradford (1976) или Whitaker (1980). Определение концентрации Э в крови проводили га-зохроматографическим методом (Пронько, 1983). Содержание' восстановленного глютатиона измеряли с реактивом Эллмана (Торчинский, 1977). Уровень витамина Е в семенниках оценивали флуориметрически

(Островский, 1979), витамина С - по реакции с ДНФГ (Соколовский, 1976). Гемоглобин в крови определяли no Meyer (1962). Содержание крови в семенниках измеряли по количеству гемоглобина. Уровень К+, Na+, ионизированного кальция определяли с помощью ионселективного анализатора "Microlit" фирмы "Сопа".

Статистическую обработку данных проводили на компьютере IBM 486dx с помощью пакета программ BMDP для биомедицинских исследований Калифорнийского университета (1983). Рассчитывали t-критерий Стъюдента, множественные коэффициенты корреляции, проводили факторный и дисперсионный анализ. Методом кусочной интерполяции полиномами Лагранжа (Денисковец, 1988) обрабатывали данные РИА.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Биосинтез Т при острой и хронической алкогольной интоксикации.

1.1. Острая алкогольная интоксикация.

В модели острой алкогольной интоксикации уровень Т в плазме крови и семенниках достоверно снижался через 2, 4 и 8 часов после введения Э до 30 - 40 % от контрольных значений (рис. 1). Количество Т в семенниках составляет лишь несколько процентов от общего содержания гормона в крови. Транспорт в кровеносное русло осуществляется за счет пассивной диффузии по градиенту концентрации, а деградация проходит, в основном, в печени. Поэтому, считается, что концентрация в гонадах отражает скорость биосинтеза Т. Соответственно, зарегистрированные через 2, 4, 8 часов после введения Э сдвиги можно интерпретировать как угнетение биосинтеза данного гормона.

—контроль -•-этанол

время, мин

Рисунок 1. Концентрация Т в плазме крови (А) и семенниках (Б) крыс в динамике острой алкогольной интоксикации. * - Р < 0,05.

Содержание Э в крови достигает максимума к первому часу от начала эксперимента и не коррелирует с уровнем Т. Отсутствие снижения концентрации гормона в короткие сроки опыта свидетельствует о том, что эффект, скорее всего, не обусловлен прямым действием Э, а опосредован какими-то нейро-эндокринными и (или) метаболическими событиями.

Единственным микросомальным стероидогенным ферментом, активность которого достоверно снижалась при действии Э, была СДГ.

1.2. Влияние острой алкогольной интоксикации на гормональный статус здоровых людей.

Сравнение средних значений всех исходных показателей продемонстрировало однородность эндокринного статуса обследуемых (табл. I). С помощью многофакторного дисперсионного анализа установлено, что из рассмотренных показателей существенное влияние на уровень Т и отношение Т/эстрадиол оказывает фолликулостимулирующий гормон, на содержание прогестерона и коэффициенты 11-дезоксикортизол/ прогестерон, Т/прогестерон - лютеинизирующий гормон. АКТГ воздействует на величину 11-дезоксикортизол/прогестерон, ТТГ - на содержание трийод-тиронина (ТЗ), а также все изученные показатели - на концентрацию и К+ в сыворотке крови.

Характер воздействия алкоголя на гормональный статус по данным, полученным с помощью дисперсионного анализа, в утреннее и вечернее время различался. Определен достоверный вклад Э в изменение уровней кортикостерона, прогестерона, отношений 11-дезоксикортизол/ прогестерон, Т/эстрадиол, №+/К+, развивающиеся через 1 час после начала эксперимента. Через 12-14 ч после приема алкоголя выявлено статистически значимое влияние его на содержание прогестерона и отношение Т/прогестерон.

Отсутствие достоверного снижения концентрации Т имеет две вероятные причины. Во-первых, доза алкоголя могла быть недостаточно высокой. Для животных показано, что биосинтез Т снижается при введении более 1 г Э на килограмм массы тела. Во-вторых, достаточно большие интервалы между взятием крови в динамике интоксикации могли не позволить зафиксировать максимум эффекта.

1.3. Хроническая алкогольная интоксикация у крыс.

В качестве модели хронической алкогольной интоксикации было выбрано введение Э в составе жидкого рациона. На протяжении всего эксперимента наблюдалась положительная динамика массы животных, свидетельствовавшая об эффективности процедуры парного кормления. Уровень Т у опытных животных достоверно снизился по сравнению с контрольной группой, но не парнокормленной (табл. 2). Последняя, ограниченная в корме насильственно (а не добровольно, как этанолпотреб-ляющая), по-видимому, находилась в состоянии стресса, что и привело к снижению уровня Т. Поэтому, для данного исследования более коррекг-

ным является сравнение опытной группы животных с контрольной, а не парнокормленной.

Таблица 1. Влияние Э на биохимические параметры плазмы крови здоровых добровольцев.

* - различия достоверны с исходными показателями, ** - с показателями в контрольной группе; м- показатели рассчитаны для мужчин.

Показатель Исходный Через 1 час Контрольная Опытная

уровень (вечер) после нагрузки группа (утро) группа (утро)

Глюкоза, ммоль/л 4,67+0,11 4,74+0,22 4,6110,11 4.59+0,21

Инсулин, мкед /мл 20,06+2,65 16,39±1,78 17,7012,00 14,4311,22

Глюкоза/ инсулин 0.29+0,03 0,32+0,04 0,55+0,10* 0,28+0,03**

Кортизол, нмоль/л 176,1+19,4 139,8+19,7 313,3120,2* 414,7+40,6"

АКТГ, пг/мл 32,01+6,20 21,76±6,59 48,15+5,44' 25,09+5,90*

11-дезокси-кортизол, нмоль/л 8,24+1,27 7,81±0,77 12,8411,16* 14,75±3,13

Кортикостерон, нмоль/л 16,9+1,5* 11,0±0,9 21,9+2,1* 28,6+3,2

ЛГ, мед/мл 9,62+1,36 9,3810,78 9,81+0,89 9,11+1,18

ФСГ, мед/мл 3,56±0,49 3,87+0,56 3,60+0,34 4,05+0,59

СТГ, нг/мл 3,59+0,96 2,4410,77 2,ЗОЮ,51 3,1311,19

ТТГ, мед/л 3,02+0,56 2,36+0,24 2,77+0,40 3,5510,84

ТЗ, нмоль/л (м) 1,84±0,11 1,67+0,10 1,49+0,09* 1,88Ю,08**

Прогестерон, нмоль/л (м) 1,45±0,22 0,84+0,16* 1,74±0,36 3,53+0,81**

Т, нг/мл (м) 6,38±0,64 7,11+0,93 7,56±0,75 6,91+0,67

Эстрадиол, пмоль/л (м) 316,7+76,8 285,2155,1 353,5+72,0 244,4+46,8

К+, ммоль/л (м) 4,23±0,08 3,92+0,10* 4,03+0,07* 4,43Ю,09*

ммоль/л (м) 140,23±0,88 142,76+1,09 139,37+1,11 142,1711.29

Са2+ , ммоль/л 0,47+0,02 0,46+0,02 0,56+0,09* 0,46Ю,03*

Осмолярность, моем/л 297,2+2,0 299,5±2,3 294,812,9 300,3+4,8

№+/К+ 34,49+0,56 37,6410,65* 34,63+0.39 33,21+0,49*

Кортизол /11- 18,58+1,77 18,2513,47 27,9012,11* 25,7315,62

дезоксикортизол

11-дезоксикорти-зол/ прогестерон 4,62±1,76 14,11+2,64* 9,84±1,96* 6,38+2,06

Кортикостерон/ 14,72+3,46 17,76+3,92 18,83+3,98 13,98+3,57

прогестерон

Т/прогестерон (м) 6,31±1,56 16,10+5,22 11,7913,96 3,43+0,73*

Т/эстрадиол (м) 0,019±0,003 0,038+0,008* 0,03410,006* 0,04510,008

Таблица 2. Концентрация Т в семенниках и плазме крови крыс при хронической алкогольной интоксикации. * - р < 0,05 по отношению к контрольной группе.

