Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Патобиохимическое обоснование использования геля пектина для профилактики образования спаек брюшной полости(экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Патобиохимическое обоснование использования геля пектина для профилактики образования спаек брюшной полости(экспериментальное исследование)"

На правах рукописи

ШЕВЧУК Вячеслав Юрьевич

ПАТОБИОХИМИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЕЛЯ ПЕКТИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ОБРАЗОВАНИЯ СПАЕК БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.01.04 - биохимия 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Краснодар - 2013

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России).

Официальные оппоненты:

Нагиев Эйзудин Рамазанович, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дагестанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО ДГМА Минздрава России), кафедра общей и биологической химии, заведующий кафедрой;

Овсянников Виктор Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России), кафедра патологической физиологии, заведующий кафедрой.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» Российской академии медицинских наук (г. Москва).

Защита состоится « /19 » 0М#$ЬЛГ, 2013 г. в ¿3_ _час. на заседании диссертационного совета Д208.038.02 на базе ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861) 262-73-75).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России

Автореферат разослан » 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д208.038.02

доктор медицинских наук,

доцент Лапина Наталья Викторовна

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Павлюченко Иван Иванович

Ы!п| .'К: 1 : <А 20И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема профилактики и лечения спаечных процессов брюшной полости (СПБП) продолжает оставаться актуальной в связи с широкой распространенностью данного состояния, дефицитом исчерпывающих знаний о патофизиологических механизмах его формирования и отсутствием универсальных подходов к его профилактики и лечения. В настоящее время по поводу СПБП регистрируется от 4 до 20 случаев на 100000 населения. Увеличение числа таких пациентов обусловлено выросшим количеством лапаротомий (В.Г.Харин 1990; Аг.Яа]аЬ е1 а1.,1991; В.В.Барканов и соавт., 2011; Г.А.Баранов, М.Ю.Карбовский, 2003; е1 а!., 2012).

Наиболее частыми причинами образования спаек в брюшной полости являются воспалительно-деструктивные заболевания органов брюшной полости, травмы и повторные оперативные вмешательства (А.А.Воробьев и соавт., 2000; 2001; А.Б.Гаврилик и соавт., 2002; М.Ь.Егеешап е1 а1., 2003; 1.М.Са1ше8 е1 а1., 2005). Одним из значимых факторов в спайкообразовании выступает генетическая предрасположенность. У пациентов с быстрым типом ацетилирования преобладает процесс спайкообразования над лизисом соединительной ткани (С.Ю.Гармонов и соавт., 2006), что можно связать с активацией микросомального окисления, которое является предшествующим звеном в реакциях конъюгации, в том числе и ацетилирования. Не маловажную роль в процессах спайкообразования играет микрофлора кишечника.

Несомненно, одну из ключевых ролей в формировании послеоперационных спаек и развитии СПБП и их осложнений играет выраженный окислительный стресс ((X!) и эндотоксикоз (ЭТ), крторые характерны для пациентов хирургического профиля (И.А.Ерюхин, Б.В.Шашков, 1995; И.Н.Пасечник, 2004, В.Н.Титов, 2004; Г.К.Рубцов, 2013), а результатом генерализованных процессов спайкообразования в большинстве случаев является кишечная непроходимость. За последние 20 лет частота спаечной непроходимости увеличилась в 1,9 раза (Р.А.Женчевский, 1989; М.П.Лаврешин,2005; М.С.Жуков,2008; С\¥.Тау1ог е1 а1., 2010).

До настоящего времени предлагаемые методы лечения и профилактики СПБП не отвечают всем запросам клиники и наличие большого количества предлагаемых методов их лечения уже само за себя говорит об их несовершенстве, в том числе это относится и к предлагаемым барьерным препаратам (М.Оау|с1 е1 а!., 2005).

Наиболее обоснованными являются методы профилактики спайкообразования, прошедшие испытания в эксперименте, в частности применение в качестве средства профилактики геля пектина. Для разработки и внедрения в клиническую практику новых профилактических средств необходимы полноценные доклинические исследования различных их эффектов, а для наиболее объективной диагностики метаболических оксидативных и токсических сдвигов в организме пациентов в периоперационном периоде необходимы быстрые, легко выполняемые и недорогие методы мониторинга проводимой' терапии и течения

послеоперационного периода, в частности биохимические и биофизические экспресс-методы, а также интегральные способы оценки ОС и ЭТ (И.И.Павлюченко, 2005; С.Р.Федосов и соавт., 2010) значимость которых до конца не оценена.

Цель исследования: дать экспериментальное патобиохимическое и патофизиологическое обоснование возможности использования в медицинской практике геля пектина в качестве средства профилактики хирургического окислительного стресса и процессов спайкообразования в брюшной полости.

Задачи исследования:

1) Разработать экспериментальную модель формирования спаечного процесса брюшной полости на животных. Изучить морфологические изменения органов брюшной полости на модели спаечного процесса и хирургического окислительного стресса и установить их особенность при местном использовании геля пектина.

2) Выявить характерные сдвиги в системах антиоксидантной защиты и детоксикации при развитии хирургическо окислительного стресса у экспериментальных животных с моделью спаечного процесса

3) Оценить возможность коррекции патобиохимических и патофизиологических сдвигов и профилактики спаечной болезни брюшной полости у экспериментальных животных с моделью спаечного процесса при внутрибрюшинном использовании геля пектина в качестве барьерного средства.

4) Изучить в лабораторных условиях антибактериальные свойства геля пектина в отношении патогенных госпитальных штаммов микроорганизмов (Staphylococcus aureus, Escherihia coli, Pseudomonas aeruginosa).

5) Определить наиболее информативные показатели метаболических сдвигов при моделировании хирургического окислительного стресса и спаечных процессов брюшной полости, позволяющих осуществлять мониторинг проводимых мероприятий.

Научная новизна работы. Впервые:

- предложена и экспериментально обоснована на лабораторных животных модель формирования спаечного процесса в брюшной полости, которая позволяет моделировать хирургическим способом ОС, подтвержденный биохимическими и биофизическими данными и, практически в 100% случаев получать спайки брюшной полости (патент РФ № 23331367);

- на хирургической модели спаечных процессов органов брюшной полости установлена и показана тесная взаимосвязь морфологических и метаболических изменений в тканях при их формировании, которая сопровождается активацией стресс-реализующих и угнетением стресс-лимитирующих систем, в том числе системы антиоксидантной защиты и детоксикации;

- проведена оценка и мониторинг развития моделированного спаечного процесса комплексно с помощью авторской бальной системы, показателей

системы прооксиданты-антиоксиданты и детоксикации, патоморфологии, что позволило объективно оценить развитие хирургического окислительного стресса и спаечного процесса на локальном (тканевом) и организменном уровне, в том числе и с использованием интегральных коэффициентов и индексов (КОМБэр -коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов; ИЭИ - индекса эндогенной интоксикации);

- продемонстрирован выраженный противоспаечный эффект местного использования геля свекловичного высокоочищенного низкометоксилированного пектина отечественного производства, который обусловлен его антимикробными, антиоксидантыми и детоксицирующими свойствами.

Научно-практическая значимость исследования. Установлены особенности патобиохимических, патофизиологических и морфологических сдвигов в органах и системах организма при развитии спаечных процессов брюшной Полости, которые позволяют их прогнозировать и вести профилактику. Показана тесная взаимосвязь ОС и ЭТ в формировании патологической реакции организма на хирургическую травму в виде вторичной аутоагрессии, которая является основой структурно-функциональных изменений в органах и тканях, в том числе и образовании спаек. Расширены знания о свойствах природного полимерного вещества растительного происхождения - пектина, который способен проявлять не только свойства сорбента и барьерного вещества, но и участвовать в гашении неконтролируемых реакций свободнорадикального окисления (СРО), а также обеспечивать антимикробную защиту.

Предложенная и апробированная модель спаечного процесса в брюшной полости позволяет не только изучать процессы, характерные для спайкообразования в брюшной полости в эксперименте, но и моделировать ОС и ЭТ, состояния, характерные для многих пациентов хирургического профиля, что важно для доклинического изучения лечебных и, прежде всего, антиоксидантных свойств различных лекарственных препаратов.

