Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антибактериальное действие пектина (экспериментальное микробиологическое исследование)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антибактериальное действие пектина (экспериментальное микробиологическое исследование)"

РГ6 од

1 3 АНН 1.997

На правах рукописи

ПОТИЕВСКИЙ Эмиль Григорьевич

АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕКТИНА

(экспериментальное микробиологическое исследование)

03.00.07 — микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ЧЕЛЯБИНСК 10ев

Работа выполнена в Омской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный консультант — доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор З.Н. Кондрашова

Доктор медицинских наук, профессор З.С. Горовец

Доктор медицинских наук, профессор В. И. Лучшее

Ведущая организация — Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Минздрава РФ

на заседании диссертационного совета диа4Л)4.и;г при Челябинском государственном медицинском институте

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан

В.М. Бондаренко

Защита состоится

454092 Челябинск, ул. Воровского, 64

Ученый секрет.' рь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор A.B. Зурочна

ВВЕДЕНИЕ

/Устуяпь но сть темы. Острые кишечные инфекции, протекающие с диарейным синдромом, продолжают оставаться одной из первоочередных проблем здравоохранения.

Принятая в 1978 году программа ЕОЗ по борьбе с диарей-ныии заболеваниями и в настоящее время остается одним из важнейших действующих международных документов, тем более, что основные намеченные цели — снижение высокого уровня заболеваемости и смертности населения — все еще далеки от достижения.

Одним из наиболее результативных путей достижения этих целей является разработка новых этпотропных средств лече*-,я и профилактики. Несмотря на то, что на вооружение медицины ежегодно поступают новые антибиотики и химиопрепараты для лечения острых кишечных инфекций (ОКИ),отмечается зее более быстрое развитие' стойкой адаптации возбудителей этих инфекци"; :< новым препаратам, а также рост неблагоприятных побочных эф-' фектов этиотропной терапии на организм больного и его ауто-шырофпору.

Общепризнано, что клинические проявления этих побочных эффектов (аллергии, иммунодефициты, дисбзктериозы п др.) по тяжести нередко соизмеримы с исходным заболеванием. Поэтому актуальным остается поиск средств, сочетающих максимальную отиотропную активность с минимальным повреждающим действием на внутреннюю среду человека.

В этом плане наше внимание привлек пектин — естественный компонент практически всех зеленых растений и следовательно, растительный компонент пищи человека. При выделении его в чистом виде выяснилось, что пектин при определенных условиях может проявлять антибактериальную активность. В то же время он остается общеизвестным пищевым продуктом, совершенно безвредным для человека, и сохраняет благоприятное влияние на обменные процессы и пищеварительную функцию человека.

Вышеизложенное свидетельствует о необходимости и целесообразности предпринятой научной разработки для обоснования возможности использования пектина в качестве этиотропного средства для терапии острых кишечных инфекций.

Цель исследований. — научная разработка концепции характера воздействия пектина на патогенных энтеробактерий и обоснование возможности использования его в качестве этио-тропного средства, что позволит внести существенный вклад в проблему повышения эффе!,тивности борьбы с ОКИ.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние пектина на представителей основных групп патогенных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл, условно-патогенных бактерий, а также вибрионов), определить основные моменты, характеризующие механизм этого явления.

2. Выяснить влияние пектина на основных представителей нормальной микрофлоры кишечника человека (бифидумбактерий, эшерихий и др.).

3. Показать возможность клинического применения пектина.

4. Разработать концепцию (рабочую гипотезу) механизма действия пектина на патогенных энтеробактерий.

Научная новизна.

1. На основании проведенного экспериментального исследования впервые научно обоснована целесообразность и перспективность использования пектина в качестве антибактериального (бактерицидного) средства для борьбы с инфекционными диа-рейными заболеваниями (шигелпезами, сальмонелпезами и др.)

2. Экспериментально установлен характер влияния пектина на представителей нормальной микрофлоры кишечника человека.

3. Впервые совместно с клиницистами показана принципиальная возможность успешного применения пектина для терапии шигеллезов, сальмонеллезов и других ОКИ.

Практическая значимость работы.

На основании экспериментальных данных показана возможность принципиально нового подхода к терапии ОКИ, исключающая традиционные методы лечения данных заболеваний с использованием антибиотиков и антибактериальных химиопрепа-ратов (патент Республики Узбекистан).

Определены некоторые критерии, характеризующие пектин, пригодный для тпапии ОКИ.

Усгановлено, что для вышеуказанных целей может быть использован пектин, полученный из любого сырья (яблоки., то маты ЧДР-)-

Внедрение п практику.

Использование данных результатов экспериментальных исследований позволило разработать и внедрить о практику здравоохранения метод лечения ОКИ пектином (патент СССР).

Совместно с Институтом физи;:и и химии полимеров АН РУз разработана технология получения из местного сырья пектина, пригодного для медицинского применения (патент Республики Узбекистан).

Совместно с клиницистами Омской государственной медицинской академии проведена апробация-внедрение метода пек-тинотерапии и разработаны рекомендации по практическому применению метода.

Разработана методика определенна пригодности для медицинских целей пектина, получаемого производственным способом.

Апробация работы.

Диссертация апробирована на совместном заседании кафедр эпидемиологии и инфекционные болезней Омской государственной медицинской академии 04 июня 1996 г.

