Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России

Кочнева, Галина Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России"

На правах рукописи

Кочнева Галина Вадимовна

Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах

России

03.01.03 - молекулярная биология 03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 1 НОЯ 2010

Кольцово-2010

004612015

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научные консультанты

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, Сергей Викторович Нетесов

доктор биологических наук, профессор Валерий Борисович Локтев

Официальные доктор медицинских наук, профессор

оппоненты: Евстропов Александр Николаевич

доктор биологических наук Мордвинов Вячеслав Алексеевич

доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна

Ведущая организация

Учреждение российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН имени М.П. Чумакова

Защита состоится « 24 » декабря 2010 г. в / > ~~ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан « "Л'г/Л 2оюг.

Ученый

секретарь диссертационного совета ^^^^^^д.б.н. Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучению вопросов молекулярной эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов в России долгое время уделялось мало внимания. Не было единого подхода в проведении эпидемиологических исследований, большинство результатов основывалось на данных официальной статистики, полученных без использования принятых в развитых странах и рекомендованных ВОЗ методов, таких как: подтверждающие серологические тесты и ПЦР анализ - в диагностике; филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей - в генотипировании образцов; использование программ Epilnfo и SPSS - для статистически значимой оценки факторов риска инфицирования вирусами гепатитов. Проведённые к 2001 году работы по молекулярной эпидемиологии гепатитов В, С и G были единичными в России и охватывали в основном население европейской части страны, тогда как популяции регионов, расположенных за Уралом, были изучены совершенно недостаточно. Крупномасштабных исследований по генотипированию HBV и HGV до публикации результатов наших, работ в 2003 году в Российской Федерации не проводилось. В связи с вышесказанным в 2001г нами был начат цикл комплексных молекулярно-эпидемиологических исследований парентеральных вирусных гепатитов В, С и G на территории трех сибирских регионов России - Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края.

Знание особенностей молекулярной эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов на определенной территории имеет важное социальное значение и способствует разработке продуманной стратегии борьбы с этими инфекциями. Особое место в этой борьбе занимает вакцинопрофилажтика. Среди исследованных нами трех парентеральных вирусных гепатитов В, С и G вакцина разработана только в случае HBV инфекции.

Для вакцинации против гепатита В в настоящее время повсеместно используется рекомбинантный поверхностный белок HBV (HBsAg), выделенный из культуры клеток дрожжей. Эффективность вакцинации определяется путем измерения концентрации анти-HBs IgG в сыворотке крови (протективный уровень >10 МЕ/л). Однако в течение 5-7 лет после полного курса прививок от 30 до 50 % лиц утрачивают антитела, что ставит вопрос о необходимости ревакцинации [Акимкин, 2004; Yuen et al., 2004J. Вместе с тем установлено, что вакцинация ведет к индукции

эффективной и продолжительной иммунологической памяти, которая обеспечивает защиту от инфекции и после утраты антител [Селиашвили и др., 2006; Yuen et al., 2004], но этот критерий защищенности практически не исследован у вакцинированных против гепатита В. Методом его оценки может стать определение индекса HBsAg-специфической стимуляции лимфоцитов периферической крови в ELISPOT анализе.

Создание вакцины против гепатита С - одна из самых насущных задач мирового здравоохранения. Ее решение сдерживается рядом факторов, в числе которых высокий уровень изменчивости вируса. Наибольшая вариабельность наблюдается в поверхностных белках Е1 и Е2 HCV [Simmonds et al., 2005], однако антитела именно к этим белкам обладают вируснейтрапизующей активностью [Yu et al., 2004]. В настоящее время идет накопление данных о том, какие районы поверхностных белков вируса гепатита С индуцируют синтез антител с широким спектром действия, способных нейтрализовать различные генотипы и субтипы вируса. Пептиды, имитирующие структуру таких районов, рассматриваются в качестве перспективных компонентов анти - HCV вакцин.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось проведение комплексного молекулярно-эпидемиологического исследования парентеральных вирусных гепатитов на территории сибирских регионов России, а также оценка протективных свойств поверхностных белков вирусов гепатитов В и С.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1) Организация и проведение молекулярно-эпидемиологических исследований

гепатитов В, С и G в Новосибирской, Иркутской областях и Алтайском крае:

• постановка методов молекулярно-эпидемиологического анализа в соответствии с рекомендованными ВОЗ и принятыми в развитых странах стандартами (http://www.who.int/chp/steps);

• анализ сывороток крови с обязательным использованием двух типов ИФА - скринингового и подтверждающего;

• генотипирование изолятов HBV, HCV и HGV с использованием наиболее репрезентативных районов вирусного генома;

• создание баз данных в формате Epilnfo, включающее перенос информации со всех бумажных и инструментальных носителей - результаты анкетирования, ИФА, ПЦР и генотипирования изолятов; данные выписки

из истории болезни в случае пациентов стационаров - в структурированный электронный формат;

• выявление статистически значимых факторов риска инфицирования HBV, HCV и HGV.

2) Оценка напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета методом ELISPOT через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В:

• формирование группы участников исследования из сотрудников ФГУН ПЩ ВБ «Вектор», вакцинированных против вирусного гепатита В как группы риска инфицирования;

• выявление показателей гуморального и клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса иммунизации вакциной Engerix;

• оценка применяемой схемы вакцинации и ревакцинации против гепатита В на основе полученных данных.

3) Сравнительный функциональный анализ антител, индуцированных нативными (у инфицированных людей) и рекомбинантными (у иммунизированных мышей) гликопротеинами ЕI и Е2 вируса гепатита С:

• пептидное сканирование антигенного профиля нативных поверхностных белков El и Е2 HCV и выявление межгенотиповых различий;

• получение рекомбинантных белков El и Е2 HCV в клетках млекопитающих с помощью двух экспрессирующих систем - вирусов Синдбис и осповакцины, сравнение их иммунохимических свойств и антигенного профиля;

• картирование вируснейтрализующих линейных эпитопов рекомбинантных белков El и Е2 HCV и оценка их перекрестной активности.

Научная новизна. В данной работе в соответствии с международными стандартами впервые проведено крупномасштабное молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов В, С и G на территории Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края.

Созданы три уникальные электронные базы данных в формате Epilnfo, содержащие эпиданамнез и результаты иммуно- и генодиагностики гепатитов В, С и G среди 5605 представителей разных групп населения Сибирского региона России. В исследование были вовлечены пациенты инфекционных больниц и наркологической

клиники; медицинские работники ряда крупных городских и сельских больниц; группы, сформированные по принципу места проживания или места работы.

Впервые получены данные по встречаемости маркеров HBV, HCV и HGV среди представителей разных групп населения трех регионов Сибири. Оценена роль HBV и HCV в ■ этиологии острых и хронических гепатитов на обследованной территории.

С использованием созданных электронных баз данных и статистических мощностей программы EpiInfo-2007 впервые проведена количественная оценка факторов риска инфицирования гепатитами В, С и G в период с 2001 по 2003 гг. Силу статистической связи между каждым фактором риска и статусом по инфекции выражали с помощью отношения шансов (OR, odds ratio).

Впервые проведен анализ генотипического разнообразия сибирских изолятов HBV и HGV, а в случае HCV показано, что встречаемость генотипов существенно различается в разных возрастных и популяционных группах.

Получены новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинаций против вирусного гепатита В. Показано, что клеточное звено вносит существенный вклад в развитие поствакцинального иммунного ответа.

С использованием панели из 76-ти перекрывающихся синтетических пептидов впервые проведен сравнительный полноразмерный анализ антигенного профиля поверхностных белков сибирских изолятов вируса гепатита С трех генотипов lb, 2а/2с и За. Показано, что общие для всех генотипов HCV высокоиммуногенные пептидные эпитопы белков Е1 и Е2 расположены в позициях аминокислот 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400, 430-440 и 680-690 (Е2 белок). Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. В районе 280-290 а.о. белка Е1 выявлена новая антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с генотипа HCV.

С использованием высоковирулентного клона HCV J6/JFH1 и культуры клеток гепатомы человека Huh-7.5 выявлены два новых вируснейтрализующих эпитопа в позициях а.о. 264-318 (Е1 белок) и 496-515 (Е2 белок), первый из которых является генотип-специфическим, а второй - консервативным.

адекватных природным аналогам. Впервые показано, что в одних и тех же клетках млекопитающих (BHK-F) рекомбинантные белки El и Е2 HCV, полученные в системе экспрессии вируса осповакдины (VV), существенно отличаются от аналогичных белков, полученных в системе вируса Синдбис (SIN). Хотя оба препарата белков индуцируют синтез антител к поверхностным гликопротеинам HCV, иммунный ответ к VV-экспрессированным белкам был выше и обладал большей универсальностью в отношении разных генотипов HCV, чем иммунный ответ к SIN-экспрессированным белкам.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенного крупномасштабного молекулярно-эпидемиологического исследования получены статистически значимые количественные оценки дифференцированной встречаемости маркёров парентеральных вирусных гепатитов в различных популяционных группах, заболеваемости острыми и хроническими формами гепатитов, факторов риска и параметров интенсивности циркуляции генотипов HBV, HCV и HGV в период 2001-2003 гг на территории Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края. Результаты исследований были доведены до сведения региональных медицинских служб и главных врачей крупных инфекционных больниц и использовались ими для разработки стратегии борьбы с распространением вирусных гепатитов в регионах Сибири.

В связи с тем, что общим и наиболее значимым фактором риска парентеральных гепатитов В, С и G, а также смешанных инфекций В+С и C+G в Сибири является внутривенное употребление наркотиков, оценки путей заражения и распространения разных типов психотропных препаратов оказались полезны при проведении адресных превентивных программ в сфере контроля за оборотом наркотиков.

Созданные электронные базы данных представляют отдельную как научную, так и практическую ценность. Они могут использоваться для комплексной динамической оценки ситуации по вирусным гепатитам в исследованных регионах России в любом временном периоде.

Показана важность проведения ПЦР-анализа для диагностики наиболее распространенных вирусных гепатитов в случаях наличия клинических проявлений гепатита и отрицательных результатах ИФА на известные вирусные маркеры.

Полученные новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В

позволили предложить ряд рекомендаций по проведению ревакцинации в гетерогенных по возрасту, состоянию здоровья, привычкам и степени опасности группах риска инфицирования НВУ.

Проведенный сравнительный функциональный анализ рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 НСУ показал, что иммунохимические свойства этих белков могут существенно зависеть от системы экспрессии. Причем эффективность продукции, на которую, обычно, исследователи обращают внимание в первую очередь, может быть одинаковой, а свойства белков разные. Данный факт необходимо учитывать при планировании экспериментальных работ с аналогичными мембран-связанными гликозилированными белками.

Картирование позиций высокоиммуногенных линейных эпитопов поверхностных белков Е1 и Е2 сибирских изолятов НСУ может бьггь использовано для совершенствования региональной диагностики гепатита С.

Пептиды, соответствующие новым вируснейтрализующим линейным эпитопам, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов анти-НСУ вакцин.

Положения, выносимые на защиту:

1. Внутривенное употребление наркотиков является основной причиной заболеваемости парентеральным вирусным гепатитом С (011=27.3) и смешанной инфекцией НСУ и НВУ (011=10.0) на территории сибирских регионов России в период 2001-2002 гг. Вторым по значимости фактором риска являются инвазивные медицинские процедуры, наибольшую опасность из которых представляет переливание крови (011=3.8-11.3). Половой путь передачи НВУ, НОУ и, что особенно важно, НСУ является статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах (011=1.66-2.88).

2. При наличии клинических проявлений гепатита и отрицательных результатах ИФА на известные вирусные маркеры необходимо проведение ПЦР-анализа для выявления геномов наиболее распространенных вирусных гепатитов. Такой подход позволяет дополнительно диагностировать 32.7% случаев острого гепатита и 78.9% случаев хронического гепатита в группах «безмаркерных» пациентов.

3. С увеличением возраста респондентов, инфицированных НСУ, растет доля генотипа 1 и снижается доля генотипа 3. Этот сдвиг обусловлен миграцией генотипа 3 НСУ из районов производства наркотиков. Около 90% лиц, употребляющих наркотики, попадает в возрастную группу до 35 лет.

4. Генотипирование изолятов HCV (п=818) по двум противоположным районам генома 5'-UTR и NS5B выявило четыре рекомбинантных изолята с генотипами 2k/lb (2) и 2а-2с/1Ь (2), что ранее являлось крайне редким явлением вследствие генотипирования только по одному району генома - 5'-UTR.

5. Через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В в группе, где концентрация защитных антител была ниже протективного уровня (<10МЕ\л), положительный индекс HBsAg стимуляции лимфоцитов определялся в 72.2% случаев, что достоверно выше (р < 0.05), чем в группе с протективным уровнем апти-HBs IgG (48.1%). Это свидетельствует о важности оценки клеточной составляющей иммунитета при разработке стратегии вакцинации и ревакцинации.

6. Полноразмерное пептидное сканирование антигенного профиля поверхностных белков Е1 и Е2 выявило существенные различия, характерные для сибирских изолятов lb, 2а/2с и За генотипов HCV. Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. Этот факт необходимо учитывать при разработке вакцин против гепатита С.

7. Иммуногенные свойства рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV существенно зависят от эукариотической системы экспрессии, в которой эти белки продуцируются. Рекомбинантные белки, полученные в системе экспрессии вируса осповакцины, обладают большей иммуноадекватностыо природным белкам, чем гликопротеины, полученные в системе экспрессии вируса Синдбис.

8. Пептиды, соответствующие новым вируснейтрализующим линейным эпитопам в позициях а.о. 264-318 рекомбинантного белка Е1 и а.о. 496-515 рекомбинантного белка Е2 HCV, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов вакцин против гепатита С.

Апробация результатов диссертации и публикации. Работа представлялась в докладах и постерах на 8 международных и 9 российских конференциях, конгрессах и симпозиумах: на IV конференции по вирусным гепатитам В, С и Д (Москва, 2001); 2-й научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); Xllth International Congress of Virology (Paris, France, 2002); V Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2003); 6-м ежегодном съезде Европейского Общества Клинической Вирусологии и 8-ой Конференции по Современной ситуации в области хронических вирусных гепатитов (Лион, Франция, 2003); Международном

междисциплинарном конгрессе «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Судак, Крым, Украина, 2004); Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Сосновка, Новосибирская обл., 2004); на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва,

2004); на 1-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004); на Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Сосновка, Новосибирская обл.,

2005); на Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005); III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» (Алматы, Казахстан, 2006); Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, Белоруссия, 2007); Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); XIV International Congress of Virology (Istanbul, Turkey, 2008); 16th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses (Nice, France, 2009); American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) annual meeting (Boston, USA, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 45 работ, включая 26 тезисов в сборниках конференций и 19 статей, из которых 15 опубликованы в журналах списка, рекомендованного ВАК, 2 статьи опубликованы в международных журналах Antiviral Therapy и Journal of Medical Virology.

Работа выполнена в 1998-2010 гг. в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в рамках научных тем организации, по гранту Американского Фонда Гражданских Исследований и Развития (CRDF) №RB0-893 «Совместный эпидемиологический проект по изучению вирусного гепатита С», по грантам Международного научно-технического центра (МНТЦ) № 1637р «Изучение частоты встречаемости, распределения генотипов и молекулярной вариабельности изолятов вируса гепатита С в сибирских регионах России» и № 3255р «Исследование иммунологических и структурных свойств рекомбинантных белков El и Е2 ВГС экспрессированных в клетках млекопитающих».

Результаты, представленные в диссертации, получены лично автором, под ее руководством и в соавторстве с к.х.н. Г.Ф. Сиволобовой (раздел 3.1-3.2 и 5.2), к.б.н.

A.A. Гражданцевой (раздел 3.1-3.2; 4.2 и 5.3-S.4), к.б.н. A.B. Качко (раздел 3.3.4; 3.5.3; 5.5), к.ф.-м.н. А.Н. Шваловым (раздел 3.5 и 5.1), Т.А. Лупан (раздел 5.2.1), к.б.н. A.B. Шустовым (раздел 3.3.2), к.м.н. И.В. Плясуновой (раздел 3.3.2-3.3.3), к.б.н. Р.Б. Баяндиным (раздел 3.3.1), Е.В. Чуб (раздел 3.3.2), A.B. Ивановой (раздел 5.2.2), к.б.н.

B.А. Терновым (раздел 3.2.5), А.Е. Нестеровым (раздел 4.3-4.4), к.б.н. О.В. Носаревой (раздел 4.3-4.4), JI.A. Акинфеевой (раздел 3.2). Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за сотрудничество.

Автор искренне признателен врачам, оказавшим помощь в выполнении данной работы: к.м.н. В.М. Гранитову, Н.Г. Клиновенко, к.м.н. О.И. Матрос, к.м.н. И.А. Хорошиловой (г. Барнаул); Л.И. Губановой, А.П. Четверикову, Ю.А. Данилову, В.В. Леоненко (г. Иркутск); В.Г. Орловскому, М.В. Алешиной, В.И. Кузубову, Л.И. Локтевой, Р.П. Алейникову (р.п. Кольцово); Е.Г. Сахаровой, Н.Я. Черноусовой, И.В. Красильниковой, Д.И. Козлову, Т.Г. Бурмистровой, Т.Г. Томиленко, Я.С. Ульяновой, Е.А. Фихман, О.В. Мельниковой, Т.А. Масленниковой, А.Г. Лебедеву (г. Новосибирск).

За сотрудничество в работе автор признателен и благодарен своим американским коллегам Dr. Stephen M. Feinstone (зав. лабораторией вирусов гепатитов, FDA, USA) и Dr. Marian Е. Major (ведущий специалист лаборатории вирусов гепатитов, FDA, USA).

Автор искренне благодарит своих консультантов д,б,н., профессора, члена-корреспондента РАН C.B. Нетесова и д.б.н., профессора В.Б. Локтева за научное руководство и помощь в организации работ, представленных в диссертации.

Структура и объем работы. Диссертация построена по монографическому типу и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 347 страницах, включая 43 рисунка, 31 таблицу, 449 библиографических ссылок. Нумерация рисунков и таблиц приводится отдельно для каждой главы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных

вирусных гепатитов в сибирских регионах России

1.1. Организация молекулярно-эпидемиологических исследований в

Новосибирской, Иркутской областях и Алтайском крае

Эпидемиологическая часть работы выполнена по схеме "поперечного" (cross-sectional) исследования, от обследуемых лиц получали не только образец сыворотки крови, но также собирали эпиданамнез. Для этого, каждому участнику предлагали ответить на вопросы заранее разработанной анкеты в условиях индивидуального анонимного интервью.

Было использовано три варианта анкет, набор вопросов в которых варьировал для разных групп участников и разрабатывался с учетом международного опыта по проведению аналогичных исследований. Все работы были одобрены Этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Интервьюирование и взятие крови осуществляли только после подписания респондентом Информированного согласия.

Одноразовые вакуумные системы забора крови «Вакутайнер» были впервые нами использованы для проведения крупномасштабного эпидемиологического исследования на территории Сибири. Мы использовали вакутайнеры с гелевой пробкой, которая формирует разделительный барьер между сывороткой и клетками крови во время центрифугирования. Этот барьер обеспечивал качество образцов сывороток при хранении и транспортировке из больниц в лабораторию ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» для проведения последующих анализов.

В целом нами было проведено два крупных молекулярно-эпидемиологических исследования, в результате которых были созданы три электронные базы данных. Каждая база данных включает более 400 полей, по которым в дальнейшем проводили статистическую обработку. Каждое поле представляет вопрос Анкеты, пункт Истории болезни, результат ИФА отдельно по всем тестированным маркерам вирусных гепатитов, ПЦР анализа или генотип вирусного изолята.

Первая электронная база данных (база данных №1 далее) содержит информацию о 2000 участниках исследования, представляющих четыре группы населения Новосибирской области:

1) пациенты Муниципального городского наркологического диспансера г. Новосибирска (МГНД), которые являются группой риска в отношении

парентеральных вирусных гепатитов вследствие социального поведения и повышенных гемоконтактов;

2) пациенты Новосибирского областного Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (цСПИД), р.п. Кольцово, эта группа была использована для оценки частоты встречаемости гепатитов В и С среди стационарных пациентов инфекционных больниц широкого профиля;

3) посетители поликлиники Новосибирской районной больницы №1 (НРБ-1), р.п. Кольцово использовались как группа сравнения в связи с тем, что такая выборка представляет общую популяцию лучше, чем доноры крови, поскольку большая часть последних уже прошла предварительный отбор по наличию HBsAg и антител к HCV;

4) медицинские работники МГНД, НРБ-1, цСПИД, больницы скорой медицинской помощи №2 (БСМП-2) г. Новосибирска, эта группа также является группой риска в отношении парентеральных вирусных гепатитов вследствие своей профессиональной активности.

Исследование проводили в 2001-2002 гг. При формировании всех четырех групп не делали никакого отбора по возрасту, полу или диагнозу, а включали в обследование всех лиц, подписавших Информированное согласие, до достижения объёма выборки п=500.

Вторая электронная база данных (база данных №2 далее) была окончательно сформирована в 2004 году. Она включает информацию о 3441-м пациенте инфекционных больниц 3-х сибирских регионов России - Новосибирской обл. (п=1509), Иркутской обл. (п=888) и Алтайского края (п=1044). В обследовании участвовали пациенты, поступившие в больницы в период с 1 сентября 2001 по 31 декабря 2002 года с симптомами острого гепатита и не имеющие в анамнезе указаний на перенесенные гепатиты.

Третья электронная база данных (база данных №3 далее) была существенно меньше двух предыдущих и содержала информацию о 164-х пациентах Государственной областной клинической больницы г. Новосибирска (ГОКБ) с диагнозом «хронический гепатит». Она была выполнена ' в рамках второго молекулярно-эпидемиологического исследования вместе с анализом острых гепатитов и полностью сформирована в 2004 году.

Общий объем выборки, доступной для эпидемиологического анализа на электронном носителе, составляет 5605 жителей сибирских регионов России. Все

базы данных выполнены в рекомендованном ВОЗ международном формате ЕрПпйэ [http://www.who.int/chp/steps/resources/EpiInfo/en/index.html] на английском языке.

1.2. Общая характеристика обследованной выборки на основе всех баз данных

Обследованная нами популяция жителей Сибири содержит примерно равное количество мужчин (п=2860) и женщин (п=2745), и это соотношение соблюдается для всех регионов (Рис. 1.1)/Более 50% участников исследования входят в возрастную группу до 35 лет. Эта группа представляет наибольший интерес с точки зрения оценки инфекции парентеральными вирусными гепатитами, поскольку обладает высокой репродуктивной и социальной активностью и особенно ценна с точки зрения прогнозирования здоровья регионов.

Ьб 1=_1

1а 3

! II ш

ст? ¿г 4?

а Мужчины □ Женщины!

Новосибирск

Щщ

-го,.—Ш

О^ 'Г

^ ¥ *> й> <¥ <$> /

[□ Мужчины ¡3 Женщины)

1 4

?Ът Ьгттагт^-

+ А Л А & р Л

| О Мужчины а Женщины |

Иркутск

шМЬм

а ф а

ф ❖ 4 4>

[□Мужчины о Женщины]

Рис. 1.1. Поло-возрастная структура обследованной выборки.

Наше исследование с исчерпывающей ясностью показывает, что внутривенное употребление наркотиков являлось основной причиной заболеваемости парентеральным вирусным гепатитом С и смешанной инфекцией НСУ и НВУ на территории сибирских регионов России в период 2001-2002 гг. (Табл. 1.1). Среди потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) процент инфицированности НСУ и микста НСУ+НВУ составляет 83% и 28.9% соответственно, в то время как во всей

остальной популяции - 15.2% и 3.9%. Риск инфицирования НСУ и микстом НСУ+НВУ у ПИН в 27.3 и 10 раз выше, чем у лиц, не употребляющих наркотики. Статистически достоверным фактором риска для ПИН также является инфекция НВУ (011=1.74).

Таблица 1.1.

Риск инфицирования гепатитами В и С среди потребителей инъекционных наркотиков.

Фактор риска N1 | %(+)2 | OR3 N | %(+) | OR N | %(+) | OR

Гепатит С (анти-HCV IgG) Микст В+С (анти-HCV IgG + HBsAg) Гепатит В (HBsAg)

Всего 5605 25.5 5605 7.6 5605 28.5

Внутривенное употребление наркотиков

Да 835 83.0 2730 835 28.9 10.0 835 38.7 1.7 4

Нет 4737 15.2 0.037 4737 3.9 0.10 4737 26.6 0.58

1 Обшее число обследованных респондентов по 3-м базам.

2 Процент проб, позитивных в ИФА на НВзА§ и/или анти-НСУ ^О.

3 Отношение шансов ((Ж). Количественные значения (Ж рассчитаны на 5% уровне значимости.

Около 90% лиц, употребляющих наркотики, попадает в возрастную группу до 35 лет, и доля мужчин существенно выше, чем женщин. Среди наркотических препаратов внутривенного употребления наибольшее распространение имеет так называемая «ханка» (80.57%) (Рис. 1.2), которая представляет собой кустарно приготовленный грубый экстракт опия-сырца. Вторым по значимости является героин (45.85%). Из интраяазальных наркотиков респондентами были указаны крэк (20.74%) (курение) и, в существенно меньшей степени, кокаин (1.75%) (вдыхание). Амфетамины и метадон имеют незначительное распространение, 1.31% и 0.87% соответственно.

90% -|---------

80%---- -

70%--

60% --

60% * ' --------

40% ■ • . I -

30% J- " - -

20% - ■' -----

10%--Й - -----

о%-Ц-14—...... ■ I-1,'...........' ...I.

'Ханка" Героин КрЭк Кокаин Амфетамины Метадон

Рнс. 1.2. Процент употребления различных наркотических препаратов.

lJ. Встречаемость серологических маркеров гепатитов В и С в различных группах населения регионов Сибири

Исследование серологических маркёров инфекции HBV и HCV выполнено с использованием коммерческих тест-систем, активно используемых в сибирских регионах для диагностирования данных инфекций: ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) и НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород). В некоторых спорных случаях для диагностики дополнительно использовали наборы фирмы MONOLISA (Франция) и Ortho Clinical Diagnostics (США). В случае гепатита С анализировали IgG к белкам core, NS3, NS4 и NS5; в случае гепатита В - HBsAg, HBeAg, анти -НВс IgM и IgG, анти-НВе IgG, анти-HBs IgG; в случае гепатита А -общие анти-HAV IgM и IgG и в случае гепатита Е - общие анти-HEV IgM и IgG.

Для повышения достоверности результатов ИФА нами использовались как скрининговые, так и подтверждающие тест-системы в случае определения HBsAg и анти-HCV IgG.

Частота встречаемости серологических маркёров HCV и HBV в группе посетителей поликлиники оказалась достаточно велика: анти-HCV IgG -5.6%; HBsAg - 3.6%, анти-НВс IgG - 24.0%, что свидетельствует о неблагополучной ситуации по гепатитам В и С в р.п. Кольцово и отражает рост заболеваемости этими инфекциями в период 2001-2002 гг. в России в целом [ЗНиСО, №1,2003].

У обследованного медицинского персонала больниц Новосибирской области HBsAg встречался с частотой 5.4%, а средняя частота выявления анти-HCV IgG составила 5.2% (Табл. 1.2), 27% медработников были вакцинированы против HBV.

Таблица 1.2.

Встречаемость серологических маркеров НВУ, НСУ и количество вакцинированных

против НВУ в группе «медицинские работники».

Маркер вирусов гепатита БСМП-2 (п=218) п(%) НРБ-1 (п=145) п(%) МГНД (п=93) п(%) цСПИД (п=44) п(%) Всего (п=500) п(%)

HBsAg 10(4.6) 7(4.8) 2 (2.2) 8 (18.2) 27 (5.4)

анти-НВс IgG 48 (22.0) 33 (22.8) 22 (23.7) 9(20.5) 112 (22.4)

анти-HBs IgG 66 (30.3) 62 (42.8) 23 (24.7) 11 (25.0) 162 (32.4)

Вакцинированы против HBV 49(22.4) 65 (44.8) 12 (12.9) 9 (20.5) 135 (27)

анти-HCV IgG 16(7.4) 6(4.1) 0 4(9.5) 26 (5.2)

Среди медработников-женщин HBsAg выявлен, в основном, у медсестер и сотрудников диагностических лабораторий. Среди медработников-мужчин HBsAg был найден у хирургов, анестезиологов, медбратьев. Самая высокая частота

встречаемости анти-НСУ \%0 (7.3%) выявлена нами у персонала больницы скорой помощи (БСМП-2), что связано со спецификой работы таких медучреждений: оказание экстренной помощи, работа в экстремальных ситуациях или в ночное время.

Из числа обследованных пациентов цСПИД 35.8% оказались позитивными в ИФА на анти-НСУ Частота встречаемости HBsAg составила 35.0%, анти-НВс ^М и/или выявлялись с частотой 50.7%, а анти-НВэ ^М и/или ^О обнаружены у 20.8% пациентов.