Выявленные особенности сдвигов в системе про- /антиоксиданты крови при развитии моделированных спаечных процессов брюшной полости свидетельствуют о том, что эффективная ранняя диагностика возможных структурно-функциональных изменений в тканях и органах брюшной полости в послеоперационном периоде должна включать исследование и анализ основных показателей системы прооксиданты-антиоксиданты и детоксикации.

Наиболее доступными и эффективными и достаточно информативными для выявления состояния ОС в послеоперационном периоде являются биофизические экспресс-методы, такие как амперометрическое определение общей антиоксидантной активности биологических жидкостей организма и хемилюминесцентный анализ уровня продуктов СРО, а также расчетные коэффициенты и индексы (ИЭИ, КОМБэр).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах фундаментальной и клинической биохимии, общей и клинической патофизиологии, клинической

иммунологии, аллергологии и лаборатроной диагностики ФПК и ППС, фармации ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России, имеются акты внедрения.

Личный вклад автора в исследование. Автором разработаны основные идеи и алгоритмы получения и обработки результатов проведенного исследования, проведен тщательный анализ современной отечественной и зарубежной литературы, продумано и осуществлено моделирование спаечных процессов брюшной полости на достаточной по количественному составу группе экспериментальных животных. Автор производил забор биологического материала и участвовал в проведении морфологических, биохимических, биофизических, микробиологических исследований. На основании проведенных исследований сделаны достоверные, обоснованные выводы и разработаны практические рекомендации. Авторский вклад в написание научных работ по теме диссертации 70%.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Развитие спаечной болезни брюшной полости сопровождается выраженными сдвигами в системе прооксиданты-антиоксиданты с превалированием первого звена и дисбалансом в самой системе антиоксидантной защиты, что проявляется резкой активацией процессов свободнорадикального окисления и пероксидации как на местном, так и на системном организменном уровне.

2. Эффективная и полноценная диагностика метаболических сдвигов в организме пациентов хирургического профиля с абдоминальной патологией в послеоперационном периоде возможна на основании биофизических показателей системы про-/антиоксиданты и интегральных показателей, комплексно отражающих выраженность процессов окислительного стресса и эндотоксикоза, таких как КОМБэр и ИЭИ.

3. Барьерные полимерные средства профилактики спаечного процесса, растительного происхождения, медленно биодеградируемые в брюшной полости, обладающие антирадикальными, детоксикационными и антимикробными свойствами, является важным дополнительным фактором борьбы с осложнениями послеоперационного периода, что подтверждено на примере 5% геля пектина.

Публикации и апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на XV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2007, 2008), конгрессе «Человек и лекарство» (Краснодар, 2008), 12 международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2011). По результатам исследования опубликовано 14 печатных работ 5 из них, в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации, получен 1 патент на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы и трех приложений. Список литературы включает 190 отечественных и 154 зарубежных источника. Диссертация изложена на 158 страницах, иллюстрирована 76 рисунками (в том числе 60 фотографиями), 10 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В эксперименте были использованы 140 беспородных крыс-самцов с массой тела 180-200 гр. (основная группа 50 крыс и группа сравнения 50 крыс). Животные содержались в стандартных условиях вивария на стандартном рационе. Группой контроля для исследования биохимических и биофизических показателей крови служили интактные животные (п=40, в 20 образцах крови определены ферментные и неферментные показатели системы антиоксидантной защиты и в 20 образцах показатели прооксидантной нагрузки и эндогенной интоксикации). Обезболивание проводилось путем эфирного ингаляционного наркоза с соблюдением правил гуманного обращения с животными, регламентированным соответствующими документами.

Технология моделирования спаечного процесса в брюшной полости: после введения животного в эфирный наркоз выполнялась лапаротомия, весь органокомплекс брюшной полости в т.ч. петли тонкой и толстой кишки выводились из брюшной полости. Осуществлялось их высушивание феном в течение 5 минут при температуре воздушного потока 50°С, затем петли тонкой кишки обрабатывались 1% раствором перманганата калия в течение 1 минуты и дополнительно иссеклись участки передней брюшной стенки размерами 2x2 см изнутри вместе с париетальной брюшиной и мышцами до поверхностной фасции с двух сторон от лапаротомной раны. Такая травма сопровождалась кровотечением в полость живота, что являлась само по себе дополнительным спайкообразующим фактором. Органокомплекс укладывался обратно в брюшную полость, и рана передней брюшной стенки ушивалась отдельными плетеными нерассасывающимися швами.

В основной группе (№1) животным в брюшную полость перед ушиванием лапаротомной раны вводился 5 мл 5% гель пектина, а в группе сравнения (№2) выполнялось ушивание без введения геля в брюшную полость (табл. 1). В качестве контроля исследования про- и антиоксидантных показателей крови и определения наличия/отсутствия эндогенной интоксикации использовалась кровь интактных животных с лапаротомией без моделирования спаечного процесса брюшной полости (40 крыс, забор крови осуществлялся по общепринятым методикам из нижней полой вены).

В основной группе (п=50) экспериментальных животных на 7 сутки из эксперимента было выведено 10 крыс, у которых оценивали выраженность спаечного процесса брюшной полости методом семантического дифференциала и изучались патоморфологические аспекты спаечного процесса.

Таблица 1

Распределение животных по группам

Группа основная (№1) п=50 Группа сравнения (№2) п=50 Группа контроля (№3) п=40

модель СББП интактная брюшная полость

пектин в брюшную полость вводился пектин в брюшную полость не вводился

На 14 сутки все лабораторные животные данной группы выводились из эксперимента, у них проводилась оценка выраженности спаечного процесса брюшной полости, и осуществлялся забор крови на биохимические и биофизические исследования, а также тканей органокомплекса для изучения патомор-фологических показателей. Полный объем определения биохимических показателей антиоксидантной системы крови выполнен в 20 образцах крови экспериментальных животных и в 20 образцах изучены показатели окислительного стресса и эндогенной интоксикации. Животные выводились из эксперимента с соблюдением всех правил работы с лабораторными животными.

В группе сравнения исследований использовали 50 животных с лапарото-мией и хирургической моделью спаечного процесса брюшной полости и ОС. Из этой группы 7 крыс погибли в течение первых 7 суток эксперимента. При анализе органов брюшной полости этих животных выяснилось, что у четверых животных развилась спаечная непроходимость, у троих сформировались наружные кишечные свищи. Оставшиеся 43 крысы оставались в эксперименте до 14 суток. Из них на 7 сутки исследования из эксперимента были выведены 10 животных, у которых была оценена выраженность спаечного процесса и взят тканевой материал для исследования патоморфологии. На 14 сутки выведены из эксперимента все животные, у них был взят биоматериал тканей брюшной полости и проведены исследования патоморфологических показателей. В 20 образцах крови животных этой группы после забора крови был выполнен полный объем запланированных биохимических исследований антиоксидантного статуса и в 20 образцах крови изучены показатели окислительного стресса и эндогенной интоксикации.

Контрольная группа включала 40 интактных животных, у которых под наркозом, с соблюдением всех правил гуманного отношения к животным была произведена лапаротомия и осуществлен забор крови из нижней полой вены и проведены исследования биохимических показателей антиоксидантного статуса в 20 образцах крови, и в 20 образцах крови изучены показатели окислительного стресса и эндогенной интоксикации. Для определения основных параметров системы про- /антиоксиданты и уровня ЭТ кровь гепаринизировалась в соотношении 1:10 после чего в ней определялись все запланированные показатели.

Выраженность спаечного процесса в брюшной полости оценивали на 7 и 14-е сутки после начала эксперимента. Макроморфологическое исследование выполнялось с помощью семантического дифференциала по 5 балльной системе. Для объективной оценки выраженности спаечного процесса брюшной полости применена методика В.А. Липатова (2004 г).