Материалы диссертации доложены на:

— заседаниях Узбекского общества эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов (1993,1994,1995);

— научно-практической конференции (Ташкент, 1990);

— Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы химиотерапии бактериальных инфекций" (Москва, 1991);

— Съезде врачей-инфекционистов (Суздаль, 1991)

— конференции "Интенсивная терапия инфекционных больных" (СПБ, 1993)

— VI съезде эпидемиологов, микробиологов, паразитологов, инфекционистов Узбекистана (Ташкент, 1994)

— годовом итоговом семинаре Института химии и физики полимеров АН РУз (Ташкент, 1994);

— международном симпозиуме "Пищевые зоонозы" (Москва, 1995); международной конференции "Современные проблемы науки о полчыерах (Ташкент, 1995. внепрограммный доклад);

— заседаниях Омсксй ассоциации инфекционистов (Омск, 1995, 1S9Ö)

— заседании Омского общества эпидемиологов и микро-биологоз (1996)

Публикации.

Научные положения, изложенные в диссертации, отражены в 15 работах, опубликованных с 1990 по 1996 гг.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 115 страницах текста, в том числе 9 приложениях. Включает 16 рисунков и 10 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов.

Библиография включает 163 источника, в том числе 43 иностранных. '

Материалы и методы исследований.

Основные исследования проведены на базе Ташкентского НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных заболеваний (НИИЭМИЗ) Минздрава РУз.

Исследуемым объектом являлся пектин — природный полимер Д-галактуроновой кислоты, естественный компонент повседневной пищи человека.

Изучались образцы пектинов различного сырьевого происхождения: яблочный, томатный, цитрусовый, хлопковый, капустный, чесночный, пеганиевый, айвовый, — приготовленных по оригинальным технологиям.

Параметры всех исследуемых образцов стандартизовались по ОСТ III-3-82 (в дальнейшем — по ГОСТ 29186-91 Пектин).

Основное внимание уделялось таким свойствам пектина, как растворимость, pH растворов и стойкость их в процессе хранения.

Водные растворы пектина готовили при помощи высокооборотных микг ^ров или. магнитных мешалок. Готовый раствор пектина представляет собой мутноватую вязкую жидкость серовато-белого цвета со слегка кислым привкусом. При хранении

б

более суток происходит образоваьие аморфного осадка, который легко переходит в раствор при взбалтывании. При условии хранения в холодильнике при температуре 6±1°С раствор сохраняет свои бактерицидные свойства более 4-х месяцев. При температуре 18' С и выше наступает быстрый гидролиз пектине.

В работе использовано 66 штаммов микроорганизмов, в т.ч. 34 штамма шигелл всех 4-х групп, 9 штаммов сальмонелл (тифи-муриум, энтеритпдис, тифи, ньюпорт, анатум), 4 штамма золотистых стафилококков, 11 штаммов кишечных палочек, 2 штамма бифидумбактерий, по одному штамму синегнойной палочки, лакто-бактерий, кпебсиелы пневмонии, 2 штамма холерных вибрионов Эль-Тор.

Штаммы были получены частично из коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва), частично от бактериологических лабораторий г. Ташкента. Работа с холерными вибрионами проводилась в лаборатории Республиканской ПЧС (Ташкент).

При бактериологических определениях (тестах) использовались общепринятые методики и питательные среды для соответствующих микроорганизмов. Общий объем микробиологических исследований составил 601 эксперимент, в т.ч. 165 экспериментов с сальмонеллами, 349 — с шигеллами, 37 — с представителями нормальной и условно-патогенной микрофлоры, 16 — с возбудителями холеры, 34 — комбинированных эксперимента. Всего выполнено 10355 микробиологических определений (тестов).

Для определения антимикробной активности пектина использовали, главным образом, 1 млрд. взвесь микроорганизмов в 1 мл раствора пектина соответствующей концентрации. Для этого готовили стерильные растворы пектина от 0,5 до 5%. Большие концентрации, как правило, не использовали, т.к. далее характер антимикробного действия существенно не менялся, но возрастало стимулирующее действие его на моторику кишечника, что нежелательно при ОКИ.

Смесь "пектин-микроорганизм" тщательно перемешивали и инкубировали в термостате при температуре 37°С. Определение жизнеспособности осуществляли путем высева на чувствительные питательные среды, начиная с одного часа инкубации и далее с 1-2-часовым интервалом. Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз.

В качестве экспериментальных животных использовались белые мыши, беспородные, весом 10-12 г. В 11 экспериментах было использовано 450 белых мыш»й.

Исследуемый материал — смесь "пектин-микроорганизмы" — иводипи зондом в желудок по 1 мл. Смесь "пектин-токсины" вводили в пяточку задней лапки мыши по 0,2 мл или зондом в желудок пс 1 мл.

Выделение тест-микроорганизмов из кишечника подопытных животных осуществляли по общепринятой системе определения патогенных энтеробактерий.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Сопоставление свойств различных образцов пектина показало, что наиболее высокой степенью очистки, стабильности и антибактериальной активностью отличались яблочный и томатный пектины, полученные по технологии проф. Ашубаевой З.Дж. (институт органической химии АН РКырг, Бишкек). С этими пектинами выполнена основная часть работы.

Предварительными установочными экспериментами было показано:

— что пектин не утилизируется возбудителями ОКИ, как питательный субстрат,

— что пребывание в растворе пектина негативно влияет на жизнеспособность этих микроорганизмов при концентрации раствора 2% и более,

— что нейтрализация раствора пектина полностью исключает его угнетающее действие на микроорганизмы.

Влияние пектина на представителей рода Shiaella.

В экспериментах "ин витро" было изучено влияние пектина на представителей всех 4-х групп данного рода энтеробактерий. Всего было выполнено 349 экспериментов (4430 определений). Особое внимание уделялось таким эпидемиологически значимым видам, как S.Disenteria 1, S.FIexneri spp., S.Sonnei, с этими видами поставлена большая часть опытов. В то же время, изучалось влияние пектина и на отдельных представителей всех групп.