Группы животных

Название показателя Этанол Парнокормлен-ный контроль Контроль

Т плазмы, нмоль/л 5,2+ 1,2 * 2,7 ± 0,7* 9,9+3,1

Т семенников, нмоль/г 0,31 ± 0,07 * 0,32 ± 0,09 * 0,67 ± 0,14

Определение активности микросомальных ферментов стероидогене-за продемонстрировало, что у этанолпотребляющих крыс достоверно снижен синтез прогестерона под действием СДГ и синтез Т под действием 17-дегидрогеназы (рис. 2). Поскольку эффект регистрируется как in vivo, так и in vitro, имеет место, вероятно, устойчивая модификация структуры фермента или его мембранного окружения.

1.4. Уровень Т у больных хроническим алкоголизмом.

Концентрация Т была измерена у 18 больных хроническим алкоголизмом, находящихся на стационарном лечении в Гродненском психоневрологическом диспансере. Было зафиксировано ее снижение по отношению к группе здоровых добровольцев на 34+8%.

1.5. Влияние Э на биосинтез Т in vitro.

Добавление Э уменьшает образование андростендиона микросомами семенников. Концентрация этого соединения через 64 мин в средах,

А 10 -

•Я

о с:

5 0 X

оГ

о £

а X О

гЬ

§ 5

1 2 3

Рисунок 2. Активность СДГ (А), 17-гидроксилазы (Б), С)7.20 -лиазы (В) и 17-дегидрогеназы (Г) в микросомах семенников крыс после хронической алкогольной интоксикации: 1 - контрольные, 2 - парнокормленные и 3 - потреблявшие Э животные.

содержащих 0,05 М, 0,2 М и 1 М Э, снизилась на 6, 16 и 53%, соответственно. Если учесть, что при этом снижается и суммарная концентрация андростендиона и Т, то можно заключить, что Э угнетает активность С17. 2о лиазы. 200 мМ Э снижал активность СДГ. Скорость реакций, катализируемых 17-гидроксилазой и 17-дегидрогеназой, особенно в присутствии 1 М Э была выше контроля. Таким образом, настоящее исследование устанавливает два возможных места ингибирования биосинтеза Т в микросомах: превращение Зр-гидрокси-5-ен-стероидов в З-оксо-4-ен-стероиды и образование андростендиона из 17- гидроксипрогестерона.

Далее, влияние Э изучали на культуре эндокриноцитов. Предварительно было продемонстрировано, что параметры выделяемых клеток соответствуют данным литературы. Жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим составила более 95%. 38,9% общей популяции положительно окрашивалось на активность СДГ, что говорит о высоком содержании в ней клеток Лейдига. Накопление Т в культуральной жидкости носило линейный характер на протяжении, как минимум, 5 часов. Скорость стероидогенеза зависела от концентрации ХГЧ.

Добавление Э до концентрации 50 мМ в инкубационную среду клеток Лейдига привело к снижению скорости биосинтеза Т на 47%.

Таким образом, исследование влияния однократного и хронического введения этилового алкоголя на профиль стероидных гормонов в плазме крови и семенниках, изучение эффектов Э in vitro - в препаратах микро-сом и культуре клеток позволило зафиксировать основные патогенетические эндокринные эффекты Э, что позволяет перейти к изучению молекулярных механизмов их возникновения.

Очевидно, что одним из ключевых метаболических процессов, интенсифицирующихся в тканях при алкогольной интоксикации и имеющих патогенетическое значение, является окисление Э. Поэтому, в качестве следующего шага в нашем исследовании мы выбрали оценку спектра и мощности в семенниках этанолметаболизирующих ферментов.

2. Характеристика этанолметаболизирующих ферментов семенников человека.

В организме животных и человека большая часть Э окисляется АДГ. Из других способов утилизации спирта важное значение имеет МЭОС и пероксидазная реакция, катализируемая каталазой.

2.1. Очистка и некоторые свойства АДГ семенников.

Нами разработан способ очистки АДГ из семенников человека, включающий стадии получения цитозоля, ионообменной хроматографии на DEAE-TOYOPearf-650 М, гель-фильтрации на TSK-HW-40 и аффинной хроматографии на 5ЧАМФ сефарозе 4В, что позволило получить препарат фермента с удельной активностью 923 нмоль НАДН/мин на I мг белка, степенью очистки - 344 и выходом 43,1% (табл. 3).

Фермент был гомогенен по данным электрофореза в ПААГ с ДСН и мигрировал одной зоной в соответствии с величиной молекулярной мае-

сы- 37000 кд. Аналитический диск-электрофорез в 10% ПААГ с последующей окраской на активность (субстрат - бутанол) выявил три изофор-мы с близкой по величине анодной подвижностью. Кроме этого, гомогенность выделенного фермента была подтверждена одиночными линиями преципитации при радиальной иммунодиффузии в агаре.

Таблица 3. Таблица очистки АДГ из семенников человека.

Наименование Объем, Концен- Актив- Удельн. Выход, Сте-

стадии очистки мл трация ность, активн., % пень

белка, нмоль нмоль очист-

мг/ мл НАДН / мин НАДН/ мин/мг ки

Гомогенат 75 18,7 50,14 2,68 100 0

Цитозоль 72 8,4 51,7 6,1 100 2,3

Хроматография 12,9 3,2 179,1 55,6 62,2 20,8

на DEAE-TOYO

Pearl - 650 М

Хроматография 24,1 1,8 95,5 52,6 62,2 19,6

на TSK-HW-40

Хроматография на 5'АМФ- се- 13,4 0,1 121,8 922,6 43,1 344

фарозе 4В

Удерживаемый объем АДГ при гель-фильтрации на колонке с ТБК-Н\У-55 соответствовал димерной форме молекулы.

Отдельные кинетические характеристики фермента измерены при рН 10,0 и суммированы в табл. 4.

Как видно, короткоцепочечные первичные спирты являются плохими субстратами для АДГ из семенников человека. Метанол до 2,5 М концентрации не окислялся совсем. Скорость превращения Э возрастала до 2,5 М без признаков насыщения, причем, такое поведение фермент демонстрировал и при физиологическом рН. Окисление длинноцепочечных спиртов катализировалось значительно эффективнее и подчинялось кинетике Михаэлиса-Ментен. Величина Кгп изменялась обратно пропорционально длине углеводородного радикала.

Типичной для АДГ, также, оказалась кривая зависимости скорости реакции от концентрации водородных ионов. Максимальная активность регистрировалась при рН 11,0 и далее резко снижалась, вероятно, вследствие денатурации белка.

Характерной чертой АДГ семенников человека явилось то, что она оказалась практически нечувствительной к пиразолу и его производным. Даже при 15 мМ концентрации ингибитора (субстрат - бутанол) снижение активности не превышало 10%.

Таблица 4. Некоторые кинетические константы АДГ семенников человека.

Название субстрата Км, мМ Kcat, мин-"1 Kcat/Км

Метанол нет активности нет активности нет активности

Этанол 2000 146* 0,073

Бутанол 330 259 0,78

Октанол 0,526 42 75

НАД+ (бутанол) 75 - -

НАД+ (этанол) 98 - -

* - при концентрации Э - 2М.

Сопоставление свойств выделенного из семенников фермента с литературными данными о кинетических параметрах различных АДГ позволило уверенно отнести его к III классу.

Как видно из полученных результатов, АДГ семенников практически не участвует в окислении Э. Каталитическая константа фермента в условиях, приближенных к физиологическим (pH 7,5 и концентрации Э 0,5 М), составляет приблизительно 2 мин"1. Соответственно, его вклад в наработку ацетальдегида внутри гонад или в смещение отношения НАД/НАДН при алкогольной интоксикации не может быть существенным.