Состояние антиоксидантной системы (АОС) крови экспериментальных животных оценивали по активности каталазы (КАТ) и супероксиддисмутазы (СОД) эритроцитов, по уровню восстановленных тиоловых групп эритроцитов и амперометрическому определению антиокислительной активности плазмы крови. Активность КАТ исследовали в гемолизате эритроцитов (R. Beers и соавт., 1952) в модификации (И.И. Павлюченко и соавт., 2006), основанному на оценке скорости убыли субстрата фермента (перекиси водорода). Активность СОД определяли в гемолизате эритроцитов (В.А. Костюк и соавт., 1990) в модификации (И.И. Павлюченко и соавт., 2006), которая основана на способности СОД ингибировать индуцированную реакцию аутоокисления кверцетина. Количество тиоловых групп в гемолизате эритроцитов определяли модифицированным методом с использованием реактива Эллмана (В.Н. Орехович, 1977). Определение АОА плазмы крови и экссудата раны проводилось модифицированным амперометрическим способом (А.Я. Яшин и соавт., 2003) на анализаторе «Яуза-01-AAA». Способ основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении биологического образца на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале.

Состояние прооксидантной системы и выраженность ОС оценивали в плазме крови по исходному количеству продуктов окислительной модификации биомолекул, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК - активные продукты выражаемые как тиобарбитуровое число - ТБЧ), а в эритроцитах определяли как базальный их уровень продуктов ТБК, так и их уровень после предварительной индукции процессов СРО (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977). Также в плазме крови и в экссудате раны оценивали интенсивность быстрой вспышки хемилюминесценции (XJI) с помощью люминотестера ЛТ-01 в составе системы для диагностики ОС (И.И. Павлюченко, A.A. Басов, С.Р. Федосов, 2006), включающей аналогово-цифровой преобразователь и ЭВМ с авторской «Программой регистрации сигналов хемилюминотестера ЛТ-01», позволяющей регистрировать амплитуду и площадь хемилюминесценции.

Расчет интегрального показателя состояния системы прооксиданты-антиоксиданты для многофакторной оценки выраженности ОС производили по методу И.И. Павлюченко (И.И. Павлюченко и соавт., 2003) с использованием формулы: КОМБэр = (ТБЧэр +ТБЧэр. Ind) • (E„-sh-rp. - Ersh-rp.) • 100.

Уровень ЭТ определялся по сорбционной способности эритроцитов и МСиНМ эритроцитов. Определение количества МСиНМ эритроцитов и плазмы проводили в УФ области спектра (в интервале от 238 до 306 нм с шагом длины волны 4 нм), с последующим расчетом площади фигуры, очерченной полученной кривой, на основании методики М.Я. Малаховой (C.B. Оболенский и соавт., 1991).

Определение уровня эндогенной интоксикации проводили по методике (А.А.Тогайбаев и соавт., 1988) в модификации (И.И. Павлюченко и соавт., 1999), принцип которой основан на оценке способности эритроцитов сорбировать витальные красители (метиленовый синий).

Также оценку уровня ЭТ проводили по расчетным авторским интегральным коэффициентам и индексам. Расчетный показатели эндогенной интоксикации -ИЭИ определяются по методике И.И. Павлюченко (Ю.В. Дынько, И.И. Павлюченко, А.А.Басов, 2004) на основании расчета коэффициента катаболической деструкции (ККД):

ККД = [(МСиНМ-эр * МСиНМ-пл) + (ТБЧэр + ТБЧэр Ind) * ТБЧпл)]/ [(МСиНМ-эр + МСиНМ-пл) * ((ТБЧэр + ТБЧэр Ind) + ТБЧпл)], ИЭИ = [(КК/Ц • 100) / ККДц ] - 100.

Для гистологического и гистохимического исследования органов брюшной полости поперечными разрезами вырезали кусочки слепой кишки и тонких кишок вместе с окружающими тканями, а также участок ткани из ранее травмированной передней брюшной стенки. Патоморфологические показатели изучены у 10 животных из 1 и 2 групп на 7 сутки и оставшихся живыми животных, выведенных на 14 сутки из 1 группы, и 33 экспериментальных животных 2 группы, забитых на 14 сутки. Исследуемый тканевой материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и через спирты восходящей концентрации и хлороформ заливали в парафин по общепринятой методике (Г.А.Меркулов, 1969). Изготовляли парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм. Применили комплекс традиционных способов гистологической и гистохимической окраски гистологических срезов. Среди них окраска гематоксилином и эозином для получения обзорных картин, способ окраски по Маллори для соединительной ткани, окраска альциановым синим при рН 1 и рН 3 для выявления кислых гликозаминогликанов (Б.Ромейс, 1953; Р.Лилли, 1969). Кроме того, широко использовали способ комбинированной окраски альдегид-фуксином - хромотропом - анилиновым синим (Н.Л.Сычева, 2009), а также способ окраски альциановым синим - нейтральным красным (Н.Л.Сычева, В.А. Сычев, 2002).

Для микробиологических исследований 5% гель пектина приготавливался из порошка путем его растворения в теплом изотоническом растворе хлорида натрия, затем стерилизовался на кипящей водяной бане в течение трех суток по 20 минут ежедневно. Для контроля стерильности производили посев 1 мл 5% геля пектина в 9 мл тиогликолевой среды и инкубировали в течение 14 суток при температуре 37 С, с ежедневными высевами 0,2 мл на среды Эндо, Левина, кровяной агар и на желточно-молочно-солевой агар (ЖМСА).

Антибактериальное действие 5% геля пектина изучали на чистых культурах E.coli, S. aureus, P. Aeruginosa. Для этого в 1 мл 5% геля пектина вносили 0,1 мл взвеси бактерий в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащей 5x105 микробных тел для каждой из выделенных культур; концентрацию бактерий определяли путем сравнения мутности бактериальной взвеси с оптическим стандартом. Смесь геля и бактерий инкубировали в термостате при

температуре 37 С и через каждые 15 минут в течение 6 часов производили высев бактериологической петлей (диаметр 4 мм) на питательные среды: посевы Е. coli и P. aeruginosa производились на среду Эндо, Левина и кровяной агар, S. aureus - на ЖМСА с последующим подсчетом количества выросших колоний.

При обработке экспериментальных данных для нахождения параметров описательной статистики использовали стандартные процедуры определения среднего значения (М) и стандартной ошибки среднего значения (m). Проверку выборочных распределений на нормальный закон распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Сравнение выборок проводили, опираясь на критерий Манни-Уитни. Уровень достоверности равный 0,05 (р < 0,05) принимали за критическое значение (С.Гланц, 1999). Обработку данных проводили в программных пакетах Microsoft Excel 2010 (Пакет анализа) и Statistica 6.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В контрольной группе развитее спаечных процессов в послеоперационном периоде имели место у всех наблюдаемых животных. Выраженность спаечного процесса методом семантического дифференциала составила на 7 сутки 3,42±0,45 баллов и на 14 сутки 4,39 ±0,64 баллов. В основной группе животных лишь у 3 крыс на 7 сутки имело место рыхлое подпаивание пряди сальника к срединному рубцу, а выраженность спаечного процесса составляла от 0,19 балла. При гистологическом исследовании у животных группы сравнения париетальная и висцеральная брюшина фиброзно изменена с подпаиванием органов брюшной полости к париетальной брюшине (рис. 1). В основной группе экспериментальных животных, наблюдаемых на 14 сутки эксперимента брюшина практически не отличалась, от интактной, без висцеропариетальных сращений (рис. 2).

Рис. 1. Спаечный процесс брюшной Рис. 2. Отсутствие спаечного

полости у животных группы сравнения. процесса брюшной полости у

животных основной группе.

Гистологическое исследование у животных группы сравнения позволило охарактеризовать некоторые морфогенетические проявления спаечного

процесса в ответ на повреждение париетальной и висцеральной брюшины (рис. 3). Так, спустя 7 суток серозная оболочка слепой и тонких кишок была отечна, гиперемирована, ткань ее вместе с продольным мышечным слоем кишок была пропитана фибринозным экссудатом, который также располагался на ее поверхности.

Мезотелиальный покров на значительном протяжении полностью отсутствовал. Отмеченные альтеративные и экссудативные проявления воспалительного процесса дополнялись выраженными пролиферативными процессами, ведущими к организации фибринозного экссудата и формированию сращений. Процессы организации фибринозного экссудата наблюдались и в области дефекта париетальной брюшины передней брюшной стенки, там массы фибрина заселялись молодыми фибробластами, которые приводили к его фиброзированию (рис.3).