Среди образцов крови, полученных от пациентов МГНД, анти-НСУ были найдены в 48.0% образцов. Частота выявления HBsAg среди всех пациентов МГНД составила 8.4%, антитела к HBcAg встречались у 49.9% пациентов (244/500), а анти-НВэ IgM и/или обнаружены в 32.6% случаев.

Доля вирусных гепатитов А, В, С и Е в структуре заболеваемости острыми гепатитами в сибирских регионах России составляет 85.4% (Рис. 1.3), при этом наибольший вклад вносят НАУ (40.7%) и НВУ (37.8%).

Иркутск Новосибирск Барнаул Всего

Рис. 1.3. Этиология острых вирусных гепатитов в сибирских регионах.

Высока частота встречаемости смешанных инфекций (16.6% в суммарной популяции), среди которых 48.8% составляет микст-инфекция НВУ+НСУ. В последнем случае среди больных преобладали лица моложе 30 лет и употребляющие наркотики внутривенно. В Иркутске процент инфицирования ПИН вирусом гепатита С был наиболее высок (45%). Это коррелирует с вспышкой ВИЧ инфекции среди ПИН г. Иркутска в этот же период, когда в город была завезена большая партия инфицированного героина. Препараты наркотиков на наличие НСУ специально не

проверялись, однако общий путь передачи этих вирусов определяет высокую вероятность ко-инфекции при инъекционных процедурах.

Случаи гепатита Е среди пациентов с острым гепатитом в Сибири достаточно редки. Нами было выявлено только 3 случая HEV инфекции в Новосибирске, 2 из которых подтверждены ПЦР-анализом.

Отрицательны в ИФА на маркеры гепатитов А-Е оказались 14.6% больных (выявлены болезни желчевыводящих путей, ОРЗ и др.), 30% из них были выписаны с формулировкой «гепатит невыясненной этиологии». Анализ показал, что доля пациентов данной группы растет с увеличением возраста. Так, среди пациентов моложе 25 лет только 8.8% больных с признаками острого гепатита не имели серологических маркеров А-Е гепатитов. В возрастной группе старше 60 лет доля таких гепатитов составляет 51.4% (Рис. 1.4). ПЦР анализ данных образцов выявил наличие геномов вирусов гепатитов А, В или С в 32.7% случаев.

Я Не А-С

а Гепатиты А+В+С Н Гепатиты В+С В Гепатиты А+С И Гепатиты А+В 13 Гепатит С В Гепатит В □ Гепатит А

Рис. 1.4. Структура острых вирусных гепатитов в разных возрастных группах. На оси ординат указан объем выборки (п), на оси абсцисс - возрастные группы.

В группе больных хроническим гепатитом хотя бы один из маркеров гепатита В имели 25.6% респондентов, маркеры гепатита С - 69.5%, смешанная инфекция гепатитов В и С регистрировалась в 6.7% случаев и у 11.6% пациентов не было найдено серологических маркёров ни НСУ, ни НВУ инфекций. Проведение ПЦР для этой группы лиц позволило определить этиологию гепатита в 78.9% случаев. Эти

данные подтверждают важность проведения ПЦР для диагностики острого и хронического гепатита в случае наличия клинических симптомов и отсутствия серологических маркеров известных вирусов гепатитов.

1.4. Генотипическое разнообразие сибирских изолятов НВУ, НСУ и НСУ

Молекулярно-биологическая часть работы предусматривала проведение ПЦР-амплификадии фрагментов областей рге32-3 (303 п.о.) для выявления ДНК НВУ; 5'-ЦШ (260 п.о.) и Ж5В (360 п.о.) - для выявления РНК НСУ; №5В (402 п.о.) для детекции генома НвУ и определение их первичных структур посредством прямого секвенирования амплификатов. Секвенированные последовательности депонированы в электронную базу ОепВапк. Генотипирование образцов вьгаолнено с помощью филогенетического анализа полученных нами данных секвенирования и последовательностей гомологичных районов прототипных изолятов соответствующих вирусов из международных баз данных.

Для оценки генотипического разнообразия изолятов НВУ на территории сибирских регионов России нами были использованы 246 секвенированных фрагментов вирусной ДНК. Результаты филогенетического анализа (Рис. 1.5) показали, что последовательности полученных нами изолятов относятся к трем генотипам: 4 последовательности относятся к генотипу А (1.6%), 2 последовательности к генотипу С (0.8%), 240 последовательностей к генотипу Б (97.6%).

Ц~Р г

^AB263412D Mongolia X02496D Latvia KGV1S2 Nov(Bar)(63) AMV127 Nov AB126581D Moscow -»»0194 Bar

— GAA146 Nov(6) RIG297 Nov KNG39 Bart 4} RIG486 Nov

[t— KGV80NOV

— BTG59 Now Lr KGV450 Nov(4)

L KGV440 Nov r KGV303 Nov p KGV205 Nov KGV34 Nov —J- OOB3 Nov(5) I AMV36 Nov ]j— KGV304 Nov RfG128 Nov OOB54 Nov I—MOI34 Bar "If- KNG47 Bar

H1A33 Bai(NovK1Z) RIG28Q Nov(4)

-KGV353 Nov

-SGP146 Nov

-GAA338 Nov

-BTG71 Nov

r KGV210 Nov(2) H-RIG31SNOV RIG76 Nov R1G384 Nov LU~ MOI38 Bar KNG54 Bar J- AMV4J Nov RIG26 Nov

— KGV264 Nov

— AMV49 Nov b-AMV14Nov(BarX82)

AMV108 Nov(BarK3) J-MOI64Bar(Nov)(11) t-r-MOHWBar LJ KNG106 Bar n KNG34 Bar lr X65257D Italy L-J02203D France

_r BTG32 Nov(2)

RIG505 Nov X72702D Germany MOI98 Bar M32138D Turkey AMV29 Nov AMV220 Nov SGF41 Nov GAA221 Nov KGV319 Nov L27106D Israel RIG401 Nov SGF138 Nov(2)

I-R1G242 Nov

d I-KNGS7 Bar

d f-KIGI Nov

X70185A Germany

1 IAB126580A Moscow

H RIG67 Nov

G L13994A Latvia ja- AB064311G USA AF405706G Germany X75657E W.Africa

11-RIGS Nov C SGF11S Nov

__J— D0Q63QC Japan B»—X14193C Korea

__J— D00329B Japan

c™— M54923B Indonesia

_M~ X69798F Brasll

u X75658F France

AV090457H Nlcoragua

" AY090460H USA

ejus вДЭО ОЛИ «.020 0 015 8 010 0Л«9 MM

Рис. 1.5. Филогенетическое дерево, построенное с помощью программы Mega v.2.1 методом UPGMA на основе нуклеотидных последовательностей preS2/S области генома HBV (303 п.о.). Изоляты, полученные нами, помечены шифром Nov и Ваг. Цифры в скобках указывает количество идентичных последовательностей.

Прототипные последовательности из GenBank приведены с добавлением заглавной латинской буквы, обозначающей генотип, а также указанием страны происхождения. Большие латинские буквы в узлах дерева показывают принадлежность последовательностей к соответствующему генотипу. Внизу приведен масштаб шкалы генетических расстояний.

Изучение распределения генотипов НВУ не выявило никаких особенностей среди различных социальных, экономических, половых, возрастных групп, а также групп лиц, склонных к рискованному поведению и людей, вынужденных часто обращаться за медицинской помощью. Это обусловлено высокой долей генотипа В во всех выше перечисленных группах.

Изучение генотипического разнообразия изолятов НСУ (п=818) в Иркутской, Новосибирской областях и Алтайском крае среди всех обследованных групп показало, что преобладающим является субтип 1Ь (54.6%), следующий по частоте встречаемости - субтип За (36.9%), с меньшими частотами встречаются изоляты генотипа 2 (2а, 2с, 2к, 2а/2с). Выделено четыре межтиповых рекомбинантных изолята НСУ: два рекомбинантных изолята 2к/1Ь (Рис. 1.6) и два рекомбинантных изолята 2а-2с/1Ь, что ранее являлось крайне редким явлением вследствие генотипирования только по одному району генома - 5'-ЦТ11.

687 674 747

KNG327 KNG318

2KVAT96AB031663 2F HCJK139 2C ВЕВЕ1 2EHCJK109 2Е HCJK025

Q2A PJKCF 2

100 42AHC-J6

_01 2AD00944

Ч 2B MD2B-1 2BD10988

-11A D63822

6А Y12083 ЗА D17763 * 10AD63821 SA Y13184 4А V11604 1BD90208 1А М62321

5'UTR(260)

fcE

KNG31S KNG3Z7 1B HPCHUMR iBHcv-j 1АН77 1С HC-G9 2B HC-J8 2А HC-J6 2C ВЕВЕ1 3ANZL1 ЗВ HCV-TR

NS5b(360)

Рис. 1.6. Филогенетические деревья нуклеотидных последовательностей фрагментов генома рекомбинантных изолятов генотипа 2k/lb (KNG318 и KNG327) и прототияных изолятов, построенные с помощью программы Mega v.2.1 методом Neighbor-Joining. Справа указаны районы генома HCV и в скобках размеры амплифицированных фрагментов.

Распределение генотипов в сибирских регионах России является средним между европейской популяцией [Шахгильдян, 2003], Средней Азией [Khan et al., 2008; Kurbanov et al., 2003] и Северным Китаем [Zhang et al., 1995].

Генотипическое разнообразие изолятов HCV оказалось неодинаковым в разных возрастных группах. С увеличением возраста респондентов происходит постепенное снижение доли генотипа 3 (с 40% в группе 18-25 лет до 5% среди лиц старше 50 лет), увеличение доли генотипа 1 (с 52% в группе 18-25 лет до 90% среди лиц старше 50 лет) и сохранение доли генотипа 2 на примерно одном уровне 6-13% во всех возрастных группах (Рис. 1.7). Такой сдвиг генетической вариабельности HCV обусловлен основным фактором риска инфицирования - внутривенным употреблением наркотиков.

Возраст

Рис. 1.7. Доля (%) изолятов HCV генотипов 1,2 и 3 в возрастных группах с 5-ти летними

интервалами.

Повышенная частота генотипа 3 среди ПИН отмечена во многих исследованиях, выполненных в различных, удалённых друг от друга, странах: в Германии, Бельгии, Франции [Esteban et al., 2008], в Узбекистане [Kurbanov et al., 2008], в Австралии [Freeman et al., 2000], в Таиланде [Hansurabhanon et al., 2002], в Иране [Hajia et al., 2010]. Данная связь описана и для Европейской России [Бобкова и др., 2002]. Эпидемиологическая интерпретация наших результатов и указанных выше работ других авторов позволяет предполагать возможность контаминирования препаратов наркотиков вирусом гепатита С ещё в местах их производства. Согласно отчёту Агентства ООН по борьбе с распространением наркотиков (UNDCP)

основным источником опиатов в мире в 2001-2002 гг являлся Афганистан (доля в мировом производстве героина - 76%) (UNDCP annual report, 2003). До настоящего времени не было опубликовано работ по определению генотипического разнообразия изолятов HCV в Афганистане, но такие исследования были выполнены для стран-соседей по южноазиатскому региону и выявили доминирование генотипа 3 [Amarapurkar et al., 2001; Hajia et al., 2010; Shah et al., 1997].

Встречаемость РНК HGV оценивали в группе пациентов МГНД (п=500), поскольку в этой группе процент инфицирования HCV наиболее высок, а из данных литературы известно о большой вероятности ко-инфекции HGV и HCV [Chu et al., 2001; Хлопова и др., 1999]. Частота встречаемости РНК HGV среди всех пациентов МГНД составила 33.6%. Среди 240 образцов сывороток, положительных на серологические маркёры HCV, РНК HCV найдена в 195 (81.3%) пробах, а РНК HGV обнаружена в 103-х образцах (42.9%, OR = 2.26).

Были протестированы также 260 проб, отрицательных на серологические маркеры к HCV, среди них РНК HGV была обнаружена в 65 образцах (25%), из которых 2 образца были положительны на маркеры гепатита В.

Секвенирование ПЦР-фрагментов генома 78 изолятов HGV и последующий филогенетичсекий анализ показал, что большинство из них относится ко 2 генотипу, который преимущественно циркулирует в Европе (Рис, 1.8). Найдена только одна сыворотка 4 генотипа, который распространен в Южной Азии И Австралии.

KGB341

KGB373

KGB27

KGBS3

KGB379

KGB402

KGB361

Z98913GERMANY Z78240RUSSIA KGB410 KGB437 J- KGB502 KGB290 Z78Z60RUSS1A RIG95

Z98926GERMANY

KGB412

KGB295

Z78275BRAZILIA

KGB47

Z782SOMOLDOVIA Z78275 KGB278

Z98916GERMANY KGB2 KGB370 KGB244 KGB3S6 KGB13 KGB404 RIG443

Z78269SIERRALEONE AB003291JAPAN AB01B667MYANMAR KGB24

_ID87715JAPAN

~ 087262JAPAN

-D133INDONEZIA

1-D116IND0NEZIA

-Z78272ZAIR

Генотип

J Z78276ZAIR 1 D136BRAZILIA - D130CQTE

1Д4 Генотипы

0.08

0.06

0.04

0.00

Рис. 1.8. Филогенетическое дерево, построенное с помощью программы Mega v.4 методом UPGMA на основе нуклеотидных последовательностей NS5B области генома HGV (402 п.о.).

Изоляты, полученные нами, отмечены шифром KGB или RJG с соответствующим номером. Для прототипных последовательностей указаны уникальные шифры базы данных GenBank. Внизу приведен масштаб шкалы генетических расстояний.

1.5. Анализ факторов риска парентеральных вирусных гепатитов В, С и G

Фактор риска - некое условие, формирующее высокие показатели заболеваемости в определённом коллективе на заданной территории. Факторы риска включают в себя риск становления (формирования) эпидемического варианта возбудителя, риск распространения эпидемического варианта возбудителя, риск заражения, риск заболевания [Беляков и др., 1989]. Фактор риска - особенность организма или внешнее воздействие, приводящие к увеличению риска возникновения заболевания или иному неблагоприятному исходу [Флетчер и др., 1998].

На основе вышеуказанных определений, которыми мы руководствовались в своей работе, к факторам риска инфекции парентеральных вирусных гепатитов относятся как процедуры непосредственного контактного воздействия на организм человека, так и особенности образа жизни участников исследования.

Величину фактора риска выражали отношением шансов инфицирования и не инфицирования для каждого тестируемого фактора ((Ж). Значения СЛ больше единицы свидетельствуют о том, что данный фактор является фактором риска, значения СЖ. меньше единицы - фактором защиты. Ниже рассмотрены факторы риска, уровень достоверности которых превышает 95%.

1.5.1. Факторы риска инфицирования НВУ

Расчет факторов риска проводили на основе выявления статистических связей между ответами на вопросы соответствующих каждой базе данных анкет и результатами ИФА в отношении двух серологических маркеров: HBsAg (скрининговый и подтверждающий тест) и/или анти-НВс ^О. Эти серологические маркеры наиболее полно охватывают все группы инфицированных НВУ: острую и хроническую инфекцию, а также реконвалесцентов и лиц, перенесших инфекцию НВУ в бессимптомной форме (только анти-НВс ^Б).

Наиболее значимые факторы риска инфицирования гепатитом В представлены в Табл. 1.3. Как следует из данной таблицы риск одновременного инфицирования НВУ и НСУ существенно превосходит риск НВУ моноинфекции во всех обследованных группах жителей Сибири. Следующим по значимости фактором риска является употребление наркотических препаратов.

Нозокомиальные факторы явились значимыми для инфекции НВУ в 2001-2002 гг во всех исследованных группах и регионах. В частности, наличие в анамнезе общей анестезии (операций) кроме медработников явилось также фактором риска в группе посетителей поликлиники НРБ-1 (011=1.6), а переливание крови - в группе пациентов Центра СПИД (ОЯ=3.0). Посещение хирурга достоверно коррелировало с инфекцией НВУ в группе пациентов МГНД (011=1.75).

Таблица 1.3.

Наиболее значимые факторы риска инфицирования HBV

Фактор риска Отношение шансов - OR

База данных №1 База данных №2 (п=3441)

Мед. персонал п=500 Поликли пика п=500 СПИД п=500 МГНД п=500 Новоси бирск п=1509 Барнаул п=1044 Иркутск п=888 Все п=3441

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Микст инфекция с гепатитом С

Да 14.523 22.718 53.423 52.763 4.6227 6.5538

Нет 0.0689 0.044 0.019 0.019 0.216 0.152

Инъекционное употребление наркотических средств

Да 2.701 10.959 29.27 2.21 1.7397 2.1635 2.15

Нет 0.370 0.091 0.034 0.45 0.5748 0.462 0.47

Количество половых партнеров

>3 2.474 2.4048 1.89 1.981 1.90

<3 0.404 0.416 0.53 0.505 0.53

Половые контакты с партнерами с гепатитом в анамнезе

Да 2.160 2.031 2.4379 2.051

Нет 0.4629 0.492 0.4102 0.488

Наличие ЗППП в анамнезе

Да 1.68 2.6546 2.1510 1.90

Нет 0.60 0.377 0.465 0.53

Переливание крови

Да 1.812 3.049

Нет 0.552 0.328

Хирургические вмешательства

Да 1.712 1.661 1.757 1.614 1.305

Нет 0.584 0.602 0.569 0.6198 0.766

Образование

Нет | 11.5116 | 1.62 | 1.262 | | |

Наличие Работы

Да 0.611 0.769 0.686

Нет 2.793 2.3225 7.0497 1.30 1.458

Употребление крепких напитков

Да 0.636 0.080 1.635 1.380 1.445

Нет 1.572 12.46 0.612 0.725 0.692

Содержание под стражей в течение 6 мес. до заболевания

Да 2.045 3.326

Нет 0.489 0.301

Наличие татуировок

Да 2.0916 1.564

Нет 0.478 0.639

Посещение маникюрного кабинета

Да 1.527 2.096 1.654

Нет 0.655 0.477 0.605

Бытовые контакты (общие щетки, бритвы и пр.)

Да 1.293 1.693 1.639

Нет 0.774 0.591 0.610

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Вакцинация

Да 0.474 0.480

Нет 2.11 2.083

Среди социальных факторов риска инфекции гепатита В наиболее высоким является статус безработного (OR=2.3-7.0), что достоверно связано с отсутствием образования (OR=1.5 и 1.6 в группах пациентов цСПИД и МГНД соответственно), ранним началом (до 17-ти лет) употребления крепких напитков (OR=1.7 и 3.36 в группах пациентов цСПИД и МГНД соответственно) и тюремным заключением (OR=2.0 и 3.32 в группах пациентов цСПИД и МГНД соответственно).

Набор факторов риска в отношении гепатита В отличался в разных сибирских регионах. Так лечение в больнице в последние 6 месяцев до заболевания, наличие в анамнезе эндоскопии или зондирования оказались факторами риска гепатита В в Алтайском крае (OR=1.6 и 1.3), а наличие татуировок - в Иркутской области (OR=2.09). Иглоукалывание оказалось значимым фактором риска гепатита В в общей выборке по трем сибирским регионам (OR=1.7). Использование общих с другими людьми предметов гигиены и посещение маникюрного кабинета в последние 6 мес. до заболевания являлись факторами риска инфицирования HBV в Новосибирске и Иркутске (OR 1.3:1.5 и 1.5:2.0 соответственно). Статус безработного повышал риск инфицирования HBV в Барнауле (OR=1.3) и Иркутске (OR=1.458).

Попытка проанализировать факторы риска HBV инфекции по базе данных №3 (хронические гепатиты, 164 респондента) имела успех только в отношении одного фактора - наличие язвенной болезни достоверно коррелировало с сероконверсией по маркерам HBV (OR=4.3).

1.5.2. Факторы риска инфицирования HCV

Для оценки статуса по HCV инфекции были выбраны два теста -подтверждающий ИФА и/или ПЦР на наличие РНК HCV. Позитивный ответ на наличие антител хотя бы к одному из белков Core или NS в подтверждающем ИФА является точным и универсальным маркером гепатита С. В связи с высокой иммуногенностью HCV антитела к Core и/или NS белкам появляются очень рано в процессе инфекции, сохраняются пожизненно у хронических больных и являются маркером паст-инфекции [Pavio et al., 2003]. Маркер РНК HCV обеспечил включение в анализируемую выборку серонегативных образцов. Таким образом использование данных двух маркеров позволило нам достаточно полно проанализировать случаи

инфекции вирусом гепатита С, начиная с реконвалесцентов и бессимптомных носителей и кончая хронической и острой манифестной инфекцией.

Как следует из Табл. 1.4 основным фактором риска инфекции НСУ является внутривенное употребление наркотиков, причем (Ж в этом случае в десятки и сотни раз превышает аналогичные показатели для других факторов риска. Основным источником заражения в группах ПИН во всех регионах является совместное использование контейнеров, игл или шприцев при употреблении наркотиков. В связи с такими высокими значениями (Ж среди респондентов-ПИН для анализа менее значимых по инфекции НСУ факторов риска было целесообразно исключить данную категорию участников из тестируемых выборок. Такой подход позволил нивелировать искажение оценки статистически значимых факторов риска вследствие неравномерного попадания ПИН в те или иные тестируемые выборки (факторы).

Переливание крови являлось вторым по значимости фактором риска НСУ среди разных групп населения Новосибирской области в 2001-2002 гг. (СЖ=3.8 -11.3).

Таблица 1.4.

Наиболее значимые факторы риска инфицирования НСУ

Фактор риска Отношение шансов - ОВ.

База данных №1 (п=2000) База данных №2 (п=3441)

Мед. персонал Поликли ника цСПИД мгнд Новоси бирск Барнаул Иркутск Все

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Всего 11=500 п=500 п=500 п=500 п=1509 11=1044 11=888 п=3441

Внутривенное употребление наркотических средств

Да 47.5 31.7 1753 16.68 12.02 23.50 1536

Нет 0.021 0.032 0.006 0.06 0.083 0.043 0.07

Совместное использование контейнеров, игл или шприцев

Да 4.13 12.5 2.80 2.44 2.35

Нет 0.242 0.080J 0.36 0.41 0.43

Без ПИН п=498 п=493 п=315 п=255 п=130 0 п=895 11=810 п=3005

Переливание крови

Да 10.44 3.831 11364

Нет 0.096 0.261 0.088

Хирургические вмешательства

Да 1.70 1.31

Нет 0.59 0.76

Эндоскопия или зондирование в анамнезе

Да 1.41

Нет 0.71

Инъекционные медицинские процедуры (>10) в течение 6 мес. до заболевания

1 2 3 4 5 б 7 8 9

Да 2.17

Нет 0.46

Количество половых партнеров

>3 2.88 1.68 1.95

<3 0.35 0.6 0.51

Половые контакты с партнерами с гепатитом в анамнезе

Не знаю 2.25 1.66 2.05 1.68

Нет 0.54 0.47 0.65

Употребление крепких напитков

Да 3.175 1.72 1.32

Нет 0.315 0.58 0.76

Употребление пива более 900г в неделю

Да 1.98 1.69 1.67 1.68

Нет 0.51 0.59 0.60 1 0.59

Наличие татуировок

Да 3.67 2.94 2.16

Нет 0.27 0.34 0.46

Содержание под стражей в течение 6 мес. до заболевания

Да 4.17 7.86 3.25

Нет 0.24 0.127 0.31

Половой путь передачи НСУ оказался статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах. Особое значение при этом имеет количество половых партнеров больше или равно 3 в последние 6 месяцев до заболевания (011=1.68-2.88) й половой контакт с партнерами, которые перенесли гепатит 6 и менее месяцев назад (0(1=1.66-2.25). Количество половых партнеров меньше 3-х обеспечивало достоверную защиту от НСУ инфекции.

Наличие хирургических операций являлось фактором риска в Иркутской области (011=1.7), а большое количество инъекционных процедур (>10) при госпитализации увеличивало риск инфекции НСУ в 2.5 раза в объединенной выборке. Из других медицинских процедур эндоскопия или зондирование проявились как фактор риска в объединенной выборке (011= 1.4).

Высоким фактором риска в отношении НСУ инфекции оказалось пребывание в тюрьме или камере предварительного заключения в Новосибирской и Иркутской областях (011=4.17 и 7.86). Эти данные коррелируют с наличием татуировок у респондентов в этих же регионах (011=3.67 в Новосибирске и 011=2.94 в Иркутске).

Употребление алкоголя, особенно пива больше 900г в неделю, достоверно коррелировало с высоким статусом по НСУ инфекции во всех сибирских регионах (011=1.67-1.98).

Анализ факторов риска в базе данных №3 также показал, что внутривенное употребление наркотических препаратов является основной причиной хронической НСУ инфекции в Новосибирской области (011=6.98). В этой группе среди лиц, употребляющих наркотики внутривенно, 94.7% имели маркёры НСУ. Среди пациентов ГОКБ, никогда не употреблявших наркотики, риск инфицирования НСУ был достоверно выше у тех лиц, которые указывали о заболеваемости острым гепатитом кого-нибудь из членов семьи (011=5.74).

1.5-3. Факторы риска инфицирования НСУ

Наибольшие шансы инфицирования НОУ имели пациенты с гепатитом С (011=2.26) и употребляющие наркотики внутривенно (011=2.15). Выявлено, что употребление героина (011=1.4) является менее опасным фактором, чем употребление <аанки» (011=2.4). Фактором риска было также наличие большого количества (более 7) половых партнёров в течении жизни (011=1.5) и статус безработного (011=2.0).

В то же время не было показано статистически значимой зависимости между наличием гемотрансфузий в анамнезе, их количеством и временем их выполнения (до

1994 года и после) и инфицированием вирусом гепатита О.

***

Наличие и, главное, широкое использование вакцины против гепатита В в настоящее время является огромным успехом мирового здравоохранения. Число хронически инфицированных НВУ людей в мире оценивается в 350 миллионов человек, и все они являются возможным источником заражения для остальной популяции, при этом вирус гепатита В в 100 раз более контагиозен, чем ВИЧ. Наше исследование также показало, что самым значимым фактором защиты против НВУ инфекции является вакцинация (011=0.48). Следующий раздел диссертации посвящен более подробному анализу факторов иммунной защиты в отдаленные сроки после вакцинации такой группы риска как сотрудники ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», которые вели активную работу с материалом, инфицированным НВУ.

2. Исследование напряженности гуморального иммунитета и состояния

клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса вакцинации

против гепатита В

Для определения состояния поствакцинального иммунитета мы учитывали уровень анти-НВв и индекс специфической стимуляции лимфоцитов методом

ELISPOT. Концентрацию анти-HBs IgG определяли с помощью тест-системы «BeKroHBsAg-антитела» (ЗАО «Векгор-Бест», г. Новосибирск). ELISPOT-анализ проводили с использованием набора INF-y BD™ ELISPOT Set (BD Biosciences, США). В качестве клеток-эффекторов использовали лимфоциты периферической крови, в качестве специфического антигена - природный HBsAg («Внугрилабораторный контроль HBsAg» ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), в качестве неспецифического митогена - фитогемоагглютинин (ФГА, Sigma, США). Регистрацию и обработку результатов реакции ELISPOT проводили на AxioCam, Stemi 2000С с помощью программы AxioVision Reí. 4.5 «Carl Zeiss» (Германия). Определяли отношение спотов (ИФН-у-продуцирующих клеток) в экспериментальной (стимулированной специфическим антигеном) лунке к количеству спотов в контрольной (не стимулированной) лунке. Кратность превышения была обозначена как индекс специфической стимуляции лимфоцитов. Ответ считали положительным, если наблюдался ответ на митоген (контроль системы), индекс специфической стимуляции был больше 2, и регистрировалось более чем 20 спот-формирующих единиц на 106 лимфоцитов.

Результаты, полученные при анализе образцов крови вакцинированных сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», получивших в 2002 году полный курс вакцины Engerix, приведены в Табл. 2.1. Как видно из данной таблицы, 22.4% вакцинированных имеют антитела к HBcAg, что свидетельствует об инфекции вирусом гепатита В. Существовали ли эти антитела до вакцинации или были индуцированы после, сказать не представляется возможным, так как обследование на маркеры HBV до вакцинации не проводилось. Если предположить, что инфицирование произошло до вакцинации, то при наличии достаточного уровня анти-HBs IgG (>10 МЕ/л) и отсутствии HBsAg, 22.4% данной выборки могли бы не подвергаться вакцинации как имеющие естественный иммунитет вследствие бессимптомной инфекции HBV (в Анкете эти сотрудники указали, что ранее вирусным гепатитом не болели). Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения обследования на наличие маркеров HBV инфекции перед вакцинацией.

В группе вакцинированных, не содержащих анти-НВс IgG (45 человек, Табл.2.1), протективный уровень антител к HBsAg (>10МЕ/л) был выявлен у 27 человек, т.е. эффективность иммунизации вакциной Engerix в данной группе через 5

лет составила 60.0%, при этом только 16 человек из 27 имели уровень анти-HBs IgG >100МЕ/л.

Таблица 2.1.

Выявление показателей гуморального и клеточного иммунитета у сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» через 5 лет после полного курса иммунизации вакциной Engerix в

2002 г.