Зарегистрировать кинетические параметры обратной реакции не удалось. Окисление НАД Н не наблюдалось при различных pH (6,5, 8,8, 10,0) и в буферных растворах различного состава. В качестве субстратов были исследованы следующие соединения: формальдегид, ацетальдегид, пентаналь, октаналь, метилглиоксаль, бензальдегид, гликолевый и глюта-ровый альдегиды.

2.2. Иммуноферментный и иммуногистохимический анализ АДГ III класса из семенников человека.

Антисыворотку получали иммунизацией кроликов. Ее моноспецифичность была подтверждена методом двойной радиальной иммунодиффу-зии и иммуноблоттинга. Антисыворотка дала удовлетворительные результаты в конструировании иммуноферментной тест-системы. Оптимальная концентрация антигена, определенная экспериментально, находится в диапазоне 30-100 нг/мл, степень разведения антисыворотки - 1:5000 -1:10000. Описанные условия анализа были использованы для определения содержания АДГ III в семенниках человека. Оно составило 1,288 и 1,047 мг/г, соответственно, для ткани двух здоровых мужчин репродуктивного возраста, погибших в автокатастрофе примерно за 8 часов до момента проведения анализа.

При изучении локализации АДГ III класса в семенниках человека иммуногистохимическим методом с использованием антител и стрептави-

дин-биотинового комплекса выявлена иммунореактивность в цитоплазме всех основных типов клеток: сперматогенном эпителии, поддерживающих клетках извитых канальцев, а также в интерстициальных эндокриноцитах (фото I). В ядрах всех типов клеток иммунореактивность АДГ Ш отсутствовала, что подтверждает наши биохимические исследования (Хоха и др, 1987). Среди сперматогенных клеток она меняется в зависимости от стадии их дифференцировки: незначительна в сперматогониях, резко возрастает в сперматоцитах второго порядка, вновь снижается в сперматидах и, особенно, в сперматозоидах. Иммунореактивность АДГ III в различных сперматоцитах значительно варьирует - от очень высокой до умеренной, что, вероятно, связано с различными фазами их роста и созревания.

Такой характер распределения АДГ III исключает возможность избирательного сосредоточения фермента в отдельных типах клеток и существенного влияния его на метаболизм в них Э.

Фото 1. Иммуногистохимическое распределение АДГ III в семенниках человека. Обозначены: а - поддерживающие клетки, б - сперматого-нии, в - сперматоциты 1 порядка, г - сперматоциты И порядка, д - спер-матиды, е - интерстициальные эндокриноциты, ж - соединительнотканная капсула, з - базальная мембрана. Микрофотогафия. Исходное увеличение-80.

2.2. Микросомальная этанолокисляющая система.

Активность МЭОС в семенниках человека определяли по наработке ацетальдегида используя два методических приема - с использованием 1,2-[14С]-Э и ВЭЖХ. Ни одним из них зафиксировать наработки ацетальдегида в ходе инкубации не удалось. Учитывая чувствительность метода, можно заключить, что активность фермента в данных условиях не превышает 0,2 нмоль/мин на 1 мг белка.

2.3. Каталаза.

В присутствии аскорбиновой кислоты и 1,10-фенантролина была зарегистрирована высокая скорость окисления Э в печени крысы - 1,137 нмоль/мин на 1 мг белка и на порядок меньше - в семенниках - 0,096 нмоль/мин на 1 мг белка.

Таким образом, очевидно, что из всех этанолметаболизирующих ферментов лишь последняя реакция обладает в семенниках достаточной мощностью in vitro. Ее активность in vivo будет зависеть, вероятно, от скорости генерации в ткани перекиси водорода.

В целом можно заключить, что семенники чрезвычайно инертны в окислении Э. Наряду с наличием гематотестикулярного барьера для аце-тальдегида и мощной альдегиддегидрогеназной активности тестикулярных клеток, это можно интерпретировать как механизм, обеспечивающий защиту жизненно важных процессов хранения и передачи генетической информации. Характерно, что ядра семенников полностью лишены даже Х-алкогольдегидрогеназной активности (Хоха и др., 1987).

3. Метаболические сдвиги в семенниках, индуцированные окислением Э, и их связь с биосинтезом Т.

3.1. Концентрация НАД и соотношение НАД/НАД'Н.

Единственным достоверным отличием между опытной и контрольной группой в модели острой алкогольной интоксикации явилось некоторое снижение уровня лактата через 8 часов после инъекции Э. Однако, этот эффект, как и некоторые другие статистически недостоверные колебания на сроки 15 минут и 2 часа, компенсировался аналогичным сдвигом в уровне пирувата. Следовательно, значение отношения НАД/НАДН существенно не изменялось. Статистически значимое влияние Э на концентрацию НАД проявилось в повышении уровня последнего через час после инъекции. Таким образом, полученные данные противоречат представлениям о том, что угнетение биосинтеза Т при острой алкогольной интоксикации опосредовано смещением отношения НАД/НАДН.

3.2. Активность АДГ и изоферментов АльДГ семенников крыс в динамике острой алкогольной интоксикации.

Анализ относительных сдвигов в активности исследуемых ферментов показывает, что они происходят синхронно в опытной и контрольной группе. Единственным достоверным различием до 4 часов действия Э было снижение активности АльДГ с высоким Km. Таким образом, какие-либо закономерные изменения функционирования этанолметаболизирующих ферментов в семенниках, позволяющие связать их с нарушением образования Т, в данном эксперименте не выявлены.

3.3. Концентрация свободных аминокислот в семенниках крыс в динамике острой алкогольной интоксикации.

Сравнительный анализ изменений в структуре фонда свободных аминокислот в печени и семенниках в динамике острой алкогольной интоксикации продемонстрировал, что окисление Э в последнем органе про-

текает с незначительной скоростью и не оказывает такого мощного, как в печени, воздействия на внутриклеточный обмен веществ.

4. Индукция ПОЛ при алкогольной интоксикации, как фактор повреждения семенников и нарушения стероидогенеза.

Одним из механизмов гонадотоксичности Э, по нашему мнению, может быть его способность оказывать влияние на интенсивность свобод-норадикальных процессов. Ряд продуктов его окисления, в том числе гид-роксиэтильный радикал, могут стимулировать ПОЛ.

4.1. Влияние Э на ПОЛ и показатели антиоксидантной защиты семенников.

4.1.1. Острая алкогольная интоксикация.

Изменение уровня продуктов ПОЛ в динамике острой алкогольной интоксикации отражено в таблице 5. На первый срок после введения Э найдено превышение количества ДК в контрольной группе, на более поздних сроках опытные данные достоверно выше контроля. Достоверных изменений в уровнях других продуктов ПОЛ - МДА и ФП - не отмечено. Содержание а-токоферола - компонента антиоксидантной защиты - не изменялось ни у контрольной, ни у опытной группы в течение всего эксперимента. Концентрация аскорбиновой кислоты в семенниках достоверно уменьшалась через 60 минут после введения Э. Уровень восстановленного глютатиона был ниже контроля во все сроки эксперимента (табл. 5).

Таблица 5. Содержание витамина С, глютатиона и показатели, характеризующие ПОЛ, в семенниках в динамике острой алкогольной интоксикации. В числителе - контрольные значения, в знаменателе - на фоне Э. * - Р < 0,05.