В основной группе животных на 7-е сутки эксперимента признаки, указывающие на развитие спаечного процесса, практически отсутствовали. Серозная оболочка была утолщена за счет отека и воспалительного гистиолимфоцитарного клеточного инфильтрата, но при этом на серозном покрове кишок не обнаруживались фибринозные наложения. Непрерывность мезотелиального покрова была нарушена. Имелись участки, лишенные клеток мезотелия. Наряду с этим в других участках как проявление регенерации отмечалось нагромождение этих клеток с их многорядным расположением. При этом их ядра округлялись и выглядели гиперхромными (рис.4).

Рис. 3. Серозно-фибринозный экссудат между десерозированными поверхностями кишок подвергается организации Группа сравнения на 7 сутки эксперимента (окраска гематоксилином и эозином, ув. х 1000).

Рис. 4. Очаговые нагромождения клеток мезотелия с круглыми гиперхромными ядрами на поверхности кишки. Основная группа на 7 сутки эксперимента (окраска гематоксилином и эозином, ув. * 200).

Спустя 14 суток от начала эксперимента у крыс группы сравнения в межкишечных сращениях, а также в сращениях кишок с областью поврежденной брюшной стенки отечность грануляционной ткани ликвидировалась. Расстройства кровообращения стали менее выражены. На поверхности серозного покровакишок, свободной от фибринозных наложений и спаек, восстанавливался мезотелиальный покров. Выявлялись признаки пролиферации мезотелиальных клеток в виде их очаговых скоплений.

На 14-е сутки эксперимента в основной группе крыс межкишечные спайки не развивались. Дефект в париетальной брюшине ликвидировался за счет созревающей грануляционной ткани с ее трансформацией в плотную волокнистую рубцовую ткань, поверхность которой подверглась мезотелизации на всем протяжении (рис. 5). Отсутствовали также сращения между кишками и дефектом в париетальной брюшине. На поверхности серозной оболочки кишок восстановился слой из мезотелиальных клеток (рис. 6).

Рис. 5. Мезотелиальная выстилка на Рис. 6. Непрерывный слой из

поверхности зрелой грануляционной ткани мезотелиальных клеток на поверхности

передней брюшной стенки серозной оболочки тонкой кишки у

экспериментального животного основной экспериментального животного основной

группы на 14 сутки эксперимента. Окраска группы на 14 сутки эксперимента. Окраска

гематоксилином и эозином. Ув. х 200. гематоксилином и эозином. Ув. х 200.

Для оценки метаболических сдвигов в организме экспериментальных животных с моделированным спаечным процессом и хирургическим ОС были проведены исследования по изучению состояния системы про-/антиоксиданты (табл. 2; рис.7), а также влияние на этот процесс противоспаечного компонента 5% геля пектина, применяемого внутрибрюшинно.

При исследовании ферментов антиоксидантной и антирадикальной защиты эритроцитов КАТ и СОД выявлены нарушения их активности и взаимного функционирования. Активность КАТ эритроцитов была снижена у животных 1 и 2 групп в послеоперационном периоде. При этом у животных основной группы снижение составляло 22,5%, а у животных группы сравнения, которые не получали профилактически пектин ее снижение было выражено в большей мере и составляло в среднем 30% относительно показателя группы контроля (рис. 7).

Активность СОД, как фермента первой линии антирадикальной защиты, в отличие от КАТ была значительно повышена у животных обеих наблюдаемых групп на 14 сутки моделирования спаечного процесса, но в большей степени у экспериментальных животных группы сравнения, у которых СОД была выше показателя контрольных значений интактных животных на 70,6%, в то время как у животных основной группы, активность СОД эритроцитов была повышена на 41,2% (рис.7). Разнонаправленные изменения показателей

ферментного звена свидетельствуют о разбалансированности отдельных компонентов системы антиоксидантной и антирадикальной защиты (АОЗ) и нарушении из взаимного функционирования.

КАТ/СОД

характеристи

m Гр. №3 (контроль) » Гр. Nal (основная) ira Гр. №2 (сравнения)

Рис.7. Показатели системы антиоксидантной защиты у экспериментальных животных основной группы на фоне пектина и группы сравнения без использования пектина относительно группы контроля. (Яуза - общая антиокислительная активность; SH -сульфгидрильные группы; КАТ - каталаза; СОД - супероксиддисмутаза). *- достоверность различий между средними значениями характеристик сравниваемых групп р>0,05. Для остальных средних значений сравниваемых характеристик групп вероятность ошибки р<0,05.

Дисбаланс в АОС также наблюдалась при расчете интегрального коэффициента КАТ/СОД, который более наглядно и направленно отражает разбалансированность в защитных системах организма и, прежде всего, в системе антиоксидантной защиты. У животных основной группы на фоне применения пектина снижение показателя составляло в среднем 45%, относительно показателя нормы, наблюдаемой у животных группы контроля, а у животных группы сравнения показатель был снижен в большей мере, в среднем на 59%, т.е. на 14% ниже, чем у животных основной группы (рис.7).

Показатель КАТ/СОД отражает неоднозначную реакцию ферментного звена АОС крови и организма в целом на прооксидантную нагрузку, что может проявиться избыточной генерацией активированных форм кислорода (АФК), в частности пероксида водорода, который образуется при высокой активности СОД и низкой активности КАТ. В присутствии избытка супероксидного анион-радикала, металлов переменной валентности перекись водорода может стать источником генерации других представителей АФК и реактивно опасных кислородных метаболитов и, прежде всего, наиболее устойчивого и агрессивного гидроксильного радикала, которые имеет достаточно продолжительный период жизни, может

проникать через клеточные мембраны и повреждать различные биоструюуры, в том числе тиолсодержащие белки и аминокислоты.

Отражением напряжения в АОС крови и организма в целом является показатель общей антиокислительной активности плазмы (АОА), который был повешен у всех животных с моделированным спаечным процессом к 14-м суткам послеоперационного периода, но не в равной степени (рис.7).

Антиоксидантный потенциал крови у животных группы сравнения был выше показателя контрольной группы интактных животных в среднем на 38%, а у животных основной группы, у которых использовался в качестве профилактического средства пектин, на 72%. Увеличение антиоксидантного потенциала плазмы крови в периоперационном периоде свидетельствует об активации стресс-лимитирующих систем, в ответ на освобождение стресс-реализующих факторов (АФК, некоторые представители цитокинов, гормонов и гормоноподобных веществ) и активацию гипоталамо-адреналовой системы. При этом идет частичная инактивация продуктов чрезмерного индуцированного СРО и значительное расходование эндогенных антиоксидантных ресурсов.

Это подтвердилось при исследовании общих сульфгидрильных групп эритроцитов (рис.7), которые первыми вступают в нейтрализацию различных АФК.

Так в основной группе экспериментальных животных показатель БН-групп эритроцитов был снижен на 32,6% относительно показателя группы контроля, а у животных группы сравнения снижение уровня сульфгидрильных групп быле выражено, в среднем на 39,5%. Этот показатель отражает напряжение в работе эндогенного звена АОС, и прежде всего неферментного звена АОС крови у наблюдаемых экспериментальных животных, расходование низко- и высокомолекулярных белковых ресурсов и, как следствие, снижение восстановительного потенциала крови в условиях повышенной прооксидантной нагрузки.

При оценке интенсивности СРО и перекисного окисления биомолекул с помощью индуцированной хемилюминесценции у экспериментальных животных к 14 суткам послеоперационного периода было выявлена значительная активация этих процессов и увеличение уровня ХЛ у животных, как группы сравнения, так и основной группы, что отражает сохранение или нарастание прооксидантной нагрузки в отдаленный период после операции и активное образование и накопление в тканях и биологических жидкостях различных продуктов СРО и ПОЛ (табл.2; рис.8).

Так, амплитуда максимальной быстрой вспышки ХЛ плазмы крови была увеличена у животных основной группы, получающих пектин, в 3,1 раза, а у животных группы сравнения более чем в 3,8 раза, в сравнении с показателями контрольной группы. При этом у животных основной группы площадь вспышки ХЛ превышала показатели группы интактных животных в 3,9 раза, а у животных группы сравнения более чем в 5 раз. Это также является отражением протективных свойств геля пектина, который несколько сглаживает прооксидантную нагрузку.

