Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Патоморфология и химиотерапия экспериментального пневмоцистоза

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Патоморфология и химиотерапия экспериментального пневмоцистоза"

РГ6 од

5 / ИЮЛ 1993

ШШСГЕРСТБО ЗДРАБ00ХРЛНШИЯ РОССИЙСКОЙ ФЭДЕРАЦИИ СЛНКГ-ПВГЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ШСТИШ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ВРАЧЕЙ

На правах рукописи

СаЙЮВА ДОДЫИЛА АЛЕКСАНДРОВНА

ПАТОЮШЗЛОГИЯ И ХИМИОТЕРАПИЯ ЭЖПЕРИШГГАЛШОГО ШЕВЬЩИСТОЗА

03.00.24 - микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт - Петербург 1993

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной микологии Государственного научно-исследовательского технологического института антибиотиков и ферментов медицинского назначения < г.Санкт-Петербург )

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Р. А.АРАВИЙСКИЙ

Официальные оппоненты:

Ведущие учреждение:

доктор медицинских наук, профессор В.Л.БЯДЯНШ

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки Р£, член-корреспондент Санкт-Петербургской Инженерной Академии, профессор

Н.П.ЕЛИНОБ

Санкт-Петербурге кий санитарно-гигиенический медицинский институт им.И.И.Меч-никова

Защита состоится " 3 " 1993 года в (З тъоъ

на заседании специализированного Ученого Совета Д 074.16.04 по защите докторских диссертаций при Санкт-Петербургской государственном институте усовершенствования врачей ИЗ В* (193015, Санкт-Петербург, ул.Салтыкова-Щедрина, 41).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке института.

Автореферат разослан " 4Л-Ы?и.Л 1993 года

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор медицинских неук, профессор

В.Г.Кубаеь

СБВД ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инфекционная патология последних десятилетий характеризуется все более возрастающим значением заболеваний, вызываеглтх условно-патогенными возбудителями. В особую группу следует выделить заболевания, которые возникают на фоне выраженных иммунологических нарушений СКашкин П.Н. 1978; Калина Г,П. 1980). Отмечено, что при нарушениях имтиунногс статуса патологические изменения -часто локализуются в легких (W&'/e (t). J. 1939; ôoiî/'x С. 1930). При атом, большая часть легочных оппортунистических инфекций вызывается пневмоцисташ, цитомегалови-русом, крилтококком, грибами рода Сик-d/ola, Л^га^асЬиим- avium-( bîwM- U. 1989). Если раньше некоторые из них описывались в качестве казуистических наблюдений, то по мере все возраставшего применения имцунодепрессивной терапии, увеличения -числа случаев врожденных к приобретенных имлунодефицитов, эпидеиш СПВДа, их значение возрастает. Наибольшую важность и распространенна среди этих инфекций имеет пневмоцкстоз.

Пневмэцистоз легких известен ученым с начала XX века (Нежен-цева А.В.1959; ^jajdustk- %>,£, 1957). Однако, эта инфекция не привлекала большого внимания практической медицины вплоть до 80х го-дов^ Решаюиеэ значение патологии им;-гунятега в генезе пневмоцисто-за стало очевидным в связи с проблемой СПИДа, когда основным контингентом больных явились люди, пораженные ВИЧ-инфекцией, при которой пневюцистоз является основной оппортунистической инфекцией, определяшей клиническую картину и исходи болезни ( Миггау J.P. 1904; Ccfuv SO. L. 1988). 05£ больных ШЧ-инфекцией поражены пневмо-цистозом, а при легочной патологии у пораженных ВИЧ в 90% этиологическим фактором заболевания является возбудитель пневмоцистоза, смертность у нелеченых пациентов близка к I00Ï ( Siovev ?>.<?, 1985; JliiUs^. 1986),

Диагностика пневмоцистоза затруднена из-за отсутствия характерной симптоматики ч частота бессимптомных форм, недостаточной осведомленности врачей о данной патологии, сложностей, связанных с культизированием пневмоцист и их выявлением и идентификацией в патологическом материале. Традиционные способы лечения этого заболевания сульфаниламидными препаратами являются недостаточно эффективным. Применение бактрика и пентамидина как у больных СПВДом",

так и в случаях пневмоцистоза при других иммукодефицитах наталкивается ira выраженную токсичность этих препаратов. Б 60-70% у больных СГЩои пригодятся прекращать лечение, не достигнув терапевтического эффекта I JJ. 1988; ijaïtccxd- &-У. 1983). Учитывая глобальное значение проблемы СПИДа, заболеваемость которым растет ъ геометрической прогрессии, требуется разработка оптимальных методов лечения оппортунистических: инфекций и, в частности, пневмоцистоза. Работа выполнялась в соответствии с Государственным заказом .'¿инустерсгва медицинской промышленности, номер Государственной регистрации 01890064456.

Целью исследования явилось изучение химио-торапевтической эффективности противогрибковых полиеновых антибиотиков при экспериментальной пнепмоцистной пневмонии.

3 а д а ч я исследования:

1). Разработка экспериментальной модели пневмоцкстной пневмонии.

2). Подтверждение ее адекватности на аеновании изучения патоморфо-догии пневмоцистоза на секционном материале и в эксперименте.

3). Изучение химиогерапевтической эффективности противогрибковых полмонових антибиотиков при экспериментальной шевмсцисткой пневмонии .

Научная новиана исследования. Разработаны две варианта экспериментальной модели пневмоцистной пневмонии , основанные на принципе длительного введения кортикостероид-ных гормонов, которые пригодны для хшаотерапевткческого скрининга лекарственных препаратов.

При сравнении патоморфодогических изменений в легких: при пне-вмоцистозе у детей, у больной СПИДом и при экспериментальном пневмоцистоза показано, что нарастание интерстициальных изменений происходит при длительно текущем патологическом процессе. Обоим признаком является отсутствие острой воспалительной реакции при течении заболевания в виде моноинфекции. Показана обратная зависимость между степенью .развития пневмоцистоза и степенью выраженности гнойного воспаления, называемого, главным образом, Грам-отрицательными микроорганизмами.

С целью оптимального выявления тканевых форы пнзвмоцист била применена реакция Бауэра и показано диагностическое преимущество этого метода для идентификации возбудителя в тканях

• легкого и в патологическом материале.

Новейшие представления о приосде пневмоцист, свидетельствующие о таксономической близости их к грибам ( Voivxa. 1970; ¿dnan- 1983), позволяют считать пневмоцистную пневмонии микозом легких, который требует соответствующей антимико-тической терапии. 3 проведенных экспериментах была показана хи-миотерапевтическая эффективность полиеновмс антибиотиков в отношении пневмоцистной пневмонии при их ингаляционном введении.

Практическая значимость. Нейтро-фильная реакция, вызванная другими легочными патогенами, является одним из механизмов контроля развития пневмоцистной инфекции. Повышение уровня нейтрофилов в тканях легкого и в патологическом материале у больных пневмоцистозом может быть использовано для прогноза течения патологического процесса в легких и дифференциальной диагностики пневмоцистной пневмонии.

Предложенный метод Бауэра для идентификации пневмоцист достаточно прост, дает стабильные результаты и может быть широко использован для практической диагностики.

Ингаляционное введение полиенов при пновыцистной пневмонии может быть использовано как в терапевтических целях, так и для профилактики. Были' показаны преимущества использования ингаляционного амфоглшзмма в сравнении с сульфаниламидными препаратами: лучшая биодоступность, отсутствие лейкопенического эффекта, потенциальное воздействие на другие сопутсгствуюиие грибковые инфекции. Предложенные принципа лечения позволяют использовать противогрибковые препараты как препараты выбора или замены в комплексной терапии пневмоцистоза, наряду с другими лекарственными средствами.

Основные положения, выносимые на запит у:

1. Разработанная модель экспериментальной пневмоцистной пневмонии адекватна по патоморфюлогическим признакам пневмоцис-тозу у человека.

2. Изучение тинкгориальных свойств возбудителя позволило выявить диагностическое преимущество и практическое значение метода Бауэра для идентификации пневмоцист в тканях легкого.

Способность пневмоцист окрашиваться по методу Бауэра коррелирует с нарастанием слоев клеточной стенки, определимых на элекг-ронномикроскошческом уровне.

3. Проведенные химиотерапевтические исследования показали высокую эффективность противогрибковых полиеновых антибиотиков в отношении пневмоцистной пнеимонии. Показаны прею^гиест-ва использования ингаляционного амфоглюкамина.

Апробация работы. Основные положения диссертации Силу, долокены на IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленно^ изысканию лекарственных вевеств t Рига, 1Э91 ), на II Международном микологическом стшсзиуме ( Ленинград, 1991 ), на Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" ( Москва, 1991 ), на Международном семинара "Проблемы моделирования патологических состояний у животных и человека" С Санкт-Петербург, 1992 ). Работа апробирована на . заседания проблемной комиссии ГНИГИАФ (28.12.S2).

Научные публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного теиста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводов , указателя литературы ( 40 отечественных и 171 зарубежный источник ). Материалы диссертации содержат II таблиц, 43 рисунка. Работа выполнена с лаборатории экспериментальной микологии (рук. - д.м.н.P.A.Аравийский) Государственного научно-исследова- • тельского технологического института антибиотиков и ферментов медицинского назначения ( г.Санкт-Петербург ).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ

Эксперименты проводились на белых беспородных крысах: иа взрослых, весом 180-200,0 г, и на колодах, весом 100-120,0 г, самцах. Всего проведено 14 серий опытов по подбору доз ичкуно-депрессантов при воспроизведении экспериментальной модели, и 17 серий опытов по определнию терапевтической эффективности лекар-

ствечньгг препаратов. Использовано 395 крыс.

При воспроизведении эксперичентельной модели пневмоцистной пневмонии был использован принцип создания иммунодофицитно-го состояния у крыс путем длительного введения кортизона. Регулярно в процессе опытов животных взвешивали, фиксируя падение веса тела, проводилось наблюдение оа изменениями лейкоцитарной формулы периферической крови при кмуунодепрессии и на фоне введения лекарственндас препаратов. Лечение животных начинали после гистологического подтверждения развившейся пневмоцистной пневмонии. Курс лечения составлял 10-12 дней. После этого выживших животных умерщвляли эфирным наркозом и легкие подвергали патоморфологиче-скому исследованию. Введение лекарственных препаратов проводилось внутримышечно, орально или ингаляторно. Ингаляции проводились в камере объемом 0,1 ъР при подаче воздуха сс скоростью 15 л/мин. Расчет дозы проводился с учетом объма и частоты дыхания одной крысы.

Все препараты, использованное в опытах ?или получены из аптечной сети и соответствуют требованиям ГОСТа, за исключением леворидона, наработанного в лабораториях БШГГИАй, и ингаляционного амфо'глюнамкна, полученного на Курганском комбинате "Биосинтез" .

Морфологические исследования проводились гистопатологи-ческим методом с количественны*.«! учетом возбудителя, клеточных реакций, с одновременным бактери логическим исследованием.

Для гистологических исследований легкие фиксировали в 10% нейтральном формалине. Для проведения реакции Оельгена проводили фиксацию по Ньюкомеру. Использовались парафиновые среза, которые окрашивали различными гистохимическими методами: для выявления нейтральных полисахаридов - PAS -метод, методы Казелла, Бауэра; для выявления глюкозоамшогликанов /кислых полисахаридов/ - окраска альциановым синим по Моури; для выявления ДШ -реакция уельгена ; для выявления зрелых форм возбудителя - шцрер-кирование серебром по Гомори-Гроккоту, окраска толуидиновым синем, по методу Романовского-Гдаэа, Штернберге; для выявления различных стадий развития пневмоцист - гематоксилин-эозин, азур, тионин; для выявления сопутствующей бактериальной микрофлоры -окраска по Грацу (в модификации Гудпастура), по Боголепсву, по

Грам-Вейгергу. Общие патоморфологические изменения тканей изучались при окрасках гематоксилин-эозином, PAS -методом с,докрашиванием гематоксилином.

На гистологических препаратах проводилась количественная оценка стелет тяжести пневмоцистной инфекции по 5-бальной системе, пропорционально количеству зрелых пневмоцист в патологическом материале, заполняющем легочные альвеолы: О - отсутствие инфекции 1цист нет в 50 полях зрения микроскопа); I - минимальная степень Cl циста в 10 полях зрения); 2 - слабая степень 12-9 цист в 10 полях зрения) ; 3 - умеренная степень 1.1—10 цист в I поле зрения); 4 - тяжелая степень 110-99 цист в I поле зрения); 5 - очень тяжелая степень (более 100 цист в I поле зрения). Затем вычислялся средний индекс обсемененности в каждой группе животных. Ыетода количественной оценки хиыиотерапевтической эффективности лекарственных препаратов заключались в сравнении степени обсемененности легких пневмоцистами у леченых животных и в контрольной группе, не получавией лечения.

Сравнительное изучение патоморфологических изменений в легких при пневмоцистозе у детей, у больной СПИДом, при экспериментальном пневыоцистозэ проводилось на секционном материале, подученном из прозектуры ГИДУВа, из института Цитологии и из архива патологоанатомического отделения больницы № 18 им.Филатова г.Санкт-Петербурга.

Для изучения ультраструктуральных особенностей тканевых форм возбудителя были использованы элёктронномикросконические методы. Материал фиксировали в Z% глутаровом альдегиде на 0,1 M коккодилатноы буфере ( рН 7,2 ), промывали буфером и дофиксиро-вали в 1% растворе четырехокиси осмия. Заливали в эпон. Ультратонкие срезы, изготовленные на ультратоме LKB - 5, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе " JEîi-100".

Определение обсемененности легких сопутствующей бактериальной флорой и ее идентификация были проведены на кафедре микробиологии ГИДУВА совместно с Даниловой О.П. Общепринятыми методами производили высевы гомогенатов легкйх у забитых крыс,-Изучалась подвижность микроорганизмов методом раздавленной кап-

ли и в 0,32 полужидком агара, наличие капсулы при окраске по Бу-ри-Гинсу и ферментативная активность Исследования чувствительности выделенных культур к антибиотикам проводили методом серийных разведений в мясо-пелтонном бульоне.

Полученные цифровые дачные экспериментальных исследований были статистически обработай с помощью параметрически и непараметрических методов. Достоверность различий оценивали с помощью критериев Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ МССЩОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

Для изучения химиотерапевтической эффективности лекарственных препаратов были разработана два варианта экспериментальной модели шзбт-'оцистноЯ пневмонии на белых крысах, в основе которых создание имцунодепрессивного состояния путем длительного введения животным кортизона. В ходе экспериментов было испытано влияние различных доз кортизона в сочетании с разными антибиотиками I пенициллин, тетрациклин, тетраолеан). Обязательное введе- . нив антибактериальных препаратов проводилось с целью зашиты от сопутствующей бактериальной инфекции. Результаты показали два оптимальных варианта. В одном случае животные получали кортизон внутримышечно 2 раза в неделя в дозе 125 мг/кг и тетрациклин в питьевой воде ежедневно из расчета 500 мг/л. Индекс обсеменен-ности легких пневмоцистзми в этой группе равен 2,47 ± 0,22. Во втором случае при аналогичных условиях опыта доза кортизона была в 5 раз меньше I 25 иг/кг ), при этом, индекс обсемененности составил 2,39 ± 0,26. Оба варианта моделей одинаково хорошо воспроизводим и дают стабильные результаты. Различие заключается в более длительном, хроническом течении пневмоцистной инфекции в последнем случае 190-95 суток), что в патогенетическом отношении в большей степени отражает развитие пневмоцистоза у человека. Однако, по степени обсемененности эти модели не уступают друг другу. При остром течении эксперимента длительность опыта составляла 30 суток, в течение которых все животные погибали. Гистологическое подтверждение пневмоцистной пневмонии у крыс выявлялось после 15 суток опыта. В хроническом опыте наблюдалась умеренная гибедь животных после "75 суток, остальные находились под набло-

дением до 95 суток.-Явления пневмоцистной пневмонии гистологически выявлялись после 65 суток. Таким образом, острый вариант эксперимента, требующий меньшего времени, удобен для предварительного изучения втиотропного действия препаратов на возбудитель. Хроническая шдель дает возможность проследить детали патогенеза патологического процесса на поздних сроках опыта, а при химиотерапевтических исследованиях - влияние препарата на организм и его активность в отношении пневмоцист в условиях, более приближенных к естественным.

В процессе моделирования пневмоцистной пневмонии было выявлено, что у некоторых кивоткад, длительно получавших кортизо-нотерапию, наряду с пневмоцистозом возникала бактериальная инфекция различной этиологии, что сопровождалось гнойны;ли изменениями в легких. В группе, где животные не получали антибиотшеа на фоне высокой дозы кортизона, возникало выраженное распространенное гнойное воспаление при отсутствии признаков пневмоцис-тоза. В группах, где кортизонотерапкя сопровождалась низкими дозами антибиотика, пневмоцистная пневмония развивалась в составе смешанной инфекции, при этом выявлялась нейтрофильная реакция различной интенсивности, а степень- развития пневмоцистоза была низкой 11-2 балла ). Бала установлена четкая закономерность -чем более выражено гнойное воспаление, тем менее развит пневмо-цистоз. Таким образом, молено предполагать, что одним из механизмов контроля активизации пневмоцист является острая воспалительная реакция, вызванная другими легочными патогенами. По данным литературы также предполагается, что нейтрофилы могут играть важную роль в защите легочной ткани от пневмоцист.

При сравнительной характеристике патошрфологических изменений в легких у экспериментальных животных, у детей, погибших от пневмоцистоза, и у больной, погибшей от пневмоцистоза на фоне СПИДа, было показрно, что во всех случаях основные проявления патологического процесса были сходными. Таким образом, била подтверждена адекватность экспериментальной модели и ее пригодность для испьгшпм эффективности лекарственных препаратов. При исследовании гистологических препаратов легких выявляется характерная картина, типичная для пневмоцистной пневмонии. Обращает на

себя вникание выраженное утолвоние межальвеолярнъгх переговодок за счет гипертрофии альвеолярного эплелия, контактируюиего с возбудителем, и пролиферации гистиоцитов. Характерно полное отсутствие в тканях легкого нейтрофильньвс гранулоцитов. Расширенные альвеолы, бронхиолы и мелкие бронхи заполнены эозинофильной ячеистой массой, представлямяей собой скопления возбудителя. Наблюдаются единичные гипертрофированные макрофаги с вакуолизированной цитоплазмой. Явлений фагоцитоза и внутрисооудистого расположения возбудителя не обнаружено.

Некоторые отличия в патоморфологии пневмоцистоза на фоне ВИЧ-инфекции заключаются в том, что стенки альвеол не столь утолщены, как в случаях пневмоцистоза у детей. Они в меньшей степени инфильтрнровану мононуклеарншн и плазматическими клетками, хотя гипертрофия и пролиферация гистиоцитов также имеет место. Эпителий, граничащий с гоэбудителем, утолкен и приобретает кубический характер.

Экспериментальный пнешоцистоз при остром течении разви- -Бается с 15-17 суток после начала кортизокотерапии и наиболее ви-ралсен н 30 суткам опыта. Как и з описанных вкше случаях пневмоцистоза у человека, выявляется скопления размножагаегося возбудителя в альвеолах и в мелких бронхах. Однако, при таком течении пневмоцистной инфекции возбудитель располагается в большей степени пристеночно, выстилая альвеолярный эпителий. Утслиенко альвеолярных перегородок выражено не значительно, в основном, за счет резко расширенных альвеолярных капилляров, заполненных элемента;® крови.

При хроническом течении экспериментального пневмоцистоза типичная патоморфологическая картина выявляется после 70 суток. В таких случаях особенности патологического процесса в легких у крыс были более сходными с проявлениями пневмоцистоза у человека. Наблюдается выраженная консолидация скоплений возбудителя внутри альвеол с полным их заполнением. Стенки пораженных альвеол резко утолчены за счет гипертрофии альвеолярного эпителия и пролиферации гистиоцитов. Существенно, что в участках, где отсутствуют пневмоцисты или они единичны, гипертрофия альвеолярных перегородок не наблюдается.

При большом количестве размножающегося возбудителя во во всех описанных случаях инфильтративно-пролиферативные процессы были более выражены при пневмоцистозе у детей и при хроническом течении пневыоцистоза в эксперименте. Природа данных процессов в настоящее время дискутируется в литературе. Существует мнение о вирусной отиологии интерстициальных изменений, поскольку авторы отмечают частое сочетание пневмоцистоза с вирусными инфекциями, в частности, с цитомегаловирусным инфицированием. В наших экспериментах было установлено, что утолщение межальвеолярных перегородок вследствие инфильтрации их кругло-клйточнкми элементами происходило по мере заполнения альвеол массами размножающегося возбудителя. Можно предполагать о компенсаторном механизме развития ннтерстициальных изменений по типу адаптационного процесса и изменяющихся условиях функционирования легочной ткани. Известно, что при недостаточном поступлении воздуха в легочные альвеолы, плоский эпителий послед- . них приобретает кубическую форк^г и пролиферирует. Наши наблюдения, проводимые в ходе терапии, подтвердили данные о том, что при излечении шевкоцисгной пневмонии происходит постепенное восстановление обычной структуры легкого.

Поскольку культивирование пневмоцист на питательных средах связано с больоими трудностями и не используется на практике, основой для диагностики и для оценки химиотерапевтичес-кого воздействия является неприменное выявление в патологическом материале и количественный учет зрелых форм пневмоцист. Для идентификации пневмоцист на гистологических препаратах и в патологическом материале используется ряд гистохимических методов, каждый из которых имеет определенные достоинства и недостатки. Наш было опробовано более 20 различных микробиологических и цитохимических методов идентификации. Пенистые внут-риальвеолярине образования, патогнсмоничные для пневмоцистоза легких, выявляются PAS -методом и при окрашивании гематоксилин-эозином. Однако, в этих случаях ни сами пневыоцисты, ни другие стадии развития возбудителя идентифицировать не удается. Для выявления зрелых форы пневмоцист используются традиционные способы окрашивания толуидиновым синим, импрегнация серебром

по Гомори-Гроккоту, окраска по Романовекоцу-Гимзе и Грам-ВеЯ-герту. Но ни один из этих методов не является по разним причинам оптимальным для диагностики. Для получения достоверных результатов требуется, как правило, использование нескольких методов. Наличие различных стадий развития тканевых форм паразита, необходимость дифференцировать их с клетками хозяина и другими патогенными микроорганизмами требуют специфичности гистохимических методов. В связи с этим многими авторами разрабатываются различные модификации уже известных способов окраски и предлагаптся нозые. Предложен модифицированный метод импрегнации по Гомори-Гроккоту, позволявший регистрировать зрелые цисты с одновременным выявлением в них внутрицистных телец. При использовании толуидинового синего было исследовано влияние различных фактороз, от которых зависит качество и интенсивность окрашивания пневмоцист, и предложен модифицированный метод. В нашей работе были проведена реакции с использованием реактива Ииффа с. применением различных окислителей: йодной кислоты (РАб -метод), раствора марганцовокислого калия 1метод Казелла) и хромовой кислоты (метод Бауора). Полученные результаты показали, что метод Бауэра является оптимальным для выявления зрелых и !.;олодах прецистиых форм шевшцист в патологическом материале и н<3 гистологических препаратах. При этом окружавшие ткани и клетки макроорганизма остаются неокрашенными. Сущность реакции в том, что она такко как и РАЭ-метод избирательно окрашивает нейтральные полисахариды, но в отличии ст РАЯ-метода, где после окисления йодной кислотой 1-2, 1-4 гликолевые группы превращаются в альдегиды, дашие среактивом Шиффа-яркокрасную окраску, при методе Бауэра окисление происходит хромовой кислотой 1-3 гликолевых групп, а, следовательно, выявляются полисахариды иной природы.

Принцип окисления хромовой кислотой был описан в литературе, где авторы предлагали модификации метода Гридли для выявления пневмоцист. Независимо от этих данных, нами экспериментально были отработаны оптимальные условия проведения реакции, отличаяииеся от описанных в литературе, что в данном методе имеет первостепенное значение.

Используя данный метод окраски, удалось выявить довольно редкий факт прямого деления пневмоцист, когда у клетки появляется поперечная перетяжка и в результате ее углубления формируется две дочерние клетки. Проведенная реакции Фельгена при специальном методе фиксации по Ньюкпмору показала наличие ДЖ в клетках возбудителя-. Применение реакции йельгена после обычных методов фиксации ( формалин, спирт, жидкость Карнуа ) не дало положительных результатов. Наблюдается явное несоответствие размеров Фельген-положительннх структур и ядер (вцутрицкетных телец ?), окрещенных другими методами (гематоксилин, метод Ро-кановского-Гимза). В последних случаях выявляются гораздо более крупные базофильные образования, что, по-видимоьу, объясняется преобладанием в них РНК. Это явление достаточно характерно для дрожжевых микроорганизмов, где содержание НЖ а ядрах в 5-6 раз превышает содержание ДЕК. Еыявлено, что ДЖ в пневыоцистах располагается в очень мелких гранулах ( 0,2-0,3 мкм ).

Электронномикроскопические исследования были проведены на 30 сутки опыта, когда альвеолы местами целиком были заполнены возбудителем на различных стадиях развития. Обзорные снимки были сделаны при увеличении 8 тыс., что позволяло представить взаикораспол женив различных клеток. При больших увеличениях становятся видны детали строения стенок и разнообразных мембранных структур. Зрелые пневмоцисты на электроннограммах в большинстве случаев представлены серповидными формами, то есть клеткам , спавшимися после выброса эндоспор. Зрелые пневмоцисты окружены толстой клеточной стенкой, имеюей наружный гранулярный электронноплотвдй елей, рыхлый электронносветлый и, наконец, внутренний, тонкий олектронноплотный слой, лежащий на цитоплаз-маткческой мембране. В целом, строение клеточной стенки зрелой пневмоцисты мало отличается от такового у дрожжевых микроорганизмов. На световом уровне пневмоцисты с такой стенкой окрашиваются наиболее ярко по ыето,иу Бауэра. Молодые трофозоидн окружены бол'.е тонкой двуслойной клеточкой стенкой. Определяется тонкий светлый слой и внутренний плотшй, наружный гранулярный слой отсутствует. Такие трофозоиды РАЙ-положительны, но почти не скрашивается по методу Бауэра. Толщина стенок у зрелыг форм

достигает 250-300 ии, в то время как толпкна стенок трофозоидов равна ¡30-60 им.

По мере развития трофозоиды формируют на своей поверхности своеобразные везикулярные струкгрры, функциональнее значение которых в литературе обсуждается. На электроннограммах при больших увеличениях удается проследить механизм формирования "везикулярного аппарата". Стенка трофозоида выпячивается, увлекая за собой участок цитоплазмагической мембраны и содержимого метки, включая рибосомы. Причем, двуконтурность клеточной стенки, обра-зушей пузырек, сохраняется. Иногда пузырьки вытягиваются в трубочки, сохраняющие просвет. Затем везикулы сепарируются от стенок трофозоида, выстраиваясь в своеобразные цепочки и скопления. Как отдельные везикулы, так и их группы контактируют с альвеолярным эпителием. Иногда■они оказывается фагоцитированными крупными макрофагами, причем, находясь в фагоцитарных вакуолях, везикулы почти всегда сохраняют свое строение. Их стенки или же не отличаются от стенок трофозоидов, или несколько утолщаются и становятся более рыхлчми, В &том случае видны болео плотные внутренние мембраны. Обнаруженный нами факт образования многочисленных везикул на поверхности трофозоидов, вероятно, является примером обратного гошоцитоза, то есть экскреции каких-либо биологически активных веществ в окруяаяиуо сред/.

Немаловажно, что пузырьки, контактирующие с альвеолярным эпителием,не производят повреждаювего действия на последний и ке проникают внутрь эпителиальных клеток. Инение ряда авторов о том, что трубчатые и везикулярные структуры играют роль "присосок" к эпителиальному пласту ( возможно, питаших пневмоцисты ) по нашим данным не подтверждается,

По мере развития трофозоиды сбрасывают со своой поверхности все везикулы. Е дальнейшем болызая часть трофозоидов, по-видимому, дегенерирует - их стенки разрываются, клетки запустова-ют, мембраны скручиваются в "миелиноподобные" структуры. Такие отмиравшие форш в большом количестве активно фагоцитируются макрофагами и обнаруживаются в их фагосомах, чего никогда не случается с неповрежденными трофозоидами или зрелыми пневмоцистами. Другая часть трофозоидов или превращается в прецисты или начинает делиться,, как ото было ужа отмечено на световом уровне.

В цитоплазме трофозоидов и в цистах были обнаружены единичные митохондрии с редкими, неупорядоченными кристами, вакуоли различной плотности, рыхлые скопления рибосом, длинные цистерны шероховатого эндоплазматичиского ретику.чума, свотлые ядра с рыхлым хроматином, ограниченные двуяонтуршй ядерной оболочкой, Выявленные особенности строения различных стадий развития пневмоцис включая строение клеточной стенки, позволят проворить аналогии кеуду пкевмоцисгаки и грибными микроорганизмами. В то ке время, отсутствие у пневмоцист фагосом, дязооом, моторных органелл, аппарата Гольдки отличает их от простейших.

На основении проведенных светооптических и электронно-микросконических исследований мы представляем цикл развития пневмоцист , паразит ручких в тканях легкого, как смену зрелых многоядерных форм, зоключеяныг в тол стул полисахаридную стенку, н тонкостенных трофозоздоа. Причем, большая часть трофозоидов разрушатся, образуя "друзояодобную массу", заполняюую альвеолу и про пятстауоту» нормальной респирации легких. Остальная часть проходит стадию прямого деления, либо минуя эту стадии, превращается в прецисты.

Изучение химиотерапевтической эффективности противогрибковых полиеновьгх антибиотиков проводилось в сравнении с аф»фекгив-ностыо сульфаниламидных препаратов, хоторые мяиболее часто в настоящее время используются для лечения пневмоцистной пневмонии. В опытах были использованы полиеноше антибиотики - амфотерицин В, леворидон,амфогдюкащш. Учитывая локализацию патологического процесса в легких, предпочтение было отдано ингаляционного/ способу введения препаратов, что обеспечивает лучшую биодоступность, длительное поддержание лечебного уровня антибиотика в ткани легкого, при этом, антибиотики ограниченно проникают в кровь. Химиотерапевт ичес кие испытания противогрибковых антибиотиков проводились по двум вариантам: по схеме лечения, когда введение■антибиотика начиналось после гистологического подтверждения выраженной пневмо-, цистной пневмоний у контрольных хивотньк I 15 сутки при остром течении и 75 сутки при хроническом ); и по схеме профилактики, когда тавотные получали курс антибиотика до Начала жьеаддй кар-

Таблица I

Результаты лечения экспериментальной пневмоцистной пневмонии

Препарат Доза мг/кг Количество животных в группе - Вес тела (г) Индекс обсемененнос-ти 1 д )

первоначальный потеря веса к концу опыта

Амфотерицин В 0,2 20 185 ±3 62 ± I 0,40 + 0,1.»

Деворидон 3000 ВД/кг 15 192 ± 2 . 65 ± I 0,67 ± 0,19

Аыфоглвкамин 1,2 16 195 ± 3 63+2 0,31 + 0,15

Бнсептол (триметаприм+ сульфаметаксазол) 50 250 13 174 ± I 54+2 0,92 +0,31

Метакелфин 1сульфален+ пириметамин) 200 10. 13 169 ± 2 61+2 0,61 + 0,21

Контроль 1без лечения) - 20 200 * 3 74+2 2,52 + 0,29

- к -

тизона. После окончания лечения степень обсемененности легких шевмоцистами у леченых животных сравнивалась с обсемененностью в контрольной группе. Расчет дозы антибиотика при ингаляционном введении проводился, исходя из частоты дыхания и объема дыхания однс-й крысы, скорости подачи воздуха в камеру и концентрации ин-галируешх растворов. Первоначально эффективность полиенов изучалась на модели острого течения пневмоцистоза и затем при хроническом течении. Инъекции кортизона продолжались в течение всего опыга. В аналогичных условиях проводилось лечение бисептолом и мзтакелфином при их оральном введении. Результаты лечения представлены на таблице I. При использовании амфотерицина В в оптимальной терапевтической дозе 0,2 мг/кг обсемененкость снижалась в 6,5 раз по сравнению с контрольной группой, при этом у 60% животных лневмоцисты разрушались полностью. В результате лечения леворидоном обсекекенность-была снижена в 4 раза. Лечение амфо-глвкаминон привело к снижении обсемененности в 8 раз. При лечении сульфаниламидными препаратами I бисепгол, метакелфин) оСсе-мененность снизилась в 2,5 и в 4 раза.

После профилактики гистологическое исследование показало, что обсемененность легких пневюцистаыи была в 2 раза ниже, чем в контрольной группе, при этом, у 30% крыс лневмоцисты не обнаруживались до конца опыта. Предварительное введение аьфотерици-на В не может быть использовано с достаточно высоким эффектом, но оно оказывает заметное положительное влияние на развитие и течение пневмоцистной инфекции: уменьшается риск возникновения заболевания, снижается о'семененность легких пневиоцистами у заболевших животных.

Эффективность амфотерицина В была подтверждена на модели хронического течения пневмоцистоза ( доза кортизона - 25 мг/кг амфотерицина В - 0,2 мг/кг ). Индекс обсемененности составил 0,58 ± 0,36. Гибели животных на фоне лечения не наблвдадось, аа период лечения отмечено нарастание весе тела, в то время как в контрольной группе, а также и в остром опыте продолжалось падение веса, несмотря на лечение 1табд.2).

Таблица 2

Результаты лечения гкепериментальной пневмоцистной пневмонии амфотерицином В при хроническом течении.

Группы ЖИВОТНЫХ Количество животных в группе Вес тела (г) . Индекс обсеменен-ности ( &)

первоначальный 80е сутки (перед лечением) 95 сутки (после лечения)

Лечение амфотерн-цином В Ю,2мг/кг) 24 198+3 18542 192 ± 4 0,58 ¿0,36

Контроль (без лечения) 26 164+2 2,51 + 0,23

Наблвдения за показателями белой крови в динамике на фоне введения кортизона и при лечении показали, что изменения в периферической крови имели место уже с 5х суток опыта с незначительными колебаниями в последуялие сроки до конца опыта. Общее количество лейкоцитов у нелеченых животных сохранялось в пределах норки. На этом фоне имели место выраженные абсолютный и относительный нейтрофилеэ со сдвигом вправо и лимфоцитопения. При лечении сульфаниламидными препаратами была выявлена лейкопения, более выраженная при использовании метакелфина. Терапия полиеновы-ми антибиотиками не вызвала существенных изменений со стороны белой крови в сравнении с контрольными животными.

Характер патоморфюлогических изменений в легких у крыс, леченных различными шлиековыми антибиотиками, был сходным. У животных, вскрытых в первые пять суток лечения, при гистологическом исследовании обращают на себя внимание ткани легкого, зна чительно инфильтрированные нейтрофильнши гранулоцитами. Для исключения возможной контаминации легкого дополнительной бактериальной флорой в ходе ингаляций были проведены бактериологические окраски по Грацу и Боголепову. Бактериальная флора не обнаружена. В альвеолах, в местах скоплений возбудителя выявляется деформированные клетки пневмоцист и фрагменты разрушенных клеточних сте-

нок, которые ярко окрашиваются по методу Бауэра. В местах наибольшего распада возбудителя сосредоточены абсцедирувдие участки. Отсутствие в тканях легкого сопутствующей бактериальной флоры указывает на то, что приток нейтрофилов вызван лишь распадом пнепмоцист под воздействием этиотропных средств. У животных, вскрытых после окончания лечения, количество абсцедируядих участков в тканях легкого резко снижается. Однако, альвеолярные перегородки местами остаются инфильтрированными сегментоядерными нейтрофилами.

Необходимо отметить, что при применении амфоглюкамина повышалась результативность лечения, снижались показатели гибели животных на фоне терапии, отсутствовал лейкопенический эффект. В патоморфолои: 1еском отношении отличие заклсчалось в меньшей выраженности нейтрофильной реакции и отсутствии абсцедируотих участков в тканях легкого. Следует полагать, что это связано с равной дисперсностью ингалируемых растворов препаратов. Применение ингаляционного амфоглокакина в виде истинного раствора не вызывает раздражающего эффекта в дыхательной системе и закономерно приводит к выздоровлению без нежелательных осложнений.

Процесс выздоровления во всех случаях, включая оральное лечение сульфаниламидами, сопровождался появлением в большом количестве крупных вакуолиэированных макрофагов и постепенным восстановлением нормальной структуры легкого. Причем, ггри остром течении пневмоцистоза уменьшение интерстициальных изменений происходило сразу после окончания лечения. Б случае хронического течения утолмение мажа:ьвеолярных перегородок и гипертрофия альвеолярного эпителия сохранялись более продолжительное время.

Окончательные выводы в отношении терапевтического воздействия полнено^ при пневмоцистной пневмонии могут быть получены только на основании клинического опыта. Однако, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о перспективности использования противогрибковых препаратов как для лечения, так и для профилактики гчевмоцистоаа. Учитывая необходимость длительных нурсов лечения, они могут быть вкличены в комплексную терапии как препараты выбора или ааиены, наряду о другими лекарственными средства.м.

выводи

1. Разработана модель экспериментального пневмоцистоза, пригодная для экспресс-испытаний протявопневмоцистних препаратов, и хроническая модель, более близкая по патоморфологическим изменениям к патологии у человека.

2. Патопорфология экспериментального пневмоцистоза, пневмоцистоза у детей и у больной СПИДом характеризуется гипертрофией и гиперплазией альвеолярного эпителия и клеток интерстициальной ткани вокруг скоплений возбудителя в просветах альвеол, при этом, отмечено, что нарастание интерстициалы-шх изменений в легких происходит при длительно текущем патологическом процессе. Обикм признаком является отсутствие острой воспалительной реакции при течении заболевания в виде моноинфекции.

3. Патоморфология при сыеианной пневмоцистно-бактериальной инфекции характеризуется гнойным воспалением. Бсказана обратная зависимость между степеньп развития пневмоцистоза и степенью выраженности гнойного воспаления, вызываемого, главным образом, Грам-отрицательны.'.я микроорганизмам!.

4. При анализе тиккторкалышх свойств различтгх стадий развития пневмоцист показано диагностическое преиьглзество метода Бауэра для идентификации возбудителя в тканях легкого.

5. жизненный цикл развития тканевой формы возбудителя характеризуется сменой толстостенных зрелых пневмоцист, содержащих вну-трицистные тельца (эндоспоры), и тонкостенных трофозоидов, в большинстве своем погибающих в условиях организма, или вновь формирующих цисты.

6. На электронномикроскопическом уровне показано образование на 'клеточных сгенках трофозоидов везикул, проникаотих в округао-пую среду и, возможно, несущих определенные БАБ. Везикулы, контактирующие с альвеолярным эпителием, не повреждают его и не проникают внутрь клеток.

7. Проведенные химиотерапевтические исследования показали высокую эффективность противогрибковых полиешвых антибиотиков в отношении пневыоцистноЯ пневмонии. Профилактическое использование полиенов оказывает заметное положительное влияние на развитие и течение пневмоцистной инфекции: уменьшается риск

¡возникновения заболевания, снижается обсемененность легких пне-вмоцистами у заболевших кивотных. 8. Показаны преимущества использования ингаляционного амфоглюкамина в сравнении с сульфаниламидными препаратами: лучшая биодоступность, отсутствие лейкопенического эффекта, потенциальное хишо-терапевтическое воздействие на другие сопутствушие грибковые инфекции.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕПЕ даССЕРГАЦИИ

1. Патоыорфология экспериментального пневмоцистоза и цитогенез возбудителя. //Архив патологии.-1991.-т.53.-Ж.-с.33-37.

( Соавт. Аравийский P.A., Михайлова ¿i.A. }

2." К вопросу о дгагностике пневмоцистной пневмонии (применение реакции Бауэра для индикации возбудителя в патологическом материале). //Лаб.дело.-1991.-!? а.-с.44-46.

( Соавт. Аравийский P.A.)

3. Химиотерапевтическая эффективность амфотерицина В при экспериментальном пневыоциетозе. //Тез.IX Всесоюзного симпозиума по целенаправленному изысканию лекарственных веиеств. -Рига.-1991.-с.69<

4. Пневюцисгоз и полиеновые антибиотики. //Материалы П Международного микологического симпозиуна.-Ленинград.-1991.

( Соавт. Аравийский P.A., Михайлова М.А.)

5. Новые подходы к химиотерапии пневмоцистной пневмонии. //Материалы Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций". -Москва.-1991,-чЛ.-с.2I-P2.

( Соавт. Аравийский P.A.}

6. йодель экспериментального пневмоцистоза, пригодная для химиоте-рапевтического скрининга. /Дез.Международного семинара "Проблемы моделирования патологических состояний у человека и животных и испытание БАБ".-Санкт-Петербург.-1992.-с.4-5.

( Соавт. Аравийский P.A. )