Наличие анти-НВс IgG (+/-) п Доля вакцинированных лиц с разным уровнем анти-HBs IgG Доля вакцинированных лиц, имеющих положительный индекс стимуляции, п (%)

Конц. анти-HBsAg п(%)

+ 13 >10МЕ\л 10 (77.0%) 6 (60.0%)

<10МЕ\л 3 (23.0%) 3 (100%)

45 >10МЕ\л из них >100МЕ\л 27 (60.0%) 16 (35.6%) 13 (48.1%) 7 (43.8%)

<10МЕ\л 18 (40.0%) 13 (72.2%)

При анализе индекса специфической стимуляции лимфоцитов в этой группе было установлено, что только у 13 человек (48.1%) (Рис. 2.1, сектор Б) из 27 вакцинированных (Рис. 2.1, сектор Б и Г), имеющих протекгивный уровень анти-НВв ^О (>10 МЕ/л), присутствует клеточная составляющая иммунитета (индекс стимуляции 2 и более). В группе, где концентрация защитных антител была ниже протективного уровня (Рис. 2.1, сектор А и В), положительный индекс стимуляции лимфоцитов определялся в 72.2% случаев (Рис. 2.1, сектор А), что достоверно выше (р < 0.05), чем в группе с протективным уровнем антител к HBsAg (Рис. 2.1, сектор Б). Это согласуется с данными о том, что иммунологическая память формируется независимо от уровня антител, так как обусловлена в основном Т-клеточным звеном иммунитета [Селиашвили и др., 2006; Вапа^аЬ е( а!., 2000].

Доля лиц с положительным индексом стимуляции лимфоцитов растет по мере снижения уровня анти-НВв Так в группе с уровнем антител более 100 МЕ/л положительный индекс стимуляции лимфоцитов имеют меньше половины вакцинированных, 7 человек из 16 (43.8%), а в группе с уровнем антител 10-100 МЕ/л - больше половины вакцинированных, 6 человек из 11 (54.5%). Возможным объяснением полученных данных является сбалансированность иммунного ответа на уровне индивидуального организма: в случае доминирования цитокинсекреторной активности Т-хелперов 1-го типа происходит снижение активности Т-хелперов 2-го типа, которые регулируют стимуляцию гуморального иммунитета [ВегЫеШ е£ а1., 1997].

0.1

А Ф й © 1 в ¿ь( Б © и О к © <9 0 ©о а о - п

в © о г У о О о "о О

ю газ «го юхо

КЬзцктращя аЕтопяпсНВ^Д^

100000

Рис. 2.1. Соотношение показателей клеточного (индекс специфической стимуляции лимфоцитов) и гуморального (уровень анти-НВз ^О) иммунного ответа в группе вакцинированных. Сектор А: анти-НВв ^О < 10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов >2; сектор Б: анти-НВя ДО >10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов >2; сектор В: анти-НВз <10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов <2; сектор Г: анти-НВв ДО >10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов <2.

Таким образом, оказалось, что через 5 лет из группы вакцинированных, не имеющих анти-НВс 27 человек (60.0%) имеют протективный уровень антител к НВзА£, 26 человек (58.0%) имеют положительный индекс стимуляции лимфоцитов (2 и более), и оба положительных ответа имеют 13 человек (28.8%). В целом из 45-ти вакцинированных 5 лет назад 40 человек имеют хотя бы один положительный показатель протективности, что составляет 89.0% и существенно превышает уровень оценки, сделанный только на основе количества анти-НВв (60.0%).

В группе вакцинированных с анти-НВс (Табл. 2.1) выявлена тенденция к увеличению количества образцов с протективным уровнем антител к НВвА£ (77.0%), что может быть обусловлено аддитивным эффектом ^вакцинации и перенесенной

инфекции. У трех человек, имеющих анти-НВс антитела к НВзА§ оказались ниже протективного уровня - эти лица требуют усиленного наблюдения с целью исключения развития хронического гепатита В. Увеличение частоты выявления положительного индекса стимуляции лимфоцитов в этой группе (6 человек из 10 и 3 человека из 3-х) оказалось недостоверно на уровне значимости р < 0.05.

2.1. Оценка необходимости ревакцинации при различном соотношении показателей иммунного ответа

Результаты исследования напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В показали, что кроме общепринятого критерия оценки эффективности вакцинации против гепатита В - уровень анти-НВв ДО, при решении вопроса о ревакцинации необходимо учитывать и Т-клеточную составляющую иммунитета - определение HBsAg-cтимyлиpoвaннoй продукции ИФН-у лимфоцитами методом ЕЫБРОТ. Совокупность этих данных позволит более адекватно оценить эффективность вакцинации и принять решение о ревакцинации. Из представленных данных следует, что положительный индекс специфической стимуляции лимфоцитов встречается чаще при низком уровне антител, что позволяет определить состояние иммунитета у вакцинированных со слабым гуморальным ответом и в отдаленный период, когда содержание анти-НВв становится ниже 10 МЕ/л.

Анализ полученных нами данных и данных литературы позволил сформулировать следующий алгоритм вакцинации и ревакцинации против гепатита В:

1. Проведение перед вакцинацией обследования на наличие маркеров гепатита В

(НВзА& анти-НВс ДО, анти-НВв ДО).

2. Проведение обследования после полного курса вакцинации против гепатита В с

целью определения ее эффективности:

• при уровне анти-НВэ ниже 10 МЕ/л провести оценку клеточного иммунитета (ЕЫЗРОТ), при индексе стимуляции <2 рекомендовать проведение дополнительной вакцинации;

• при уровне анти-НВБ >10 МЕ/л - рекомендовать скрининг уровня анти-НВэ ЦО через 5 лет и при снижении данного показателя ниже протективного (10 МЕ/л) определять состояние клеточного иммунитета с целью оценки необходимости ревакцинации.

***

Одним из предикторов успеха при создании вакцины против гепатита В явилось наличие высокоиммуногенной консервативной детерминанты «а» в поверхностном белке вируса - HBsAg. Выявлению и конструированию таких детерминант в поверхностных гликопротеинах Е1 и Е2 вируса гепатита С посвящена следующая часть работы.

3. Изучение антигенного профиля поверхностных белков Е1 и Е2 НСУ 3.1. Пептидное сканирование антигенных детерминант нативных поверхностных белков Е1 и Е2 НСУ

В работе использовали коллекцию из 45 сывороток крови хронически инфицированных НСУ пациентов ГУЗ Государственный Новосибирский Областной Клинический Диагностический Центр, г. Новосибирск. В коллекцию входили образцы, содержащие НСУ трех генотипов - 1Ь, 2а/2с и За, которые наиболее широко распространены на территории России и, в частности, в г. Новосибирске. Каждая генотипическая группа сывороток включала 15 образцов.

Сканирование антигенно-значимых детерминант поверхностных белков НСУ проводили методом ИФА с использованием набора синтетических пептидов, перекрывающих полную последовательность гетеродимера Е1Е2 (192-809 а.о.) (Р ер Б сап анализ). Набор состоит из 76 пептидов, рассчитанных на основе структуры штамма Н77 НСУ, генотип 1а и синтезированных в фирме МипоЬэрев (Австралия). Пептиды имеют длину 20 а.о. с перекрыванием в 12 а.о., благодаря чему при сканировании каждая последовательность представлена 2-3 раза.

Для увеличения репрезентативности антигенных профилей и нивелирования колебаний неспецифических фоновых значений оптической плотности (ОП) индивидуальных сывороток нами была проведена теоретическая оценка антигенной активности каждой аминокислоты тестируемых Е1 и Е2 белков НСУ (ОПак) с учетом количества пептидов, в которых она участвует в РерБсап анализе, и среднего значения ОП для каждого пептида внутри группы сывороток одного генотипа. Такой подход позволил также преодолеть ступенчатый характер пептидного анализа (в нашем случае размер «ступени» составляет 8 а.о.) и картировать антигенные детерминанты в соответствии с позициями определенных аминокислот на полипротеине Е1Е2 НСУ. Суммированные по разным генотипам НСУ результаты расчета представлены на Рис. 3.1.

Как следует из Рис. 3.1 общие высокоиммуногенные эпитопы выявлены в следующих позициях а.о.: 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400,430-440, 680-690 (Е2 белок). В позициях 340-350, 490-500 и 560-580 а.о. также регистрируются общие, но существенно слабее реагирующие эпитопы. Широкое варьирование границ большинства эпитопов свидетельствует о высокой изменчивости белков Е1 и Е2, однако способность антител, индуцированных разными генотипами НСУ, реагировать с одинаковыми пептидами свидетельствует также и о возможности создания на

основе этих пептидов универсальных иммуногенных конструкций для разработки вакцин против НСУ.

1.4

1,2

° 1 Ш '

8 0,8

о 0,4

0,2 _

1Л

1,2

8 1 ю

2 0,8 Ч

! 0,6

О 0,4

0,2

1,4 1,2

о § 1

8 0,8 !

О 0,4

0,2 0

Рис. 3,1. Антигенные профили поверхностных белков НСУ трех разных генотипов, построенные на основе расчета активности отдельных аминокислот Е1Е2 полипротеина НСУ в пептидном анализе. Вдоль оси абсцисс указаны позиции а.о. в полипротеине Е1Е2, вдоль оси ординат указаны рассчитанные для каждой аминокислоты значения ОПак. Генотипы НСУ указаны в рамках в правом верхнем углу рисунка, «ВГС отр.» обозначает значения ОП негативных на присутствие маркеров НСУ сывороток человека (п=6, отрицательный контроль), «среднее» на нижнем рисунке обозначает среднее значение ОП для всех генотипов НСУ. Все расчеты проводили в среде программного обеспечения «ЬаЬУ|е\у».

Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях а.о. 280290, 410-430 и 520-540 (Рис. 3.1). Так, в частности, в районе 280-290 а.о. белка Е1 выявлена ранее не описанная в литературе антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с субтипа сибирских изолятов НСУ.

Выявленные нами межгенотиповые различия антигенного профиля поверхностных белков НСУ свидетельствуют о необходимости генотипирования изолятов при изучении свойств поверхностных белков Е1 и Е2 и некорректности в ряде случаев распространения данных, полученных для отдельного генотипа, на вирус гепатита С в целом (как следует из Рис. 3.1, среднее).

3.2. Получение и анализ рекомбинантных белков Е1 и Е2 НСУ

Белки Е1 и Е2 являются поверхностными гликопротеинами НСУ и относятся к трансмембранным белкам I типа с высокогликозилированным ]Ч-терминальным эктодоменом (5 сайтов гликозилирования для Е1 и 11 - для Е2) и С-терминальным гидрофобным якорем. Процессинг Е1 и Е2 белков и формирование нековалентного гетеродимера происходит на мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР) (Рис. 3.2А).

\\ Е1 \

192

383

Е2

384

746

Е1 Е2

192 383 715

Рис. 3.2. Схематическое изображение мембран-связанных поверхностных белков HCV и структура конструкта, использованного в нашей работе. А - процессинг структурных белков HCV от N до С конца: Core, El, Е2 и Р7; стрелками указаны сайты разрезания пегггидазами клетки. Цветные боксы - полноразмерные белки Е1 и Е2 с указанием краевых позиций а.о. в полипротеине HCV; полые боксы - необходимые для их функциональной активности фрагменты Core (для Е1) и El (для Е2) [Bian et al., 2009]. В - структура встраиваемого фрагмента генома HCV.

Трансмембранные домены гликопротеинов Е1 и Е2 HCV играют определяющую роль в формировании и субклеточной локализации Е1Е2 гетеродимера, который является функционально активной формой поверхностных белков HCV и обеспечивает проникновение вируса в клетку [Lavie et al., 2007]. Несмотря на то, что в последние годы была разработана система культивирования HCV с использованием выделенного в Японии JFH-1 клона, способного размножаться в клетках гепатомы человека Huh7.5 [Kato et al., 2006], выделение и изучение свойств поверхностных белков HCV в этой системе проводить затруднительно вследствие низкого уровня репродукции вируса. Лучшими кандидатами для экспрессии генов поверхностных белков HCV являются вирусные векторы, поскольку гликозилирование белков и образование Е1Е2 комплексов в этом случае происходит наиболее близким к природному образом.

Для продукции препаративных количеств Е1 и Е2 белков нами были использованы два вируса: Синдбис вирус (альфавирус с РНК геномом позитивной полярности) и вирус осповакцины (ортопоксвирус с ДНК геномом). Эти два вируса совершенно различны по скорости репликации, внутриклеточной локализации и механизмам синтеза и процессинга белков, что позволяет выбрать наиболее адекватную природной систему экспрессии. В обоих случаях проводили ко-экспрессию генов белков Е1 и Е2 HCV с целью обеспечения возможности образования Е1Е2 гетеродимера. При конструировании в расчет было принято также то, что для правильного процессинга Е1 белка необходим С-концевой фрагмент Core, а для процессинга Е2 белка - примыкающий к нему С-концевой фрагмент Е1 (Рис. 3.2А) [Bian et al., 2009; Dubuisson et al., 2003]. Таким образом встраиваемая конструкция состояла из фрагмента гена Core, кодирующего 21 а.о. С-концевой части этого белка, полноразмерной копии гена белка Е1 (192-383 а.о. по последовательности полипротеина штамма Н77, генотип 1а) и усеченного с С конца гена белка Е2 (384-715 а.о.), у которого был удален гидрофобный трансмембранный домен и введены шесть остатков гистидина (E1E2T-HIS) (Рис. 3.2В).

Рекомбинантный вирус осповакцины со встройкой Е1Е2 фрагмента генома HCV в структурную часть гена тимидинкиназы (rVV-ElE2) был получен нами из американской лаборатории вирусных гепатитов (CBER, FDA).

Для конструирования рекомбинантного вируса Синдбис была использована двух-плазмидная система: плазмида SinRepElE2T-His, несущая гены всех неструктурных белков вируса Синдбис со встройкой последовательности E1E2T-HIS

и вспомогательная плазмида DH-BB helper, несущая встройку генов структурных белков вируса Синдбис [Bredenbeek et al., 1993]. Синтез функционально активных РНК, представляющих фрагменты генома вируса Синдбис (структурная и неструктурная часть) осуществляли in vitro с помощью SP6 РНК полимеразы, под контролем промотора которой клонированы гены вируса Синдбис в плазмидных ДНК. Рекомбинантный вирус Синдбис (rSin-ElE2) получали совместной электропорацией клеток препаратами РНК SinRepElE2T-His и DH-BB helper. Образующиеся вирионы содержат рекомбинантную субгеномную РНК вируса Синдбис SinRepElE2T-His и не способны формировать полноценное потомство вследствие отсутствия генов структурных белков. Такой подход обеспечивает безопасность работы с системой экспрессии вируса Синдбис поскольку в нативном состоянии данный вирус патогенен для человека. Однократная абортивная инфекция клеток BHK-F вирусом rSin-ElE2 способна эффективно направлять экспрессию генов рекомбинантных белков HCV, встроенных в субгеномную РНК вируса Синдбис.

Продукцию рекомбинантных белков осуществляли в клетках почки китайского хомячка BHK-F вследствие инфекции их рекомбинантными вирусами осповакцины или Синдбис. Не смотря на высокую репродуктивную способность rVV-ElE2 и rSin-Е1Е2, уровень продукции Е1 и Е2 белков оказался невысок и составлял приблизительно 1.25 х10"п г/клетка в случае осповакцины и 2.1 хЮ"12 г/клетка в случае Синдбис вируса, что не превышает 1% от общего белка клетки. В связи с этим нами был разработан многостадийный метод выделения комплекса Е1Е2 гликопротеинов HCV.

Мы использовали ранее описанный принцип очистки высоко гликозилированных белков [Maertens et al., 2006] и особенность EI и Е2 белков HCV, связанную с наличием преимущественно маннозных остатков в их гликозидных цепочках [Flint et al., 2000]. Такой тип модификации позволяет использовать на первом этапе очистки Е1 и Е2 белков HCV иммобилизованный на агарозе GNA-лектин, обладающий высокой аффинностью к маннозным сахарам. «His-tag» технологию использовали на втором этапе очистки Е1Е2 гетеродимера. Все фракции, выделенные на хроматографе, анализировали в Western blot на присутствие белков Е1 и Е2 HCV с использованием моноклональных антител анти-Е1 (МКА El А4) и анти-Е2 (МКА Е2 All) [Dowd et al., 2009] (любезно предоставлены Dr. Marian Major, США).

Анализ очищенных препаратов белков, экспрессированных в системе вируса осповакцины (УУ-Е1Е2) представлен на Рис. 3.3, а в системе вируса Синдбис (БШ-Е1Е2)-на Рис. 3.4.

17.9 -s-i..,,_,..:_.

Рис. 3.3. Иммуноблот и электрофоретический анализ очищенного препарата Е1Е2 белков HCV, полученных в системе рекомбинантного вируса осповакцины. Слева - маркер молекулярных весов (BioRad, Kaleidoscope Prestained Standards, Cat 161-0324). A - связывание с MKA El A4; В -связывание с MKA E2 A11; С -10% SDS-ПААГ, окраска no Laemmly, 1 и 2 - два препарата очищенных белков W-E1E2: 1 - нанесен1 ц г; 2 - нанесено 0.2 цг белков.

1 2 3

Ч-

Е2 —►:•' Ц •

Рис. 3.4. Иммуноблот и электрофоретический анализ очищенного препарата Е1Е2 белков HCV, полученных в системе рекомбинантного вируса Синдбис. Слева - маркер молекулярных весов. А -связывание с MKA El А4; В - связывание с MKA Е2 А11; С - 10% SDS-ПААГ, окраска по Laeramly. 1 - очищенный препарат белков W-E1E2 (положительный контроль); 2 и 3 - два препарата очищенных белков SIN-E1E2.

Как следует из Рис. 3.3 и 3.4, при анализе белков в SDS-ПААГ видимая полоса формируется только белком Е2, однако Western blot анализ выявляет и присутствие белка Е1 (Рис. 3.3А и 3.4А), который выделяется в составе нековалентного комплекса с Е2. Во всех препаратах белков в иммуноблоте с MKA А4 Е1 регистрируется также полипротеин Е1Е2 с Мв около 100 кДа. Таким образом полученные нами очищенные препараты Е1Е2 белков представлены белком Е2, нерасщепленным полипротеином Е1Е2 и гетеродимером Е1Е2, что наиболее ценно с точки зрения природного фолдинга этих белков и последующего изучения их иммуногенных и протективных свойств.

При сравнении Рис. 3.3 и 3.4 хорошо видны различия в уровне гликозилироваиия белков в двух системах экспрессии. В препаратах белков W-E1E2 наблюдаются отдельные четкие полосы, соответствующие полностью гликозилированным формам белков Е1 (35 кДа), Е2 (72 кДа) и комплексу Е1Е2 (Рис. 3.3). Белки, экспрессированные в системе вируса Синдбис, не полностью гликозилированы, что выражается в наличии серии полос в иммуноблоте (Рис. 3.4). Это особенно наглядно выявляется в случае белка Е1, где можно наблюдать до четырех полос, соответствующих 4-м сайтам гликозшгарования данного белка [Dubuisson et al., 2003].

Оценку иммуноадекватности выделенных нами рекомбинантных белков нативным аналогам проводили в ИФА и Western blot анализе с использованием фрагмента коллекции HCV-позитивных сывороток человека, описанных в разделе 3.1: по 13 образцов lb и 2а/2с генотипов и 11 образцов За генотипа HCV. Все тестированные сыворотки распознавались как позитивные в ИФА с использованием в качестве антигена W-E1E2. Белки SIN-E1E2 распознают все сыворотки только в случае генотипа За HCV и не распознают 5 сывороток в группе с генотипом 2а/2с и 3 сыворотки в группе с генотипом lb.

Таким образом, по результатам ИФА рекомбинантные белки, экспрессированные в системе вируса осповакцины, являются более компетентными для иммуноанализа (100% узнавания), чем белки из системы Синдбис вируса (78% узнавания). Еще в большей степени различия между рекомбинантными белками проявились в Western blot анализе, в котором система экспрессии вируса Синдбис обеспечивала только 46% узнавания HCV-позитивных сывороток против 100% в системе вируса осповакцины.

33. Вируснейтрализующая активность иммуногенных эпитопов рекомбинантных белков Е1 и Е2

Для оценки иммуногенных и протективных свойств рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV проводили иммунизацию мышей линии BALB/c очищенными препаратами белков. Позитивные сыворотки объединяли в пулы (VV-АВ и SIN-AB, соответственно) и анализировали в PepScan анализе с набором пептидов, описанным в разделе 3.1 (Рис. 3.5). Главный линейный эпитоп, узнаваемый обоими пулами сывороток, был локализован в позиции а.о. 632-667 (Рис. 3.5А) с сравнимым титром антител (~106) (Рис. 3.5Б). Сыворотки SIN-AB узнавали только 3 основных линейных эпитопа (а.о. 496-515, 512-547 и 632-667), в то время как 10

больших линейных детерминант узнавалось УУ-АВ пулом сывороток в полноразмерной последовательности Е1Е2 полипротеина.

Номер аминокислоты Е1Е2 полипротеина HCV

Рис. 3.5. ИФА иммунных сывороток крови мышей с набором синтетических пептидов, перекрывающих последовательность полипротеина Е1Е2 HCV (PepScan).A - результаты PepScan анализа сывороток мышей в разведении 1:300; В - титры антител для каждого эпитопа в обеих сыворотках, полученные методом предельных 4-х кратных разведений в диапазоне от 1:200 до 1:3276800 (Рис. 5-13 В) в PepScan анализе.

Вируснейтрализующую активность сывороток (Рис.3.6) оценивали с использованием высоковирулентного клона HCV J6/JFH1 с генотипом 2а, способного к многопассажной репликации в клетках Huh-7.5 [Lindenbach et al., 2005]. Для оценки перекрестной межгенотиповой вируснейтрализующей активности использовали химерные вирусы с поверхностными белками генотипов 1а (химера 1а/2а) и lb (химера 1Ь/2а). Работа проводилась в американской лаборатории вирусных гепатитов (FDA, USA) в рамках проекта Международного научно-технического центра № 3255-п, руководителем которого являлась автор представленной диссертации.

о in

х «

ni о ffl

о. ь

500

250

JW-AB CD SIN-AB ■■NMS

1а/2а

1Ь/2а J6/JFH1

генотип HCV

Рис. 3.6. Нейтрализация 1а/2а и 1Ь/2а химерных вирусов и 2а J6/JFH1 клона иммунными сыворотками мышей W-AB и Sin-AB. NMS - нормальная мышиная сыворотка. Вируснейтрализующую активность сывороток определяли в единицах «ингибируюгцая доза 50» (ID50). Ю50 рассчитывали как максимальное разведение, способное нейтрализовать 50% вируса [Zhang et al., 2007]. Расчет средних значений и стандартного отклонения проводили с использованием пакета программ Origin для уровня значимости Р < 0.05.

Из Рис. 3.6 следует, что пул сывороток W-AB обладает существенно большей нейтрализующей и перекрестной активностью, чем SIN-AB. Самые существенные различия между сыворотками были выявлены в случае генотипа 2а HCV (J6/JFH1), в котором ID50 титр для W-AB составил 295.7 в сравнении 109.3 для SIN-AB, т.е. больше в 2.7 раза. Средний ID50 титр для нормальной мышиной сыворотки (NMS) в этих же экспериментах составил 21.47.

Для картирования вируснейтрализующих детерминант рекомбинантных гликопротеинов El и Е2 HCV нами было проведено блокирование иммунных мышиных сывороток пептидами, соответствующими четырем наиболее иммуногенным эпитопам белков VV-E1E2 и SIN-E1E2: а.о. 264-318; 496-515; 512-547 и 632-667 (Рис. 3.7). На первом этапе тест вирусной нейтрализации проводили с химерой Ia/2a HCV, последовательность El и Е2 белков которой гомологична рассчитанным и синтезированным пептидам.

Как следует из Рис, 3.7А и В наибольший вклад в нейтрализацию вируса вносят пептиды, соответствующие районам а.о. 264-318 и 496-515. Эти районы представляют новые ранее не описанные вируснейтрализующие эпитопы белков El и Е2 HCV. Суммарное блокирование сывороток двумя пептидами, соответствующими данным эпитопам (Рис. 3.7С), приводило к практически полной отмене

нейтрализующей активности вШ-АВ и редукции ГО50 титра до уровня неспецифической нейтрализации нормальной мышиной сывороткой и контрольным пептидом Пи. В случае УУ-АВ эффект был выражен в меньшей степени, что свидетельствует о наличии других вируснейтрализующих детерминант в Е1Е2 рекомбинантных белках, синтезированных в системе вируса осповакцины. Из проведенного анализа также следует, что наибольший иммунный ответ как в случае УУ-Е1Е2, так и в 8ГМ-Е1Е2 формируется к не нейтрализующим эпитопам, локализованным в районах а.о. 512-547 и а.о. 624-667.

А: \Л/-АВ , 1000

S 750 ZI

1 500

В: SIN-AB 1000 ■

о in О

750 500 250

«г J / &

# JF

„/ J ¿у é

Блокирующие пептиды

с 1000

S 'so

500

Блокирующие пептиды

T" ES Flu

ЕЗ 264-291+496-515

SIN-AB

W-AB

NMS + Flu

Рис. 3.7. Снижение титра ГО50 иммунных сывороток мышей после блокирования специфическими пептидами. Блокирование антител к специфическому пептиду осуществляли к описано в работе [Major et al., 1999], используя 1-5цг небиотинилированных пептидов в ЮОмкл

сыворотки. Оценку блокирования осуществляли с использованием соответствующего биотинилированного пептида в ИФА. В качестве негативного контроля использовали пептид F (Mimotopes, Австралия) в той же концентрации как HCV-специфичные пептиды.

Анализ перекрестной межгенотиповой активности вируснейтрализующих эпитопов проводили с использованием VV-AB сыворотки и трех вариантов HCV - 2а (J6/JFH1 клон), химеры 1а/2а и 1Ь/2а. Кроме выявленных нами двух новых вируснейтрализующих эпитопов в позициях а.о. 264-318, а.о. 496-515 и не нейтрализующего доминантного эпитопа в позиции а.о. 624-667 нами были

проанализированы три другие, ранее описанные в литературе, иммунодоминантные эпитопы, выявленные в УУ-Е1Е2 белках (Рис. 3.8).

ВИ1 а

Блокирующие пептиды

Рис. 3.8. Анализ перекрестной активности эпитоп-специфичных антител в сыворотке W-AB для la, lb и 2а генотипов HCV. Активность рассчитывали как % снижения титра ID50 до и после блокирования специфическими пептидами.

Как следует из Рис. 3.8 блокирование антител к пептиду а.о. 624-667 оказывало слабый эффект на нейтрализацию всех трех тестированных вирусов, что соответствует данным, представленным на Рис. 3.7. Блокирование антител к выявленному нами новому эпитопу а.о. 264-318 вызывало -20% - ную редукцию ID50 титра для 1а и lb HCV, но не влияло на нейтрализацию 2а вируса, что свидетельствует о неконсервативности этого района в случае 2а генотипа. Блокирование антител к хорошо изученным районам белка Е2 в позициях а.о. 390-410 (HVR1) и 448-483 существенно редуцировало нейтрализацию 1а вируса, но не влияло на нейтрализацию lb или 2а вирусов, что очевидно является следствием высокой вариабельности этих районов. Напротив, район а.о. 412-419 (EPI) является высоко консервативным между генотипами [Zhang et al., 2007], и блокирование антител к этому району приводило к снижению нейтрализации вируса на 50% для всех тестированных генотипов la, lb и 2а. Блокирование антител к эпитопу в позиции а.о. 496-515 также существенно снижало нейтрализацию всех трех вирусов на 30-50%. Этот район консервативен между тремя исследуемыми генотипами и представляет новый универсальный вируснейтрализующий эпитоп.

ВЫВОДЫ

1) Впервые на территории Сибири проведено крупномасштабное (п=5605) молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов В, С и G, по результатам которого созданы три электронные базы данных в международном формате Epilnfo.

2) С использованием этих баз данных проведен анализ частоты встречаемости, генотипического разнообразия и факторов риска парентеральных вирусных гепатитов В, С и G среди представителей разных групп населения Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края в период 2001- 2003 гг.

• Частоты выявления иммунологических маркеров HBV инфекции: среди пациентов поликлиники (п=500) положительными на HBsAg оказались 3.6% пациентов, анти-НВс IgG выявлены у 24.0%; в общей группе медработников (n=500) HBsAg встречался с частотой 5.4%, анти-НВс IgG обнаружены у 22.4% респондентов; частота выявления HBsAg среди всех пациентов МГНД (п=500) составила 8.4%, антитела к HBcAg встречались у 49.9% пациентов; в группе больных острыми гепатитами Новосибирской (п=1509), Иркутской областей (п=888) и Алтайского края (n=1044) HBsAg встречался с частотой 48.8, 20.6 и 36.5% соответственно; в группе больных хроническим гепатитом (п=164) только 25.6% имели серологические маркеры HBV инфекции.