характеристи*

■ Гр. №3 (контроль) « Гр. №1 (основная) ЮЯ Гр. №2 (сравнения)

Рис. 8. Показатели прооксидантиой нагрузки у экспериментальных животных основной группы на фоне пектина и группы сравнения без использования пектина на 14 послеоперационные сутки относительно группы контроля. (XJI - хемилюминесценция; ТБЧ -тиобарбитуровое число). *- для всех характеристик уровня свободнорадикального окисления крови наблюдалось достоверное различие (р<0,05) средних значений параметров для группы №3 (контроль) и групп №1 (основной) и №2 (сравнения), а также наблюдалось достоверное различие (р<0.05) средних значений характеристик для группы №1 и группы №2

Таблица 2

Основные параметры прооксидантно-антиоксидантной системы*

Показатель/группа Группа №1 Группа №2 Группа №3

М ш 1-3 1-2 М m 2-3 М m

Яуза, нА*с 2815,15 67,23 <0,001 <0,001 2251,84 96,07 <0,001 1630,54 57,91

ХЛ максимум, у.е. ХЛ 0,46 0,01 <0,001 <0,001 0,57 0,02 <0,001 0,15 0,01

ХЛ площадь, у.е. ХЛ 2,84 0,05 <0,001 <0,001 3,61 0,13 <0,001 0,72 0,03

ГБЧ плазмы, усл. ед. 0,38 0,01 <0,001 <0,001 0,43 0,01 <0,001 0,30 0,01

ТБЧ эритр., усл. ед. 1,61 0,03 <0,001 <0,001 1,79 0,01 <0,001 0,99 0,02

ГБЧ общее, усл. ед. 3,36 0,07 <0,001 <0,001 3,77 0,02 <0,001 2,42 0,03

БН группы, опт. ед. 0,29 0,01 <0,001 0,08 0,26 0,01 <0,001 0,43 0,01

КАТ, ед. акт. 0,93 0,07 0,04 0,22 0,84 0,04 0,01 1,20 0,13

СОД, ед. акт. 0,24 0,02 0,01 0,06 0,29 0,02 <0,001 0,17 0,03

КАТ/СОД 3,88 0,42 0,94 0,48 2,90 0,21 0,73 7,06 0,68

*В колонках 1-3, 1-2, 2-3 указан уровень достоверности различий между соответствующими группами, рассчитанный с использованием критерия Манна-Уитни. Различия считаются достоверными при уровне р<0,05.

Подтверждением повышения уровня реактивных промежуточных и конечных продуктов СРО и перекисного окисления стали показатели уровня

ТБК-активных веществ в эритроцитах и плазме крови (рис.8; табл.2).

Уровень ТБК-активных веществ эритроцитов, выражаемый как ТБЧ эритроцитов, был выше показателя контрольной группы у животных 2-й группы на 80,8%, а у животных 1-й группы на фоне внутрибрюшиннош введения пектина на 62.6%. Уровень ТБК-активных веществ в плазме крови экспериментальных животных обеих групп был также повышен, но менее выражено, чем в клеточном звене.

Показатель ТБЧ плазмы у животных основной группы было увеличено на 27%, а у животных группы сравнения, более значимо, на 43% относительно данных контроля. При оценке состояния вторичной аутоагрессии было установлено, что показатели эндогенной интоксикации и катаболической деструкции имеют высокие значения у всех экспериментальных животных с моделированным спаечным процессом.

ССЭ у животных 1-й группы превышала показатели группы интактных животных на 46%, а у животных группы сравнения этот показатель был увеличен еще более и превышал контроль на 70,4% (табл. 3; рис. 9).

Другой показатель токсичности внутренних сред, уровень МСиНМ эритроцитов, также был значительно увеличен у экспериментальных животных обеих групп. У животных основной группы МСиНМ эритроцитов превышали показатели контрольной группы на 67%, а у животных группы сравнения на 94%. В плазме крови экспериментальных животных происходили количественные изменения уровня эндогенных токсических субстанций на 14 сутки после оперативного вмешательства на органах брюшной полости. У животных 1-й группы показатель МСиНМ плазмы крови превышал данные контрольной группы на 73%, а у животных 2-й группы, не получавших пектин, этот показатель был еще выше, превосходя фоновые данные на 106,6%. Т.о., происходило практически более чем двукратное увеличение МСиНМ, среди которых отмечается большая группа соединений, обладающих высокой мембрано- и цитотоксичностью (рис. 9).

Интегральная оценка, основанная на использовании расчетных коэффициентов и индексов, объективно отражающих уровень ОС и СЭИ, позволит более объективно оценить эффективность использование пектина в целях профилактики неконтролируемых реакций СРО и спаечного процесса у экспериментальных животных. Полученные результаты подтвердили перспективность использования пектина для предотвращения генерализации процессов оксидативной модификации структурных и функциональных биомолекул и развития гиперкатаболических деструктивных процессов в области операционной раны, которые могут способствовать формированию спаечных процессов (табл. 3; рис. 9).

характеристики*

■ Гр. №3 (контроль) ■ Гр. №1 (основная) ÜW Гр. NB2 (сравнения)

Рис.9. Показатели эидотксикоза у экспериментальных животных основной группы с использованием геля пектина и группы сравнения на 14 сутки после операции относительно группы контроля. ССЭ - сорбционная способность эритроцитов; МСиНМ - молекулы средней и низкой массы плазмы и эритроцитов; ККД - коэффициент катаболической деструкции; ИЭИ - индекс эндогенной интоксикации; КОМБэр - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов.*- для всех характеристик эндотоксикоза наблюдалось достоверное различие (р<0,05) средних значений характеристик для группы №3 (контроль) и групп №1 (основной) и №2 (сравнения), а также наблюдалось достоверное различие (р<0,05) средних значений характеристик для группы №1 и группы №2.

Таблица 3

Основные параметры эндотоксикоза*

Показатель/группа Группа №1 Группа №2 Группа №3

М m 1-3 1-2 М m 2-3 М m

ССЭ, % 512,86 9,11 <0,001 <0,001 598,41 10,99 <0,001 351,11 17,60

МСиНМ пл., ед. экст. 2,63 0,03 <0,001 <0,001 3,14 0,15 <0,001 1,52 0,04

МСиНМ эр., ед.экст. 6,73 0,10 <0,001 <0,001 7,75 0,31 <0,001 4,02 0,18

ККД, усл. ед. 5,19 0,06 <0,001 <0,001 6,19 0,27 <0,001 3,10 0,06

ИЭИ, усл. ед. 434,31 6,25 <0,001 <0,001 537,28 27,39 <0,001 219,77 5,88

КОМБэр, усл. ед. 574,53 10,86 <0,001 <0,001 653,26 4,41 <0,001 357,87 7,57

*В колонках 1-3, 1-2, 2-3 указан уровень достоверности различий между соответствующими группами, рассчитанный с использованием критерия Манна-Уитни. Различия считаются достоверными при уровне р<0,05.

Расчетные коэффициенты, описанные в главе материалы и методы -КОМБРэр, ККД и ИЭИ были значительно повышены у животных с моделированным хирургическим ОС, относительно показателей контроля.

При этом показатель окислительной модификации биосубстратов,

отражающий выраженность прооксидантной нагрузки на клеточное звено -КОМБэр, был увеличен у животных обеих экспериментальных групп, но не в равной степени. У животных группы сравнения КОМБРэр был выше показателей контроля в среднем на 60,5%, а у животных основной группы на 82,5%. ИЭИ у животных основной группы был увеличен на 97%, а у животных группы сравнения еще более, на 144%.

При исследовании антибактериальных свойств 5% геля пектина во всех сериях опытов с контрольными высевами пектина, засеянного в тиогликолевую среду, на среды Эндо, Левина, ЖМСА и кровяной агар в течение 14 дней не было выявлено роста и размножения микроорганизмов, что указывает на стерильность используемого в экспериментах на животных геля пектина.