Проведенное изучение чувствительности представителей рода Шигепла к воздействию различных концентраций пектина показало, что наряду с индивидуальными различиями отдельных видов и их сероваров. прослеживается общая тенденция, которая

s

в аппроксимированном виде представлена на рис.1 и характерна для всего рода в целом. Суть установленной тенденции состоит в том, что наибольшая выживаемость (устойчивость) — до 5-6 часов

— проявляется у шигелл при контакте с раствором пектина в концентрации ?го до 1%. При увеличении концентрации пектина время выживаемости шигелл сокращается: 2-3% раствор пектина

— до 3-5 часов, 4% раствор — 1 час, 5% раствор — менее одного часа.

Время экспозиции час

Концентрация раствора пектина (%)

Здесь и далее:

I ' | сохранение жизнеспособности ¡¡2523 гибель бактерий Рис.1. Влияние пектина на жизнеспособность шигелл

Влияние пектина на представителей рода Salmonella.

Как известно, сальмонеллы представляют наиболее общир-ную группу в семействе энтеробактерий. Этой группе присуща сложная антигенная дифференциация, полипагогенность и убик-витарность распространения.

Большое количество гр„пп и сероваров в них исключали проведение в рамках настоящей работы такого же подробного изучения, как с представителями рода Шигелла. Поэтому в данном исследовании мы уделили основное внимание таким эпидемиологически значимым видам возбудителей сальмонелпезоо, как сальмонеллы тифимуриум. энгеритидис, тифи, а также некоторым

сравнительно редко встречающимся возбудителям, как, например, сальмонеллы Лондон, анатум.

Схема постановки экспериментов с сальмонеллами принципиально не отличалзсь от такой же при изучении шигелл. Обобщенная картина тенденции чувствительности сальмонелл к воздействию пектина представлена на рис.2. Данная картина, построенная на материале 165 экспериментов (2153 определений) довольно близко напоминает обобщенную картину чувствительности к пектину шг^елл (рис.1). Однако нельзя не заметить, что при явной сходности тенденций, сальмонеллы проявили большую устойчивость к пектину, особенно при концентрациях его в растворе 2-3-4%. В ттих случаях сальмонеллы выдерживали неблагоприятное воздействие пектина, ,;ак правило, на 1-2 часа дольше, чем шигеллы. Только при воздействии 5% раствора пектина устойчивость представителей обоих родов становилась сходной: выжизаемость сальмонелл отмечалась в пределах одного часа, после чего микроорганизмы погибали.

В индивидуальной чувствительности представителей отдельных сальмонелл имели место определенные отличия. Био-вары сальмонелл тифимуриум, активно образующие сероводород, были устойчивее сероводород-негативных биоваров, которые погибали при воздействи: 3-4-5% растворов пектина в течение 1-2 часов.

Время экспозиции, час Концентрация раствора пектина {%)

1 2 3 4 5

1 . •• г' ' ■ •

2

3 <

4

5

6

24

Рис.2. Влияние пектина н- жизнеспособность ' сальмонелл

Ю

Более высокая чувствительность к пектину было обнаружена у возбудителя брюшного тифа. Эти сальмонеллы выдерживали контакт с 2-3% растворами пектина в течение 2-х часов, после чего обнаружить жизнеспособные бактерии не представлялось возможным. Таким образсм, было установлено выраженное антибактериальное действие пектина в отношении сальмонелл.

Достоверность характера влияния концентрации пектина и времени воздействия на шигелл и сальмонелл была подтверждена и статистически методом дисперсионного факторного анализа и по критерию "хи-квадрат".

Влияние пектина на холерных вибрионов.

Помимо чисто научного интереса, актуальность данного исследования обусловлена подъемом заболеваемости холерой, четко зафиксированной в последнее время.

Время Концентрация раствора пектина 1%)

экспозиции,

час 0,25 » * » 1 1 0,5 | 1 | 2 | 3-5 |

1 | ' ¡^^

2 ^^ ^^

3 / 1 ^^ ^^1

4 ^^ ^^ !

5

6

24

Рис.3. Чувствительность холерных вибрионов к пектину

Представлялось интересным изучить устойчивость холерных вибрионов к воздействию пектина. Исследование проводилось с классическим штаммом холерного вибриона Эль-Тор (штамм Р-1-145, Саратов) и штаммом Огава-727 (Ташкент). Всего выполнено 16 экспериментов (300 определений). Результаты экспериментов в обобщенном виде представлены на ^ис.З. Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности холерных вибрионов к пектину. Сохранение жизнеспособности наблюдалось только при воздействии 0.25% раствора пектина.

При повышении концентрации пектина до 0,5% жизнеспособность вибрионов сохранялась только в течение первого часа контакта, р дальнейшем обнаружить жизнеспособные микроорганизмы не удавалось. При концентрации пектина в растворе 1% и более, гибель вибрионов наступала в течение первого часа контакта. В связи с вышеизложенным, мы рассматриваем действие пектина на холерных вибрионов также, как бактерицидное.

Описанная чувствительность холерных вибрионов к пектину является впервые установленным фактом.

Влияние пектина на условно-патогенную микрофлору кишечника.

Изучение чувствительности представителей условно-патогенных энтеробактерий к пектину проводилось на модели клеб-сиел, цитрсбактера, псевдомончд, стафилококков. На материале 16 экспериментов (1117 определений) выявилась, за исключением стафилококков, однотипная картина. Все перечисленные микроорганизмы проявили выраженную чувствительность к воздействию 3-5% растворов пектина. Наиболее характерно это демонстрируется на модели синегнойной палочки (рис.4). Как видно из рисунка, псевдомонады (аналогично — клебсиелы, цитробактер) довольно быстро погибают при концентрациях растворов пектина,

Значительно более выраженная устойчивость к воздействию пектина была обнаружена у стафилококков. Устаноплено, что по сравнению с представителями семейства энтеробактерий, стафилококки оказались значительно устойчивее: они выживали посае 6-часового контакта с 3-5% растворами пектина. Вероятно, это связано с особенностями, присущими грамлозитивиым микроорганизмам.