• Частоты выявления иммунологических маркеров HCV инфекции: 48.0% -среди пациентов Муниципального наркологического диспансера, 5.6% - среди посетителей поликлиники и 5.2% - у медицинских работников больниц Новосибирской обл. В группе больных острыми гепатитами Иркутской, Новосибирской областей и Алтайского края анти-HCV имели 17.2, 21.0 и 35.1% соответственно. В группе больных хроническим гепатитом - 69.5%.

• Отрицательными в ИФА на маркеры гепатитов оказались 14.6% больных острым гепатитом и 11.6% больных хроническим гепатитом. Доля таких пациентов растет с увеличением возраста и составляет 8.8% среди лиц моложе 25 лет и 51.4% в возрастной группе старше 60 лет. ПЦР анализ позволил определить этиологию гепатита в 32.7% и 78.9% случаев в группах с острым и хроническим гепатитом соответственно.

На территории сибирских регионов преобладает генотип D HBV, доля которого в обследованных популяциях составила 97.6% (генотип А - 1.6% и генотип С - 0.8%).

Генотипическое разнообразие изолятов HCV (п=818), циркулирующих в Сибири, ограничено четырьмя субтипами: lb, 2а, 2с, За, среди которых превалируют субтипы lb (54.6%) и За (36.9%), субтипы 2а и 2с встречаются с частотой 7.9%. Выявлено четыре рекомбинантных изолята генотипов 2k/lb (2) и 2а-2с/1Ь (2). Генотипическое разнообразие HCV не одинаково в разных возрастных группах. С ростом среднего возраста респондентов происходит снижение доли генотипа 3 с 40% в группе 18-25 лет до 5% среди лиц старше 50 лет и увеличение доли генотипа 1 с 52% в группе 18-25 лет до 90% среди лиц старше 50 лет.

Частота встречаемости РНК HGV среди пациентов МГНД (п=500) составила 33.6%. Частота ко-инфекции с HCV составляла 42.9%, (OR=2.26). Все генотипированные изоляты HGV (п=78) относятся ко 2 генотипу, найден только один изолят 4 генотипа.

Общим и наиболее значимым фактором риска парентеральных гепатитов В, С и G, а также смешанных инфекций В+С и C+G в Сибири является внутривенное употребление наркотиков (OR=1.74-175.3). Основной путь заражения - использование общих шприцев и игл (OR=2.26). Среди наркотических препаратов внутривенного употребления наибольшее распространение имеет «ханка» (80.57%), вторым по значимости является героин (45.85%). Употребление героина (OR=l,4) является менее опасным фактором, чем употребление <«анки» (OR=2.4).

Половой путь передачи HBV, HGV и, что особенно важно, HCV оказался статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах. Факторами риска являлись: количество половых партнеров больше или равно 3 в последние 6 месяцев до заболевания (OR=l .68-2.88), половые контакты с ПИН и партнерами с гепатитом в анамнезе (OR=l.66-2.25). Инвазивные медицинские процедуры также являлись факторами риска заражения гепатитами В и С в 2001-2002 гг: переливание крови (OR=2.45-11.3), эндоскопия и зондирование (OR=1.3-1.6). Хирургические операции и большое количество инъекционных процедур (>10) при госпитализациях

достоверно увеличивали риск гепатита С (011=1.31 и 2.5), но не являлись факторами риска в отношении гепатита В.

• Низкий социально-экономический статус был ассоциирован с повышенным риском инфицирования НВУ, НСУ и НвУ, но набор факторов варьировал для разных гепатитов. Гепатиты В и в - статус безработного ((Ж=4.46 и 2.0); гепатиты В и С - пребывание в тюрьме (011=2.5 и 3.25), наличие татуировок (011=1.5 и 2.16), употребление крепких напитков (СЖ=1.4 и 1.32). Гепатит В -посещение маникюрного кабинета (011=1.65) и бытовые контакты (011=1.63).

• Вакцинация против НВУ инфекции является достоверно значимым фактором защиты (011=0.47) в группе медработников, где выборка вакцинированных на момент нашего исследования была наиболее высока (п=135).

3) Оценка состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В показала, что протективный уровень анти-НВя (>10МЕ/л) через 5 лет после полного курса вакцинации имеют только 60% вакцинированных, при этом 48.1% из них обладают и клеточным иммунитетом (индекс НВвАя-стимуляции лимфоцитов более 2-х). В группе вакцинированных с отсутствием протективного уровня антител число лиц с клеточным иммунитетом достоверно выше и составляет 72.2%.

4) Пептидное сканирование Е1 и Е2 белков сибирских изолятов НСУ генотипов 1Ь, 2а/2с и За (п=45) выявило консервативные высокоиммуногенные эпитопы в позициях а.о.: 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400, 430-440, 680-690 (Е2 белок). Наибольшие межгенотиповые различия были зарегистрированы в позициях а. о. 280-290 (Е1), 410-430 и 520-540 (Е2).

5) Проведен сравнительный функциональный анализ рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 НСУ, полученных в клетках млекопитающих с помощью двух вирусных систем экспрессии - вирусы Синдбис и осповакцины.

Показано, что:

• иммунохимические свойства Е1 и Е2 НСУ белков из системы вируса осповакцины в большей степени соответствуют природным аналогам, чем белки вируса Синдбис - связывание с НСУ-позитивньши сыворотками человека в ИФА и иммуноблот анализе составляло (100 и 78)% и (100 и 46)%, соответственно;

• белки, экспрессированные вирусом осповакцины, обладали большей иммуногенностью для мышей и большим разнообразием антигенного профиля (10 детерминант) по сравнению с белками вируса Синдбис (3 детерминанты);

• мажорные иммуногенные эпитопы рекомбинантных белков индуцировали антитела, не обладающие нейтрализующими свойствами.

6) Выявлены два новых вируснейтрализующих эпитопа в позициях а.о. 264-318 (El) и 496-515 (Е2), первый из которых оказался генотип-специфическим, а второй обладал перекрестной активностью. Пептиды, соответствующие данным эпитопам, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов анти-HCV вакцин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах

1. Kochneva G.V., Sivolobova G.F., Grazdantseva A.A., Shustov A.V., Gavrilova I.V., Nesterov A.E., Streltsova M.A., Paltsev A.I., Loktev A.V., Maksyutov A.Z., West E., Netesov S.V. and Ryder R.W. The prevalence and risk factors of hepatitis С virus and hepatitis В virus infections among health care workers in Novosibirsk region hospitals. // Antiviral Therapy. - 2000. - Vol. 5 (Suppl. 1). - P.31-32.

2. Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Гаврилова И.В., Нестеров А.Е., Стрельцова М.А., Пальцев А.И., Локтев A.B., Максютов А.З., Акинфеева JI.A., Торшин В.П., West Т.Е., Нетесов C.B., Ryder R.W., Онищенко Г.Г. Частота встречаемости маркеров гепатита С и факторы риска у персонала больниц Новосибирской области. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2002. - № 2. - С.26-32.

3. Баяндин Р.Б., Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Акинфеева JI.A., Ракова И.Г., Алешина М.В., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов B.C., Нетесов C.B. Генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В у отдельных групп населения Новосибирской области. Н Инфекционные болезни. -2004.- №3. - С.39-44.

4. Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Гаврилова И.В., Акинфеева Л.А., Ракова И.Г., Алешина М.В., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов B.C., Zelicoff А.Р., Нетесов C.B. Частоты встречаемости маркёров, распределение генотипов и факторы риска вирусного гепатита С среди некоторых групп населения Новосибирской области. // Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии (ЖМЭИ). - 2004. - №5. - С.20-25.

5. Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Шустов A.B., Гаврилова И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г., Нетесов C.B. Этиология острых гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. // Инфекционные болезни. -2005. - Т. 3. - №1. - С.26-31.

6. Качко A.B., Ершов А.Е., ГавриловаИ.В., Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Букин В.Н., Комиссарова М.А., Нетесов C.B. Частота встречаемости РНК HGV/GBV-C и факторов риска у пациентов наркологического диспансера Новосибирска. И Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии (ЖМЭЙ). - 2005. - № 2. - С.25-30.

7. Shustov А.V., Kochneva G.V., Sivolobova G.F., Grazhdantseva A.A., Gavrilova I.V., Akinfeeva L.A, Rakova I.G., Aleshina M.V., Bukin V.N., Orlovsky V.G., Bespalov V.S., Robertson B.H., Netesov S.V. Molecular epidemiology of the hepatitis С virus in Western Siberia. // J. Med. Virol. - 2005. - Vol. 77(3). - P.382-389.

8. Мануйлов B.A., Нетесова И.Г., Осипова Л.П., Шустов A.B., Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Нетесов C.B. Генетическая вариабельность изолятов вируса гепатита В у населения Шурышкарского района Ямало-Ненецкого Автономного Округа. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2005. - №4. -С.30-34.

9. Гаврилова И.В., Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Алёшина М.В., Сахарова Е.Г., Толоконская Н.П., Нетесов C.B. Факторы риска заражения больных гепатитом С в инфекционных больницах Новосибирска. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2005. - №6. - С.28-33.

10. Матрос О.И., Гранитов В.М., Кочнева Г.В., Шустов A.B., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Чуб Е.В., Нетесов C.B.. Особенности вирусных гепатитов в Алтайском крае в первые годы XXI века: клиника и эпидемиология. // Российские медицинские вести. - 2005. - №3. - С.57-60.

11. Терновой В.А., Чаусов Е.В., Бондаренко Т.Ю., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Нетесов C.B. Изучение генетического разнообразия вируса гепатита А в Западной Сибири. // Вопросы вирусологии. - 2006. - № 51(1). - С.23-27.

12. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Кочнева Г.В., Святченко В.А., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Киселев H.H., Сахарова Е.Г., Нетесов C.B. Выявление вируса гепатита Е при остром гепатите в Сибири. // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. - 2007. - № 3. - С.3640.

13. Баяндин Р.Б., Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Локтев В.Б., Гранитов В.М., Нетесов C.B. Частота обнаружения маркеров, генотипы вируса и факторы риска гепатита В у пациентов инфекционного отделения городской больницы Барнаула. К Инфекционные болезни. - 2007. - Т.5. -№1.-С.5-10.

14. Гаврилова И.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Баяндин Р.Б., Нетесов C.B. Распространенность, генотипическое разнообразие и факторы риска гепатита С среди больных с хроническими вирусными гепатитами в Новосибирской области. // Инфекционные болезни. - 2007. - Т.5. - № 3. - С.9-15.

15. Чуб Е.В., Кочнева Г.В., Гранитов В.М., Нетесов C.B. Ре комбинаты вируса гепатита С типа 2k/lb у населения Алтайского края. // Инфекционные болезни. -2007. -Т.5. - №4. - С.5-11.

16. Гражданцева A.A., Носарева О.В., Нестеров А.Е., Сиволобова Г.Ф., Локтева Л.И., Алейников Р.П., Кузубов В.И., Кочнева Г.В. Изучение показателей иммунитета при вакцинации против гепатита В. // Эпидемиология и В акцинопрофил агогика. -2008. - №5. - С.40-46.

17. Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Лупан Т.А., Разумов И.А., Швалов А.Н., Локтев В.Б., Кочнева Г.В. Выделение и иммунохимическая харакгеризация поверхностных гликопротеинов El и Е2 вируса гепатита С, экспрессированных в клетках млекопитающих. Достижения современной биотехнологии. // Сборник научных трудов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под ред. д.м.н., проф. Дроздова И.Г. - 2008. - Новосибирск. - С.250-259.

18. Кочнева Г.В., Чуб Е.В., Гранитов В.М., Матрос О.И., Кпиновенко Н.Г., Хорошилова И.А., Нетесов C.B. Обнаружение природных рекомбинантных вариантов вируса гепатита С в Алтайском крае и Новосибирской области. // Актуальные вопросы инфекционной патологии. Юбилейный сборник научных работ, посвященный 50-летию кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет». - 2009. - Барнаул. -С.147-153.

19. Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Major M., Чуб Е.В., Швалов А.Н., Юдин П.В., Нетесов C.B., Локтев В.Б., Кочнева Г.В. Полноразмерный пептидный анализ антигенного профиля поверхностных белков сибирских изолятов вируса гепатита С. //Медицинская иммунология. - 2010. - Т. 12. - № 1-2. - С.115-124.

Тезисы или статьи в сборниках конференций

1. Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Гаврилова И.В., Нестеров А.Е., Пальцев А.И., Максютов А.З., Акинфеева Л.А., Торшин В.П., Райдер Р.У. Факторы риска и генотипическое разнообразие изолятов вируса гепатита С у персонала больниц Новосибирской области // IV Конф. по вирусным гепатитам В, С и Д. - Москва. - 2001. - С. 15.

2. Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Гаврилова И.В., Акинфеева Л.А., Ryder R.W. Влияние характеристик серологической тест-системы на результат эпидемиологического исследования // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Тезисы 2-й науч. конф. с междунар. участием. - Новосибирск. - 2002. - С. 62.

3. Шустов A.B., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Кочнева Г.В., Гаврилова И.В., Баяндин Р.Б., Акинфеева Л.А., Зеликов А. Распространенность и факторы риска заболевания вирусными гепатитами В и С среди медицинских работников больниц Новосибирской области // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Тезисы 2-й науч. конф. с междунар. участием. - Новосибирск. - 2002. - С. 63.

4. Shustov А.V., Sivolobova G.F., Grazdantseva A.A., Kochneva G.V., Gavrilova I.V., Bayandin R.B., Akinfeeva L.A., Zelicoff A., Netesov S.V. The Prevalence and Risk Factors of HCV and HBV Infections Among Health Care Workers in Novosibirsk Region Hospitals // XHth International Congress of Virology. Abstracts. - 2002. - P. 343.

5. Нетесов C.B., Шустов A.B., Гаврилова И.В., Терновой В.А., Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Маркович H.A., Гранитов В.М., Губанова Л.И., Сахарова Е.Г. Вирусные гепатиты в Западной Сибири за сорок лет в сравнении с данными по России и другим странам // Сборник трудов V Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики». - Москва. - 2003. - С. 206-207.

6. Шустов A.B., Гаврилова И.В., Терновой В.А., Рудзевич Т.Н., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Фаворов М.О., Робертсон Б. Дж., Нетесов C.B. Генотипы вирусов А, В и С, циркулирующих среди населения Западной Сибири // Сборник трудов V Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики». - Москва. - 2003. - С. 352-353.

7. Shustov А.V., Gavrilova I.V., Ternovoi V.A., Rudzevich T.N., Chub E.V., Bayandin R.B., Kochneva G.V., Grazhdantseva A.A., Sivolobova G.F., Favorov M.O. and Netesov S.V. Genotypes of hepatitis А, В, and С viruses circulating in the population of Western Siberia // 6-ой ежегодный съезд Европейского Общества Клинической Вирусологии и 8-ая Конференция по Современной ситуации в области Хронических Вирусных Гепатитов. - Лион (Франция). - 2003.

8. Гаврилова И.В., Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Алешина М.В., Сахарова Е.Г., Толоконская Н.П. Частота встречаемости маркеров, распределение генотипов и факторы риска вирусного гепатита С среди пациентов инфекционных больниц г. Новосибирска// Материалы международного междисциплинарного конгресса «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека». -Судак (Украина). - 2004. - С. 87-88.

9. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Бондаренко Т.Ю., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A. Генетическое разнообразие вируса гепатита А в Сибири // Материалы международного междисциплинарного конгресса «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека». -Судак (Украина). - 2004. - С. 154 -155.

10. Шустов A.B., Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Ракова И.Г., Алешина М.В., Гаврилова И.В., Чуб Е.В., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Сахарова Е.Г., Гранитов В.М., Губанова Л.И. Предварительные итоги сторожевого надзора за острыми вирусными гепатитами в трех городах Западной Сибири: Новосибирске, Барнауле и Иркутске II Материалы международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». - Сосновка, Новосибирская обл. - 2004. - Новосибирск: ЦЭРИС, 2004.-С. 301-302.

11.0.И.Матрос, Г.В.Кочнева, Е.В.Чуб, Г.Ф.Сиволобова, А.А.Гражданцева, А.В.Шустов, В.М.Гранитов, С.В.Нетесов. Генотипическое разнообразие изолятов вируса гепатита С в Алтайском крае // Сборник трудов 5-ой всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». -Москва. - 2004. - Т. 1. - С. 254-256.

12. Баяндин Р.Б., Шустов A.B., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Акинфеева Л.А., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов B.C., Нетесов C.B. Генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом

гепатита В среди некоторых групп населения Новосибирска // Тезисы 1-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». -Москва. - 2004. - С. 21-22.

13. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Нетесов C.B. Выявление случаев гепатита Е в западной Сибири // Материалы Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний». - Сосновка (Новосибирская обл.). - 2005. - С. 78.

14. Чуб Е.В., Шустов A.B., Кочнева Г.В., Нетесов C.B. Генотипы изолятов вируса гепатита С у больных острыми гепатитами в г. Барнауле Алтайского края и выявление ВГС-рекомбинантов // Материалы Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний». - Сосновка (Новосибирская обл.). - 2005. - С. 80.

15. Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Шустов A.B., Плясунов И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева JI.A., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г. Молекулярное разнообразие геномов вирусов гепатитов А, В, С, Е и его диагностическое, клиническое и эпидемиологическое значение // Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине». - Новосибирск. - 2005. - С. 62.

16. Баяндин Р.Б., Шустов A.A., Ершов А.Е., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Акинфеева Л.А., Ракова И.Г., Алешина М.В., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов B.C.. Гранитов В.М.. Нетесов C.B. Частота встречаемости маркеров, генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В у отдельных групп населения Новосибирска и Барнаула // Тезисы Ш Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». - Новосибирск. - 2006. - С. 37.

17. Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Плясунова И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М.. Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г., Нетесов C.B. Этиология гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. // Тезисы Ш Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». - Новосибирск. - 2006. - С. 44.

18. Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Нетесов C.B. Частота встречаемости маркеров, генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В у отдельных групп населения Новосибирска и Барнаула // Материалы Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней». - Минск. -2007. - С. 82-83.

19. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Нетесов C.B. Выявление случаев гепатита Е в Западной Сибири // Материалы международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков». - Алматы (Казахстан). -2006.-С. 223-224.

20. Чуб Е.В., Kurbanov F., Mizokami M., Кочнева Г.В., Нетесов C.B. Обнаружение . рекомбинантных вариантов вируса гепатита С в Сибири и разработка ПЦР-

системы для их идентификации И Материалы Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней». - Минск. - 2007. - С.83-84.

21. Кочнева Г.В., Баяндин Р.Б., Мануйлов В.А., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов C.B. Молекулярно-генетическое разнообразие изолятов вируса гепатита в и факторы риска передачи вирусного гепатита В в регионах Азиатской части России» // Материалы Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». - Санкт-Петербург. - 2008. - С. 435.

22. Chub Е., Kochneva G., Manuilov V., Sivolobova G., Grazhdantseva A., Kurbanov F., Tanaka Y., Mizokami M., Netesov S. Hepatitis С virus recombinants type 2k/lb were found in Siberia, Russia // XIV International Congress of Virology. - 2008. - Istanbul (Turkey). - P. 284.

23. Bayandin R., Kochneva G., Netesov S. Isolates genotypic variability and risk factors of HBV infection among different groups of Novosibirsk and Barnaul population // XIV International Congress of Virology. - 2008. - Istanbul (Turkey). - P. 278.

24. Plyasunova I., Kochneva G., Sivolobova G., Grazhdantseva A., Bayandin R., Netesov S. The prevalence, distribution of genotypes and risk factors of Hepatitis С virus in patiens with chronic Hepatitis in Novosibirsk region // XIV International Congress of Virology. - 2008. - Istanbul (Turkey). - P. 280.

25. Kachko A., Kochneva G., Sivolobova G., Grazhdantseva A, Lupan T., Wells F., Merchlinsky M., Ivanova A, Shvalov A., Loktev V., Netesov S., Major M. Mammalian expression systems used to produce recombinant HCV envelope glycoproteins influence the immunogenicity and antibody profile induced // 16th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses. - Nice (France). - 2009. -P. 121.

26. Kachko A, Kochneva G., Sivolobova G., Grazhdantseva A, Lupan T., Zubkova I., Wells F., Merchlinsky V., Williams O., Ivanova A., Shvalov A, Loktev V., Netesov S. and Major M. New neutralizing antibody epitopes in hepatitis С virus envelope glycoproteins are revealed by dissecting peptide recognition profiles // American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) annual meeting. - Boston (USA), - 2010.

Кочнева Галина Вадимовна Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России. Автореф. дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук

Усл. печ. л. 2. Тираж 100 экз. Отпечатано в центре оперативной полиграфии ИП. Нестеров. П.Н. 630084 г. Новосибирск, ул.Кропоткина, 555

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кочнева, Галина Вадимовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирусный гепатит В.

1.1.1. Вирус гепатита В (НВV).

1.1.2. Генотипы вируса гепатита В.

1.1.3. Эпидемиология вирусного гепатита В.

1.1.4. Вакцинация против НВV.

1.2. Вирусный гепатит С.

1.2.1. Вирус гепатита С (НСУ).

1.2.2. Вариабельность НСУ.

1.2.3. Эпидемиология вирусного гепатита С.

1.2.4. Особенности иммунного ответа при инфекции НСУ.

1.2.5. Методы культивирования НСУ.

1.3. Вирусный гепатит в.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России"

Актуальность темы

К парентеральным вирусным гепатитам в настоящее время относят гепатиты В, С, О и О. Этиологическая роль в развитии гепатита других вирусов с доказанным парентеральным путем передачи, например ТТУ и 8ЕЫУ, пока однозначно не выяснена. В Российской Федерации официальной регистрации подлежат вирусные гепатиты В, С и О. Исследования вирусного гепатита в до сих пор носят поисковый характер. Различают три клинические формы парентеральных вирусных гепатитов: острый гепатит, хронический гепатит и носительство, В оценке заболеваемости каждой из этих форм имеются значительные трудности. Так официально регистрируемые случаи острых гепатитов не в полной мере отражают реальную картину заболеваемости, что в основном связано с бессимптомным течением острых гепатитов (особенно это характерно для гепатита С) и со сложностью дифференциальной диагностики острой инфекции от случаев обострения хронического гепатита. Официальные данные по выявлению хронических гепатитов также являются неполными, поскольку наряду с ежегодно впервые выявленными больными с манифестными формами хронических гепатитов В и С регистрируют большую когорту бессимптомных носителей вирусов. Так, например, индекс заболеваемости вирусным гепатитом С составлял 16.7/100000 в 2001 и 7.2/100000 в 2002гг (период нашего исследования), а количество вновь выявляемых носителей в то же время было значительно больше - 126.3/100000 в 2001 и 123.1/100000 в 2002 году[8].

Изучению вопросов молекулярной эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов в России долгое время уделялось мало внимания. Не было единого подхода в проведении эпидемиологических исследований, большинство результатов было получено на основе данных официальной статистики, что может не являться отражением реальной картины заболеваемости. В США, например, данные официальной статистики по заболеваемости гепатитами считаются в 3-5 раз ниже реальных (www.cdc.gov/hepatitis/Statistics.htm).

В период наибольшего роста заболеваемости гепатитами В и С (до 20002001 гг.) некоторые авторы предпринимали попытки проанализировать имеющиеся официальные данные по заболеваемости с целью выявления групп риска, путей передачи парентеральных гепатитов и их соотношения на разных территориях Российской Федерации [7, 9, 10, 15, 346]. Однако сделанные выводы основывались только на изучении встречаемости серологических маркёров в скрининговых тестах без привлечения подтверждающих тестов и ПЦР анализа по причине их высокой стоимости и весьма ограниченного применения в Российской Федерации в то время. Проведённые к 2001 году работы по эпидемиологии гепатитов В и С с привлечением используемых за рубежом молекулярно-эпидемиологических подходов, таких как подтверждающие серологические тесты, ПЦР анализ, генотипирование были единичными в России и охватывали в основном население европейской части страны, тогда как популяции регионов. России, расположенные за Уралом, были исследованы совершенно недостаточно [И, 13, 199]. Крупномасштабных исследований по генотипированию вируса гепатита В до публикации результатов наших работ в 2003 году в Российской Федерации вообще не проводилось [29].

Молекулярно-эпидемиологические исследования вирусного гепатита в в России и до сих пор носят чрезвычайно редкий и эпизодический характер. До получения наших данных все описанные случаи инфекции вирусом гепатита в были зарегистрированы только в европейской части РФ [18,19, 419].

Структура и соотношение факторов риска инфицирования парентеральными вирусными гепатитами в России также были изучены недостаточно, в более чем 30% случаях факторы риска оставались не идентифицированными [7, 19]. Кроме того, выводы о значимости тех или иных факторов риска строились лишь на сравнении процентов инфицированных среди некоторых популяционных групп или основывались только на данных эпидемиологического анамнеза без использования специально разработанных программ для обработки эпидемиологических данных (Epilnfo, SPSS), которыми пользуются зарубежные учёные.

В связи с тем, что в России не проводилось молекулярно-эпидемиологических исследований вирусных гепатитов с использованием современных международно-признанных подходов, в 2001 году в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» нами был начат цикл работ, направленных на изучение распространенности, факторов риска, генотипического разнообразия парентеральных вирусных гепатитов В, С и G на территории Сибири. Исследования были проведены с привлечением рекомендованных ВОЗ методов и подходов: в диагностике (подтверждающие серологические тесты, ПЦР анализ), в генотипировании (филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей), в обработке собранных эпидемиологических и молекулярно-биологических данных (использование программ Epilnfo, SPSS).

Наши молекулярно-эпидемиологические исследования проходили на рубеже второго тысячелетия, когда Россия пережила резкий скачок заболеваемости вирусным гепатитом В с 18.1 случаев на 100 тыс. населения в 1992 до 43.8-42.5 случаев в 1999-2000 годах [8]. Это было во многом связано с широким распространением наркотиков среди молодежи и активизацией полового пути передачи инфекции. В последующие годы ситуация изменилась, и началось значительное снижение заболеваемости гепатитом В в России: в 2001 она составила 34.9, в 2002 году - 19.7, в 2007 снизилась до 5.26, в 2008 году индекс заболеваемости составил 4.04/100,000 и, наконец, в 2009 году упал ниже запланированного уровня 3 и составил 2.7/100,000 [8, www.fcgsen.ru]. Такое значительное снижение заболеваемости стало возможным благодаря организованной государственными структурами борьбе с распространением и употреблением наркотиков и включению с 2001 года тотальной вакцинации новорожденных против гепатита В в национальный календарь профилактических прививок (Приказ МЗ РФ N 229 от 27.06.2001), а затем - с 2006 года - массовой вакцинации населения до 55 лет в рамках национального проекта «Здоровье» [17].

Создание в 1980 году в США рекомбинантной вакцины против гепатита В стало возможным благодаря уникальным свойствам поверхностного белка вируса гепатита В - HBsAg. Этот белок обладает перекрестной активностью за счет наличия общей антигенной детерминанты «а», проявляет способность к самосборке вирусоподобных частиц in vitro и индуцирует синтез протективных антител in vivo. В состав современных вакцин против гепатита В входит продуцируемый дрожжевыми клетками рекомбинантный HBsAg. Установлено, что иммунный ответ на введение таких вакцин зависит от возраста вакцинируемых (наилучшим он был у лиц до 30 лет), наличия/отсутствия у них вредных привычек (курение, прием наркотиков и др.), а также от наличия/отсутствия у них ожирения и иммуносупрессивных : заболеваний [29]. Кроме того ответ на вакцинацию слабее у хронически инфицированных вирусным гепатитом С, больных диабетом и некоторыми другими хроническими заболеваниями [Материалы IV Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D — проблемы диагностики, лечения и профилактики», Москва, 2001]. В связи с вышесказанным возникает необходимость тщательного индивидуального анализа поствакцинального иммунного статуса у лиц в гетерогенных по всем вышеперечисленным признакам группах риска. Персонал ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» представляет такую гетерогенную группу риска, вакцинированную в связи с проведением работ с вирусами гепатитов на территории нашего института.

С самого начала вакцинации против гепатита В и до настоящего времени идет накопление данных о длительности и стойкости поствакцинального иммунитета, о необходимости и сроках ревакцинации. Считается, что лица, получившие полный курс вакцинации против гепатита В и ответившие на него образованием специфических антител в защитной концентрации, сохраняют иммунитет в течение не менее 15 лет. Отмечается также, что поствакцинальный иммунитет может сохраняться и при исчезновении из крови антител к НВбА§ - благодаря активности клеток иммунологической памяти [146]. Вместе с тем, мировым медицинским сообществом признается необходимость проведения дальнейших исследований по определению контингентов, подлежащих ревакцинации, а также сроков ее проведения у них. К таким контингентам, прежде всего, относятся группы лиц, имеющие постоянный профессиональный.контакт с кровыо и другим инфекционным материалом. Эти лица имеют высокую вероятность инфицирования вирусом гепатита В при снижении концентрации анти-ЫВБ ^О в крови. С целью оценки напряженности поствакцинального иммунитета и прогноза необходимости ревакцинации нами было проведено исследование анти-НВБ и индекса HBsAgиндуцированной стимуляции лимфоцитов (клетки иммунологической памяти) у сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и медицинских работников стационарных отделений больниц г. Новосибирска, которые, несомненно, относятся к вышеперечисленным группам риска.