При изучении влияния 5% геля пектина на S. aureus получены следующие результаты. Исходный уровень роста стафилококка на ЖМСА составил 5x105 микробных единиц. Через 15 минут рост составил 4x105 микробных единиц. Через 30 минут рост стафилококка отсутствовал. Отсутствие роста колоний наблюдали и в дальнейшие промежутки времени в течение 6 часов. При изучении влияния 5% геля пектина на P. aeruginosa получены следующие результаты. Через 15-30 минут рост синегнойной палочки на среде Левина составил 5x10 микробных единиц (колоний), через 45 минут рост составил 5хЮ4 микробных единиц (колоний). Через 60 минут рост составил 5х 103 колоний. Через 75 минут рост P. aeruginosa отсутствовал. Отсутствие роста колоний наблюдали и в дальнейшие промежутки времени.

При изучении влияния 5% геля пектина на Е. coli получены следующие результаты. Через 30 минут рост кишечной палочки на среде Левина составил 4хЮ5 микробных единиц (колоний), через 2 часа рост составил ЗхЮ2 микробных единиц (колоний). Через 4,5 часа рост Е. coli отсутствовал. Отсутствие роста колоний наблюдали и в дальнейшие промежутки времени в течение 6 часов.

ВЫВОДЫ

1. Разработанный способ хирургического моделирования окислительного стресса и спаечных процессов брюшной полости в эксперименте, сочетающий в себе химическое, физическое, механическое и биологическое воздействие на брюшину, вызывает резкие сдвиги в метаболических процессах организма как на локальном, так и на системном уровнях и, практически в 100% случаев обеспечивает образование спаек.

2. Ключевую роль в развитии послеоперационных спаек играют как локальные факторы, так и сдвиги в системе прооксиданты-антиоксиданты у экспериментальных животных, проявляющиеся дисфункцией антиоксидантной системы, оксидативным стрессом, эндогенной интоксикацией, гиперкатаболизмом и появлением в тканях и биологических жидкостях избыточного количества продуктов свободнорадикального окисления.

3. Внутрибрюшинное использование 5% геля пектина в качестве барьерного средства при моделировании спаечных процессов в брюшной полости предупреждает запредельное развитие окислительного стресса и эндотоксикоза, способствует полной регенерации поврежденного мезотелия

(подтверждено патоморфологически) и, как следствие, препятствует образованию спаек.

4. Гель пектина (5%) обладает выраженными антимикробными свойствами в отношении возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний (E.coli, S. aureus и P. Aeruginosa), характеризующимися подавлением и/или полной остановкой роста патогенных микроорганизмов под его влиянием in vitro.

5. Наиболее информативными и объективными показателями патобиохимических сдвигов в организме при моделировании спаечных процессов брюшной полости хирургическим способом являются интегральные способы диагностики окислительного стресса и эндотоксикоза - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов и индекс эндогенной интоксикации, которые базируются на многофакторном анализе и позволяют осуществлять мониторинг течения послеоперационного раневого процесса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанная модель индукции процессов спайкообразования и формирования хирургического окислительного стресса в лабораторных условиях, практически в 100% случаев дающая выраженные спайки брюшной полости, может широко использоваться в экспериментальных исследованиях, в том числе и для проведения доклинического испытания различных фармакологических препаратов.

В клинической практике целесообразно использовать показатели прооксидантно-антиоксидантного баланса и эндогенной интоксикации, демонстрирующие отчетливую взаимосвязь при определении их в клеточных и во внеклеточных структурах, для мониторинга течения послеоперационного процесса и проводимой терапии.

Для борьбы со спаечным процессом брюшной полости в качестве барьерного средства представляется перспективным использование 5% геля свекловичного высокоочищенного низкометоксилированного пектина, который оказывает выраженный противоспаечный эффект и проявляет антиоксидантные, детоксицирующие и антимикробные свойства, что доказано в экспериментальных условиях.

Наиболее доступными и достаточно информативными способами тестирования наличия и выраженности окислительного стресса в послеоперационном периоде являются биофизические экспресс-методы, такие как амперометрическое определение общей антиоксидантной активности и хемилюминесцентный анализ уровня продуктов свободнорадикального окисления в плазме крови и эритроцитах. Для комплексной оценки уровня окислительного стресса и эндогенной интоксикации эффективнее использовать интегральные коэффициенты и индексы, имеющие мультифакториальные характеристики.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Павленко, С.Г. Экспериментальное обоснование использования геля пектина для профилактики образования спаек в брюшной полости : Всерос.

науч.-пракг. конф. / С.Г. Павленко, В.Ю. Шевчук // Вестн. хирург, гастроэнтерологии. 2006. -№1.~ С. 126.

2. Павленко, С. Г. Профилактика послеоперационного спайкообразования в брюшной полости / С.Г. Павленко, В.Ю. Шевчук, И.И. Павлюченко,

A.A. Евглевский, А.Э. Моргоев // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии : материалы 15 междунар. конф. и дискус. науч. клуба. - Ялта ; Гурзуф. 2007 г С.262-263.

3. Шевчук, В.Ю. Профилактика образования спаек в брюшной полости после оперативных вмешательств / В.Ю. Шевчук, А.Э. Моргоев,

И.И. Павлюченко, A.A. Евглевский // Первый съезд хирургов Южного федерального округа : материалы съезда. - Ростов н/Д., 2007.~ С.220-221.

4. Павленко, С.Г. Профилактика послеоперационного образования спаек брюшной полости / С. Г. Павленко, В.Ю. Шевчук, А.Э. Моргоев,

И.И. Павлюченко, A.A. Евглевский // Современные аспекты кишечной непроходимости : материалы Рос. науч. - практ. конф. с междунар. участием. -Анапа, 2007' С. 246-247.

5. Шевчук, В.Ю. Состояние системы антиоксидантной защиты крови у экспериментальных животных с моделированным спаечным процессом на фоне применения пектина / В.Ю. Шевчук, С.Г. Павленко, И.И. Павлюченко,

С.Р. Федосов, О.С. Охременко // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии // Материалы 16 междунар. конф. и дискус. науч. клуба. - Ялта ; Гурзуф, 2008.— С.372-374.

6. Шевчук, В.Ю. Экспериментальное обоснование профилактического применения геля пектина против образования спаек в брюшной полости / Шевчук В.Ю.. Хатко З.Н., Евглевский A.A. // Конгр. «Человек и лекарство. Краснодар 2008» : тез. докл. Краснодар, 2008,—С. 104.

7. Павлюченко, И.И. Состояние системы антиоксидантной системы крови у экспериментальных животных с моделированным спаечным процессом на фоне применения геля пектина / И.И. Павлюченко, С.Г. Павленко, В.Ю. Шевчук, С.Р. Федосов // Успехи соврем, естествознания. - 2009,- №2.~ С. 52-54.

8. Павленко, С.Г. Применение геля пектина для профилактики послеоперационного спайкообразования в брюшной полости в эксперименте / С. Г. Павленко, В.Ю. Шевчук, И. И. Павлюченко, 3. Н. Хатко // Актуальные вопросы хирургии, травматологии, анестезиологии-реаниматологии : материалы конф. - Владикавказ, 2009."" С.143-144.

9. *Шевчук, В.Ю. Экспериментальное профилактическое использование геля пектина против спайкообразования в брюшной полости / В.Ю. Шевчук, С.Г. Павленко // Фундам. исследи 2009,- №7г С.56-57.

10.* Моргоев, А.Э. Возможности использования тамерита для профилактики послеоперационных осложнений у пожилых больных с колоректальным раком /

A.Э. Моргоев, И. И. Павлюченко, С. Г. Павленко, С.Р. Федосов, В.Ю. Шевчук, К.И. Мелконян // Кубан. науч. мед. вестн. -2009. - №9 (114).— С.99-101.

11. Шевчук, В.Ю. Влияние итраабдоминапьного введения геля пектина на спайкообразование в брюшной полости и его антиоксидантные свойства /

B.Ю. Шевчук, И.И. Павлюченко, С.Г. Павленко, С.Р. Федосов // Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение

высоких технологий в промышленности : 12 междунар. науч.-практ. конф.-СПб., 2011. С.300-303.

12.* Моргоев, А.Э. Динамика изменения системы прооксиданты-антиоксиданты крови у больных колоректальным раком в периоперационном периоде на фоне применения тамерита / А.Э. Моргоев, И.И. Павлюченко,

С.Г. Павленко, В.Ю. Шевчук // Фундам. исслед. 2011:— №2— С.131-136.