Влияние пектина па прк/устлпитнпай нормальней микрофлоры кишечника чолопека.

Логическим следствием установления бактерицидного действия пектина на возбудителей ОКИ и условно-патогенных микроорганизмов является постановка вопроса о влиянии его на нормальную микрофлору кишечника человека. Возбудители ОКИ в течение инфекционного процесса функционируют в присутствии нормального бактериоценоза кишечника и любое воздействие на них является одновременно воздействием на нормальную микрофлору кишечника.

Изучение влияния пектина на нормальную микрофлору кишечника осуществлялось, главным образом, на модели даух наиболее массовых видов — кишечной палочки и бифи-думбактерий.

Изучение влияния пектина на нормальную кишечную палочку осуществлялось параллельно с энтеропатогенными кишечными палочками. На материале 20 экспериментов (715 определений) было установлено следующее.

Изучение штаммов нормальных кишечных палочек показало, что чувствительность их может варьировать от выраженной, когда эти бактерии погибают в течение 1-2 часов воздействия низкоконцентрированных растворов пектина, до слабо выраженной, когда кишечная палочка выдерживает воздействие 5% раствора пектина в течение 1-2 часов. Вероятно, это отражает неоднородность популяции кишечной палочки по признаку пекти-ноустойчивости, а также является следствием эволюционной адаптации к папину,.как компоненту пищи человека. Обобщенная картина устойчивости нормальных зшерихий к пектину представлена на рис.5. .

Представлялось интересным проследить влиячие пектина, 5% раствора, на взвесь кишечных палочек, плотность которой сопоставима с таковой в кишечника человека.

Изучение проводилось на модели 10-млрд взвеси нормальных кишечных палочек (условный нижний предел численности на 1 г содержимого кишечника). При обычной схеме постановки эксперимента было установлено: сроки выживания кишечной палочки возросли до 4-х часов против 2-х часов при одномиллиардной взвеси, т.е. бактерицидное действие на более плотную взвесь оказалось несколько ослабленным.

По сравнению с нормальными эшерихиями, энтеропатоген-ные проявляли несколько большую устойчивость к воздействию 3 и 4% раствора пектина, но, в целом, для этих близкородственных микроорганизмов характерна одинаковая тенденция чувствительности к пектину, отраженная на рис.5, что подтверждено статистически дисперсионным факторным анализом.

Время Концентрация раствора пектина (%)

экспозиции

чао 1 2 3 4 5

0 ■ * *. ь1.

1- •

2

3

4

5 ^— „_____ -'5

6

24

Рис.5. Чувствительность нормальных Е.соИ к пектину

Полученные данные позволяют высказать несколько предположений, объясняющих выживание эшерихий в кишечнике при воздействии пектина:

во-первых, в толстом кишечнике происходит снижение концентрации исходного раствора пектина за счет разведения кишечным содержимым,

во-вторых, в просвете толстого кишечника пектин частично разлагается под действием пектинолитических бактерий, а также частично "блокируется" за счет сорбции макромолекулярных комплексов белков и пипидов, что также снижает его активность,

и

в-третьих, высокая численность популяции естественно адаптированной к пектину кишечной палочки позволяет быстро восстановиться после частичной гибели от кратковременного воздействия повышенной концентрации пектина.

Влияние пектина на бифидумбактерий.

Следствием убиквитарности распространения в кишечнике бифидумбактерий является то обстоятельство, что они подвергаются воздействию всех лекарственных средств, применяемых при терапии инфекционных заболеваний желудочно-кишечного траста. Поэтому, изучая влияние пектина на нормальную микрофлору, мы на могли но исследовать его влияние на зти микроорганизмы.

Чувствительность бифидумбактерий определялась по возможному изменению титра их после контакта с пектином Было установлено, что бифидумбактерии проявили выраженную устойчивость к воздействию 5% раствора пектина. Снижение титра, которое свидетельствовало бы о гибели . микроорганизмов, но отмсчалосл даже после 24-чпсового контакта.

Причины такой устойчивости, преязде всего, в физиологических особенностях данных микроорганизмов. Будучи мощными кислотообразователями, бифидумбактерии способны длительно сохранять жизнеспособность в закисленной средо. По нашим наблюдениям, в среде культипированил при рН менее 4,0 бифидумбактерии сохраняли жизнеспособность до 5 суток.

По сравнзннк* с бифидумбактериями, другие кислотообра-зеватели, обитающие в кишечнике, например, лактобактерии, оказались более чувствительными, чем первые при воздействии пектина. Их устойчивость более сопоставима с таковой у кишечных палочек, нежели чем с бифидумбактериями.

Таким образом, проведенные исследования показали, что воздействие пектина на представителей нормальной микрофлоры кишечника неоднозначно и должно рассматриваться в комплексе с учетом физиологических особенностей микроорганизмов,' а также экологических условий обитания их в кишечнике. Это, в конечном счете, обусловливает выживание популяций нормального бакте-риоценоза в условиях кратковременных воздействий больших количеств пектина.

С другой стороны, можно предположить, что пектин (в эволюционном плане) является одним из регуляторов количества

нормальной микрофлоры кишечника, что уже само по себе может свидетельствовать о его важном значении для здоровья человека.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Накопление положительной информации об антимикробной активности пектина позволило нам не тог.ако дополнить и углубить ранее существовавшие представления о возможном влиянии пектина на возбудителей ОКИ, но и логически привело к осознанию целесообразности рекомендовать пектин к использованию при терапии ОКИ, т.к. он сочетает в себе два важнейших качества: выраженную антимикробную активность и безвредность пищевого продукта.