Создание вакцины против гепатита С - одна из самых насущных задач мирового здравоохранения. Её решение сдерживается рядом факторов, в числе которых высокая вариабельность генома вируса на популяционном уровне (генотипы) и на уровне инфицированного индивида (квазивиды), сложность и малая доступность лабораторных моделей для экспериментов по нейтрализации, отсутствие восприимчивых животных (кроме шимпанзе). Наибольшая вариабельность наблюдается в поверхностных белках Е1 и Е2 вируса гепатита С [380], однако антитела именно к этим белкам обладают вируснейтрализующей активностью [441]. Роль вируснейтрализующих антител в защите от инфекции вирусом гепатита С не ясна до сих пор. Такие антитела в больших титрах выявляются в сыворотке хронически инфицированных людей и шимпанзе [248], но в ряде случаев была доказана связь между появлением вируснейтрализующих антител в острой фазе инфекции и последующей очисткой организма от вируса [129, 238, 324].

В настоящее время идет накопление данных о том, какие районы поверхностных белков вируса гепатита С индуцируют синтез антител с широким спектром действия, способных нейтрализовать различные генотипы и субтипы вируса. Особенность поверхностных белков вируса гепатита С состоит также и в том, что зачастую рядом с вируснейтрализующим эпитопом расположен не нейтрализующий высокоиммуногенный эпитоп, антитела к которому образуются раньше в процессе инфекции, и комплекс этих антител с не нейтрализующим эпитопом блокирует нейтрализацию вируса [447, 448]. Таким образом, при создании вакцины исследователям необходимо одновременно решать две проблемы, первая из которых состоит в поиске кандидатных вакцинных эпитопов, обладающих вируснейтрализующей и протективной активностью, а вторая - в повышении эффективности презентации этих эпитопов иммунной системе. В последнем случае важно решать вопрос по сохранению, удалению или замене окружающих эпитоп аминокислотных последовательностей, которые могут индуцировать синтез блокирующих антител.

С целью выявления новых вируснейтрализующих эпитопов и оценки их иммуногенных свойств нами был проведен сравнительный функциональный анализ антител, индуцированных рекомбинантными гликопротеинами Е1 и Е2 вируса гепатита С, полученными в клетках млекопитающих с помощью двух экспрессирующих векторов: Синдбис вирус (альфавирус с РНК геномом позитивной полярности) и вирус осповакцины (ортопоксвирус с ДНК геномом).

В целом, несмотря на некоторые успехи, создание универсальной вакцины для такого вариабельного вируса, каким является вирус гепатита С, представляется чрезвычайно сложной задачей. Создание же кандидатных вакцинных препаратов, эффективных в отношении отдельных генотипов вируса гепатита С, может реализоваться значительно быстрее. Возможность применения и оценка эффективности использования таких препаратов для профилактики гепатита С в определённых группах лиц и на определенной территории будет зависеть от результатов соответствующих молекулярно-эпидемиологических исследований и, в частности, от знания превалирующих генотипов вируса. В связи с этим организация и проведение постоянного «сторожевого» мониторинга генетического разнообразия вируса гепатита С на конкретной территории и в конкретных группах чрезвычайно важно как с точки зрения работы по созданию вакцин, так и для клинического испытания кандидатных вакцинных препаратов.

Для достижения этой цели решались следующие задачи: I) Организация и проведение молекулярно-эпидемиологических исследований гепатитов В, С и О в Новосибирской, Иркутской областях и Алтайском крае:

• анализ сывороток крови с обязательным использованием двух типов ИФА - скриниигового и подтверждающего;

• генотипирование изолятов HBV, HCV и HGV с использованием наиболее репрезентативных районов вирусного генома;

• создание баз данных в формате Epilnfo, включающее перенос информации со всех бумажных и инструментальных носителей -результаты анкетирования, ИФА, Г1ЦР и генотипирования изолятов; данные выписки из истории болезни в случае пациентов стационаров - в структурированный электронный формат;

• выявление статистически значимых факторов риска инфицирования HBV, HCV и HGV.

• формирование группы участников исследования из сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», вакцинированных против вирусного гепатита В как группы риска инфицирования;

• оценка применяемой схемы вакцинации и ревакцинации против гепатита В на основе полученных данных.

3) Сравнительный функциональный анализ антител, индуцированных нативными (у инфицированных людей) и рекомбинантными (у иммунизированных мышей) гликопротеинами El и Е2 вируса гепатита С:

• получение рекомбинантных белков Е1 и Е2 НСУ в клетках млекопитающих с помощью двух экспрессирующих систем -вирусов Синдбис и осповакцины, сравнение их иммунохимических свойств и антигенного профиля;

• картирование вируснейтрализующих линейных эпитопов рекомбинантных белков Е1 и Е2 НСУ и оценка их перекрестной активности.

Научная новизна. В данной работе в соответствии с международными стандартами впервые проведено крупномасштабное молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов В, С и С на территории Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края.

Созданы три уникальные электронные базы данных в формате ЕрПп£о, содержащие эпиданамнез и результаты иммуно- и генодиагностики гепатитов В, С и в среди 5605 представителей разных групп населения Сибирского региона России. В исследование были вовлечены пациенты инфекционных больниц и наркологической клиники; медицинские работники ряда крупных городских и сельских больниц; группы, сформированные по принципу места проживания или места работы.

Впервые получены данные по встречаемости маркеров НВУ, НСУ и НвУ среди представителей разных групп населения трех регионов Сибири. Оценена роль НВУ и НСУ в этиологии острых и хронических гепатитов на обследованной территории.

С использованием созданных электронных баз данных и статистических мощностей программы Ер11пГо-2007 впервые проведена количественная оценка факторов риска инфицирования гепатитами В, С и О в период с 2001 по 2003 гг. Силу статистической связи между каждым фактором риска и статусом по инфекции выражали с помощью отношения шансов (OR, odds ratio).

Впервые проведен анализ генотипического разнообразия сибирских изолятов HBV и IiGV, а в случае HCV показано, что встречаемость генотипов существенно различается в разных возрастных и популяционных группах.

Получены новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В. Показано, что клеточное звено вносит существенный вклад в развитие поствакцинального иммунного ответа.

В рамках работы по созданию белковых вакцин против гепатита С был проведен сравнительный анализ двух эукариотических систем экспрессии генов поверхностных гликопротеинов HCV с целью получения белков, наиболее адекватных природным аналогам. Впервые показано, что в одних и тех же клетках млекопитающих (BHK-F) рекомбинантные белки El и Е2 I-ICV, полученные в системе экспрессии вируса осповакцины (VV), существенно отличаются от аналогичных белков, полученных в системе вируса Синдбис (SIN). Хотя оба препарата белков индуцируют синтез антител к поверхностным гликопротеинам HCV, иммунный ответ к VV-экспрессированным белкам был выше и обладал большей универсальностью в отношении разных генотипов HCV, чем иммунный ответ к SIN-экспрессированным белкам.

Полученные новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В позволили предложить ряд рекомендаций по проведению ревакцинации в гетерогенных по возрасту, состоянию здоровья, привычкам и степени опасности группах риска инфицирования НВУ.

Проведенный сравнительный функциональный анализ рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 НСУ показал, что иммунохимические свойства этих белков могут существенно зависеть от системы экспрессии. Причем эффективность продукции, на которую, обычно, исследователи обращают внимание в первую очередь, может быть одинаковой, а свойства белков разные. Данный факт необходимо учитывать при планировании экспериментальных работ с аналогичными мембран-связанными • гликозилированными белками.

Картирование позиций высокоиммуногенных линейных эпитопов поверхностных белков Е1 и Е2 сибирских изолятов ПСУ может быть использовано для совершенствования региональной диагностики гепатита С.

Положения, выносимые на защиту:

1. Внутривенное употребление наркотиков является основной причиной заболеваемости парентеральным вирусным гепатитом С (ОК=27.3) и смешанной инфекцией НСУ и НВУ (011=10.0) на территории сибирских регионов России в период 2001-2002 гг. Вторым по значимости фактором риска являются инвазивные медицинские процедуры, наибольшую опасность из которых представляет переливание крови (011=3.8-11.3). Половой путь передачи НВУ, 1-ЮУ и, что особенно важно, НСУ является статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах (011=1.66-2.88).

2. При наличии клинических проявлений гепатита и отрицательных результатах ИФА на известные вирусные маркеры, необходимо проведение ПЦР-анализа для выявления геномов наиболее распространенных вирусных гепатитов. Такой подход позволяет дополнительно диагностировать 32.7% случаев острого гепатита и 78.9% случаев хронического гепатита в группах «безмаркерных» пациентов.

4. Геиотипирование изолягов НСУ (п=818) по двум противоположным районам генома 5'иТЯ и N856 выявило четыре рекомбинантных изолята с генотипами 2к/1Ь (2) и 2а-2с/1Ь (2), что ранее являлось крайне редким явлением вследствие генотипирования только по одному району генома -5'1Гт.

5. Через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В в группе, где концентрация защитных антител была ниже протективного уровня (<10МЕ\л), положительный индекс HBsAg стимуляции лимфоцитов определялся в 72.2% случаев, что достоверно выше (р < 0.05), чем в группе с протективным уровнем анти-НВз (48.1%). Это свидетельствует о важности оценки клеточной составляющей иммунитета при разработке стратегии вакцинации и ревакцинации.

6. Полноразмерное пептидное сканирование антигенного профиля поверхностных белков Е1 и Е2 выявило существенные различия, характерные для сибирских изолятов 1Ь, 2а/2с и За генотипов НСУ. Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. Этот факт необходимо учитывать при разработке вакцин против гепатита С.

7. Иммуногенные свойства рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 НСУ существенно зависят от эукариотической системы экспрессии, в которой эти белки продуцируются. Рекомбинантные белки, полученные в системе экспрессии вируса осповакцины, обладают большей иммуноадекватностыо природным белкам, чем гликопротеины, полученные в системе экспрессии вируса Синдбис.

8. Пептиды, соответствующие новым вируснейтрализующим - линейным эпитопам в позициях а.о. 264-318 рекомбинантного белка Е1 и а.о. 496-515 рекомбинантного белка Е2 НСУ, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов вакцин против гепатита С.

Структура и объем работы

Диссертация построена по монографическому типу и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 337 страницах, включая 43 рисунков, 31 таблицу, 449 библиографических ссылок. Нумерация рисунков и таблиц приводится отдельно для каждой главы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кочнева, Галина Вадимовна

ВЫВОДЫ

1) Впервые на территории Сибири проведено крупномасштабное (п=5605) молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов В, С и в, по результатам которого созданы три электронные базы данных в международном формате ЕрПпАэ.

2) С использованием этих баз данных проведен анализ частоты встречаемости, генотипического разнообразия и факторов риска парентеральных вирусных гепатитов В, С и в среди представителей разных групп населения Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края в период 20012003 гг.

• Частоты выявления иммунологических маркеров НВУ инфекции: среди пациентов поликлиники (п^ОО) положительными на НВзА§ оказались 3.6% пациентов, анти-НВс выявлены у 24.0%; в общей группе медработников (п=500) HBsAg встречался с частотой 5.4%, анти-НВс обнаружены у 22.4% респондентов; частота выявления НВэА§ среди всех пациентов МГНД (п=500) составила 8.4%, антитела к HBcAg встречались у 49.9% пациентов; в группе больных острыми гепатитами Новосибирской (п=1509), Иркутской областей (п=888) и Алтайского края (п=1044) HBsAg встречался с частотой 48.8, 20.6 и 36.5% соответственно; в группе больных хроническим гепатитом (п=164) только 25.6% имели серологические маркеры НВУ инфекции.

• Частоты выявления иммунологических маркеров НСУ инфекции: 48.0%> -среди пациентов Муниципального наркологического диспансера, 5.6% -среди посетителей поликлиники и 5.2% - у медицинских работников больниц Новосибирской обл. В группе больных острыми гепатитами Иркутской, Новосибирской областей и Алтайского края анти-НСУ имели 17.2, 21.0 и 35.1% соответственно. В группе больных хроническим гепатитом - 69.5%.

Отрицательными в ИФА на маркеры гепатитов оказались 14.6% больных острым гепатитом и 11.6% больных хроническим гепатитом. Доля таких пациентов растет с увеличением возраста и составляет 8.8% среди лиц моложе 25 лет и 51.4% в возрастной группе старше 60 лет. ПЦР анализ позволил определить этиологию гепатита в 32.7% и 78.9% случаев в группах с острым и хроническим гепатитом соответственно. На территории сибирских регионов преобладает генотип Б НВУ, доля которого в обследованных популяциях составила 97.6% (генотип А -1.6% и генотип С-0.8%).

Генотипическос разнообразие изолятов НСУ (п=818), циркулирующих в Сибири, ограничено четырьмя субтипами: 1Ь, 2а, 2с, За, среди которых превалируют субтипы 1Ь (54.6%) и За (36.9%), субтипы 2а и 2с встречаются с частотой 7.9%. Выявлено четыре рекомбинантных изолята генотипов 2к/1Ь (2) и 2а-2с/1Ь (2). Генотипическое разнообразие НСУ не одинаково в разных возрастных группах. С ростом среднего возраста респондентов происходит снижение доли генотипа 3 с 40% в группе 1825 лет до 5% среди лиц старше 50 лет и увеличение доли генотипа 1 с 52% в группе 18-25 лет до 90% среди лиц старше 50 лет. Частота встречаемости РНК НвУ среди пациентов МГНД (п=500) составила 33.6%). Частота ко-инфекции с НСУ составляла 42.9%, (ОК=2.26). Все генотипированные изоляты НвУ (п=78) относятся ко 2 генотипу, найден только один изолят 4 генотипа.

Общим и наиболее значимым фактором риска парентеральных гепатитов В, С и О, а также смешанных инфекций В+С и С+в в Сибири является внутривенное употребление наркотиков (ОК= 1.74-175.3). Основной путь заражения - использование общих шприцев и игл (ОК=2.26). Среди наркотических препаратов внутривенного употребления наибольшее распространение имеет «ханка» (80.57%), вторым по значимости является героин (45.85%). Употребление героина (СЖ=1,4) является менее опасным фактором, чем употребление «ханки» (СЖ=2.4).

• Половой путь передачи НВУ, 1-ЮУ и, что особенно важно, НСУ оказался статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах. Факторами риска являлись: количество половых партнеров больше или равно 3 в последние б месяцев до заболевания (011=1.68-2.88), половые контакты с ПИН и партнерами с гепатитом в анамнезе (011=1.66-2.25).

• Инвазивные медицинские процедуры также являлись факторами риска заражения гепатитами В и С в 2001-2002 гг: переливание крови (011=2.45-11.3), эндоскопия и зондирование (011=1.3-1.6). Хирургические операции и большое количество инъекционных процедур (>10) при госпитализациях достоверно увеличивали риск гепатита С (ОЯ=1.31 и 2.5), но не являлись факторами риска в отношении гепатита В.

• Низкий социально-экономический статус был ассоциирован с повышенным риском инфицирования НВУ, НСУ и НвУ, но набор факторов варьировал для разных гепатитов. Гепатиты В и О - статус безработного (011=4.46 и 2.0); гепатиты В и С - пребывание в тюрьме (011=2.5 и 3.25), наличие татуировок (ОЯ=1.5 и 2.16), употребление крепких напитков (011=1.4 и 1.32). Гепатит В - посещение маникюрного кабинета (011=1.65) и бытовые контакты (011=1.63).

• Вакцинация против НВУ инфекции является достоверно значимым фактором защиты (ОЯ=0.47) в группе медработников, где выборка вакцинированных на момент нашего исследования была наиболее высока (п=135).

3) Оценка состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В показала, что протективный уровень анти-НВБ ^С (>1 ОМЕ/л) через 5 лет после полного курса вакцинации имеют только 60% вакцинированных, при этом 48.1%) из них обладают и клеточным иммунитетом (индекс HBsAg-cтимyляции лимфоцитов более 2-х). В группе вакцинированных с отсутствием протективного уровня антител число лиц с клеточным иммунитетом достоверно выше и составляет 72.2%.

Показано, что:

• иммунохимические свойства Е1 и Е2 НСУ белков из системы вируса осповакцины в большей степени соответствуют природным аналогам, чем белки вируса Синдбис - связывание с НСУ-позитивными сыворотками человека в ИФА и иммуноблот анализе составляло (100 и 78)%> и (100 и 46)%>, соответственно;

• белки, экспрессированпые вирусом осповакцины, обладали большей иммуногенностыо для мышей и большим разнообразием антигенного профиля (10 детерминант) по сравнению с белками вируса Синдбис (3 детерминанты);

6) Выявлены два новых вируснейтрализующих эпитопа в позициях а.о. 264318 (Е1) и 496-515 (Е2), первый из которых оказался генотипспецифическим, а второй обладал перекрестной активностью. Пептиды, соответствующие данным эпитопам, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов анти-НСУ вакцин.

4.6. Заключение

1. Проведение перед вакцинацией обследования на наличие маркеров гепатита В (HBsAg, анти-НВс анти-НВБ .

2. Проведение обследования после полной вакцинации против гепатита В с целью определения ее эффективности:

- при уровне анти-НВв ниже 10 МЕ/л провести оценку клеточного иммунитета (ЕЫБРОТ), при индексе стимуляции <2 рекомендовать проведение дополнительной вакцинации;

- при уровне анти-НВБ >10 МЕ/л - рекомендовать скрининг уровня анти-НВз 1§0 через 5 лет и при снижении данного показателя ниже протективного (10 МЕ/л) определять состояние клеточного иммунитета с целью оценки необходимости ревакцинации.

Одним из важнейших предикторов успеха при создании вакцины против гепатита В явилось наличие высокоиммуногенной консервативной детерминанты «а» в поверхностном белке вируса - HBsAg. Выявлению и конструированию таких детерминант в поверхностных гликопротеинах Е1 и Е2 вируса гепатита С посвящена следующая часть работы.

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОГО ПРОФИЛЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ Е1 И Е2 HCV

5.1. Пептидное сканирование антигенных детерминант нативных поверхностных белков Е1 и Е2 HCV

В работе использовали образцы крови пациентов ГУЗ Государственный Новосибирский Областной Клинический Диагностический Центр, г. Новосибирск с длительной (не менее 3-х лет) хронической инфекцией HCV. Возраст участников исследования составил 18-35 лет с примерно равным соотношением мужчин и женщин. Часть участников призналась во внутривенном употреблении наркотических препаратов. В образцах крови всех пациентов с использованием коммерческого ИФА были выявлены антитела класса IgG против белка Core и неструктурных белков NS3, NS4 и NS5. Вирусная нагрузка составила 104-106 копий РНК HCV/мл сыворотки при определении методом количественной ОТ-ПЦР с праймерами на консервативную 5'иТЯ-область генома HCV.

Определение генотипа исследуемых изолятов HCV проводили при помощи филогенетического анализа последовательности 5'иТЯ-области генома HCV (Рис. 5-1). По результатам анализа в коллекцию сывороток, использованную далее в пашей работе, были отобраны образцы, содержащие HCV трех генотипов - lb, 2а/2с (генотипирование по 5'иТК-области не позволяет дифференцировать эти два субтипа) и За, которые наиболее широко распространены на территории России и, в частности, в г. Новосибирске.

100

Н112

Н206

Н195

524

231

458

1Ь АЛ32996

Н117

Н194

Н114

198

320

Н156

247

389

384

1Ь 011168 1а М62321 1а ОЮ749 1а М67463 5аУ13184 5аАР064490 5а АР007520 6а АВ306366 6(1 АВ301814 беАВ162875 4а У11604 4<) 00418786 104 50 375

2а АВ047644 Н62 Н198 1001 Н88 Н132 Н126 Н157 Н59 290 Н116 341 976

2с АВ301777

2Ь АВ030907

2Ь ОЮ988

147

Н209

357

Н118

Н109

Н123

277

Н119

184

Н122

Н124

За 017763

364

394

Н124

Н130

Н21

ЗЬ 049374 ЗЬ А^21218 I

0,000 I

0,005

Рис. 5-1. Филогенетическое дерево, построенное на основе иРОМА-анализа последовательностей области 5'иТЯ генома НСУ. Размер сравниваемых последовательностей составил 240 нуклеотидов. Изоляты, полученные нами, отмечены жирным шрифтом. Для прототипных последовательностей указаны субтипы и уникальные шифры базы данных СепВапк. Крупными цифрами (1-6) отмечены узлы, соответствующие предполагаемым общим предкам генотипов. Приведены индексы статистической поддержки узлов, превышающие 60, а также масштаб шкалы генетических расстояний.

Каждая генотипическая группа сывороток включала 15 образцов.

На Рис. 5-2 представлены результаты ИФА с набором синтетических пептидов (76 штук, см Материалы и методы) трех НСУ-позитивных и одной контрольной (6 образцов) групп сывороток. На рисунке видно, что разброс значений оптической плотности (ОП) при анализе разных сывороток очень велик. Минимальное значение варьирует от 0.05 до 0.66 (шеап±8В = 0.18±0.11), а максимальное - от 0.77 до 2.22 (1.87±0.40). Такой разброс, по-видимому, является следствием индивидуальных особенностей иммунного ответа, степенью поражения печени, нарушениями обмена веществ, сопутствующими заболеваниями и др. Уровень ОП контрольных НСУ-негативных сывороток (Рис. 5-2) варьировал от 0.046 до 0.5 (0.19±0.073) на протяжении всей сканированной последовательности Е1 и Е2 белков НСУ, что свидетельствует об отсутствии специфического связывания.

Для увеличения репрезентативности антигенных профилей и нивелирования колебаний неспецифических фоновых значений ОП индивидуальных сывороток в пептидном анализе мы использовали следующий алгоритм обработки результатов (все расчеты проводили в среде программного обеспечения «ЬаЬУ1е\у»):

1. На первом этапе нами было проведено нормирование данных • пептидного ИФА в рамках максимального и минимального значений ОП для каждой сыворотки. При этом минимальное значение ОП каждой сыворотки рассматривали как фон и считали равным 0, а максимальное значение приравнивали к 2, т.е. как бы «растягивали» по шкале 0-2 (стандартный диапазон значений ОП в ИФД). Коэффициент нормирования для разных сывороток варьировал от 0.96 до 3.23 со средним значением 1.31±0.56.

2. Для корректного сравнения нормализованных значений НСУ-позитивных сывороток с контрольными негативными образцами, все значения ОП последних были умножены на коэффициент 1.31 (средний коэффициент нормирования НСУ-позитивных сывороток, см выше).

4. В связи с тем, что пептидный анализ носит ступенчатый характер (в нашем случае размер «ступени» составляет 8 а.о.) и не позволяет строго картировать антигенные детерминанты в соответствии с позициями определенных аминокислот (ак) на полипротеине Е1Е2 HCV, нами была проведена теоретическая оценка антигенной активности каждой аминокислоты тестируемых El и Е2 белков HCV (ОПак) с учетом количества пептидов, в которых она участвует в пептидном анализе:

• если ак, соответствующая определенной позиции в полипротеине Е1Е2, встречается 1 раз в пептидном анализе (первые 8 а.о. 192-199 и последние 6 а.о. 804-809 см Табл. 2-8), то для определения ОПак такой аминокислоты в каждой генотипической и контрольной группах сывороток использовали среднее значение ОП соответствующего пептида (соответственно, Al или D10 - см Табл. 2-8). Например, ОП]92/1ь = ОПА1/1ь или ОП804/2а2с = ОП0ю/2а2с;

• если ак встречается 2 раза в пептидном анализе (например, позиции 200207, 212-215, 220-223 и т.д., см Табл. 2-8), мы делали допущение, что ее активность реализуется одинаково в обоих пептидах и определяли ОПак как среднее значение ОП соответствующих двух пептидов в каждой генотипической и контрольной группах сывороток. Например, ОП2оо/1Ь = (ОПв1/,ь + ОПС1/1Ь)/2;

• если ак встречается 3 раза в пептидном анализе (например, позиции 208211, 215-219, 224-227 и т.д., см Табл. 2-8), то, аналогично предыдущему пункту, значение ее ОПак определяли как среднее значение ОП соответствующих трех пептидов в каждой генотипической и контрольной группах сывороток. Например, ОП2]б/1ь = (ОПВ]/1ь + ОПа/ib + ОПошьУЗ.

Такой подход уменьшает размер «ступеней» в перекрывающемся пептидном анализе до 4-х ак и позволяет наложить профиль антигенности пептидов на непрерывную аминокислотную последовательность полипротеина Е1Е2.

Как следует из представленных на Рис. 5-3 данных, в белках Е1 и Е2 исследованных нами сибирских изолятов HCV генотипов lb, 2а/2с и За выявляется значительное количество общих иммуногенных районов, что согласуется с ранее опубликованными данными по изолятам HCV из разных регионов мира [87, 31 1, 326, 359, 398, 444]. Важно также учесть, что пептиды синтезированы на основе аминокислотной последовательности американского штамма Н77 с генотипом 1а, поэтому картированные нами сайты иммуногенности имеют гомологию также и с этим генотипом HCV. Общие высокоиммуногенные пептидные эпитопы выявлены в следующих позициях а.о.: 250-260, 315-325 (El белок), 390-400 (гипервариабельный район 1 белка Е2), 430-440, 680-690 (Е2 белок) (здесь и далее указаны центральные участки пиков из Рис. 5-3). В позициях 340-350, 490-500 и 560-580 а.о. также регистрируются общие, но существенно слабее реагирующие, эпитопы. Широкое варьирование границ большинства эпитопов свидетельствует о высокой изменчивости белков Е1 и Е2, однако способность антител, индуцированных разными генотипами HCV, реагировать с одинаковыми пептидами свидетельствует о возможности создания на их основе универсальных иммуногенных конструкций для разработки вакцин против HCV.

Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях а.о. 280-290, 410-430 и 520-540. Так, в частности, в районе 280-290 а.о. белка Е1 нами выявлена ранее не описанная в литературе антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с субтипа HCV выделенных нами сибирских изолятов. Интересно отметить, что детерминанта 412-426 а.о., проявляющая межгенотиповые вируснейтрализующие свойства in vitro [398, 443], и эпитопы конформационной детерминаты 412-423+528-535 а.о. белка Е2, описанные в [322], выявлены нами также только в случае 2а/2с субтипа HCV. Однако расположенная рядом блокирующая нейтрализацию детерминанта 434-446 а.о. [443] является высокоиммуногенной во всех исследованных генотипах НСУ. Это согласуется с данными, представленными в [448], где из 9-ти тестированных НСУ-позитивных сывороток человека антитела к блокирующему эпитопу 434-446 а.о. были выявлены в четырех образцах, а к нейтрализующему 412-426 а.о. только в двух, причем в существенно более низком титре. В статье [398] было также показано, что антитела к узнающему эпитопу 412-423 а.о. вируснейтрализующего моноклонального антитела АРЗЗ выявляются лишь в 2.5% случаев природной инфекции НСУ. Авторы высказали предположение, что низкая иммуногенность данного района связана с присутствующим в позиции 417 а.о. сайтом гликозилирования белка Е2.

В ряде работ было показано, что в Ы-концевой (192-202 а.о.) области белка Е1 расположен высокоиммуногенный эпитоп, обладающий вируснейтрализующей, активностью [194, 213]. Нам не удалось выявить в этом районе значимых иммуногенных эпитопов ни для одного из исследованных генотипов НСУ. В опубликованных работах не приведены генотипы тестированных изолятов НСУ, поэтому различия, возможно, связаны с присутствием антигенных детерминант в структуре И-концевой части Е1 белка других, отличных от наших, субтипов НСУ.

В исследуемой группе сывороток нам не удалось выявить антитела ко второму гипервариабельному району Е2 белка в позиции 470-480 а.о., хотя в литературе показано наличие иммуногенных эпитопов в данном районе Е2 белка 1а и 1Ь субтипов НСУ [87]. Возможно, это объясняется наиболее высокой вариабельностью изолятов 1 генотипа НСУ по сравнению с другими генотипами и, соответственно, отличием группы изолятов, исследованных в нашей работе, от изученных в работе [87].

Выявленные нами межгенотиповые различия антигенного профиля поверхностных белков НСУ свидетельствуют о необходимости генотипирования изолятов при изучении свойств поверхностных белков Е1 и Е2 и некорректности в ряде случаев распространения данных, полученных для природному образом. Эти процессы проходят неэффективно в системах культуральной трапзиентной экспрессии.