Показатель Время после инъекции (мин)

0 60 120 240

ДК, мкмоль/г 17,1 ± 4,2 50,5 ± 10,5 39,7 ± 4,3 * 29,8 ± 3,4*

21,2 + 5,3 58,6 ± 10,4 73,9 + 15,6

МДА, нмоль/г 43 ± 7 114 + 7 47 ± 8 43 + 7

126 + 14 33 + 5 34 ± 4

ФП, усл. ед. 92,4 ± 2,4 94,9 ± 6,7 91,2 ± 2,9 93,7 ± 2,0 92,7 ± 1,7

102,8 + 6,6 95,0 + 1,7

Аскорбиновая кислота, мкг/г 166+ 12 168 + 13* 145 + 10 173 ± 12

135 + 4 145 + 9 151 ± 13

Глютатион, ммоль/г 3,803±0,052 4,024±0,012* 4,154±0,028* 3,671+0,038*

3.726±0,057 3,651+0.034 3.563±0.022

Исследование показало, что в сроки 120 и 240 минут наблюдается достоверное снижение активности СДГ, Скорость реакций, катализируемых 17а-гидроксилазой, С^о-лиазой и 17-дегидрогеназой при этом не изменялась.

Увеличение концентрации ДК в семенниках, совпадающее по времени с максимальным угнетением биосинтеза Т, уменьшение активности СДГ, а также снижение содержания аскорбиновой кислоты и глютатиона можно расценивать как проявление индукции ПОЛ в семенниках. Отсутствие сдвигов в активности других стероидогенных ферментов указывает на то, что этот процесс при острой алкогольной интоксикации не приводит к выраженным повреждениям мембранных структур клеток Лейдига.

4.1.2. Хроническая алкогольная интоксикация.

Хроническую алкогольную интоксикацию моделировали с помощью жидкого рациона. На рис. 3 показано изменение уровня продуктов ПОЛ у этанолпотребляющих, контрольных и парнокормленных животных. Комплекс использованных методов дает возможность заключить, что алкогольная интоксикация приводит к активации процессов ПОЛ в семенниках. Наибольшие изменения наблюдаются в уровне флуоресцирующих продуктов.

100

о -

1 2 3

о о

¡25

1 2 3

О)

ч о

1 2 3

Рисунок 3. Изменение уровня продуктов ПОЛ в семенниках крыс после хронической алкогольной интоксикации: 1 - контрольная, 2 - пар-нокормленная, 3 - потреблявшая Э. * - Р < 0,05 к контролю.

Концентрация восстановленного глютатиона и аскорбиновой кислоты в семенниках алкоголизированных крыс достоверно не отличалась как от обычного, так и от парнокормленного контроля. Это отражает, вероят-

но, включение адаптивных механизмов, противодействующих окислительному стрессу в исследуемом органе.

Таким образом, снижение при хронической алкогольной интоксикации активности ферментов стероидогенеза, накопление ФП свидетельствует об активации ПОЛ в семенниках.

4.2. Влияние индукции ПОЛ на биосинтез стероидных гормонов в организме крыс.

С целью выяснения вопроса: в какой мере нарушения гормонопоэза в семенниках опосредованы усилением ПОЛ, мы попытались индуцировать перекисное окисление с помощью мощных и хорошо известных стимуляторов - CCI4 и у-облучения и сопоставить спектр формирующихся нарушений стероидогенеза с последствиями алкогольной интоксикации.

При у-облучении крыс достоверных изменений в уровне ДК в надпочечниках и семенниках не наблюдалось ни через одни, ни через пять суток. Хемилюминисцентные характеристики и антиоксидантная активность микросом, выделенных из семенников облученных крыс, не отличались от контрольных. Правда, достоверные изменения в уровне Т в плазме и семенниках также отсутствовали, что йе противоречит гипотезе о причинно-следственных взаимоотношениях между скоростью стероидогенеза и интенсивностью ПОЛ. В то же время, активность СДГ в микросомах семенников достоверно уменьшилась через сутки после воздействия.

Введение CCI4 снизило концентрацию тестостерона, увеличило уровень ДК в семенниках и привело к статистически значимому снижению активности СДГ и 17-дегидрогеназы.

Сопоставляя изложенные данные с особенностями стероидогенеза при алкогольной интоксикации, отметим ряд общих черт. Хроническая алкогольная интоксикация также сопровождается снижением концентрации Т, увеличением уровня ДК и угнетением активности 17-дегидрогеназы и СДГ семенников. Таким образом, в основе обнаруженных нарушений при интоксикации алкоголем и CCI4 может лежать общий механизм.

4.3. Взаимоотношения процессов биосинтеза Т и ПОЛ в модельных системах in vitro.

Для изучения влияния ПОЛ на активность ферментов стероидогенеза перекисное окисление было индуцировано in vitro. Измерение МДА в динамике опыта показало, что в опытной среде, в отличие от контрольной, идет интенсивная наработка продуктов. С целью усиления влияния липопероксидации на стероидогенез была проведена преинкубация системы индуцирования ПОЛ в течение 60 минут, после чего был добавлен прогестерон и запущена непосредственно реакция биосинтеза Т.

Индуцирование ПОЛ приводит к резкому снижению образования прогестерона, 17-ОН- прогестерона и Т. Концентрация этих соединений через 30 минут инкубации уменьшалась на 48, 83 и 89%, соответственно. Это свидетельствует об ингибировании всех ферментов микросомального

стероидогенного комплекса. Вероятно, повреждая клеточные мембраны, ПОЛ приводит к снижению активности ассоциированных на них фермен-татиных ансамблей стероидогенеза.

Добавление в среду системы индукции ПОЛ приводило к резкому увеличению накопления МДА в интерстициальных клетках (табл. 6). Эффект практически полностью обращался избирательным удалением из раствора ионов железа с помощью специфического хелатирующего агента - деферроксамина. В то же время, диметилсульфоксид - наиболее эффективный скэвенджер гидроксильных радикалов, благодаря своей высокой растворимости в биологических материалах,- ингибировал ПОЛ в значительно меньшей степени (табл. 6).

Добавление в инкубационную среду Э в концентрации 50 мМ, -достижимой в крови при алкогольной интоксикации, достоверно увеличивало содержание МДА в интерстициальных клетках. Более того, Э потенцировал действие системы индукции ПОЛ. Уровень МДА в среде с обоими индукторами был достоверно выше (табл. 6). Этот факт подтверждает предположение о преобладании in vitro у Э прооксидантных свойств и указывает, что, по крайней мере, часть его эффектов в семенниках может быть обусловлена этим явлением.

Таблица 6. Содержание МДА и биосинтез Т в интерстициальных клетках семенников при добавлении в среду различных эффекторов. Цифровые индексы обозначают номер группы, по отношению к которой данный показатель достоверно (р< 0,05) отличается.

№ Воздействие Содержание МДА (нмоль/ Ю6 кл) Биосинтез Т (в % к контр.)

1 Контроль 98±2 100±4

2 Система индукции ПОЛ 477±3 1 160+53 1

3 Система индукции ПОЛ + де-ферроксамин 133+92 232+75 1

4 Деферроксамин - 103±26

5 Система индукции ПОЛ + диметилсульфоксид 338+7 2 242+50 1

6 Этанол 152+16 1 53±3 1

7 Система индукции ПОЛ + этанол 611±12 '-2-3 73±7 1.2.3

8 АДФ 161±31 151+12 1

9 Ре 3+ 493+93 1 117±9

10 АМФ - 258+67 1

11 Аденин 112±20

12 УДФ - 125+21

Среди компонентов системы индукции ПОЛ наибольшей способностью модулировать образование МДА в клетках обладали ионы железа. Присутствие АДФ достоверно не изменяло этого показателя.

Способность клеток к биосинтезу Т отчетливо увеличивалась при добавлении системы индукции ПОЛ. Однако, этот феномен, вероятно, не имеет отношения к изменению скорости липопероксидации. При последовательном внесении в культуральную среду компонентов системы выяснилось, что стимулирующим действием обладает АДФ. Его активность, вероятно, опосредована влиянием на цепь тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования.