13.* Влияние 5% геля свекловичного пектина на патогенную микрофлору / В.Ю. Шевчук, С. А. Бабичев, И. И. Павлюченко, С. Г. Павленко, В. Я. Зобенко //Кубан. науч. мед. вестн. -2013. - №1 (136).- С.195-197.

14.* Шевчук, В.Ю. Экспериментальное обоснование возможности использования геля пектина в абдоминальной хирургии / В.Ю. Шевчук,

И.И. Павлюченко, С.Р. Федосов, Е.И. Ременякина, В.Д. Левичкин,

Ю.С. Панасенкова // Соврем, проблемы науки и образования,— 2013.— №3

[Электронный ресурс]. URL: www.science-education.ru/109-9165.

* - работа, опубликована в журнале, включенном в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации.

Полученные патенты на изобретение:

1. Пат. 2331367 Российская Федерация, МПКН04 В1/38. Способ профилактики образования спаек и их рецидива / Павленко С.Г., Шевчук В.Ю., Моргоев А.Э., Павлюченко И.И., Евглевский A.A.; заявитель и патентообладатель Павленко С.Г., Шевчук В.Ю., Моргоев А.Э., Павлюченко И.И., Евглевский А. А. №2007104508/14; заявл. 05.02.07; опубл. 20.08.2008, бюл. № 23.

Список сокращений

АОА - антиокислительная активность;

АОС - антиоксидантная система;

АФК - активные формы кислорода;

ИЭИ - индекс эндогенной модификации;

КАТ - каталаза;

ККД - коэффициент катаболической деструкции;

КОМБэр - коэффициент окислительной модификации биомолекул

эритроцитов;

ОС - окислительный стресс;

сод - супероксиддисмутаза;

СРО - свободнорадикальное окисление;

ССЭ - сорбционная способность эритроцитов;

ТБК - тиобарбитуровая кислота;

ТБЧ - тиобарбитуровое число;

SH-группы - сульфгидрильные группы;

ХЛ - вспышка хемилюминесценции;

эт - эндотоксикоз.

U--5 673

Шевчук Вячеслав Юрьевич АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 25.09.13. Печать трафаретная. Формат 60x84 Vie. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 958 . Отпечатано в ООО «Издательский Дом-ЮГ» 350072, г. Краснодар, ул. Московская 2, корп. «В», оф. В-120, Тел.8 918-41-50-571

e-mail: olfomenko@yandex.ru

Сайт: http://id-yug.com

2014066697

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шевчук, Вячеслав Юрьевич, Краснодар

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201365867

ШЕВЧУК Вячеслав Юрьевич

На правах рукописи

ПАТОБИОХИМИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЕЛЯ ПЕКТИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ОБРАЗОВАНИЯ СПАЕК

БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ

(экспериментальное исследование)

03.01.04 - биохимия

14.03.03 - патологическая физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор И.И. Павлюченко

Краснодар 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ОГЛАВЛЕНИЕ............................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................12

1.1. Основные причины формирования спаечных процессов брюшной полости....................................................................................................................12

1.2. Роль окислительного стресса и эндогенной интоксикации в развитии спаечных процессов брюшной полости...............................................................15

1.3. Патобиохимические и патофизиологические подходы к диагностике, профилактике и терапии спаечных процессов брюшной полости...................20

1.3.1. Методы устранения последствий и принципы профилактики спаечных процессов брюшной полости.............................................................................20

1 АПерспективы экспериментального обоснования разработки новых подходов к профилактике и лечению спаечных процессов брюшной полости.

..................................................................................................................................32

1.4.1. Пектин и перспективы его использования в медицинской практике.. 34 ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................................................38

2.1. Методика создания спаечного процесса брюшной полости......................38

2.2. Методика оценки выраженности спаечного процесса................................47

2.3. Биохимические и биофизические методы исследования показателей оксидативных сдвигов и интоксикации в крови экспериментальных животных ..................................................................................................................................50

2.3.1. Методика забора биологического материала.........................................50

2.3.2. Методики оценки про-/антиоксидантных показателей и уровня эндогенной интоксикации крови экспериментальных животных.................51

2.3.2.1. Люминол-зависимая НгОг-индуцированная хемилюминесценция плазмы крови....................................................................................................51

2.3.2.2. Амперометрический анализ антиоксидантной активности плазмы крови..................................................................................................................52

2.3.2.3. Определение активности каталазы эритроцитов.............................52

2.3.2.4. Определение активности супероксиддисмутазы эритроцитов......53

2.3.2.5. Определение количества сульфгидрильных групп эритроцитов.. 53

2.3.2.6. Определение ТБК-активных продуктов крови................................53

2.3.2.7. Определение показателей уровня эндогенной интоксикации.......55

2.3.3. Методики расчета интегральных показателей окислительного стресса (ОС) и эндотоксикоза (ЭТ).................................................................................56

2.3.3.1. Интегральный показатель - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов (КОМБэр).....................................56

2.3.3.2. Интегральный показатель эндогенной интоксикации - индекс эндогенной интоксикации (ИЭИ)..................................................................57

2.4. Морфологические методы исследования.....................................................58

2.5. Микробиологические методы исследования...............................................59

2.6. Статистические методы исследования.........................................................60

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ С ОБСУЖДЕНИЕМ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................................................................61

3.1. Результаты исследования животных экспериментальных групп по показателям выраженности спаечного процесса................................................61

3.2. Результаты морфологических исследований..............................................72

3.3. Результаты биохимических и биофизических исследований системы про-/антиоксиданты и эндогенной интоксикации у экспериментальных животных ..................................................................................................................................84

3.3.1. Показатели системы про-/антиоксиданты у экспериментальных животных.............................................................................................................86

3.3.1.1. Показатели системы антиоксидантной защиты у экспериментальных животных.......................................................................86

3.3.1.2. Показатели процессов свободно-радикального окисления и перикисного окисления липидов у экспериментальных животных...........92

3.3.2. Показатели уровня эндотоксикоза у экспериментальных животных.. 98

3.3.3. Интегральные расчетные показатели эндотоксикоза и окислительного стресса у экспериментальных животных.......................................................103

3.4. Результаты микробиологического исследования 5% геля свекловичного

пектина..................................................................................................................106

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................111

ВЫВОДЫ.................................................................................................................121

Список сокращений и условных обозначений.....................................................123

Список литературы.................................................................................................124

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Проблема профилактики и лечения спаечных процессов брюшной полости (СПБП) продолжает оставаться актуальной в связи с широкой распространенностью данного состояния, дефицитом исчерпывающих знаний о патофизиологических механизмах его формирования и отсутствием универсальных подходов к его профилактике и лечению. В настоящее время по поводу СПБП регистрируется от 4 до 20 случаев на 100000 населения. Увеличение числа таких пациентов обусловлено выросшим количеством лапаротомий [В.Г. Харин 1990; Ar. Rajab et al.,1991; В.В. Барканов и соавт., 2011; Г.А Баранов, М.Ю., Карбовский, 2003; WK. Arung et al., 2012].

Наиболее частыми причинами образования спаек в брюшной полости являются воспалительно-деструктивные заболевания органов брюшной полости, травмы и повторные оперативные вмешательства [А.А. Воробьев и соавт., 1996, 2001; А.Б. Гаврилик и соавт., 2002; M.L. Freeman et al., 2003; J.M.Calmes et al., 2005]. Одним из значимых факторов в спайкообразовании выступает генетическая предрасположенность. У пациентов с быстрым типом ацетилирования преобладает процесс спайкообразования над лизисом соединительной ткани [С.Ю. Гармонов и соавт., 2006], что можно связать с активацией микросомаль-ного окисления, которое является предшествующим звеном в реакциях конъюгации, в том числе и ацетилирования. Немаловажную роль в процессах спайкообразования играет микрофлора кишечника.

Несомненно, одну из ключевых ролей в формировании послеоперационных спаек и развитии СПБП и их осложнений играет выраженный окислительный стресс (ОС) и эндотоксикоз (ЭТ), которые характерны для пациентов хирургического профиля [И.А. Ерюхин, Б.В. Шашков, 1995; И.Н.Пасечник, 2004; В.Н.Титов, 2004; Г.К. Рубцов, 2013], а результатом генерализованных процессов спайкообразования в большинстве случаев является кишечная непроходимость. За последние 20 лет частота спаечной непроходимости увеличилась в 1,9

раза [P.A. Женчевский, 1989; М.П. Лаврешин, 2005; М.С. Жуков, 2008; GW. Taylor et al., 2010].

До настоящего времени предлагаемые методы лечения и профилактики СПБП не отвечают всем запросам клиники, и наличие большого количества предлагаемых методов их лечения само по себе говорит об их несовершенстве, в том числе это относится и к предлагаемым барьерным препаратам [M. David et al., 2005].

Наиболее обоснованными являются методы профилактики спайкообразо-вания, прошедшие испытания в эксперименте, в частности, применение в качестве средства профилактики геля пектина. Для разработки и внедрения в клиническую практику новых профилактических средств необходимы полноценные доклинические исследования различных их эффектов, а для наиболее объективной диагностики метаболических оксидативных и токсических сдвигов в организме пациентов в периоперационном периоде необходимы быстрые, легко выполняемые и недорогие методы мониторинга проводимой терапии и течения послеоперационного периода, в том числе, биохимические и биофизические экспресс-методы, а также интегральные способы оценки ОС и ЭТ [И.И. Пав-люченко, 2005; С.Р. Федосов и соавт., 2010], значимость которых не оценена в полной мере.

Цель исследования: дать экспериментальное патобиохимическое и патофизиологическое обоснование возможности использования в медицинской практике геля пектина в качестве средства профилактики хирургического окислительного стресса и процессов спайкообразования в брюшной полости.

Задачи исследования

1. Разработать экспериментальную модель формирования спаечного процесса брюшной полости на животных. Изучить морфологические изменения органов брюшной полости на модели спаечного процесса и хирургического окислительного стресса и установить их особенность при местном

использовании геля пектина.

2. Выявить характерные сдвиги в системах антиоксидантной защиты и детоксикации при развитии хирургического окислительного стресса у экспериментальных животных с моделью спаечного процесса

3. Оценить возможность коррекции патобиохимических и патофизиологических сдвигов и профилактики спаечной болезни брюшной полости у экспериментальных животных с моделью спаечного процесса при внутрибрюшинном использовании геля пектина в качестве барьерного средства.

4. Изучить в лабораторных условиях антибактериальные свойства геля пектина в отношении патогенных госпитальных штаммов микроорганизмов (Staphylococcus aureus, Escherihia coli, Pseudomonas aeruginosa).

5. Определить наиболее информативные показатели метаболических сдвигов при моделировании хирургического окислительного стресса и спаечных процессов брюшной полости, позволяющих осуществлять мониторинг проводимых мероприятий.

Новизна результатов исследования

Впервые:

- предложена и экспериментально обоснована на лабораторных животных модель формирования спаечного процесса в брюшной полости, которая позволяет моделировать хирургическим способом ОС, подтвержденный биохимическими и биофизическими данными и практически в 100% случаев получать спайки брюшной полости (патент РФ № 23331367);

- на хирургической модели спаечных процессов органов брюшной полости установлена и показана тесная взаимосвязь морфологических и метаболических изменений в тканях при их формировании, которая сопровождается активацией стресс-реализующих и угнетением стресс-лимитирующих систем и, прежде всего, системы антиоксидантной защиты и

детоксикации;

- проведена оценка и мониторинг развития моделированного спаечного процесса комплексно с помощью авторской бальной системы, показателей системы прооксиданты-антиоксиданты и детоксикации, патоморфологии, что позволило объективно оценить развитие хирургического окислительного стресса и спаечного процесса на локальном (тканевом) и организменном уровне, в том числе, и с использованием интегральных коэффициентов и индексов (КОМБэр - коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов; ИЭИ - индекса эндогенной интоксикации);

- продемонстрирован выраженный противоспаечный эффект местного использования геля свекловичного высокоочищенного низкометоксилированного пектина отечественного производства, который обусловлен его антимикробными, антиоксидантами и детоксицирующими свойствами.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Развитие спаечной болезни брюшной полости сопровождается выраженными сдвигами в системе прооксиданты-антиоксиданты с превалированием первого звена и дисбалансом в самой системе антиоксидантной защиты, что проявляется резкой активацией процессов свободнорадикального окисления и пероксидации как на местном, так и на системном организменном уровне.

2. Эффективная и полноценная диагностика метаболических сдвигов в организме пациентов хирургического профиля с абдоминальной патологией в послеоперационном периоде возможна на основании биофизических показателей системы про-/антиоксиданты и интегральных показателей, комплексно отражающих выраженность процессов окислительного стресса и эндотоксикоза, таких как КОМБэр и ИЭИ.

3. Барьерные полимерные средства профилактики спаечного процесса

растительного происхождения, медленно биодеградируемые в брюшной полости, обладающие антирадикальными, детоксикационными и антимикробными свойствами, являются важным дополнительным фактором борьбы с осложнениями послеоперационного периода, что подтверждено на примере 5% геля пектина.

Теоретическая значимость работы

Установлены особенности патобиохимических и морфологических сдвигов в органах и системах органов при развитии спаечных процессов брюшной полости, которые позволяют существенно дополнить представления об основных звеньях патогенеза данного заболевания.

Доказана тесная взаимосвязь ОС и ЭТ в формировании неадекватной реакции организма на хирургическую травму в виде вторичной аутоагрессии, которая является основой структурно-функциональных изменений в органах и тканях, в том числе и образовании спаек после хирургического вмешательства на фоне механического, физического и химического воздействия на органы и ткани.

Расширены знания о свойствах природного полимерного вещества растительного происхождения - пектина, который способен проявлять не только свойства сорбента и барьерного вещества, но и участвовать в гашении неконтролируемых реакций СРО, а также обеспечивать антимикробную защиту, в том числе и в отношении нозокомиальных инфекций, что доказано в эксперименте.

Практическая значимость работы

Созданная и апробированная модель спаечного процесса в брюшной полости позволяет не только изучать процессы спайкообразования в брюшной полости в эксперименте, но и моделировать процессы окислительного стресса и

эндогенной интоксикации, характерные для острых и неотложных состояний, что дает возможность использовать эту методику для изучения антиоксидант-ных свойств различных лекарственных средств как новых, так и уже используемых в клинике.

Для борьбы со спаечным процессом брюшной полости в качестве барьерного средства перспективно использовать 5% гель свекловичного высоко-очищенного низкометоксилированного пектина, который оказывает выраженный противоспаечный эффект и проявляет антиоксидантные и антимикробные свойства.

Выявленные в экспериментальных условиях особенности динамики процессов свободнорадикального окисления и перекисного окисления при развитии спаечных процессов брюшной полости и окислительного стресса и эндо-токсикоза свидетельствуют о том, что эффективная ранняя диагностика пато-биохимических изменений в раннем послеоперационном периоде должна включать анализ основных показателей системы прооксиданты-антиоксиданты.

Наиболее доступными и достаточно информативными для выявления состояния ОС и его мониторинга в послеоперационном периоде являются биофизические экспресс-методы, такие как амперометрическое определение общей антиоксидантной активности и хемилюминесцентный анализ уровня продуктов СРО в плазме крови.

Личный вклад автора

Автором разработаны основные идеи и алгоритмы получения и обработки результатов проведенного исследования. Автор самостоятельно провел тщательный анализ современной литературы по проблеме повышения эффективности диагностики, профилактики и лечения спаечной болезни брюшной полости с использованием барьерных средств и, в частности, 5% геля пектина. Разработан дизайн и осуществлено многократное моделирование хирургического окис-

лительного стресса и спаечных процессов брюшной полости на достаточной по количественному составу группе экспериментальных животных. Автор самостоятельно курировал условия содержания животных в виварии, производил забор биологического материала и участвовал в проведении морфологических, биохимических, биофизических, микробиологических исследований. Автором разработаны протоколы исследования, позволяющие получить, зафиксировать и подвергнуть математической и статистической обработке данные по теме диссертационного исследования. На основании проведенных исследований сделаны достоверные, обоснованные выводы и разработаны практические рекомендации. Авторский вклад в написание научных работ по теме диссертации 70%.

Апробация работы

Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на XV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2007, 2008), конгрессе «Человек и лекарство» (Краснодар, 2008), 12 международной научно-практической конференции «Фунд