После успешных предварительных клинических наблюдений в 1989 году по использованию пектина для лечения затяжных диарейнь'х состояний инфекционной природы, были начаты совместные с клиницистами фундаментальные исследования по эффективности клинического применения пектинотерапии при ОКИ.

В течение 1990-1С92 гг под наблюдением находилось 207 больных ОКИ, в т.ч. 50 — сальмонеллезом (преимущественно тифимуриум и энтсритидис), 56 — острой дизентерией (преимущественно Флекснер, Зонне), 20 — ОКЗ, вызванных условнотпа-тогенной микрофлорой (эшерихии, цитробактер и др.), а также 81 больной ОКЗ неустановленной этиологии. Преобладали лица молодого возраста — 53,1%. Среди наблюдаемых: мужчин — 70%, женщин — 30%.

Все больные были разделены на основную и контрольную группы. По кпиническому течению, тяжести патологического процесса сравниваемые группы были сопоставимы.

Клиническое течение характеризовалось, как легкое или среднетяжелое. У больных сальмонеллезами преобладала гаст-роинтестинальная форма, у больных дизентерией — колитическая форма.

Бактериологически диагноз был подтвержден у всех больных при поступпении, кроме случаев ОКЗ неустановпенной этиологии. Перед выпиской из стационара также производился контрольный бактериологический анализ.

к.

Лечение пекыном осуществлялось путы перорапьного введения 5% водного раствора пектина по 25 мл через 6 часов до полного исчезновения клинических симптомов болезни.

Лечение другими этиотропными средствами (контрольные группы) осуществлялось по общепринятым схемам.

В результате проведенных клинических исследований было установлено, что прием пектина больные переносили хорошо. Побочных реакций на прием пектина не отмечались. Во всех группах, получающих пектинотерапию, нормализация основных клинических проявлений наблюдалась, в целом, к концу третьих суток от начала лечения, тогда как в контрольных группах к концу четвертых суток только намечалась тенденция к улучшению. Особенно отчетливо подобная тенденция просматривалась в группах больных дизентерией и сальмоноллезами. Сравнительные сроки нормализации основных симптомов в соответствующих группах приводятся в таблице 1.

Бактериологические анализы после курса пектинотерапии были отрицательными. Рецидивы или хронизация ОКИ после пектинотерапии не отмечались.

Для определения возможного влияния пектинотерапии на нормальную микрофлору была обследосяна группа больных ОКИ (случайная выборка ) в количестве 20 человек. Количественный анализ основных представителей нормальной микрофлоры (бифи-думбактерии. кишечная палочка, лактобактерии), проведенный до начала пектинотерапии и после окончания ее, не выявил различий, что подтвердило результаты экспериментальных наблюдений по влиянию петг-и на представителей нормальной микрофлоры. Клинические наблюдения также показали, что дисбактериоз после пектинотерапии у рекоивалесцентов не отмечался.

Анализ данных о влиянии пектинотерапии на длительность клинических проявлений показал, чтэ лечение пектином ускоряет выздоровление и сокращает, в среднем на 2,5-3 суток показатель "койко-дней".

В 1995-1996 гг на базе каф. инфекционных болезней ОГМА (руководитель кафедры — проф. Дроздов В.Н.) была проведена апробация пектинотерапии при лечении ОКИ. Было показано полное совпадение данных, как по характеру купирования основных клинических проявлений, так и по срокам выздоровления.

В процессе экспериментального изучения бактерицидного действия пектина на возбудителей ОКИ, а затем и н процессе

клинических ■ испытаний возник вопрос определения количественных параметров актиснрсти пектина и разработки критерия бактерицидной активности пектина.

Такой критерий может быть полезным как для понимания аспектов клинического применения пектина, так к для определения пригодности его для медицинских целей при промышленном производстве.

Для выяснения данного вопроса были выполнены эксперименты, в которых проверялась бактерицидная активность 5% раствора пектина по отношению к возрастающим концентрациям пектина: 10-50-100-150-200 млрд микробных тел в 1 мл раствора пектина. Ислытывались экспериментальные и производственные образцы пектина.

Было установлено, что количество микроорганизмов, которое может нейтрализовать пектин, варьирует. Эта способность пзшша, которую предлагается назвать бзкторицидной емкостью, вероятно, мс;цет служить критерием пригодности пектина для лечения и профилактики ОКИ.

По нашим данный бактерицидна емкость пектинов, приготовленных по различным технологиям, существенно различалась. . Наилучшко показатели бактерицидной емкости зависят от степени чистоты и растворимости пектина.

Критерий бактерицидном емкости может быть рекомендован для практического использования при промышленном производстве поетика для медицинских целей. По нашему мнению, наиболее оптимальными параметрами бактерицидной емкости является инактивация 150-200 млрд микробных тел одним миллилитром 5% раствора пектина в течение не более 3-х-чассеой инкубации при 37°С.

Сроки исчезновения клинических симптомов (э днях М±гп) при лечении Зольных со среднетя)1селым точением

Таблица 1

Симптомы Сальмонеллэз Дизентерия ОКИ установленной этиологии ОКИ неустановленной этиологии

Основная п=25 Контроль«. п=25 Основная п=27 Конт-рольн. п=29 Основная п=Э Конт-рольн. п=11 Основная п=42 Конт-рольн. п=39

Пихор ад кз 1.3Ю.5 1.5Ю.6 1.210.4 1.310.5 1.3Ю.6 1.510.7 1.2+05 1.110.3

Слабость 2.510.6 3.6Ю.8 2.4+0.6 3.110.7 2.4Ю.6 2.6+0.7 Г.410.6 2.910.6

Головная боль 1.610.5 Т.9Ю.6 1.510.3 1.810.3 1.6±0.09 1.7Ю.6 1.3+0.3 1.410.5

Тошнота t.2+0.4 1.710.5 1.2Ю.4 1.710.6 1.0+0.1 1.210.5 1.210.4 1.510.6

Рвота - i.o±a? 1.310.3 1.010.1 1.7Ю.6 1.0Ю.1 ■1.0+0.1 1.1+0.4 1.310.6

Бальз ризоте 3.5+0.5 5.1±0.5 3.2Ю.6 5.6Ю.8 2.6Ю.З 3.5Ю.5 2.510.5 4.0Ю.5

Жидкий ступ З.ЗЮ.4 4.9Ю.5 3.110.6 5.5Ю.8 2.4Ю.З 3.210.3 2.6Ю.З 3.710.3

КОНЦЕПЦИЯ НЕКОТОРЫХ АСПЕКТОВ

АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ПЕКТИНА.

Настоящее исследование, являясь, по существу, первым в данной области, не претендует на всестороннее освещение такого сложного сопроса, как механизм антибактериального (бактерицидного) действия пектина. Поэтому мы ограничились попыткой теоретического обоснования некоторых наиболее важных, по нашему мнению, аспектов этого явления.

Химический аспекты антибактериального действия пектина.

Как известно, пектин — одно из немногих естественных органических соединений, которые не подвергаются химической деградации, проходя через кислотный и щелочной энзимзтичесхие барьеры человеческого организма. Таким образом, на протяжении всего желудочно-кишечного тракта, за исключением части толстого кишечника, пектин сохраняет свою структуру и свойства.

Содержимоо. тонкой кишки при острых инфекционных диареях можно условно представи-п., как сложный попиэлектролит — следствие дезорганизация процессов водно-солевого обмена организма.

В такой среде состояние макромолекулы пектина, содержащей свободные карбоксильные группы, можно представить в ьиде обратимо-диссоциированного макроиона.

Свободные карбоксильные ионы -СОО макроиона вступают во взаимодействие с присутствующими в растворе положительно заряженными катионами натрия и калия, образуя, с одной стороны, соответствующие соли, а с другой стороны — остающийся катион Н\ нзпимодействуя с анионом хлора, образует соляную кисло гу. Количество образовавшейся соляной кислоты, как промежуточного продукта на этапе обратимой диссоциации пектина, вероятно, должно зависеть от количества хлоридов, поступающих в просвет кишки из внутренней среды организма. Таким образом, захисление просвета кишки при приеме пектина обусловливается , не только макромолекулой пектина, гак органической кислоты, но и (возможно, не в меньшей степени) за счет образования в процессе диссоциации свободной соляной кислоты.

Возможны •.акже и другие реакции, например омыление этерифицированных карбоксильных групп с образованием солей и метилового спирта. Влияние всех упомянутых возможных промежуточных продуктов на микроорганизмы общеизвестно — выраженное бактерицидное. •

Очень важным представляется установленный факт "буферной" способности пектина: при многократном разведении нейтральным физиологическим раствором (в 40-100 раз) существенного изменении р! не отмечалось. Так, при исходном рН 5% раствора пектина = 2,9-3,0, рН сорохакратного разведения равнялся 3,5, а после разведения в 100 раз — 3,65. Следовательно, можно допустить, что благодаря пектину с тонкой (преимущественно) кишке временно формируется дополнительный кислотный барьер с соответствующим временным изменением эколо: гических условий, что угнетает или препятствует развитию лато-геннсй микрофлоры, даже при определенном разведении пектина в просвете кишки. -

Как известно, рН просрета тонкий кишки (за исключением 12-перстной кишки) характеризуется, как слабощелочная, т.е. в предела : 6.Р-7.6. Естественно, что попадая в эти условия: оптимальные рН и температура, обилие нутриьитоо, — возбудители

ОКИ находят прекрасные экологические условия для жизнедеятельности. В этих условиях наиболее полно реализуется токси-генное действие возбудителя — продукция токсина и его транзит через слизистую во внутреннюю среду организма.

Изменение этих экологических условий должно сразу же сказаться на характере жизнедеятельности патогенных микроорганизмов. Следует учитывать также, что cpaL.-штельно медленное продвижение содержимого тонкого кишечника и обеспечение постоянного присутствия пектина в желудочно-кишечном тракте, например, при дробном приеме препарата, позволяет на определенное время создать состояние "закислен».я" внутренней среды тонкого кишечника, что самым неблагоприятным образом скажется на жизнедеятельности возбудителей и способно дезорганизовать развитие инфекционного процесса.

Вероятно, такое изменение внутренней среды сказывается и на характере некоторых физиологических процессов, например, всасывании-экскреции. Клиницистами отмечено быстрое купирование токсического синдрома и диареи при приме пектина, что косвенно подтверждает данное предположение.

В плане экспериментальной проверки некоторых теоретических положений нами, было выполнено 6 экспериментов на 150 белых мышах. Изучалось влияние пектина на эндотоксины шигелл Григорьева-Шига и энтеропатогенной кишечной палочки 055:В5.

Разведения токсинов готовили на 5% растворе пектина и после инкубации при 37°С вводили зондом в желудок по 1 мл или по 0,2 в пяточку задней лапки мыши. При пероральном введении срок наблюдения составлял 5-7 суток. При введении токсина в лапку срок наблюдения — 48 ч. В среднем, разведение 1:2 токсина соответствовало дозе tfJ/feo- Контролем являлись соот зетствую-щио разведения на бульоне.

О влиянии пектина на активность токсина судили по различию уровней выживаемости в опыте и контроле. Или по различию проявлений токсического отека лаг..ш, в которую вводили опытную смесь, по сравнению с контрольной.

Оценивая результаты проведенных экспериментов, следует отметить, что в группе животных, получивших смесь "пектин-токсин", отмечался выраженный протективный эффект: практически 100% выживаемость при введении смеси з- желудок и статистически достоверное различие (уменьшение) проявлений отека лапки. В контрольных тестах выживаемость при введении смеси

"бульоч-токсин" в желудей колебалась от 50 до 75% (в зависимости от степени раз£едеьия токсина). Проявления токсического отека были достоверно более выражены.

О возможном слияние" пектина на процесс клетка-клеточного взэи .у. од о й стс и я_при инспекциях бактериальной

природы.

Важным аспектом антибактериального действия пектина на возбудителей ОКИ может быть влияние его на процесс адгезии этих микроорганизмов на эпителий кишечника. В настоящее время накоплен и описан в литературе убедительный экспериментальный материал, свидетельствующий, что колонизация эпителия кишечника возбудителями кишечных инфекций осуществляется, главным образом, процессом лиганд-рецепторной связи. При этом установлено, что для возбудителей ОКИ среди рецепторов' кишечного эпителия наиболее существенную роль в адгезии играют терминальные остатки Д-галактооы, ианозы и др. Сахаров. Следует отметить, что аналогичные остатки гала;стозы и других Сахаров присутствуют и на молекуле пектина.

По нашему мнению, вполне корректно допустить, что в просвете кишечника и пристеночном пищеварительном слое макромолекула пектина с ее углеводными остатками может выступить конкурентом рецепторов эпителия кишечной стенки. Взаимодействие лигакда микроба с гомологичным углеводным остатком на молекуле пектина (аналог эпителиального рецептора) приведет к блокированию лиганда и сделает невозможным прикрепление (адгезию) микроба на стенку кишки.

В патогенетическом аспекте, взаимодействие такого рода означает прекращение взаимодействия макро- и микроорганизмов и следовательно, прекращение инфекционного процесса.

С целью проверки данного допущения нами были выполнены 5 экспериментов на белых мышах, в которых моделировалось влияние пектина на экспериментальный инфекционный процесс.

В двух экспериментах животным вводи пи в желудок смесь равных объемов 1ЛД50 сальмонелл тифимуриум и 5% раствора пектина после предварительной часовой инкубации при 37°С.

В трех других экспериментах животные получали интра-гастрально 1ЛДк тех же сальмонелл, а через час равный объем 5% раствора пектина. Контрольные животные получали раздельно

или возбудителя в соответствующей дозе игч только 5% раствор пектина.

У мышей опытной и контрольной групп из тонкого кишечника и желчного пузыря производили высевы для определения присутствия сальмонелл через б, 12 и 24 часа от момента заражения. Б контрольной группе мышей, получивших 5% раствор пектина, как и во всех предыдущих экспериментах, неблагоприятных воздействий на состояние здоровья животных не отмечалось.

В контрольной группе животных, получивших заразный материал без пектина, отмечалось обсеменение всех отделов кишечника и развитие сальмонеллезной эпизоотии.

В результате проведенных экспериментов выявилась следующая картина:

В группе получавших смесь "пектин-микроб" через 6 часов после заражения только в дистальной части тонкой кишки у одной из трзх зараженных мышей удалось выделить сальмонеллу тифи-муриум. В содержимом желчного пузыря тест-микроорганизм обнаружен не был.

Через 12 часов после заражения верхняя треть тонкой кишки была свободна от сальмонелл. 8 средней и нижней трети тонкого кишечника только часть посевов оказалась положительной. В содержимом желчного пузыря обнаружить сальмонелл не удалось.

Через 24 часа картина, в целом, не изменилась. Еще через сутки эксперимент был прекращен при хорошем состоянии животных.

Таким образом, при данной форме постановки эксперимента инфекционный процесс не получил развития, о чем косвенно свидетельствует отсутствие высевов из желчного пузыря, т.е. возбудитель не смог покинуть просвет кишечника и проникнуть в кровь, печень, что мы наблюдали в контрольной группе.

В группе экспериментов с последующим введением пектина наблюдалась несколько иная картина.

Через 6 часов после заражения и введения пектина практически во всех высевах из тонкого кишечника был обнаружен тест-микроб. Однако, через 12 и 24 часа после заражения результаты всех бактериологических проб были отрицательными, что свидетельствовало о прекращении инфекционного процесса, тогда как в контроле наблюдалось обычное развитие его.

. Резюмируя вышеприведенные материалы, можно сделать вывод, что применение пектина способствует освобождению кишечника от возбудителя и препятствует развитию генерализованного инфекционного процесса. Тем самым косвенно подтверждается концепция влияния пектина на ситуацию в просвете кишечника. Данную часть работы мы рассматриваем, как установочную для отдельного экспериментального исследования.

Таким образом, представленные материалы свидетельствуют,. что антимикробное действие пектина является сло;киым многофакторным процессом, обусловленным химической природой пектина, физиологией микроорганизмов и особенностями физиологических условий (и экологических) кишечника, в котором развертывается инфекционный процесс, вызванный возбудителями ОКИ.

•В настоящей работе мы акцентируем внимание на отдельных, существенных моментах этого процесса и подчеркиваем необходимость дальнейших углубленных исследований всего комплекса, антибактериального, антитоксического и аутидиарей-ного действия пектина.

ВЫВОДЫ

1. В результате экспериментального изучения свойств высо-коочищенного пектина установлено антибактериальное (бактерицидное) действие пектина на возбудителей острых инфекционных диарей и на другие микроорганизмы (патент Республики Узбекистан). Определены условия проявления антибактериального действия пектина.

2. Установлено, что в присутствии 5% водного раствора пек. тина представители рода Salmonella погибают в течение двухчасового контакта, а представители рода Shigella — с течение одночасового контакта при.+37°С.

3. Установлена высокая чувствительность холерного вибриона к пектину — гибель наступала е течение одночасового кон-такга .с 1% водным раствором пектина.

4. Нормальная микрофлора проявляет определенную устойчивость к воздействию пектина, что отражает ее эволюционно выработанную адаптацию к присутствию пектина в пище человека. Степень устойчивости варьирует: от относительной у эшерихий, до полной у.бифидобактерий.

?А

5. Показана более высокая устойчивость к пектину у грам-положительных микроорганизмов по сравнению с грамотрица-тельными.

6. Бактерицидное действие пектина обусловлено, прежде всего, его кислотным воздействием на бактериальную клетку.

7. Одним из вероятных механизмов антибактериального действия пектина является препятствие адгезии бактериальных клеток на кишечный эпителий благодаря комплементарное™ углеводных остатков на макромолекуле пектина лигандам бактериальных клеток.

8. Антибактериальное действие пектина не зависит от характера сырьевого материала, а обусловлено технологией получения и очистки его.

9. Разработан критерий антибактериальной активности пектина — бактерицидная емкость — для производственного определения пригодности его к использованию в лечебных целях — 1 мл 5% водного раствора пектина . должен инактивировап. 150-200 млрд микробных тел возбудителя в течение не боле-: трехчасового контакта.

10. На основании результатов экспериментальных исследований совместно с клиницистами разработан метод лечения острых кишечных инфекций раствором пектина (патент СССР).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Потиевский Э.Г., Садыкова А Н., Мухитдинов И.М. Опыт экспериментального и клинического исследования пектинов. //Актуальные вопросы кишечных инфекций. Тезисы докл. науч.-практ. конференции — Ташкент, 1990 — с. 119-120

2. Потиевский Э.Г., Ашубаева,3:Дж., Рахимов Д.А., Камало-ва С.А., Рахимова А.Х., Исмаилходжаева Г.Г. Бактерицидное действие пектинов на возбудителей острых кишечных инфекций. //Мед. журн. Узбекистана,. 1991 — №7 — с. 20-22

3. Потиевский Э.Г. К вопросу о механизме взаимодействия пектина и возбудителей острых кишечных инфекций. //Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций. Тез.докл. Всесоюзной конф. — Москва. 1991—ч. 3—с. 518-51Э

. 4. Шавахабов Ulli), Потиевский Э.Г., Рашидова P.A., Ссльс-кая Л.Л. Способ лечения острых кишечных диарейных инфекций. //Патент Na 1790412 Госкомизобретений при ГКНТ СССР 22.09.1992

5. Шавахабов Ш.Ш., Юсупов Ш.Р., Потиевский Э.Г. Приме-• нение пектина при лечении ОКИ. //Съезд врачей-инфекционистов в

г. Суздале. — Москва-Киров, 1992—Т.1. — с. 348-351

6. Шавахабов Ш.Ш., ' Потиевский Э.Г., Бондаренко В.М., Юсупов Ш.Р. Пектинотерапия — интенсификация лечения инфекционных диарей. //Интенс. терапия инфекц. больных. Тез.докл. научн. конф. BMA им. С.М.Кирова. — Санкт-Петербург, 1993-С.108-109

7. Потиевский Э.Г., Шавахабов Ш.Ш., Бондаренко В.М. Антимикробное действие пектина и перспективы его дальнейшего использования для терапии острых кишечных инфекций. //Актуальные проблемы инфекц. nafon. Часть 1. Кишечные и респираторные инфекции — Санкт-Петербург, 1993 — с. 62

8. Потиевский Э.Г., Шавахабов Ш.Ш., Бондаренко В.М., Ашубаева З.Дж. Экспериментальное и клиническое изучение влияния пектина на возбудителей острых кишечных инфекций! //Ж. микробиол. — 1994 — приложение август-сентябрь — с. 106-109

9. Потиевский ЭТ., Шавф<абов Ш.Ш. Лекарственный препарат для лечения кишечных инфекционных заболеваний. //Предварительный патент Республики Узбекистан № 641 от 11.02.1994 г

10. Потиевский Э.Г., Булатова Г.М., Ахмадулина C.B., Панова Л.Ф. Влияние пектина на жизнеспособность нормальной микрофлоры кишечника //Акг. вопр. инф. патол. Сб. трудов — Ташкент, • 1994 —с.126-128

11. Потиевский Э.Г., Пекгининг микробга карши таъсирини экспериментал урганиш. //Узбекистан эпидемиол., микроб., пара-зитол. ва инфекционист. VI Съезди маърузаларининг кисакча басни — Тошкент, 1994 — с. 134

12. Рашидова С.Ш., Семенова Л.Н., Кабулова Б.Дж., Васильева С.А., Норкулова К.Т., Шавахабов Ш.Ш., Потиевский Э.Г., Фахрутдинов 3. Способ получения пектина. //Предварительный патент Республики Узбекистан Na от 20.03.1995 г

13. Потиевский Э.Г., Бактерицидное действие пектина на сальмонелл. //Пищевые зоонозы. Меяадунар. симпозиум. —

. Москва, 1955 — c.6j-64

14. Потиевский Э.Г., Зайцева Т.е., Шавахабоа Ш.Ш., Хаки-мов М.М. Влияние пектина на жизнеспособность У)Ьпо С1ю1сгае. //Ж. микробиол. — 1995—№ 6 —с. 22-23

15. Потиевский Э.Г., О возможных механизмах антимикробного действия пектина при острых инфекционных диареях. //Антибиотики и химиотерапия. — 1996—N9 7/8 —с. 40-42