Если вместе с системой индукции ПОЛ в среду внести деферрок-самин, что, как было показано выше, резко уменьшает индукцию ПОЛ, стимуляция стероидогнеза возрастает. Причем, сам деферроксамин биосинтеза Т не изменяет. Аналогичное действие оказывает другой ингибитор свободнорадикальных процессов - диметилсульфоксид (табл. 6). Это говорит о том, что ПОЛ угнетает стероидогенез. На это же указывают эффекты Э. Добавление этого агента в инкубационную среду снижает скорость биосинтеза Т. Комбинация его с системой индукции ПОЛ, вызывающая наибольшее накопление в клетках МДА, резко снижает ее способность стимулировать стероидогенез (табл. 6).

В целом, полученные данные согласуются с представлениями об ингибирующем влиянии ПОЛ на биосинтез Т. Соответственно, действие Э на стероидогенез в семенниках, по крайней мере частично, может осуществляться по механизму усиления липопероксидации.

5. Роль гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси в угнетении Э биосинтеза Т.

Острое и хроническое введение Э сопровождается активацией ги-поталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. В то же время, негативное влияние стресса на стероидогенез в семенниках хорошо известно. Поэтому логично предположить, что подавление биосинтеза Т при алкогольной интоксикации может частично реализовываться в рамках общих механизмов взаимодействия двух нейроэндокринных осей: гонадной и надпочечниковой.

5.1. Уровень кортикостерона в плазме крови и надпочечниках в динамике острой алкогольной интоксикации.

Введение Э в организм крыс приводит к увеличению концентрации кортикостерона в плазме крови и в надпочечниках. В начальной фазе реакции обе группы животных демонстрируют одинаковый выброс гормона, однако, уже через 30 минут отмечается превышение показателей в опытной группе над контрольной. Это превышение достоверно в сроки 30, 60 и 240 минут. Уровень гормона в надпочечниках изменяется аналогично, хотя и менее выраженно, что свидетельствует об ускорении не только выброса, но и образования кортикостерона при острой алкогольной интоксикации.

Следует отметить, что активация гормонсинтезирующей функции надпочечников предшествует по времени угнетению биосинтеза Т.

5.2. Уровень Т и продуктов ПОЛ в семенниках при различной функциональной активности надпочечников.

Введение дексаметазона резко снижало биосинтез собственных кортикостероидов в надпочечниках. Адреналэктомия приводила к достоверному снижению уровня кортикостерона в плазме крови. Наличие напряжения в системе ГГН подтверждается повышением уровня АКТГ у этих животных. Введение ХГЧ сопровождалось незначительным снижением, по отношению к "интактной" группе, уровня кортикостерона в плазме крови.

Перечисленные экспериментальные воздействия оказали выраженное влияние на функцию семенников. Стресс и введение дексаметазона вызвали существенное снижение концентрации Т в плазме и семенниках (рис. 4). Любопытно, что аналогичный эффект оказала адреналэктомия. В плазме, по отношению к "интактной" группе, уровень гормона снизился. В семенниках этот эффект был выражен в меньшей степени.

В семенниках введение дексаметазона и стресс увеличивают, по отношению к "интактной" группе, содержание диеновых конъюгатов (рис.4). Эффект Э достоверен только в "интактной" группе животных. В целом, за исключением группы животных, которым вводился гонадотро-пин, отмечается обратная зависимость скорости стероидогенеза от уровня ДК. Это подтверждает тезис о том, что ПОЛ может быть одним из факторов, участвующих в" регуляции стероидогенеза.

По отношению к "интактным" животным, получившим лишь инъекцию физраствора, уровень тестостерона в плазме и семенниках уменьшился в 2-2,5 раза. При введении ХГЧ относительное снижение было выражено в меньшей степени, однако, абсолютный эффект был выше. При стрессе, введении дексаметазона и адреналэктомии действие Э не проявлялось (рис. 4). Поэтому, можно предположить, что воздействие Э на гонады реализуется в рамках общих закономерностей взаимодействия двух систем - надпочечниковой и гонадной. Соответственно, подавление образования Т в исследуемых экспериментальных ситуациях могло реализоваться по разным механизмам. При введении дексаметазона главную роль играет повышение глюкокортикоидного фона в крови. При адреналэктомии - изменение функции нейроэндокринных центров, в том числе - увеличение синтеза АКТГ и р-эндорфина. В случае иммобилизационного стресса - это сочетание обоих факторов. На фоне действия ХГЧ, вероятно, реализуется независимый от надпочечников механизм. Рецепторы ЛГ в данной экспериментальной ситуации блокированы гонадотропином, что позволяет исключить влияние вышестоящих уровней регуляции. В условиях максимально стимулированного стероидогенеза создаются идеальные условия для реализации местных эффектов Э, в т.ч. - индукции ПОЛ и, возможно, конкуренции за никотинамидные коферменты.

л ч о

= .20

10 -

□ контроль И этанол

лЛ1

120

□ контроль 0 этанол

12 3 4 5

1 2 3 4 5

Рисунок 4. Концентрация Т в плазме крови и ДК в семенниках крыс на фоне различной функциональной активности надпочечников. 1 -контроль, 2 - стресс, 3 - дексаметазон, 4 - адреналэктомия, 5 - ХГЧ. * - Р < 0,05.

То, что в каждой из этих ситуаций, эффект Э неаддитивен к действию основного эффектора, свидетельствует о том, что его активность опосредуется различными механизмами взаимодействия двух систем - гонадной и надпочечниковой.

Если это взаимодействие реализуется на центральном уровне, то в семенниках оно должно отразиться на концентрации вторичных мессенд-жеров. В динамике острой алкогольной интоксикации было измерено содержание цАМФ. В семенниках оно существенно изменялось в контрольной и опытной группах, по отношению к исходному уровню, однако, эти колебания происходили синхронно. Достоверно ниже по отношению к контролю этот показатель был лишь через 7 часов.

Концентрация цАМФ в какой-то мере отражает интенсивность ги-пофизарной стимуляции гонад. И то, что при действии Э она снижалась весьма незначительно и не коррелировала с уровнем Т (г = -0,14), свидетельствует против центрального механизма угнетения стероидогенеза при

острой алкогольной интоксикации. Следовательно, влияние гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы реализуется либо непосредственно на уровне семенников, либо вовлечены другие мессенджеры.

Принятие тезиса об опосредовании эффектов этанола в семенниках элементами гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы открывает новые возможности в изучении механизмов гонадотоксичности Э и разработке способов профилактики и коррекции алкогольных повреждений, основанных на использовании антистрессорных и адаптогенных мероприятий.

5.3. Уровень кортикостерона в семенниках крыс при различной функциональной активности надпочечников и острой алкогольной интоксикации.

Одним из механизмов взаимодействия гонадной и надпочечниковой осей может быть прямое действие кортикостероидов на биосинтез андро-генов. Мы предположили, что особую роль в этом процессе может играть кортикостерон, синтезируемый in situ - в семенниках.

Комбинацией методов ВЭЖХ и РИА продемонстрировано наличие в семенниках кортикостерона. Его концентрация у контрольных животных составила 29,2±5,7 пмоль/г. Она резко снижалась при адреналэктомии и не реагировала на дополнительный стресс. Уровень гормона у ложноопе-рированных животных также снижался, хотя и не столь выраженно. Из полученных данных следует, что сдвиги в концентрации кортикостерона в семенниках аналогичны таковым тестостерона и, вероятно, регулируются гонадотропинами. Было показано, также, наличие 1 lp-гидроксилазной активности в митохондриях семенников. Она составляла 4-5% от скорости, регистрируемой в коре надпочечников.

Изменения концентрации кортикостерона в семенниках при острой алкогольной нтоксикации соответствовали приведенным выше рассуждениям. Введение Э в дозе 3,5 г/кг массы тела крыс приводило через 4 часа к снижению этого показателя (контроль - 28,5±4,4, опыт - 16,9±4,7; Р<0,05).

Таким образом, можно допустить, что взаимоотношения между надпочечниками и семенниками при алкогольной интоксикации могут реализовываться и на уровне "эндокринной периферии". Выяснение молекулярных механизмов взаимного влияния требует дополнительных исследований.