Для продукции препаративных количеств Е1 и Е2 белков нами были использованы два вируса: ДНК-вирус осповакцины и РНК-позитивный вирус Синдбис. Эти два вируса совершенно различны по скорости репликации, внутриклеточной локализации и механизмам синтеза и процессинга белков, что позволяет выбрать наиболее адекватную природной систему экспрессии. В обоих случаях проводили ко-экспрессию генов белков Е1 и Е2 HCV с целью обеспечения возможности образования Е1Е2 гетеродимера [110]. При конструировании в расчет было принято также то, что для правильного процессинга Е1 белка необходим С-концевой фрагмент Core, а для процессинга Е2 белка - примыкающий к нему С-концевой фрагмент гликопротеина Е1 (Рис. 5-4 А) [69, 134]. Таким образом встраиваемый конструкт состоял из фрагмена гена Core, кодирующего 21 а.о. С-концевой части этого белка, полноразмерной копии гена белка Е1 (192-383 а.о. по последовательности полипротеина штамма Н77, генотип 1а) и усеченного с С конца гена белка Е2 (384-715 а.о.), у которого был удален гидрофобный трансмембранпый домен и были введены шесть остатков гистидина (Е1Е2Т-HIS) (Рис. 5-4 В). Мы предполагали, что, несмотря на отсутствие гистидинового тракта, Е1 белок можно будет выделять в составе гетеродимерного комплекса Е1Е2. Удаление гидрофобного трансмембранного домена Е2 (718-746 а.о.) должно было обеспечить повышение растворимости Е1Е2 комплекса, облегчить выделение и очистку этих белков. Имелись данные, что усечение Е2 белка не приводит к снижению его иммуногенных свойств и что такая форма Е1Е2 полипротеина способна генерировать синтез нейтрализующих антител у шимпанзе [335]. использовано для иммунизации мышей, что подтверждено Western blot анализом и окрашиванием очищенных препаратов белков Coomassie blue. О корректности сравнения иммуногенных свойств белков VV-E1E2 и SIN-E1E2 свидетельствует также факт индукции одинаково высокого титра антител к доминирующему эпитопу в позиции а.о. 624-667.

В литературе описано, что процесс гликозилирования играет важную роль в правильном фолдинге белков El и Е2 IICV, а также в проявлении их природной активности (связывание с рецепторами, проникновение в клетки) и иммуногенности [120, 135]. Western blot анализ для обоих белков показал, что SIN-E1E2 белки представлены несколькими фракциями, молекулярный вес которых соответствует разной степени гликозилирования El и Е2 протеинов [282, 285], в то время как в препаратах VV-E1E2 выявлены только высокомолекулярные гликопротеины El и Е2, соответствующие их полностью гликозилированным формам (Рис. 5-12). Возможно, что выявленные нами различия иммуногенных свойств VV- и SIN-E1E2 белков полностью или частично обусловлены уровнем их гликозилирования в данных системах экспрессии.

Несмотря на различия в процессинге рекомбинантных белков и в индуцированном ими репертуаре антител, мы показали, что наибольший иммунный ответ как в случае VV-E1E2, так и в SIN-E1E2 формируется к не нейтрализующим эпитопам, локализованным в районах а.о. 512-547 и а.о. 624667 (Рис. 5-13, 5-17 и 5-18). К этим областям генома HCV ранее были получены МКА [187, 316, 413], которые, хотя и блокировали связывание Е2 антигена с CD81, тем не менее не обладали вируснейтрализующей активностью на модели HCVpp псевдочастиц, что согласуется с нашими данными.

Две другие линейные детерминанты, узнаваемые SIN-AB (а.о. 264-318 и а.о.496-515) были также узнаваемы VV-AB, и было обнаружено, что они представляют новые ранее не описанные вируснейтрализующие эпитопы. В экспериментах по блокированию сывороток специфическими пептидами было показано, что антитела к этим двум эпитопам представляют большую часть нейтрализующей активности SIN-AB (Рис. 5-17 С). Один из двух новых эпитопов в позиции а.о. 496-515 является консервативным и обладает межгенотиповой вируснейтрализующей активностью, в то время как второй эпитоп, а.о. 264-318, является генотип-специфическим и нейтрализует только вирусы первого генотипа 1а и Ib, не обладая активностью в отношении 2а генотипа.

В сыворотке VV-AB выявлены антитела к другим ранее описанным в литературе вируснейтрализующим эпитопам. Районы IIVR1 и а.о. 448-483 были ранее идентифицированы как нейтрализующие эпитопы [187]. В нашем исследовании блокирование антител к этим областям в сыворотке VV-AB уменьшает нейтрализующую активность последней в случае 1а генотипа HCV, но не в случае генотипов Ib или 2а. Эти результаты свидетельствуют о генотип-специфической природе эпитопов HVR1 и а.о. 448-483, что очевидно является следствием их высокой вариабельности. Область а.о. 412-419 (EPI) известна как высоко консервативная между генотипами с идентичностью 93.3% (Ib) и 86.7% (2а) по сравнению с 1а последовательностью [441]. Ранее было показано, что антитела к рядом расположенной области а.о. 434-446 (обозначенной как ЕРИ) могут интерферировать с активностью антител к EPI в ЫСУ-позитивных сыворотках человека [447, 448]. Однако в нашем исследовании PepScan анализ (Рис. 5-13) показал, что ответ к району EPII в VV-AB был очень низкий, титр антител <1:200, что свидетельствует об отсутствии негативного эффекта в этом препарате иммунной сыворотки на функцию антител к EPI.

Блокирование антител к эпитопу в позиции а.о. 496-515 уменьшало нейтрализацию всех 3 вирусов la, Ib и 2а до 30-50%) сывороткой VV-AB (Рис. 5-18). Последовательность этого эпитопа высоко консервативна для всех 6-ти генотипов HCV с наибольшей вариабельностью 80%, наблюдаемой в генотипе

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кочнева, Галина Вадимовна, Кольцово

1. Акимкин В.Г. Серологический мониторинг и эпидемиологическая эффективность специфической иммунопрофилактики гепатита В медицинского персонала отечественной вакциной «Комбиотех». // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004. - №2. - С.8-12.

2. Беляков В.Д., Яфаев, Р.Х. Эпидемиология: Учебник. М.: Медицина, 1989. -416с.

3. Бобкова М.Р., Самохвалов Е.И., Кравченко A.B. и др. Генетические варианты вируса гепатита С у ВИЧ-инфицированных наркоманов. // Вопросы вирусологии. 2002. - №3. - С. 15-20.

4. Бююль А., Цёфель П. SPSS: Искусство обработки информации. Анализ статистических данных и восстановление скрытых закономерностей. // Пер. с нем.-СПб.: ООО «ДиаСофтЮП», 2002. 608 с.

5. Дартау Л.А., Стефанюк А.Р. Компьютерная технология Эдифар для сбора данных от населения через структуры первичной медицинской помощи. // Материалы конференции «Медицинские информационные технологии». -М., 2001.

6. Демьяненко Э.Р., Вольпов В.В., Гришина Т.В. Экспресс-оценка ситуации с внутривенным потреблением наркотиков в г. Барнауле. // Круглый стол (КС), 1999.-Т.2.-С.15-21.

7. Закиров И.Г. Хронические гепатиты в условиях крупного промышленно-сельскохозяйственного региона (на примере республики Татарстан). // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. - №2. - С. 19-21.

8. Здоровье населения и среда обитания (ЗНиСО): Информационный бюллетень. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. № 1, 1992 №1, 2010.

9. Каира А.Н., Ющенко Г.В. Вирусные гепатиты в Московской области: эпидемиология и профилактика. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - №5. - С.7-10.

10. Каира А.Н., Ющенко Г.В. Вирусные гепатиты В и С среди медицинских работников Московской области и их профилактика. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - №2. - С.230-34.

11. П.Кузин С.Н., Лисицина Е.В., Самохвалов Е.И. и др. Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса. // Вопросы вирусологии. 1999. - №44. - С.79-82.

12. Лобастов С.П., Шестов В.А., Варданян Н.В. и др. Оценка эффективности иммунизации вакциной против гепатита В «Шанвак-В» подростков до 19 лет. // Биопрепараты. 2004. - №3. - С.22-24.

13. Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Миширо С.Т. и др. Закономерности распространения вируса гепатита С и его генотипов в России и странах СНГ. // Вопросы вирусологии. 1997. - 4. - С. 157-161.

14. Львов Д.К., Дерябин П.Г. Географическое распространение вируса гепатита С и его генотипов. // Вопросы вирусологии. 1997. - №5. - С. 196199.

15. Мефодьев В.В., Марченко А.Н., Огурцов A.A. Эпидемиология вирусных гепатитов на юге Тюменской области. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - №4. - С.13-16.

16. Морозов В. Молекулярно-генетическая характеристика вариантов вируса гепатита В, циркулирующих в Санкт-Петербурге и Якутии. // Автореф. канд. биол. наук. — С-Петербург, 2003 18 с.

17. Направления, основные мероприятия и параметры приоритетного национального проекта «Здоровье». Утверждены президиумом Совета при

18. Президенте Российской Федерации по реализации приоритетных национальных проектов, протокол № 2 от 21 декабря 2005 г.

19. Новиков Д.В., Мохнов В.В., Селиванов Т.С. и др. Сравнительный анализ фрагментов NS5B-peraoHa изолятов HGV, обнаруженных в России, Казахстане и Кыргызстане. // Вопросы вирусологии. 1999. - №44(6). -С.244-247.

20. Новиков Д.В., Пименов В.К., Самохвалов Е.И. и др. Определение маркеров вируса гепатита G в различных группах риска. // Вопросы вирусологии. 2000. - №45(6). - С.20-22.

21. Патлусова В.В. Характеристика напряженности и стойкости поствакцинального иммунитета и оценка эффективности массовой вакцинации против гепатита В в разных группах населения: Автореф. дис. на соискание ученой степени к.м.н. М., 2008. - 29с.

22. Письмо министра здравоохранения Шевченко Ю.Л. председателю Комитета по охране здоровья и спорту ГМ РФ Герасименко Н. Ф. от 28.12.2000 г. http://www.privivka.ru/info/bulletin/article.php?id=254.

23. Рагимов A.A., Дашкова Н.Г., Горбунов М.А. и др. Оценка эффективности схемы «экстренной» профилактики гепатита В. // Биопрепараты. 2002. -№1 (5). - С.24

24. Селиашвили Р.И., Балмасова И.П., Кабанова Е.Б. и др. Вирус гепатита В: биология, иммунопатогенез, система ЕК/ЕКТ при вирусной персистенции. // Журнал Микробиологии. 2006. - №6. - С.76-83.

25. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. Этиология. Эпидемиология. Патогенез. Иммуногенез. Патоморфология печени. Клиника. Классификация. Диагностика. Дифференциальная диагностика. Терапия. Профилактика. 2-е изд. доп. и перераб. СПб, «Теза», 1998. - 331с.

26. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. Пер с англ. М.: Медиа Сфера, 1998. - 352с.

27. Хлопова И.Н., Быченко Д.В., Самохвалов Е.И. и др. Влияние вируса гепатита G на течение острого гепатита В и С. // Вопросы вирусологии. -1999. №6. -С.225-232.

28. Шахгильдян И.В. Характеристика групп высокого риска инфицирования вирусом гепатита С. // Информационный бюллетень «Вирусные гепатиты: достижения и перспективы». 2000. - №2. - С. 1-3.

29. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. - 384с.

30. Abe К., Tran Н.Т. Hepatitis В virus, genotype A, isolated in Russia. // Published Only in Database. 2003.

31. Abe K., Hayakawa E., Sminov A.V. et al. Molecular epidemiology of hepatitis В, C, D and E viruses among children in Moscow, Russia. // J. Clin. Virol. -2004.-Vol. 30-P.57-61.

32. Acharya S.K., Madan K., Dattagupta S. and Panda S.K. Viral hepatitis in India. // Natl. Med. J. India. 2006. - Vol. 19 - P.203-217.

33. Adams A., Chamberlain R.W., Taylor L.A. et al. Complete coding sequence of hepatitis С virus genotype 6a. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. -Vol. 234. - P.393-396.

34. Allain J.P. Occult hepatitis B virus infection: implications in transfusion. // Vox Sang. 2004. - Vol. 86 - P.83-91.

35. Allain J.P. Epidemiology of Hepatitis B virus and genotype. // J. Clin. Virol. -2006. Vol. 36, Suppl 1 - P.12-17.

36. Almeida J.D., Rubenstein D. and Stott E.J. New antigen-antibody system in Australia-antigen-positive hepatitis. // Lancet. 1971. - Vol. 2 - P. 1225-1227.

37. Alter H.G., Nacatsuji Y., Melpolder J. et al. The incidence of transfusion-associated hepatitis G virus infection and its relation to liver disease. // New England journal of medicine. 1997. - Vol. 336. - P.747-754.

38. Alter M.J., Kruszon-Moran D., Nainan O.V. et al. The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1988 through 1994. // N. Engl. J. Med. -1999.-Vol. 341. — P.556-562.

39. Alter M.J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. // World. J. Gastroenterol.-2007.- Vol. 13. P.2436-2441.

40. Amarapurkar D., Dhorda M., Kirpalani A. et al. Prevalence of hepatitis C genotypes in Indian patients and their clinical significance. // J. Assoc. Physicians India. -2001,- Vol. 49. P. 983-985.

41. Andre F.E. and Zuckerman A.J. Review: protective efficacy of hepatitis B vaccines in neonates. //J. Med. Virol. 1994. - Vol. 44 - P. 144-151.

42. Andre P., Perlemutter G., Budkowska A. et al. Hepatitis C virus and lipid metabolism. // Seminars in Liver disease. 2005. - Vol. 25(1). - Vol.95. - P. 1004-1016.

43. Arauz-Ruiz P., Norder II., Robertson B.Ii. and Magnius L.O. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America. // J. Gen. Virol. 2002. - Vol. 83 - P.2059-2073.

44. Araya V., Rakela J. and Wright T. Hepatitis C after orthotopic liver transplantation. // Gastroenterology. 1997. - Vol. 112. - P.575-582.

45. Armstrong G.L., Wasley A., Simard E.P. et al. The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1999 through 2002. // Ann. Intern. Med. -2006. Vol.144. - P.705-714.

46. Asratian A.A., Melik-Andreasian G.G., Mkhitarian I.L. et al. Seroepidemiological characterization of virus hepatitis in the Republic of Armenia. // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2005. - №5. - P.93-96.

47. Avazova D., Kurbanov F., Tanaka Y. et al. Hepatitis B virus transmission pattern and vaccination efficiency in Uzbekistan. // J. Med. Virol. 2008. - Vol. 80 -P.217-224.

48. Badr 1.1., Farghaly A.G., Koura M.R. et al. Health status assessment of drug addicts in Alexandria. // J. Egypt. Public Health Assoc. 1998. - Vol. 73 -P.275-296.

49. Banatvala J., Van Damme P. and Oehen S. Lifelong protection against hepatitis B: the role of vaccine immunogenicity in immune memory. // Vaccine. 2000. -Vol. 19 (7-8). - P.877-885.

50. Barría M.I., Vera-Otarola J., León U. et al. Influence of extrahepatic viral ' infection on the natural history of hepatitis C. // Ann. Hepatol. 2008. - Vol.7. -P. 136-143.

51. Bartenschlager R. and Schaller H. Hepadnaviral assembly is initiated by polymerase binding to the encapsidation signal in the viral RNA genome. // EMBO J. 1992. - Vol. 11 - P.3413-3420.

52. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Yasargil K. et al. Substrate determinants for cleavage in cis and in trans by the hepatitis C virus NS3 proteinase. // J. Virol. 1995.-Vol. 69.-P. 198-205.

53. Bartenschlager R. and Pietschmann T. Efficient hepatitis C virus cell culture system: What a difference the host cell makes. // PNAS. 2005. - Vol. 102(28).- P.9739-9740.

54. Berg T., Hopf U., Stark K. et al. Distribution of hepatitis C virus genotypes in German patients with chronic hepatitis C: correlation with clinical and virological parameters. //J. Hepatol. 1997. - Vol. 26. - P.484-491.

55. Bertoletti A., D'Elios M.M., Boni C. et al. Different cytokine profiles of intraphepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infections. // Gastroenterology. 1997.-Vol. 112,- P.193-199.

56. Bian T., Zhou Y., Bi S. et al. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. // Bioch. and Biophys. Res. Commun. -2009.-Vol. 378.-P. 118-122.

57. Bichko V., Pushko P., Dreilina D. et al. Subtype ayw variant of hepatitis B virus. DNA primary structure analysis. // FEBS Letters. 1985. - Vol. 185. -P.208-212.

58. Blackard J.T., Hiasa Y., Smeaton L. et al. Compartmentalization of hepatitis C virus (HCV) during HCV/HIV coinfection. // J. Infect. Dis. 2007. - Vol.195. -P.1765-1773.

59. Blanchard E., Brand D., Trassard S. et al. Hepatitis C virus-like particle morphogenesis. // J. Virol. 2002. - Vol. 76(8). - P.4073-4079.

60. Blanchette V.S., Vorstman E., Shore A. et al. Hepatitis C infection in children with hemophilia A and B. // Blood. -1999. Vol.78. - P.285-289.

61. Blight K.J., Kolykhalov A. A. and Rice C.M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. // Science. 2000. - Vol. 290. - P. 1972-1974.

62. Blight K.J., McKeating J.A., Rice C.M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. // J. Virol. 2002. -Vol. 76(24).-P.13001-13014.

63. Blumberg B.S., Alter H.J. and Vishich S. A "New" antigen in leukemia sera. // JAMA. 1965. - Vol.191 - P.541-546.

64. Bonanni P., Pesavento G., Bechini A. et al. Impact of universal vaccination programmes on the epidemiology of hepatitis B: 10 years of experience in Italy. // Vaccine. 2003. - Vol. 21 - P.685-691.

65. Bourliere M., Barberin J. M., Rotily M. et al. Epidemiological changes in hepatitis C virus genotypes in France: evidence in intravenous drug users. // J. Viral. Hepat. 2002. - Vol. 9(1). - P.62-70.

66. Bredenbeek P.J., Frolov I., Rice C.M. and Schlesinger S. Sindbis virus expression vectors: packaging of RNA replicons by using defective helper RNAs. // J. Virol. 1993. - Vol. 67. - P.6439-6446.

67. Bronowicki J.P., Venard V., Botte C. et al. Patient-to-patient transmission of hepatitis C virus during colonoscopy. // N. Engl. J. Med. 1997. - Vol.337. -P.237-240.

68. Brunetto M.R., Giarin M., Saracco G. et al. Hepatitis B virus unable to secrete e antigen and response to interferon in chronic hepatitis B. // Gastroenterology. -1993. Vol. 105 - P.845-850.

69. Butsashvili M., Tsertsvadze T., McNutt L.A. et al. Prevalence of hepatitis B, hepatitis C, syphilis and HIV in Georgian blood donors. // Eur. J. Epidemiol. -2001. Vol. 17 - P.693-695.

70. Cacoub P., Ohayon V., Sekkat S. et al. Epidemiologic and virologie study of hepatitis C virus infections in Morocco. // Gastroenterol. Clin. Biol. 2000. -Vol. 24 - P. 169-173.

71. Cantaloube J.F., Gallian P., Attoui H. et al. Genotype distribution and molecular epidemiology of hepatitis C virus in blood donors from southeast France. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol.43. - P. 3624-3629.

72. Cai Z., Zhang C., Chang K.S. et al. Robust production of infectious hepatitis C virus (HCV) from stably HCV cDNA-transfected human hepatoma cells. // J. Virol. 2005. - Vol. 79(22). - P.13963-13973.

73. Carlos M.P., Yamamura Y., Vu Q. et al. Humoral immunity to immunodominant epitopes of Hepatitis C virus in individuals infected with genotypes la or lb. // Clin. Immunol. 2004. - Vol. 111.- P.22-27.

74. Carman W.F., Zanetti A.R., Karayiannis P. et al. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus. // Lancet. 1990. - Vol. 336 - P.325-329.

75. Carman W., Thomas H. and Domingo E. Viral genetic variation: hepatitis B virus as a clinical example. // Lancet. 1993. - Vol. 341 - P.349-353.

76. Cavalheiro N. de P. Sexual transmission of hepatitis C. // Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. 2007. - Vol.49. - P.271-277.

77. CDC. A Comprehensive Immunization Strategy to Eliminate Transmission of Hepatitis B Virus Infection in the United States. // MMWR. 2006. - Vol. 55. -N RR16:11.

78. Chamberlain R.W., Adams N.J., Saeed A.A. et al. Complete nucleotide sequence of a type 4 hepatitis C virus variant, the predominant genotype in the Middle East. // J. Gen. Virol. 1997. - Vol. 78. - P.1341-1347.

79. Chamberlain R.W., Adams N.J., Taylor L.A. et al. The complete coding sequence of hepatitis C virus genotype 5a, the predominant genotype in South Africa. // Biochcm. Biophys. Res. Commun. 1997. - Vol. 236. - P.44-49.

80. Chang J.C., Seidel C., Ofenloch B. et al. Antigenic heterogeneity of the hepatitis C virus NS4 protein as modeled with synthetic peptides. // Virology. -1999,-Vol.257. P.177-190.

81. Chang M.H. Hepatitis B virus infection. // Semin. Fetal Neonatal Med. 2007. -Vol. 12 - P.160-167.

82. Chayama К., Tsubota A., Koida I. et al. Nucleotide sequence hepatitis С virus (type 3b) isolated from a Japanese patient with chronic hepatitic C. // J. Gen. Virol. 1994. - Vol.75. - P.3623-3628.

83. Chen S.L., Morgan, T.R. The natural history of hepatitis С virus (HCV) infection. // Int. J. Med. Sci. 2006. - Vol. 3. - P.47-52.

84. Chen C.C., Yen C.H., Wu W.Y. et al. Epidemiology of hepatitis В virus infection among young adults in Taiwan, China after public vaccination program.//Chin Med. J. 2007. - Vol. 120 - P.l 155-1 158.

85. Choi S.H., Kim S.Y., Park K.J. et al. Hepatitis С virus core protein is efficiently released into the culture medium in insect cells. // J. Biochem. Mol. Biol. 2004. - Vol. 37(6). - P.735-740.

86. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J. et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. // Science. 1989. - Vol. 244. - P.359-362.

87. Choo Q.L., Richman K., Han J.H. et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. США. 1991. - Vol. 88. -P.2451-2455.

88. Chowdhury A., Santra A., Chaudhuri S. et al. Hepatitis С virus infection in the general population: a community-based study in West Bengal, India. // Hepatology. 2003. - Vol. 3,- P.802-809.

89. Chu С., Hwang S., Luo J. et al. Clinical, virological, immunological significance of GB virus C/hepatitis G infection in patient with chronic hepatitis C. // Hepatology Res. 2001. - Vol. 19. - P.225-236.

90. Clarysse C., Lin L., Crabbe T. et al. HVR1 quasispecies analysis from a long-term culture of hepatitis C virus in Hep G2 derived cells grown in a haemodialysis cartridge. //J. Viral. Hepat. 2001. - Vol. 8.- P. 132-13 8.

91. Clayton R.F., Owsianka A., Aitken J. et al. Analysis of antigenicity and topology of E2 glycoprotein present on recombinant hepatitis C virus-like particles. // J. Virol. 2002. - Vol. 76(15). - P.7672-7682.

92. Cochrane A., Searle B., Hardie A. et al. A genetic analysis of hepatitis C virus transmission between injection drug users. // J. Infect. Dis. 2002. - Vol. 186. -P. 1212-1221.

93. Cocquerel L., Meunier J. C., Pillez A. et al. A retention signal necessary and sufficient for endoplasmic reticulum localization maps to the transmembrane domain of hepatitis C virus glycoprotein E2. // J. Virol. 1998. - Vol. 72. -P.2183-2191.

94. Cocquerel L., Duvet S., Meunier J.C. et al. The transmembrane domain of hepatitis C virus glycoprotein El is a signal for static retention in the endoplasmic reticulum. // J.Virol. 1999. - Vol. 73. - P.2641-2649.

95. Cocquerel L., Meunier J. C., Op de Beeck A. et al. Coexpression of hepatitis C virus envelope proteins El and E2 in cis improves the stability of membrane insertion of E2. // J. Gen. Virol. 2001. - Vol. 82. - P.1629-1635.

96. Cody S.H., Nainan O.V., Garfein R.S. et al. Hepatitis C virus transmission from an anesthesiologist to a patient. // Arch. Intern. Med. 2002. - Vol. 162. -P.345-350.

97. Conry-Cantilena C., VanRaden M., Gibble J. et al. Routes of infection, viremia, and liver disease in blood donors found to have hepatitis C virus infection. // N. Engl. J. Med. 1996. - Vol. 334. - P. 1691 -1696.

98. Curran R., Jameson C.L., Craggs J.K. et al. Evolutionary trends of the first hypervariable region of the hepatitis C virus E2 protein in individuals with differing liver disease severity. // J. Gen. Virol. 2001. - Vol. 83. - P. 11-23.

99. Currier J.R., Kuta E.G., Turk E. et al. A panel of MHC class I restricted viral peptides for use as a quality control for vaccine trial ELISPOT assays. // J. Immunol. Methods. 2002. - Vol. 260 (1-2). - P.157-172.

100. Dal Molin G., Ansaldi F., Biagi C. et al. Changing molecular epidemiology of hepatitis C virus infection in Northeast Italy. // J. Med. Virol. 2002. - Vol. 68. - P.352-356.

101. Dane D.S., Cameron C.H. and Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis. // Lancet. 1970. - Vol.1 -P.695-698.

102. Davaalkham D., Ojima T., Uehara R. et al. Analysis of hepatitis B surface antigen mutations in Mongolia: molecular epidemiology and implications for mass vaccination. // Arch. Virol. 2007. - Vol. 152(3). - P.575-584.

103. Da Villa G., Piccinino F., Scolastico C. et al. Long-term epidemiological survey of hepatitis B virus infection in a hyperendemic area (Afragola, southern Italy): results of a pilot vaccination project. // Res. Virol. 1998. - Vol. 149 -P.263-270.

104. Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C. Formation of native hepatitis C virus glycoprotein complexes. // J. Virol. 1997. - Vol. 71. - P.697-704.

105. Diaz T., Des Jarlais D.C., Vlahov D. et al. Factors associated with prevalent hepatitis C: Differences among young adult injection drug users in lower andupper Manhattan, New York City. // Am. J. Public Health 2001. - Vol. 91. -P.23-30.

106. Diaz O., Delers F., Maynard M. et al. Preferential association of Hepatitis C virus with apolipoprotein B48-containing lipoproteins. // J. Gen. Virol.- 2006. -Vol. 87. P.2983-2991.

107. Djebbi A., Triki H., Bahri O. et al. Genotypes of hepatitis C virus circulating in Tunisia. // Epidemiol Infect. 2003. - Vol. 130. - P.501-505.

108. Doitsh G. and Shaul Y. A long IIBV transcript encoding pX is inefficiently exported from the nucleus. // Virology. 2003. - Vol. 309 - P.339-349.

109. Dominguez A., Bruguera M., Vidal J. et al. Community-based seroepidemiological survey of HCV infection in Catalonia, Spain. // J. Med. Virol. 2001. - Vol. 65. - P.688-693.

110. Donahue J.G., Munoz A., Ness P.M. et al. The declining risk of posttransfusion hepatitis C virus infection. // N. Engl. J. Med. 1992. - Vol. 327. - P.369-373.

111. Dore G.J., Law M., MacDonald M., Kaldor J.M. Epidemiology of hepatitis C virus infection in Australia. // J. Clin. Virol. 2003. - Vol. 26. - P. 171-184.

112. Dowd K.A., Netski D.M., Wang X.H. et al. Selection pressure from neutralizing antibodies drives sequence evolution during acute infection with hepatitis C virus. // Gastroenterology. 2009. - Vol. 136(7). - P.2377-2386.

113. Dreux M., Pietschmann T., Granier C. et al. High density lipoprotein inhibits hepatitis C virus-neutralizing antibodies by stimulating cell entry via activation of the scavenger receptor BI. // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281(27).1. P. 18285—18295.

114. Drummer H.E., Maerz A., Poumbourios P. Cell surface expression of functional hepatitis C virus El and E2 glycoproteins. // FEBS Letters. 2003. -Vol. 546(2-3).-P.385-390.

115. Dubuisson J., Hsu H.H., Cheung R.C. et al. Formation and intracellular localization of hepatitis C virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia virus and Sindbis viruses. // J. Virol. 1994. - Vol. 68. -P.6147-6160.

116. Dubuisson J., Duvet S., Meunier J-K. et al. Glycosylation of the Hepatitis C virus envelope protein El is dependent on the presence of a downstream sequence on the viral polyprotein. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 275(39). -P.30605-30609.

117. Dubuisson J., Helle F., & Cocquerel L. Early steps of the hepatitis C virus life cycle. // Cell Microbiol. 2008. - Vol. 10(4). - P.821-827.

118. Egah D.Z., Banwat E.B., Audu E.S. et al. Hepatitis B surface antigen, hepatitis C and HIV antibodies in a low-risk blood donor group, Nigeria. // East Mediterr. Health J. 2007. - Vol. 13 - P.961-966.

119. Elghouzzi M.H., Bouchardeau F., Pillonel J. et al. Hepatitis C Virus: Routes of Infection and Genotypes in a Cohort of Anti-HCV-Positive French Blood Donors. // Vox. Sang. 2000. - Vol.79. - P. 138-144.

120. El Nawawy A., Soliman A.T., el Azzouni O. et al. Maternal and neonatal prevalence of toxoplasma and cytomegalovirus (CMV) antibodies and hepatitis-B antigens in an Egyptian rural area. // J. Trop. Pediatr. 1996. - Vol. 42 -P. 154-157.

121. Erickson A.L., Kimura Y., Igarashi S. et al. The outcome of hepatitis С virus infection is predicted by escape mutations in epitopes targeted by cytotoxic T lymphocytes. // Immunity. -2001. Vol. 15(6). - P.883-895.

122. Eroglu C., Yildiz E., Ozturk M. and Pinarbasi E. A highly sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay of antibodies to hepatitis С virus. // Acta Virol. J. 2000. - Vol. 44. - P.29-33.

123. Ertekin V., Selimoglu M.A. and Altinkaynak S. Sero-epidemiology of hepatitis В infection in an urban paediatric population in Turkey. // Public Health. -2003.-Vol. 117 P.49-53.

124. Esteban J.I., Gomez J., Martell M. et al. Transmission of hepatitis С virus by a cardiac surgeon. // N. Engl. J. Med. 1996. - Vol. 334. - P.555-560.

125. Esteban J.I., Sauleda S., Quer J. The changing epidemiology of hepatitis С virus infection in Europe. // J. Hepatol. 2008. - Vol. 48. - P. 148-162.

126. European consensus group on hepatitis immunity. // Lancet. — 2000. Vol.355. - P.561-565.

127. Evans M.J., von Hahn Т., Tscherne D.M. et al. Claudin-1 is a hepatitis С virus co-receptor required for a late step in entry. // Nature. 2007. - Vol. 446(7137).-P.801-805.

128. Ezelle H.J., Markovic D., Barber G.N. Generation of hepatitis С virus-like particles by use of a recombinant vesicular stomatitis virus vector. // J. Virol. -2002. Vol. 76(23). - P.12325-12334.

129. Farci P., Shimoda A., Wong D. et al. Prevention of hepatitis С virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 of the envelope 2 protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. США. 1996. - Vol. 93 - P. 15394-15399.

130. Farci P., Shimoda A., Coiana A. et al. The outcome of acute hepatitis C predicted by the evolution of the viral quasispecies. // Science. 2000. - Vol. 288. - P.339-344.

131. Felsenstein J. PHYLIP phylogeny inference package. // Cladistics. - 1989. -Vol. 5. - P.164-166.

132. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6a3. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle. 2002.

133. Flint M., Dubuisson J., Maidens C. et.al. Functional characterization of intracellular and secreted forms of a truncated hepatitis C virus E2 glycoprotein. // J.Virol. 2000. - Vol. 74(2). - P.702-709.

134. Flodgren E., Bengtsson S., Knutsson M. et al. Recent high incidence of fulminant hepatitis in Samara, Russia: molecular analysis of prevailing hepatitis B and D virus strains. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38 - P.3311-3316.

135. Francis D.P. Hepatitis B virus vaccine. An opportunity for control. // JAMA. -1983.-Vol.250 -P.1891-1892.

136. Frank C., Mohamed M.K., Strickland G.T. et al. The role of parenteral antischistosomal therapy in the spread of hepatitis C virus in Egypt. // Lancet. -2000.-Vol. 355. -P.887-891.

137. Freeman A.J., Zekry A., Whybin L.R. et al. Hepatitis C prevalence among Australian injecting drug users in the 1970s and profiles of virus genotypes in the 1970s and 1990s. //Med. J. Aust. 2000. - Vol. 172. - P.588-591.

138. Galibert F., Mandart E., Fitoussi F. et al. Nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome (subtype ayw) cloned in E. coli. // Nature. 1979. - Vol. 281 -P.646-650.

139. Ganem D. and Prince A.M. Hepatitis B virus infection—natural history and clinical consequences. // N. Engl. J. Med. 2004. - Vol. 350 - P.l 118-1129.

140. Garcia-Retortillo M., Forns X., Feliu A. et al. Hepatitis C virus kinetics during and immediately after liver transplantation. // Hepatology. 2002. - Vol. 35. - P.680-687.

141. Garten R.J., Zhang J., Lai S. et al. Coinfection with HIV and hepatitis C virus among injection drug users in southern China. // Clin. Infect. Dis. 2005. - Vol. 41. - P. 18-24.

142. Gellin B.G., Greenberg R.N., Hart R.H. et al. Immunogenicity of two doses of yeast recombinant hepatitis B vaccine in healthy older adults. // J. Infect. Dis. -1997.-Vol. 175(6).- P.1494-1497.

143. Gogos C.A., Fouka K.P., Nikiforidis G. et al. Prevalence of hepatitis B and C virus infection in the general population and selected groups in South-Western Greece. // Eur. J. Epidemiol. 2003. - Vol. 18 - P.551-557.

144. Gondeau C., Pichard-Garcia L., Maurel P. Cellular models for the screening and development of anti-hepatitis C virus agents. // Pharmacology & Therapeutics. 2009. - Vol. 124. - P. 1-22.

145. Goobar-Larsson L., Wiklund L. and Schwartz S. Intracellular hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase activity. // Arch.Virol. 2001. - Vol. 146. -P.1553-1570.

146. Gottwein J.M., Scheel T.K., Hoegh A.M. et al. Robust hepatitis C genotype 3 a cell culture releasing adapted intergenotypic 3a/2a (S52/JFH1) viruses. // Gastroenterology. 2007. - Vol. 133(5). - P. 1614-1626.

147. Goudeau A. and Dubois F. Incidence and prevalence of hepatitis B in France. //Vaccine. 1995,-Vol. 13(1) - P.22-25.

148. Goutagny N., Fatmi A., De Ledinghen V. et al. Evidence of viral replication in circulating dendritic cells during hepatitis C virus infection. // J. Infect. Dis. -2003. -Vpl. 187. P.1951-1958.

149. Grakoui A., Wychowski C., Lin C. et al. Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. // J.Virol. 1993. - Vol. 67. -P. 1385-1395.

150. Griffin S.D., Beale L.P., Clark D.S. et al. The p7 protein of hepatitis С virus forms an ion channel that is blocked by the antiviral drug, Amantadine // FEBS Lett. 2003. - Vol. 535. - P.34-38.

151. Gross J.B. Hepatitis C: A sexually transmitted disease? // Am. J. Gastroenterol. -2001.-Vol. 96. P.3051-3053.

152. Hadler S.C., de Monzon M.A., Lugo D.R. and Perez M. Effect of timing of hepatitis В vaccine doses on response to vaccine in Yucpa Indians. // Vaccine. -1989. Vol. 7-P.106-110.

153. Hagan H., Thiede H., Weiss N.S. et al. Sharing of drug preparation equipment as a risk factor for hepatitis C. // Am. J. Public. Health. 2001. - Vol. 91. -P.42-46.

154. Hajia M., Amirzargar A.A., Khedmat II. et al. Genotyping Pattern among Iranian HCV Positive Patients // Iranian J. Publ. Health. 2010. - Vol. 39. -№2. - P.39-44.

155. Harpaz R., McMahon B.J., Margolis H.S. et al. Elimination of new chronic hepatitis В virus infections: results of the Alaska immunization program. // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181 - P.413-418.

156. Hasegawa I., Tanaka Y., Kurbanov F. et al. Molecular epidemiology of hepatitis В virus in the United Republic of Tanzania. // J. Med. Virol. 2006. -Vol. 78 - P.1035-1042.

157. Hauri A.M., Armstrong G.L., Hutin Y.J. The global burden of disease attributable to contaminated injections given in health care settings. // Int. J. STD AIDS. -2004.-Vol. 15. -P.7-16.

158. Higgins D.G., Bleasby A.J. and Fuchs R. CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment. // Comput. Appl. Biosci. 1992. - Vol. 8 - P. 189191.

159. Hipgrave D.B., Nguyen T.V., Vu M.H. et al. Hepatitis B infection in rural Vietnam and the implications for a national program of infant immunization. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2003. - Vol. 69 - P.288-294.

160. Heermann K.H., Gerlich W.H., Chudy M. et al. Quantitative Determination of Hepatitis B Virus DNA in two International Reference Plasmas. // Submitted (OCT-1998) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases.

161. Hladik W., Kataaha P., Mermin J. et al. Prevalence and screening costs of hepatitis C virus among Ugandan blood donors. // Trop. Med. Int. Health. -2006. Vol. 11. - P.951-954.

162. Hoefs J.C., Renner I.G., Askhcavai M. and Redeker A.G. Hepatitis B surface antigen in pancreatic and biliary secretions. // Gastroenterology. 1980. - Vol. 79 - P.191-194.

163. Honorati M.C. and Facchini A. Immune response against HBsAg vaccine ISSN 1007-9327 CN 14-1219/R. // WJG. 1998. - Vol. 4 (6). - P.464-466.

164. Hottenrott S., Schumann T., Pluckthun A. et al. The Escherichia coli SlyD is a metal ion-regulated peptidyl-prolyl cis/trans-isomerase // J.Biol.Chem. 1997. -Vol. 272. - P.15697-15701.

165. Hsu M., Zhang J., Flint M. et al. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. // Proc. Natl. Acad. Sci. CLHA. 2003.-Vol. 100. - P.7271-7276.

166. Huang J.M., Huang T.H., Qiu H.Y. et al. Effects of hepatitis B virus infection on human sperm chromosomes. // World J. Gastroenterol. 2003. - Vol. 9 -P.736-740.

167. Hugle Т., Fehrmann F., Bieclc E. et al. The hepatitis С virus nonstructural protein 4B is an integral endoplasmic reticulum membrane protein // Virology. -2001.-Vol. 284. P.70-81.

168. Igietseme J.U., Eko F.O., He Q. et al. Antibody regulation of T-cell immunity: implications for vaccine strategies against intracellular pathogens // Expert. Review of Vaccines. 2004. - Vol. 3 9(1).- P.23-34.

169. Inchauspe G., Zebedee S.L., Lee D.H.H. et al. Genomic structure of the human prototype strain H of hepatitis С virus: Comparison with American and Japanese isolates. // Proc. Natl. Acad. Sci. США. 1991. - Vol. 88. - P. 1029210296.

170. Ishida S., Kaito M., Kohara M. et al. Hepatitis С virus core particle detected by immunoelectron microscopy and optical rotation technique. // Hepatol. Res. -2001. Vol. 20. - P.335-347.

171. Jack A.D., Hall A.J., Maine N., Mendy M. What Level of Hepatitis В Antibody Is Protective? // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 179. - P.489-492.

172. Jenison S.A., Lemon S.M., Baker L.N. and Newbold J.E. Quantitative analysis of hepatitis В virus DNA in saliva and semen of chronically infected homosexual men. // J. Infect. Dis. 1987. - Vol. 156 - P.299-307.

173. Jilg W., Schmidt M. and Deinhardt F. Vaccination against hepatitis B: comparison of three different vaccination schedules. // J. Infect. Dis. 1989. -Vol. 160 - P.766-769.

174. Kalinina O., Norder H., Vetrov T. et al. Shift in predominating subtype of HCV from lb to 3a in St. Petersburg mediated by increase in injecting drug use //J. Med. Virol. 2001. - Vol. 65. - P.517-524.

175. Kamili S., Krawczynski K., McCaustland K.A., Li X., Alter M.J. The infectivity of hepatitis C virus after drying and storing at room temperature // Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 2007. - Vol. 28. - P.519-524.

176. Kann M., Schmitz A. and Rabe B. Intracellular transport of hepatitis B virus // World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13 - P.39-47.

177. Karayiannis P., Novick D.M., Lok A.S. et al. Hepatitis B virus DNA in saliva, urine, and seminal fluid of carriers of hepatitis B e antigen. // Br. Med. J. (Clin. Res. Ed). 1985. - Vol. 290 - P.1853-1855.

178. Katayama K., Fukushi S., Kurihara C. et al. Full-length GBV-C/HGV genomes from nine Japanese isolates:characterization by comparative analyses. //Arch. Virol. 1998.-Vol.143.-P.l-13.

179. Kato N., Hijikata M., Ootsuyama Y. et al. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. // Proc. Natl. Acad. Sci. CIJLIA. 1990. - Vol. 87. - P.9524-9528.

180. Kato N., Ootsuyama Y., Ohkoshi S. et al. Characterization of hypervariable regions in the putative envelope protein of hepatitis C virus. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - Vol. 189. - P. 119-127.

181. Kato N. Genome of human hepatitis C virus (HCV): gene organization, sequence diversity, and variation. // Microb. Comp. Genomics. 2000. - Vol. 5. - P.129-151.

182. Kato N. Molecular virology of hepatitis C virus. // Acta. Med. 0kayama.-2001. -Vol. 55. P.133-159.

183. Kato T., FurCLLlAka A., Miyamoto M. et al. Sequence analysis of hepatitis C virus isolated from a fulminant hepatitis patient // J. Med. Virol. 2001. - Vol. 64. - P.334-339.

184. Kato 11., Orito E., Gish R., et al. Characteristics of hepatitis B virus isolates of genotype G and their phylogenetic differences from the other six genotypes (A through F).//J. Virol. 2002.- Vol.76. - P.6131-6137.

185. Kato T., Date T., Murayama A. et al. Cell culture and infection system for hepatitis C virus. // Nature protocols 2006. - Vol. 1(5). - P.2334-2339.

186. Kato N., Mori K., Abe K. et al. Efficient replication systems for hepatitis C virus using a new human hepatoma cell line. // Virus Research. 2009. - Vol. 146.-P.41-50.

187. Keck Z-Y., Sung V.M.H., Perkins S. et al. Human monoclonal antibody to hepatitis C Virus El glycoprotein that blocks virus attachment and viral infectivity // J. Virol. 2004. - Vol. 78(13). - P.7257-7263.

188. Kew M.C. Progress towards the comprehensive control of hepatitis B in Africa: a view from South Africa. // Gut. 1996. - Vol. 38(2) - P.31-36.

189. Khan A., Kurbanov F., Tanaka Y. et al. Epidemiological and clinical evaluation of hepatitis B, hepatitis C, and delta hepatitis viruses in Tajikistan. // J. Med. Virol. 2008. - Vol. 80 - P.268-276.

190. Khudyakov Y., Cong M., Bonafonte M. et al. Sequence variation within a nonstructural region of the hepatitis G virus genome. // J. Virol. 1997. - Vol. 71 (9). - P.6875-6880.

191. Kidd-Ljunggren K., Miyakawa Y. and Kidd A.H. Genetic variability in hepatitis B viruses. //J. Gen. Virol. 2002. - Vol. 83 - P. 1267-1280.

192. Kim Y.S., Ahn Y.O. and Kim D.W. Familial clustering of hepatitis В and С viruses in Korea. // J. Korean Med. Sei. 1994. - Vol. 9 - P.444-449.

193. Kita H., Hiroishi K., Moriyama T. et al. A minimal and optimal cytotoxic T cell epitope within hepatitis С virus nucleoprotein. // J. Gen. Virol. 1995. -Vol. 76/- P.3189-3 193.

194. Knipe D.M. и др. Fields Virology. Издательство "Lippincott-Raven Publishers". Philadelphia. - 2001.

195. Kohara M., Tsukiyama-Kohara K., Maki N. et al. Expression and characterization of glycoprotein gp35 of hepatitis С virus using recombinant vaccinia virus // J.Gen.Virol. 1992. - Vol. 73. - P.2313-2318.

196. Korenaga M., Hino K., Katoh Y. et al. A possible role of hypervariable region 1 quasispecies in escape of hepatitis С virus particles from neutralization. // J. Viral. Hepat. 2001. - Vol. 8. - P.331-340.

197. Kramvis A. and Kew M.C. Epidemiology of hepatitis В virus in Africa, its genotypes and clinical associations of genotypes. // Hepatol. Res. 2007. - Vol. 37 - P.9-19.

198. Krause G., Trepka M.J., Whisenhunt R.S. et al. Nosocomial transmission of hepatitis С virus associated with the use of multidose saline vials. // Infect. Control. Hosp. Epidemiol. -2003. Vol. 24. - P.122-127.

199. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B., Nei M. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software // Bioinformatics. 2001. - Vol. 17. -P. 1244-1245.

200. Kunkel M., Lorinczi M., Rijnbrand R. et al. Self-assembly of nucleocapsid-like particles from recombinant hepatitis С virus core protein // J. Virol. 2001. -Vol. 75. -P.2119-2129.

201. Kuo G., Choo Q.L., Alter H.J. et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis. // Science. 1989. -Vol. 244. - P.362-364.

202. Kupcinskas L., Petrauskas D., Petrenkiene V. and Saulius K. Prevalence of hepatitis B virus chronic carriers and risk factors for hepatitis B virus infection among lithuanian army soldiers. // Mil. Med. 2007. - Vol. 172 - P.625-627.

203. Kurbanov F., Tanaka Y., Sugauchi F. et al. Hepatitis C virus molecular epidemiology in Uzbekistan. // J. Med. Virol. 2003. - Vol.69. - P.367-375.

204. Kurbanov F., Tanaka Y., Avazova D. et al. Detection of hepatitis C virus natural recombinant RFl2k/lb strain among intravenous drug users in Uzbekistan // Hepatology Research. V.38. - № 5. - 2008. - P.457-464.

205. Lai IC.N., Li L., Au T., Tong L. Membranous nephropathy related to hepatitis B virus in adults. // The New England journal of medicine. 1991. - Vol. 324 (21).-P. 1457-1463.

206. Lanford R.E., Bigger C., Basset! S. and Klimpel G. The chimpanzee model of hepatitis C virus infections. // liar J. 2001. - Vol. 42. - P. 117-126.

207. Laskus T., Operskalski E.A., Radkowski M. et al. Negative-strand hepatitis C virus (HCV) RNA in peripheral blood mononuclear cells from anti-HCV-positive/HIV-infected women. // J. Infcct. Dis. 2007. - Vol. 195. - P. 124-133.

208. Lavie M., Goffard A., Dubuisson J. Assembly of a functional HCV glycoprotein heterodimer. // Curr. Issues Mol. Biol. 2007. - Vol. 9. - P.71-86.

209. Law M.G., Dore G.J., Bath N. et al. Modelling hepatitis C virus incidence, prevalence and long-term sequelae in Australia, 2001. // Int. J. Epidemiol. -2003.-Vol. 32. P.717-724.

210. Leary T.P., Muerhoff A.S., Simons J.N. et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: a novel member of the Flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis. // J. Med. Virol. 1996. - Vol. 48. - P.60-67.

211. Lee D.H., Kim J.H., Nam J.J., Kim H.R. and Shin H.R. Epidemiological findings of hepatitis B infection based on 1998 National Health and Nutrition Survey in Korea. // J. Korean Med. Sci. 2002. - Vol. 17 - P.457-462.

212. Lee C.L., Hsieh K.S. and Ko Y.C. Trends in the incidence of hepatocellular carcinoma in boys and girls in Taiwan after large-scale hepatitis B vaccination. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2003. - Vol. 12 - P.57-59.

213. Lemberg M.K., Martoglio B. Requirements for signal peptide peptidase-catalysed intramembrane proteolysis. // Mol. Cell. 2002. - Vol. 10. - P.735-744.

214. Lemon S.M., Layden T.J., Seeff L. et al. The 20th United States-Japan Joint Hepatitis Panel Meeting. //Hepatology. 2000. - Vol. 31 - P.800-806.

215. Levy M. and Koren G. Hepatitis B vaccine in pregnancy: maternal and fetal safety. // Am. J. Perinatol. 1991. - Vol. 8 - P.227-232.

216. Lindenbach B.D., Evans M.J., Syder A.J. et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. // Science. 2005. - Vol. 309. - P.623-626.

217. Linen J., Wages J., Zhangkeck Z.Y. et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. // Science. -1996.-Vol. 271. — P.505-508.

218. Logvinoff C., Major M.E., Oldach D. et al. Neutralizing antibody response during acute and chronic hepatitis C virus infection // Proc. Natl. Acad. Sci. CILIA. 2004. - Vol. 101. - P. 10149-10154.

219. Lohmann V., Korner F., Dobierzewska A. and Bartenschlager R. Mutations in hepatitis C virus RNAs conferring cell culture adaptation. // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P.1437-1449.

220. Lu S.N., Su W.W., Yang S.S. et al. Secular trends and geographic variations of hepatitis B virus and hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma in Taiwan. // Int. J. Cancer. 2006. - Vol. 119 - P. 1946-1952.

221. Lugoboni F., Migliozzi S., Mezzelani P. et al. Progressive decrease of hepatitis B in a cohort of drug users followed over a period of 15 years: the impact of anti-HBV vaccination. // Scand. J. Infect. Dis. 2004. - Vol. 36 - P. 131-133.

222. Lvov D.K., Samokhvalov E.I., Tsuda F. et al. Prevalence of hepatitis C virus and distribution of its genotypes in Northern Eurasia. // Arch. Virol. 1996. -Vol. 141. - P.1613-1622.

223. Lwin A.A., Shinji T., Khin M. et al. Hepatitis C virus genotype distribution in Myanmar: Predominance of genotype 6 and existence of new genotype 6 subtype. // Hepatol. Res. 2007. - Vol. 37. - P.337-345.

224. Macedo de Oliveira A., White K.L., Leschinsky D.P. et al. An outbreak of hepatitis C virus infections among outpatients at a hematology/oncology clinic. // Ann. Intern. Med. 2005. - Vol. 142. - P.898-902.

225. Maertens G. and Styuver E. Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. // In: The molecular medicine of viral hepatitis. Edited by T. J. Harrison & A. J. Zuckerman.: John Wiley and Sons Ltd. 1997. - P. 183-233.

226. Maertens G., Bosman F., De Martynoff G., Buyse M.-A. Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use // United States Patent #7026457. -2006.

227. Magdzik W.W. Hepatitis B epidemiology in Poland, Central and Eastern Europe and the newly independent states. // Vaccine. 2000. - Vol. 18(1) -P.13-16. •

228. Magnius L.O. and Espmark A. A new antigen complex co-occurring with Australia antigen // Acta Pathol. Microbiol. Scand. B. Microbiol. Immunol. -1972. Vol. 80 - P.335-337.

229. Magnius L.O. and Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene // Intervirology. 1995. - Vol. 38 - P.24-34.

230. Mahaney K., Tedeschi V., Maertens G. et al. Genotypic analysis of hepatitis C virus in American patients. // Hepatology. 1994. - Vol. 20. - P. 1405-1411.

231. Mahoney F.J. Update on diagnosis, management, and prevention of hepatitis B virus infection. // Clin. Microbiol. Rev. 1999. - Vol. 12 - P.351-366.

232. Major M.E., Mihalik K., Fernandez J. et al. Long-term follow-up of chimpanzees inoculated with the first infectious clone for hepatitis C virus // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P.3317-3325.

233. Mantegani P., Piaña F., Codecasa L., et al. Comparison of an In-house and a Commercial RD1-based ELISPOT-IFN-y Assay for the Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis. II Infection Clinical Medicine & Research. 2006. - Vol. 4 (4). - P.266 -272.

234. Mariano A., Mele A., Tosti M.E. et al. Role of beauty treatment in the spread of parenterally transmitted hepatitis viruses in Italy. // J. Med. Virol. 2004. -Vol. 74 - P.216-220.

235. Marsano L.S., West D.J., Chan I. et al. A two-dose hepatitis B vaccine regimen: proof of priming and memory responses in young adults. // Vaccine. -1998. Vol. 16 - P.624-629.

236. Masaki T., Suzuki R., Murakami K. et al. Interaction of hepatitis C virus nonstructural protein 5A with core protein is critical for the production of infectious virus particles. // J. Virol. 2008. - Vol. 82(16). - P.7964-7976.

237. Massari M., Petrosillo N., Ippolito G. et al. Transmission of hepatitis C virus in a gynecological surgery setting. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. -P.2860-2863.

238. Mathe C., Van Dooren S., Lemey P. et al. The Epidemic History of Hepatitis C Among Injecting Drug Users in Flanders, Belgium. // J. Viral. Hepat. 2008. -Vol. 15(6). - P.399-408.

239. Mawdsley J., Teo C.G., Kyi M., Anderson M. Anesthetist to patient transmission of hepatitis C virus associated with non exposure-prone procedures. //J. Med. Virol. 2005. - Vol. 75. - P.399-401.

240. McKeating J.A., Zhang L.Q., Logvinoff C., Flint M., Zhang J., Yu J. et al. Diverse hepatitis C virus glycoproteins mediate viral infection in a CD81-dependent manner. //J. Virol. 2004. - Vol. 78(16). - P.8496-8505.

241. Medhat A., Shehata M., Magder L.S. et al. Hepatitis c in a community in Upper Egypt: risk factors for infection. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2002. - Vol. 66. - P.633-638.

242. Meisel H., Reip A., Faltus B. et al. Transmission of hepatitis C virus to children and husbands by women infected with contaminated anti-D immunoglobulin // Lancet. 1995. - Vol. 345. - P. 1209-1214.

243. Mele A., Stroffolini T., Tosti M.E. et al. Heterosexual transmission of hepatitis C in Italy. // J. Med. Virol. 1999. - Vol. 57. - P.l 11-113.

244. Mercer D.F., Schiller D.E., Elliott J.F. et al. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers //Nat. Med. 2001. - Vol. 7. - P.927-933.

245. Merican I., Guan R., Amarapuka D. et al. Chronic hepatitis B virus infection in Asian countries. // J. Gastroenterol. Hepatol. 2000. - Vol. 15 - P.1356-1361.

246. Mikhailov M.I., Gomberg M.A., Dolzhanskaya N.A. and Koubanova A.A. Significance of sexual route of transmission of hepatitis B and C in Russia // Int. J. STD AIDS. 2002. - Vol. 13 Suppl 2. - P.9-11.

247. Milich D.R., Chen M.K., Hughes J.L. and Jones J.E. The secreted hepatitis B precore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid: a mechanism for persistence. //J. Immunol. 1998. - Vol. 160 - P.2013-2021.

248. Miyamura T. and Matsuura Y. Structural proteins of hepatitis C virus. // Trends Microbiol. 1993. - Vol. 1. - P.229-231.

249. Moaven L.D., TennaKoon P.S., Bowden D.S., Locarmini S.A. Mother-to-baby transmission of hepatitis G virus. // Medical journal of Australia. 1996. - Vol. 165 (2). - P.84-85.

250. Moolla N., Kew M. and Arbuthnot P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. // J. Viral. Hepat. 2002. - Vol. 9 - P.323-331.

251. Morice Y., Cantaloube J.F., Beaucourt S. et al. Molecular epidemiology of hepatitis C virus subtype 3a in injecting drug users. // J. Med. Virol. 2006. -Vol.78.-P.1296-1303.

252. Mosley J.W. The epidemiology of viral hepatitis: an overview. // Am. J. Med. Sci. 1975. - Vol. 270 - P.253-270.

253. Murakami K., Abe M., Kageyama T., Kamoshita N., Nomoto A. Downregulation of translation driven by hepatitis C virus internal ribosomal entry site by the 3'-untranslated region of RNA // Arch. Virol. 2001. - Vol. 146.-P.729-741.

254. Myung P., Mallette C., Taylor L., Allen S., Feller E. Sexual transmission of hepatitis C: practical recommendations // Med. Health. R. I. 2003. - Vol. 86. -P.168-171.

255. Naito IT, Hayashi S. and Abe K. The entire nucleotide sequence of two hepatitis G virus isolates belonging to,a novel genotype: isolation in Myanmar and Vietnam.//J. Gen. Virol. 2000. - Vol. 81(1). - P.189-194.

256. Nakao H., Okamoto H., Tokita H. et al. Full-length genomic sequence of a hepatitis C virus genotype 2c isolate (BEBE1) and the 2c-specific PCR primers. //Arch. Virol. 1996. - Vol. 141. -P.701-704.

257. Nakao H., Okamoto H., Fukuda M. et al. Mutation rate of GB virus C/hepatitis G virus over the entire genome and in subgenomic regions. // J.Virology. 1997. - Vol. 233(1). - P.43-50.

258. Nassal M. and Schaller II. Iiepatitis B virus replication—an update. // J. Viral Hepat. 1996. - Vol. 3 - P.217-226.

259. Nassal M. Hepatitis B virus replication: novel roles for virus-host interactions. // Intervirology. 1999. - Vol. 42 - P. 100-116.

260. Naumann H., Schaefer S., Yoshida C.F. et al. Identification of a new hepatitis B virus (HBV) genotype from Brazil that expresses HBV surface antigen subtype adw4. // J. Gen. Virol. 1993. - Vol.74. - P. 1627-1632.

261. Neddermann P., Tomei L., Steinkuhler C. et al. The nonstructural proteins of the hepatitis C virus: structure and functions. // Biol. Chem. 1997. - Vol. 378. - P.469-476.

262. Newman M., Suk F.M., Cajimat M. et al. Stability and morphology comparisons of self-assembled virus-like particles from wild-type and mutant human hepatitis B virus capsid proteins. // J. Virol. 2003. - Vol. 77 - P. 1295012960.

263. Ni Y.H., Chang M.H., Huang L.M. et al. Hepatitis B virus infection in children and adolescents in a hyperendemic area: 15 years after mass hepatitis B vaccination. //Ann. Intern. Med. 2001. - Vol. 135 - P.796-800.

264. Njouom R., Pasquier C., Ayouba A. et al. High rate of hepatitis C virus infection and predominance of genotype 4 among elderly inhabitants of a remote village of the rain forest of South Cameroon // J. Med. Virol. 2003. -Vol. 71. - P.219-225.

265. Norder H., Courouce A.M. and Magnius L.O. Complete genomes, phylogenetic relatedness, and structural proteins of six strains of the hepatitis Bvirus, four of which represent two new genotypes. // Virology. 1994. - Vol. 198 - P.489-503.

266. Nousbaum J.B., Pol S., Nalpas B., Landais P. et al. Group Collaborative Study. Hepatitis C virus type lb (II) infection in France and Italy. // Ann. Intern. Med.- 1995.-Vol. 122. P. 161-688.

267. Nowicki M.J., Laskus T., Nikolopoulou G. et al. Presence of hepatitis C virus (HCV) RNA in the genital tracts of HCV/IIIV-l-coinfected women. // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. - P.1557-1565.

268. Nurgalieva Z.Z., Hollinger F.B., Graham D.Y., Zhangabylova S. and Zhangabylov A. Epidemiology and transmission of hepatitis B and C viruses in Kazakhstan. // World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13 - P. 1204-1207.

269. Ogata N., Alter H.J., Miller R.H., Purcell R.H. Nucleotide sequence and mutation rate of the H strain of hepatitis C virus // Proc. Natl. Acad. Sci. CLL1A.- 1991. Vol. 88. - P.3392-3396.

270. Okamoto I-I., Tsuda F., Sakugawa H. et al. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes // J. Gen. Virol. 1988. - Vol. 69(10). - P.2575-2583.

271. Okamoto H., Okada S., Sugiyama Y. et al. Nucleotide sequences of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparison with reported isolates for conserved and divergent regions // J. Gen. Virol. -1991. Vol. 72. - P.2697-2704.

272. Okamoto H., Kojima M., Okada S. et al. Genetic drift of hepatitis C virus during an 8.2-year infection in a chimpanzee: variability and stability // Virology. 1992. - Vol. 190. - P.894-899.

273. Okamoto H., Kojima M., Sakamoto M. et al. The entire nucleotide sequence and classification of a hepatitis C virus isolate of a novel genotype from an Indonesian patient with chronic liver disease // J. Gen. Virol. 1994. - Vol. 75 (Pt 3). - P.629-635.

274. Osella A.R., Sonzogni L., Cavallini A. et al. Molecular epidemiology of hepatitis C virus infection in an area of hyperendemicity in Southern Italy: a population-based study. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P.2371-2372.

275. Quinn E.R., Chan C.H., Hadlock K.G. et al. The B-cell receptor of a hepatitis C virus (HCV)-associated non-Ilodgkin lymphoma binds the viral E2 envelope protein, implicating HCV in lymphomagenesis. // Blood. 2001. — Vol. 981. P.3745-3749.

276. Parana R. and Almeida D. HBV epidemiology in Latin America. // J. Clin. Virol. 2005. - Vol. 34(1) - P.130-133.

277. Parkin D.M., Bray F., Ferlay J. and Pisani P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. // Int. J. Cancer. 2001. - Vol. 94 - P. 153-156.

278. Pavio N. and Lai M.M.C. The hepatitis С virus persistence: how to evade the immune system? // J. Biosci. 2003. - Vol. 28. - P.287-330.

279. Pavlovic D., Neville D.C., Argaud O. et al. The hepatitis С virus p7 protein forms an ion channel that is inhibited by long-alkyl-chain iminosugar derivatives. //Proc. Natl. Acad. Sci. США. 2003. - Vol. 100. - P.6104-6108.

280. Perotti M., Mancini N., Diotti R.A. et al. Identification of a broadly cross-reacting and neutralizing human monoclonal antibody directed against the hepatitis С virus E2 protein // J. Virol. 2008. - Vol. 82(2) - P. 1047-1052.

281. Perrillo R.P., Gelb L., Campbell C. et al. Hepatitis В e antigen, DNA polymerase activity, and infection of household contacts with hepatitis В virus //Gastroenterology. 1979. - Vol. 76 - P. 1319-1325.

282. Pestlca J.M., Zeisel M.B., Blaser E. et al. Rapid induction of virus-neutralizing antibodies and viral clearance in a single-source outbreak of hepatitis C. // Proc. Natl. Acad. Sci. США. 2007. - Vol. 104 - P.6025-6030.

283. Petit J.M., Bour J.B., Aho L.S. et al. HCV and diabetes mellitus: influence of nosocomial transmission with the use of a finger stick device. // Am. J. Gastroenterol. 1999. - Vol. 94. - P.1709-1710.

284. Piazza M., Sagliocca L., Tosone G. et al. Sexual transmission of the hepatitis С virus and efficacy of prophylaxis with intramuscular immune serum globulin. A randomized controlled trial. // Arc. Intern. Med. 1997. - Vol. 157. - P. 15371544.

285. Ploss A., Evans M.J., Gaysinskaya V.A. et al. Human occludin is a hepatitis С virus entry factor required for infection of mouse cells // Nature. 2009. -Vol. 457(7231). - P.882-886.

286. Pokorski R.J. and Ohlmer U. Long-term morbidity and mortality in Chinese insurance applicants infected with the hepatitis B virus. // J. Insur. Med. 2001. - Vol. 33 -P.143-164.

287. Polyak S.J., Khabar K.S., Rezeiq M., Gretch D.R. Elevated levels of interleukin-8 in serum are associated with hepatitis C virus infection and resistance to interferon therapy. // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P.6209-6211.

288. Polyak S.J., Khabar K.S., Paschal D.M. et al. Hepatitis C virus nonstructural 5A protein induces interleukin-8, leading to partial inhibition of the interferon-induced antiviral response. //J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P.6095-6106.

289. Preisler-Adams S., Schlayer H.J., Peters T., Korp R., Rasenack J. Complete nucleotide sequence of a hepatitis B virus, subtype adw2, and identification of three types of C open reading frame. // Nucleic Acids Res. 1993. - Vol.21. -P.2258-2260.

290. Premkumar A., Wilson L., Ewart G.D., Gage P.W. Cation-selective ion channels formed by p7 of hepatitis C virus are blocked by hexamethylene amiloride. // FEBS Lett. 2004. - Vol. 557. - P.99-103.

291. Prince A.M. Relation of Australia and SH antigens. // Lancet. 1968. - Vol.2 -P.462-463.

292. Querenghi F., Yu Q., Billaud G., Maertens G., Trepo C., Zoulim F. Evolution of hepatitis C virus genome in chronically infected patients receiving ribavirin monotherapy. // J. Viral. Hepat. 2001. - Vol. 8. - P. 120-131.

293. Radkowski M., Wilkinson J., Nowicki M. et al. Search for hepatitis C virus negative-strand RNA sequences and analysis of viral sequences in the central nervous system: evidence of replication. // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P.600-608.

294. Radkowski M., Gallegos-Orozco J., Jablonska J. Persistence of hepatitis C virus in patients successfully treated for chronic hepatitis C. // Hepatology. -2005. Vol. 41. - P. 106-114.

295. Ralston R., Thudium K., Berger K., et al. Characterization of hepatitis c virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia virus // J. Virol. 1993. - Vol. 67. - P.6753-6761.

296. Ralston R., Marcus P., Thudium K. et al. Antibodies to hepatitis C virus asialoglycoproteins // United States Patent #7105303. 2001.

297. Ramia S. & Eid-Fares, J. Distribution of hepatitis C virus genotypes in the Middle East // Int J. Infect. Dis. 2006. - Vol. 10. - P.272-277.

298. Raney A.K., Johnson J.L., Palmer C.N. and McLachlan A. Members of the nuclear receptor superfamily regulate transcription from the hepatitis B virus nucleocapsid promoter.//J. Virol. 1997.-Vol. 71 - P. 105 8-1071.

299. Ranjith-Kumar C.T., Gajewski J., Gutshall L. et al. Terminal nucleotidyl transferase activity of recombinant Flaviviridae RNA-dependent RNA polymerases: implication for viral RNA synthesis. // J. Virol. 2001. - Vol. 75.- P.8615-8623.

300. Ray R.B. & Ray R. Hepatitis C virus core protein: intriguing properties and functional relevance. // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - Vol. 202. - P. 149-156.

301. Reshetnikov O.V., Khryanin A.A., Teinina T.R. et al. Hepatitis B and C seroprevalence in Novosibirsk, western Siberia // Sex. Transm. Infect. 2001. -Vol. 77. - P.463-473.

302. Rho H.M., Kim K., Hyun S.W., Kim Y.S. The nucleotide sequence and reading frames of a mutant hepatitis B virus subtype adr. // Nucleic Acids Res.- 1989. Vol. 17(5). - P.2124-2133.

303. Roberts E.A. and Yeung L. Maternal-infant transmission of hepatitis C virus infection. // Hepatology. 2002. - Vol. 36. - P. 106-113.

304. Rosenberg S. Recent advances in the molecular biology of hepatitis C virus. // J. Mol. Biol. -2001. -Vol. 313,- P.451-464.

305. Ross R.S., Viazov S., Renzing-Kohler K., Roggendorf M. Changes in the epidemiology of hepatitis C infection in Germany: shift in the predominance of hepatitis C subtypes. // J. Med. Virol. 2000. - Vol.60. - P.122-125.

306. Ross R.S., Viazov S., Roggendorf M. Phylogenetic analysis indicates transmission of hepatitis C virus from an infected orthopedic surgeon to a patient. // J. Med. Virol. 2002. - Vol. 66. - P.461-467.

307. Ross R.S., Viazov S., Thormahlen M. et al. Risk of hepatitis C virus transmission from an infected gynecologist to patients: results of a 7-year retrospective investigation. // Arch. Intern. Med. 2002. - Vol. 162. - P.805-810.

308. Ross R.S., Viazov S., Gross T., et al. Transmission of hepatitis C virus from a patient to an anesthesiology assistant to five patients. // N. Engl. J. Med. 2002. - Vol. 343. - P.1851-1854.

309. Ruzibakiev R., Kato H., Ueda R. et al. Risk factors and seroprevalence of hepatitis B virus, hepatitis C virus and human immunodeficiency virus infection in Uzbekistan. // Intervirology. 2001. - Vol. 44. - P.327-332.

310. Sagnelli E., Stroffolini T., Mele A. et al. The importance of HCV on the burden of chronic liver disease in Italy: a multicenter prevalence study of 9,997 cases. // J. Med. Virol. 2005. - Vol. 75. - P.522-527.

311. Sakamoto N., Enomoto N., Kurosaki M., Marumo F., Sato C. Sequential change of the hypervariable region of the hepatitis C virus genome in acute infection//J. Med. Virol. 1994.-Vol. 42. - P. 103-108.

312. Sakamoto M., Akahane Y., Tsuda F. et al. Entire nucleotide sequence and characterization of a hepatitis C virus of genotype V/3a. // J. Gen. Virol. 1994. -Vol. 75. — P.1761-1768.

313. Sallberg M., Ruden U., Wahren B. and Magnius L.O. Immune response to a single peptide containing an immunodominant region of hepatitis C virus core protein: the isotypes and the recognition site. // Immunol. Lett. 1992. - Vol. 33. - P.27-33.

314. Sarih M., Bouchrit N. and Benslimane A. Different cytokine profiles of peripheral blood mononuclear cells from patients with persistent and self-limited hepatitis C virus infection // Immunol. Lett. 2000. - Vol. 74. — P. 117— 120.

315. Sarobe P. Can VHC subvert dendritic cell function? // EASL Postgraduate Course. Vienna, Austria, April 26-27. 2006. - P.25-29.

316. Sastrosoewignjo R.I., Omi S., Okamoto H., Mayumi M., Rustam M. and Sujudi. The complete nucleotide sequence of FIBV DNA clone of subtype adw (pMND122) from Manado in Sulawesi Island, Indonesia. // ICMR Ann. 1987. -Vol. 7. — P.51-60.

317. Savey A., Simon F., Izopet J., Lepoutre A., Fabry J., Desenclos J.C. A large nosocomial outbreak of hepatitis C virus infections at a hemodialysis center. Infect Control. // Hosp. Epidemiol. 2005. - Vol. 26. - P.752-760.

318. Scaglioni P.P., Melegari M. and Wands J.R. Posttranscriptional regulation of hepatitis B virus replication by the precore protein // J. Virol. 1997. - Vol. 71 -P.345-353.

319. Schaefer S. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. // World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13 - P. 14-21.

320. Schiff E.R., de Medina M.D., Kline S.N. et al. Veterans Administration cooperative study on hepatitis and dentistry. // J. Am. Dent. Assoc. 1986. -Vol. 113 - P.390-396.

321. Schmidt H.A., Strimmer K., Vingron M. and von Haeseler A. TREE-PUZZLE: maximum likelihood phylogenetic analysis using quartets and parallel computing. // Bioinformatics. 2002. - Vol. 18. - P.502-504.

322. Schmitt S., Glebe D., Alving K. et al. Analysis of the pre-S region of hepatitis B virus //J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274 - P. 11945-11957.

323. Schröter M., Zöllner B., Schäfer P. et al. Epidemiological dynamics of hepatitis C virus among 747 German individuals: new subtypes on the advance. //J. Clin. Microbiol. -2002.-Vol.40. P. 1866-1868.

324. Seeger C. and Mason W.S. Hepatitis B virus biology. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - Vol. 64 - P.51-68.

325. Seong Y.R., Lee C.H., Im D.S. Characterization of the structural proteins of hepatitis C virus expressed by an adenovirus recombinant. // Vir. Res. 1998. -Vol. 55. - P.177-185.

326. Shah H.A., Jafri W., Malik I., Prescott L. and Simmonds P. Hepatitis C virus (HCV) genotypes and chronic liver disease in Pakistan. // J. Gastroenterol. Hepatol. 1997. - Vol. 12. - P.758-761.

327. Shepard C.W., Simard E.P., Finelli L., Fiore A.E. and Bell B.P. Hepatitis B virus infection: epidemiology and vaccination. // Epidemiol. Rev. 2006. - Vol. 28 - P.l 12-125.

328. Shimizu Y.K., Feinstone S.M., Kohara M. et al. Hepatitis C virus: detection of intracellular virus particles by electron microscopy. // Hepatology/ 1996. -Vol. 23. - P.205-209.

329. Shimizu Y.K., Igarashi H., Kiyohara T. A hyperimmune constructs against a synthetic peptide corresponding to the hypervariable region 1 of hepatitis Cvirus can prevent viral infection in cell cultures // Virol. 1996. - Vol. 223 -P.409-412.

330. Silini E., Locasciulli A., Santoleri L. et al. HCV infection in a hematology ward: evidence for nosocomial transmission and impact on hematologic disease outcome. // Haematologica. 2002. - Vol. 87. -P. 1200-1208.

331. Simmonds P. Reconstructing the origins of human hepatitis viruses. // Philos. Trans. R. Soc. bond. B. Biol. Sci. -2001. Vol. 356.-P. 1013-1026.

332. Simmonds P. The origin and evolution of hepatitis viruses in humans. // J. Gen. Virol. 2001. - Vol. 82. - P.693-712.

333. Simmonds P., Bukh J., Combet C. et al. Consensus proposal for a unified system of nomenclature of hepatitis С virus genotypes // Hepatology. 2005. -Vol. 42. - P.962-973.

334. Singleton P. and Sainsbury D. Dictionary of microbiology and molecular biology. // 3rd Edition. John Wiley & Sons. Portland. - 2002. - США.

335. Sitia G., Cella D., De Mitri M.S., Novati R. et al. Evolution of the E2 region of hepatitis С virus in an infant infected by mother-to-infant transmission. // J. Med. Virol. 2001. - Vol. 64. - P.476-481.

336. Smith D.B., Basaras M., Frost S. et al. Phylogenetic analysis of GBV-C/hepatitis G virus. // J. Gen. Virol. 2000. - Vol. 81,- P.769-780.

337. Smuts H.E., Kannemeyer J. Genotyping of hepatitis С virus in South Africa // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P.1679-1681.

338. Soldan K., Gay N.J., Allain J.P. et al. The prevalence of hepatitis В infection in adults with no recognized increased risk of infection. // J. Infect. 2000. -Vol. 41 - P.198-199.

339. Sood A., Midha V., Sood N., Awasthi G. Prevalence of anti-HCV antibodies among family contacts of hepatitis С virus-infected patients. // Indian J. Gastroenterol. 2002. - Vol. 21. - P. 185-187.

340. Stempniak M., Hostomska Z., Nodes B.R. and Hostomsky Z. The NS3 proteinase domain of hepatitis C virus is a zinc-containing enzyme. // J. Virol. -1997. Vol. 71. - P.2881-2886.

341. Stuyver L., De Gendt S., Van Geyt C. et al. A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness. // J. Gen. Virol. 2000. -Vol. 81 - P.67-74.

342. Suzuki K., Mizokami M., Cao K. et al. Prevalence of hepatitis C virus infection in Nanjing, southern China. // Eur. J. Epidemiol. 1997. - Vol. 13. -P.511-515.

343. Szmuness W., Stevens C.E., Harley E.J. et al. Hepatitis B vaccine in medical staff of hemodialysis units: efficacy and subtype cross-protection. // N. Engl. J. Med. 1982. - Vol. 307 - P.1481-1486.

344. Tackett A.J., Wei L., Cameron C.E. and Raney K.D. Unwinding of nucleic acids by HCV NS3 helicase is sensitive to the structure of the duplex. // Nucleic Acids Res. 2001. - Vol. 29. - P.565-572.

345. Takahashi K., Hijikata M., Aoyama K. et al. Characterization of GBV-C/HGV viral genome: comparison among different isolates for a ~2Kb-sequence that covers entire El and most of 5'UTR and E. // Int. Hepatol. Commun. 1997. - Vol. 6. - P.253-263.

346. Takamizawa A., Mori C., Manabe S. et al. The structure and organization of the Hepatitis C virus genome isolated from human carriers. // J. Virol. 1991. -Vol. 65. - P.l 105-1113.

347. Tamada Y. Yano K. Komatsu T. et al. Hepatitis B virus isolate B3586-YKH94, complete genome. // Direct Submission Submitted (04-DEC-2006)

348. CRC, National Nagasaki Medical Center, 2-1001-1 ICubara, Omura 856-8562, Japan.

349. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution. 2007. - Vol. 24. - P. 1596-1599.

350. Tanaka E. Does GBV-C/HGV replicate in the liver? // Journal of Gastroenterology. 1999. - Vol. 34. - P.721-723.

351. Tarr A.W., Owsianka A.M., Szwejk A., Ball J., K., Patel A.H. Cloning, expression and functional analysis of patient-derived hepatitis C virus glycoproteins // Methods Mol. Biol. 2007. - Vol. 379. - P. 177-197.

352. Terrault N.A. Sexual activity as a risk factor for hepatitis C. // Hepatology. -2002. Vol. 36. - P.99-105.

353. Thaikruea L., Thongsawat S., Maneekarn N. et al. Risk factors for hepatitis C virus infection among blood donors in northern Thailand. // Transfusion. -2004. Vol. 44. - P. 1433-1440.

354. Thiel H.J., Collett M.S., Gould E.A. et al. Flaviviridae. In: Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U,Ball LA, eds // Virus Taxonomy, Vlllth Report of the ICTV. 2005. - P. 979-996.

355. Thomas D.L., Vlahov D., Solomon L. et al. Correlates of hepatitis C virus infections among injection drug users. // Medicine. 1995. - Vol. 74. - P.212-220.

356. Thomas D.L., Zenilman J.M., Alter H.J. et al. Sexual transmission of hepatitis C virus among patients attending sexually transmitted diseases clinics in Baltimore-an analysis of 309 sex partnerships. // J. Infect. Dis. 1995. - Vol. 71. - P.768-775.

357. Toldta LI., Okamoto H., Iizuka H. et al. Hepatitis C virus variants from Jakarta, Indonesia classifiable into novel genotypes in the second (2e and 2f)> tenth (10a) and eleventh (11a) genetic groups. // J. Gen. Virol. 1996. - Vol. 77. -P.293-301.

358. Tokita LL, Okamoto H., Iizuka H. et al. The entire nucleotide sequences of three hepatitis C virus isolates in genetic groups 7-9 and comparison with those in the other eight genetic groups. // J. Gen. Virol. 1998. - Vol. 79. - P. 18471857.

359. Tong S., Li J., Vitvitski L. and Trepo C. Active hepatitis B virusreplication in the presence of anti-HBe is associated with viral variants containing an inactive pre-C region. // Virology. 1990. - Vol. 176. - P.596-603.

360. Toukan A.U., Sharaiha Z.K., Abu-el-Rub O.A. et al. The epidemiology of hepatitis B virus among family members in the Middle East. // Am. J. Epidemiol. 1990. - Vol. 132 - P.220-232.

361. Toukan A.U. Hepatitis B in the Middle East: aspects of epidemiology and liver disease after infection. // Gut. 1996. - Vol. 38(2) - P.2-4.

362. Tovo P.A., Lazier L. and Versace A. Hepatitis B virus and hepatitis C virus infections in children. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2005. - Vol. 18 - P.261-266.

363. Triki H., Said N., Ben Salah A. et al. Seroepidemiology of hepatitis B, C and delta viruses in Tunisia. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1997. - Vol. 91 -P. 11-14.

364. Triyatni M., Vergalla J., Davis A.R. et al. Structural features of envelope proteins on hepatitis C virus-like particles as determined by anti-envelope monoclonal antibodies and CD81 binding. // Virology. 2002. - Vol. 298. -P. 124-132.

365. Valiante N.M., D'Andrea A., Crotta S. et al. Life, activation and death of intrahepatic lymphocytes in chronic hepatitis C. // Immunol. Rev. 2000. - Vol. 174.-P.77-89.

366. Valliammai T., Thyagarajan S.P., Zuckerman A.J. and Harrison T.J. Diversity of genotypes of hepatitis C virus in southern India. // J. Gen. Virol. 1995. -Vol. 76.-P.711-716.

367. Van der Sande M.A., Waight P., Mendy M. et al. Long-term protection against carriage of hepatitis B virus after infant vaccination. // J. Infect. Dis. 2006. -Vol. 193 (11). - P. 1528-1535.

368. Van Ilattum J., Boland G.J., Jansen K.G. et al. Transmission profile of hepatitis B virus infection in the Batam region, Indonesia. Evidence for a predominantly horizontal transmission profile. // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. -Vol. 531 - P.177-183.

369. Viazov S., Kuzin S., Paladi N. et al. Hepatitis C virus genotypes in different regions of the former Soviet Union (Russia, Belarus, Moldova, and Uzbekistan). // J. Med. Virol. 1997. - Vol. 53. - P.36-40.

370. Viazov S., Riffelmann M., Khoudyakov Y et al. Genetic heterogeneity of hepatitis G virus isolates from different parts of the world. // J. Gen. Virol. -1997.-Vol. 78. P.577-581.

371. Vildosola G.H. Hepatitis B vaccination impact on acute disease, chronic earners and hepatocarcinoma incidence. // Rev. Gastroenterol. Peru. 2000. -Vol. 20-P.414-421.

372. Vieth S., Manegold C., Drosten C., Nippraschk T., Gunther S. Sequence and phylogenetic analysis of hepatitis B virus genotype G isolated in Germany. // Virus Genes. 2002. - Vol. 24. - P. 153-156.

373. Viviani S., Jack A., Hall A.J. et al. Hepatitis B vaccination in infancy in The Gambia: protection against carriage at 9 years of age. // Vaccine. 1999. - Vol.17 P.2946-2950.

374. Wakita T., Pietschmann T., Kato T. et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. // Nat. Med. 2005. - Vol. 11. -P.791-796.

375. Walsh B., Maguire H. and Carrington D. Outbreak of hepatitis B in an acupuncture clinic. // Commun. Dis. Public Health. 1999. - Vol. 2 - P. 137-140.

376. Wang Y., Okamoto H., Tsuda F. et al. Prevalence, genotypes, and an isolate (HC-C2) of hepatitis C virus in Chinese patients with liver disease. // J. Med. Virol. 1993. - Vol. 40. - P.254-260.

377. Wang S., Peng G., Li M. et al. Identification of hepatitis B virus vertical transmission from father to fetus by direct sequencing. // Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 2003. - Vol. 34 - P.106-113.

378. Wang J.S., Chen H. and Zhu Q.R. Transformation of hepatitis B serologic markers in babies born to hepatitis B surface antigen positive mothers. // World J. Gastroenterol. 2005. - Vol. 11 - P.3582-3585.

379. Wang Y., Xia X., Li C., Maneekarn N. et al. A new HCV genotype 6 subtype designated 6v was confirmed with three complete genome sequences. // J. Clin. Virol. 2009. - Vol. 44(3). - P. 195-199.

380. Weber M., Bronsema V., Bartos H. et al. Hepadnavirus P protein utilizes a tyrosine residue in the TP domain to prime reverse transcription. // J. Virol. -1994. Vol. 68 - P.2994-2999.

381. Wounderlich G. and Bruss V. Characterization of early hepatitis B virus surface protein oligomer. // Arch. Virol. 1996. - Vol. 141 - P. 1191-1205.

382. Wu R.R., Mizokami M., Lau J.Y. ct al. Seroprevalence of hepatitis C virus infection and its genotype in Lanzhou, western China. // J. Med. Virol. 1995. -Vol. 45. -P.174-178.

383. Xu L.Z., Larzul D., Delaporte E., Brechot C., Kremsdorf D. Hepatitis C virus genotype 4 is highly prevalent in Central Africa (Gabon). // J. Gen. Virol. -1994. Vol. 75. - P.2393-2398.

384. Yagnik A.T., Lahm A., Meola A. et al. A model for the hepatitis C virus envelope glycoprotein E2. // Proteins. 2000. - Vol. 40. - P.355-366.

385. Yamada N., Manihara K., Mizokami M. et al. Full-length sequence of the genome of hepatitis C virus type 3a: comparative study with different genotypes. // J.Gen. Virol. 1994. - Vol. 75. - P.3279-3284.

386. Yan F.M., Chen A.S., Hao F. et al. Hepatitis C virus may infect extrahepatic tissues in patients with hepatitis C. // World J. Gastroenterol. 2000. - Vol. 6. -P.805-811.

387. Yanase Y., Ohida T., Kaneita Y. et al. The prevalence of HIV, HBV and HCV among Filipino blood donors and overseas work visa applicants. // Bull. World Health Organ. 2007. - Vol. 85 - P. 131-137.

388. Yazdanpanah Y., De Carli G., Migueres B. et al. Risk factors for hepatitis C virus transmission to health care workers after occupational exposure: a European case-control study. // Clin Infect Dis. 2005. - Vol. 41. -P. 14231430.

389. Yu X. and Mertz J.E. Critical roles of nuclear receptor response elements in replication of hepatitis B virus. // J. Virol. 2001. - Vol. 75 - P. 11354-11364.

390. Yu M.Y., Bartosch В., Zhang P. et al. Neutralizing antibodies to hepatitis С virus (HCV) in immune globulins derived from anti-HCV-positive plasma // Proc. Natl. Acad. Sci. США. 2004. - Vol. 101. - P.7705-7710.

391. Yuen M.F., Lim W.L., Chan A.O. et al. 18-year follow-up study of a prospective randomized trial of hepatitis В vacctination without booster doses in children // Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2004. - Vol. 2(10). - P. 941-945.

392. Zang P., Wu C.G., Mihalik K., Virata-Theimer M.L. et al. Hepatitis С virus epitope-specific neutralizing antibodies in Igs prepared from human plasma // Proc. Natl. Acad. Sci. США. 2007. - Vol. 104(20) - P.8449-8454.

393. Zhang Z.-X., Sonnerborg A., Sallberg M. Antigenic structure of the hepatitis С virus envelope 2 protein // Clin. Exp. Immunol. 1994. - Vol. 98. - P.382-387.

394. Zhang Y.Y., Lok A.S., Chan D.T. and Widell A. Greater diversity of hepatitis С virus genotypes found in Hong Kong than in mainland China. // J.Clin. Microbiol. 1995.-Vol. 33. - P.2931-2934.

395. Zhang J., Zou S. and Giulivi A. Epidemiology of hepatitis В in Canada. // Can. J. Infect. Dis. 2001. - Vol. 12 - P.345-350.

396. Zhang P., Wu C.G., Mihalik K. et al. Hepatitis С virus epitope-specific neutralizing antibodies in Igs prepared from human plasma. // Proc. Natl. Acad. Sci. США. 2007. - Vol. 104. - P.8449-8454.

397. Zhang P., Zhong L., Struble E.B. et al. Depletion of interfering antibodies in chronic hepatitis С patients and vaccinated chimpanzees reveals broad cross-genotype neutralizing activity. // Proc. Natl. Acad. Sci. США. 2009. - Vol. 106. - P.7537-7541.

398. Zuckerman J.N. and Zuckerman A.J. Current topics in hepatitis B. // J. Infect. -2000.-Vol. 41 P.130-136.

Информация о работе

Кочнева, Галина Вадимовна
доктора биологических наук
Кольцово, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кочнева, Галина Вадимовна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кочнева, Галина Вадимовна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кочнева, Галина Вадимовна, Кольцово

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология