Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
p53-зависимые сигнальные пути в опухолевых клетках с диким типом p53
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "p53-зависимые сигнальные пути в опухолевых клетках с диким типом p53"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА
На правах рукописи
РАЗОРЁНОВА Ольга Валериевна
р53-ЭАВИСИМЫЕ СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ С ДИКИМ ТИПОМ р53.
Специальность 03.00.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА-2005
Работа выполнена в лаборатории пролиферации клеток Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
П.М. Чумаков
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
B.C. Прасолов
доктор биологических наук A.A. Штиль
Ведущая организация: ГНИИ генетики и селекции
промышленных микроорганизмов
Защита диссертации состоится «ЯЪ» 2005 года
в^ часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.
Автореферат разослан «23» JAdJj 2005 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук
¿У /
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Многочисленные сигнашьные пути отслеживают состояние клетки, и в случае возникновения стрессовых условий, угрожающих приобретением наследуемых изменений генетического материала, вызывают активацию белка р53. В результате клетки либо временно задерживаются в сверочных точках клеточного цикла, 1 де они имеют возможность исправить возникшие повреждения в процессе репарации ДНК, либо полностью выключаются из дальнейших делений, подвергаясь клеточной смерти по типу апоптоза или клеточному старению, ведущему к смерти по типу некроза Таким образом, белок р53 является центральным компонентом механизма, обеспечивающего удаление из организма патологических клеток Утрата гена р53 приводит к накоплению генетических повреждений, приводящих к потере контроля над отдельными клетками со стороны целого организма, злокачественному росту и смерти
Интактность гена р53 важна при использовании химио- и радиотерапии для лечения раковых заболеваний Многие химические соединения, используемые для предотвращения злокачественного роста опухолей, приводят к повреждениям ДНК, которые активирую-! белок р53, что, в свою очередь, приводит к апоптозу раковых клеток Однако существует ряд случаев злокачественного роста опухолей, характеризующихся диким типом бежа р53, но не регрессирующих в ответ па применение химио- или радиотерапии. Этот факт говорит о том, что белок р53 по какой-то причине не может быть активирован в данном типе клеток, или его активация недостаточна для индукции апоптоза При этом возникает вопрос об интактности р53-зависимого сигнального пути, а также взаимосвязанных с ним путей передачи сигнала. Известно, что р53 может активироваться в ответ на целый ряд стрессовых воздействий, включающих не только повреждения ДНК, но и гипоксию (кислородное голодание) и тепловой шок Также известна связь р53 сигнального пути с такими путями стрессового ответа, центральными компонентами которых являются индуцируемый гипоксией фактор (Н№-1) и фактор теплового шока (ШР-1) Таким образом, изучение Н1Б-1 и ЩР-1 активностей наряду с транскрипционной активностью белка р53 может пролить свет на многие аспекты клеточного реагирования на стресс, особенно в контексте опухолевого роста. Изучение механизмов клеточного реагирования на вышеперечисленные стрессы является
областью активных научных исследований и обещает разработку в будущем новых подходов к предотвращению и лечению рака и многих других патологических заболеваний
Цель и задачи исследования
Основной целью дапиой работы являлось исследование активности р53 сигнального пути в клеточных линиях различного происхождения.
В ходе исследования были поставлены следующие задачи1
1 Создание индивидуальных для каждого транскрипционного фактора (р53, НГР-1 и Н5Р-1) репортерных кассет, включающих в себя а) мультимеризованные палиндромные последовательности, узнаваемые и связываемые данными транскрипционными факторами, б) минимальный промотор гена теплового шока 70 или раннего гена цитомегаловируса; в) репортерный ген зеленого флуоресцентного белка или Р-галактозидазы
2 Получение и оптимизация работы репортерных кассет в контексте ретровирусной и лен гивирусной систем доставки репортера Проверка адекватности количественной оценки активностей белков р53 и НШ-1 по экспрессии репортерного гена в различных клеточных системах
3 Анализ уровня экспрессии и локализации белка р53 и ряде опухолевых клеточных линий, особенно в линиях с диким типом гена р53
4 Проверка гипотезы о цитоплазматическом заякоривании белка р53 в цитоплазме ряда меланомных клеточных линий.
5 Изучение влияния различных стрессовых воздействий, главным образом обработок повреждающими ДНК соединениями, на транскрипционную функцию белка р53 в меланомных клеточных линиях с различным статусом генар53 по сравнению с нормальными меланоцитами.
Научная новизна и практическая ценность работы
Сочетание новейших подходов к конструированию репортерных систем для измерения активности транскрипционных факторов с векторной технологией вирусной доставки трансгенов в клетки-мишени позволило нам создать три репортерные системы Главными преимуществами полученных репортерных конструкций являются а) возможность их транедукции в широкий спектр клеточных линий, включая высокодифференцированные и
неделящиеся клетки, с эффективностью близкой к 100%, б) возможность количественной оценки динамики транскрипционной активности белков р53, НШ-1 и ШР-1 в клеточных системах в ответ на специфические «активирующие» или «инактивируюшие» воздействия Таким образом, созданные репортериые конструкции позволяют получать из практически любых клеточных культур стабильные репортерные линии, которые могут быть использованы для скрининга химических и биологических модуляторов активностей р53, Н1Р-1 и Н5Р-1 транскрипционных факторов. Выявление модуляторов вышеперечисленных факторов важно для создания новых противоопухолевых препаратов
Работа, главным образом, была сконцентрирована на изучении р53 сигнального пути в ряде клеточных линий, характеризующихся экспрессией р53 дикого типа Мы провели эксперименты по оценке уровня экспрессии, локализации и транскрипционной активности белка р53 Особое внимание было уделено клеточным линиям меланом и почечных карцином, в которых мутации в гене р53 достаточно редки Проведенные эксперименты убедительно показали, что в подавляющем большинстве меланомных клеточных линий с диким типом гена р53, включая нормальные меланоциты, р53-зависимая транскрипция в ответ на обработку классическими р53-активируюшими химическими соединениями не нарушена В опухолевой клеточной линии почечного происхождения (АСНЫ) транскрипционная функция р53 подавлена, что характерно и для первичных почечных клеток Полученные данные говорят о тканеспецифичности регуляции активности белка р53, аспекты которой сохраняются после перехода клеток в статус злокачественных
Впервые в ряде меланомных клеточных линий, включая нормальные меланоциты, нами была детектирована экспрессия белка с молекулярной массой около 250 кДа, имеющего IX)-1 эпитоп. характерный для белка р53 Экспрессия этого 250 кДа белка, по-видимому, является тканеспецифичной, поскольку этот белок не был ранее детектирован 00-1 антителами ни в одном другом клеточном типе Установлено, что этот белок локализуется в цитоплазме на/в эндосомах, и экспрессия БО-1 эпигопа/самого белка падает в ответ на обработку определенным химическим соединением, специфичным для каждой из исследованных меланомных клеточных линий.
Проведен анализ механизма действия камптотецина, который является противомеланомным химиотерапевтическим препаратом Показано, что стабилизация и активация белка р53 коррелирует со снижением экспрессии его белка-ингибитора 1н1т2 на
уровне мРНК Этот механизм действия камптотецина является специфичным именно для опухолевых клеток меланомного происхождения, поскольку экспрессия Мт2 при обработке камптотецином повышается в нормальных меланоцитах
Апробация диссертации Материалы диссертации были доложены на ежегодном собрании американского общества биохимии и молекулярной биологии и на 8-ой конференции международного общества биохимии и молекулярной биологии (IUBMB/ASBMB) "A Molecular Exploration of the Cell" (Бостон, Массачусетс, 12-16 июня, 2004), конференции SKCC "Genomics, Signaling and Tumor Targeting" (Сан Диего, Калифорния, 1-5 марта, 2004), конференции CSHL "Cancer Genetics and Tumor Suppressor Genes" (Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 18-22 августа, 2004) и на лабораторном коллоквиуме лаборатории пролиферации клеток в Институте Молекулярной Биологии им В А ЭнгельгардтаРАН (Москва, 10 ноября, 2004)
Структура и объем работы Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 4 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения и выводов. Список литературы цитирует 31ß работ
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Получение и оптимизация работы ретро/лентивирусных репортерных конструкций для оценки транскрипционной активности белка р53
С целью оценки транскрипционной активности белков р53, HIF-1 и HSF-1 в клеточной системе мы создали серию репортерных конструкций. Все репортерные плазмиды получили на основе самоинактивирующихся ретровирусных (pUSTdS-mCMV-lacZ; pSIP-mHsp70-lacZ) или лентивирусного (pLV-CMV-H4) векторов. Ретро/лентивирусные самоинактивирующиеся векторы содержат функциональный промотор в длинном концевом повторе (ДКП), находящимся в 5' положении по отношению к минимальным промоторам и репортерному гену, и дефектный промотор в 3' ДКП. В процессе обратной транскрипции (происходит в случае вирусной инфекции клеток-мишеней) нефункциональный промотор из 3' ДКП замещает функциональный в 5' ДКП Таким образом, интегрирующаяся в геном клетки провирусная ДНК не несет функциональных вирусных промоторов и оказывается
неспособной влиять на экспрессию репортерного гена Р-галактозидазы (lacZ) Такая структура вектора почвочича нам получить репортерные конструкции в которых экспрессия гена 1ас7 строго контролируется минимальным промотором и р53-чувствительвычи элементами (WafConA), чувствительными к гипоксии элементами (HRF - hypoxia response elements) или элементами теплового шока (HSE - heat-shock elements) в качестве энхансеров (см ниже)
р53-чувствитетьные репортерные пчаэчиды получили на основе ретровирусного вектора pUSTdS-mCMV-lacZ, содержащею минимальный промотор раннего гена цитомегаловируса (mCMV) и репортерный ген 1ас7 Также получили вектор pUSTdS-mHsp70-lac7, в котором mCMV промотор замени ш минимальным промотором гена теплового шока 70 (mHsp70) Вслед за этим из векторов делегировали сайтеисер, который негативно влиял на экспрессию гена lacZ, находящегося под контролем минимального промотора (mCMV или mHsp70) и р53-чувствительного энханссра (см ниже) Полученные конструкции получили название pUSTdSB-mCMV-lacZ и pUSTdSB-mHsp70-lacZ р53-чувс пштельные элементы (WafConA), представляющие собой тандем из шести р53-связываюших сайтов из промоторной области гена p2lñVafl, консенсусного связывающего сайта (Con) и последовательности А рибосомного кластера генов, вырезали из гшазмиды pSIP-WafConA-mHsp70-GFP и клонировали в четыре получившиеся векторные конструкции Также во всех р53-чувствительных репортерных плазмидах (pUSTdS-WafConA-mCMV-lacZ, pUSTdS-WafConA-mHsp70-lacZ, pUSTdSB-WafConA-mCMV-Iac7 и pUSTdSB-WafConA-mHsp70-lacZ) репортерный ген lacZ заменили геном зеленого флуоресцентного белка (GFP) Все полученные конструкции протестировали на клеточной линии карциномы человека НСТ116 Поскольку белок GFP является намного более долгоживущим, чем р-галактозидаза, его использование в качестве репортерного белка в данной системе оказалось непригодным из-за его накопления и маскирования эффекта стимуляции активности р53 В то же время репортеры на основе р-галактозидазы позволяли изучать динамику повышения или понижения активности р53 Нами было показано, что mCMV является более чувс!вительным по сравнению с mHsp70 уровень экспрессии репортерного гена в необработанных клетках был выше, а также индукция репортера в ответ на обработку р53-стимулирующими химическими соединениями была выше в случае mCMV Таким образом, для дальнейшей работы использовали ретровирусную репортерную конструкцию pUSTdSB-WafConA-
mCMV-lacZ и потом создали ее лентивирусный эквивалент pLV-WafConA-mCMV-lacZ (рис 1)
mCMV
Xbal Xhol Xbal Sphl Hindlll nCMV
Sphl Xhol Xbal Sphl Spei
Рис.1 Схемы репортерных конструкций: а) ретровирусной pUSTdS-WafConA-mCMV-lacZ и б) лентивирусной pLV-WafConA-mCMV-lacZ. 5', 3' - 5' ДКП и 3' ДКП соответственно. WafConA - р53-чувствительный элемент, mCMV - минимальный промотор раннего гена цитомегаловируса, lacZ - ген ß-галактозидазы, Н4 - промотор гена гистона Н4, РигсР - ген устойчивости к пуромицину, Аря - ген устойчивости к ампициллину.
2. Получение и оптимизация работы ретро/лентивирусных репортерных конструкций для оценки транскрипционной активности белков HIF-1 и HSF-1
Дня создания HIF-1-зависимых репортерных конструкций использовали самоинактивирующиеся ретровирусные векторы pSIP-mHsp70-lacZ и pUSTdS-mCMV-lacZ В эти векторы в 5' положение от минимального промотора клонировали тандемом небольшие фрагменты промоторных (из генов F'GKI и LDH А) и энхансерных (из гена EN01) областей генов, содержащие консенсусные сайты связывания транскрипционного фактора HIF-1 Мы сфуппировали HIF-1-связывающие сайты таким образом, что они стали экспонированы с одной стороны двойной спирали ДНК, руководствуясь правилом, что один поворот двойной спирали происходит примерно через каждые 11 нуклеотидов Полученный чувствительный к гипоксии элемент (HRE) повторили 12 раз, чтобы увеличить его способность связывать транскрипционный фактор При создании HSF-1 -зависимых репортерных конструкций использовали тот же подход и фрагменты промоторных областей генов MDRI, Hsp40 и Hsp70 Полученный элеме!гг теплового шока (HSE) повторили 18 раз Карты полученных конструкций (pSlP-HRE12-mHsp70-lacZ, pUSTdS-HRE12-mCMV-lacZ, pSIP-HSE18-mHs,p70-lacZ и pUSTdS-HSE18-mCMV-lacZ) аналогичны картам р53-чувствительных конструкций на рисунке 1а, за исключением чувствительных элементов (HRE12 или HSE18 вместо WafConA) и минимального промотора mHsp70 вместо mCMV
С помощью ретровирусной инфекции мы трансдуцировали р51Р-Н$Е18-тН5р70-1ас2 репортерную конструкцию в клетки Н1299, а р81Р-ЖЕ12-тН5р70-1ас2 и рШТ<15-НКЕ12-тСМУ-1асг репоргерные конструкции в Н1299, НЕЙ, НСТ116 и 10(1) клеточные линии, отобрав инфицированные клетки на селективной среде с пуромицином.
Для индукции ШР-1-зависимой транскрипции клетки подвергали тепловому шоку при 44°С в течение часа и через 12 часов активность Р-галакгозидазы определяли Х^а1 окрашиванием (рис.2).
р51Р-Н5Е18-тШр70-1ас2 37°С 44°С, 60 мин Н1299 , \ г *
Рис.2 Детекция активности Н8Р-1-индуцируемого репортерного белка в клетках Н1299/р31Р-Н8Е18-тН8р70-1асг в ответ на обработку тепловым шоком. Клетки подвергали тепловому шоку в течение часа и через 12 часов инкубации при 37°С окрашивали Х-да1.
Чтобы индуцировать гипоксический ответ, клетки обрабатывали НИМ стабилизирующим агентом деферроксамином (ДФО) в 300 мкМ концентрации в течение 12
р51РИШ2-тН5р70-1асг рШТаЭ-НКЕИ-тОУГУМасг необработанные +ДФО необработанные +ДФО
.....- - У "•.^"""Л.* Г4* • -
-.'>'. , "''Л «ЛV,-
Й1299
!* г **
^ ХЛ Л * ,
Рис.З
активности
Детекция Н1Р-1-
индуцируемого репортерного белка в различных клеточных линиях в ответ на обработку ДФО. Все клеточные линии,
содержащие репортерные конструкции, указанные на рисунке, обрабатывали или не обрабатывали
соединением ДФО в 300 мкМ концентрации а течение 12 часов, а затем подвергали Х-да1
окрашиванию, чтобы определить активность р-галактозидазы.
часов, а потом подвергали X-gal окрашиванию (рис 3) Как видно из рисунка 3, в клеточной линии НСТ116, судя по интенсивности X-gal окрашивания, активность HIF-1 высока в условиях нормоксии, что ранее не было описано
Чтобы показать специфичность индукции экспрессии репортерного гена HIF-1 фактором, мы создали лентивирусную конструкцию на основе вектора pLSLG, экспрессирующую HIF-la siRNA В ниже описанных экспериментах использовали клеточные линии Н1299 и НСТ116, содержащие pLV-HRE12-mCMV-lacZ репортерную конструкцию, являющуюся лентивирусным эквивалентом pUSTdS-HRE12-mCMV-1acZ
Через 48 часов после инфекции pLSLG-HIF-la-siRNA лентивирусом клеточные линии Н1299/ и HCT116/pLV-HRE12-mCMV-lacZ окрашивали X-gal Репортерную клеточную линию Н1299 обрабатывали 300 мкМ ДФО в течение 12 часов, чтобы индуцировать гипоксический ответ На рисунке 4 хорошо видна разница в X-gal окрашивании между клетками, инфицированными HIF-la siRNA и клетками, инфицированными контрольной
Рис.4 Снижение активности репортерного белка при подавлении экспрессии фактора HIF-1a с помощью siRNA. Зависимость экспрессии репортерного гена в клеточных линиях Н1299/ и НСТ116/pLV-HRE12-mCMV-lacZ от активности HIF-1 фактора показали с помощью подавления экспрессии гена H!F-1a специфической siRNA SiRNA, подавляющую экспрессию люциферазы (lue siRNA), использовали в качестве контроля.
Поскольку HIF-la siRNA действует на постгранскрицционном уровне, приводя к деградации мРНК HIF-la, уровень его белка тоже понижается, что приводит к ингибированию HIF-1-зависимой транскрипции (ингибированию экспрессии ß-галактозидазы в репортерных клеточных линиях). Результаты этого эксперимента показали, что репортерные конструкции индуцируются HIF-1-зависимо Обработка клеточной линии НСТ116 камптотецином, который является хорошо известным ингибитором активности
siRNA к люциферазе (pLSLG-luc-siRNA, lue siRNA) _pLV -HRB12-mCM V-lacZ_
необработанные +ДФО необработанные
транскрипционного фактора НГР-1, также приводила к уменьшению экспрессии Р-галакточидазы
Для оценки динамики активации Н1Р-1 фактора, мы обработали Н1299/, НЕР/ и НСТ116/р81Р-НШ;12-тН8р70-1асг клеточные линии ДФО в различных концентрациях и в течение различных промежутков времени Количественная оценка экспрессии гена 1ас1 по ОМЧЗ окрашиванию приведена на рисунке 5
Н1299/р81Р-НКЕ12-тШр70-1ас2
в) НСТ116/р81Р-НКЕ12-тШр70-1асг
2 5 -
-•-14 28 -о-56 -а-113 -•-225 ^>-450
б) НЕР/р51Р-НКЕ12-тН8р70-1асг
25 -—
-»-7 |
20
-»-14
2в 15 -I
-0-56
10 -I
—о—113
-•-225 5 1
28 -56 -43 -225 -450
0
Рис.5 Динамика транскрипционной активности Н1М фактора в ходе обработки клеток ДФО в различных концентрациях и в течение различных промежутков времени.
Н1299/ (а), НЕЙ (б) и НСТ116/р81Р-НЯЕ12-шНбр70-1ас2 (в) линии клеток обрабатывали ДФО в различных концентрациях и в течение различных промежутков времени. На оси ординат показано число раз, в которое индуцируется экспрессия гена р-галактозидазы судя по оптической плотности ОИРЭ реакции (405 нм) На оси абсцисс указано время обработки клеток ДФО в часах. На графиках
приведены стандартные отклонения, рассчитанные после проведения трех идентичных экспериментов Справа от каждого графика приведены использовавшиеся концентрации ДФО в мкМ
На рисунке показано число раз, в которое индуцируется экспрессия гена 1ас2 в ответ на обработку клеток ДФО. Видно, что динамика активации Н1Р-1-зависимого репортера является специфической характеристикой каждой из проанализированных линий (для Н1299 - максимальная активация через 12 часов, для НЕР - 24 часа, для НСТ116 - 12 часов для высоких доз ДФО и 24 - для низких). Разница между двумя использованными минимальными промоторами (тН?р70 и тСМУ) в НП5-!-зависимых репортерных
конструкциях, как и в случае р53-зависимых конструкций, заключается в чувствительности, которая выше в случае mCMV.
Также, мы показали, что при обработке 300 мкМ ДФО клеток Н1299 и НСТ116 в течение различных промежутков времени уровень экспрессии HIF-1-зависимых генов-мишеней повышался, что сопровождалось увеличением экспрессии репортерного гена lacZ в протестированных репортерных конструкциях (ср рис 5 и 6) Хорошо видно, что при подавлении экспрессии HIF-la с помощью siRNA экспрессия генов-мишеней (оцененная с помощью ОТ-ПЦР) не изменяется в ответ на обработку клеток ДФО (рис 6) Максимальный уровень экспрессии генов LDHA, PGK1 и lacZ индуцируется после 12 часов обработки ДФО в клеточных линиях Н1299 и НСТ116 Таким образом, полученные репортерные конструкции позволяют судить об активности HIF-1 в динамике
Н1299 НСТ116
lue siRNA HIF-la siRNA lue siRNA HIF-la siRNA
ДФО обработка, часы 0 3 6 1224 48 0 3 6 1224 48 0 3 6 12 24 48 0 3 6 1224 48
LDHA m ~ ~
PGK1 w «tji Ц/гшк
циклофилин - ,
Рис.6 Трансактивация HIF-1-зависимых генов при обработке клеток ДФО в течение различных промежутков времени. Клетки обрабатывали 300 мкМ ДФО в течение различных промежутков времени. Экспрессию LDHA, PGK1 (известных HIF-1-активируемых генов) и циклофилина (HIF-1-независимого гена) оценивали с помощью ОТ-ПЦР Чтобы показать HIF-1 зависимость экспрессии генов LDHA и PGK1 при обработке ДФО, клетки транслировали HIF-la siRNA. siRNA, подавляющую экспрессию люциферазы (lue siRNA), использовали в качестве контроля Максимальный уровень экспрессии генов LDHA, PGK1 и lacZ индуцируется после 12 часов обработки ДФО в Н1299 и НСТ116 клеточных линиях.
3. Определение субклеточной локализации и количества белка р53 в различных опухолевых линиях клеток
В анализ включили клеточные линии различного происхождения, имеющие разный статус гена р53. Согласно проанализированной литературе, большинство клеточных линий характеризовалось экспрессией гена р53 дикого типа, (табл 1) Субклеточную локализацию р53 определяли методом иммунофлуоресцентного окрашивания клеток антителами DO-1, распознающими белок р53, и FITC-конъюгированными вторичными антителами (рис 7).
Табл.1 Описание проанализированных человеческих клеточных линий.
Клеточная линия Происхождение Статус гена о53
НСТИб карцинома толстой кишки дикий тип
HLF эмбриональные фиоробласты дикий тип
Ме15 меланома (статус рУЗ определен секвенированием) дикий тип
Meli меланома дикий тип
Mel 16 меланома дикий тип
Mel8 меланома дикий тип
Mel29 меланома дикий тип
Mel23 меланома мугантный
Melll меланома мутантный
Mel7 меланома дикий тип
Mel6 меланома -1-
Mel2 меланома дикий тип
HfcMnLP нормальные эпидермальные меланоциты дикий тип
A549 карцинома легких дикий тип
SR-N-SH нейробластома дикий тип
ACHN аденокарцинома почек дикий тип
IMR-32 нейробластома дикий тип
TERA-2 эмбриональная карцинома дикий тип
NC1-H460 карцинома легких дикий тип
Hep U2 карцинома печени дикии тип
В клеточных линиях немеланомного происхождения с диким типом р53 (дт-р53), таких как ACHN, А549 и Hep G2, уровень белка р53 невысок, его ядерная локализация встречается в единичных клетках, а в линиях TERA-2 и NCI-H460 детектируется низкий уровень белка р53 в ядре От описанных выше клеточных линий резко отличаются меланомные клеточные линии (Mel), которые характеризуются высоким уровнем белка р53. Эти линии клеток делятся на три группы: 1) с цитоплазматической локализацией белка р53, 2) с ядерной локализацией белка р53 и 3) с ядерно-цитоплазматической локализацией белка р53 Важно отметить, что локализация белка р53 не зависит от статуса его гена' в линиях МеШ и Ме123 с мутантным р53 (мут-р53) локализация его белка ядерная и ядерно-цитоплазматическая соответственно, а в линиях Ме17, Ме15 и HEMnLP (нормальные меланоциты) (дг-р53) локализация ядерная, цитоплазматическая и ядерно-цитоплазматическая соответственно Также стоит отметить присутствие многоядерных клеток в ликии Мей и микроядер в клетках меланомных линий Meli 1 и Ме129 (см рис 7) Примечателен тот факт, что в ряде меланомных клеточных линий, включая HEMnLP, DO-1 антитела детектируют цитоплазматическое окрашивание в виде гранул (см окрашивание линий Meli, Ме15, Ме123 и HEMnLP)
U//.V : Mel If, i & щ \iilii ¡ /
1544 1 Mein tít . & щ у ! \hl2.i
\( I-II4M) \lil7 if- \ ! Meli , *
Т1КЛ-2 °¡üí К' 1 \Н29 / m* \lcl5
///:/»(,2 Mcl2 ."f. У '■ llliMnl.r
Для определения количества белков р53 и р21 (продукт р53-зависимого гена) в различных линиях клеток провели вестерн-анализ (рис 8) Для детекции р53 и р21 использовали антитела DO-1 и F-5
соответственно Результаты
вестерн-анализа хорошо
коррелируют с результатами иммунофлуоресцентного окрашивания клеток Экспрессия р53-зависимого гена (р21) не детектируется в клеточных линиях с мутантным типом гена р53 (Melll, Ме123) и в р53 -/- клетках Ме16 Также уровень белка р21 находится за порогом детекции в некоторых клеточных линиях с высоким уровнем экспрессии г ена р53 дикого типа (Hep G2, IMR-32, NCI-H460, Ме17, TERA-2, Ме12), что говорит о возможном существовании
механизмов, подавляющих
транскрипционную активность белка р53.
Представляют интерес результаты, полученные на меланомных клеточных линиях с гранулярным окрашиванием цитоплазмы антителами DO-1 (Meli, Ме15, Ме123 и HEMnLP) В линиях, где р53 отсутствовал в ядре и присутствовал в цитоплазме в виде гранул (Meli, Ме15), его уровень, детектируемый вестерн-анализом, сравнительно низок При этом появляется дополнительная полоса на уровне около 250 кДа. Эта полоса является
Рис.7 Субклеточная локализация белка р53 в различных опухолевых линиях клеток, определенная окрашиванием антителами D0-1 и FITC-конъюгированными вторичными антителами.
Микроядра и многоядерные клетки отмечены стрелками
отличительной характеристикой для всех четырех линий клеток с гранулярным окрашиванием цитоплазмы
гч
íltí'MÍ^ asSsKüsss ^ S « aí
SSlEUaggssSsgssss ill Ii
я 15
Ч -А й й Ч
Р53,
ез
р21,
Рис.8 Вестерн-анализ количества белков р53 и р21 (продукт р53-зависимого гена) в различных опухолевых линиях клеток. Каждый образец, нанесенный на гель, содержит 10 мкг тотального белка Для детекции р53 и р21 использовали антитела DO-1 и F-5 (Santa-Cruz Biotechnology) соответственно * - белок с молекулярной массой около 250 кДа, имеющий D0-1 эпитоп
Также определили субклеточную локализацию р53 вестерн-анализом ядерных и цитоплазматических экстрактов белка клеточных линий Mell, MeI5, МеШ, МеПб и Ме123 (см рис.9).
ч 8.1
х с
о- S
3 Э
, Mell6t fielll , JHelS tjdell „ Jtíel23 ,
9
= S
« 1 § I
ев с
fr I
Э I
P53,
Рис.9 Определение субклеточной локализации белка р53 вестерн-анализом ядерных (ядерн) и цитоплазматических (цитапл) экстрактов белка (по 10 мкг) клеточных линий Med, Ме15, Ме111, МеИб и МЫ23. Для детекции р53 использовали DO-1 антитепа * - белок размером около 250 кДа.
Ядерные и цитоплазматические экстракты белка наносили на гель в равном количестве (по 10 мкг) Для детекции р53 использовали DO-1 антитела Вестерн-анализ показал, что белок размером около 250 кДа локализуется только в цитоплазме, тогда как белок р53 (53 кДа) локализуется как в цитоплазме, так и в ядре
4. Выяснение природы гранулярного цнтоплазчатического окрашивания антителами DO-1 некоторых меланомных клеточных линий
Исхода из полученных результатов, мы сделали следующие предположения 1) За счет альтернативного сплайсинга пре-мРНК или глобальной перестройки самого гена р53, его мРНК имеет неканонический (больший) размер, 2) Существование вторичных модификаций белка р53, в результате которых происходит его ковалентное связывание с неизвестным белком, приводящее к сдвигу р53 от уровня 53 кДа на уровень примерно 250 кДа Также образование ковалентного комплекса р53 с неизвестным белком приводит к их удержанию в цитоплазме, предотвращая транслокацию р53 в ядро и гранскрипционную активацию генов-мишеней; 3) Экспрессия в пекоторых меланомных клеточных линиях белка, обладающего DO-1 эпитопом Для прояснения сделанных предположений провели описанные ниже эксперименты
Для определения размеров транскрипта гена р53 в ряде меланомных клеточных линий провели нозерн-анализ, который показал существование одного транскрипта гена р53 одинакового размера во всех проанализированных клеточных линиях (данные приведены на рис.14)
Гранулярное окрашивание цитоплазмы в ряде меланомных клеточных линий, детектируемое иммунофлуоресценцией с использованием DO-1 антител, было очень схоже с данными о локализации р53, полученными Wadhwa с соавторами (Wadhwa et al, 2000) В этой работе на ряде нейробластомных клеточных линий было показано, что р53 способен взаимодействовать с белком GRP75, который удерживает его в цитоплазме, где они совместно локализуются в виде гранул. Эксперименты по иммунофлуореспентному окрашиванию показали, что эти белки не колокализукпея.
В экспериментах по определению субклеточной локализации гранул, детектируемых антителами DO-1, использовали ряд коммерчески доступных плазмид (Clontech laboratories), характерной особенностью которых является возможность экспрессии в клетках млекопитающих флуоресцентных белков с определенной субклеточной локализацией (в
митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, эндосомах, комплексе Готьджи и пероксисомах) После трансдукции данных плазмид в линию Ме15 клетки окрашивали антителами DO-1 Данные эксперименты показали, что цитоплазматические гранулы, детектируемые антителами DO-1, колокализуются с эндосомами (рис 10)
зеленый белок, Рис.10 Определение субклеточной локализации р53 За"эндосом"х " фанул, детектируемых антителами D0-1, в клеточной
вШЩ^^^^^Ш ¡HBMHH линии Mel5. Плазмиду, экспрессирующую зеленый белок ^^НН^^^^Н с эндосомной субклеточной локализацией вводили
клетки Mel5 липофекцией Через часа клетки окрашивали антителами D0-1 конъюгированными вторичными антителами Совместную локализацию гранул и эндосом определяли смешанном зелено-красном фильтре (фотография не приведена) Цитоплазматические гранулы, детектируемые антителами D0-1, колокализуются с эндосомами
С целью изучения вопроса о том, содержат ли детектируемые гранулы в своем составе белок р53, провели эксперименты по гиперэкспрессии р53 дикого типа и по подавлению экспрессии эндогенного р53 с помощью siRNA Для постановки первого эксперимента сконструировали pLPC-p53-N-FLAG и pLPC-p53-C-FLAG плазмиды. р53, экспрессирующийся при введении этих плазмид в клетки, имеет последовательность короткого пептида FLAG на N- или С-конце соответственно, детектируемую анти-FLAG антителами (М2, Sigma) Было сделано предположение, что при гиперэкспрессии р53 должны происходить ковалентные вюричные модификации его белкового продукта (если таковые существуют), что будет детектироваться как вестерн-анализом, так и иммунофлуоресцентным окрашиванием анги-FLAG антителами При проведении вестерн-анализа на Ме15 и Mel 11 линиях клеток, липофицированных описанными плазмидами, анти-FLAG антитело детектировало только одну полосу, размером 53 кДа При определении субкпеточной локализации белка р53 в Ме15 линии клеток с гиперэкспрессированным р53 мы показали, что экзогенный белок р53, в отличие от эндогенного, локализуется в ядре
Чгобы подавить экспрессию гена р53 в меланомных клеточных линиях, использовали лентивирусную плазмиду pLSLG-p53-siRNA Через 48 часов после инфекции на клетках провели вестерн-анализ с использованием DO-1 антител Этот эксперимент показал эффективное ингибирование экспрессии гена р53 с помощью специфической siRNA и отсутствие влияния на количество белка размером около 250 кДа Параллельно провели
иммунофлуоресцентное окрашивание клеток DO-1 и вторичными РГГС-конъюгированными антителами При ингибировании экспрессии р53, этот белок перестает детектироваться в ядре клеток Ме123 Цитоплазматическое же гранулярное окрашивание остается незатронутым.
Использование варьирующих денатурирующих условий для проверки стабильности экспрессии DO-1 эпитопа неизвестного белка с молекулярной массой 250 кДа показало, что этот эпитоп является нестабильным и при сильноденатурирующих условиях (повышенное содержание ß-меркаптоэтанола и прогревание образцов при в течение 10 минут) разрушается. Тем не менее, 250 кДа белок можно иммунопреципитировать DO-1 антителами
Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что в ряде меланомных клеточных линий, включая нормальные меланоциты HEMnLP, в цитоплазме экспрессируется неизвестный белок с молекулярной массой около 250 кДа, который имеет DO-1 эпитоп, не происходящий из молекулы белка р53 Этот эпитоп, по-видимому, образован в результате вторичной структуры данного белка, поскольку он может быть разрушен при использовании определенных условий денатурации При этом эпитоп DO-1 неизвестного белка достаточно специфично распознается соответствующим антителом, с помощью которого этот белок можно иммунопреципитировать Белок колокализуется с эндосомами 5. Измерение транскрипционной активности белка р53 в различных клеточных линиях в ответ на обработку клеток рядом химических соединений
В данной работе сначала использовали ретровирусную редортерную конструкцию pUSTdSB-WafConA-mCMV-lacZ. После вирусной инфекции ряда клеточных линий проводили селекцию на пуромицине в течение двух недель. Потом клетки рассаживали на 96-луночные культуральные планшеты и обрабатывали рядом химических соединений (ММС - метил-метансульфонат, ЭМС - этил-метансульфонат, 5-ФУ - 5-фторурацил, доксирубицин и камптотецин), которые являются известными активаторами транскрипционной активности белка р53 Методом ONPG окрашивания мы получили кривые активации экспрессии репортерного гена (lacZ) в ряде меланомных клеточных линий и линии аденокарцияомы почки ACHN Мы показали, что в двух меланомных клеточных линиях с мутантным типом гена р53 (Mel 11 и Ме123) активации репортерного гена не происходит С другой стороны, линии клеток с диким типом р53 разделили на две группы: 1) линии, в которых активация белка р53 в ответ на химические обработки не нарушена (Meli,
Ме!5, МеНб и HEMnLP) и 2) линии, в которых репортерный ген не индуцируется в ответ ни на одну из обработок (Ме12, Ме17, Ме129 и ACHN) Отсутствие индукции репортерного гена во второй группе дало возможность выдвинуть две гипотезы- 1) дг-р53 в этих линиях не может быть активирован в ответ на обработку химическими соединениями, что может говорить о существовании сбоев в путях активации дт-р53; 2) существование механизмов сайленсинга репортерной конструкции Чтобы проверить эти гипотезы, мы провели вестерн-анализ экспрессии р53 и его гена-мишени р21 в ответ на обработки соединениями в концентрациях, являвшихся оптимальными для активации р53-чувствительного репортера в линиях, где репортер активировался (см. табл 2)
Табл.2 Сравнение данных индукции р53-чувствительного репортера с данными экспрессии р21, полученными вестерн-анализом. Линии клеток, имеющие дт-р53 и отвечающие индукцией репортера в ответ на обработку соединениями, выделены светло-серым цветом Линии с мут-р53 и не индуцирующимся репортером выделены темно-серым цветом Линии с дт-р53 и не индуцирующимся репортером цветом не выделены Количеством плюсов и минусов обозначена степень индукции экспрессии Обработка ММС и ЭМС приводит к протеолитическому расщеплению белка р21, что объясняет отсутствие увеличения его экспрессии при проведении вестерн-анализа Реп - активность репортера, вест - экспрессия р21, определенная вестерн-анализом Контроль - необработанные клетки.
№ линия Контроль ММС ЭМС Доксирубицин 5-ФУ Камгттотецин
реп вест per вест реп вест реп вест реп вест реп вест
1 Meli +++ +4+ 444 +++ 44 +++ ++ +++ ++ ++++ ++++ ++++ ++++
г Meß + 4+ + ++ + ++ ++++ ++ +4 ++++ ++++
3 Мв116 4 +++ ++ + +++ ++ + +++ +++ ++ ++ +++ ++
4 7 НЕМп Мв17 + +4++ +++ ++++ +++ ++ +++ ■н ++ ++ н-н + + +++ ++4
в Мей +- +
9 Ме129 + - +- - +■ +++ ++++ 4444
10 ACHN - +- - +- 4
Хорошо видно, что для группы линий с дт-р53 и не активирующимся репортером характерна в той или иной степени индукция экспрессии р21 в ответ на определенный набор химических обработок Тем не менее, линии Ме12 и ACHN по степени индукции экспрессии репортера и р21 ведут себя очень схоже с линией МеШ, в которой р53 мутантный Данный результат дает возможность предположить существование в этих линиях механизма, подавляющего транскрипционную активность дг-р53. Альтернативным объяснением может служить
существование механизмов сайленсинга репортерной конструкции одновременно с репрессией экспрессии р21, которая действует независимо огг транскрипционной компетентности белка р53.
ммс
г) Доксирубицин
ils ал sm WHO
эмс
1J6
-■-МгИ
12
-*-MS7
-о-№16 08
-<-№111 04
-о-№23 00
00 39 78 15L6 3U 625 1250 2SM
д) Камптотецин
ао iss зи ей iso 2900 тал ioooo в) 5-ФУ
Рис, 11 Измерение транскрипционной активности белка р53 с помощью лентивирусной репортерной конструкции pLV-WafConA-mCMV-lacZ в различных меланомных клеточных линиях в ответ на обработку клеток повреждающими ДНК соединениями. Меланомные клеточные линии (указаны справа от каждого графика) обрабатывали различными оо 1.6 3.1 ез -as so son mo соединениями (указаны в заголовке каждого
графика) в различных концентрациях в течение 12 часов Активность р-гапактозидазы измеряли с помощью ONPG окрашивания На оси абсцисс отображены различные концентрации химических соединений (ММС (а), ЭМС (б), 5-ФУ (в), мкг/мл; доксирубицин (г), нг/мл; камптотецин (д), мкМ), на оси ординат - оптическая плотность ONPG реакции, измеренная при 405 нм На графиках представлено стандартное отклонение трех идентичных экспериментов.
Данные, полученные на линиях Ме17 и Ме129 (повышение уровня белка р21 в ответ на химические обработки и отсутствие активации репортера), говорят о сайленсинхе репортерной конструкции в данных линиях клеток. Этот факт был доказан при повторении экспериментов по индукции репортера на транзиентио инфицированных pLV-WafConA-
mCMV-lacZ лентивирусным репортером клетках в ответ на обработку соединениями (рис 11). Видно, что через 48 часов после инфекции сайленсинг репортера не успевает произойти, что позволяет зафиксировать его индукцию После двухнедельного пассирования клеток Ме17 и Ме129 с лентивирусным репортером в присутствии пуромицина наблюдался сайленсинг репортера Из приведенных данных видно, что каждая меланомная клеточная линия с дт-р53 имеет характерный набор химических соединений, способный активировать белок р53, что можно считать специфической характеристикой для каждой из проанализированных линий.
В большинстве меланомных клеточных линий уровень белка р53 высок и он преимущественно локализуется в ядре. В то же время в нескольких клеточных линиях, таких как Meli и Ме15, наблюдается полное отсутствие ядерной локализации (см рис 7) Судя по результатам вестерн-анализа, в ответ на обработку соединениями р53 стабилизируется и накапливается в клетке Целью данного эксперимента являлась проверка локализации белка р53 в ответ на обработку химическими соединениями, а 1акже оценка уровня его стабилизации На рисунке 12 приведены результаты иммунофлуоресцентного окрашивания меланомных линий антителами DO-1 в ответ на определенную химическую обработку, которая являлась наиболее сильным индуктором экспрессии р21, определенной вестерн-анализом В качестве вторичных антител использовали ЬТГС-конъюгированные антитела Фотографии делали при одинаковой экспозиции, что позволяет судить о стабилизации и повышении уровня бежа р53 Видно, что в меланомных клеточных пиниях с лт-р53 (HEMnLP, Ме17, Ме15 и Meli) стабилизация и транслокация белка р53 в ядро (если он изначально в ядре не детектировался) не нарушена Интересно, что для линий Meli, MeI5, Ме123 и HEMnLP, характеризующихся гранулярным окрашиванием цитоплазмы антителами DO-1, существует определенное соединение, способное разрушать DO-1 эпитоп неизвестного белка с молекулярной массой около 250 кДа или понижать экспрессию самого белка (рис 12) Кроме того, именно это соединение вызывает наибольшую индукцию р21 Для линии Ме15 таким соединением является камптотецин, для Meli - доксирубицин, для Ме123 - ЭМС и ММС (корреляция с экспрессией р21 отсутствует, поскольку эта линия имеет мут-р53) Также, в ответ на эти химические обработки 250 кДа белок перестает детектироваться DO-1 антителами при проведении вестерн-анализа
необработанные Камтготецин необработанные Доксирубицин
Рис.12 Определение субклеточной локализации белка р53 в различных меланомных клеточных линиях в ответ на обработки соединениями. Клетки обрабатывали ЭМС (750 мкг/мл), доксирубицином (175 нг/мл) и камптотецином (1 мкМ) в течение 12 часов и окрашвали антителами D0-1 В качестве вторичных антител использовали FITC-конъюгированные антитела
6. Определение степени р53-зависимости действия камптотецина на экспрессию генов-мишеней белка р53
Камптотецин является химическим соединением, которое известно своим р53 стабилизирующим действием Он используется при химиотерапии раковых опухолей, хотя точный механизм его действия остается неизвестным Мы предприняли попытку изучения степени р53-зависимости действия камптотецина на экспрессию нескольких генов мишеней р53 Мы применили подход с использованием р53 siRNA, которая подавляет экспрессиюр^З на уровне мРНК Клетки заражали чентивирусами pLSLG р53 siRNA (р53 siRNA) или pLSLG-E6-siRNA (Е6 siRNA, контроль) Через пять дней после инфекции проводили вестерн анализ количества белков р53 и р21 в ответ на обработку камптогецином (рис 13) Для детекции р53 и р21 использовали антитела DO-1 и F-5 соответственно Видно, что в проанализированных клеточных линиях р21 индуцируется р53-зависимо в ответ на обработку камптотецином Слабая р53-зависимая индукция р21 наблюдается даже в клеточных линиях с мут-р53 (Melll и Ме123) Также данный вестерн-анализ показывае-i, что
в линии Meli с дг-р53 происходит настолько сильное увеличение уровня р53 в ответ на обработку камптотецином, что оно способно подавить эффект р53 siRNA В Ме123 с мут-р53 наблюдается тот же эффект, хотя и менее выраженный В Mel И с мут-р53 понижение уровня экспрессии р53 с помощью siRNA не может быть изменено действием камптотецина Это говорит о селективном действии камптотецина на определенные мутантные варианты белка р53
Рис.13 Вестерн-анализ количества белков р53 и р21 в различных меланомных клеточных линиях в присутствии или отсутствии |¿3 sIRNA в ответ на обработку камптотецином. Меланомные клеточные культуры заражали
лентивирусами pLSLG-p53-siRNA (р53 siRNA) или pLSLG-E6-siRNA (Е6 siRNA, контроль) Для детекции р53 и р21 использовали антитела D0-1 и F-5 соответственно. +Кампт -клетки, обработанные 1,5 мкМ камптотецина в течение 12 часов.
Следующим шагом в изучении действия камптотецина на экспрессию р53-зависимых генов было проведение нозерн-анализа На рисунке 14 приведен нозерн-анализ экспрессии р53 и р53-зависимых генов в некоторых меланомных линиях клеток, зараженных р53 sjRNA или lue siRNA в ответ на химические обработки Через пять дней после инфекции клетки обрабатывали 5-ФУ (50 мкг/мл) или камптотецином (1 мкМ) в течение 12 часов В качестве зондов использовали фрагменты кДНК из кодирующих областей генов р53, РЛ26 и hdm2 Нозерн-анализ, проведенный на клеточных линиях Melló, Ме123 (а) и Ме17, Meli, HEMnLP (б), показал, что экспрессия гена РА26 повышается в ответ на обработки соединениями и понижается в присутствии р53 siRNA Видно, что в ответ на обработку камптотецином экспрессия РА26 повышается даже в условиях подавления экспрессии р53 во всех меланомных клеточных линиях кроме нормальных меланоцитов (HEMnLP) Экспрессия
РА26 в условиях подавления экспрессии р53 в ответ на камптотецин ниже, чем в контроле (lue siRNA) Это говорит о существовании как р53-опосредованного, так и р53-независимого путей активации экспрессии РЛ26 в ответ на обработку камптотецином Также видно, что камптотецин является лучшим индуктором экспрессии РА26, чем 5-ФУ
а)
> 5
? I
<п Ьй
р53 ,
' f-f
hdm\ 28S .1
>■ I >> l >■ Ё >. Ё >■ i е § g 3 0 1 ©S
n ^ u-i i/i ¡к ai X "ЛИ
lue siRNA р53 siRNA
lue siRNA p53 siRNA
^ ^ ЛЦЬШ AÀ MM:
v 4M
i " i» ЯЦИР*ШШИИ|1»*| w
18S
» %?# *** 49МГ MP fe*' 4
Meli 6
Mel23
6)
b53
E >>
i e
«
>> e
e
» n и ■
lue siRNA p53 siRNA
^ 'tf <1
Ë s
¡2 n S vn Й lue siRNA p53 siRNA
©
©
ô
s >■ I
i © I
4 IT) Ä
p53 siRNA
Mel7
Meli
HEMnLP
Рис.14 Нозерн-аиапиз экспрессии p53 и р53-зависимых генов в некоторых меланомных линиях клеток в присутствии или отсутствии р53 siRNA в ответ на химические обработки. Меланомные клеточные линии Meli 6, Mel23 (а) и Mel7, Meli, HEMnLP (б) заражали лентивирусами р53 siRNA или lue siRNA Через 48 часов после инфекции клетки обрабатывали 5-ФУ или камптотецином (Кампт) в течение 12 часов В качестве зондов использовали фрагменты кДНК из кодирующих областей генов р53, РА26 и hdm2. В качестве контроля количества нанесенной на гель РНК приведены фотографии 28S и 18S РНК на агарозных гелях.
Мт2 экспрессируется независимо от экспрессии гена р53 во всех проанализированных меланомных клеточных линиях кроме нормальных меланоцитов, в которых ген Ыт2 экспрессируется р53-зависимо. Примечателен тот факт, что камптотецин
блокирует экспрессию гена ИеЬп2 в меланомных клеточных линиях, стабилизируя ее в нормальных меланоцитах Приведенные данные говорят о возможности существования механизма стабилизации р53 в меланомах посредством понижения экспрессии гена Ыт2 в ответ на обработку камптотецином Этот механизм является селективным, поскольку работает только в меланомных клеточных линиях, а не в нормальных меланоцитах
Выводы
1 Получены три ретро/лентивирусные репортерные системы, позволяющие оценивать изменение транскрипционной активности белков р53, НПМ и ШР-1 в практически любых клеточных линиях в ответ на специфические «активирующие» или «инактивирующие» эти транскрипционные факторы воздействия
2 Изменение экспрессии репортерного гена в репортерных клеточных линиях коррелирует с изменением экспрессии эндогенных генов-мишеней соответствующего транскрипциотюго фактора (р53 или Н1Р-1), что позволяет проводить количественную оценку активности изучаемых транскрипционных факторов в динамике
3 Опухолевые клеточные линии с диким типом гена р53 меланомного происхождения характеризуются ядерной локализацией белка р53 при высоком уровне его экспрессии и цитоплазматической - при низком уровне его экспрессии в клетке
4. В цитоплазме на/в эндосомах ряда меланомных клеточных линий, включая нормальные меланоциты, локализуется белок с молекулярной массой около 250 кДа, имеющий 00-1 эпитоп Экспрессия йО-1 эпитопа в этом белке (или самого белка) падает в ответ на обработку определенным для каждой клеточной линии химическим соединением.
5 В большинстве исследованных клеточных линий с диким типом гена р53, р53-зависимая транскрипция в ответ на обработку классическими р53-активирующими химическими соединениями не нарушена Исключение составляют линии АСТПЧ и Мс12, в которых активация р53-зависимой транскрипции подавлена Набор химических соединений, активирующих р53-зависимую транскрипцию, является специфической характеристикой для каждой из проанализированных клеточных линий
6 Для некоторых меланомных клеточных линий характерен сайленсинг индукции репортерною гена в р53-чувствительных конструкциях при пассировании клеток Этот эффект можно преодолеть при транзиептном введении репортеров в клетки
7 Камптотецин является стабилизатором и активатором белка р53 за счет снижения экспрессии его белка-ингибитора hdm2 на уровне мРНК Этот механизм действия камптотецина является специфичным дня опухолевых клеток меланомного происхождения, поскольку экспрессия hdm2 при обработке камптотецином повышается в нормальных меланоцитах.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1 Разоренова О В , Агапова JIС , Буданов А.В , Иванов А В., Струнина С М и Чумаков П М Ретровирусные репортерные системы для опенки активности стрессовых сигнальных путей, контролируемых факторами транскрипции р53, HIF-1 и HSF-1 Молекулярная биология. 2005; 39(2): с. 286-293
2 Razorenova O.V, Ivanov A.V., Budanov А V and Chumakov P M Virus based reporter systems for monitoring transcriptional activity of hypoxia-inducible factor 1. Gene 2005; 350(1)- p. 89-98.
3 Разоренова О В., Агапова JI С. и Чумаков П М. Экспрессия гена р53 и активация р53-зависимой транскрипции в линиях клеток меланом Молекулярная биология 2005, 39(3): с. 445-456.
4 Gurova K.V, Hill J Е , Razorenova O.V, Chumakov P M., Gudkov A.V p53 pathway in renal cell carcinoma is repressed by a dominant mechanism Cancer Research 2004; 64(6) p 1951-1958.
5 Razorenova О V., Ivanov A.V, Budanov A.V , Byzova T V., Chumakov P M. Development of readout system for monitoring HIF-1 transcriptional activity IUBMB/ASBMB "A Molecular Exploration of the Cell". Boston, Massachusetts, June 12-16, 2004, Late Breaking Abstracts: p. 39.
6 Boiko A.D., Porteous S., Razorenova O.V., Knvokrysenko VI, Chumakov P M., Williams В , Gudkov A.V. Human candidate tumor suppressor genes identified by Ras cooperation assay SKCC "Genomics, Signaling and Tumor Targeting". San Diego, California, March 15,2004; p 51.
7 Boiko A.D., Porteous S., Razorenova O V, Krivokrysenko V.I., Chumakov P.M., Williams B., Gudkov A V. Human candidate tumor suppressor genes identified by Ras cooperation assay CSHL "Cancer Genetics and Tumor Suppressor Genes". Cold Spring Harbor, New York, August 18-22, 2004; p 35.
(И 1 Г о
РНБ Русский фонд
2006-4 8327
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 17.05.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л.1,75. Тираж 100 экз. Заказ 304. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Разорёнова, Ольга Валериевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
У I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Введение г* < 1.1 Онкогены и опухолевые супрессоры
1.2 р53 - центральный компонент сигнальных путей, ограничивающих злокачественный рост клеток
1.2.1 Последствия инактивации гена р
1.2.2 Биологическая роль гена р
1.2.3 Функции, строение молекулы и активация белка р
1.2.4 Транскрипционные мишени белка р
1.2.5 Латентное и активированное состояние белка р
1.2.6 Активация р53 в ответ на стрессы
1.3 Белки, физически взаимодействующие с белком р53 и модулирующие его функции
1.3.1 Н1Р-1-зависимый сигнальный путь
1.3.1.1 Структура белка НПМа - главного регулятора кислородного гомеостаза
1.3.1.2 Ог-зависимая регуляция активности НПМа
1.3.1.3 Транскрипционные мишени Н1К
1.3.1.4 Роль р53 в ответе клетки на действие гипоксии
1.3.1.5 Роль р53 в регуляции активности НПМ
С 1.3.2 НБР-зависимый сигнальный путь и белки теплового шока
1 1.3.2.1 Регуляция экспрессии НБР
V 1 * 1.3.2.2 Локализация НБР
1.3.2.3 Экспрессия НБР в раковых клетках
1.3.2.4 НБР и р
1.3.2.5 Возможные механизмы стабилизации белка р
1.3.2.6 Стабилизация мут-р53 за счет ассоциации с НБР
1.3.2.7 Стабилизация мут-р53 за счет ассоциации с НБР
1.3.2.8 Взаимодействие р53 с морталинами
1.4 Репортерные конструкции для изучения динамики активности белков различных сигнальных путей
1.4.1 Технология репортерных генов
1.4.2 Репортерные гены
1.4.3 Применение репортерной технологии
1.4.3.1 Введение экзогенного генетического материала в клетки и экспрессия генов
1.4.3.1.1 Анализ промоторов
1.4.3.1.2 Мониторинг эффективности трансфекции (доставки трансгенов внутрь клеток)
1.4.3.1.3 Визуализация генной экспрессии
1.4.3.2 Биологические скрининги и открытие химических соединений
1.4.3.2.1 Характеристика рецепторов и их лигандов
1 1.4.3.2.2 Изучение сигнальных путей
1 1.4.3.2.3 Применение репортерной технологии в токсикологии
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
И.1 Клеточные линии и их культивирование
И.2 Обработки клеточных линий химическими соединениями и тепловым шоком
11.3 Векторы и плазмидные конструкции
II.3.1 HIF-la-чувствительные репортерные плазмиды
0 II.3.2 HSF-1-чувствительные репортерные плазмиды
11.3.3 р53-чувствительные репортерные плазмиды
11.3.4 Плазмиды, экспрессирующие siRNA
11.3.5 Получение конструкций, экспрессирующих р53 с FLAG 68 последовательностью аминокислот на С или N конце
11.4 Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами, киназой, 69 щелочной фосфатазой и ферментом Кленова
11.5 Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей
11.6 Лигирование фрагментов ДНК
11.7 Получение компетентных клеток E.coli и трансформация
11.8 Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК
II.9 Получение ретровирусных и лентивирусных вирионов, заражение ими клеток-мишеней и отбор инфицированных клеток на антибиотике
11.10 Окраска клеток на р-галактозидазу
11.10.1 X-gal окрашивание
11.10.2 ONPG окрашивание
11.11 Вестерн-анализ
11.12 Иммунопреципитация
11.13 Выделение ядерных и цитоплазматических экстрактов
11.14 Иммунофлуоресценция
11.15 Коиммунофлуоресценция
11.16 Определение субклеточной локализации белка
11.17 Норзерн-анализ
11.18 ОТ-ПЦР-анализ и секвенирование кДНК р
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
111.1 Вирусные системы экспрессии генов в культивируемых 80 клетках млекопитающих
111.2 Получение и оптимизация работы ретро/лентивирусных 81 репортерных конструкций для оценки транскрипционной активности белка р
III.3 Получение и оптимизация работы ретро/лентивирусных репортерных конструкций для оценки транскрипционной активности белков HIF-1 и HSF
111.4 Определение субклеточной локализации и уровня экспрессии 92 белка р53 в различных опухолевых линиях клеток
111.5 Выяснение природы гранулярного цитоплазматического 95 окрашивания антителами DO-1 в некоторых меланомных клеточных линиях
111.6 Измерение транскрипционной активности белка р53 в 102 различных клеточных линиях в ответ на обработку клеток рядом химических соединений
111.7 Определение степени р53-зависимости действия камптотецина 110 на экспрессию генов-мишеней белка р
IV. ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "p53-зависимые сигнальные пути в опухолевых клетках с диким типом p53"
Ген р53 является центральным компонентом механизма, обеспечивающего удаление из организма патологических клеток. Многочисленные сигнальные пути отслеживают состояние клетки и в случае возникновения повреждений или сбоев, угрожающих приобретением наследуемых изменений генетического материала, вызывают активацию белка р53. В результате клетки либо временно задерживаются в сверочных точках клеточного цикла, где они имеют возможность исправить возникшие повреждения в процессе репарации ДНК, либо полностью выключаются из дальнейших делений, подвергаясь клеточной смерти по типу апоптоза или клеточному старению, ведущему в конечном итоге к смерти по типу некроза. Утрата гена р53 приводит к накоплению генетических повреждений, приводящих к потере контроля над отдельными клетками со стороны целого организма, злокачественному росту и смерти.Интактность р53-зависимого сигнального пути важна при использовании химио- и радиотерапии для лечения раковых заболеваний. Многие химические соединения, используемые для предотвращения злокачественного роста опухолей, приводят к повреждениям ДНК, которые активируют белок р53. Известно, что р53 может активироваться в ответ на целый ряд стрессовых воздействий, включающих гипоксию (кислородное голодание) и тепловой шок. Также известна связь р53-зависимого сигнального пути с такими путями стрессового ответа как сигнальные пути, центральными компонентами которых являются индуцируемый гипоксией фактор 1 (HIF-1) и фактор теплового шока 1 (HSF-1). Таким образом, изучение взаимосвязей между р53, HIF-1 и HSF-1 активностями может пролить свет на многие аспекты клеточного реагирования на стресс, особенно в контексте опухолевого роста. Изучение механизмов клеточного реагирования на вышеперечисленные стрессы является областью активных научных исследований и обещает возникновение в будущем новых подходов к предотвращению и лечению рака и многих других патологических заболеваний.Основной целью данной работы являлось исследование состояния р53-зависимого сигнального пути в клеточных линиях различного происхождения.В ходе исследования бьши поставлены следующие задачи: 1. Создание дизайна индивидуальных для каждого транскрипционного фактора (р53, HIF-1 и HSF-1) репортерных кассет, включающих в себя а) множественные палиндромные последовательности, узнаваемые и связываемые данными транскрипционными факторами; б) минимальный промотор гена белка теплового шока 70 или минимальный ранний промотор из генома цитомегаловируса; в) репортерный ген зеленого флуоресцентного белка или р-галактозидазы.2. Получение и оптимизация работы репортерных кассет в ретровирусной и лентивирусной системах доставки репортера. Проверка адекватности количественной оценки активностей белков р53 и HIF-1 по экспрессии репортерного белка в различных клеточных системах.3. Анализ уровня экспрессии и локализации белка р53 в ряде опухолевых клеточных линий, большинство из которых характеризуется экспрессией гена р53 дикого типа.4. Проверка гипотезы о заякоривании белка р53 в цитолазме ряда меланомных клеточных линий.5. Изучение влияния различных стрессовых воздействий, главным образом обработок повреждающими ДНК агентами, на транскрипционную функцию белка р53 в меланомных клеточных линиях с различным статусом гена р53 по сравнению с нормальными меланоцитами. I.l Онкогены и опухолевые супрессоры Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов и протоонкогенов, а затем - опухолевых супрессоров и мутаторных генов. Онкогены - это клеточные или вирусные (привнесенные вирусом в клетку) гены, экспрессия которых может привести к развитию опухолевого новообразования. Протоонкогены - это нормальные клеточные гены, усиление или модификация функции которых превращает их в онкогены. Опухолевые супрессоры (антионкогены, рецессивные опухолевые гены) - клеточные гены, инактивация которых резко увеличивает вероятность возникновения новообразований, а восстановление функции, наоборот, может подавить рост опухолевых клеток. Следует заметить, что причисляемые к опухолевым супрессорам так называемые «мутаторные» гены, т.е. гены, нарушение функции которых тем или иным способом увеличивает темп возникновения мутаций и/или других генетических изменений, могут и не влиять на рост неопластических клеток. Однако их инактивация столь сильно увеличивает вероятность появления различных онкогенных мутаций, что образование опухоли становится лишь делом времени.Принадлежность к онкогенам или опухолевым супрессорам определяется несколькими критериями: а) закономерным характером изменений структуры и/или экспрессии данного гена в клетках определенных или различных новообразований; б) возникновением в юном или молодом возрасте определенных форм опухолей у индивидов с передающимися по наследству мутациями данного гена; в) резким повышением частоты появления опухолей у трансгенных животньи, либо экспрессирующих активированную форму данного гена - в случае онкогенов, либо несущих инактивирующие мутации данного гена - в случае опухолевых супрессоров; г) способностью вызывать в культивируемых in vitro клетках морфологическую трансформацию и/или неограниченный рост (онкогены), либо подавление клеточного роста и/или выраженности признаков трансформации (опухолевые супрессоры).Два последних десятилетия характеризовались бурным открыгием новых онкогенов и опухолевых супрессоров. К настоящему времени известно около сотни потенциальных онкогенов (клеточных и вирусных) и около двух десятков опухолевых супрессоров. Были описаны генетические события, приводящие к активации протоонкогенов или инактивации опухолевых супрессоров [1-4]. Обнаружено, что механизм действия вирусных онкогенов связан с активацией клеточных протоонкогенов (ретровирусы) или инактивацией опухолевых супрессоров (ДНК-содержащие вирусы) [5, 6]. Выявлены характерные для тех или иных форм новообразований человека изменения онкогенов и опухолевых супрессоров, в том числе высокоспецифичные аномалии, используемые для постановки диагноза.Однако долгое время знания о каждом из онкогенов или опухолевых супрессоров представлялись дискретными, в значительной мере не связанными между собой. И лишь в самые последние годы стала вырисовываться общая картина, показывающая, что подавляющее большинство известных протоонкогенов и опухолевых супрессоров являются компонентами нескольких общих сигнальньк путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз, целостность генома, морфогенетические реакции и дифференцировку клеток. Очевидно, изменения именно в этих сигнальных путях, в конце концов, и приводят к развитию злокачественных новообразований.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Разорёнова, Ольга Валериевна
IV. ВЫВОДЫ
1. Получены три вирусные репортерные системы, позволяющие оценивать изменение транскрипционной активности белков р53, Н1Р-1 и Н8Р-1 в практически любых клеточных линиях в ответ на специфические «активирующие» или «инактивирующие» эти транскрипционные факторы воздействия.
2. Изменение экспрессии репортерного гена в репортерных клеточных линиях коррелирует с изменением экспрессии эндогенных генов-мишеней соответствующего транскрипционного фактора (р53 или НИМ), что позволяет проводить количественную оценку активности изучаемых транскрипционных факторов в динамике.
3. Опухолевые клеточные линии с диким типом гена р53 меланомного происхождения характеризуются ядерной локализацией белка р53 при высоком уровне его экспрессии и цитоплазматической - при низком уровне его экспрессии в клетке.
4. В цитоплазме на/в эндосомах ряда меланомных клеточных линий, включая нормальные меланоциты, экспрессируется белок с молекулярной массой около 250 кДа, имеющий БО-1 эпитоп. Экспрессия БО-1 эпитопа в этом белке (или самого белка) падает в ответ на обработку определенным для каждой клеточной линии химическим соединением.
5. В большинстве исследованных клеточных линий с диким типом гена р53, р53-зависимая транскрипция в ответ на обработку классическими р53-активирующими химическими соединениями не нарушена. Исключение составляют линии АСНЫ и Ме12, в которых активация р53-зависимой транскрипции подавлена. Набор химических соединений, активирующих р53-зависимую транскрипцию, является специфической характеристикой для каждой из проанализированных клеточных линий.
6. Для некоторых меланомных клеточных линий характерен сайленсинг индукции репортерного гена в р53-чувствительных конструкциях при пассировании клеток. Этот эффект можно преодолеть при транзиентном введении репортеров в клетки.
7. Камптотецин является стабилизатором и активатором белка р53 за счет снижения экспрессии его белка-ингибитора НБМ2 на уровне мРНК. Этот механизм действия камптотецина является специфичным для опухолевых клеток меланомного происхождения, поскольку экспрессия НИМ2 при обработке камптотецином повышается в нормальных меланоцитах.
V. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Разоренова О.В., Агапова J1.C., Буданов А.В., Иванов А.В., Струнина С.М. и Чумаков П.М. Ретровируеные репортерные системы для оценки активности стрессовых сигнальных путей, контролируемых факторами транскрипции р53, HIF-1 И HSF-1. Молекулярная биология. 2005; 39(2): с. 286-293.
2. Razorenova О.У., Ivanov A.V., Budanov A.V. and Chumakov P.M. Virus-based reporter systems for monitoring transcriptional activity of hypoxia-inducible factor 1. Gene. 2005; 350(1): p. 89-98.
3. Разоренова О.В. Агапова J1.C. и Чумаков П.М. Экспрессия гена р53 и активация р53-зависимой транскрипции в линиях клеток меланом. Молекулярная биология. 2005; 39(3): с. 445-456.
4. Gurova К.V., Hill J.E., Razorenova O.V., Chumakov P.M., Gudkov A.V. p53 pathway in renal cell carcinoma is repressed by a dominant mechanism. Cancer Research. 2004; 64(6): p. 1951-1958.
5. Razorenova O.V. Ivanov A.V., Budanov A.V., Byzova T.V., Chumakov P.M. Development of readout system for monitoring HIF-1 transcriptional activity. IUBMB/ASBMB "A Molecular Exploration of the Cell". Boston, Massachusetts, June 12-16, 2004; Late Breaking Abstracts: p. 39.
6. Boiko A.D., Porteous S., Razorenova O.V., Krivokrysenko V.I., Chumakov P.M., Williams В., Gudkov A.V. Human candidate tumor suppressor genes identified by Ras cooperation assay. SKCC "Genomics, Signaling and Tumor Targeting". San Diego, California, March 1-5,2004; p. 51.
7. Boiko A.D., Porteous S., Razorenova O.V., Krivokrysenko V.I., Chumakov P.M., Williams В., Gudkov A.V. Human candidate tumor suppressor genes identified by Ras cooperation assay. CSHL "Cancer Genetics and Tumor Suppressor Genes". Cold Spring Harbor, New York, August 18-22, 2004; p. 35.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Разорёнова, Ольга Валериевна, Москва
1. Hooper M.L. 1998. Tumour suppressor gene mutations in humans and mice: parallels and contrasts. Embo J. 17, 6783-6789.
2. Hunter T. 1997. Oncoprotein networks. Cell. 88, 333-346.
3. Levine A.J. 1993. The tumor suppressor genes. Annu Rev Biochem. 62, 623-651.
4. Weinberg R.A. 1995. The molecular basis of oncogenes and tumor suppressor genes. Ann N YAcadSci. 758, 331-338.
5. Scarpa A., Tognon M. 1998. Molecular approach in human tumor investigation: oncogenes, tumor suppressor genes and DNA tumor polyomaviruses (review). Int J Mol Med. 1, 1011-1023.
6. Flint J., Shenk T. 1997. Viral transactivating proteins. Annu Rev Genet. 31, 177-212.
7. Donehower L.A., Harvey M., Slagle B.L., McArthur M.J., Montgomery C.A., Jr., Butel J.S., Bradley A. 1992. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature. 356,215-221.
8. Tsukada Т., Tomooka Y., Takai S., Ueda Y., Nishikawa S., Yagi Т., Tokunaga Т., Takeda N., Suda Y., Abe S., et al. 1993. Enhanced proliferative potential in culture of cells from p53-deficient mice. Oncogene. 8,3313-3322.
9. Levine A.J., Momand J., Finlay C.A. 1991. The p53 tumour suppressor gene. Nature. 351, 453-456.
10. Lane D.P. 1992. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358, 15-16.
11. El-Deiry W.S. 2003. The role of p53 in chemosensitivity and radiosensitivity. Oncogene. 22, 7486-7495.12. el-Deiry W.S. 1998. Regulation of p53 downstream genes. Semin Cancer Biol. 8, 345357.
12. Agarwal M.L., Taylor W.R., Chernov M.V., Chemova O.B., Stark G.R. 1998. The p53 network.JBiolChem. 273, 1-4.
13. Prives C. 1998. Signaling to p53: breaking the MDM2-p53 circuit. Cell. 95, 5-8.
14. Sherr C.J. 1998. Tumor surveillance via the ARF-p53 pathway. Genes Dev. 12, 29842991.
15. Ichihara A., Tanaka K. 1995. Roles of proteasomes in cell growth. Mol Biol Rep. 21, 4952.
16. Chowdary D.R., Dermody J.J., Jha K.K., Ozer H.L. 1994. Accumulation of p53 in a mutant cell line defective in the ubiquitin pathway. Mol Cell Biol. 14, 1997-2003.
17. Ginsberg D., Mechta F., Yaniv M., Oren M. 1991. Wild-type p53 can down-modulate the activity of various promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 88, 9979-9983.
18. Ewen M.E., Miller S.J. 1996. p53 and translational control. Biochim Biophys Acta. 1242, 181-184.
19. Mummenbrauer T., Janus F., Muller B., Wiesmuller L., Deppert W., Grosse F. 1996. p53 Protein exhibits 3'-to-5' exonuclease activity. Cell. 85, 1089-1099.
20. Jayaraman J., Prives C. 1995. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by short single strands of DNA requires the p53 C-terminus. Cell. 81, 1021-1029.
21. Bakalkin G., Yakovleva T., Selivanova G., Magnusson K.P., Szekely L., Kiseleva E., Klein G., Terenius L., Wiman K.G. 1994. p53 binds single-stranded DNA ends and catalyzes DNA renaturation and strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 91,413-417.
22. Lee S., Elenbaas B., Levine A., Griffith J. 1995. p53 and its 14 kDa C-terminal domain recognize primary DNA damage in the form of insertion/deletion mismatches. Cell. 81, 1013-1020.
23. Reed M., Woelker B., Wang P., Wang Y., Anderson M.E., Tegtmeyer P. 1995. The C-terminal domain of p53 recognizes DNA damaged by ionizing radiation. Proc Natl Acad Sci US A. 92, 9455-9459.
24. Raycroft L., Wu H.Y., Lozano G. 1990. Transcriptional activation by wild-type but not transforming mutants ofthep53 anti-oncogene. Science. 249, 1049-1051.
25. Kern S.E., Kinzler K.W., Bruskin A., Jarosz D., Friedman P., Prives C., Vogelstein B. 1991. Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein. Science. 252, 1708-1711.
26. Wu X., Bayle J.H., Olson D., Levine A.J. 1993. The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop. Genes Dev. 7, 1126-1132.
27. Lozano G., Montes de Oca Luna R. 1998. MDM2 function. Biochim Biophys Acta. 1377, M55-59.
28. Meek D.W. 1999. Mechanisms of switching on p53: a role for covalent modification? Oncogene. 18,7666-7675.
29. Kussie P.H., Gorina S., Marechal V., Elenbaas B., Moreau J., Levine A.J., Pavletich N.P. 1996. Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain. Science. 21 A, 948-953.
30. Venot C., Maratrat M., Sierra V., Conseiller E., Debussche L. 1999. Definition of a p53 transactivation function-deficient mutant and characterization of two independent p53 transactivation subdomains. Oncogene. 18,2405-2410.
31. Walker K.K., Levine A.J. 1996. Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression. Proc Natl Acad Sci U SA. 93, 15335-15340.
32. Sakamuro D., Sabbatini P., White E., Prendergast G.C. 1997. The polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growth arrest. Oncogene. 15, 887-898.
33. Cho Y., Gorina S., Jeffrey P.D., Pavletich N.P. 1994. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265,346-355.
34. Milner J. 1994. Forms and functions of p53. Semin Cancer Biol. 5, 211-219.
35. Shaulsky G., Ben-Ze'ev A., Rotter V. 1990. Subcellular distribution of the p53 protein during the cell cycle of Balb/c 3T3 cells. Oncogene. 5, 1707-1711.
36. Sturzbecher H.W., Brain R., Addison C., Rudge K., Remm M., Grimaldi M., Keenan E., Jenkins J.R. 1992. A C-terminal alpha-helix plus basic region motif is the major structural determinant of p53 tetramerization. Oncogene. 7, 1513-1523.
37. Levine A.J. 1990. Tumor suppressor genes. Bioessays. 12, 60-66.
38. Fukasawa K., Choi T., Kuriyama R., Rulong S., Vande Woude G.F. 1996. Abnormal centrosome amplification in the absence of p53. Science. 271,1744-1747.
39. Dameron K.M., Volpert O.V., Tainsky M.A., Bouck N. 1994. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Science. 265, 1582-1584.
40. Komarova E.A., Diatchenko L., Rokhlin O.W., Hill J.E., Wang Z.J., Krivokrysenko V.I., Feinstein E., Gudkov A.V. 1998. Stress-induced secretion of growth inhibitors: a novel tumor suppressor function of p53. Oncogene. 17, 1089-1096.
41. Shaulian E., Haviv I., Shaul Y., Oren M. 1995. Transcriptional repression by the C-terminal domain of p53. Oncogene. 10, 671-680.
42. Liu X., Miller C.W., Koeffler P.H., Berk A.J. 1993. The p53 activation domain binds the TATA box-binding polypeptide in Holo-TFIID, and a neighboring p53 domain inhibits transcription. Mol Cell Biol. 13, 3291-3300.
43. Cairns C.A., White R.J. 1998. p53 is a general repressor of RNA polymerase III transcription. Embo J. 17,3112-3123.47. el-Deiry W.S. 1998. p21/p53, cellular growth control and genomic integrity. Curr Top Microbiol Immunol. 121, 121-137.
44. Waldman T., Kinzler K.W., Vogelstein B. 1995. p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells. Cancer Res. 55, 5187-5190.
45. Brugarolas J., Chandrasekaran C., Gordon J.I., Beach D., Jacks T., Hannon G.J. 1995. Radiation-induced cell cycle arrest compromised by p21 deficiency. Nature. 377, 552557.
46. Waga S., Hannon G.J., Beach D., Stillman B. 1994. The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA. Nature. 369, 574-578.
47. Smith M.L., Chen I.T., Zhan Q., Bae I., Chen C.Y., Gilmer T.M., Kastan M.B., O'Connor P.M., Fornace A.J., Jr. 1994. Interaction of the p53-regulated protein Gadd45 with proliferating cell nuclear antigen. Science. 266, 1376-1380.
48. Zhan Q., Kontny U., Iglesias M., Alamo I., Jr., Yu K., Hollander M.C., Woodworth
49. C.D., Fornace A.J., Jr. 1999. Inhibitory effect of Bcl-2 on p53-mediated transactivation following genotoxic stress. Oncogene. 18,297-304.
50. Hermeking H., Lengauer C., Polyak К., He T.C., Zhang L., Thiagalingam S., Kinzler K.W., Vogelstein B. 1997. 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Mol Cell. 1,3-11.
51. Miyashita Т., Reed J.C. 1995. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell. 80,293-299.
52. Oltvai Z.N., Korsmeyer S.J. 1994. Checkpoints of dueling dimers foil death wishes. Cell. 79, 189-192.
53. Srinivasula S.M., Ahmad M., Fernandes-Alnemri Т., Alnemri E.S. 1998. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization. Mol Cell. 1, 949-957.
54. Wu G.S., Burns T.F., McDonald E.R., 3rd, Jiang W., Meng R., Krantz I.D., Kao G., Gan
55. D.D., Zhou J.Y., Muschel R., Hamilton S.R., Spinner N.B., Markowitz S., Wu G., el-Deiry W.S. 1997. KILLER/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene. Nat Genet. 17, 141-143.
56. Ashkenazi A., Dixit V.M. 1998. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281,1305-1308.
57. Prisco M., Hongo A., Rizzo M.G., Sacchi A., Baserga R. 1997. The insulin-like growth factor I receptor as a physiologically relevant target of p53 in apoptosis caused by interleukin-3 withdrawal. Mol Cell Biol 17,1084-1092.
58. Yin Y., Terauchi Y., Solomon G.G., Aizawa S., Rangarajan P.N., Yazaki Y., Kadowaki T., Barrett J.C. 1998. Involvement of p85 in p53-dependent apoptotic response to oxidative stress. Nature. 391, 707-710.
59. Okamoto K., Beach D. 1994. Cyclin G is a transcriptional target of the p53 tumor suppressor protein. Embo J. 13,4816-4822.
60. Okamoto K., Prives C. 1999. A role of cyclin G in the process of apoptosis. Oncogene. 18,4606-4615.
61. Van Meir E.G., Polverini P.J., Chazin V.R., Su Huang H.J., de Tribolet N., Cavenee W.K. 1994. Release of an inhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells. Nat Genet. 8,171-176.
62. Janus F., Albrechtsen N., Knippschild U., Wiesmuller L., Grosse F., Deppert W. 1999. Different regulation of the p53 core domain activities 3'-to-5' exonuclease and sequence-specific DNA binding. Mol Cell Biol. 19, 2155-2168.
63. Janus F., Albrechtsen N., Dornreiter I., Wiesmuller L., Grosse F., Deppert W. 1999. The dual role model for p53 in maintaining genomic integrity. Cell Mol Life Sci. 55, 12-27.
64. Reisman D., Loging W.T. 1998. Transcriptional regulation of the p53 tumor suppressor gene. Semin Cancer Biol. 8,317-324.
65. Reisman D., Elkind N.B., Roy B., Beamon J., Rotter V. 1993. c-Myc trans-activates the p53 promoter through a required downstream CACGTG motif. Cell Growth Differ. 4, 57-65.
66. Sun X., Shimizu H., Yamamoto K. 1995. Identification of a novel p53 promoter element involved in genotoxic stress-inducible p53 gene expression. Mol Cell Biol. 15, 44894496.
67. Albrechtsen N., Dornreiter I., Grosse F., Kim E., Wiesmuller L., Deppert W. 1999. Maintenance of genomic integrity by p53: complementary roles for activated and non-activated p53. Oncogene. 18,7706-7717.
68. Maltzman W., Czyzyk L. 1984. UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells. Mol Cell Biol. 4,1689-1694.
69. Reich N.C., Oren M., Levine A.J. 1983. Two distinct mechanisms regulate the levels of a cellular tumor antigen, p53. Mol Cell Biol. 3,2143-2150.
70. Caelles C., Helmberg A., Karin M. 1994. p53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation of p53-target genes. Nature. 370,220-223.
71. Mosner J., Mummenbrauer T., Bauer C., Sczakiel G., Grosse F., Deppert W. 1995. Negative feedback regulation of wild-type p53 biosynthesis. Embo J. 14,4442-4449.
72. Lu H., Levine A.J. 1995. Human TAFII31 protein is a transcriptional coactivator of the p53 protein. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 5154-5158.
73. Thut C.J., Chen J.L., Klemm R., Tjian R. 1995. p53 transcriptional activation mediated by coactivators TAFII40 andTAFII60. Science. 267,100-104.
74. Truant R., Xiao H., Ingles C.J., Greenblatt J. 1993. Direct interaction between the transcriptional activation domain of human p53 and the TATA box-binding protein. J Biol Chem. 268,2284-2287.
75. Grunstein M. 1997. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352.
76. Mizzen C.A., Allis C.D. 1998. Linking histone acetylation to transcriptional regulation. Cell Mol Life Sci. 54, 6-20.
77. Struhl K. 1998. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes Dev. 12, 599-606.
78. Gu W., Shi X.L., Roeder R.G. 1997. Synergistic activation of transcription by CBP and p53. Nature. 387, 819-823.
79. Wadgaonkar R., Collins T. 1999. Murine double minute (MDM2) blocks p53-coactivator interaction, a new mechanism for inhibition of p53-dependent gene expression. J Biol Chem. 21 A, 13760-13767.
80. Janknecht R., Hunter T. 1996. Transcription. A growing coactivator network. Nature. 383, 22-23.
81. Sakaguchi K., Herrera J.E., Saito S., Miki T., Bustin M., Vassilev A., Anderson C.W., Appella E. 1998. DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade. Genes Dev. 12, 2831-2841.
82. Gu W., Roeder R.G. 1997. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell. 90, 595-606.
83. Liu L., Scolnick D.M., Trievel R.C., Zhang H.B., Marmorstein R., Halazonetis T.D., Berger S.L. 1999. p53 sites acetylated in vitro by PCAF and p300 are acetylated in vivo in response to DNA damage. Mol Cell Biol. 19, 1202-1209.
84. Chen C.Y., Oliner J.D., Zhan Q., Fornace A.J., Jr., Vogelstein B., Kastan M.B. 1994. Interactions between p53 and MDM2 in a mammalian cell cycle checkpoint pathway. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 2684-2688.
85. Kubbutat M.H., Jones S.N., Vousden K.H. 1997. Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature. 387,299-303.
86. Blaydes J.P., Gire V., Rowson J.M., Wynford-Thomas D. 1997. Tolerance of high levels of wild-type p53 in transformed epithelial cells dependent on auto-regulation by mdm-2. Oncogene. 14,1859-1868.
87. Bottger A., Bottger V., Sparks A., Liu W.L., Howard S.F., Lane D.P. 1997. Design of a synthetic Mdm2-binding mini protein that activates the p53 response in vivo. Curr Biol. 7, 860-869.
88. Shieh S.Y., Ikeda M., Taya Y., Prives C. 1997. DNA damage-induced phosphorylation ofp53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91, 325-334.
89. Siliciano J.D., Canman C.E., Taya Y., Sakaguchi K., Appella E., Kastan M.B. 1997. DNA damage induces phosphorylation of the amino terminus of p53. Genes Dev. 11, 3471-3481.
90. Fiscella M., Zambrano N., Ullrich S.J., Unger T., Lin D., Cho B., Mercer W.E., Anderson C.W., Appella E. 1994. The carboxy-terminal serine 392 phosphorylation site of human p53 is not required for wild-type activities. Oncogene. 9, 3249-3257.
91. Woo R.A., McLure K.G., Lees-Miller S.P., Rancourt D.E., Lee P.W. 1998. DNA-dependent protein kinase acts upstream of p53 in response to DNA damage. Nature. 394, 700-704.
92. Mayo L.D., Turchi J.J., Berberich S.J. 1997. Mdm-2 phosphorylation by DNA-dependent protein kinase prevents interaction with p53. Cancer Res. 57, 5013-5016.
93. Canman C.E., Lim D.S., Cimprich K.A., Taya Y., Tamai K., Sakaguchi K., Appella E., Kastan M.B., Siliciano J.D. 1998. Activation of the ATM kinase by ionizing radiation and phosphorylation of p53. Science. 281, 1677-1679.
94. Lavin M.F., Shiloh Y. 1997. The genetic defect in ataxia-telangiectasia. Annu Rev Immunol. 15,177-202.
95. Kastan M.B., Zhan Q., el-Deiry W.S., Carrier F., Jacks T., Walsh W.V., Plunkett B.S., Vogelstein B., Fornace A.J., Jr. 1992. A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia. Cell. 71, 587-597.
96. Khanna K.K., Lavin M.F. 1993. Ionizing radiation and UV induction of p53 protein by different pathways in ataxia-telangiectasia cells. Oncogene. 8, 3307-3312.
97. Xu Y., Baltimore D. 1996. Dual roles of ATM in the cellular response to radiation and in cell growth control. Genes Dev. 10, 2401-2410.
98. Cliby W.A., Roberts C.J., Cimprich K.A., Stringer C.M., Lamb J.R., Schreiber S.L., Friend S.H. 1998. Overexpression of a kinase-inactive ATR protein causes sensitivity to DNA-damaging agents and defects in cell cycle checkpoints. Embo J. 17, 159-169.
99. Lakin N.D., Jackson S.P. 1999. Regulation of p53 in response to DNA damage. Oncogene. 18,7644-7655.
100. Lu H., Taya Y., Ikeda M., Levine A.J. 1998. Ultraviolet radiation, but not gamma radiation or etoposide-induced DNA damage, results in the phosphorylation of the murine p53 protein at serine-389. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 6399-6402.
101. Meek D.W. 1998. Multisite phosphorylation and the integration of stress signals at p53. Cell Signal. 10, 159-166.
102. Wang Y., Prives C. 1995. Increased and altered DNA binding of human p53 by S and G2/M but not Gl cyclin-dependent kinases. Nature. 376, 88-91.
103. Ashcroft M., Kubbutat M.H., Vousden K.H. 1999. Regulation of p53 function and stability by phosphorylation. Mol Cell Biol. 19, 1751 -1758.
104. Waterman M.J., Stavridi E.S., Waterman J.L., Halazonetis T.D. 1998. ATM-dependent activation of p53 involves dephosphorylation and association with 14-3-3 proteins. Nat Genet. 19,175-178.
105. Hupp T.R., Lane D.P. 1994. Allosteric activation of latent p53 tetramers. Curr Biol. 4, 865-875.
106. Chernov M.V., Ramana C.V., Adler V.V., Stark G.R. 1998. Stabilization and activation of p53 are regulated independently by different phosphorylation events. Proc Natl Acad Sei US A. 95,2284-2289.
107. Lambert P.F., Kashanchi F., Radonovich M.F., Shiekhattar R., Brady J.N. 1998. Phosphorylation of p53 serine 15 increases interaction with CBP. J Biol Chem. 273, 33048-33053.
108. Goga A., Liu X., Hambuch T.M., Senechal K., Major E., Berk A.J., Witte O.N., Sawyers C.L. 1995. p53 dependent growth suppression by the c-Abl nuclear tyrosine kinase. Oncogene. 11,791-799.
109. Sionov R.V., Moallem E., Berger M., Kazaz A., Gerlitz O., Ben-Neriah Y., Oren M., Haupt Y. 1999. c-Abl neutralizes the inhibitory effect of Mdm2 on p53. J Biol Chem. 274, 8371-8374.
110. Yuan Z.M., Huang Y., Whang Y., Sawyers C., Weichselbaum R., Kharbanda S., Kufe D. 1996. Role for c-Abl tyrosine kinase in growth arrest response to DNA damage. Nature. 382, 272-274.
111. Kamijo T., Zindy F., Roussel M.F., Quelle D.E., Downing J.R., Ashmun R.A., Grosveld G., Sherr C.J. 1997. Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reading frame product pi9ARF. Cell. 91, 649-659.
112. Kamijo T., Weber J.D., Zambetti G., Zindy F., Roussel M.F., Sherr C.J. 1998. Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2. Proc Natl AcadSci USA. 95, 8292-8297.
113. Kamijo T., Bodner S., van de Kamp E., Randle D.H., Sherr C.J. 1999. Tumor spectrum in ARF-deficient mice. Cancer Res. 59,2217-2222.
114. Leveillard T., Wasylyk B. 1997. The MDM2 C-terminal region binds to TAFII250 and is required for MDM2 regulation of the cyclin A promoter. J Biol Chem. Ill, 3065130661.
115. Zhang Y., Xiong Y. 1999. Mutations in human ARF exon 2 disrupt its nucleolar localization and impair its ability to block nuclear export of MDM2 and p53. Mol Cell. 3, 579-591.
116. Zindy F., Eischen C.M., Randle D.H., Kamijo T., Cleveland J.L., Sherr C.J., Roussel M.F. 1998. Myc signaling via the ARF tumor suppressor regulates p53-dependent apoptosis and immortalization. Genes Dev. 12,2424-2433.
117. Serrano M., Lin A.W., McCurrach M.E., Beach D., Lowe S.W. 1997. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell. 88, 593-602.
118. Palmero I., Pantoja C., Serrano M. 1998. pl9ARF links the tumour suppressor p53 to Ras. Nature. 395, 125-126.
119. Calabro V., Parisi T., Di Cristofano A., La Mantia G. 1999. Suppression of Ras-mediated NIH3T3 transformation by pl9ARF does not involve alterations of cell growth properties. Oncogene. 18, 2157-2162.
120. Ruas M., Peters G. 1998. The pl6INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives. Biochim BiophysActa. 1378, F115-177.
121. Graeber T.G., Osmanian C., Jacks T., Housman D.E., Koch C.J., Lowe S.W., Giaccia A.J. 1996. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours. Nature. 379, 88-91.
122. Valenzuela M.T., Nunez M.I., Villalobos M., Siles E., McMillan T.J., Pedraza V., Ruiz de Almodovar J.M. 1997. A comparison of p53 and pl6 expression in human tumor cells treated with hyperthermia or ionizing radiation. Int J Cancer. 72, 307-312.
123. Tishler R.B., Lamppu D.M., Park S., Price B.D. 1995. Microtubule-active drugs taxol, vinblastine, and nocodazole increase the levels of transcriptionally active p53. Cancer Res. 55, 6021-6025.
124. Sablina A.A., Ilyinskaya G.V., Rubtsova S.N., Agapova L.S., Chumakov P.M., Kopnin B.P. 1998. Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in response to micronuclei formation. J Cell Sci. Ill ( Pt 7), 977-984.
125. Nikiforov M.A., Hagen K., Ossovskaya V.S., Connor T.M., Lowe S.W., Deichman G.I., Gudkov A.V. 1996. p53 modulation of anchorage independent growth and experimental metastasis. Oncogene. 13, 1709-1719.
126. An W.G., Kanekal M., Simon M.C., Maltepe E., Blagosklonny M.V., Neckers L.M. 1998. Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducible factor 1 alpha. Nature. 392, 405-408.
127. Semenza G.L., Wang G.L. 1992. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol Cell Biol. 12, 5447-5454.
128. Wang G.L., Semenza G.L. 1995. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1 .J Biol Chem. 270, 1230-1237.
129. Wang G.L., Jiang B.H., Rue E.A., Semenza G.L. 1995. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 5510-5514.
130. Forsythe J.A., Jiang B.H., Iyer N.V., Agani F., Leung S.W., Koos R.D., Semenza G.L. 1996. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol Cell Biol. 16,4604-4613.
131. Camenisch G., Stroka D.M., Gassmann M., Wenger R.H. 2001. Attenuation of HIF-1 DNA-binding activity limits hypoxia-inducible endothelin-1 expression. Pflugers Arch. 443,240-249.
132. Feldser D., Agani F., Iyer N.V., Pak B., Ferreira G., Semenza G.L. 1999. Reciprocal positive regulation of hypoxia-inducible factor lalpha and insulin-like growth factor 2. Cancer Res. 59, 3915-3918.
133. Semenza G.L. 2003. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 3, 721-732.
134. Jiang B.H., Zheng J.Z., Leung S.W., Roe R., Semenza G.L. 1997. Transactivation and inhibitory domains of hypoxia-inducible factor 1 alpha. Modulation of transcriptional activity by oxygen tension. J Biol Chem. 272, 19253-19260.
135. Semenza G.L. 1999. Regulation of mammalian 02 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. AnnuRev Cell Dev Biol. 15, 551-578.
136. Semenza G.L. 2001. HIF-1, 0(2), and the 3 PHDs: how animal cells signal hypoxia to the nucleus. Cell. 107,1-3.
137. Kaelin W.G., Jr. 2002. How oxygen makes its presence felt. Genes Dev. 16, 1441-1445.
138. Ivan M., Kondo K., Yang H., Kim W., Valiando J., Ohh M., Salic A., Asara J.M., Lane W.S., Kaelin W.G., Jr. 2001. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for 02 sensing. Science. 292, 464-468.
139. Gu J., Milligan J., Huang L.E. 2001. Molecular mechanism of hypoxia-inducible factor lalpha -p300 interaction. A leucine-rich interface regulated by a single cysteine. J Biol Chem. 276, 3550-3554.
140. Kung A.L., Wang S., Klco J.M., Kaelin W.G., Livingston D.M. 2000. Suppression of tumor growth through disruption of hypoxia-inducible transcription. Nat Med. 6, 13351340.
141. Bruick R.K., McKnight S.L. 2002. Transcription. Oxygen sensing gets a second wind. Science. 295,807-808.
142. Lando D., Peet D.J., Gorman J.J., Whelan D.A., Whitelaw M.L., Bruick R.K. 2002. FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor. Genes Dev. 16, 1466-1471.
143. McNeill L.A., Hewitson K.S., Claridge T.D., Seibel J.F., Horsfall L.E., Schofield C.J. 2002. Hypoxia-inducible factor asparaginyl hydroxylase (FIH-1) catalyses hydroxylation at the beta-carbon of asparagine-803. Biochem J. 367, 571-575.
144. Mahon P.C., Hirota K., Semenza G.L. 2001. FIH-1: a novel protein that interacts with HIF-1 alpha and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity. Genes Dev. 15,2675-2686.
145. Ryan H.E., Lo J., Johnson R.S. 1998. HIF-1 alpha is required for solid tumor formation and embryonic vascularization. Embo J. 17,3005-3015.
146. Krishnamachary B., Berg-Dixon S., Kelly B., Agani F., Feldser D., Ferreira G., Iyer N., LaRusch J., Pak B., Taghavi P., Semenza G.L. 2003. Regulation of colon carcinoma cell invasion by hypoxia-inducible factor 1. Cancer Res. 63, 1138-1143.
147. Tian H., McKnight S.L., Russell D.W. 1997. Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells. Genes Dev. 11, 72-82.
148. Brusselmans K., Bono F., Maxwell P., Dor Y., Dewerchin M., Collen D., Herbert J.M., Carmeliet P. 2001. Hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is involved in the apoptotic response to hypoglycemia but not to hypoxia. J Biol Chem. 276,39192-39196.
149. Makino Y., Kanopka A., Wilson W.J., Tanaka H., Poellinger L. 2002. Inhibitory PAS domain protein (IPAS) is a hypoxia-inducible splicing variant of the hypoxia-inducible factor-3 alpha locus. J Biol Chem. 211,32405-32408.
150. Jewell U.R., Kvietikova I., Scheid A., Bauer C., Wenger R.H., Gassmann M. 2001. Induction of HIF-1 alpha in response to hypoxia is instantaneous. Faseb J. 15, 13121314.
151. Wenger R.H., Camenisch G., Desbaillets I., Chilov D., Gassmann M. 1998. Up-regulation of hypoxia-inducible factor-1 alpha is not sufficient for hypoxic/anoxic p53 induction. Cancer Res. 58, 5678-5680.
152. Hammond E.M., Denko N.C., Dorie M.J., Abraham R.T., Giaccia A.J. 2002. Hypoxia links ATR and p53 through replication arrest. Mol Cell Biol. 22, 1834-1843.
153. Ashcroft M., Taya Y., Vousden K.H. 2000. Stress signals utilize multiple pathways to stabilize p53. Mol Cell Biol. 20,3224-3233.
154. Piret J.P., Mottet D„ Raes M., Michiels C. 2002. Is HIF-lalpha a pro- or an anti-apoptotic protein? Biochem Pharmacol. 64, 889-892.
155. Denko N.C., Green S.L., Edwards D., Giaccia A.J. 2000. p53 checkpoint-defective cells are sensitive to X rays, but not hypoxia. Exp Cell Res. 258, 82-91.
156. Halterman M.W., Federoff H.J. 1999. HIF-lalpha and p53 promote hypoxia-induced delayed neuronal death in models of CNS ischemia. Exp Neurol. 159, 65-72.
157. Crumrine R.C., Thomas A.L., Morgan P.F. 1994. Attenuation of p53 expression protects against focal ischemic damage in transgenic mice. J Cereb Blood Flow Metab. 14, 887891.
158. Sansome C., Zaika A., Marchenko N.D., Moll U.M. 2001. Hypoxia death stimulus induces translocation of p53 protein to mitochondria. Detection by immunofluorescence on whole cells. FEBSLett. 488, 110-115.
159. Blagosklonny M.V., An W.G., Romanova L.Y., Trepel J., Fojo T., Neckers L. 1998. p53 inhibits hypoxia-inducible factor-stimulated transcription. J Biol Chem. 273, 1199511998.
160. Arany Z., Huang L.E., Eckner R., Bhattacharya S., Jiang C., Goldberg M.A., Bunn H.F., Livingston D.M. 1996. An essential role for p300/CBP in the cellular response to hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 12969-12973.
161. Avantaggiati M.L., Ogryzko V., Gardner K., Giordano A., Levine A.S., Kelly K. 1997. Recruitment of p300/CBP in p53-dependent signal pathways. Cell. 89,1175-1184.
162. Ravi R., Mookeijee B., Bhujwalla Z.M., Sutter C.H., Artemov D., Zeng Q., Dillehay L.E., Madan A., Semenza G.L., Bedi A. 2000. Regulation of tumor angiogenesis by p53-induced degradation of hypoxia-inducible factor lalpha. Genes Dev. 14, 34-44.
163. Maxwell P.H., Pugh C.W., Ratcliffe P.J. 2001. Activation of the HIF pathway in cancer. Curr Opin Genet Dev. 11, 293-299.
164. Zhong H., De Marzo A.M., Laughner E., Lim M., Hilton D.A., Zagzag D., Buechler P., Isaacs W.B., Semenza G.L., Simons J.W. 1999. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1 alpha in common human cancers and their metastases. Cancer Res. 59, 58305835.
165. Fatyol K., Szalay A.A. 2001. The pl4ARF tumor suppressor protein facilitates nucleolar sequestration of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1 alpha ) and inhibits HIF-1-mediated transcription. J Biol Chem. 276, 28421-28429.
166. Margulis B.A., Guzhova I.V. 2000. Stress proteins in eukaryotic cells. Tsitologiia. 42, 323-342.
167. Morimoto R.I., Sarge K.D., Abravaya K. 1992. Transcriptional regulation of heat shock genes. A paradigm for inducible genomic responses. J Biol Chem. 267,21987-21990.
168. Wadhwa R., Kaul S.C., Mitsui Y. 1994. Cellular mortality to immortalization: mortalin. Cell Struct Funct. 19, 1-10.
169. Margulis B.A., Zhivotovski B.D., Pospelova T.V., Smagina L.V. 1991. Patterns of protein synthesis in various cells after extreme heat shock. Exp Cell Res. 193,219-222.
170. Bush K.T., Goldberg A.L., Nigam S.K. 1997. Proteasome inhibition leads to a heat-shock response, induction of endoplasmic reticulum chaperones, and thermotolerance. J Biol Chem. 272, 9086-9092.
171. Sorger P.K. 1991. Heat shock factor and the heat shock response. Cell. 65,363-366.
172. Morimoto R.I., Kline M.P., Bimston D.N., Cotto J.J. 1997. The heat-shock response: regulation and function of heat-shock proteins and molecular chaperones. Essays Biochem. 32,17-29.
173. Mathew A., Mathur S.K., Morimoto R.I. 1998. Heat shock response and protein degradation: regulation of HSF2 by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol Cell Biol. 18,5091-5098.
174. Wu C. 1995. Heat shock transcription factors: structure and regulation. Annu Rev Cell Dev Biol. 11,441-469.
175. Nakai A., Kawazoe Y., Tanabe M., Nagata K., Morimoto R.I. 1995. The DNA-binding properties of two heat shock factors, HSF1 and HSF3, are induced in the avian erythroblast cell line HD6. Mol Cell Biol. 15, 5268-5278.
176. Nakai A., Tanabe M., Kawazoe Y., Inazawa J., Morimoto R.I., Nagata K. 1997. HSF4, a new member of the human heat shock factor family which lacks properties of a transcriptional activator. Mol Cell Biol. 17, 469-481.
177. Tanabe M., Kawazoe Y„ Takeda S., Morimoto R.I., Nagata K., Nakai A. 1998. Disruption of the HSF3 gene results in the severe reduction of heat shock gene expression and loss of thermotolerance. Embo J. 17, 1750-1758.
178. Sarto C., Binz P.A., Mocarelli P. 2000. Heat shock proteins in human cancer. Electrophoresis. 21, 1218-1226.
179. Jolly C., Morimoto R.I. 2000. Role of the heat shock response and molecular chaperones in oncogenesis and cell death. J Natl Cancer Inst. 92, 1564-1572.
180. Kastan M.B., Onyekwere O., Sidransky D., Vogelstein B., Craig R.W. 1991. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res. 51, 6304-6311.
181. Fritsche M., Haessler C., Brandner G. 1993. Induction of nuclear accumulation of the tumor-suppressor protein p53 by DNA-damaging agents. Oncogene. 8, 307-318.
182. Scheffner M., Huibregtse J.M., Vierstra R.D., Howley P.M. 1993. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75,495-505.
183. Soussi T. 1996. The p53 tumour suppressor gene: a model for molecular epidemiology of human cancer. Mol Med Today. 2, 32-37.
184. Zambetti G.P., Levine A.J. 1993. A comparison of the biological activities of wild-type and mutant p53. Faseb J. 7, 855-865.
185. Landers J.E., Cassel S.L., George D.L. 1997. Translational enhancement of mdm2 oncogene expression in human tumor cells containing a stabilized wild-type p53 protein. Cancer Res. 57, 3562-3568.
186. Cordon-Cardo C., Latres E., Drobnjak M., Oliva M.R., Pollack D., Woodruff J.M., Marechal V., Chen J., Brennan M.F., Levine A.J. 1994. Molecular abnormalities of mdm2 and p53 genes in adult soft tissue sarcomas. Cancer Res. 54, 794-799.
187. Gannon J.V., Greaves R., Iggo R., Lane D.P. 1990. Activating mutations in p53 produce a common conformational effect. A monoclonal antibody specific for the mutant form. EmboJ. 9, 1595-1602.
188. Milner J., Watson J.V. 1990. Addition of fresh medium induces cell cycle and conformation changes in p53, a tumour suppressor protein. Oncogene. 5,1683-1690.
189. Zhang W., Hu G., Estey E., Hester J., Deisseroth A. 1992. Altered conformation of the p53 protein in myeloid leukemia cells and mitogen-stimulated normal blood cells. Oncogene. 7,1645-1647.
190. Ryan J J., Clarke M.F. 1994. Alteration of p53 conformation and induction of apoptosis in a murine erythroleukemia cell line by dimethylsulfoxide. LeukRes. 18, 617-621.
191. Blagosklonny M.V., Toretsky J., Neckers L. 1995. Geldanamycin selectively destabilizes and conformationally alters mutated p53. Oncogene. 11, 933-939.
192. Whitesell L., Sutphin P.D., Pulcini E.J., Martinez J.D., Cook P.H. 1998. The physical association of multiple molecular chaperone proteins with mutant p53 is altered by geldanamycin, an hsp90-binding agent. Mol Cell Biol. 18, 1517-1524.
193. Coux O., Tanaka K., Goldberg A.L. 1996. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu Rev Biochem. 65, 801-847.
194. Pagano M. 1997. Cell cycle regulation by the ubiquitin pathway. Faseb J. 11, 10671075.
195. Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H. 1997. Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell. 90, 65-75.
196. Stebbins C.E., Russo A.A., Schneider C., Rosen N. Hartl F.U., Pavletich N.P. 1997. Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex: targeting of a protein chaperone by an antitumor agent. Cell. 89,239-250.
197. Wiech H., Buchner J., Zimmermann R., Jakob U. 1992. Hsp90 chaperones protein folding in vitro. Nature. 358, 169-170.
198. Miyata Y., Yahara I. 1992. The 90-kDa heat shock protein, HSP90, binds and protects casein kinase II from self-aggregation and enhances its kinase activity. J Biol Chem. 267, 7042-7047.
199. Blagosklonny M.V., Toretsky J., Bohen S., Neckers L. 1996. Mutant conformation of p53 translated in vitro or in vivo requires functional HSP90. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8379-8383.
200. Pinhasi-Kimhi O., Michalovitz D., Ben-Zeev A., Oren M. 1986. Specific interaction between the p53 cellular tumour antigen and major heat shock proteins. Nature. 320, 182-184.
201. Hinds P.W., Finlay C.A., Frey A.B., Levine A.J. 1987. Immunological evidence for the association of p53 with a heat shock protein, hsc70, in p53-plus-ras-transformed cell lines. Mol Cell Biol. 7,2863-2869.
202. Finlay C.A., Hinds P.W., Tan T.H., Eliyahu D., Oren M., Levine A.J. 1988. Activating mutations for transformation by p53 produce a gene product that forms an hsc70-p53 complex with an altered half-life. Mol Cell Biol. 8, 531-539.
203. Sturzbecher H.W., Chumakov P., Welch W.J., Jenkins J.R. 1987. Mutant p53 proteins bind hsp 72/73 cellular heat shock-related proteins in SV40-transformed monkey cells. Oncogene. 1,201-211.
204. Sturzbecher H.W., Addison C., Jenkins J.R. 1988. Characterization of mutant p53-hsp72/73 protein-protein complexes by transient expression in monkey COS cells. Mol Cell Biol. 8,3740-3747.
205. Hainaut P., Milner J. 1992. Interaction of heat-shock protein 70 with p53 translated in vitro: evidence for interaction with dimeric p53 and for a role in the regulation of p53 conformation. Embo J. 11,3513-3520.
206. Chernov M.V., Stark G.R. 1997. The p53 activation and apoptosis induced by DNA damage are reversibly inhibited by salicylate. Oncogene. 14,2503-2510.
207. Wadhwa R., Kaul S.C., Sugimoto Y., Mitsui Y. 1993. Induction of cellular senescence by transfection of cytosolic mortalin cDNA in NIH 3T3 cells. J Biol Chem. 268, 2223922242.
208. Wadhwa R., Kaul S.C., Mitsui Y., Sugimoto Y. 1993. Differential subcellular distribution of mortalin in mortal and immortal mouse and human fibroblasts. Exp Cell Res. 207,442-448.
209. Wadhwa R., Kaul S.C., Ikawa Y., Sugimoto Y. 1993. Identification of a novel member of mouse hsp70 family. Its association with cellular mortal phenotype. J Biol Chem. 268, 6615-6621.
210. Wadhwa R., Akiyama S., Sugihara T., Reddel R.R., Mitsui Y., Kaul S.C. 1996. Genetic differences between the pancytosolic and perinuclear forms of murine mortalin. Exp Cell Res. 226, 381-386.
211. Wadhwa R., Takano S., Robert M., Yoshida A., Nomura H., Reddel R.R., Mitsui Y., Kaul S.C. 1998. Inactivation of tumor suppressor p53 by mot-2, a hsp70 family member. J Biol Chem. 273, 29586-29591.
212. Kaul S.C., Duncan E.L., Englezou A., Takano S., Reddel R.R., Mitsui Y., Wadhwa R. 1998. Malignant transformation of NIH3T3 cells by overexpression of mot-2 protein. Oncogene. 17, 907-911.
213. Kaul S.C., Takano S., Reddel R.R., Mitsui Y., Wadhwa R. 2000. Transcriptional inactivation of p53 by deletions and single amino acid changes in mouse mot-1 protein. Biochem Biophys Res Commun. 279, 602-606.
214. Kaul S.C., Duncan E., Sugihara T., Reddel R.R., Mitsui Y., Wadhwa R. 2000. Structurally and functionally distinct mouse hsp70 family members Mot-1 and Mot-2 proteins are encoded by two alleles. DNA Res. 7,229-231.
215. Alam J., Cook J.L. 1990. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem. 188,245-254.
216. Wood K.V. 1995. Marker proteins for gene expression. Curr Opin Biotechnol. 6, 50-58.
217. Karin M. 1994. Signal transduction from the cell surface to the nucleus through the phosphorylation of transcription factors. Curr Opin Cell Biol. 6,415-424.
218. Misteli T., Spector D.L. 1997. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nat Biotechnol. 15, 961-964.
219. Broach J.R., Thorner J. 1996. High-throughput screening for drug discovery. Nature. 384, 14-16.
220. Welsh S., Kay S.A. 1997. Reporter gene expression for monitoring gene transfer. Curr Opin Biotechnol. 8,617-622.
221. Thompson J.F., Geoghegan K.F., Lloyd D.B., Lanzetti A.J., Magyar R.A., Anderson S.M., Branchini B.R. 1997. Mutation of a protease-sensitive region in firefly luciferase alters light emission properties. J Biol Chem. 272, 18766-18771.
222. Siemering K.R., Golbik R., Sever R., Haseloff J. 1996. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Curr Biol. 6,1653-1663.
223. Heim R., Tsien R.Y. 1996. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 6, 178-182.
224. Crameri A., Whitehorn E.A., Tate E., Stemmer W.P. 1996. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nat Biotechnol. 14, 315-319.
225. Naylor L.H. 1999. Reporter gene technology: the future looks bright. Biochem Pharmacol. 58, 749-757.
226. Tsien R.Y. 1998. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544.
227. Llopis J., McCaffery J.M., Miyawaki A., Farquhar M.G., Tsien R.Y. 1998. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 6803-6808.
228. Miesenböck G., De Angelis D.A., Rothman J.E. 1998. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394,192-195.
229. Levitzki A. 1996. Targeting signal transduction for disease therapy. Curr Opin Cell Biol. 8,239-244.
230. Schafer H., Schafer A., Kiderlen A.F., Masihi K.N., Burger R. 1997. A highly sensitive cytotoxicity assay based on the release of reporter enzymes, from stably transfected cell lines. J Immunol Methods. 204, 89-98.
231. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Strategies for cloning in plasmid vectors, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, C. Nolan, Editor. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York. p. 1.53-51.73.
232. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. 2002. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553.
233. Inoue H., Nojima H., Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28.
234. Chen J.Y., Funk W.D., Wright W.E., Shay J.W., Minna J.D. 1993. Heterogeneity of transcriptional activity of mutant p53 proteins and p53 DNA target sequences. Oncogene. 8,2159-2166.
235. Pietenpol J.A., Tokino T., Thiagalingam S., el-Deiry W.S., Kinzler K.W., Vogelstein B. 1994. Sequence-specific transcriptional activation is essential for growth suppression by p53. Proc Natl Acad Sei USA. 91, 1998-2002.
236. Park D.J., Chumakov A.M., Miller C.W., Pham E.Y., Koeffler H.P. 1996. p53 transactivation through various p53-responsive elements. Mol Carcinog. 16, 101-108.
237. Keller D.M., Zeng X., Wang Y., Zhang Q.H., Kapoor M., Shu H., Goodman R., Lozano G., Zhao Y., Lu H. 2001. A DNA damage-induced p53 serine 392 kinase complex contains CK2, hSptl6, and SSRP1. Mol Cell. 7,283-292.
238. Renzing J., Lane D.P. 1995. p53-dependent growth arrest following calcium phosphatemediated transfection of murine fibroblasts. Oncogene. 10,1865-1868.
239. Струнина C.M., Иванов A.B., Чумаков П.М. 2003. Разработка репортерной системы для тонкой количественной оценки активности белка р53 в культурах клеток. Молекулярная биология. 31,1007-1018.
240. Wang G.L., Semenza G.L. 1996. Oxygen sensing and response to hypoxia by mammalian cells. Redox Report. 2, 89-96.
241. Koshikawa N., Takenaga K., Tagawa M., Sakiyama S. 2000. Therapeutic efficacy of the suicide gene driven by the promoter of vascular endothelial growth factor gene against hypoxic tumor cells. Cancer Res. 60, 2936-2941.
242. Su H., Arakawa-Hoyt J., Kan Y.W. 2002. Adeno-associated viral vector-mediated hypoxia response element-regulated gene expression in mouse ischemic heart model. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 9480-9485.
243. Hanze J., Eul B.G., Savai R., Krick S., Goyal P., Grimminger F., Seeger W., Rose F. 2003. RNA interference for HIF-lalpha inhibits its downstream signalling and affects cellular proliferation. Biochem Biophys Res Commun. 312, 571-577.
244. Linden T., Katschinski D.M., Eckhardt K., Scheid A., Pagel H., Wenger R.H. 2003. The antimycotic ciclopirox olamine induces HIF-1 alpha stability, VEGF expression, and angiogenesis. Faseb J. 17, 761-763.
245. Shibata T., Giaccia A. J., Brown J.M. 2000. Development of a hypoxia-responsive vector for tumor-specific gene therapy. Gene Ther. 7,493-498.
246. Rapisarda A., Uranchimeg B., Scudiero D.A., Selby M., Sausville E.A., Shoemaker R.H., Melillo G. 2002. Identification of small molecule inhibitors of hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activation pathway. Cancer Res. 62,4316-4324.
247. Post D.E., Van Meir E.G. 2001. Generation of bidirectional hypoxia/HIF-responsive expression vectors to target gene expression to hypoxic cells. Gene Ther. 8,1801-1807.
248. Firth J.D., Ebert B.L., Pugh C.W., Ratcliffe P.J. 1994. Oxygen-regulated control elements in the phosphoglycerate kinase 1 and lactate dehydrogenase A genes: similarities with the erythropoietin 3' enhancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 64966500.
249. Dachs G.U., Patterson A.V., Firth J.D., Ratcliffe P.J., Townsend K.M., Stratford I.J., Harris A.L. 1997. Targeting gene expression to hypoxic tumor cells. Nat Med. 3, 515520.
250. Wadhwa R., Takano S., Mitsui Y., Kaul S.C. 1999. NIH 3T3 cells malignantly transformed by mot-2 show inactivation and cytoplasmic sequestration of the p53 protein. Cell Res. 9,261-269.
251. Wadhwa R., Taira K., Kaul S.C. 2002. An Hsp70 family chaperone, mortalin/mthsp70/PBP74/Grp75: what, when, and where? Cell Stress Chaperones. 7, 309-316.
252. Li G., Bush J.A., Ho V.C. 2000. p53-dependent apoptosis in melanoma cells after treatment with camptothecin. J Invest Dermatol 114, 514-519.
253. Koh H.K. 1991. Cutaneous melanoma. N Engl J Med. 325, 171-182.
254. Hartmann A., Blaszyk H., Cunningham J.S., McGovern R.M., Schroeder J.S., Helander S.D., Pittelkow M.R., Sommer S.S., Kovach J.S. 1996. Overexpression and mutations of p53 in metastatic malignant melanomas. Int J Cancer. 67, 313-317.
255. Cristofolini M., Boi S., Girlando S., Zumiani G., Cristofolini P., Dalla Palma P., Doglioni C., Barbareschi M. 1993. p53 Protein expression in nevi and melanomas. Arch Dermatol. 129, 739-743.
256. Sparrow L.E., Soong R., Dawkins H.J., Iacopetta B.J., Heenan P.J. 1995. p53 gene mutation and expression in naevi and melanomas. Melanoma Res. 5, 93-100.
257. Lowe S.W., Schmitt E.M., Smith S.W., Osborne B.A., Jacks T. 1993. p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature. 362, 847-849.
258. Tron V.A., Trotter M.J., Tang L., Krajewska M., Reed J.C., Ho V.C., Li G. 1998. p53-regulated apoptosis is differentiation dependent in ultraviolet B-irradiated mouse keratinocytes. Am J Pathol. 153, 579-585.
259. Lowe S.W., Ruley H.E., Jacks T., Housman D.E. 1993. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Cell. 74,957-967.
260. Miyake H., Hara I., Gohji K., Yamanaka K., Arakawa S., Kamidono S. 1998. Enhancement of chemosensitivity in human bladder cancer cells by adenoviral-mediated p53 gene transfer. Anticancer Res. 18, 3087-3092.
261. Petty R., Evans A., Duncan I., Kurbacher C., Cree I. 1998. Drug resistance in ovarian cancer the role of p53. Pathol Oncol Res. 4,97-102.
262. Nitiss J.L. 2002. DNA topoisomerases in cancer chemotherapy: using enzymes to generate selective DNA damage. Curr Opin Investig Drugs. 3, 1512-1516.
263. Ellerhorst J.A., Bedikian A.Y., Smith T.M., Papadopoulos N.E., Plager C., Eton 0.2002. Phase II trial of 9-nitrocamptothecin (RFS 2000) for patients with metastatic cutaneous or uveal melanoma. Anticancer Drugs. 13, 169-172.
264. Rich T.A., Shepard R.C., Mosley S.T. 2004. Four decades of continuing innovation with i fluorouracil: current and future approaches to fluorouracil chemoradiation therapy. J Clinf Oncol. 22,2214-2232.
265. Seo Y.R., Fishel M.L., Amundson S., Kelley M.R., Smith M.L. 2002. Implication of p53 in base excision DNA repair: in vivo evidence. Oncogene. 21, 731-737.
266. Rothenberg M.L. 1997. Topoisomerase I inhibitors: review and update. Ann Oncol. 8,837.855.
267. Cheung K.J., Jr., Li G. 2002. The tumour suppressor p33INGl does not enhance camptothecin-induced cell death in melanoma cells. Int J Oncol. 20,1319-1322.
268. Wang F., Cao Y., Liu H.Y., Xu S.F., Han R. 2003. Anti-invasion and anti-angiogenesis » effect of taxol and camptothecin on melanoma cells. J Asian Nat Prod Res. 5, 121-129.1. O i>
-
Разорёнова, Ольга Валериевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.03
- Трансактивационные свойства антионкогена р53 в различных культурах клеток: разработка эффективной репортерной системы для количественной оценки активности р53
- Роль белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих агентов
- Влияние трансдоминантных ингибиторов на функциональную активность онкосупрессора р53
- Исследование контрольных точек клеточного цикла клеток тератокарциномы мыши линии F9 при действии повреждающих агентов
- Исследование молекулярных механизмов дерегуляции супрессора опухолевого роста PDCD4 в опухолевых клетках