5.4. Вовлечение локальной опиоидной системы семенников в реализацию эффектов Э.

Наше предположение о возможности опосредования эффектов Э опиоидной системой семенников не нашло подтверждения в эксперименте. Достоверных различий между опытом и контролем по уровню (5-эндорфина и лей-энкефалина не удалось зафиксировать ни в один из исследованных сроков действия Э.

6. Коррекция нарушения биосинтеза Т при алкогольной интоксикации на основе постулированных патогенетических механизмов.

На основании проведенных исследований можно допустить, что корригирующее действие на биосинтез Т при алкогольной интоксикации будут оказывать соединения, обладающие антистрессорной, антиокси-дантной и антиметаболитной, по отношению к этанолу, активностью.

6.1. Влияние этаноламина на подавление биосинтеза Т, вызванное Э.

Этаноламин является структурным аналогом Э и оказывает влияние на активность этанол- и альдегидметаболизирующих ферментов. В последнее время обнаружено его антистрессорное действие при острой алкогольной интоксикации (Быков и др., 1989).

Введение Э сопровождалось снижением концентрации Т в плазме крови и семенниках. Ту же векторность имели сдвиги, вызванные этано-ламином, хотя выражены были в меньшей степени. Достоверное снижение отмечалось лишь в плазме крови. Введение этаноламина совместно с Э не корригировало, но и не усугубляло действия последнего.

Изменения концентрации кортикостерона носили иной характер. При действии обоих соединений раздельно эффект отсутствовал, а при совместном введении наблюдался парадоксальный ответ - концентрация кортикостерона увеличивалась втрое по отношению, к контролю. Очевидно, что применение этаноламина для коррекции эффектов Э в семенниках представляется мало обоснованным.

6.2. Влияние никотинамида на снижение биосинтеза Т, вызванное Э.

Известно, что никотинамид активно вмешивается в обмен НАД, увеличивая его биосинтез в несколько раз (Виноградов, 1987) и снижая утилизацию кофермента в поли-АДФ-рибозосинтетазной реакции (Hutting, 1988). Если клетки Лейдига имеют особенности в обмене Э, можно допустить, что данный агент может нивелировать в них влияние спирта на уровень и соотношение окисленных и восстановленных форм никотинамидных коферментов и, возможно, на биосинтез Т.

В эксперименте, однако, никотинамид не оказывал влияния на уровень гормона ни в плазме крови, ни в семенниках. При одновременном введении с Э он существенно не модифицировал действия последнего. Активность поли-АДФ-рибозосинтетазы в ядрах, изолированных из тести-кул крыс, получивших инъекцию Э, никотинамида или их комбинации, также не менялась Концентрация НАД в семенниках достоверно не изменялась ни в одной группе. Лишь при совместном введении с Э сдвиги носили характер тенденции к повышению этого показателя. Концентрация НАД не коррелировала с уровнем Т в семенниках. То, что концентрация Т и НАД изменялись разнонаправленно и не коррелировали друг с другом, свидетельствует о том, что эти сдвиги не были взаимно обусловлены. Соответственно, вызванное Э угнетение гормонопоэза в гона-

дах, вероятно, реализуется по другим механизмам, не связанным с метаболизмом НАД.

6.3. Влияние витаминов, обладающих антиоксидантным действием, на взаимоотношения процессов ПОЛ и биосинтеза Т.

6.3.1. Витамин Е.

Наиболее четко способность подавлять аутокаталитические перок-сидазные реакции в липидном бислое выражены у витамина Е. Поэтому, мы предприняли попытку использовать предварительное введение токоферола ацетата для коррекции эффектов Э в семенниках.

Введение Э снизило концентрацию Т в семенниках на фоне предварительной витаминизации. Эффект наблюдался через час после алкоголизации и сохранялся через 2 и 4 часа. К 8 часам показатель возвращался к норме. Витамин Е не оказывал антистрессорного действия в данных условиях и уровень кортикостерона на фоне введения токоферол ацетата был даже выше, чем в контроле. Следует отметить, что на фоне введения 70 мкл оливкового масла (контроль) ингибирующий эффект Э отсутствовал.

Анализируя динамику уровня диеновых конъюгатов в семенниках крыс, следует отметить, что сдвиги выражены незначительно (на один срок) и не коррелируют с изменением концентрации Т. Содержание - восстановленного глютатиона уменьшалась в гонадах в динамике алкогольной интоксикации и витамин не оказывал при этом защитного действия.

Возможно, что отсутствие протекторного эффекта обусловлено высокой дозой витамина.' Известно, что последний может оказывать в таких случаях даже прооксидантное действие. Это согласуется и с данными следующего эксперимента, где токоферол вводился интратестикулярно с целью создания максимальной концентрации витамина in situ.

У контрольных животных концентрация Т была несколько выше в семенниках, в которые был введен токоферол, однако это различие не было достоверным. Использование в качестве контроля контрлатерального органа достоверно продемонстрировало, что витамин Е стимулирует образование Т у контрольных животных и не оказывает влияния на фоне Э. Сравнение концентрации гормона у животных разных групп показало, что острая алкогольная интоксикация оказывает угнетающее действие на стероидогенез в семенниках независимо от витаминного фона.

6.3.2. Витамин А.

6.3.2.1. Эффекты большой дозы витамина на фоне острой алкогольной интоксикации.

Молекулярный механизм действия витамина до конца не ясен, однако показано, что одним из компонентов является антиоксидантный эффект, обусловленный способностью ретинола образовывать резонансно-стабилизированные радикалы (Спиричев, 1989).

Содержание Т увеличивалось в плазме крови животных предварительно витаминизированных ретинола ацетатом. В комбинации с Э вита-

мин нормализовал уровень Т, а в сочетании с внутрибрюшинным введением физиологического раствора уровень гормона превысил контрольный (интактные животные) почти вдвое. Аналогичная тенденция, хотя и в меньшей степени, отмечается и в семенниках (табл. 7).

Несмотря на то, что введение витамина per os осуществлялось в щадящих условиях (одним и тем же лицом, нетравматичным методом), уровень кортикостерона во всех экспериментальных группах оказался достоверно выше, чем у интактных.

Замечательным свойством витамина А оказалась его способность нарушать реципрокность изменений уровня андрогенов и кортикостерои-дов. Содержание Т в плазме крови витаминизированных животных существенно возрастало, несмотря на повышенный уровень кортикостерона.

Содержание продуктов ПОЛ повышалось, как под действием Э, так и витамина А. Возможно, влияние ретинола опосредуется центральными звеньями регуляции.

Таблица 7. Содержание стероидных гормонов в эндокринных железах и плазме крови при введении Э и ретинола ацетата. Цифровым индексом обозначены группы животных, по отношению к которым данный показатель достоверно ( Р < 0,05) отличается.

Название группы Т (семенники), нмоль/г В (надпочечники), нмоль/г Т (плазма), пмоль/мл В (плазма), пмоль/мл

Интактные животные 5,5 ± 1,2 11,9 ± 3,2 0,99 ± 0,44 176,0 ± 32,6

Ол. масло + 0,85% №С1 6,9 ± 1,5 80,2 ± 11,6 1 0,59 ± 0,22 397,8 ± 42,8'

Ол. масло+ Э 7,4 ± 1,2 78,1 ± 9,4 1 0,09 ± 0,04 2 490,0 ± 37,0'

Витамин А + 0,85% ЫаС1 13,6 + 3,1 56,8 ± 7,8 1 1,74 ± 0,59 1 409,0 ± 55,2'

Витамин А + Э 11,1 ± 3,6 62,1 ± 5,6 1 0,59 + 0,43 4 477,8 + 33,8'

6.3.2.2. Влияние малой дозы витамина А на стероидогенез в семенниках и уровень кортикостерона в плазме крови.

Известно, что ретинол может оказывать при алкогольной интоксикации гепатотоксическое действие. Поэтому, представляла интерес проверка эффективности более малых доз. Курсовое введение 5000 ед/кг массы витамина А привело к увеличению уровня Т в плазме крови и семенниках по сравнению с интактным контролем и животными, получавшими оливковое масло, в 2 раза (рис. 5). Введение витамина А сопровождалось тенденцией к повышению уровня кортикостерона в плазме кро-

ви. Э снижал концентрацию Т в плазме и семенниках как на контрольном фоне, так и при действии витамина А. Однако, в последнем случае содержание гормона даже превышало уровень интактных животных. Изменение витаминного фона не влияло на активность СДГ в семенниках.

В целом, полученные данные позволяют предположить, что витамин А может быть универсальным фактором, улучшающим гонадальный статус животных, что особенно важно для коррекции нарушений, вызываемых стрессом и алкогольной интоксикацией.

6.3.2.3. Влияние ретинола ацетата на уровень Т у здоровых людей добровольцев и больных хроническим алкоголизмом.

В настоящем исследовании изучали влияние витамина А на уровень Т в плазме крови здоровых добровольцев и лиц, страдающих алкоголизмом и находившихся на стационарном лечении по поводу основного заболевания. Ретинола ацетат вводился через рот в дозе 33000 МЕ в сутки в течение 10 дней.

500

400 -

^ 300

Л 200

400 -0 —

1 2 3 4 5

Рисунок 5. Концентрация Т в семенниках крыс после введения витамина А и Э. 1- контроль; 2 - оливковое масло; 3 - оливковое масло + Э; 4 - витамин А; 5 - витамин А + Э. * - Р < 0,05 по отношению к соответствующему контролю.

Методом многофакторного дисперсионного анализа выявлено, что факторами, существенно влияющими на уровень Т, являются возраст №=4,31; Р<0,05) и алкоголизм №=30,73; Р<0,0001). У добровольцев в возрасте до 35 лет витамин А вызывает достоверный прирост концентрации Т (+ 2,5+0,51 нмоль/л). У алкоголиков, находящихся на стационарном лечении, средний уровень гормона также возрастал на 16%, однако это изменение носило недостоверный характер. Полученные данные по-

гН

зволяют допустить, что витамин А может быть использован в терапии алкоголизма для профилактики гипогонадизма.

6.3.2.4. Влияние ретинола ацетата на биосинтез Т in vitro.

Эффект in vivo может реализовываться разными путями - через изменение функциональной активности центральных звеньев эндокринной регуляции, либо местно - на уровне клеточного метаболизма. Для решения этого вопроса было исследовано влияние витамина А на стероидоге-нез в клетках Лейдига и активность отдельных ферментов в микросомах семенников крыс.

К выделенным интактным микросомам добавлялся ретинола ацетат в концентрациях 50 и 500 мкг%. Витамин А дозозависимо снижал скорость биосинтеза Т интерстициальными клетками семенников. Максимальный и статистически достоверный эффект отмечался при концентрации ретинола - 500 мкг%. Этот несколько неожиданный результат предполагает, что механизмы действия ретинола in vivo и in vitro различаются. Можно предположить, что in vivo витамин активирует центральные звенья гипоталамо- гипофизарно- гонадной оси и этот эффект преодолевает негативное влияние на уровне клеток Лейдига.

Ферменты биосинтеза Т функционируют в мембранах эндоплазма-тического ретикулума. В свою очередь, витамин А является гидрофобной молекулой, и логично предположить, что он, накапливаясь в липидном бислое, может модифицировать свойства мембран и ассоциированных на них ферментативных ансамблей. Поэтому, для дальнейшего выяснения механизма действия ретинола на стероидогенез, было изучено его влияние на активность ферментов в микросомах семенников.

Единственным ферментом, активность которого стимулировалась ретинола ацетатом, была СДГ. Добавление витамина в концентрации 50 и 500 мкг% увеличивали ее примерно в равной степени. В то же время, дозозависимо снижалась активность 17-гидроксилазы и 17-дегидрогеназы. С 17.20 - лиаза на добавление ретинола достоверно не реагировала. Эти факты интересны в плане возможности коррекции витамином А нарушений стероидогенеза при алкогольной интоксикации. Как было нами показано, ключевым молекулярным дефектом при этом является снижение образования прогестерона из прегненолона. Негативное влияние на другие звенья стероидогенной цепи может не иметь in vivo значения, так как именно СДГ является лимитирующим скорость ферментом на микросо-мальной стадии андрогеногенеза (Ishii-Ohba, 1986).

ВЫВОДЫ.

1. Острая и хроническая алкогольная интоксикация сопровождается угнетением биосинтеза Т в семенниках и снижением его концентрации в плазме крови. Э угнетает стероидогенез in vitro в культуре интерстици-альных клеток. Основным молекулярным дефектом в функционировании микросомального стероидогенного комплекса при действии Э является угнетение активности СДГ.

2. АДГ из семенников человека относится к III классу изофермен-тов и проявляет низкую субстратную специфичность и каталитическую активность по отношению к Э. Иммуногистохимически показано наличие данного фермента во всех типах клеток семенников человека, причем, наибольшая концентрация зафиксирована в сперматоцитах и сперматого-ниях. В ядрах клеток АДГ отсутствует.

3. Ткань семенников человека катализирует пероксидазное окисление Э со скоростью 96 ± 10 пмоль/мин/мг белка. Активность микросо-мальной этанолокисляющей системы в семенниках человека незначительна в сравнении с активностью в печени и не превышает 0,2 нмоль аце-тальдегида/мин/г влажной ткани.

4. Свойства этанолметаболизирующих ферментов и характер метаболических изменений в семенниках (уровень НАД, отношение НАД/ НАД Н, аминокислотный спектр) при острой алкогольной интоксикации свидетельствует о низкой скорости обмена в них Э и незначительной роли сдвига окислительно-восстановительного потенциала клеток в угнетении биосинтеза Т.

5. Острая и хроническая алкогольная интоксикация сопровождается активацией ПОЛ в семенниках крыс, что является одним из механизмов угнетения биосинтеза Т. Э индуцирует липопероксидацию и потенцирует действие прооксидантов в культуре клеток Лейдига.

6. Активация ПОЛ угнетает биосинтез Т в семенниках in vivo, культуре клеток Лейдига, препаратах микросом. Активность микросо-мальных ферментов йтероидогенеза и, в первую очередь, СДГ может служить чувствительным маркером прооксидантного действия различных эффекторов.

7. Алкогольная интоксикация увеличивает концентрацию кортико-стерона в надпочечниках и плазме крови крыс. Изменение функциональной активности надпочечников, сопровождающееся увеличением, либо уменьшением концентрации кортикостероидов в различных экспериментальных ситуациях, предотвращает угнетение биосинтеза Т Э. Ингиби-рующее действие Э на стероидогенез в семенниках частично опосредуется активацией гипоталамо-гипофизарногнадпочечниковой системы.

8. Витамины А и Е, обладающие антиоксидантными свойствами, стимулируют биосинтез Т у крыс. Ретинола ацетат увеличивает концентрацию Т в семенниках и плазме крови крыс, как на интактном фоне, так и при алкогольной интоксикации, в плазме крови людей добровольцев; стимулирует базальный стероидогенез в клетках Лейдига и повышает активность СДГ в препаратах микросом in vitro. Витамин А нарушает реци-прокность функционирования гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и гонадной систем, одновременно увеличивая концентрацию в крови как андрогенов, так и кортикостероидов.

Список основных публикаций по материалам диссертации.

1. Хоха A.M., Воронов П.П., Фусточенко Б.П., Величко М.Г. Ломе-ко И.Е. Ферменты обмена этанола в ядрах семенников//В кн.: Структура и функции клеточного ядра. - Москва, 1987.- С. 187.

2. Хоха A.M., Воронов П.П. Выделение и некоторые свойства алко-гольдегидрогеназы из семенников человека//Наука - практике. Тез. докл. 4 Гродненской областной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Гродно, 1987.- С. 96.

3. Хоха A.M., Воронов П.П. Алкогольдегидрогеназа из семенников человека не участвует в обмене этанола//Наука- практике. Тез. докл. 4 Гродненской областной научно- практической конференции молодых ученых и специалистов. - Гродно, 1987.- С. 109.

4. Денисковец A.A., Воронов П.П., Хоха A.M. Об одном подходе статистической обработки экспериментальных данных// В кн.: Перспективные методы планирования и анализа при исследовании случайных полей и процессов. - Гродно, 1988.- С. 97.

5. Хоха A.M. Патогенез алкогольного синдрома плода// Акушерство и гинекология.- 1988,- №1.- С.5-7.

6. Хоха A.M., Воронов П.П., Фусточенко Б.П. Алкогольный синдром плода// Здравоохранение Беларуси.- 1988.- №4.-С.53- 56.

7. Хоха A.M. Определение кортикостерона ,в плазме крови крыс методом адсорбционной ВЭЖХ// Вопр. мед. химии.- 1989, №5,- С.122-127.

8. Ляликов С.А., Орехов С.Д., Воронов П.П., Хоха A.M. Влияние этанола на динамику некоторых гормонов и электролитов в сыворотке крови человека//Наука-практике. Тез. докл. 5 Гродненской областной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. -Гродно, 1989. -С. 37.

9. Хоха A.M., Воронов П.П. Этанол снижает концентрацию эстра-диола в плазме крови крыс//Наука-практике. Тез. докл. 5 Гродненской областной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Гродно, 1989.- С. 52.

10. Воронов П.П., Хоха A.M. Оптимизация условий аффинной хро-матогра фии при очистке алкогольдегидрогеназы из семенников человека/ /Наука- практике. Тез. докл. 5 Гродненской областной научно- практической конференции молодых ученых и специалистов. - Гродно, 1989.-С. 55.

11. Хоха A.M., Воронов П.П., Фусточенко Б.П. К механизму подавления биосинтеза тестостерона этанолом// Проблемы эндокринологии. -1989.- Т. 35, N 3,- С. 68-72.

12. Быков И.Л., Тарасов Ю.А., Чумаченко С.С., Островский Ю.М., Хоха A.M. Антистрессорное действие этаноламина при острой алкогольной интоксикации//Проблемы эндокринологии. - 1989,- Т.35, №3.- С.72-74.

13. Хоха А.М., Воронов П.П., Фусточенко Б.П. Уровень тестостерона, НАД и отношения НАД/НАДН в семенниках крыс при острой алкогольной интоксикации// Ред. ж. Фармакология и токсикология. Москва, 1989. Деп. в ВИНИТИ 13.09.89, N 5848-В 29.

14. Ляликов С.А., Орехов С.Д., Воронов П.П., Хоха А.М. Влияние острой алкогольной интоксикации на гормональный статус здоровых людей/ / Вопросы наркологии. - 1989.- N 4.- С. 3-7.

15. Воронов П.П., Хоха А.М. Этанолметаболизирующие ферменты семенников человека// Биохимия. 1990.- Т. 55, N 8,- С. 1451 - 1460.

16. Lyalikov S.A., Orekhov S.D., Voronov P.P., Khokha А.М. Effect of acute alcohol intoxication on hormonal status in healthy persons// Alcohol and alcoholism. 1991,- V. 26, N 2.- P. 228.

17. Хоха A.M., Воронов П.П. Никотинамид не оказывает влияния на снижение биосинтеза тестостерона, вызванное этанолом// Укр. био-хим. ж..- 1991,- Т. 63, N 5,- С. 67-73.

18. Кашко М.Ф., Хоха А.М. Этанол и процессы перекисного окисления липидов влияют на стероидогенез в семенниках// 6-ая Гродненская конференция молодых ученых и специалистов: Тез. - Гродно, 1990.-С.6.

19. Хоха А.М., Анцулевич С.Н., Воронов П.П., Дорошкевич Н.А., Кашко М.Ф. Влияние витамина Е на метаболические изменения в семенниках, вызванные этанолом// Всесоюзная конференция по клинической витаминологии: Тез.- Москва, 1991,- С.332.

20. Хоха А.М., Воронов П.П., Дорошкевич Н.А., Кашко М.Ф., Анцулевич С.Н. Влияние витамина Е на метаболические сдвиги в семенниках, вызванные этанолом// М.,1991.- 7с.-Деп. в ВИНИТИ, №4103-В.

21. Хоха А.М., Кашко М.Ф., Воронов П.П., Дорошкевич Н.А., Анцулевич С.Н. Влияние острой алкогольной интоксикации на процессы перекисного окисления липидов в семенниках и надпочечниках крыс// Вопросы питания,- 1993.- №1.- С.30-34.

22. Хоха А.М., Кашко М.Ф., Воронов П.П., Дорошкевич Н.А., Анцулевич С.Н. Концентрация кортикостерона в семенниках крыс в динамике острой алкогольной интоксикации// Проблемы эндокринологии.-1992.-№1.-С.59-61.

23. Кашко М.Ф., Хоха А.М., Дорошкевич Н.А.. Анцулевич С.Н., Воронов П.П. Влияние этанола и индуцируемого им перекисного окисления липидов на стероидогенную активность семенников// Украинский биохимический журнал.- 1993,-Т.65,№2.- С.89-94.

24. Кашко М.Ф., Воронов П.П., Хоха А.М. Перекисное окисление липидов опосредует эффекты этанола в культуре клеток Лейдига// Международная научная конференция: Тез.- Гродно, 1993.- С.324-325.

25. Хоха А.М., Воронов П.П., Зиматкин С.М. Иммуноферментный и иммуногистохимический анализ алкогольдегидрогеназы (АДГ) класса III

семенников человека// Международная научная конференция, Ч.2.: Тез.- Гродно, 1993,- С.372-373.

26. Хоха A.M., Кашко М.Ф., Воронов П.П. Влияние этанола и пе-рекисного окисления липидов на биосинтез тестостерона интерстициаль-ными клетками семенников крыс// Укр. биохим. ж.- 1993.- Т. 65, №4,-C.l 11-115.

27. Хоха A.M., Воронов П.П., Зиматкин С.М. Иммуноферментный и иммуногистохимический анализы алкогольдегидрогеназы 111 класса семенников человека// Биохимия.- 1994.- Т.59, №7.- С.997-1002.

28. Хоха A.M. Угнетение этанолом биосинтеза половых гормонов и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система// Успехи современной биологии.- 1994,- Т. 114, №2,- С.573-580.

29. Хоха AM., Вораноу П.П., Кашко М.Ф., Анцулев1ч С.Н., Дараш-кев1ч Н.А. Уплыу папярэдняга увядзення рэтынолу ацэтату на эффекты этанолу у семяншках// Весш АНБ.- 1995,- №2.- С.72-75.

30. Кашко М.Ф., Хоха A.M. Особенности стероидогенеза в семенниках при хронической алкогольной интоксикации и добавлениии этанола in vitro// Укр. биохим. ж.- 1996.-Т.68,№6.-С.103-107.

31. Khokha A., Voronov P., Buko V. Effect of retinol acetate on testosteron concentration in health volunteers and chronic alcoholics// Alcohol & Alcoholism.- 1997,- Vol.32, N3,- P. 374,- ESBRA Abstr. N M96.

32. Voronov P., Khokha A., Zimatkin S., Buko V. Analysis of alcohol dehydrogenase III isoenzyme using enzyme immunoassay and immunohisto-chemical method// Alcohol & Alcoholism.- 1997.- Vol.32, N3.- P. 407,-ESBRA Abstr. N T227.

Информация о работе

Хоха, Александр Михайлович
доктора медицинских наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы